PL186398B1

PL186398B1 - Sposób przeprowadzania reakcji chemicznej lub biochemicznej oraz urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej lub biochemicznej

Info

Publication number: PL186398B1
Application number: PL97333772A
Authority: PL
Inventors: Martin A. Lee; Dario Leslie
Original assignee: Secr Defence
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2004-01-30
Also published as: ES2252778T3; JP4044619B2; GB9912372D0; EP1520625A2; EP0942781A1; HK1025753A1; IL130279A0; US20020028165A1; TW555856B; NZ336056A; GB2334904B; KR20000057407A; JP2001509256A; AU5060698A; CA2273840A1; DE69734457T2; GB2334904A; US6436355B1; GB9716052D0; EP1520625A3

Abstract

1. Sposób przeprowadzania reakcji chemicznej lub biochemicznej, w którym umieszcza sie odczyn- niki potrzebne do reakcji w zbiorniku reakcyjnym, znamienny tym, ze zbiornik reakcyjny zawiera po- limer przewodzacy prad i emitujacy cieplo podczas zasilania go pradem, przy czym polimer zasila sie pradem w celu grzania odczynników do pierwszej zadanej temperatury, nastepnie prad reguluje sie do wytworzenia kolejnych wielokrotnych cykli tempe- raturowych wymaganych do przeprowadzenia reakcji. 6. Urzadzenie do przeprowadzania reakcji che- micznej albo biochemicznej, zawierajace co naj- mniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umozliwiajacy ich kon- trolowane ogrzewanie, znamienne tym, ze zawiera elektrycznie przewodzacy polimer grzejny ( 2), emi- tujacy cieplo podczas przeplywu przez niego pradu elektrycznego oraz srodki sterowania do regulacji zasilania polimeru grzejnego ( 2) pradem, w celu wytwarzania sekwencji róznych temperatur w od- czynnikach znajdujacych sie w zbiorniku reakcyj- nym ( 1), przy czym polimer grzejny ( 2) polaczony jest ze zródlem zasilania przez srodki sterowania (3). Fig.5. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób przeprowadzania reakcji chemicznej oraz urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej wykorzystujące kontrolowane grzanie odczynników, stosowane zwłaszcza w reakcjach biochemicznych.

Kontrolowane grzanie zbiorników reakcyjnych często przeprowadza się przy użyciu litych grzejników blokowych, które są grzane i chłodzone różnymi sposobami. Stosowane obecnie lite grzejniki blokowe są nagrzewane przez elementy elektryczne lub między innymi urządzenia termoelektryczne. Inne zbiorniki reakcyjne mogą być grzane przez urządzenia z żarówką halogenową i z burzliwym przepływem powietrza. Zbiorniki mogą być chłodzone przez urządzenia termoelektryczne, przy użyciu techniki stosowanej w chłodziarkach sprężarkowych, wymuszonym powietrzem lub płynami chłodzącymi. Zbiorniki reakcyjne pasują do wnętrza grzejnika blokowego z różnymi stopniami suwliwości. Kontakt termiczny pomiędzy grzejnikiem blokowym a zbiornikiem reakcyjnym zmienia się zatem w zależności od konstrukcji grzejnika. W reakcjach wymagających stopniowania temperatury można regulować temperaturę grzejnika blokowego stosując programowany sterownik, np. aby umożliwić przeprowadzanie cyklu termicznego z wykorzystaniem grzejników·'.

186 398

Ten rodzaj układu grzejnikowego jest szczególnie użyteczny do reakcji wymagających cyklu termicznego, takich jak metody amplifikacji DNA, jak łańcuchowa reakcja polimerazy (polymerase chain reaction) (PCR). PGR jest procedurą wytwarzania dużych ilości określonej sekwencji DNA i oparta jest na właściwościach DNA tworzenia par zasad i dokładnego kopiowania komplementarnych nici DNA. Typowa PCR wymaga cyklicznego procesu o trzech podstawowych etapach.

Denaturacja: mieszanina zawierająca odczynniki PCR (DNA do amplifikacji, pojedyncze zasady nukleotydów (A, T, G, C), odpowiednie środki pobudzające i enzym polimerazy) jest ogrzewana do określonej temperatury w celu rozdzielenia dwóch nici docelowego DNA.

Renaturacja: mieszanina jest następnie chłodzona do innej określonej temperatury, a startery umieszczają swe komplementarne sekwencje na niciach DNA i wiążą się z nimi.

Przedłużenie: mieszaninę ogrzewa się znowu do kolejnej określonej temperatury. Enzym polimerazy (działający w charakterze katalizatora) łączy pojedyncze zasady nukleotydów z końcem startera, by utworzyć nową nić DNA, która jest komplementarna wobec sekwencji docelowego DNA, przy czym obie te nici są spojone ze sobą.

Wada znanych grzejników blokowych wynika z opóźnienia potrzebnego do umożliwienia grzania i chłodzenia bloku grzejnego do temperatur wymaganych przez reakcję. Czas do zakończenia każdego cyklu reakcji jest częściowo określony przez dynamikę cieplną grzejnika oraz przez szybkości reakcji. W przypadku reakcji wymagających wielu cykli i wielu stopni temperaturowych opóźnienie takie ma znaczny wpływ na czas upływający do zakończenia reakcji. Urządzenia do prowadzenia cykli termicznych bazujące na takich grzejnikach blokowych zwykle potrzebują około dwóch godzin do zakończenia trzydziestu cykli reakcji.

Dla wielu zastosowań techniki PGR pożądane jest zakończenie sekwencji cykli w minimalnym możliwym czasie. W szczególności przykładowo, kiedy powietrze do oddychania lub płyny albo żywność do spożycia przez człowieka lub zwierzę są podejrzane o skażenie, szybkie metody diagnostyczne są bardziej ekonomiczne, a jednocześnie mają pozytywny wpływ na zdrowie lub nawet życie pacjenta.

Alternatywne urządzenia do prowadzenia cykli termicznych zawierają wiele włoskowatych rurek reakcyjnych, które są zawieszone w powietrzu. Grzanie i chłodzenie tych rurek reakcyjnych odbywa się z zastosowaniem lampy halogenowej i burzliwego przepływu powietrza z dmuchawy. Dynamika cieplna takiego systemu jest znacznym ulepszeniem w stosunku do tradycyjnej konstrukcji grzejnika blokowego, ponieważ ogrzane i ochłodzone powietrze jest przepuszczane przez rurki reakcyjne, a żądane temperatury są uzyskiwane dość szybko, przy czym dmuchawa zapewnia jednorodne środowisko termiczne i wymuszone chłodzenie. Przy stosowaniu tego urządzenia 30 cykli reakcji można przeprowadzić w ciągu 15 minut.

Wadą tego urządzenia do przeprowadzania cykli cieplnych jest to, że powietrzne chłodzenie i grzanie nie jest odpowiednie dla urządzeń wielokrotnych, a z pewnością nie dla urządzeń ruchomych lub przenośnych.

W rozwiązaniu przedstawionym w niemieckim opisie patentowym DE 3132926 stosuje się pojedyncze naczynie, które jest odpowiednie do trzymania odczynników w celu umożliwienia ich kontrolowanego grzania. Elementy sterowania rozmieszczone są tak, aby umożliwić wytworzenie różnych temperatur wewnątrz naczynia. Zgodnie z tym wynalazkiem przez naczynie przepływowe wymusza się przepływ odczynników przez kanał w stałej temperaturze.

Naczynie przepływowe nie jest odpowiednie do kontrolowanego grzania odczynników oraz do ich trzymania w warunkach statycznych z zapewnieniem możliwości dokonywania szybkich zmian temperatury, ponieważ takie naczynie nie umożliwia dokładnej kontroli temperatury.

Znane jest także z amerykańskiego opisu patentowego US 5,498,392 mikrofabrykowane urządzenia do przeprowadzania reakcji amplifikacji wymagających obiegu termicznego oraz stosowania zmiennej temperatury, przy czym urządzenie to wykorzystuje konwencjonalne elementy grzejne.

Według wynalazku w sposobie przeprowadzania reakcji chemicznej lub biochemicznej, odczynniki potrzebne do reakcji umieszcza się w zbiorniku reakcyjnym, przy czym zbiornik reakcyjny zawiera polimer przewodzący prąd i emitujący ciepło podczas zasilania go prądem,

186 398 przy czym polimer zasila się prądem w celu grzania odczynników do pierwszej żądanej temperatury, a następnie prąd reguluje się do wytworzenia kolejnych wielokrotnych cykli temperaturowych wymaganych do przeprowadzenia reakcji.

Korzystnym jest, że reakcja jest sposobem amplifikacji DNA, przy czym sposób amplifikacji jest łańcuchową reakcją polimerazy (PGR). Odczynniki dla wielu reakcji umieszcza się każdy w zbiorniku reakcyjnym i jednocześnie ogrzewa, zaś każdy zbiornik reakcyjny ogrzewa się oddzielnie do temperatury wymaganej do zajścia reakcji danym w zbiorniku.

Urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej albo biochemicznej, zawiera co najmniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umożliwiający ich kontrolowane ogrzewanie. Urządzenie zawiera elektrycznie przewodzący polimer grzejny, emitujący ciepło podczas przepływu przez niego prądu elektrycznego oraz środki sterowania do regulacji zasilania polimeru grzejnego prądem, w celu wytwarzania sekwencji różnych temperatur w odczynnikach znajdujących się w zbiorniku reakcyjnym, przy czym polimer grzejny połączony jest ze źródłem zasilania przez środki sterowania.

Korzystnym jest, że urządzenie zawiera wiele zbiorników reakcyjnych, przy czym każdy zbiornik albo grupa zbiorników reakcyjnych jest oddzielnie połączona do źródła zasilania elektrycznego poprzez środki sterujące. Zbiornik reakcyjny zawiera zbiornik na odczynniki oraz przyległy do niego polimer grzejny, przy czym polimer grzejny tworzy płaszcz wokół zbiornika. Polimer grzejny ma postać powłoki albo postać płaszcza, który stanowi integralną część zbiornika, przy czym polimer ten może być perforowany lub siatkowany. Polimer grzejny tworzy zbiornik na odczynniki. Zbiornik reakcyjny zawiera zbiornik na odczynniki, przy czym jedna z powierzchni zbiornika pokryta jest polimerem grzejnym. Ponadto jeden lub każdy zbiornik reakcyjny stanowi włoskowatą rurkę, albo jeden lub każdy zbiornik reakcyjny stanowi płytkę, albo jest zbudowany ze struktury półprzewodnikowej. Wiele zbiorników reakcyjnych może być połączonych w układ, zaś urządzenie może zawierać elementy do detekcji sygnału z próbki w zbiorniku reakcyjnym.

Zgodnie z odmianą wynalazku urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej albo biochemicznej, zawierające co najmniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umożliwiający ich kontrolowane ogrzewanie, charakteryzuje się tym, że zbiornik reakcyjny stanowi strukturę półprzewodnikową albo płytkę, z elektrycznie przewodzącym polimerem grzejnym emitującym ciepło podczas zasilania go prądem elektrycznym, przy czym polimer grzejny jest przeznaczony do ogrzewania odczynników na strukturze półprzewodnikowej lub płytce.

Korzystnym jest, że polimer grzejny jest integralną częścią struktury półprzewodnikowej lub płytki.

Zgodnie z inną odmianą wynalazku urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej albo biochemicznej, zawierające co najmniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umożliwiający ich kontrolowane ogrzewanie charakteryzuje się tym, że zawiera przewodzący polimer grzejny emitujący ciepło podczas zasilania go prądem oraz środki sterowania do kontroli zasilania prądem polimeru grzejnego, przy czym polimer grzejny połączony jest ze źródłem zasilania poprzez środki sterowania i przeznaczony jest do grzania zbiornika reakcyjnego, przy czym ogrzewanie jednego zbiornika jest sterowane niezależnie od ogrzewania innego zbiornika.

Korzystnym jest, że zbiornik reakcyjny zawiera zbiornik na odczynniki oraz przyległy do niego polimer grzejny, przy czym polimer grzejny tworzy płaszcz wokół zbiornika na odczynniki albo ma postać powłoki. Płaszcz jest integralną częścią zbiornika na odczynniki, zaś polimer grzejny jest perforowany lub siatkowany i tworzy zbiornik na odczynniki. Zbiornik reakcyjny zawiera zbiornik na odczynniki, przy czym jedna z powierzchni zbiornika pokryta jest polimerem grzejnym.

Zaleta sposobu według wynalazku, w porównaniu z konwencjonalnym sposobem wykorzystującym ogrzewanie przy pomocy grzejnika blokowego, wynika z tego, że polimery, które przewodzą prąd elektryczny, mogą szybko się nagrzewać. Prędkość grzania zależy od dokładnej natury polimeru, wymiarów użytego polimeru i ilości doprowadzanego prądu. Korzystnie polimer ma dużą rezystywność, np. większą niż 1000 om-cm. Temperatura polimeru

186 398 może być łatwo kontrolowana przez sterowanie ilości prądu elektrycznego przepuszczanego przez polimer, co umożliwia utrzymywanie go w żądanej temperaturze przez żądaną ilość czasu. Ponadto prędkość przejścia pomiędzy temperaturami może być łatwo kontrolowana po kalibracji przez doprowadzanie odpowiedniej wielkości prądu elektrycznego, np. pod kontrolą programu komputerowego.

Ponadto, dzięki małej masie cieplnej polimeru, może być również zapewnione szybkie chłodzenie. Jeżeli jest to pożądane, zbiornik reakcyjny może być poddawany sztucznemu chłodzeniu, by dodatkowo zwiększyć prędkość chłodzenia. Odpowiednie sposoby chłodzenia obejmują wymuszone chłodzenie powietrzne, np. za pomocą dmuchaw, zanurzanie w lodzie lub w kąpielach wodnych itd.

Sposób przeprowadzania reakcji chemiczna lub biochemiczna, który to sposób obejmuje grzanie odczynników w zbiorniku reakcyjnym stosuje się w reakcji amplifikacji jak i w przypadku reakcji PCR. Sposób według wynalazku może być stosowany w celu sekwencjonowania kwasów nukleinowych i przeprowadzania kinetycznych badań enzymów, gdzie bada się aktywność enzymów w różnych temperaturach. Dotyczy to również innych reakcji, zwłaszcza dotyczących aktywności enzymatycznej, gdzie trzeba utrzymywać dokładne temperatury. Zbiorniki reakcyjne stosowane w sposobie według wynalazku umożliwiają osiąganie dokładnych temperatur i utrzymywanie ich przez odpowiednie czasy, a następnie uzyskanie szybkich zmian, nawet w urządzeniu przenośnym. W przypadku reakcji PCR warunki temperaturowe potrzebne do osiągnięcia denaturacji, wyżarzania i przedłużenia oraz czas potrzebny do realizacji tych etapów będą się zmieniać w zależności od różnych czynników, co jest zrozumiałe w tej dziedzinie. Przykłady takich czynników obejmują naturę i długość amplifikowanych nukleotydów, naturę stosowanych starterów i wykorzystywane enzymy. Optymalne warunki mogą być w każdym przypadku określone przez fachowca. Typowe temperatury denaturacji są rzędu 95°C, typowe temperatury denaturacji są rzędu 55°C, a temperatury przedłużenia 72°C są zwykle prawidłowe. Przy stosowaniu zbiorników reakcyjnych i urządzeń w sposobie według wynalazku temperatury te można szybko osiągnąć i szybko można kontrolować prędkość zmiany temperatury'.

Interkolacyjne barwniki rodzajowe DNA i testy przy pomocy specyficznych sond genowych, np. badania Taqman®, jak przedstawiono w opisie patentowym US 5,538,848 oraz badania całkowitej wewnętrznie odbijanej fluorescencji (TIRF), takie jak opisane w WO 93/06241, mogą oczywiście być wykorzystywane z wieloma rozwiązaniami według wynalazku. W takich badaniach sygnał z próbki, taki jak sygnał fluorescencyjny lub sygnał nadkrytyczny, jest wykrywany za pomocą urządzenia monitorującego fluorescencję. Przy podejmowaniu tego typu procesu urządzenie do monitorowania fluorescencji musi być zestawione tak, aby było zdolne do wykrywania sygnału pochodzącego z próbki. W pewnych przypadkach może być pomocne, jeżeli część zbiornika, np. koniec, gdzie zbiornik ma postać rurki, może być optycznie przezroczysta, tak że mogą być przez nią wykonywane pomiary. Alternatywnie zbiornik może być wyposażony w środki przenoszenia sygnału z próbki do urządzenia monitorującego, np. światłowód lub falowód nadmiarowy

Stosowanie polimeru jako elementu grzejnego w zbiorniku reakcyjnym umożliwia zmniejszenie wymiarów urządzenia, co jest użyteczne przy przeprowadzaniu reakcji chemicznych w warunkach terenowych, np. na otwartym powietrzu, nad rzeką, na kondygnacji fabrycznej lub nawet w niewielkim sklepie.

Zbiorniki według wynalazku zapewniają skuteczne i szybkie grzanie i chłodzenie odczynników, co jest szczególnie użyteczne w reakcjach wymagających cykli termicznych.

Elektrycznie przewodzące polimery są znane i można je otrzymać z Caliente Systems Inc., Newark, USA. Inne przykłady takich polimerów opisano np. w amerykańskich opisach patentowych US 5,106,540 i Us 5,106,538. Odpowiednie przewodzące polimery mogą dawać temperatury do 300°C, a więc mogą być z powodzeniem stosowane w procesach PCR, gdzie typowy zakres temperatur jest 30-100°C.

Płaszcz polimerowy umożliwia osiągnięcie ścisłego kontaktu cieplnego ze zbiornikiem reakcyjnym. Zapewnia to, że zbiornik szybko osiąga żądaną temperaturę bez zwykłego opóźnienia powodowanego przez izolujące działanie warstwy powietrza pomiędzy zbiornikiem

186 398 reakcyjnym a grzejnikiem. Ponadto, polimerowy płaszcz może być używany do adaptacji urządzenia wykorzystującego dotychczas istniejące zbiorniki reakcyjne. W szczególności wstęga giętkiej folii polimerowej może być owinięta wokół zbiornika reakcyjnego o różnych wymiarach i kształtach. Tam, gdzie stosowany jest płaszcz, może być korzystne perforowanie go lub siatkowanie w dowolny sposób. Może to zwiększać giętkość polimeru i może pozwalać nawet na łatwiejszy dostęp czynnika chłodzącego, jeżeli sam polimer nie jest wykorzystywany do powodowania chłodzenia.

Polimer może być również zastosowany jako integralna część zbiornika reakcyjnego. Zbiornik reakcyjny może być wykonany z polimeru przez wytłaczanie, formowanie wtryskowe lub podobnymi technikami. Alternatywnie, zbiornik reakcyjny może być wykonany z zastosowaniem konstrukcji kompozytowej, w której warstwa przewodzącego polimeru jest umieszczona pomiędzy warstwami materiału, z którego wykonany jest zbiornik lub w którym wewnętrzne lub zewnętrzne powierzchnie zbiornika reakcyjnego są powleczone polimerem, albo znowu w którym zbiornik jest zasadniczo wykonany z polimeru powleczonego cienkim laminatem z materiału kompatybilnego z PCR. Zbiorniki takie mogą być wytwarzane z zastosowaniem laminowania i/lub osadzania, np. znanymi technikami osadzania chemicznego lub elektrochemicznego.

Zbiorniki, które zawierają polimer jako integralną część, mogą mieć szczególnie zwarte konstrukcje.

Jeżeli do danej reakcji potrzeba kilku zbiorników reakcyjnych, dowolne punkty połączenia elektrycznego można umieścić tak, że jedno zasilanie może być dołączone do wszystkich zbiorników lub rur reakcyjnych. Zbiorniki reakcyjne mogą być zestawione w pole.

Alternatywnie każdy ze zbiorników reakcyjnych lub każda grupa zbiorników reakcyjnych może mieć swój własny profil grzania ustawiony przez regulację prądu doprowadzanego do tego zbiornika lub grupy zbiorników. Stanowi to dalszą i szczególnie ważną zaletę zbiorników reakcyjnych z polimerem według wynalazku w porównaniu z litymi grzejnikami blokowymi lub grzejnikami z burzliwym przepływem powietrza, ponieważ poszczególne zbiorniki mogą być kontrolowane niezależnie od siebie zgodnie ze swym własnym profilem temperatury. Oznacza to, że stosunkowo niewielkie urządzenie może być wykorzystywane do przeprowadzania wielu badań PCR w tym samym czasie bez zważania na to, że każde badanie wymaga innej temperatury pracy. Przykładowo testy PCR do wykrywania dużej liczby organizmów w próbce mogą być przeprowadzane równocześnie nie zważając na to, że sekwencja nukleotydów, która jest charakterystyczna dla każdego organizmu, jest amplifikowana przy innych temperaturach pracy PCR.

Polimer może być odpowiednio stosowany w postaci materiału arkuszowego lub folii, np. o grubości 0,01-10 mm, takiej jak 1-10 mm, a korzystnie 0,1-0,3 mm. Przy stosowaniu cienkich folii ilość polimeru potrzebna do przykrycia danego zbiornika reakcyjnego lub powierzchni jest zmniejszona do minimum. Skraca to czas potrzebny do nagrzania polimeru do żądanej temperatury, ponieważ ciepło wytwarzane przez przepuszczanie prądu przez polimer nie musi być rozprowadzane w całej dużej objętości materiału polimerowego.

W zastosowaniu składnik polimerowy zbiornika reakcyjnego jest umieszczony tak, że prąd elektryczny może być wytwarzany wewnątrz polimeru. Można to osiągnąć albo przez wyposażenie polimeru w punkty dołączenia zasilania elektrycznego, albo przez indukowanie przepływu prądu elektrycznego wewnątrz polimeru, np. przez wystawienie polimeru na działanie odpowiednich pól elektrycznych lub magnetycznych.

Ścisły kontakt termiczny pomiędzy polimerem a odczynnikami lub pojemnikiem z odczynnikami, który może być ustanowiony w zbiornikach reakcyjnych według wynalazku, zmniejsza lub eliminuje izolujący wpływ warstwy powietrza pomiędzy elementem grzejnym a zbiornikiem reakcyjnym.

W przypadku wykonania zbiornika w postaci włoskowatej rurki, przenoszenie ciepła z tej włoskowatej rurki do odczynników zawartych w niej jest szybsze niż w przypadku stosowania konwencjonalnych zbiorników odczynników, ponieważ stosunek pola powierzchni do objętości odczynników w rurce włoskowatej jest większy niż w konwencjonalnym zbiorniku odczynników.

186 398

Alternatywnie zbiornik może stanowić płaską płytkę wsporczą, taką jak dwuwymiarowe pole, zwłaszcza płytkę takąjak półprzewodnikowa płytka krzemowa, albo też płytka laboratoryjna, zwłaszcza płytka mikroskopowa, na której mogą być wsparte odczynniki. Płytka może być wykonana z polimeru, albo też polimer może być zastosowany jako integralna część płytki albo jako powłoka na jednej stronie płytki, albo jako warstwa polimeru wewnątrz konstrukcji kompozytowej.

Tam, gdzie jest to właściwe, a zwłaszcza kiedy płytka jest elementem półprzewodnikowym, polimer może być osadzony i/lub trawiony w korzystnym kształcie na tym elemencie półprzewodnikowym, np. przy zastosowaniu technologii obwodów drukowanych (PCB).

Zbiorniki tego rodzaju mogą być szczególnie użyteczne do przeprowadzania PCR in situ, np. na próbkach tkankowych.

Innym odpowiednim zbiornikiem reakcyjnym są znane rurki i kuwety.

Przez stosowanie programowanego sterownika do obwodu elektrycznego dołączonego do polimeru za pomocą urządzenia można zaprogramować określony reżim grzania, np. określoną liczbę cykli określonych etapów temperaturowych do utworzenia w określonych interwałach czasowych i przerwach, łącznie ze stosowaniem różnych profili temperaturowych i czasowych z różnymi zbiornikami reakcyjnymi równocześnie w tym samym urządzeniu.

Urządzenie sterujące może zawierać urządzenie monitorowania temperatury, takie jak termopara, które monitoruje temperaturę zbiornika reakcyjnego i podaje tę informację do systemu sterowania, tak że przestrzegany jest żądany reżim grzania i/lub chłodzenia.

Alternatywnie temperatura polimeru może być monitorowana bezpośrednio przez pomiar jego rezystywności, np. przez zastosowanie polimerowego elementu grzejnego jako rezystora w układzie mostka Wheatstone'a. Pozwala to na uniknięcie stosowania innych urządzeń pomiaru temperatury, takich jak termopary.

Ewentualnie urządzenie zawiera ponadto środki sztucznego chłodzenia, takie jak jedna lub więcej dmuchaw-.

Urządzenie może zawierać wiele pojemników. Polimer może być stosowany jako integralna część każdego pojemnika, jako płaszcz wokół każdego pojemnika lub umieszczony tak, że warstwa polimeru jest usytuowana pomiędzy sąsiednimi pojemnikami. Punkty połączenia elektrycznego na polimerze mogą być dołączone do jednego zasilacza elektrycznego, jeżeli ma być przeprowadzana pewna liczba reakcji wymagających takich samych stopni temperatury.

Polimer będący w kontakcie z pojemnikiem (lub tworzący pojemnik) lub z grupą pojemników może być dołączony do oddzielnego zasilania, przy czym kilka pojemników lub grup pojemników jest dołączone do różnych niezależnie sterowanych zasilaczy elektrycznych. Przy takim układzie pewna liczba różnych reakcji wymagających różnych stopni temperatury może być przeprowadzana równocześnie, ponieważ każdy pojemnik łub grupa pojemników ma swój własny element grzejny. Układ taki umożliwia użytkownikom przeprowadzanie pewnej liczby niewielkich reakcji wsadowych przy użyciu jednego urządzenia, co nie było możliwe przy zastosowaniu znanych rozwiązań.

Tam, gdzie zbiornik reakcyjny zawiera płytkę lub strukturę półprzewodnikową urządzenie zawiera ponadto, zasilacz elektryczny, środki do dołączania zasilacza elektrycznego do płytki lub struktury półprzewodnikowej lub do indukowania prądu elektrycznego w polimerze oraz środki do sterowania przepływu prądu przez warstwę polimeru na płytce lub strukturze półprzewodnikowej. Zbiorniki reakcyjne i urządzenia według wynalazku mogą być stosowane w wielu różnych sytuacjach, gdzie trzeba przeprowadzić reakcje chemiczne lub biochemiczne.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia grzejnik zbiornika reakcyjnego zawierający płaszcz z elektrycznie przewodzącego polimeru umieszczony wokół rurki reakcyjnej, fig. 2 przedstawia płytkę posiadającą elektrycznie przewodzącą powłokę polimerową na jednej ze swych powierzchni, fig. 3 przedstawia płytkę posiadającą warstwę elektrycznie przewodzącego polimeru w konstrukcji kompozytowej, fig. 4 przedstawia urządzenie do przeprowadzania reakcji wymagających wielu stopni temperatury, które wykorzystuje taśmę z elektrycznie przewodzącego polimeru do grzania zbiornika reakcyjnego w postaci rurki wloskowatej, fig. 5 przedstawia schemat

186 398 urządzenia według wynalazku do przeprowadzania reakcji PCR, fig. 6 przedstawia profil termocykliczny stosowany z urządzeniem z fig. 5, fig. 7 przedstawia schemat przenośnego multidetektora PCR, zaś fig. 7a - schemat elementu detekcyjnego do stosowania w urządzeniu z fig. 7.

Sposobem według wynalazku przeprowadzono amplifikację DNA przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR), wymagającą cykli termicznych. Zamplifikowano amplikon o długości 100 par zasad sklonowanego fragmentu Ycrsinia pestis. Warunki reakcji uprzednio zoptymalizowano stosując Idaho RapidCycler™, a ponadto próbki takiej samej mieszaniny reakcyjnej amplifikowano w Idaho RapidCycler™ jako reakcje kontrolne, w urządzeniu przedstawionym na fig. 5 z usuniętą termoparą typu K, w rurce 6, umieszczono mieszaninę reakcyjną o następującym składzie:

mM Tris.HCl pH 8,3 mM MgCl2

2,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej

200 μΜ każdego z następujących czynników: dATP, dTTP, dCTP i dGTP μg/ml każdego ze starterów PGR jednostek/ml polimerazy Taq

Profil cyklu termicznego zaprogramowano jako 95°C przez zero sekund, 55°C przez zero sekund, 72°C przez zero sekund, jak pokazano na fig. 6. Dla porównania podobny profil zmian temperatury zaprogramowano w Idaho RapidCycler™. Zarówno w zbiarnika w postaci włoskowatej rurki 6 przykrytej polimerem jak i w Idaho RapidCycler™ stosowano objętości reakcyjne 50 μ!.

W tym kontekście zero sekund oznacza, że natychmiast po osiągnięciu docelowej temperatury program wydaje polecenie osiągnięcia następnej temperatury. Dokładny czas, w którym reakcja jest utrzymywana w temperaturze docelowej, jest zatem zależny od parametrów i właściwości stosowanego urządzenia. Na ogół jednak będzie on krótszy niż jedna sekunda.

Po 40 cyklach w zbiorniku włoskowatym próbkę 50 μΐ produktu PCR z każdej z reakcji frakcjonowano pod względem wielkości przez elektroforezę na żelu agarazawym w 2% żelu w buforze 1 x TAE. DNA wizualizowano przy wykorzystaniu barwienia bromkiem etydyny. Próbkę badano równolegle z próbką z Idaho RapidCycler™ (25 cykli) i wykryto podobny prawidłowo zwymiarowany amplikon.

W zbiorniku reakcyjnym 1 przedstawionym na fig. 1, płaszcz z przewodzącego elektrycznie polimeru grzejnego 2 jest wyposażony w punkty połączenia elektrycznych środków sterowania 3 do dołączenia zasilania elektrycznego. Wielkość i kształt płaszcza z polimeru grzejnego 2 są określone przez wymiary i kształt zbiornika reakcyjnego 1, wokół którego umieszczony jest płaszcz w ścisłym kontakcie cieplnym ze zbiornikiem reakcyjnym 1. Punkty połączenia elektrycznego zostają następnie dołączone do zasilania elektrycznego (nie pokazapo) i pezez płaszcz z polimeru grzejnego 2 przepuszczany jest prąd, który ogrzewa wszystkie odczynniki wewnątrz zbiornika reakcyjnego 1.

Na fig. 2 jest przedstawi ony ceakcyjny zbiornik w postaci płytki 1A powleczonej po jednej stronie elektrycznie przewodzącą warstwą polimeru grzejnego 2A. Przy każdym końcu płytki 1A przewidziane są punkty połączenia elektrycznych środków sterowania 3 połączone elektrycznie z warstwą polimeru grzejnego 2A.

Na fig. 3 reakcyjny zbiornik ma postać płytki 1B o takiej konstrukcji warstwowej, w której warstwa elektrycznie przewodzącego polimeru grzejnego 2B jest umieszczona pomiędzy warstwami typowego materiału używanego do wytworzenia takich płytek, takiego jak szkło. Punkty połączenia elektrycznych środków sterowania 3 są umieszczone przy każdym końcu pPłytk;! 1B zbiornika i połączone el ektrycónie z warstwą polimeru grzejnego 2B.

W celu przygotowania urządzenia do pracy, zasilanie elektryczne (nie przedstawione na rysunku) dołącza się do punktów połączenia elektrycznych środków sterowania 3 umieszczony^ _na końcach płytki HA, 1B pokazanej na fig. 2 i 3 i przepuszcz a się prąd przez warstwę polimeifu grzejnego 2A, 2B, gB-zejąc przez to płytkę 1A, IB i wszelkie odczynniki na niej usytuowane.

Nw fig. 4, polimer grzejny 2C w postaci taśmy z elektrycznie przewodzącej polimerowej folii j^gst mwmmty wokół zbiornika reakcyjnego 1 wjjostaei włoskow/atej rurki 1C

186 398 i zamocowany. Polimer grzejny 2C ma punkty połączenia elektrycznych środków sterowania 3, do których zasllirnie elekty/crne 5 jett dołączone przez zaciski przyłączowe 4. Przez poiimer grzejny 2C w postaci folii przepuszcza się prąd, grzejąc przez to włoskowatą rurkę 2C i wszystkie umieszczone w niej odczynniki.

Urządzenie z fig. 5 zostało skonstruowane w celu przeprowadzania PCR w celach detekcji. Włoskowata rurka 6 o średnicy wewnętrznej 1,12 mm i o średnicy zewnętrznej 1,47 mm została użyta jako reakcyjny zbiornik. Pasek elektrycznie przewodzącego polimeru owinięto wokół tej rurki i przymocowano tak, że jest on trzymany dość ciasno przy zewnętrznej powierzchni rurki. Grzanie odbywa się dzięki temu ze wszystkich stron rurki, zmniejszając do minimum gradient temperatury na próbce w rurce 6.

Grzanie przeprowadzano za pomocą elektrycznego zasilacza 8, który był dołączony poprzez zespół sprzęgający 9 do komputera 10, aby umożliwić automatyczne sterowanie cykli grzania. Chłodnica z dmuchawą 11 była przeznaczona do kierowania powietrza na polimer 7. Termopara 12 na podczerwień umieszczona była po zewnętrznej stronie polimeru w celu monitorowania temperatury.

W celu ocenienia stanu urządzenia przed użyciem zastosowano termoparę typu K do monitorowania temperatury wewnątrz rurki 6. Następnie temperaturę wewnętrzną, i zewnęttrną użyto do llnearrmcji odcz^ów ttenpeertury zewnętrzne do oo^i^e^^llo^ty temperatury próbki.

Polimer grzejny jest dołączony do zrellrcna 8, a obwód zostaje zamknięty za pomocą zespołu sprzęgającego 9 i oprogramowania. Łącznik 14, służący do zamykania obwodu, był szybkim przekaźnikiem optycznym, który może przełączać co 10 milisekund. Drugi obwód zastosowano do sterowania dwóch niewielkich dmuchaw 11, które służą do chłodzenia wymuszonym przepływem powietrza próbki reakcyjnej i które pracują nieprzerwanie. Do sterowania użyto oprogramowanie LabView, które stanowi przyjazny użytkownikowi interfejs graficzny zarówno przy programowaniu jak i przy eksploatacji. Prąd doprowadzano początkowo ze stosunkowo dużą częstotliwośccą aby szybciej uzyskać żądaną temperaturę. Po osiągnięciu wyznaczonej temperatury pracy prąd doprowadzano mniej często, tak jak to było wymagane w celu utrzymania wyznaczonej temperatury pracy przez określony czas.

Urządzenie przedstawione na fig. 7 zawiera skrzynkę 70 z przykrywką, posiadającą izolujące przegrody, które tworzą wiele wnęk 71 przyjmujących elementy detekcyjne. Skrzynka 70 jest przedstawiona jako połączona elektrycznie poprzez zespół sprzęgający 72 ze źródłem zasilania 73 i z komputerem 74. Połączenie jest takie, aby umożliwić różne zasilanie każdej z wnęk 71. Każda wnęka zawiera termoparę (nie pokazano) do monitorowania temperatury we wnęce.

Element detekcyjny przedstawiony na fig. 7a zawiera reakcyjną rurkę 75 otoczoną płaszczem 76. Płaszcz 76 jest wykonany z polimeru grzejnego i jest dołączony do zacisków zasilania 77 i 78.

Po napełnieniu rurki 75 i zakorkowaniu jej, można ją umieścić w odpowiedniej wnęce 71 z dołączeniem zacisków 77 i 78 do współpracujących zacisków przyjmujących we wnękach (nie pokazano). Całkowicie połączone urządzenie umożliwia wyświetlanie na ekranie komputera nieprzerwanie stanu każdej rurki 75.

Zamknięcie pokrywy skrzynki 70 uzupełnia izolowanie każdej wnęki i zamknięcie każdej rurki 75 w swej wnęce.

Program komputera jest przeznaczony do oddzielnej identyfikacji poszukiwanej cząsteczki w każdej rurce 75, a następnie do sterowania odpowiednim cyklem temperatury dla PCR w celu namnożenia tej cząsteczki, jeśli istnieje. Po zakończeniu cykli zawartość rurki można wystawić na działanie odpowiednich detektorów sondy genowej, aby stwierdzić, czy poszukiwana cząsteczka rzeczywiście występowała.

Oczywiście zasada urządzenia opisanego w odniesieniu do fig. 7 i 7a może być realizowana różnymi sposobami. Może to być raczej urządzenie przewoźne, a nie przenośne i może prreenaccone do prz.yrjno\wana eiementów .Ιε^ον-ίην^ w .ηη^ possaci nii rurka zawierająca preparat. Zwykle urządzenie to jest przeznaczone do działania z elementami detekcyjnymi.

186 398

Fig.4.

186 398

Fig.5.

TEMPERATURA °C

Fig.6.

xCYKLE

CZAS

186 398

Fig.7.

73

70o°⁰0^Vo°⁰0 °ο^οΰΡ0° ^Οο°°ο⁰ o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o| o o o o o o O o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o

Fig.7a.

7 6 78 tifś

186 398

Fig.1.

Fig.2.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób przeprowadzania reakcji chemicznej lub biochemicznej, w którym umieszcza się odczynniki potrzebne do reakcji w zbiorniku reakcyjnym, znamienny tym, że zbiornik reakcyjny zawiera polimer przewodzący prąd i emitujący ciepło podczas zasilania go prądem, przy czym polimer zasila się prądem w celu grzania odczynników do pierwszej żądanej temperatury, następnie prąd reguluje się do wytworzenia kolejnych wielokrotnych cykli temperaturowych wymaganych do przeprowadzenia reakcji.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcja jest sposobem amplifikacji DNA.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że sposób amplifikacji jest łańcuchową reakcją polimerazy (PCR).
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że poszczególne odczynniki dla wielu reakcji umieszcza się każdy w zbiorniku reakcyjnym i jednocześnie ogrzewa.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że każdy zbiornik reakcyjny ogrzewa się oddzielnie do temperatury wymaganej do zajścia reakcji danym w zbiorniku.
6. Urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej albo biochemicznej, zawierające co najmniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umożliwiający ich kontrolowane ogrzewanie, znamienne tym, że zawiera elektrycznie przewodzący polimer grzejny (2), emitujący ciepło podczas przepływu przez niego prądu elektrycznego oraz środki sterowania do regulacji zasilania polimeru grzejnego (2) prądem, w celu wytwarzania sekwencji różnych temperatur w odczynnikach znajdujących się w zbiorniku reakcyjnym (1), przy czym polimer grzejny (2) połączony jest ze źródłem zasilania przez środki sterowania (3).
7. Urządzenie według zastrz. 6, znamienne tym, że zawiera wiele zbiorników reakcyjnych (1).
8. Urządzenie według zastrz. 7, znamienne tym, że każdy zbiornik albo grupa zbiorników reakcyjnych (1) jest oddzielnie podłączona do źródła zasilania elektrycznego poprzez środki sterujące.
9. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że zbiornik reakcyjny (1) zawiera zbiornik na odczynniki oraz przyległy do niego polimer grzejny (2).
10. Urządzenie według zastrz. 9, znamienne tym, że polimer grzejny (2) tworzy płaszcz wokół zbiornika reakcyjnego (1).
11. Urządzenie według zastrz. 10, znamienne tym, że polimer grzejny (2) jest w postaci powłoki.
12. Urządzenie według zastrz. 10, znamienne tym, że polimer grzejny ma postać płaszcza (76), który stanowi integralną część zbiornika.
13. Urządzenie według zastrz. 10, znamienne tym, że polimer grzejny (2) jest perforowany lub siatkowany.
14. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że polimer grzejny (2) tworzy zbiornik na odczynniki.
15. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że zbiornik reakcyjny (1) zawiera zbiornik na odczynniki, przy czym jedna z powierzchni zbiornika pokryta jest polimerem grzejnym (2).
16. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że jeden lub każdy zbiornik reakcyjny stanowi włoskowatą rurkę (6).
17. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że jeden lub każdy zbiornik reakcyjny stanowi płytkę (1A, 1B).
18. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że jeden lub każdy zbiornik reakcyjny (1) jest zbudowany ze struktury półprzewodnikowej.

186 398
19. Urządzenie według zastrz. 7 albo 8, znamienne tym, że zawiera ponadto wiele zbiorników reakcyjnych (1) połączonych w układ.
20. Urządzenie według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienne tym, że zawiera elementy do detekcji sygnału z próbki w zbiorniku reakcyjnym (1).
21. Urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej albo biochemicznej, zawierające co najmniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umożliwiający ich kontrolowane ogrzewanie, znamienny tym, że zbiornik reakcyjny stanowi strukturę półprzewodnikową albo płytkę (1A, 1B), z elektrycznie przewodzącym polimerem grzejnym (2A, 2B) emitującym ciepło podczas zasilania go prądem elektrycznym, który jest przeznaczony do ogrzewania odczynników na strukturze półprzewodnikowej lub płytce (1A, 1B).
22. Zbiornik reakcyjny według zastrz. 21, znamienny tym, że polimer grzejny (2A, 2B) jest integralną częścią struktury półprzewodnikowej lub płytki (1A, 1B).
23. Urządzenie do przeprowadzania reakcji chemicznej albo biochemicznej, zawierające co najmniej jeden zbiornik reakcyjny odpowiedni do trzymania odczynników i umożliwiający ich kontrolowane ogrzewanie, znamienne tym, że zawiera przewodzący polimer grzejny (2) emitujący ciepło podczas zasilania go prądem oraz środki sterowania do kontroli zasilania prądem polimeru grzejnego (2), przy czym polimer grzejny (2) połączony jest ze źródłem zasilania poprzez środki sterowania (3) i przeznaczony jest do grzania zbiornika reakcyjnego (1), przy czym ogrzewanie jednego zbiornika jest sterowane niezależnie od ogrzewania innego zbiornika.
24. Urządzenie według zastrz. 23, znamienne tym, że zbiornik reakcyjny (1) zawiera zbiornik na odczynniki oraz przyległy do niego polimer grzejny (2).
25. Urządzenie według zastrz. 24, znamienne tym, że polimer grzejny (2) tworzy płaszcz wokół zbiornika na odczynniki.
26. Urządzenie według zastrz. 24 albo 25, znamienne tym, że polimer grzejny (2) jest w postaci powłoki.
27. Urządzenie według zastrz. 25, znamienne tym, że płaszcz jest integralną częścią zbiornika na odczynniki.
28. Urządzenie według zastrz. 23 albo 24, albo 25, znamienne tym, że polimer grzejny (2) jest perforowany lub siatkowany.
29. Urządzenie według zastrz. 23 albo 24, znamienne tym, że polimer grzejny (2) tworzy zbiornik na odczynniki.
30. Urządzenie według zastrz. 23 albo 24, albo 25, znamienne tym, że zbiornik reakcyjny (1) zawiera zbiornik na odczynniki, przy czym jedna z powierzchni zbiornika pokryta jest polimerem grzejnym (2).