ES2250965T3 - Agente que contiene una cinasa de serina - treonina, para la terapia de tumores y el diagnostico de tumores. - Google Patents
Agente que contiene una cinasa de serina - treonina, para la terapia de tumores y el diagnostico de tumores.Info
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Abstract
ES UNA PROTEINA PLK, QUE SE CARACTERIZA POR A) LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS REPRESENTADA EN SEQ. ID NO. 1, Y B) VARIANTES DE LA SECUENCIA.
Description
Agente que contiene una cinasa de
serina-treonina, para la terapia de tumores y el
diagnóstico de tumores.
El presente invento se refiere a la utilización
de una cinasa de serina-treonina como componente
activo de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de
tumores o como agente de diagnóstico destinado a su utilización en
el diagnóstico de tumores.
La activación de redes bioquímicas intracelulares
como respuesta a estímulos externos conduce al control coordinado
del crecimiento y de la diferenciación en eucariotas. Las cinasas de
proteínas son conocidas como componentes de muchas rutas de
transducción de señales. En tal contexto, estas cinasas fosforilan a
sus substratos fisiológicos normales y son reguladas en cuanto a su
actividad enzimática por la interacción con otras cinasas y
fosfatasas. La identificación de un gran número de cinasas de
proteínas en muchas células eucarióticas de animales mamíferos,
levaduras y drosófilas hace probable que procesos celulares de
diferenciación y crecimiento sean controlados y regulados por
iguales mecanismos en un amplio espectro de organismos.
En eucariotas todas las cinasas de proteínas
conocidas hasta ahora fosforilan a los
hidroxi-aminoácidos serina, treonina o tirosina. La
fosforilación mediante estas cinasas desempeña un cometido realzado
para el control de la mitosis y de la diferenciación celular.
Receptores para numerosos factores de crecimiento polipeptídicos son
cinasas de tirosina transmembranales, que a su vez fosforilan a
cinasas de serina/treonina tales como la proteína cinasa C, la
cinasa de MAP y la p74raf. El componente principal de la maquinaria
del ciclo celular es la cinasa de serina/treonina p34cdc2, que
originalmente ha sido aislada como producto del gen de la mitosis
cdc2 (de cell division cycle) procedente de Schizosaccharomyces
pombe y CDC28 procedente de Saccharomyces cerevisiae. La actividad
de la p34cd2 es regulada por medio de la interacción con ciclinas.
En la fase G1, que es el comienzo del ciclo celular, la p34cdc2 no
está asociada con ciclinas y no tiene ninguna actividad de cinasa.
Si se abastecen células con suficientes sustancias nutritivas, se
acumula una ciclina de G1, que inicia por asociación la actividad de
cinasa que tiene la p34cdc2. Con esto se sobrepasa el "comienzo
(Start)" y se inicia la transición al ciclo celular (replicación
de ADN, formación del MTOC, de microtubule organizing centre =
centro organizador de microtúbulos). En este caso comienza también
la síntesis de la ciclina B, que entonces se fija a la p34cdc2. Este
complejo es inactivo, puesto que la fijación de ciclina B induce la
fosforilación de p34cdc2 a la tirosina 15, con lo cual se inhibe la
actividad de cinasa. El complejo inactivo, que también se designa
como preMPF (de maturation promoting factor = factor favorecedor de
la maduración), está también fosforilado en la treonina 160. Esta
fosforilación es necesaria para la actividad de MPF, pero no es
suficiente para suprimir el efecto inhibidor de la fosforilación de
tirosina. La subsiguiente desfosforilación de la p34cdc2 durante la
posterior fase G2 del ciclo celular activa al MPF y conduce a la
inducción de la mitosis (fase M). La reacciones posteriores a la
traducción, que están sujetas a un control fisiológico complejo,
desempeñan un cometido esencial para la regulación en el curso del
tiempo de la actividad de MPF. La cinasa de proteína y tirosina wee1
fue aislada originalmente a partir de Schizosaccharomyces pombe, e
inhibe, a través del mecanismo descrito, la entrada en la mitosis,
mientras que el producto del gen cdc25 favorece el comienzo de la
mitosis. Un MPF activo activa a la fosfatasa de tirosina e inhibe a
la cinasa de proteína-tirosina, las cuales modifican
a la p34cdc2 con lo que el MPF es activado totalmente de una manera
explosiva, de modo que las células son impulsadas de manera muy
rápida e irreversible a la mitosis.
Las más recientes investigaciones del ciclo
celular muestran que ciertos reguladores esenciales del ciclo
celular participan en la génesis de cánceres. Esto no es
sorprendente, por cuanto que una proliferación continua de células
es una característica sobresaliente de tumores. Unas modificaciones
en la ciclina A, que se fija tanto a la p34cdc2 como también a la
cinasa de proteína afín a la p34cdc2, pueden provocar la
transformación de células. El gen de la ciclina A es un sitio de
integración para un fragmento del genoma del virus de la hepatitis B
en un hepato-carcinoma humano. Además de esto, la
ciclina A está asociada con la proteína transformadora E1A en
células transformadas por Adenovirus. Posiblemente, la ciclina A es
una proteína diana de E1A, puesto que ella está asociada en la fase
S con el factor de transcripción E2F en un complejo, que tiene una
menor actividad de transcripción que la E2F libre. Otro componente
de este complejo es la p34cdc2. De esta manera se produce la
relación con la expresión de genes. La E1A puede destruir a este
complejo, con lo cual se libera la E2F. Por consiguiente, se pueden
regular determinados genes, que son importantes para el fenotipo
transformado.
Además de esto, existen otras relaciones entre
oncoproteínas, productos de genes supresores de tumores y complejos
de ciclina y p34cdc2. La oncoproteína mos es asimismo una cinasa de
serina/treonina. La proteína c-mos procedente de
Xenopus es un componente del factor citostático, que es necesario
para la estabilización del ciclina B y p34cdc2 activado en huevos de
Xenopus, inhibidos en cuanto a su crecimiento. El cometido de la
proteína mos está sin embargo todavía poco claro, puesto que parece
no fosforilar in vivo al complejo. Por una parte, la
c-mos estabiliza al complejo de ciclina B y p34cdc2
activado, con lo cual las células son inhibidas en su actividad de
mitosis y por otra parte, favorece al ciclo celular. Las
investigaciones efectuadas hasta ahora demuestran la suposición de
que el diferente comportamiento de la maquinaria del ciclo celular
es regulado por la cantidad de la proteína
mos.
mos.
Diferentes oncoproteínas, tales como p. ej. las
cinasas de proteína y tirosina src y abl son fosforiladas, dentro
del marco de la mitosis, asimismo por la cinasa de serina/treonina
p34cdc2. En la familia de la src la fosforilación mitótica está
acompañada por una actividad elevada de cinasa. Los productos de los
genes supresores de tumores RB y p53 forman asimismo complejos con
el de ciclina y p34cdc2, y son fosforilados en este caso. En el caso
de un RB parece ser necesaria la fosforilación, con el fin de
desactivar a la función del RB, de manera tal que las células pueden
progresar desde la fase G1 a la fase S. Como consecuencia de la
expresión aberrante del complejo de ciclina y p34cdc2 resulta que
tales productos de genes supresores de tumores son conservados en su
estado inactivo fosforilado, lo cual tiene como consecuencia la
división celular desenfrenada.
La conexión entre la función de las cinasas de
serina/treonina del ciclo celular y la transformación muestra
manifiestamente que unos insignificantes trastornos de las
evoluciones de las mitosis desempeñan un cometido crítico en la
génesis de cánceres. Puesto que la carcinogénesis se manifiesta como
un proceso de múltiples etapas, unas mutaciones en reguladores del
ciclo celular cooperan con unas mutaciones que activan a los
proto-oncogenes o desactivan a los genes supresores
de tumores.
Como consecuencia de la enorme importancia
clínica de las cinasas de serina-treonina, existía
por consiguiente una necesidad de poner a disposición nuevos
medicamentos y agentes de diagnóstico.
Un objeto del invento es, por lo tanto, un
medicamento destinado a su utilización en la terapia de tumores, que
está caracterizado porque como componente activo contiene una
proteína PLK, que comprende
- (a)
- la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 2 o
- (b)
- partes o/y variantes de la secuencia de (a), que en el plano de los aminoácidos presentan una homología de por lo menos 95% con respecto a la secuencia procedente de (a) y que en lo que se refiere a su actividad biológica o/y inmunológica se corresponden con la proteína que se representa en SEQ ID NO: 1,
o comprende un anticuerpo dirigido
contra tal proteína PLK o un ácido nucleico, que codifica tal
proteína PLK, eventualmente junto con agentes coadyuvantes, de
vehículo, de carga o diluyentes, farmacéuticamente
usuales.
Un objeto adicional del invento es un agente de
diagnóstico para su utilización en el diagnóstico de tumores, o en
el caso de la determinación de la actividad de linfocitos, que está
caracterizado porque como componente activo contiene una proteína
PLK, que comprende (a) la secuencia de aminoácidos que se representa
en SEQ ID NO. 2 o (b) partes o/y variantes de la secuencia de (a),
que presentan en el plano de los aminoácidos una homología de por lo
menos 95% con respecto a la secuencia de (a), y que en lo que se
refiere a su actividad biológica o/y inmunológica se corresponden
con la proteína que se representa en SEQ ID NO. 1, un anticuerpo
contra tal proteína PLK o un ácido nucleico que codifica tal
proteína PLK.
Es asimismo un objeto del presente invento la
utilización de tal proteína PLK o del gen que la codifica o de un
anticuerpo dirigido contra la proteína, dentro del marco del
diagnóstico de tumores. Así, unos experimentos han mostrado que la
expresión del gen de PLK en tumores y en tejidos de referencia
exentos de tumores correspondientes es diferente. Existe por lo
tanto la posibilidad de sacar la conclusión de la actividad para
división de células a partir del nivel de la expresión del gen y
respectivamente de la proteína.
Además, el invento se refiere a un agente de
diagnóstico o terapéutico para su utilización en el diagnóstico de
tumores y respectivamente de la terapia de tumores sobre la base de
un anticuerpo, que está dirigido contra el componente activo de una
proteína PLK, que comprende:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO. 2 o
- (b)
- partes o/y variantes de la secuencia de (a), que tienen en el plano de los aminoácidos una homología de por lo menos 95% con respecto a la secuencia de (a) y que en lo que se refiere a su actividad biológica o/y inmunológica se corresponden con la proteína que se representa en SEQ ID NO. 1,
o un ácido nucleico, que codifica
tal proteína (p. ej. como ácido nucleico antisentido con el fin de
reprimir la expresión del gen). Un agente de este tipo puede
contener eventualmente conocidos agentes diluyentes, de carga, de
vehículo y coadyuvantes
farmacéuticos.
Además, el invento se refiere a la utilización de
un agente de diagnóstico destinado a la determinación de la
actividad de linfocitos. Este medicamento puede ser utilizado p. ej.
extracorporalmente en muestras de sangre extraídas. Este agente de
diagnóstico es especialmente apropiado para la detección de
trastornos del sistema inmunitario, en particular en el caso de
enfermedades autoinmunitarias o de síndromes de deficiencia
inmunitaria, inclusive el
SIDA.
SIDA.
Preferiblemente, la proteína PLK es una proteína
obtenible a partir de un ser humano, es decir que es la proteína
mostrada en SEQ ID NO. 1 y NO. 2 o una variante humana, presente en
la naturaleza, de esta proteína.
La proteína comprende partes de la secuencia de
aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 1 y 2. El invento se
refiere preferiblemente a una proteína PLK, que contiene la
secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 1 y 2, pero
puede contener también variantes de esta secuencia. Por el concepto
de "variante" en el sentido del presente invento han de
entenderse secuencias, que por sustitución, deleción (supresión) y/o
inserción de aminoácidos individuales o de cortos segmentos de
aminoácidos, se diferencian de la secuencia de aminoácidos que se
representa en SEQ ID NO: 1 y 2. Dentro del concepto de
"variante" entran tanto variaciones alélicas presentes en la
naturaleza de la proteína PLK, así como proteínas producidas por una
tecnología de ADN recombinante (en particular mediante una
mutagénesis in vitro con ayuda de oligonucleótidos
sintetizados químicamente), que en lo que se refiere a sus
actividades biológicas o/y inmunológicas se corresponden con la
proteína mostrada en SEQ ID
NO: 1.
NO: 1.
Las proteínas contenidas conforme al invento en
medicamentos y respectivamente agentes de diagnóstico se distinguen
por el hecho de que en el plano de los aminoácidos tienen una
homología de por lo menos 95%, con respecto a la secuencia de
aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 1 y 2.
El gen de PLK (de
polo-like-kinase = cinasa similar a
polo) que aquí se describe, que codifica la proteína PLK contenida
en el medicamento o agente de diagnóstico conforme al invento, fue
aislado a partir de un banco de ADNc, que se basa en una ARN de
tumor de pulmón (carcinoma de epitelio con placas).
Para una investigación por transferencia de
borrones Northern se aisló un ARN a partir de los siguientes tejidos
adultos humanos: de pulmón, hígado, corazón, cerebro, páncreas,
riñón, placenta, músculo del esqueleto, esófago, colon, estómago y
bazo. Solamente en la placenta y en el colon, es decir en tejidos
que contienen un mayor porcentaje de células en proliferación, se
detectó una expresión de la PLK. La longitud del ARNm (ácido
ribonucleico mensajero) de la PLK es de aproximadamente 2,3 kb. A
continuación, se siguió la hipótesis de que la expresión de la PLK
se correlaciona con la proliferación de células: Para esto, se
investigaron tumores humanos, inclusive un tejido de referencia
normal circundante. Una fuerte expresión se encontró en tumores de
los siguientes órganos: pulmón, mama, esófago, estómago e intestino,
así como en leiomiosarcomas y linfomas no de Hodgkin. En un
colectivo de muestras aleatorias de 48 tumores de pulmón, la PLK
estaba grandemente expresada en un 84% de las muestras. En el
restante 16% de los tumores, la PLK se había expresado poco o nada
en absoluto. Las investigaciones por transferencia de borrones
Southern de un ADN restringido procedente de tumores y tejidos de
referencia sanos, no mostraron ninguna diferencia con una sonda
específica para la PLK.
Unas conclusiones acerca del tipo de tumores y
del estado de expresión de la PLK la ofrece la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
| Pulmón: | Positivo | Negativo |
| \hskip0.5cm Carcinoma de epitelio con placas: | 24 | 2 |
| \hskip0.5cm Adenocarcinoma: | 10 | 2 |
| \hskip0.5cm Carcinoma de células grandes: | 6 | 1 |
| \hskip0.5cm Carcinoma de células pequeñas: | 3 | 0 |
| \hskip0.5cm Referencias (pulmón humano adulto): | 0 | 48 |
| \hskip0.5cm Metástasis de hígado: | 1 | 0 |
| \hskip0.5cm Leiomiosarcoma: | 1 | 0 |
| \hskip0.5cm Linfoma no de Hodgkin: | 1 | 0 |
| Mama: | ||
| \hskip0.5cm Carcinoma de mama: | 7 | 1 |
| \hskip0.5cm Referencias (tejido de mama normal): | 0 | 8 |
| Intestino: | ||
| \hskip0.5cm Carcinoma colorrectal: | 3 | 0 |
| \hskip0.5cm Referencias (tejido de colon normal): | 3 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Junto a tejidos humanos y células primarias, se
ensayaron en cuanto a la expresión de la PLK los siguientes linajes
celulares:
Linaje celular HELA (tipo de células: de
carcinoma de cerviz)
Linaje celular de epitelio pulmonar (tipo de
células: de carcinoma de pulmón)
Linaje celular A431 (tipo de células: de
carcinoma epidermoide)
Linaje celular HEP-38 (tipo de
células: de carcinoma hepatocelular),
Linaje celular A498 (tipo de células: de
carcinoma de riñón),
Linaje celular BT20 (tipo de células: de
carcinoma de mama),
Linaje celular T47D (tipo de células: de
carcinoma ductal de mama),
Linaje celular SKBR3 (tipo de células: de
adenocarcinoma de las mamas),
Linaje celular NCF7 (tipo de células: de
adenocarcinoma de las mamas) y
Linaje celular
HUV-EC-C (tipo de células: células
epiteliales de venas de cordón umbilical).
Unos transcritos de PLK eran detectables en todos
los linajes celulares investigados.
Se encontró que la expresión del gen de PLK se
correlaciona con la actividad de proliferación. Por consiguiente, se
establece la posibilidad de emplear la cantidad de productos del gen
de PLK (ARNm o bien proteína) como medida de la actividad para
división de una célula y por consiguiente como marcador de la
proliferación para el análisis de neoplasias humanas. Como se
desprende de la Tabla 1, una expresión aumentada de PLK es
detectable en un tanto por ciento muy alto de los tumores
investigados. Por consiguiente, en el caso de la PLK se trata de un
marcador de la proliferación que se puede emplear
universalmente.
Linfocitos en reposo, procedentes de sangre
periférica, no expresan al gen de PLK. Por adición de PHA (de
PhytoHaemAgglutinin = fitohemaglutinina) o de PHA e
IL-2 (interleucina-2) se estimulan
linfocitos y se llega a la inducción de la expresión de la PLK. Como
consecuencia de ello, la expresión de la PLK se puede tomar también
como una medida de la activación de linfocitos. En un experimento
adicional, el linaje celular A431 se cultiva primeramente en un
medio que contiene suero y luego en un medio exento de suero. La
expresión de la PLK retrocedió en el transcurso de los 5 días sin
suero. Después de la adición de un suero, aumentó de nuevo en gran
manera la expresión de la PLK.
Los macrófagos procedentes de sangre periférica
son células con una actividad para proliferación muy pequeña, si es
que la hay. Dependiendo del donante, los macrófagos no tenían
después de 15 días en cultivo ninguna expresión de la PLK, o tenían
solamente una muy escasa expresión de la PLK. Después de la adición
de un LPS (lipopolisacárido), se desconectó completamente la
expresión de la PLK en el transcurso de 24 horas.
Además se encontró que el pronóstico, en
particular la esperanza de vida de pacientes con tumores, se
correlaciona con la expresión de la PLK. Para esto, se investigó un
mayor colectivo de pacientes con tumores de pulmón y se encontró que
con una expresión creciente de la PLK disminuye la esperanza de vida
de los pacientes. Por consiguiente, la PLK se puede emplear como
marcador para diagnóstico de tumores también para el pronóstico. La
particularidad de la PLK ha de ser vista en el hecho de que una
expresión aumentada aparece en más de un 80% de los pacientes
investigados, por lo que la PLK es un marcador muy bueno de tumores,
que indica con alta probabilidad la presencia de tumores.
La aptitud de la PLK para ser empleada como
marcador de pronóstico, es válida no solamente para tumores de
pulmón, sino también para otros tumores tales como, por ejemplo, un
cáncer de mama, etc.
Un aspecto del invento es por consiguiente un
procedimiento para la determinación de la actividad de división de
células, en particular de células humanas, en el que se determina la
fuerza de expresión del gen que codifica la proteína PLK en la
correspondiente célula, p. ej. en el plano de la trascripción por un
procedimiento de transferencia de borrones Northern o/y en el plano
de las proteínas, mediante determinaciones de la actividad o métodos
inmunológicos. A causa de la correlación antes mostrada de la
expresión de la PLK en tejidos humanos, células primarias y linajes
celulares con la actividad de división de las células, la fuerza de
expresión del gen de PLK es una magnitud de medición apropiada para
determinar el estado de determinadas células en lo que se refiere a
una actividad de división. Este procedimiento realizable
extracorporalmente puede ser de gran utilidad p. ej. en el sector
del diagnóstico de tumores o
inmunitario.
inmunitario.
La secuencia de aminoácidos que se representa en
SEQ ID NO: 1 y 2 representa a la proteína PLK total. Esta proteína
tiene 603 aminoácidos. El gen de PLK, o variantes de éste, se pueden
clonar rutinariamente en un vector, por lo que este vector es
llevado a la expresión en una célula anfitriona apropiada,
resultando la proteína conforme al invento. Células anfitrionas
preferidas son microorganismos, tales como E. coli, o
levaduras, pero también células superiores (p. ej. células de
mamíferos o insectos). Preferidos vectores de expresión son p. ej.
plásmidos, el bacteriófago lambda para procariotas, vectores de
levaduras o vectores víricos para células superiores (p. ej. SV40,
Vaccinia, baculovirus). En lo que se refiere a la expresión del gen
de PLK se debe remitir en particular a los métodos mencionados en la
cita de Sambrook y colaboradores (A Laboratory Manual [Un manual de
laboratorio] (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Además,
la expresión de proteínas de cinasas afines se describe en los
trabajos de Crews, C. M. y colaboradores, (1991), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 8845-8849; Ben-David,
Y. y colaboradores (1991) EMBO J. 10 (2), 317-325;
Parker, L.L. y colaboradores (1991), EMBO J. 10 (5),
1255-1263; Parker, L.L. y colaboradores (1992)
Science 257, 1995-1957; Colemann, T.R. y
colaboradores (1993) Cell 72, 919-929, a cuya
divulgación se hace referencia aquí con esta finalidad.
Una comparación de la secuencia de la PLK con el
banco de datos EMBL proporciona un alto grado de homología con la
familia de las cinasas de serina/treonina. La proteína contenida en
medicamentos y respectivamente agentes de diagnóstico conformes al
invento, es designada a causa de su homología con el gen polo, que
había sido aislado a partir de Drosophila melanogaster, se denominó
como PLK (cinasa similar a polo).
Aparecen características de secuencias
específicas para las siguientes cinasas de proteínas:
- 1.
- El motivo de fijación a ATP:
- GlyLysGlyGlyPheAla.......... (16 aminoácidos).......... Lys
- (aminoácidos 60-86)
- 2.
- Dos de los motivos de aminoácidos situados en el dominio catalítico de las cinasas de proteínas, que están muy conservados en todas las cinasas de proteínas en lo que se refiere a la secuencia de aminoácidos y a la distancia de los motivos entre sí:
| HisArgAspLeu | (AA 174-177) | |
| AspPheGly | (AA 194-196) |
(AA =
aminoácidos).
Además, un objeto del presente invento es un
medicamento o respectivamente un agente de diagnóstico, que contiene
un ácido nucleico, que codifica una proteína PLK contenida conforme
al invento en el medicamento o el agente de diagnóstico, o partes de
la misma. Este ácido nucleico puede ser p. ej. un ADN o ARN
genómico. Preferiblemente, se trata en tal caso, sin embargo, de una
molécula de ADN recombinante.
Además, un objeto del invento es un medicamento o
respectivamente un agente de diagnóstico, que contiene un ácido
nucleico, el cual contiene
- (a)
- la secuencia codificadora que se representa en SEQ ID NO: 1,
- (b)
- una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de (a) dentro del marco de la degeneración del código genético,
- (c)
- una secuencia que se hibrida con las secuencias de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas de hibridación.
Por condiciones rigurosas de hibridación en el
sentido del presente invento, se entiende que una hibridación
aparece también después de lavar a 55ºC, preferiblemente a 62ºC, de
manera especialmente preferida a 68ºC, en un tampón acuoso con bajo
contenido de sal (p. ej. 0,2 x SSC, 0,1% de SDS) (véase también la
cita de Sambrook, J. y colaboradores (1989), Molecular Cloning. A
Laboratory Manual).
El invento se refiere también a medicamentos y
respectivamente agentes de diagnóstico, que contienen ácidos
nucleicos, los cuales contienen un segmento de la secuencia que se
representa en SEQ ID NO: 1 con una longitud de por lo menos 20
nucleótidos. Preferiblemente, este segmento posee una secuencia de
nucleótidos, que es específica para el gen de PLK. Estos ácidos
nucleicos son apropiados en particular para la producción de ácidos
nucleicos antisentido, que se pueden emplear terapéuticamente.
Todavía un objeto adicional del presente invento
es un medicamento y respectivamente un agente de diagnóstico que
contiene un vector, el cual contiene por lo menos una copia de un
ácido nucleico contenido conforme al invento en el medicamento, o
una parte de este ácido nucleico. El vector puede ser replicable en
eucariotas o procariotas. Puede ser un vector integrable en el
genoma de la célula anfitriona (p. ej. un bacteriófago lambda) o un
vector que se presenta extracromosomalmente (p. ej. un plásmido). El
vector se puede obtener por subclonación del gen de PLK en un vector
de base. Tales vectores de base, en particular vectores con los
elementos necesarios para la expresión de proteínas, son habituales
para un experto en la especialidad.
Un objeto adicional del presente invento es un
medicamento y respectivamente un agente de diagnóstico que contiene
una célula, que es transformada con un ácido nucleico antes
mencionado o con un vector antes mencionado. La célula puede ser
tanto una eucariótica como también una célula procariótica. Los
procedimientos para la transformación de células constituyen un
estado general de la técnica, y por lo tanto no necesitan ser
explica-
dos.
dos.
La inhibición del crecimiento de células por
inhibición de la expresión de la PLK se pudo mostrar
experimentalmente mediante construcciones artificiales antisentido y
mediante mutantes dominantes-negativos. Un aspecto
especialmente preferido del presente invento es por lo tanto la
utilización en la terapia génica de los ácidos nucleicos conformes
al invento, en la que estos ácidos nucleicos se administran a un
paciente en una forma replicable (p. ej. en un vector apropiado para
la integración en el genoma), p. ej. con el fin de producir dentro
de la célula ácidos nucleicos antisentido. Alternativamente, los
ácidos nucleicos antisentido se pueden introducir en la célula
también directamente (p. ej. mediante una microinyección).
Finalmente, la proteína PLK, o los fragmentos de
esta proteína, se adecuan para su utilización como inmunógeno para
la producción de anticuerpos. La producción de anticuerpos contra la
proteína PLK se efectúa de un modo usual por inmunización de
animales experimentales con la proteína PLK completa, o con
fragmentos de la misma, y por subsiguiente obtención de los
resultantes anticuerpos (policlonales). De acuerdo con el método de
Köhler y Milstein o sus desarrollos ulteriores, a partir de las
células productoras de anticuerpos contra la PLK de los animales
experimentales, se pudieron obtener anticuerpos monoclonales de una
manera conocida mediante fusión celular. Asimismo, se pueden obtener
anticuerpos monoclonales humanos.
La SEQ ID NO: 7 muestra una secuencia de ácido
nucleico con una longitud de 2.503 pb (pares de bases), que contiene
la zona situada directamente en el lado 5' junto al codón de
iniciación del gen de PLK. Mediante ensayos con la transferasa de
cloramfenicol (CAT) se pudo comprobar que la secuencia indicada
contiene el promotor del gen de PLK. El punto de partida de la
trascripción en SEQ ID NO: 7 está situado en el nucleótido 2.460.
Elementos reguladores positivos del promotor se encuentran dentro de
las zonas situadas entre los nucleótidos 184 y 676 o respectivamente
1.163 y 2.503). Elementos reguladores negativos se encuentran dentro
de la zona situada entre los nucleótidos 676 y 1.163. Estos
elementos reguladores pudieron ser identificados con ayuda de
ensayos de CAT con clones de deleción. Mediante comparación entre
secuencias, se comprobó además que una caja CCAAT situada entre los
nucleótidos 2.407 y 2.411 y dos sitios potenciales de fijación a SP1
están localizados entre los nucleótidos 2.375 y 2.384.
El promotor de PLK tiene la propiedad de que es
activo solamente en células en proliferación. Por lo tanto, éste se
puede emplear en combinación con un gen que es tóxico para las
células (p. ej. con el gen para la toxina de la difteria o el gen
para la toxina del cólera) también para el tratamiento por terapia
génica de tumores. Otra posibilidad de empleo terapéutico la ofrece
el promotor de PLK en combinación con el gen de PLK en una
orientación antisentido. De esta manera, se puede conseguir una
inhibición selectiva del crecimiento de células que se divi-
den.
den.
Se puede emplear conforme al invento, por
consiguiente, también un ácido nucleico que contiene la secuencia
mostrada en SEQ ID NO: 7 o un segmento de la misma, preferiblemente
un segmento con la misma actividad biológica. Este ácido nucleico
puede estar p. ej. en unión operativa con un gen tóxico o con el gen
de PLK en una orientación antisentido o con un segmento de la misma,
que preferiblemente tiene una longitud mayor que 20 nucleótidos.
Estos ácidos nucleicos se pueden emplear en particular para la
terapia génica.
El invento se debe explicar adicionalmente
mediante los protocolos de secuencias y las figuras, desde SEQ ID
NO: 1 hasta SEQ ID NO: 7 y la Fig. 1 juntamente con los siguientes
Ejemplos, sin que en tal caso tenga que ser restringida la extensión
del invento.
Muestran:
- SEQ ID NO: 1
- una secuencia de ácido nucleico con una longitud de 2.124 pb que contiene la información genética que codifica el gen de PLK,
- SEQ ID NO: 2
- la secuencia de aminoácidos con una longitud de 603 AA de la proteína PLK,
- SEQ ID NO: 3
- la secuencia de ácido nucleico del cebador de oligonucleótidos P6 DEA
- SEQ ID NO: 4
- la secuencia de ácido nucleico del cebador de oligonucleótidos Eco HRLD
- SEQ ID NO: 5
- la secuencia de ácido nucleico del cebador de oligonucleótidos P12 T+,
- SEQ ID NO: 6
- la secuencia de ácido nucleico del cebador de oligonucleótidos RAF2 y
- SEQ ID NO: 7
- la secuencia de ácido nucleico con una longitud de 2.503 pb del promotor de PLK, y
- La figura 1:
- la tasa de supervivencia después de una operación quirúrgica de pacientes con cáncer de pulmón en función de la expresión de la PLK.
- 1.1
- Se aisló conforme al procedimiento de Chirgwin y colaboradores (Biochemistry 18 (1979), 5294) un ARN procedente de un tejido de tumor de pulmón humano. Con este ARN se llevó a cabo una síntesis de ADNc mediada por oligo (dT).
Las condiciones de reacción fueron como
sigue:
- 50 mmo/l de Tris/HCl, de pH 8,3 (22ºC)
- 75 mmol/l de KCl
- 10 mmol/l de ditiotreitol (DTT)
- 3 mmol/l de MgCl_{2}
- 500 \mumol/l de una solución de dNTP
- 0,2 \mumol del cebador de oligonucleótidos P12T+ con la secuencia de ácido nucleico que se representa en SEQ ID NO: 5
- 3,0 \mug de un ARN total
- 100 \mug/ml de albúmina de suero bovino
- 10 unidades de una transcriptasa inversa (procedente del virus de leucemia murina de Moloney)
La anterior mezcla de reacción se incubó durante
una hora a 37ºC en un volumen de reacción de 20 \mul.
- 1.2
- La
amplificación del ADNc procedente de 1.1 se efectuó con dos
cebadores Eco HRDL y P6 DEA complementarios con regiones muy
conservadas de genes de PTK. La secuencia de ácido nucleico del
cebador P6 DEA se indica en SEQ ID NO: 3. La secuencia de Eco HRDL
está representada en SEQ ID NO: 4 (esta secuencia es homóloga con
los nucleótidos 588 hasta 601 de la secuencia
\hbox{que se representa en SEQ ID NO: 1.}
Condiciones de reacción:
- 8,3 mmol/l de Tris/HCl, de pH 8,8 (22ºC)
- 41,7 mmol/l de KCl
- 1,25 mmol/l de MgCl_{2}
- 0,01% de gelatina
- 166,7 \mumol/l de una solución de dNTP
- 0,6 \mumol/l de los cebadores P6 DEA y Eco HRDL
- 5 unidades de la polimerasa de Taq
- 10 \mul de la tanda de síntesis de ADNc.
El volumen de reacción era de 60 \mul. Las
condiciones para un ciclo de PCR (reacción en cadena de polimerasa)
fueron como sigue:
- desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto,
- hibridación a 40ºC durante 2 minutos,
- elongación a 72ºC durante 3 minutos.
En total se llevaron a cabo 40 ciclos.
El material amplificado formado se separó por
electroforesis en un gel de agarosa al 2% con el fin de realizar
la purificación, y el ADN se eluyó eléctricamente en el intervalo de
longitudes de aproximadamente 190 pb a 220 pb y se amplificó de
nuevo en las condiciones antes indicadas durante 30 ciclos. Los
productos de PCR, así obtenidos y purificados, se digirieron a
continuación con la endonucleasa de restricción EcoRI y se clonaron
en el vector Bluescript-KS (de Stratagene), asimismo
disociado con EcoRI.
De esta manera se aisló y secuenció un fragmento
de ADN con una longitud de 199 pb (Sambrook, J. y colaboradores,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989). La secuencia de ácido nucleico de este fragmento
de ADN corresponde a los nucleótidos 588 hasta 787 de la secuencia
que se representa en SEQ ID NO: 1.
Se estableció un banco de ADNc a partir de un ARN
poli A+ de un tejido de tumor de pulmón humano con 1,8 x 10^{6}
clones recombinantes. El aislamiento del ARNm se efectuó de acuerdo
con Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 1408). La
clonación del ADNc se efectuó de acuerdo con Gubler y Hoffman (Gene
25 (1983), 263). Este banco de genes se exploró mediante una sonda
de ADN. La sonda de ADN. La sonda de ADN se produjo mediante una
PCR. Como cebador para la PCR se utilizó el oligonucleótido RAF2. La
secuencia de ácido nucleico para el RAF2 se representa en SEQ ID NO:
6 (esta secuencia corresponde a los nucleótidos 746 hasta 767 de la
secuencia que se representa en SEQ ID NO: 1).
Condiciones de reacción:
- 20 ng de un inserto de PLK (procedente del Ejemplo 1)
- 10 mmol/l de Tris/HCl, de pH 8,8 (22ºC)
- 50 mmol/l de KCl
- 1,5 mmol/l de MgCl_{2}
- 0,01% de gelatina
- 0,8 \mumol/l de \alpha32P-dCTP (6.000 Ci/mmol)
- 0,8 \mumol/l de dATP/dGTP/dTTP
- 0,2 \mumol/l del cebador RAF2
- 2,5 unidades de la polimerasa TAQ.
El volumen de reacción era de 25 \mul. La
realización de la reacción se efectuó en 20 ciclos en las
condiciones de PCR antes mencionadas (en el Ejemplo 1).
Para la detección de un clon positivo, un ADNc
(complementario) procedente del banco de genes se inmovilizó en
filtros y se hibridó con la sonda de ADN marcada radiactivamente (1
x 10^{6} dmp/ml de una solución con una actividad específica de la
sonda de 5 x 10^{9} dpm/\mug de ADN). La temperatura de
hibridación era de 42ºC.
Solución para hibridación:
- 5 x SSC
- 0,02 mol/l de Tris/HCl, de pH 7,6 (22ºC)
- 1 x de solución de Denhardt
- 10% de sulfato de dextrano
- 0,1% de SDS
- 100 \mug/ml de un ADN de esperma de arenque
- 50% de formamida
Como solución de lavado se empleó 2 x SSC, con
0,1% de SDS a una temperatura de lavado de 42ºC.
Se encontró y caracterizó un clon positivo. Éste
contenía la secuencia de ácido nucleico que se representa en SEQ ID
NO: 1.
1 x 10^{4} células A431 se sembraron y se
dejaron crecer durante 2 a 3 días hasta una confluencia de 95%.
Luego, el cultivo se mantuvo en un medio RPMI 1640 con un suero de
ternero fetal al 0,5% durante 24 horas. Por cada célula se
inyectaron mediante una microinyección de 1 a 2 x 10^{-12} ml de
un líquido con 2 \mug/\mul de un ARN antisentido de TKF. Este
ARN antisentido de TKF se preparó por transcripción de la secuencia
mostrada en SEQ ID NO: 1 en una orientación inversa con una
polimerasa de ARN de T3 o T7.
Las células se mantuvieron adicionalmente en un
medio RPMI 1640 con 0,5% o 10% de un suero de ternero fetal. Después
de 18 horas, las células se pulsaron durante 3 a 4 horas con
^{3}H-timidina (0,5 \muCi/ml; Amersham) durante
3 a 4 horas. Después de haber lavado con una solución salina
tamponada con fosfato (PBS) se efectuó una fijación en
formaldehído-PBS al 3,5%, luego un cubrimiento con
una emulsión de película (NTP-2, Kodak) y una
incubación durante 48 horas con el fin de efectuar el revelado. Las
células se tiñeron de acuerdo con Giemsa, se recontaron y se
fotografiaron. Se mostró que mediante adición del ARN antisentido se
pudieron inhibir la expresión de la PLK y el crecimiento de las
células.
Se comprobó que en el caso de pacientes de
tumores de pulmón, operados quirúrgicamente, existe una inequívoca
correlación de la expresión de la PLK con la duración de la
supervivencia de los pacientes. Se encontró que los pacientes con
alta expresión de la PLK mueren esencialmente más temprano que los
del grupo comparativo con una pequeña expresión de la PLK.
Los resultados de este experimento se indican en
la siguiente Tabla 2. Para el análisis de la expresión de la PLK, el
ARNm procedente del tejido de tumor del respectivo paciente se
investigó mediante un análisis por transferencia de borrones
Northern. Los valores indicados en la Tabla 2 están normalizados en
lo que se refiere a la expresión de ARNm de actinas. La duración de
la supervivencia de los pacientes después de la operación quirúrgica
se indica en meses. El símbolo "*" significa que el paciente
vivía todavía en el momento indicado.
| Paciente Nº | Edad/sexo | Estadio | Tumor | Duración de la supervivencia | Expresión de la |
| tumoral | después de una operación | PLK | |||
| Carcinoma de células | |||||
| de epitelios con placas | |||||
| 1 | 71m | II | 10 | 3,79 | |
| 2 | 71m | III | *28 | 0,48 | |
| 3 | 60m | III | 5 | 1,02 | |
| 4 | 54m | III | 19 | 1,12 | |
| 5 | 61m | I | 17 | 0,36 | |
| 6 | 67m | ¿ | 24 | 0,15 | |
| 7 | 70m | I | 35 | 0,90 | |
| 8 | 69m | II | *41 | 0,08 | |
| 9 | 72m | I | *37 | 0,67 | |
| 10 | 67m | III | *55 | 0,35 | |
| 11 | 66m | II | 10 | 0,13 | |
| 12 | 57m | I | *31 | 0,10 | |
| 13 | 61m | I | 4 | 6,94 | |
| 14 | 64m | I | 7 | 1,90 | |
| 15 | 42m | II | 27 | 0,28 | |
| 16 | 70m | I | 0 | 3,84 | |
| 17 | 54m | II | 25 | 4,66 | |
| 18 | 61m | II | 12 | 1,99 | |
| 19 | 67m | I | 7 | 1,14 | |
| 20 | 70m | II | 0 | 3,75 | |
| 21 | 53f | I | *38 | 1,41 | |
| 22 | 36m | II | *37 | 8,57 | |
| 23 | 75m | I | 4 | 2,01 |
TABLA 2
(continuación)
| Paciente Nº | Edad/sexo | Estadio | Tumor | Duración de la supervivencia | Expresión de la |
| tumoral | después de una operación | PLK | |||
| Adenocarcinoma | |||||
| 24 | 77f | I | *38 | 0,31 | |
| 25 | 56m | II | *32 | 0,73 | |
| 26 | 56m | III | 13 | 2,14 | |
| 27 | 71m | III | 2 | 13,1 | |
| 28 | 72m | I | *32 | 1,04 | |
| 29 | 54m | III | 14 | 0,94 | |
| 30 | 60m | I | 26 | 1,34 | |
| 31 | 70m | I | 38 | 0,96 | |
| 32 | 43m | I | *32 | 4,12 | |
| Carcinoma de | |||||
| células grandes | |||||
| 33 | 62m | III | 26 | 3,97 | |
| 34 | 66m | I | *44 | 14,8 | |
| 35 | 66f | III | 2 | 32,3 | |
| 36 | 64m | I | 2 | 11,0 | |
| 37 | 40m | I | *36 | 17,9 | |
| 38 | 53f | III | 0 | 5,50 | |
| Carcinoma de | |||||
| células mixtas | |||||
| 39 | 61m | I | 4 | 0,10 | |
| 40 | 57m | II | 0 | 3,34 | |
| 41 | 49m | I | 3 | 0,33 | |
| Carcinoma | |||||
| bronquioalveolar | |||||
| 42 | 76f | I | *43 | 0,40 | |
| 43 | 77f | I | *44 | 0,12 | |
| 44 | 77f | II | *48 | 0,02 | |
| 45 | 57m | I | *42 | 0,12 | |
| Cáncer de pulmón | |||||
| de células pequeñas | |||||
| 46 | 77m | III | 13 | 0,55 | |
| 47 | 62m | I | 10 | 6,23 | |
| 48 | 63m | III | 18 | 11,2 | |
| 49 | 58m | I | *35 | 11,2 | |
| 50 | 63m | II | 13 | 0,04 | |
| Leiomiosarcoma | |||||
| en el pulmón | |||||
| 51 | 46m | III | 12 | 0,42 |
La Fig.1 muestra la correspondiente valoración
estadística según Kaplan-Meier de los datos de los
pacientes (E.L. Kaplan y P. Meyer J. Am. Stat. Assoc. 53 (1958),
457-481). La Curva 1 muestra la tasa de
supervivencia posterior a la operación quirúrgica de 23 pacientes
con cáncer de pulmón con una expresión de PLK > 1 (normalizada en
cuanto a una actina).
La Curva 2 muestra la tasa de supervivencia de 28
pacientes con cáncer de pulmón con una expresión de la PLK
normalizada absoluta < 1. A partir de la Fig. 1 puede observarse
que los pacientes con alta expresión de la PLK mueren esencialmente
antes que los pacientes en el grupo comparativo con menos expresión
de la PLK.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Paul-Ehrlich-Strasse 42-44
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Frankfurt
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 60596
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA SOLICITUD: Clonación de un nuevo miembro de la familia de las cinasas de serina y treonina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DO/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release & 1,0, versión #1,25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.124 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 65... 1873
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 603 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.503 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Medicamento para su utilización en la terapia
de tumores,
caracterizado porque
como componente activo contiene una proteína PLK,
que comprende
- (a)
- la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 2, o
- (b)
- partes o/y variantes de la secuencia de (a), que tienen en el plano de los aminoácidos una homología de por lo menos 95% con respecto a la secuencia de (a), y que en lo que se refiere a su actividad biológica o/y inmunológica se corresponden con la proteína que se representa en SEQ ID NO: 1,
o un anticuerpo dirigido contra tal
proteína PLK, o un ácido nucleico, que codifica tal proteína PLK,
eventualmente en común con agentes coadyuvantes, de vehículo, de
carga o diluyentes farmacéuticamente
usuales.
2. Agente de diagnóstico para su utilización en
el diagnóstico de tumores o en la determinación de la actividad de
linfocitos,
caracterizado porque
como componente activo contiene una proteína PLK,
que comprende
- (a)
- la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO: 2, o
- (b)
- partes o/y variantes de la secuencia de (a), que tienen en el plano de los aminoácidos una homología de por lo menos 95% con respecto a la secuencia de (a) y que en lo que se refiere a su actividad biológica o/y inmunológica se corresponden con la proteína que se representa en SEQ ID NO: 1,
un anticuerpo dirigido contra tal
proteína PLK, o un ácido nucleico, que codifica tal proteína
PLK
3. Medicamento y respectivamente agente de
diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque
contiene una proteína PLK, que es obtenible a
partir de un ser humano.
4. Medicamento y respectivamente agente de
diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque
contiene una secuencia de ácido nucleico, que es
una molécula de ADN recombinante.
5. Medicamento y respectivamente agente de
diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones
preceden-
tes,
tes,
caracterizado porque
comprende un ácido nucleico, que contiene
- (a)
- la secuencia codificadora de proteína que se representa en SEQ ID NO: 1
- (b)
- una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de (a) en el marco de la degeneración del código genético, o
- (c)
- una secuencia que se hibrida con las secuencias de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas de hibridación.
6. Medicamento y respectivamente agente de
diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones
preceden-
tes,
tes,
caracterizado porque
contiene un ácido nucleico, el cual contiene un
segmento con una longitud de por lo menos 20 nucleótidos de la
secuencia que se representa en SEQ ID NO: 1.
\newpage
7. Medicamento y respectivamente agente de
diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, para
la determinación de la actividad de linfocitos en el caso de
trastornos del sistema inmunitario, en particular en el caso de
enfermedades autoinmunitarias o de síndromes de deficiencia
inmunitaria.
8. Medicamento y respectivamente agente de
diagnóstico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, para
su utilización en la terapia génica.
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