CZ299691B6 - Zpusob provádení chemické nebo biochemické reakcea zarízení k provádení zpusobu - Google Patents

Abstract

Zpusob provádení chemické nebo biochemické reakce, která vyžaduje více teplotních stupnu zahrnuje umístení reakcních cinidel potrebných pro uvedenou reakci do reakcní nádoby (1, 6, 71) vybavené ohrevovým prostredkem obsahujícím elektricky vodivý polymerní prvek (2), který emituje teplo, když jím prochází elektrický proud; privádení proudu do uvedeného polymerního prvku pro ohrátí reakcních cinidel na první požadovanou teplotu; a následné nastavení proudu pro vytvorení následných teplotních stadií potrebných pro reakci. Zarízení k provádení zpusobu obsahuje alespon jednu reakcní nádobu (1, 6, 71), ohrevový prostredek zahrnující elektricky vodivý polymerní prvek (2), usporádaný k zahrívání reakcní nádoby (1, 6, 71) a rídicí prostredek (10, 74) pro rízení dodávky elektrického proudu do ohrevového prostredku, pricemž rídicí prostredek (10, 74) je nastaven pro dodávku elektrického proudu zajištující sekvenci ruzných reakcních teplot reakcních cinidel udržovaných v reakcní nádobe (1, 6, 71), a ohrevový prostredek je pripojitelný k elektrickému zdroji (5, 8, 73) pres rídicí prostredek (10,74).

Description

Způsob provádění chemické nebo biochemické reakce a zařízení k provádění způsob

Oblast techniky

Přprl lfi7Pnv in/nólp * í * V f V UV 11J , jnujv z ss tyká způsobu a zařízeni k prováděni chemické ueuu uiocučíiiíckč reaKCe, která vyžaduje více teplotních stupňů.

Dosavadní stav techniky

Řízený ohřev reakčních nádob se často provádí za použití pevných blokových ohřívačů, které se ohřívají a chladí různými způsoby. Současné pevné blokové ohřívače se ohřívají a chladí, mezi jinými, elektrickými prvky nebo termoelektrickými zařízeními. Jiné reakční nádoby se mohou ohřívat halogenovými lampami nebo zařízeními na proudící vzduch. Nádoby se mohou chladit pomocí termoelektrických zařízení, kompresorovými chladicími technikami, vzduchem nebo chladicími médii. Reakční nádoba je připojena na blokový ohřívač s různým stupněm komfortu. Tak například tepelný kontakt mezi blokovým ohřívačem a reakční nádobou se mění od jedné konstrukce ohřívače ke druhé. V reakcích vyžadujících více reakčních stupňů se teplota blokového ohřívače může nastavovat pomocí programovatelného regulátoru, například pro umožnění provádění tepelných cyklů pomocí ohřívačů.

Tento typ uspořádání ohřívače je zvláště vhodný pro reakce vyžadující tepelné cyklování, například metody amplifikace DNA, jako polymerázová řetězcová reakce (PCR, Polymerase

Chain Reaktion). PCR je postup pro vytváření velkých množství zvláštních sekvencí DNA a je založena na charakteristikách párování bází DNA a přesném kopírování komplementárních vláken DNA. Typický postup PCR zahrnuje cyklus tří základních kroků.

Denaturace: Směs obsahující reakční činidla pro PCR (zahrnující kopírovanou DNA, jednotlivé nukleotidové báze (A,T,G,C), vhodné primery a enzym polymerázu) se zahřívá na předem stanovenou teplotu pro oddělení dvou vláken cílové DNA.

Ochlazení: Směs se poté chladí na předem stanovenou teplotu a primery (molekuly s krátkým vláknem jejichž přítomnost je nutná pro tvoření molekul s delším řetězcem DNA) lokalizují jejich komplementární sekvence DNA a váží se k nim.

Růst: Směs se znovu zahřívá na stanovenou teplotu. Enzym polymeráza (fungující jako katalyzátor) připojuje jednotlivé nukleotidové báze na konec primeru pro vytvoření nového vlákna DNA, které je komplementární sekvenci cílové DNA, přičemž se obě vlákna vzájemně spojují.

Nevýhoda známých blokových ohřívačů spočívá v dobč zpoždění, nutné aby topný blok mohl ohřívat a chladit na teplotu požadovanou pro reakci. Doba pro ukončení každého reakčního cyklu je částečně určena, vedle rychlosti reakce tepelnou dynamikou ohřívače. Pro reakce zahrnující více cyklů a více teplotních stupňů tato doba zpoždění značně ovlivňuje dobu potřebnou pro úplné zreagování. Tepelné cyklovače založené na takovýchto blokových ohřívačích zpravidla potřebují 2 hodiny pro provedení 30 úplných reakčních cyklů.

Pro četné aplikace PCR techniky je požadováno dokončit sekvenci cyklů v minimálním možném čase. Zejména například když vzduch nebo tekutiny nebo potraviny pro lidskou a zvířecí spotře50 bu jsou podezřelé z kontaminace, mohou rychlé diagnostické metody ušetřit značné náklady, neli zdraví nebo do konce životy.

Alternativní tepelný cyklovač obsahuje množství kapilárních reakčních trubic zavěšených ve vzduchu. Ohřev a chlazení reakčních trubic se provádí pomocí halogenové lampy a prouděním vzduchu pomocí ventilátoru. Tepelná dynamika tohoto systému představuje značné zlepšení

-1 CZ 299691 B6 oproti tradiční konstrukci blokového ohřívače, protože ohřátý a ochlazený vzduch je veden napříč reakčním trubicím a je rychle dosaženo požadované teploty, přičemž ventilátor poskytuje homogenní tepelné prostřední a nucené chlazení. Za použití tohoto aparátu může být uskutečněno 30 reakčních cyklů během asi 15 minut.

Nevýhodou tohoto tepelného cyklovačc jc, že vzduchové chlazení a ohřívání není vhodné pro víceúčelový aparát, a zejména ne pro mobilní nebo přenosný aparát tohoto druhu.

Patent DE31 32 926 popisuje průtokovou kyvetu, u které se pro stabilizaci teploty využívá io elektricky vodivý polymer.

Patent US 5 498 392 popisuje amplifikaci polynukleotidu, stejně jako zařízení a způsob, které ke zvyšování a snižování teploty, potřebnému v závislosti na typu právě probíhající reakce, používají jako prostředek pro kontrolu teploty například odporové zahřívání.

Podstata vynálezu

Přihlašovatelé vyvinuli účinný systém rychlého ohřevu a chlazení reakčních činidel, který je použitelný zejména při reakcích s tepelným cyklováním.

Předmětem vynálezu je způsob a zařízení k provádění chemické nebo biochemické reakce, která vyžaduje více teplotních stupňů.

Zařízení podle vynálezu obsahuje alespoň jednu reakční nádobu vhodnou pro pojmutí reakčních činidel a umožňující jejich řízené zahřívání, ohřevový prostředek zahrnující elektricky vodivý polymemí prvek, který emituje teplot když jím prochází elektrický proud, uspořádaný k zahřívání reakční nádoby a řídicí prostředek pro řízení dodávky elektrického proudu do ohřevového prostředku, přičemž řídicí prostředek je nastaven pro dodávku elektrického proudu zajištující sekvenci různých reakčních teplot reakčních činidel udržovaných v reakční nádobě a ohřevový prostředek je připojitelný k elektrickému zdroji přes řídicí prostředek.

Způsob podle vynálezu zahrnuje umístění reakčních činidel potřebných pro uvedenou reakci do reakční nádoby, která zahrnuje ohřevový prostředek obsahující elektricky vodivý polymemí prvek, který emituje teplo, když jím prochází elektrický proud; přivádění proudu do uvedeného polymemího prvku pro ohřátí reakčních činidel na první požadovanou teplotu; a následné nastavení proudu pro vytvoření následných teplotních stadií potřebných pro reakci.

Elektricky vodivé polymery jsou známy ze stavu techniky a lze je získat od Caliente Systems lne.

of Newark USA. Jiné příklady takovýchto polymerů jsou popsány například v patentech US 5 106 540 a US 5 106 538. Vhodné vodivé polymery mohou poskytnout teploty až do 300 °C a jsou tedy dobře použitelné pro PCR procesy, kde je typické rozmezí teplot mezi 30 °C a 100 °C.

Výhoda vynálezu proti konvenčnímu blokovému ohřívači je odvozena ze skutečnosti, že poly45 mery, které vedou elektrický proud, se ohřívají rychle. Rychlost topení závisí na přesné povaze polymeru, rozměrech použitého polymeru a velikosti přiváděného proudu. S výhodou má polymer vysoký měrný odpor, například více než 1000 ohm.cm. Teplota polymeru může být snadno řízena řízením množství elektrického proudu procházejícího polymerem, což umožňuje udržovat jej na požadované teplotě po požadovanou dobu. Dále, rychlost přechodu mezi teplotami může být po kalibraci snadno řízena dodáváním vhodného elektrického proudu, například řízeným vhodným počítačovým programem.

Dále, ve srovnání s blokovým ohřívačem, vzhledem k malé tepelné hmotě polymeru může být zajištěno také rychlé chlazení. Je-li však třeba, reakční nádoba může být podrobena umělému chlazení pro další zvýšení rychlosti chlazení.

-2CZ 299691 B6

Vhodné způsoby chlazení zahrnují nucené vzduchové chlazení, například pomocí ventilátorů, ponoření do ledové nebo vodní lázně atd.

Kromě toho použití polymeru jako topného prvku v reakční nádobě zpravidla umožní učinit přístroj kompaktnějším než jsou stávajíc: blokové ohřívače, eož je užitečné při provádění chemických reakcí v polních podmínkách jako například pod širým nebem, na řece, v továrně nebo také v malé dílně.

Reakční nádoba může mít formu kontejneru, jako například skleněného, plastového nebo silikonového kontejneru, s elektricky vodivým polymerem uspořádaným v těsné blízkosti kontejneru. Podle jednoho vytvoření nádoby je polymer opatřen pouzdrem, které je upevněno kolem reakční nádoby, v tepelném kontaktu s nádobou. Pouzdro buď může být vytvořeno jako tvarovaný povlak, obalující reakční nádobu, nebo může být vytvořeno jako pás fólie, která může být obale15 na kolem reakční nádoby a upevněna.

Uspořádání polymemího pouzdra znamená, že je dosažitelný bezprostřední tepelný styk mezi pouzdrem a reakční nádobou. To zajišťuje, že nádoba rychle dosáhne požadované teploty bez obvyklé doby zdržení způsobené izolačním efektem vzduchové vrstvy mezi reakční nádobou a ohřívačem. Dále, polymemí pouzdro může být použito k úpravě zařízení za použití již dříve existujících reakčních nádob. Zejména pás flexibilní polymemí fólie může být obalen kolem reakční nádoby různých velikostí a tvarů.

Při použití pouzdra může být výhodné, když je perforováno nebo nějakým způsobem mřížko25 váno. To může zvýšit flexibilitu polymeru a také umožnit snadnější přístup chladicího média, jestliže není pro chlazení použit samotný polymer.

V dalším vytvořením je polymer vytvořen jako integrální část reakční nádoby. Reakční nádoba může být vytvořena z polymeru extruzí, lisovstříkem nebo obdobnými technikami. Reakční nádoba může být alternativně vyrobena za použití kompozitní konstrukce, ve které je vrstva vodivého polymeru vložena mezi vrstvy materiálu, z něhož je nádoba vyrobena, nebo v němž je vnitřní nebo vnější povrch reakční nádoby povlečen polymerem, nebo dále v němž je nádoba vytvořena v podstatě z polymeru povlečeného tenkým laminátem z PCR kompatibilního materiálu. Takovéto nádoby mohou být vytvořeny laminováním a/nebo nanášením, například technikami chemického nebo elektrochemického nanášení, známými ze stavu techniky.

Nádoby, které obsahují polymer jako integrální součást, mohou představovat zvlášť kompaktní konstrukce.

Jestliže je pro některé zvláštní reakce třeba několik reakčních nádob, mohou být elektrické kontakty umístěny tak, že ke všem reakčním nádobám nebo trubkám může být připojen jediný napájecí přívod. Reakční nádoby mohou být uspořádány v poli.

Alternativně může mít každá reakční nádoba nebo každá skupina reakčních nádob svůj vlastní topný profil daný nastavením přiváděného proudu do této nádoby nebo skupiny nádob. To poskytuje další a zvláště významnou výhodu reakčních nádob s polymerem podle vynálezu proti pevným blokovým ohřívačům nebo ohřívačům na vzduch v tom, že jednotlivé nádoby mohou být řízeny navzájem nezávisle sjejich vlastním tepelným profilem. To znamená, že pro provádění více PCR zkoušek zároveň je možné použít poměrně malý aparát, nehledě na to, že každá zkouška vyžaduje různou pracovní teplotu. Například PCR zkoušky pro zjištění značného množství organismů ve vzorku se mohou provádět zároveň, nehledě na to že sekvence nukleotidů, charakteristická pro každý organismus, se amplifikuje při jiné pracovní teplotě PCR.

Polymer může být vhodně vytvořen ve formě tabulového materiálu nebo fólie, například o tloušť55 ce 0,01 mm až 10 mm, například 1 až 1 mm, s výhodou 0,1 až 0,3 mm. Za použití tenkých fólií je

-3CZ 299691 B6 minimalizován objem polymeru potřebný pro pokrytí jednotlivé reakční nádoby nebo povrchu. To redukuje dobu potřebnou pro ohřátí polymeru na požadovanou teplotu, jestliže teplo vytvořené průchodem proudu skrze polymer nemusí být distribuováno skrze velký objem polymemího materiálu.

V ΠΓΠνΑνίι ΓΡηΙίΡΓΐί fSÓřlnKv ΪΪ

.......... .......*-··

411^1 IH íJVUVUJL IVUJWIH i nádoby usporadana tak, aby mohl uyí v polymeru vytvořen elektrický proud. Toho může být dosaženo opatřením polymeru kontakty pro elektrický přívod, nebo indukováním elektrického proudu uvnitř polymeru, například vystavením polymeru vhodnému elektrickému nebo magnetickému poli.

Spojení tepelného kontaktu mezi polymerem a kontejnerem s reakčním činidlem nebo činidly, které může být realizováno v reakčních nádobách podle vynálezu, redukuje nebo eliminuje izolační efekt vzduchové vrstvy mezi topným prvkem a reakční nádobou.

V jednom vytvoření vynálezu nádoba zahrnuje kapilární trubku. Přestup tepla z kapilární trubky do reakčních činidel v ní obsažených je rychlejší, než jakého je dosaženo za použití konvenčních reakčních nádob, neboť poměr plochy povrchu k objemu reakčních činidel v kapilární trubce je větší, než v konvenční reakční nádobě.

Alternativně může nádoba zahrnovat plochou opěrnou desku, jako například dvourozměrné pole, zejména čip, například silikonový destičkový čip, nebo destičku, zejména mikroskopové sklíčko, na které jsou nesena reakční činidla. Deska může být vyrobena z polymeru, nebo může být polymer vytvořen jako integrální část desky, buď jako povlak na jedné straně desky nebo jako póly měrní vrstva uvnitř kompozitní konstrukce jak bylo výše popsáno. Je-li třeba a zejména jestliže je deskou čip, může být polymer nanášen a/nebo leptán v preferovaném formátu na čipu za použití například technologie tištěných obvodů (PCB printed circuit board).

Nádoby tohoto typu mohou být zvláště užitečné pro provádění PCR in šitu, například na vzorcích tkáně.

Jiné vhodné reakční nádoby jsou trubky a kyvety, známé v oboru.

Vynález dáte poskytuje zařízení pro reakce vyžadující více teplotních stupňů, přičemž uvedené zařízení obsahuje reakční nádobu popsanou výše, prostředky pro vytváření elektrického proudu uvnitř polymeru a řídicí prostředky pro regulaci množství elektrického proudu procházejícího polymerem pro řízení jeho teploty.

Řídicí prostředky jsou s výhodou automatické řídicí prostředky, jako například počítačem řízené interfacové uspořádání. Za pomoci programovatelného ovladače pro elektrický obvod spojený s polymerem může být pomocí zařízení předem naprogramován definovaný topný režim, například definovaný počet cyklů předem stanovených teplotních stupňů, které se mají realizovat po dobu předem stanovených časových intervalů a zdržení, včetně využití různých teplotních a časových profilů s různými reakčními nádobami v témže zařízení v téže době.

Řídicí prostředky mohou zahrnovat zařízení pro monitorování teploty, například termočlánek, který monitoruje teplotu reakční nádoby a dodává tuto informaci do kontrolního systému pro dodržení požadovaného režimu topení a/nebo chlazení.

Alternativně může být teplota polymeru monitorována přímo měřením jeho měrného odporu, například uspořádáním polymerního topného prvku jako odporu v obvodu tvořícím Wheatstonův můstek. Tím odpadá použití jiných zařízení pro měření teploty, například termočlánků.

Volitelně může zařízení dále obsahovat prostředky pro nucené chlazení, například jeden nebo více ventilátorů.

-4CZ 299691 B6

Zařízení může obsahovat množství kontejnerů. Polymer může být vytvořen jako integrální část každého kontejneru, jako pouzdro kolem každého kontejneru nebo může být uspořádán tak, že je vrstva polymeru mezi sousedními kontejnery. Všechny elektrické kontakty na polymeru mohou být připojeny k jednomu elektrickému přívodu, jestliže se provádí více reakcí, které vyžadují stejné teplotní stupně.

Ve výhodném provedení však je zařízení uspořádáno tak, že polymer v kontaktu s kontejnerem nebo skupinou kontejnerů (nebo tvořící kontejner nebo skupinu kontejnerů) je připojen k individuálnímu přívodu, přičemž několik kontejnerů nebo skupin kontejnerů je připojeno k různým, nezávisle řízeným elektrickým přívodům. S tímto uspořádáním se může současně provádět více . různých reakcí vyžadujících různé teplotní stupně, protože každý kontejner nebo skupina kontejnerů má svůj vlastní topný prvek. Toto uspořádání umožňuje uživateli provádět množství reakcí s malými vsázkami za použití jediného zařízení, což za použití existujícího zařízení nebylo možné, Jediné dosavadní zařízení vhodné pro tento typ použití jsou určité konstrukce blokových ohřívačů, které mají mezi 2 a 4 segmenty, které mohou být ohřívány a chlazeny nezáviste. Toto zařízení je však omezeno na použití pro 2 až 4 reakční vsázky a má nevýhodu pomalého cyklu, jak bylo popsáno výše.

Když reakční nádoba obsahuje désticku nebo čip, může zařízení obsahovat destičku nebo čip, elektrický přívod, prostředky pro připojení elektrického přívodu k destičce nebo čipu nebo pro indukování elektrického proudu v polymeru a prostředky pro řízení proudu procházejícího vrstvou polymeru v destičce nebo čipu.

Reakční nádoby a zařízení podle vynálezu mohou být použity v různých situacích, kdy je poža25 dováno provádění chemických nebo biochemických reakcí. Vynález tak dále poskytuje způsob provádění reakce, jako například chemické nebo biochemické reakce, kterýžto způsob zahrnuje ohřívání reakčních činidel v reakční nádobě uvedené výše.

Stejně jako pro amplifikační reakce, jako například již výše zmínění PCR reakce, mohou být nádoby a zařízení podle vynálezu použity pro účely vytváření sekvence nukleové kyseliny a při kinetických studiích enzymů, při kterých se studuje aktivita enzymů při různých teplotách, popřípadě jiných reakcí, zejména reakcí zahrnujících enzymatickou aktivitu, při kterých je třeba udržovat přesnou teplotu. Reakční nádoby podle vynálezu umožňují dosažení přesných teplot a jejich udržování po dobu vhodné časové periody, podle potřeby ji rychle změnit, a to i v mobil35 ním nebo přenosném zařízení podle některých vytvoření vynálezu.

Pro PCR reakce se teplotní podmínky požadované pro dosažení denaturace ochlazení nebo prodloužení, a doba potřebná pro provedení těchto stupňů, mění v závislosti na různých faktorech, jak je v oboru známo. Příklady těchto faktorů zahrnují povahu a délku nukleotidu, který se má amplifikovat. Příklady těchto faktorů zahrnují povahu a délku amplifikovaného nukleotidu, povahu použitých příměrů enzymů. Optimální podmínky může určit pro každý případ odborník v oboru. Typické teploty denaturace jsou řádově 95 °C, typické teploty ochlazení jsou řádově 55 °C a teploty prodlužování 72 °C zpravidla řádově odpovídají. Při použití reakčních nádob a zařízení podle vynálezu mohou být tyto teploty rychle dosaženy a rychlost přechodu mezi teplotami snadno kontrolována.

V mnoha vytvořeních vynálezu lze samozřejmě použít zkoušek pomocí generických DNA srovnávacích barviv a zkušebních genových materiálů specifických pro vlákno, např. zkoušek Taqman^R popsaných v patentu US 5 538 848 a zkoušek materiálů TIRF (Total íntemal Reflection

Fluorescence) popsaných ve WO 93/06241. Při těchto zkouškách se signál ze vzorku, například fluorescenční nebo evanescencní, detekuje pomocí zařízení pro monitorování fluorescence. Když se provádí tento typ procesu, musí být fluorescenční monitorovací zařízení uspořádáno tak, aby bylo schopno detekovat signál vyzařující ze vzorku. V některých případech může být užitečné, jestliže je alespoň část nádoby, například v případě trubky podle vynálezu její konec, opticky čirá, aby bylo možno skrze ni provádět měření. Alternativně může nádoba být opatřena

-5CZ 299691 B6 prostředky pro vedení signálu ze vzorku do monitorovacího zařízení, například optickým vláknem nebo evanescencním vlnovodem.

Přehled obrázků na výkresech

Vytvoření předloženého vynálezu bude nyní popsáno za pomoci příkladu s odkazem na přiložené výkresy, na kterých obr. 1 představuje ohřívač reakční nádoby zahrnující pouzdro z elektricky vodivého polymeru uspořádaného pro upevnění kolem reakční trubky, obr. 2 představuje reakční destičku mající na svém povrchu povlak elektricky vodivého polymeru, obr. 3 představuje reakční destičku mající vrstvu elektricky vodivého polymeru uvnitř kompozitní konstrukce, obr. 4 představuje zařízení pro provádění reakcí zahrnujících více teplotních stupňů, které využí15 · vá pásek elektricky vodivého polymeru pro ohřev kapilární trubky reakční nádoby, obr. 5 představuje schéma zařízení podle vynálezu pro provádění PCR reakce, . obr. 6 představuje termocyklační profil použitý v zařízení podle obr. 5, obr. 7 je schéma přenosného PCR multidetektoru, a obr. 7a je schéma prvku detektoru pro použití v zařízení podle obr. 7.

Příklady provedeni vynálezu

Podle obr. I je pouzdro tvořeno elektricky vodivým polymemím prvkem 2 a opatřeno elektrickými kontakty 3 pro připojení k elektrickému zdroji. Velikost a tvar pouzdra jsou dány rozměry a tvarem reakční nádoby L, pro niž je.pouzdro uzpůsobeno.

Při použití se pouzdro umístí kolem reakční nádoby s níž je v tepelném kontaktu. Kontakty 3 se pak připojí k elektrickému zdroji (neznázoměnému) a polymemím pouzdrem prochází proud, čímž ho ohřívá spolu s reakční směsí v reakční nádobě 1.

Podle obr. 2 obsahuje reakční nádoba 1 destičku povlečenou na jedné straně elektricky vodivým polymerem. Elektrické kontakty 3 jsou uspořádány na jednom konci destičky a jsou v elektrickém spojení s polymemím prvkem 2.

Na obr. 3 obsahuje nádoba i deštičku mající kompozitní konstrukci, ve které je vrstva elektricky vodivého polymeru vložena mezi vrstvami obvyklého materiálu používaného pro výrobu takovýchto destiček, například skla. Elektrické kontakty 3 jsou uspořádány na jednom konci destičky, v elektrickém spojení s polymemím prvkem 2.

Při použití se elektrický zdroj (neznázoměný) připojí k elektrickým kontaktům 3 na destičce znázorněné na obr. 2 a 3 a proud prochází skrze polymemí vrstvu, čímž se ohřívá destička a reakční činidla umístěná na destičce.

Na obr. 4 je reakční nádoba 1, která zahrnuje kapilární trubici. Pásek z elektricky vodivého polymeru ího filmu je obalen kolem kapilární trubice a zajištěn. Pásek polymemího filmu tvořící vodivý prvek 2 je opatřen elektrickými kontakty 3, na které je připojen elektrický zdroj 5 prostřednictvím spojovacích svorek 4.

Při použití proud prochází skrze polymemí film, čímž ohřívá kapilární trubku a reakční činidla umístěná uvnitř kapilární trubky.

-6CZ 299691 B6

Zařízení podle obr. 5 bylo zkonstruováno pro provádění PCR reakcí. Jako reakční nádoba 6 byla použita kapilární trubka s vnitřním průměrem 1,12 mm a vnějším průměrem 1,47 mm. Pásek z elektricky vodivého polymeru byl obalen kolem trubky a zajištěn tak, aby byl přidržován těsně k vnějšímu povrchu trubky. Ohřev se tak provádí ze všech stran trubky, čímž se minimalizuje teplotní gradient napříč vzorkem v trubec.

Ohřev byl zajištěn prostřednictvím elektrického zdroje 8, který byl prostřednictvím interface 9 připojen k počítači Π) pro umožnění automatického řízení topných cyklů. Ventilátorový chladič

11 byl uspořádán pro vedení vzduchu na polymer 7. Pro monitorování teploty byl na vnější straně polymeru 7 uspořádán infračervený termočlánek 12.

Pro účely stanovení výkonu zařízení před použitím byl pro monitorování teploty uvnitř trubky 6 použit termočlánek typu K. Vnitřní a vnější teploty pak byly použity pro lineární přepočet vnější teploty na teplotu vzorku.

Topný polymer je připojen na zdroj 8 energie a obvod je uzavřen pomocí interface 9 a softwaru. Vypínač ]4 uspořádaný pro spojení obvodu bylo rychlé optické relé, které může spínat každých 10 ms. Druhý elektrický obvod byl použit pro řízení dvou malých elektrických ventilátorů 11, zajištujících nucené vzduchové chlazení reakčního vzorku, které mohou pracovat nepřetržitě. Řídicí software byl LabView, kteiý poskytuje uživatelsky přátelský grafický interface pro programování i provoz. Proud byl přiváděn zpočátku s poměrně vysokou frekvencí pro rychlejší dosažení požadované teploty. Po dosažení stanovené pracovní teploty byl proud přiváděn s menší frekvencí, než je požadována pro udržování stanovené provozní teploty po předepsanou dobu.

Zařízení znázorněné na obr. 7 zahrnuje zavírací krabici 70 mající rozdělení vymezující množství reakčních nádob 71 ve formě receptorových okének detektorových prvků. Krabice 70 je znázorněna elektricky připojená prostřednictvím interface 72 ke zdroji 73 energie a řídicímu prostředku

74, kterým je počítač. Připojení je takové, že umožňuje rozdílné napájení každého okénka. Každé okénko obsahuje termočlánek (neznázoměný) pro monitorování teploty uvnitř něho,

Detektorový prvek znázorněný na obr. 7a zahrnuje reakční trubici 75 obklopenou pouzdrem 76. Pouzdro 76 je vytvořeno z polymeru a je připojeno k napájecím koncovkám 77 a 78.

Po naplnění a uzavření trubice 75 byla zasunuta do vhodného okénka až do zaklapnutí koncovek 77 a 78 na příslušných koncovkách v okénku (neznázorněno). Zapojené zařízení je upraveno pro ukazování stavu zapojení každé trubice 75 na obrazovce počítače.

Uzavřením víčka krabice 70 je provedena izolace každého okénka a zachycení každé trubice 75 v jejím okénku.

Počítačový program je upraven pro oddělenou identifikaci hledané molekuly pro každou trubici

75, což je realizováno tak, zeje upraven pro řízení vhodného teplotního cyklu PCR reakcí pro amplifikaci této molekuly, je-Ιί přítomna. Když je tento cyklus ukončen, může být obsah trubice vystaven vhodnému genovému testovacímu detektoru pro určení, zda je hledaná molekula skutečně přítomna.

Princip zařízení, popsaného s ohledem na obr. 7 a 7a, samozřejmě může být realizován různými způsoby. Může být spíše mobilní než přenosný, a může být uspořádán pro přijetí detektorových prvků v jiné formě než ve formě trubice například ve formě destičky. Zpravidla je uspořádán pro zpracování 96 nebo 192 detektorových prvků.

Vynález ilustruje následující příklad.

-7CZ 299691 B6

Příklad

Amplifikace DNA

Za použití přístroje podle obr. 5 s odstraněným termočlánkem typu K byla prováděna následující 5 PCR reakce.

Byl amplifikován amplikon se 100 dvojicemi bází z klonovaného fragmentu Yersinia pestis. Reakční podmínky byly předem optimalizovány pomocí Idaho Rapideycler™ a vzorky stejné reakční směsi byly amplifíkovány v Idaho Rapideycler™ jako kontrolní reakce.

Reakční směs umístěná v trubici (reakční nádoba 6) obsahovala:

50mMTris.HCl pH8,3 3 mM MgCl₂

2,5 mg/ml albuminu hovězího séra 15 vždy 200 /zg/ml dATP, dTTP, dCTP a dGTP vždy 10 /zg/ml PCRprimeru 25 jednotek/ml Taq polymerázy.

Termocyklační profil byl naprogramován na 95 °C po dobu nula sekund, 55 °C po dobu nula 20 sekund, 72 °C po dobu nula sekund, jak je ilustrováno na obr. 6. Pro srovnání byl obdobný termocyklační profil naprogramován do Idaho Rapideycler™, Jak v polymerem pokryté kapilární nádobě 6 tak v Rapideycler™ byl použit reakční objem 50 μ\.

V této souvislosti znamená „po dobu nula sekund“ skutečnost, že jakmile je dosaženo cílové 25 teploty, program velí k zavedení následující teploty. Přesná doba, po kterou se reakce udržuje na cílové teplotě je nicméně závislá na parametrech a vlastnostech použitého zařízení. Obecně však bude menší nezjedná sekunda.

Po 40 cyklech v kapilární nádobě byl 50/zl vzorek PCR produktu z každé reakce frakcionován 30 podle velikosti elektroforézou na agaróze ve 2% gelu v 1 x TAE pufru. DNA byla zviditelněna obarvením pomocí bromidu eth idu. Vzorek byl veden v sousedství vzorku z Idaho Rapideycler™ (25 cyklů) a byl nalezen obdobně správně velký amplikon.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   40 1. Zařízení k provádění chemické nebo biochemické reakce, která vyžaduje více teplotních stupňů, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu reakční nádobu (1, 6, 71) vhodnou pro pojmutí reakčních činidel a umožňující jejich řízené zahřívání, ohřevový prostředek zahrnující elektricky vodivý polymemí prvek (
2. 2), který emituje teplo, když jím prochází elektrický proud, uspořádaný k zahřívání reakční nádoby (1, 6, 71) a řídicí prostředek (10, 74)

   45 pro řízení dodávky elektrického proudu do ohřevového prostředku, přičemž řídicí prostředek (10, 74) je nastaven pro dodávku elektrického proudu zajištující sekvenci různých reakčních teplot reakčních činidel udržovaných v reakční nádobě (1, 6, 71), a ohřevový prostředek je připojitelný k elektrickému zdroji (5, 8, 73) přes řídicí prostředek (10, 74).

   50 2, Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje množinu reakčních nádob (71).
3. 3. Zařízení podle nároku 2, vyznačující se tím, že pro ohřev každé nádoby nebo skupiny nádob (71) mohou být přiváděny různé hodnoty proudu.

   -8CZ 299691 B6
4. 4. Zařízení podle nároku 3, vyznačující se tím, že řídicí prostředek (74) je uspořádán pro přivádění proudu pro různé teplotní a/nebo časové profily pro každou z reakčních nádob (71).
5. 5. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4. vyznačující se < í m, že každá reakční nádoba (1,
6. 6) zahrnuje kontejner pro reakční činidla, přičemž polymerní prvek (2) .) ohřevového prostředkuje ve styku s kontejnerem. / io 6. Zařízení podle nároku 5, v y z n a č u j í c í se tí m , že polymerní prvek(2) ohřevového prostředku tvoří pouzdro kolem kontejneru.
7. 7. Zařízení podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že polymerní prvek (2) ohřevového prostředkuje ve formě fólie,
8. 8. Zařízení podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že pouzdro je integrální s kontejnerem.
9. 9. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8, vyznačující se tím, že polymerní

   20 prvek (2) ohřevového prostředku je perforovaný nebo mřížkovaný.
10. 10. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že polymerní prvek (2) ohřevového prostředku tvoří kontejner pro reakční činidla.

    25
11. 11. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že reakční nádoba (1, 6, 71) zahrnuje kontejner pro reakční činidla, přičemž polymemím prvkem je potažen jeden z povrchů kontejneru.
12. 12. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že

    30 každá reakční nádoba (1, 6) zahrnuje kapilární trubici. .....
13. 13. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že každá reakční nádoba (1) obsahuje destičku.

    35
14. 14. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že reakční A nádoba (l) zahrnuje čip.
15. 15. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 2 až 14, vyznačující se tím, že zahrnuje J množinu reakčních nádob (71) uspořádanou do soustavy. '7

    40 'j
16. 16. Zařízení podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že řídicí í prostředek (10, 74) je uspořádán pro přivádění proudu podle předem stanoveného časového nebo teplotního profilu.

    45
17. 17. Zařízení podle nároku 16, vyznačující se tím, že řídicí prostředek (10, 74) je uspořádaný pro přivádění elektrického proudu pro provádění reakcí vyžadujících více teplotních stadií v reakčních nádobách.
18. 18. Zařízení podle nároku 17, vyznačující se tím, že řídicí prostředek je naprogra50 mován pro automatické provádění vícenásobných cyklů reakce. 4

    A
19. 19. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že j zahrnuje dále prostředek pro detekci signálu ze vzorku v reakční nádobě. v i

    -9CZ 299691 B6
20. 20. Způsob provádění chemické nebo biochemické reakce, která vyžaduje více teplotních stupňů. vyznačující se tím, že zahrnuje umístění reakčních činidel potřebných pro uvedenou reakci do reakční nádoby (1, 6, 71), která zahrnuje ohřevový prostředek obsahující elektricky vodivý polymemí prvek (2), který emituje teplo, když jím prochází elektrický proud; přivádění proudu do uvedeného polymemího prvku pro ohřátí reakčních činidel na první požadovanou teplotu; a následné nastavení proudu pro vytvoření následných teplotních stadií potřebných pro reakci.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že reakcí je amplifikace DNA.
22. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že amplifíkact je polymerázová řetězová reakce (PCR).
23. 23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 20 až 22, vyznačující se tím, že se reakční 15 činidla pro více reakcí umístí do reakčních nádob a ohřívají se zároveň.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že každá reakční nádoba (1, 6, 71) se ohřívá individuálně na teplotu potřebnou pro reakci probíhající v této nádobě.