ES2252778T3 - Vasijas de reaccion. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN RECIPIENTE DE REACCION PARA MANTENER REACTIVOS, EL CUAL COMPRENDE UN POLIMERO ELECTRICAMENTE CONDUCTOR, CAPAZ DE EMITIR CALOR CUANDO SE PASA UNA CORRIENTE ELECTRICA A TRAVES DEL MISMO. EL RECIPIENTE DE REACCION COMPRENDE ADECUADAMENTE UN RECIPIENTE DE REACTIVO, COMO POR EJEMPLO UN TUBO CAPILAR, UN PORTAOBJETOS O UN CHIP, EN INTIMO CONTACTO CON EL POLIMERO ELECTRICAMENTE CONDUCTOR. POR EJEMPLO, EL POLIMERO PUEDE TENER LA FORMA DE UNA PELICULA ENVUELTA ALREDEDOR DEL TUBO PARA FORMAR UNA FUNDA. ESTO PROPORCIONA UN SUMINISTRO DE CALENTAMIENTO, FACILMENTE CONTROLABLE, QUE PUEDE CALENTAR Y ENFRIARSE RAPIDAMENTE A LAS TEMPERATURAS DESEADAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN Y REIVINDICAN UN APARATO ADECUADO PARA REACCIONES DE CICLOS TERMICOS, TALES COMO LA REACCION DE LA CADENA DE LA POLIMERASA (RCP), Y QUE COMPRENDEN UNO O MAS RECIPIENTES DE REACCION COMO EL DESCRITO ANTERIORMENTE, ASI COMO LOS PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACION DE DICHAS REACCIONES.
Description
Vasijas de reacción.
La presente invención se refiere a un aparato
para calentar reactivos de modo controlado, usado, por ejemplo, en
reacciones bioquímicas, y a métodos para usar el aparato.
El documento
DE-A-3132926 describe celdas de
flujo con funciones de termostato. Con frecuencia, el calentamiento
controlado de receptáculos de reacción se realiza usando
calentadores de bloques macizos que se calientan y enfrían mediante
varios métodos. Los calentadores de bloques macizos actuales se
calientan mediante elementos eléctricos o dispositivos
termoeléctricos, entre otros. Otros receptáculos de reacción pueden
calentarse mediante disposiciones de bombillas halógenas/aire
turbulento. Los receptáculos pueden enfriarse mediante dispositivos
termoeléctricos, tecnologías de compresores para refrigeradores,
aire forzado o fluidos refrigerantes. Los receptáculos de reacción
encajan en el calentador de bloques con distintos grados de apriete.
Por tanto, el contacto térmico entre el calentador de bloques y el
receptáculo de reacción varía de un diseño de calentador a otro. En
reacciones que requieran múltiples etapas de temperatura, la
temperatura del calentador de bloques puede ajustarse, por ejemplo,
usando un controlador programable para que los ciclos térmicos
puedan efectuarse usando los calentadores.
Este tipo de disposición de calentador es
particularmente útil para reacciones que requieran ciclos térmicos,
tales como los métodos de amplificación del ADN, como la reacción en
cadena de la polimerasa (RCP). La RCP es un procedimiento para
generar grandes cantidades de una secuencia particular de ADN y se
basa en las características de emparejamiento de bases del ADN y el
copiado preciso de hebras de ADN complementarias. La RCP típica
implica un proceso cíclico de tres pasos básicos.
Desnaturalización: una mezcla que contenga
los reactivos para la RCP (que incluyen el ADN a copiar, las bases
nucleótidas individuales -adenina, timina, guanina, citosina-, los
iniciadores adecuados y la enzima polimerasa) se calienta a una
temperatura predeterminada con objeto de separar las dos hebras del
ADN objetivo.
Hibridación: la mezcla se enfría luego a
otra temperatura predeterminada y los iniciadores localizan sus
secuencias complementarias en las hebras de ADN y se unen a
ellas.
Extensión: la mezcla se calienta de nuevo
a otra temperatura predeterminada. La enzima polimerasa (que actúa
como catalizador) une las bases nucleótidas individuales con el
extremo del iniciador para formar una nueva hebra de ADN,
complementaria de la secuencia del ADN objetivo, uniéndose una hebra
con otra.
Una desventaja de los calentadores de bloques
conocidos resulta del retardo necesario para permitir que el bloque
de calentamiento se caliente y se enfríe a las temperaturas
necesarias para la reacción. Por tanto, el tiempo para completar
cada ciclo de la reacción viene determinado, en parte, por la
termodinámica del calentador, además de la velocidad de la reacción.
Para reacciones que impliquen numerosos ciclos y múltiples etapas de
temperatura, este retardo afecta significativamente al tiempo
necesario para realizar la reacción. Los medios termocíclicos
basados en tales calentadores de bloques requieren, típicamente, 2
horas para ejecutar 30 ciclos de reacción.
En muchas aplicaciones de la técnica de la RCP es
deseable realizar la secuencia de ciclos en el menor tiempo posible.
En particular, por ejemplo, cuando se presuma que el aire respirable
o los líquidos o alimentos para consumo humano y de ganado estén
contaminados, los métodos de diagnóstico rápido pueden permitir un
gran ahorro de dinero, cuando no la salvaguarda de la salud e
incluso las vidas de personas o animales.
Unos medios termocíclicos alternativos contienen
una pluralidad de tubos capilares de reacción suspendidos en aire.
El calentamiento y el enfriamiento de los tubos de reacción se
efectúa usando una lámpara halógena y aire turbulento proveniente de
un ventilador. La termodinámica de este sistema representa una
mejora considerable en relación con el diseño del calentador de
bloques tradicional porque se hace pasar aire calentado y enfriado a
través de los tubos de reacción y se consiguen muy rápidamente las
temperaturas requeridas, proporcionando el ventilador un ambiente
térmico homogéneo y un enfriamiento forzado. Usando este aparato
pueden realizarse 30 ciclos de reacción en, aproximadamente, 15
minutos.
Una desventaja de estos medios termocíclicos es
que el enfriamiento y el calentamiento por aire no pueden adaptarse
con facilidad en aparatos múltiples y ciertamente no en aparatos
móviles o portátiles de esta clase.
Los solicitantes han desarrollado un sistema
eficaz para el calentamiento y el enfriamiento rápidos de reactivos,
particularmente útil en reacciones termocíclicas.
En consecuencia, la presente invención ofrece un
aparato, tal como se define en la reivindicación 1, y un método, tal
como se define en la reivindicación 19.
En la técnica se conocen polímeros conductores de
la electricidad y pueden obtenerse de Caliente
Systems Inc., Newark (EE.UU.). Otros ejemplos de tales polímeros se describen, por ejemplo, en los documentos US-A-5106540 y US-A-5106538. Polímeros conductores adecuados pueden proporcionar temperaturas de hasta 300ºC y, por tanto, pueden usarse perfectamente en procesos de la RCP cuyo intervalo de temperaturas típico se encuentre entre 30º y 100ºC.
Systems Inc., Newark (EE.UU.). Otros ejemplos de tales polímeros se describen, por ejemplo, en los documentos US-A-5106540 y US-A-5106538. Polímeros conductores adecuados pueden proporcionar temperaturas de hasta 300ºC y, por tanto, pueden usarse perfectamente en procesos de la RCP cuyo intervalo de temperaturas típico se encuentre entre 30º y 100ºC.
Una ventaja de la invención en relación con los
calentadores de bloques convencionales proviene del hecho de que
los polímeros que conducen la electricidad son susceptibles de
calentarse rápidamente. La velocidad de calentamiento depende de la
naturaleza precisa del polímero, las dimensiones del polímero usado
y la cantidad de corriente aplicada. Es preferible que el polímero
tenga una elevada resistividad, por ejemplo, superior a 1.000
ohm\cdotcm. La temperatura del polímero puede controlarse
fácilmente controlando la cantidad de corriente eléctrica que pase
por él, lo que permite mantenerlo a una temperatura deseada durante
el tiempo deseado. Además, la velocidad de transición entre
temperaturas puede controlarse fácilmente con la adecuada
calibración, alimentando una corriente eléctrica apropiada, por
ejemplo controlada mediante un programa informático.
Además, en comparación con un calentador de
bloques, puede garantizarse, también, un enfriamiento rápido,
debido a la reducida masa térmica del polímero. Pero, si se desea,
el receptáculo de reacción puede ser sometido a un enfriamiento
artificial para aumentar adicionalmente la velocidad de
enfriamiento.
Los métodos de enfriamiento adecuados incluyen el
enfriamiento por aire forzado, por ejemplo, mediante el uso de
ventiladores, inmersión en hielo o baños de agua, etc.
Además, el uso de un polímero como elemento de
calentamiento en un receptáculo de reacción permitirá, generalmente,
que el aparato adopte una forma más compacta que los calentadores
de bloques existentes, lo que resulta útil cuando se efectúan
reacciones químicas en condiciones prácticas reales, tales como al
aire libre, en un río, en el suelo de una fábrica o, incluso, en un
pequeño taller.
El receptáculo de reacción puede adoptar la forma
de recipiente para reactivos, tal como un recipiente de vidrio,
plástico o silicio, con un polímero conductor de la electricidad
dispuesto muy cerca del recipiente. En una realización del
recipiente, el polímero está previsto a modo de envuelta que se
adapta en torno al receptáculo de reacción, en contacto térmico con
él. La envuelta puede estar prevista a modo de cubierta conformada
destinada a adaptarse con apriete en torno a un receptáculo de
reacción o puede estar prevista como banda de película que pueda
envolverse en torno al receptáculo de reacción y asegurarse en
él.
La disposición de envuelta de polímero significa
que puede lograrse un contacto térmico estrecho entre la envuelta y
el receptáculo de reacción. Ello garantiza que el recipiente llegue
rápidamente a la temperatura deseada sin el retardo usual que se
produce por el efecto aislante de la capa de aire entre el
receptáculo de reacción y el calentador. Además, puede usarse una
envuelta de polímero para adaptar aparatos que usen receptáculos de
reacción preexistentes. En particular, puede envolverse una banda de
película de polímero flexible en torno a receptáculos de reacción
de distintos tamaños y formas.
Cuando se emplea una envuelta puede ser ventajoso
que esté perforada o presente algún tipo de estructura reticular.
Ello puede aumentar la flexibilidad del polímero e, incluso, puede
facilitar el acceso de un medio refrigerante, si el propio polímero
no se usa para efectuar el enfriamiento.
En otra realización de la invención, el polímero
está previsto como parte enteriza del receptáculo de reacción. El
receptáculo de reacción puede fabricarse a partir del polímero por
extrusión, moldeo por inyección o técnicas similares.
Alternativamente, el receptáculo de reacción puede fabricarse usando
una construcción de material compuesto en la que una capa del
polímero conductor esté interpuesta entre las capas del material del
que esté hecho el receptáculo o en la que la superficie interna o
externa del receptáculo de reacción esté revestida con el polímero,
o, también, en la que el receptáculo esté hecho, básicamente, del
polímero revestido con un estratificado delgado de un material
compatible con la RCP. Tales receptáculos pueden fabricarse usando
técnicas de estratificación y/o deposición, tales como deposición
química o electroquímica, como es convencional en la técnica.
Los receptáculos que comprendan el polímero como
parte enteriza pueden presentar estructuras particularmente
compactas.
Si se precisan varios receptáculos de reacción
para una reacción particular, los puntos de conexión eléctrica
pueden posicionarse de modo que pueda conectarse una única fuente de
alimentación con todas los receptáculos o tubos de reacción. Los
receptáculos de reacción pueden estar previstos como agrupación.
Alternativamente, cada receptáculo o cada grupo
de receptáculos de reacción puede tener su propio perfil de
calentamiento, establecido por ajuste de la corriente aplicada a
dichos receptáculo o grupo de receptáculos. Ello proporciona una
ventaja adicional y particularmente importante a los receptáculos de
reacción con polímero de acuerdo con la invención en relación con
los calentadores de bloques macizos o por aire turbulento, porque
los receptáculos individuales pueden controlarse de modo
independiente uno de otro merced a sus perfiles térmicos
diferentes. Ello significa que puede emplearse un aparato
relativamente pequeño para realizar una pluralidad de ensayos de la
RCP al mismo tiempo, a pesar de que cada ensayo requiera una
temperatura operativa diferente. Por ejemplo, las pruebas de la RCP
para detectar una gran pluralidad de organismos en una muestra
pueden realizarse simultáneamente, a pesar de que la secuencia de
nucleótidos característica de cada organismo se amplifique a
diferentes temperaturas operativas de la RCP.
El polímero puede estar previsto adecuadamente en
forma de material en lámina o película de espesor, por ejemplo,
entre 0,01 mm y 10 mm, tal como entre 1 y 10 mm, y, preferiblemente,
entre 0,1 y 0,3 mm. Al usar películas delgadas, se minimiza el
volumen del polímero requerido para revestir un receptáculo o
superficie de reacción particular. Ello reduce el tiempo necesario
para que el polímero se caliente a la temperatura necesaria, ya que
el calor producido al hacer pasar la corriente por el polímero no
tiene que distribuirse por todo un gran volumen de material de
polímero.
En uso, el componente de polímero del receptáculo
de reacción está dispuesto de modo que pueda generarse una
corriente eléctrica en el polímero. Ello puede conseguirse dotando
al polímero de puntos para su conexión con una fuente de
alimentación eléctrica o induciendo una corriente eléctrica en el
polímero, por ejemplo, sometiendo al polímero a campos eléctricos o
magnéticos adecuados.
El contacto térmico estrecho que puede
establecerse entre el polímero y el recipiente para el reactivo o
los reactivos en los receptáculos de reacción de la invención
reduce o elimina el efecto aislante de la capa de aire entre el
elemento de calentamiento y el receptáculo de reacción.
En una realización de la invención, el
receptáculo comprende un tubo capilar. La transmisión de calor desde
un tubo capilar a los agentes contenidos en él es más rápida que la
conseguida usando receptáculos para reactivos convencionales,
porque la relación superficie/volumen de los reactivos en el tubo
capilar es mayor que en un receptáculo para reactivos
convencional.
Alternativamente, el receptáculo puede comprender
una placa de soporte plana, tal como una agrupación bidimensional,
en particular un chip, tal como un chip de silicio en forma de
disco, o una platina, en particular un portaobjetos, en la que
puedan ser soportados los reactivos. La placa puede estar hecha a
partir del polímero o el polímero puede estar previsto como parte
enteriza de la placa, como revestimiento en un lado de la placa o
como capa de polímero en una construcción de material compuesto,
tal como se ha descrito anteriormente. Cuando sea apropiado, y
cuando, en particular, la placa sea un chip, el polímero puede
depositarse y/o aplicarse sobre el chip por ataque químico con el
formato preferido, usando, por ejemplo, tecnología de placas de
circuito impreso (PCI).
Los receptáculos de este tipo pueden ser
particularmente útiles para realizar la RCP in situ, por
ejemplo en muestras de tejidos.
Otros receptáculos de reacción adecuados
consisten en tubos y cubetas, conocidos en la técnica.
El aparato de acuerdo con la invención para
reacciones que requieran múltiples etapas de temperatura comprende
un receptáculo de reacción tal como se ha descrito en lo que
antecede, medios para generar una corriente eléctrica en el polímero
y medios de control para regular la cantidad de corriente eléctrica
que pase por el polímero, con objeto de controlar su
temperatura.
De manera adecuada, los medios de control
consisten en medios de control automáticos, tales como una
disposición de interfaz controlada mediante ordenador. Merced al uso
de un controlador programable para el circuito eléctrico conectado
con el polímero, puede preprogramarse, usando el aparato, un régimen
de calentamiento definido, por ejemplo, un número definido de ciclos
de etapas de temperatura predeterminadas a establecer a intervalos
de tiempo y con pausas predeterminados, que incluya el empleo de
perfiles de temperatura y tiempo diferentes con diferentes
receptáculos de reacción en el mismo aparato al mismo tiempo.
Los medios de control pueden incluir un
dispositivo de vigilancia de la temperatura, tal como un termopar,
que vigile la temperatura del receptáculo de reacción y alimente
esta información al sistema de control, de modo que se obtenga el
régimen deseado de calentamiento y/o enfriamiento.
Alternativamente, la temperatura del polímero
puede vigilarse directamente midiendo su resistividad, por ejemplo,
disponiendo el elemento de calentamiento del polímero a modo de
resistencia en una disposición de circuito de puente de Wheatstone.
Ello evita el uso de otros dispositivos de medición de la
temperatura, tales como termopares.
Opcionalmente, el aparato comprende, además,
medios de enfriamiento artificial, tales como uno o más
ventiladores.
El aparato puede incluir una pluralidad de
recipientes. El polímero puede estar previsto como parte enteriza de
cada recipiente, como envuelta en torno a cada recipiente o
dispuesto de modo que una capa de polímero esté interpuesta entre
recipientes adyacentes. Los puntos de conexión eléctrica del
polímero pueden conectarse con una única fuente de alimentación
eléctrica, si se están efectuando varias reacciones que requieran
las mismas etapas de temperatura.
No obstante, en una realización preferida, el
aparato está dispuesto de modo que el polímero en contacto con un
recipiente o un grupo de recipientes (o que los constituya) esté
conectado con una fuente de alimentación individual, conectándose
distintos recipientes o grupos de recipientes con distintas fuentes
de alimentación eléctrica, controladas de modo independiente.
Mediante esta disposición, pueden realizarse, al mismo tiempo, una
pluralidad de reacciones diferentes que requieran etapas de
temperatura diferentes, ya que cada recipiente o grupo de
recipientes cuenta con su propio elemento de calentamiento. Esta
disposición permite a los usuarios llevar a cabo una pluralidad de
reacciones en pequeñas tandas usando un único aparato, lo que no ha
sido posible usando equipos existentes. Los únicos aparatos
disponibles con anterioridad para este tipo de uso consisten en
ciertos diseños de calentadores de bloques de 2 a 4 cuatro segmentos
que pueden calentarse y enfriarse independientemente. Sin embargo,
tales aparatos están limitados a un uso de 2 a 4 tandas de
reacciones y tienen la desventaja de tiempos de ciclo lentos, tal
como se ha descrito en lo que antecede.
Cuando el receptáculo de reacción comprenda una
platina o un chip, el aparato puede comprender la platina o el chip,
una fuente de alimentación eléctrica, medios para conectar la fuente
de alimentación eléctrica con la platina o el chip o para inducir
una corriente eléctrica en el polímero, y medios para controlar la
corriente que pase por la capa de polímero en la platina o el
chip.
Los receptáculos y el aparato para reacciones de
la invención pueden usarse en distintas situaciones en las que se
requiera la realización de reacciones químicas o bioquímicas. De ese
modo, la invención proporciona, además, un método para realizar una
reacción, tal como una reacción química o bioquímica, cuyo método
comprende el calentamiento de reactivos en un receptáculo de
reacción tal como se ha descrito en lo que antecede.
Además de las reacciones de amplificación tales
como las reacciones RCP ya mencionadas anteriormente, los
receptáculos y el aparato para reacciones de la invención pueden
usarse con fines de determinación de secuencias de ácidos nucleicos
y en estudios de cinética de enzimas en los que se investiguen la
actividad de los enzimas a diversas temperaturas, así como para
otras reacciones, especialmente las que impliquen actividad
enzimática, en las que sea necesario mantener temperaturas
precisas. Los receptáculos de reacción de la invención permiten
alcanzar y mantener temperaturas precisas durante periodos de tiempo
adecuados y, luego, variarlas rápidamente como se desee, incluso con
aparatos móviles o portátiles de acuerdo con algunas realizaciones
de la invención.
Para las reacciones RCP, las condiciones de
temperatura requeridas para conseguir la desnaturalización, la
hibridación y la extensión, respectivamente, y el tiempo necesario
para realizar estas etapas variarán en función de distintos
factores, tal como se conoce en la técnica. Ejemplos de tales
factores son la naturaleza y la longitud del nucleótido que se esté
amplificando, la naturaleza de los iniciadores usados y los enzimas
empleados. Las condiciones óptimas pueden ser determinadas, en cada
caso, por los expertos en la técnica. Las temperaturas de
desnaturalización típicas son del orden de 95ºC, las temperaturas de
hibridación típicas son del orden de 55ºC y las temperaturas de
extensión de 72ºC son, generalmente, de un nivel correcto. Cuando
se utilizan los receptáculos y el aparato para reacciones de la
invención, pueden alcanzarse rápidamente estas temperaturas y puede
controlarse fácilmente la velocidad de transición entre
temperaturas.
Pueden emplearse con muchas realizaciones de la
invención, desde luego, colorantes genéricos para intercalar en ADN
y ensayos de sondas genéticas para hebras específicas, por ejemplo
los ensayos de Taqman®, descritos en el documento
US-A-5.538.848, y los ensayos de
Total Internal Reflection Fluorescence (Fluorescencia de reflexión
interna total) -TIRF-, tales como los descritos en el documento
WO-A-93/06241. En tales ensayos, se
detecta una señal proveniente de la muestra, tal como una señal
fluorescente o una señal evanescente, usando un dispositivo de
vigilancia de la fluorescencia. Cuando se ejecuta este tipo de
proceso, el dispositivo de vigilancia de la fluorescencia debe
estar dispuesto de modo que pueda detectar señales emitidas por la
muestra. En algunos casos, puede ser útil que al menos parte del
receptáculo, por ejemplo, un extremo en el que el receptáculo sea
un tubo de la invención, sea ópticamente transparente, de modo que
puedan realizarse mediciones a su través. Alternativamente, el
receptáculo puede estar provisto de medios para transmitir una señal
proveniente de la muestra al dispositivo de vigilancia, por
ejemplo, una fibra óptica o una guía de onda evanescente.
A continuación se describirán realizaciones de la
presente invención, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos
adjuntos, en los que:
la figura 1 es un calentador de receptáculo de
reacción que comprende una envuelta de polímero conductor de la
electricidad, dispuesta adaptada en torno a un tubo de reacción;
la figura 2 muestra una platina de reacción con
un revestimiento de polímero conductor de la electricidad en una de
sus superficies;
la figura 3 muestra una platina de reacción con
una capa de polímero conductor de la electricidad incluida en una
construcción de material compuesto;
la figura 4 muestra un aparato para efectuar
reacciones que impliquen múltiples etapas de temperatura y que
utiliza una banda de polímero conductor de la electricidad para
calentar un receptáculo de reacción de tubo capilar;
la figura 5 muestra un diagrama de un aparato de
acuerdo con la invención para realizar una reacción RCP;
la figura 6 muestra un perfil termocíclico usado
con el aparato de la figura 5;
la figura 7 es un diagrama esquemático de un
multidetector portátil para RCP; y
la figura 7a es un diagrama de un elemento de
detección para uso con el aparato de la figura 7.
Con referencia a la figura 1, una envuelta 2 de
polímero conductor de la electricidad está provista de puntos 3 de
conexión eléctrica para su conexión con una fuente de alimentación
eléctrica. El tamaño y la forma de la envuelta 2 se determinan en
función de las dimensiones y la forma del receptáculo 1 de reacción
en torno al cual se adapta la envuelta.
En uso, la envuelta 2 está posicionada en torno
al receptáculo de reacción 1 y en estrecho contacto térmico con él.
Los puntos 3 de conexión se conectan, entonces, con una fuente de
alimentación eléctrica (no mostrada) y se hace pasar corriente por
la envuelta 2 de polímero, calentando, de ese modo, la envuelta y
los reactivos que haya en el receptáculo 1 de reacción.
Con referencia a la figura 2, una platina 1 está
revestida por un lado con polímero 2 conductor de la electricidad.
Hay previstos puntos 3 de conexión eléctrica en ambos extremos de la
platina 1, en conexión eléctrica con la capa 2 de polímero.
En la figura 3, el receptáculo comprende una
platina 1 con una construcción de material compuesto de modo que
una capa de polímero 2 conductor de la electricidad esté interpuesta
entre las capas del material usual empleado para fabricar tales
platinas, tal como vidrio. Hay previstos puntos 3 de conexión
eléctrica en ambos extremos de la platina 1, en conexión eléctrica
con la capa 2 de polímero.
En uso, una fuente de alimentación eléctrica (no
mostrada) se conecta con los puntos 3 de conexión eléctrica de la
platina mostrada en las figuras 2 y 3, y se hace pasar corriente por
la capa 2 de polímero, calentando de ese modo la platina 1 y los
reactivos que haya en ella.
Con referencia a la figura 4, una banda de
película 2 de polímero conductor de la electricidad está envuelta
en torno a un tubo capilar 1 y asegurada en él. La banda de película
2 de polímero está provista de puntos 3 de conexión eléctrica con
los que, por medio de pinzas 4 de conexión, se conecta una fuente 5
de alimentación eléctrica.
En uso, se hace pasar corriente por la película 2
de polímero, calentando de ese modo el tubo capilar 1 y los
reactivos que haya en su interior.
El dispositivo de la figura 5 se construyó con el
fin de realizar detecciones de RCP. Se usó como receptáculo de
reacción un tubo capilar 6 con un diámetro interno de 1,12 mm y un
diámetro externo de 1,47 mm. Se envolvió una banda 7 de polímero
conductor de la electricidad en torno al tubo y se fijó a él, de
modo que quedara retenida muy apretadamente contra la superficie
externa del tubo. Por tanto, el calentamiento se produjo desde todos
los puntos del tubo 6, minimizando el gradiente de temperatura a
través de una muestra en el tubo 6.
El calentamiento se proporcionó mediante una
fuente de alimentación eléctrica 8 que se conectó, por medio de una
interfaz 9, con un ordenador 10, con objeto de controlar los ciclos
de calentamiento de modo automático. Se dispuso un enfriador 11 de
ventilador para dirigir aire sobre el polímero 7. Se dispuso un
termopar 12 por infrarrojos en el lado exterior del polímero 7 con
el fin de vigilar la temperatura.
Con objeto de evaluar el comportamiento del
aparato antes del uso, se usó un termopar de tipo K para vigilar la
temperatura dentro del tubo 6. Las temperaturas interna y externa se
usaron, entonces, para establecer una relación lineal entre las
lecturas de la temperatura externa y la temperatura prevista para la
muestra.
El polímero de calentamiento se conectó con la
fuente de alimentación 8 y se cerró el circuito usando la interfaz
9 y lógica. Un conmutador 14 previsto para cerrar el circuito
consistió en un relé óptico rápido que podía conmutarse cada 10 ms.
Se usó un segundo circuito para controlar dos pequeños ventiladores
eléctricos 11 que proporcionaron refrigeración por aire forzado a
la muestra de reacción y que se hicieron funcionar de manera
continua. Se utilizó lógica de control de LabView, que proporciona
una interfaz gráfica de uso sencillo para la programación y el
funcionamiento. Inicialmente, se aplicó corriente de modo
relativamente frecuente, con el fin de llegar más rápidamente a la
temperatura requerida. Cuando se logró la temperatura de
funcionamiento especificada la corriente se aplicó de manera menos
frecuente, cuando era necesario, con el fin de mantener la
temperatura de funcionamiento especificada en la duración
predeterminada.
El aparato mostrado en la figura 7 comprende una
caja 70, con tapa, con una partición aislante que define una
pluralidad de compartimientos 71 receptores de elementos de
detección. La caja 70 se muestra conectada eléctricamente, por
medio de una unidad de interfaz 72, con una fuente de alimentación
73 y un ordenador 74. La conexión es de tal modo que permite que
cada compartimiento sea alimentado de modo diferente. Cada
compartimiento contiene un termopar (no mostrado) para vigilar su
temperatura.
El elemento de detección mostrado en la figura 7a
comprende un tubo de reacción 75 rodeado por una envuelta 76. La
envuelta 76 está formada por un polímero de calentamiento y está
conectada con los terminales de alimentación 77 y 78.
Una vez llenado y tapado un tubo 75 puede
colocarse en el compartimiento 71 apropiado hasta que los terminales
77 y 78 hayan encajado en los terminales de acoplamiento del
receptor (no mostrados) en los compartimientos. El aparato está
previsto de modo que, cuando esté conectado adecuadamente, presente
en la pantalla del ordenador el estado de conexión de cada tubo
75.
El cierre de la tapa de la caja 70 determina el
aislamiento de cada compartimiento y la retención de cada tubo 75 en
su compartimiento.
El programa de ordenador está previsto para la
identificación separada de la molécula que se esté buscando en cada
tubo 75, hecha la cual está dispuesto para el control del ciclo de
temperatura apropiado para la RCP, con el fin de amplificar la
molécula, si existe. Cuando se terminan los ciclos, el contenido de
los tubos puede ser expuesto a detectores de sonda genética
apropiados para determinar si realmente existe la molécula
buscada.
Obviamente, el principio del aparato descrito en
relación con las figuras 7 y 7a puede llevarse a cabo de distintas
maneras. Puede ser móvil, en lugar de portátil, y estar dispuesto
para la recepción de elementos de detección de forma distinta a un
tubo, incluyendo una platina. Típicamente está dispuesto para tratar
con 96 o 192 elementos de detección.
El siguiente ejemplo ilustra la invención.
Usando el aparato de la figura 5 con el termopar
de tipo K retirado, se efectuó la siguiente reacción RCP.
Se amplificó un amplicón de 100 pares de bases
proveniente de un fragmento clonado de Yersinia pestis. Las
condiciones de la reacción se optimizaron previamente usando al
RapidCycler™ de Idaho y se amplificaron muestras de la misma mezcla
de reacción en el RapidCycler™ de Idaho a modo de reacciones de
control.
La mezcla de reacción colocada en el tubo 6
comprendía lo siguiente:
- -
- 50 mM de Tris-HCl, con pH de 8,3
- -
- 3 mM de MgCl_{2}
- -
- 2,5 mg/ml de albúmina de suero bovino
- -
- 200 \muM de cada uno de los desoxinucleótidos dATP, dTTP, dCTP y dGTP
- -
- 10 \mug/ml de cada uno de los iniciadores de la RCP
- -
- 25 unidades/ml de Taq polimerasa
El perfil termocíclico se programó, tal como se
muestra en la figura 6, como sigue: 95ºC durante cero segundos,
55ºC durante cero segundos, 72ºC durante cero segundos. A modo de
comparación, se programó un perfil termocíclico similar en un
RapidCycler™ de Idaho. Se usaron volúmenes de reacción de 50 \mul
en el receptáculo capilar 6 revestido de polímero y en el
RapidCycler™ de Idaho.
En este contexto, "cero segundos" significa
que una vez alcanzada la temperatura objetivo el programa induce la
temperatura subsiguiente. El tiempo preciso al que la reacción se
mantiene a la temperatura objetivo es función, por tanto, de los
parámetros y las propiedades del dispositivo usado. Pero, en
general, será menos de un segundo.
Después de 40 ciclos en el receptáculo capilar,
una muestra de 50 \mul del producto RCP de cada una de las
reacciones se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa al
2% en tampón TAE 1x. El ADN se visualizó usando coloración con
bromuro de etidio. La muestra se analizó junto a una muestra del
RapidCycler™ de Idaho (25 ciclos) y se detectó un amplicón similar
dimensionado correctamente.
Claims (23)
1. Aparato para efectuar reacciones,
comprendiendo dicho aparato un receptáculo de reacción (1, 6, 75)
adecuado para contener reactivos y que comprende un polímero (2, 7,
76) conductor de la electricidad que emita calor cuando se haga
pasar una corriente eléctrica por él, y medios de control (10, 74)
para controlar la alimentación de corriente al polímero, estando
previstos dichos medios de control (10, 74) para alimentar corriente
eléctrica con el fin de generar una secuencia de temperaturas
diferentes en los reactivos contenidos en el receptáculo de
reacción, pudiendo conectarse el polímero con una fuente de
alimentación eléctrica (5, 8, 73) merced a los medios de
control.
2. Aparato según la reivindicación 1, que
comprende una pluralidad de receptáculos de reacción (1, 6, 75).
3. Aparato según la reivindicación 2, en el que
pueden alimentarse corrientes diferentes para calentar cada
receptáculo (1, 6, 75) o grupo de receptáculos.
4. Aparato según la reivindicación 3, en el que
los medios de control (10, 74) están previstos para la alimentación
de corriente, con un perfil de temperatura y/o tiempo diferente, a
cada uno de los receptáculos de reacción.
5. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que cada receptáculo de reacción (1,
6, 75) comprende un recipiente para reactivos y el polímero
calentador (2, 7, 76) es contiguo a dicho recipiente.
6. Aparato según la reivindicación 5, en el que
el polímero calentador forma una envuelta (2, 7, 76) en torno al
recipiente.
7. Aparato según las reivindicaciones 5 o 6, en
el que el polímero calentador (2) adopta la forma de una
película.
8. Aparato según las reivindicaciones 6 o 7, en
el que la envuelta es enteriza con el recipiente.
9. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, en el que el polímero calentador está
perforado o es reticular.
10. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el polímero calentador forma un
recipiente para los reactivos.
11. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el receptáculo de reacción
comprende un recipiente para reactivos, estando revestida una de las
superficies del recipiente (1) con dicho polímero calentador
(2).
12. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el receptáculo o cada
receptáculo de reacción comprende un tubo capilar (1, 6).
13. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el receptáculo o cada receptáculo
de reacción comprende una platina (1).
14. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el receptáculo de reacción
comprende un chip.
15. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, que comprende una pluralidad de
receptáculos de reacción en una agrupación.
16. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los medios de control (10,
74) están previstos para alimentar corriente eléctrica de acuerdo
con un perfil de tiempo/temperatura predeterminado, de modo que
puedan realizarse reacciones que requieran múltiples etapas de
temperatura en los receptáculos de reacción.
17. Aparato según la reivindicación 16, en el que
los medios de control (10, 74) están programados de modo que puedan
efectuarse, automáticamente, múltiples ciclos de la reacción.
18. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende, además, medios para
detectar una señal proveniente de una muestra en un receptáculo de
reacción.
19. Un método para llevar a efecto una reacción
química o bioquímica que requiera múltiples etapas de temperatura,
comprendiendo dicho método colocar los reactivos necesarios para
dicha reacción en un receptáculo de reacción que comprenda un
polímero conductor de la electricidad que emita calor cuando se haga
pasar por él una corriente eléctrica, alimentar corriente a dicho
polímero, con el fin de calentar los reactivos a una primera
temperatura deseada, y, después, ajustar la corriente, con el fin de
producir las etapas de temperatura subsiguientes necesarias para la
reacción.
20. Un método según la reivindicación 19, en el
que la reacción es un método de amplificación de ADN.
21. Un método según la reivindicación 20, en el
que el método de amplificación es una reacción en cadena de la
polimerasa (RCP).
22. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en el que los reactivos para una
pluralidad de reacciones se colocan, cada uno, en un receptáculo de
reacción y se calientan simultáneamente.
23. Un método según la reivindicación 22, en el
que cada receptáculo de reacción se calienta individualmente a la
temperatura necesaria para la reacción que tenga lugar en dicho
receptáculo.
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