ES2250376T3 - Procedimiento de extraccion indirecta del adn de organismos no cultivables. - Google Patents
Procedimiento de extraccion indirecta del adn de organismos no cultivables.Info
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Abstract
Procedimiento de extracción indirecta de ADN diana de organismos no cultivables contenidos en una muestra medioambiental según el cual: u se tritura en medio líquido dicha muestra; u se recupera el triturado obtenido; u se separan los organismos del resto del triturado mediante sedimentación en almohadilla de densidad superior a 1; u se recuperan los organismos aislados en la superficie de la almohadilla que se incluyen en un bloque de agarosa; u se extrae el ADN mediante lisis en el bloque de agarosa; u se coloca el bloque en un gel de agarosa que se somete a al menos una electroforesis de campo alterno; u finalmente, se recuperan las hebras de ADN extraídas.
Description
Procedimiento de extracción indirecta del ADN de
organismos no cultivables.
La invención se refiere a un procedimiento de
extracción indirecta de ADN, en particular de fragmentos de ADN de
tamaños superiores a 300 kB, de organismos no cultivables contenidos
en una muestra medioambiental. Se refiere igualmente al ADN, en
particular el de tamaño superior a 300 kB, susceptible de ser
obtenido mediante el procedimiento, y también se refiere a una
librería de ADN constituida por los fragmentos de ADN extraídos
mediante dicho procedimiento.
En el campo de la búsqueda de moléculas activas,
y especialmente de nuevos antibióticos, aminoácidos, enzimas,
vitaminas, se proponen distintos métodos, cuyo principio reposa
sobre el cribado de los metabolitos producidos por organismos que
proceden de distintos ambientes. Así, productos de primera
importancia con actividades antibiótica, anticancerígena o
plaguicida se han aislado de microorganismos como por ejemplo
Streptomyces, Nocardia o Actinoplanes, etc.
El suelo y los sedimentos constituyen ambientes
importantes para la búsqueda de nuevos metabolitos activos, no solo
en virtud de la cantidad muy importante de microorganismos que
contienen, sino también debido a la importante diversidad de estos
microorganismos. Se sabe que el suelo puede contener de 10^{9} a
10^{11} bacterias por gramo, de los cuales un máximo de 1% son
cultivables sobre un medio sintético (véase AMANN R.I., Ludwig W.,
Schleifer KH (1995) "Phylogenetic identification and in
situ detection of individual microbial cells without
cultivate" Microbiological review vol 59 nº 11
143-169; Whitman WB, Coleman DC., Wiebe WJ. 1998.
Prokaryotes: the unseen majority Proceeding National Academy of
Science USA, Vol 95: 6578-6583).
Por otra parte, el número de especies bacterianas
por gramo de suelo se evalúa de 1.000 a 10.000. En efecto, mediante
técnicas de reasociación ADN-ADN, los resultados
indican que la diversidad genética de los microorganismos es
seguramente superior a 4.000 especies por muestra de suelo (Torsvik
et al. 1990, Applied Environmental Microbiology, 56:
782-787). Basándose todavía en metodologías que no
implican el cultivo in vitro de los microorganismos, Torsvik
V, Goksoyr J., Daae FL., Sorheim R., Michalsen J., Salte K. 1994, p.
39-48 en Beyond the Biomass, K. Ritz, J. Dighton y
K.E. Giller (eds), John Wiley and Sons, Chichester indican que la
diversidad de las especies bacterianas puede alcanzar 13.000
especies por 100 g de suelo. Así, estimando a 10^{10} células
bacterianas por gramo de suelo, una especie bacteriana debe estar
representada por una media de 10^{6} células, incluso para las
especies más extrañas.
Por otra parte, se detectaron las bacterias en un
gran número de ambientes, desde la estratosfera hasta el más
profundo de los abismos, incluyendo los medios más extremos en
términos de condiciones físico-químicas. Así, la
diversidad bacteriana se explica mediante una diversidad de
localización de las poblaciones de bacterias, primero a nivel de los
macromedioambientes que han colonizado, pero también a nivel de los
micromedioambientes que caracterizan por ejemplo y de forma no
limitativa la estructuración de los suelos como se describe por
Ranjar L., Poly F., Combrisson J, Richaume A., Nazaret S. 1998. A
single procedure to recover DNA from the surface or inside
aggregates and in various fractions of soil suitable for
PCR-based assays of bacterial communities. European
Journal of Soil Biology, 34 (2), 89-97.
Un gran número de estudios que se refieren a la
diversidad de bacterias, basados en el análisis de los genes de ADN
ribosómico ADNr16S, da a conocer la presencia de numerosos nuevos
tipos que pertenecen a los campos de las Arcaebacterias, pero
también de las bacterias. El número de divisiones bacterianas
identificadas se ha triplicado en 10 años. Así, la gran diversidad
de bacterias del suelo sigue siendo desconocida. Está poco
considerada en los trabajos de búsqueda científicos, no es
accesible, y por lo tanto no se explota a nivel industrial.
Uno de los objetivos perseguidos es acceder a
este enorme potencial extrayendo el ADN del 99% de bacterias no
cultivables restantes.
Para ello, una primera solución consiste en
mejorar los medios de cultivo aumentando los conocimientos sobre la
fisiología de las bacterias a fin de hacerlas cultivables y por lo
tanto disminuir el número de bacterias no cultivables. Tal técnica
se ha llevado a cabo desde el origen de la microbiología y ha dado
muy buenos resultados. En efecto, se han descrito aproximadamente
5.000 microorganismos, teniendo en cuenta todos los ambientes.
Asimismo, se han caracterizado más de 40.000 moléculas y
aproximadamente la mitad presentan una actividad biológica. Sin
embrago, tal técnica presenta el inconveniente de ser relativamente
lenta y fastidiosa.
Otra solución consiste en extraer directamente el
ADN de los organismos no cultivables a partir de distintos ambientes
mediante lisis química y/o enzimática tal como se describe por
ejemplo en los documentos
US-A-5.824.485, WO 97/12991, o
también SUAU ANTONIA et al "Direct analysis of genes
encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel
molecular species within the human gut" APPLIED AND ENVIRONMENTAL
MICROBIOLOGY, Vol. 65, nº 11, Noviembre de 1999, páginas 4799 y
4807, y ROCHELLE P.S. et al "A simple technique for
electroelution of DNA from environmental samples" BIOTECHNIQUES,
Vol. 11, nº 6, 1991, páginas 724, 726-728. Los
ambientes considerados son de tipo acuático lo que obliga a una
concentración de las células bacterianas como ilustran los trabajos
de Stein J.L., Marsh T.L., Wu K.Y., Shizuya H. y deLong E., 1996 -
Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis
of 40-kilobas-pair genome fragment
from a planktonic marine archaeon, Journal of Bacteriology, 178:
591-599, o de tipo terrestre.
Uno de los principales inconvenientes que
presenta esta técnica de extracción directa es que conduce a la
extracción de ADN de pequeño tamaño únicamente, del orden de 1 a 23
kB como máximo. En efecto, las limitaciones
físico-químicas impuestas al ADN durante este tipo
de experimentación conducen a su degradación. Frostegard A.,
Courtois S. Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le gall F., Jeannin
P., Nesme X., Simonet P. 1999. Quantification of bias related to the
extraction of DNA directly from soils. APPLIED AND ENVIRONMENTAL
MICROBIOLOGY, VOL 65 (12): 5409-5420, muestran
claramente que la mejora de los rendimientos de extracción de ADN
especialmente mediante técnicas de trituración o de sonicación lleva
a una fuerte degradación del ADN recuperado.
Además, el ADN extraído comprende el ADN
extracelular contenido en el suelo, pero también el ADN eucariótico
(hongos, células vegetales, células animales) y procariótico
(bacterias), y los demás organismos presentes en el suelo
(protozoos, etc.). Resulta que las librerías de ADN obtenidas están,
a menudo, fuertemente contaminadas mediante clones bacterianos
recombinantes que contienen ADN no deseado (eucariótico, ADN
extracelular degradado). Por otra parte, las librerías así
constituidas se caracterizan mediante insertos de ADN de tamaño
pequeño (menos que 30 kb). Por lo tanto, estas librerías no son
adecuadas para aplicaciones tales como el análisis de genomas o de
metagenomas completos, o también la búsqueda, el estudio y la
explotación de vías metabólicas completas o casi completas.
Debido a la dilución de los ADN diana por los ADN
no-diana, es indispensable amplificar selectivamente
la proporción del ADN diana mediante PCR para constituir librerías
de ADN cualificadas, como se describe en el documento de SUAU citado
anteriormente. Este enfoque presenta la principal limitación de
poder acceder solo a una información genética similar a la ya
conocida, excluyendo por lo tanto el acceso a secuencias de ADN
totalmente nuevas y originales. Sin embargo, el uso de cebadores de
PCR definidos en regiones muy conservadas permitió aislar genes de
interés que pertenecen a bacterias no aisladas como se describe por
ejemplo por Seow K., Meurer G., Gerlitz M.,
Wendt-Pienkowski E., Hutchinson C.R. y Davies J.,
1997 - A study of iterative type II Polyketide Synthases, using
bacterial genes cloned from soil DNA: a means to access and use
genes from uncultured microorganisms., Journal of Bacteriology, 179:
7360-7368.
Se han desarrollado otros métodos de selección.
Estos métodos consisten en someter la comunidad bacteriana a una
presión de selección permitiendo el enriquecimiento de poblaciones
bacterianas determinadas. Se espera así acceder preferentemente a la
información genética buscada. También se han descrito otras
selecciones basándose en la composición del ADN (% GC) o su
complejidad, como por ejemplo en el documento WO 99/45154.
Un objetivo de la invención es por lo tanto
desarrollar un procedimiento simple que permita extraer, purificar,
separar y extraer fragmentos de ADN de gran tamaño, particularmente
superior a 300 kb, de organismos no cultivables y principalmente de
bacterias. La obtención de estos ADN de gran tamaño así purificados
y extraídos, es una condición sine qua non para producir
librerías de ADN genómico y metagenómico que son adecuadas en el
campo de aplicación.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un
procedimiento que permita purificar, separar y extraer el ADN diana
libre de cualquier contaminación de ADN, especialmente eucariota o
del ADN extracelular degradado, con el fin de preparar librerías
adecuadas.
Otro objetivo de la invención es poder aplicar el
procedimiento desarrollado sobre numerosas muestras
medioambientales, y en particular, pero de forma no limitativa, los
vegetales, los insectos, por ejemplo los artrópodos, los moluscos,
las esponjas, los crustáceos, los platelmintos, los nemátodos, los
bioreactores tales como las biopelículas, fermentadores, lodos
activados y más generalmente los medios acuáticos, pero igualmente
muestras biológicas animales (por ejemplo el estiércol de cerdo,
bolo alimentario de la panza) o humanas.
Con referencia a este último ambiente, el
documento EP-A-0.939.118 describe un
método de extracción directa de ADN y de ARN a partir de heces,
según el cual la materia se mezcla en medio detergente antes de ser
sometida a la extracción propiamente dicha del ADN y del ARN en un
disolvente apropiado. No se da ninguna indicación haciendo
referencia al tamaño del ADN extraído, pero se puede esperar extraer
fragmentos pequeños. Además y al igual que anteriormente, se observa
una contaminación del ADN diana mediante ADN eucariota.
Por lo tanto, el objetivo de la invención es
proporcionar un procedimiento de extracción indirecta del ADN diana
de organismos no cultivables contenidos en muestras
medioambientales, que permite obtener fragmentos de ADN específicos
y de tamaño superior a 300 kb susceptibles de ser clonados mediante
técnicas usuales conocidas por el experto en la materia. De hecho,
este ADN permitirá la constitución de librerías de ADN adecuadas,
ofreciendo una mejor representatividad de los genomas o de los
metagenomas considerados.
Para ello, la invención da a conocer un
procedimiento de extracción indirecta de ADN diana de tamaño
superior a 300 kb de organismos no cultivables contenidos en una
muestra medioambiental según el cual:
- \bullet
- dicha muestra se tritura en medio líquido;
- \bullet
- se recupera el triturado obtenido;
- \bullet
- se separan los organismos del resto del triturado mediante sedimentación sobre almohadilla de densidad superior a 1;
- \bullet
- se recuperan los organismos aislados en la superficie de la almohadilla, y se introducen en un bloque de agarosa;
- \bullet
- se extrae el ADN mediante lisis en el bloque de agarosa;
- \bullet
- se coloca el bloque en un gel de agarosa que se somete a al menos una electroforesis de campo alterno;
- \bullet
- finalmente, se recuperan las hebras de ADN extraídas.
Se constató que la separación anterior de los
organismos del resto del triturado mediante sedimentación sobre
almohadilla de densidad, y la lisis posterior de estos organismos
directamente en un bloque de agarosa permitía separar y obtener,
gracias a la utilización de una electroforesis de campo pulsado,
fragmentos de ADN de tamaño superior a 300 kb. En efecto, esta
manera de proceder permite no manipular nunca directamente el ADN,
evitando así cualquier degradación debida a fenómenos de
limitaciones mecánicos o enzimáticos. Además, el procedimiento de la
invención permite una purificación selectiva e importante de los
fragmentos de ADN buscados liberándose de las inevitables perdidas
de ADN relacionadas con los métodos clásicos de purificación
(extracciones orgánicas, precipitaciones, métodos de intercambio de
ion, etc.). Además, para no alterar la integridad de los fragmentos
de ADN, particularmente en el caso de fragmentos de ADN de gran
tamaño, o para no afectar las eficiencias de clonación posteriores,
las etapas de preparación de los fragmentos de ADN se efectúan
ventajosamente sin ningún agente de intercalado (bromuro de etidio,
etc.), ni visualización con UV.
Con referencia a la etapa de separación de los
organismos del resto del triturado, la elección de la densidad de la
almohadilla se hará en función de la densidad del organismo que se
debe separar de los otros constituyentes del triturado. Así, cuando
se trata de separar la fracción bacteriana del resto de los
orgánulos y detritus, se sabe que ésta presenta, en función de las
especies, una densidad que puede variar de 1 a 1,4. Según los casos,
la densidad de las almohadillas utilizadas se ajustará con el fin de
optimizar la separación de la fracción bacteriana de los otros
constituyentes del triturado.
En una forma de realización preferida, la etapa
de separación de los organismos va seguida de una etapa de
centrifugación sobre gradiente de densidad isopícnica, permitiendo
así separar los organismos en función de su densidad.
Por otra parte y según una característica
ventajosa del procedimiento de la invención, la etapa de
sedimentación se acelera mediante centrifugación.
La técnica de electroforesis de campo alterno es
perfectamente conocida por el experto en la materia y se describe
más particularmente en los documentos
US-A-5.135.628 y en la publicación
"le technoscope de biofutur" nº 127 de octubre de 1993, de
manera que no se repetirá su principio.
Ventajosamente, las hebras de ADN separadas y
purificadas al final de la etapa de electroforesis de campos
alternados (en lo sucesivo denominada primera migración
electroforética) se someten a una etapa de restricción enzimática
seguida de al menos una electroforesis de campo alterno (segunda
migración electroforética). En este caso, la primera migración
electroforética se utiliza para extraer los fragmentos de ADN de
gran tamaño y separarlos de los restos celulares. En la practica,
las zonas de gel que contienen los ADN de tamaño deseado (por
ejemplo superior a 300 kb) se cortan en una medida preparativa. Los
fragmentos de ADN incluidos en los bloques de agarosa así obtenidos
se someten entonces a una restricción enzimática directamente en el
bloque de agarosa o, eventualmente, tras la extracción del ADN de la
agarosa. Los bloques de agarosa que contienen los ADN digeridos se
colocan entonces nuevamente en un gel de agarosa y se someten a al
menos una migración electroforética, permitiendo separar y purificar
los ADN digeridos.
En una primera forma de realización, la etapa de
restricción enzimática es seguida de dos electroforesis de campo
alterno (respectivamente segunda y tercera migración
electroforética).
En la práctica, los bloques de agarosa que
contienen los fragmentos de ADN digeridos se colocan en un segundo
gel de manera descentrada. El gel se coloca sucesivamente en la cuba
de electroforesis de campo alterno, en un sentido (segunda
migración) y después en el sentido opuesto (tercera migración).
Durante la segunda migración electroforética, de corta duración, la
colocación del gel en un campo eléctrico homogéneo permite sacar del
gel los fragmentos pequeños de ADN, manteniendo los grandes
fragmentos en el gel. Durante la tercera migración, el gel se coloca
en el otro sentido, y los grandes fragmentos se pueden separar según
su tamaño. Se constató que la doble migración permitía eliminar los
fragmentos de tamaño pequeño enmarañados en los fragmentos de ADN
del tamaño deseado.
En una segunda forma de realización, la etapa de
restricción enzimática es seguida de tres electroforesis de campo
alterno (respectivamente segunda, tercera y cuarta migración
electroforética).
En la práctica, después de la segunda migración
electroforética, se corta y se vuelve a colocar, en la orientación
inversa, una banda de agarosa que contiene los fragmentos de ADN
digeridos del tamaño deseado, en un nuevo gel estrictamente
idéntico. Este gel se somete a la misma migración electroforética
(tercera migración). Puesto que la movilidad propia de cada
fragmento de ADN, en cualquier punto de la zona de agarosa cortada,
es conservada entre la segunda y la tercera migración, todos los
fragmentos de ADN migran finalmente hacia una misma zona concentrada
del gel. Se constató que los fragmentos de ADN de tamaño pequeño
reticulados en los fragmentos de ADN del tamaño deseado (contenidos
en la zona de gel en la que el ADN está concentrado) se pueden
eliminar sometiendo esta zona de gel o este gel a una cuarta
migración electroforética de campo alterno según una orientación
idéntica a la de la tercera migración. Está última migración se
caracteriza mediante parámetros muy pocos separativos que afectan
únicamente a los fragmentos pequeños de ADN.
Finalmente y en los dos modos de realizaciones,
las hebras de ADN así preparadas (purificación, digestión,
selección, concentración) se recuperan mediante las técnicas
conocidas por el experto en la materia, tales como, por ejemplo,
electroelución (por ejemplo, como los sistemas comercializados por
las empresas Biorad y Schleicher & Schuell), digestión de la
agarosa (utilizando las enzimas comercializadas como la
\beta-agarasa comercializada por New England
Biolabs, o la gelasa Epicentre Technologies, y según las
instrucciones de los fabricantes) y uso de kits comercializados
(Nucleo Trap DNA extraction Kit, Clontech; Gene Clean turbo spin
BIO101) conocidos por el experto en la técnica.
En otros términos, la combinación de la
trituración, la sedimentación diferencial, la lisis del bloque de
agarosa y la sucesión de etapas de electroforesis de campo alterno,
permite:
- -
- purificar el ADN eliminando cualquier detritus inherente a la lisis de las células incluidas en el bloque,
- -
- separar el ADN en función de su tamaño,
- -
- obtener ADN concentrado con el tamaño deseado.
Dicho de otra forma, el procedimiento
desarrollado en la invención permite no solamente purificar, separar
y visualizar el ADN mediante electroforesis sobre gel, sino también
recuperar este ADN controlando precisamente el tamaño de los ADN
necesarios para las etapas posteriores de clonación. El ADN así
obtenido puede servir de matriz para ser clonado mediante técnicas
clásicas. Estas técnicas pueden utilizar bien la restricción
enzimática (extremos cohesivos), o bien la clonación de extremos
romos, o también la síntesis de colas homopoliméricas
complementarias sobre el inserto y el vector, como se describe en
Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: a
laboratory manual II edition, Cold Spring Harbor laboratory, N.Y. El
inconveniente principal que presenta la restricción enzimática es la
selección engendrada por los sitios de reconocimiento de las enzimas
de restricción utilizadas. De hecho, la restricción afecta
desigualmente los fragmentos de ADN con porcentajes GC variables. El
enlace de extremos romos y la síntesis de colas homopoliméricas
complementarias permite evitar cualquier selección de los fragmentos
de ADN.
Además, en la técnica anterior ya se han descrito
numerosos vectores de clonación o de expresión. Estos son, de manera
no limitativa, plásmidos ampliamente comercializados, fagómidos como
por ejemplo (Bluescript pSK), vectores derivados de fagos como por
ejemplo los comercializados por la empresa Stratagene (Lambda DASH
II y ZAP II), cósmidos como por ejemplo los comercializados por
Stratagene (SuperCos y pWE15) y Epicentre TEBU (kit de clonación de
cósmidos pWED), fósmidos como el descrito por Kim U.J., Shizuya H.,
de Jong P.J., Birren B. y Simon M.I., 1992 - Stable propagation of
cosmid sized human DNA inserts in a F factor based vector, Nucleic
Acids Research 20(5): 1083-1085), cromosomas
artificiales PAC como se describen por Ioannou P.A., Amemiya C.T.,
Games J., Kroisel P.M., Shizuya H., Chen C., Batzer M.A. y de Jong
P., 1994 - a new bacteriophage P1-derived vector for
the propagation of large human DNA fragments, Nature Genetics, 6:
84-89; BAC como se describen por Shizuya H., Bruce
Birren, Ung-Jin Kim, Valeria Mancino, Tatiana
Slepak, Yoshiaki Tachiiri y Melvin I. Simon, 1992 - A bacterial
cloning system for cloning large human DNA fragments, Proc. Natl.
Acad. Sci., 89: 8794-8797) y YAC como se describen
por Larin Z., Monaco A.P. y Lehrach H., 1991 - Yeast artificial
chromosome libraries containing large inserts from mouse and human
DNA, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 4123-4127. Los
vectores, técnicas de preparación de los vectores y las técnicas de
clonación ya han sido objeto de numerosos trabajos y ya se han
descrito ampliamente.
Como se ha mencionado anteriormente, uno de los
objetivos de la invención es que puede adaptarse a una gran variedad
de ambientes.
A continuación, la expresión "organismo no
cultivable", hará referencia a cualquier organismo no
cultivable sobre medio sintético tal como especialmente, pero de
manera no limitativa, las procariotas, tales como las bacterias
(endosimbióticas o parásitas), las arquebacterias y las
protistas.
Asimismo, el procedimiento de la invención
permite al mismo tiempo aislar los organismos cultivables en la
medida en que la sedimentación sobre almohadilla no permite
distinguir las bacterias cultivables de las bacterias no
cultivables.
Además, mediante la expresión "muestra
medioambiental", se designa tanto el suelo y los sedimentos
como los vegetales, los insectos, por ejemplo los artrópodos, los
moluscos, las esponjas, los crustáceos, las platelmintos, los
nematodos, los bioreactores tales como las biopelículas,
fermentadores, lodos activados, y más generalmente los medios
acuáticos, pero igualmente muestras biológicas animales (por ejemplo
el estiércol de cerdo, bolo alimentario de la panza) o humanas, y
ventajosamente cualquier fracción obtenida a partir de estos
ambientes que presenta una ventaja cuantitativa (concentración
bacteriana elevada) o cualitativa (especificidad de la comunidad o
población bacteriana).
A continuación, el procedimiento objeto de la
invención se describe más particularmente con relación a la
extracción de ADN de la flora bacteriana no cultivable contenida en
las moscas del vinagre, el suelo, y las heces de origen humano.
Así, en una primera forma de realización, la
muestra medioambiental es un insecto. En efecto, entre los
organismos no cultivables que presentan un interés potencial, se
conocen igualmente las bacterias endosimbióticas, y especialmente
las del genero Wolbachia. Este tipo de endosimbiote está
presente en un gran número de invertebrados, y especialmente de
artrópodos, en particular en las moscas del vinagre. Estas bacterias
se encuentran igualmente en los moluscos. Más particularmente, las
bacterias del genero wolbachia se localizan preferentemente
en los órganos reproductores de los insectos como se describe por
Werren JH. 1997. Biology of wolbachia. Annual Review of
Entomology. 42, 587-609. Para extraer exclusivamente
el ADN bacteriano antes que el ADN nuclear, el procedimiento de la
invención se lleva a cabo a partir de huevos no fecundados de moscas
del vinagre, y, por lo tanto, de hembras vírgenes.
Por otra parte, se constató que en el caso de los
insectos y más particularmente de la mosca del vinagre, una
trituración cuidadosa seguida de una filtración y después de una
centrifugación permitía optimizar la separación posterior de la
fracción principal bacteriana del resto del triturado.
En una segunda forma de realización de la
invención, la muestra medioambiental es una muestra de suelo o una
sub-fracción granulométrica como se describe por
ejemplo por Hattori T. 1988. Soil aggregates as microhabitats of
microorganisms. Biology and Fertility of soils. 6,
189-203, y Jocteur-Monrozier L, Ladd
JN, Fitzpatrick RW, Foster R.C., Raupach M. 1991. Components and
microbiomass content of size fractions in soils of contrasting
aggregation. Geoderma, 49, 37-62.
Según un ejemplo de realización ventajoso pero no
limitativo, el suelo utilizado es una fracción de la capa
superficial del suelo.
En una primera forma de realización, la
trituración de la muestra de suelo se puede efectuar preferentemente
pero no exclusivamente, en un tampón de sacarosa cuya concentración
es igual a 30 milimoles por litro, de EDTA cuya concentración es
igual a 25 milimoles por litro y de TES cuya concentración es igual
a 50 milimoles por litro. Se entiende por trituración cualesquiera
métodos que permitan dispersar las células bacterianas del resto de
constituyentes.
Por otra parte, la etapa de trituración comprende
sucesivamente:
- \bullet
- una primera trituración enérgica de la muestra;
- \bullet
- una centrifugación de lavado;
- \bullet
- la recogida del pellet en una disolución de tampón fisiológico;
- \bullet
- dos trituraciones enérgicas complementarias.
Por supuesto, las condiciones de trituración y de
centrifugación dependen de la masa de material de partida utilizada.
Con relación más particularmente a la centrifugación, ésta se lleva
a cabo a una velocidad comprendida entre 5.000 y 10.000 rpm,
ventajosamente 6.000 rpm, durante 5 a 15 minutos, ventajosamente 10
minutos.
Se constató sorprendentemente, que esta sucesión
de etapas permitía optimizar la separación posterior de los
organismos no cultivables del resto del triturado.
En una segunda forma de realización, la
trituración de la muestra de suelo se efectúa en una disolución
tampón de NaCl al 0,8%.
En una tercera forma de realización, la muestra
medioambiental se presenta en forma de una muestra biológica humana
o animal. En una forma de realización ventajosa, la muestra
biológica consiste en heces de origen huma-
no.
no.
Para permitir separar la flor intestinal de la
materia sólida, la trituración va seguida de una etapa de
filtración. Al igual que anteriormente, por trituración se entiende
cualquier sistema de dispersión de los
micro-organismos.
En cuanto a los medios acuáticos, puede ser
necesaria una concentración anterior de la muestra en función de su
volumen inicial. Especialmente, un enfoque preferido será el uso de
las técnicas de centrifugación de flujo continuo como se describen
por ejemplo en Centrifugation a pratical approach (2 nd). 1984. Eds,
D Rickwood & B.D. Hames (IRL Press, Oxford, Washington DC).
Para todos estas muestras medioambientales
descritas de manera no limitativa, la separación de los organismos
no cultivables del resto del triturado se efectúa, como
anteriormente, mediante sedimentación sobre almohadilla de densidad
superior a 1. En la práctica, se utiliza, si se desea, una
disolución de Nycodenz, Percoll, Ficoll, Metrizamida o iodixanol,
que se coloca en el fondo de un tubo, debajo del triturado. La
sedimentación diferencial se establece en el fondo del tubo para las
partículas muy densas y, de manera ordenada, sobre la almohadilla
para las demás. Como ya se ha mencionado, esta sedimentación se
puede acelerar mediante centrifugación.
Según una característica ventajosa del
procedimiento de la invención, la fracción que contiene los
organismos recuperados al final de la etapa de sedimentación se
somete a dos etapas de centrifugación posteriores sucesivas para
lavar con agua, a una velocidad comprendida entre 6.000 y 10.000
rpm, y a una temperatura comprendida entre 3 y 5ºC, ventajosamente
4ºC.
Por otra parte, para permitir extraer el máximo
de ADN, la mezcla constituida por los organismos cultivables y no
cultivables incluida en un bloque de agarosa al final de las dos
etapas posteriores de centrifugación se somete a dos lisis
sucesivas:
- \bullet
- una primera lisis en un tampón a base de lisosima y de acromopeptidasa;
- \bullet
- después, una segunda lisis en un tampón a base de laurilo-sarcosilo al 1%, y proteinaza.
Para permitir la separación de los fragmentos de
ADN, el bloque de agarosa que incorpora los organismos lisados se
somete a una electroforesis de campo alterno en gel de agarosa.
En la práctica, los geles de agarosa son geles
ultra-puros, de bajo punto de fusión (grado molécula
elevado), ventajosamente a una concentración de 0,8% (0,7 a 1,2%).
Preferentemente pero no limitativamente, las migraciones
electroforéticas se llevan a cabo en un voltaje de 150V durante
tiempos variables del orden de 10 a 24 horas. Las variaciones de los
pulsos (por ejemplo de 1 a 5 segundos hasta 10 a 25 segundos)
permiten obtener las separaciones óptimas según el tamaño de los
fragmentos de ADN deseados, y controlar y optimizar la separación de
los fragmentos de ADN deseados según el tamaño.
Como se ha mencionado anteriormente y en una
forma de realización preferida, las hebras de ADN separadas y
purificadas al final de la etapa de electroforesis de campo alterno
(primera migración electroforética), se someten a una etapa de
restricción enzimática seguida de al menos una electroforesis
(segunda migración electroforética).
En este caso, la primera migración
electroforética se utiliza para extraer los fragmentos de ADN de
gran tamaño, y para separarlos de los restos celulares.
Ventajosamente, se pueden utilizar condiciones electroforéticas muy
separadoras como por ejemplo pulsos de 10 a 25 segundos durante 20
horas (150V). Esta migración preparativa permite recuperar
fragmentos de ADN superiores a 300 kb.
El ADN de tamaño superior a 300 kb contenido en
la agarosa se corta y se somete a una restricción enzimática en la
agarosa. Las cantidades de enzimas utilizadas así como el tiempo de
aplicación dependen especialmente de la actividad propia de la
enzima y de la cantidad de ADN presente.
En una primera forma de realización, el número de
electroforesis es dos.
En este caso, los bloques de agarosa, que
contienen los ADN digeridos, se colocan nuevamente en un gel de
agarosa y se someten a una o varias electroforesis de campo alterno
para separar y purificar los ADN digeridos, en el mismo gel.
Ventajosamente, los ADN digeridos se someten a dos electroforesis de
campo alterno que corresponden a una doble migración
electroforética. En un campo eléctrico homogéneo y constante, el gel
se coloca alternativamente en un sentido, y en el otro sentido
estrictamente opuesto. Durante la primera migración electroforética,
el sentido del campo eléctrico permite sacar los fragmentos pequeños
de ADN del gel. En efecto, la colocación excéntrica de los bloques
de agarosa permite, del lado más corto, sacar los fragmentos
pequeños de ADN, manteniendo al mismo tiempo los grandes fragmentos
en el gel. En una segunda migración, el gel se coloca en el otro
sentido, y los grandes fragmentos de ADN se pueden separar así según
su tamaño. Las condiciones de la primera migración son
preferentemente 10/25 segundos durante 4 horas. Las condiciones de
la segunda migración son, preferentemente, 10/25 segundos durante 20
horas.
En una segunda forma de realización, el número de
electroforesis es tres.
En este caso, una segunda migración
electroforética separadora, en un gel que consiste en 100 ml de
agarosa ultra-pura al 0,8% de bajo punto de fusión
(Biorad), permite separar los fragmentos de ADN digeridos según su
tamaño (mediante 5/15 segundos durante 17 horas en un voltaje de
150V).
Los fragmentos de ADN del tamaño deseado se
concentran recuperando el bloque de agarosa y sometiéndolo a una
migración de retorno (tercera migración) (colocando el bloque de
agarosa en el sentido inverso sobre un nuevo gel). El gel y las
condiciones de migraciones electroforéticas deben ser absolutamente
idénticos.
Se efectúa una última migración electroforética
(cuarta migración) a fin de eliminar los fragmentos pequeños de ADN
enmarañados en los fragmentos de ADN de tamaño deseado. Esta
electroforesis se lleva a cabo en condiciones muy poco separativas,
afectando solo a los fragmentos pequeños (pulsos de 1/5 segundos
durante 10 horas en un voltaje de 150V).
El hecho de mantener los fragmentos de ADN en la
agarosa, y de no utilizar ni agentes intercalantes ni visualización
con UV, permite preservar la calidad y la integridad de ADN de gran
tamaño.
Como se ha mencionado anteriormente, la invención
se refiere asimismo al ADN de tamaño superior a 300 kb, susceptible
de ser obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente. El
ADN así obtenido puede presentar, según las distintas formas de
realización del procedimiento, extremos "cohesivos" (cuando es
objeto de restricción enzimática), extremos "romos" (cuando es
objeto de una ruptura mecánica y reparación enzimática de tipo
Klenow o ADN polimerasa T4 por ejemplo) o, finalmente, colas
homopoliméricas (cuando es objeto de un tratamiento mediante la
enzima de transferasa terminal). Todas estas técnicas ya están
ampliamente documentadas (Current protocols in molecular biology,
Eds F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman,
J.A. Smith y K. Struhl; Publicado por Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience. Este ADN se puede utilizar
en cualquier experimento de biología molecular, como por ejemplo, y
de manera no limitativa, para la construcción de librerías de ADN
utilizando cualquier técnica de clonación adecuada, conocida por el
experto en la materia.
Dado la pureza y el tamaño del ADN, se pueden
utilizar cualquier tipo de vectores de clonación o de expresión.
Por ejemplo y de manera no limitativa, estos vectores son de
tipo:
- -
- Fagómido: pBluescript SK+(pSK+) (Henne A., Daniel R., Schmitz R.A. y Gottschalk G, 1999 - Construction of environmental DNA librairies in Escherichia coli and Screening for the presence of genes conferring utilization of 4-Hidroxibutirate, Applied and Environmental Microbiology, 65: 3901-3907,
- -
- Vectores derivados de fagos: lambda ZAPII Cottrell M.T., Moore J.A. y Kirchman D.L., 1999 - Chitinases from uncultured marine microorganisms, Applied and Environmental Microbiology, 65: 2553-2557,
- -
- Vector cósmido pCPP47; Bauer D.W. y Collmer A., 1997 - Molecular cloning, characterization and mutagenesis of a pel gene from pseudomonas syringae pv. Lachrymans encoding a member of the Erwinia chrysanthemi PelADE family of pectate lyases, Molecular Plant-Microbe Interactions, 10: 369-379,
- -
- Fósmido pFOS1 (vector descrito por Kim U.J., Shizuya H., de Jong P.J., Birren B. y Simon M.I., 1992 - Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in a F factor based vector, Nucleic Acids Research 20(5): 1083-1085) Stein J.L., Marsh T.L., Wu K.Y., Shizuya H. y deLong E., 1996 - Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobas-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon, Journal of Bacteriology, 178: 591-599,
- -
- Vector PAC derivado del bacteriófago P1 (pCYPAC-1), Ioannou P.A., Amemiya C.T., Garnes J., Kroisel P.M. Shizuya H., Chen C., Batzer M.A. y de Jong P., 1994 - a new bacteriophage P1-derived vector for the propagation of large human DNA fragments, Nature, Genetics, 6: 84-89,
- -
- Vector BAC pBeloBAC11 (pSK+) (vector descrito por Shizuya H., Bruce Birren, Ung-Jin Kim, Valeria Mancino, Tatiana Slepak, Yoshiaki Tachiiri, Melvin I. Simon, 1992 - A bacterial cloning system for cloning large human DNA fragments, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 8794-8797); Shizuya H., Birren B., Kim U.J., Mancino V., Slepak T., Tachiiri Y. y Simon M., 1992 - Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector, Proceeding of national Academy of Science, 89, 8794-8797; Woo S.S., Jiang J., Gill B.S., Paterson A.H. y Wing R.A., 1994 - Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor, Nucleic Acids Research, 22, 4922-4931; Rondon M.R., Raffel S.J., Goodman M.R. y Handelsman J., 1999 - Toward functional genomics in bacteria: Analysis of gene expression in Escherichia coli from a bacterial artificial chromosome library of Bacillus cereus, Proceeding of National Academy of Science, 96: 6451-6455,
- -
- Vector YAC pYAC4, Larin Z., Monaco A.P. y Lehrach H., 1991 - Yeast artificial chromosome libraries containing large inserts from mouse and human DNA, Proceeding of National Academy of Science, 88: 4123-4127.
La ligación entre los distintos vectores posibles
y los fragmentos de ADN se puede realizar de manera clásica, como se
describe por los fabricantes, según el tipo de enzima utilizada,
como por ejemplo (T4 DNA ligase, Compañías Roche o Life
Technologies; Fast Link DNA ligation Kit, Compañía Epicentre
Technologies) o en gel, como se describe por ejemplo por la Compañía
Epicentre Technologies en el pWEB Cosmid Cloning Kit.
Se ha descrito la transformación o la
encapsulación (según el vector utilizado), como por ejemplo en
Current Protocols in Molecular Biology, Eds F.M. Ausubel, R. Brent,
R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith y K. Struhl;
Publicado por Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience, así como en las instrucciones de
los fabricantes.
Finalmente, la invención se refiere a las
librerías de ADN constituidas así por los fragmentos de ADN
obtenidos mediante el procedimiento descrito anteriormente, y de
manera no limitativa para su utilización en la detección
sistemática molecular, fenotípica o química.
\newpage
La invención y las ventajas que resultan de ésta
se comprenderán mejor a partir de los ejemplos de realización
siguientes con la ayuda de las figuras adjuntas.
La figura 1 representa el perfil de migración del
ADN bacteriano extraído según el ejemplo 1 (pista 2), según el
ejemplo 2 (pista 3) y el ejemplo 3 (pista 4).
La figura 2 representa el perfil de migración del
ADN bacteriano extraído según el ejemplo 2, al final de la segunda
migración (2A) y de la tercera migración (2B).
Se disolvieron 10 a 20.000 huevos no fecundados
de hembras vírgenes de Drosophila simulans en aproximadamente
500 \mul de NaCl 0,8%.
El uso de huevos no fecundados es esencial en la
medida en la que permite extraer mayoritariamente ADN bacteriano con
una carga mínima de ADN nuclear.
La trituración se efectúa de manera cuidadosa en
un microtubo de 1,5 ml con la ayuda de un pistón estéril de
polipropileno añadiendo arena de Fontainebleau estéril. La
trituración comprende las etapas siguientes:
- -
- triturar 2 minutos en hielo;
- -
- centrifugar rápidamente a 4.000 rpm a una temperatura de 4ºC;
- -
- recuperar el sobrenadante turbio en un tubo Ultraclear Kontron de 38 ml;
- -
- resuspender el pellet con 500 \mul de NaCl 0,8%;
- -
- repetir las etapas a) a d) sobre la misma muestra;
- -
- recoger los sobrenadantes de las 3 trituraciones en un tubo ultraclear;
- -
- recoger el pellet final del triturado y filtrar a través de lana de algodón estéril mediante NaCl 0,8% c.s. 20 ml;
- -
- recuperar el filtrado que se añade al sobrenadante de f).
Se prepara una disolución de NYCODENZ al 30%
peso/volumen (15 g en 50 ml de agua ultrapura) que corresponde a una
densidad del orden de 1,16. Entonces, se coloca una almohadilla de
10 ml de NYCODENZ en el tubo ultraclear, con la ayuda de una pipeta,
bajo la suspensión que procede de la trituración. Entonces, la
sedimentación se acelera durante 30 minutos a temperatura de 4ºC
mediante centrifugación a 9.000 rpm por medio de un rotor de cubeta
giratoria, con freno, de tipo TST 2838 (KONTRON).
Al final de la etapa de sedimentación, se
observan mediante microscopia óptica en el tubo ultraclear varias
capas sucesivas desde la parte superior hasta el fondo:
- \bullet
- Capa 1: fracción turbia con residuos finos en suspensión, y puntos visibles al microscopio que corresponden a bacterias y mitocondrias.
- \bullet
- Capa 2: fracción translúcida con puntos visibles al microscopio;
- \bullet
- Capa 3: fracción blanquecina con numerosos puntos que comprenden bacterias en su mayoría, así como mitocondrias;
- \bullet
- Capa 4: fracción translúcida sin ninguna estructura visible al microscopio que corresponde a la almohadilla densa de NYCODENZ;
\newpage
- \bullet
- Capa 5: un pellet blanquecino que corresponde a los residuos no retenidos mediante la filtración a través de algodón.
Se recuperan 4 a 5 ml de la fracción bacteriana a
partir de la capa 3, mediante un cono estéril. A continuación, el
volumen recuperado se recoge con 20 ml de agua ultrapura. Se procede
entonces a una nueva centrifugación con una velocidad de 9.000 rpm a
una temperatura de 4ºC durante 15 minutos con freno, para peletizar
las bacterias. Se observa que los puntos contenidos en las capas 1 y
2 no se pueden peletizar, lo que sugiere que comprenden bacterias y
mitocondrias degradadas. El sobrenadante obtenido al final de la
primera etapa de centrifugación se desecha, y el pellet bacteriano
se recoge con aproximadamente 1,5 ml de agua ultrapura. Después, se
procede a una nueva centrifugación de lavado a 9.000 rpm a 4ºC
durante 5 minutos. Finalmente, se desecha el sobrenadante, y después
el pellet se almacena a -20ºC.
El pellet bacteriano que sale después de NYCODENZ
se recoge con 100 \mul de Tris EDTA, TE_{10,1}, [pH 8,0]. Esta
suspensión bacteriana se mezcla vol/vol con 100 \mul en un bloque
de agarosa de bajo punto de fusión (BIORAD) equilibrada a 55ºC. El
bloque se vierte en moldes (molde de tapón de BIORAD) a razón de 100
\mul por molde. Los moldes se mantienen en hielo durante 20
minutos. Los tapones se retiran delicadamente para recogerlos en un
tubo en el que se efectúa la lisis.
Cada bloque se recoge en tubo Venoject estéril de
5 ml con 3 ml de tampón de 1 lisis (TE_{10,1}, [pH 8,0], 5 mg/ml
de lisosima, 0,5 mg/ml de acromopeptidasa).
Se incuba 2 horas a 37ºC.
Se elimina el tampón de 1 lisis.
Cada bloque se recoge en 3 ml de tampón 2 de
lisis (TE_{10,1}, [pH 8,0], 1% de laurilsarcosilo, 100 \mug/ml
de proteinaza K).
Se incuba 2 horas a 55ºC.
Se efectúan tres aclarados sucesivos de los
tapones de 30 minutos, en 3 ml de TE_{10,1}, [pH 8,0].
Cada uno de los bloques se coloca en los pocillos
de un gel de agarosa que consiste en 100 ml de agarosa de bajo punto
de fusión (BIORAD) al 0,8%. Se somete el gel de agarosa a una
electroforesis de campo alterno mediante un dispositivo Chef DR II
Pulsed Field Electrophoresis System (BIORAD). Se utiliza un tampón
de migración que consiste en Tris Borate EDTA (0,5x). La migración
electroforética se lleva cabo en un voltaje de 150V durante 22
horas. Pulsos de 10 a 25 segundos permiten obtener dos campos
eléctricos alternos.
Después, se visualiza y se localiza el tamaño del
ADN mediante tinción con bromuro de etidio de la parte del gel que
contiene el marcador de tamaño y un doble del ADN migrado. Así, el
ADN utilizado a continuación nunca es dañado por el uso de agentes
intercalantes o de UV. Después de cortar el gel, la tinción en
bromuro de etidio y la visualización con UV permiten verificar el
tamaño de los fragmentos de ADN efectivamente recuperados.
En la figura 1 adjunta, se representa el perfil
de migración del ADN extraído (pista 2), las pistas 1 y 5
representan el marcador de tamaño comercializado por la empresa
BIOLABS con la marca Lambda ladder PFG Marker y low range PFG
marker.
Como se muestra en la figura 1, el fragmento de
ADN bacteriano tiene un tamaño superior a 300 kb. El fragmento de
tamaño comprendido entre 200 y 250 kb es probablemente ADN que
proviene del hospedante mosca del vinagre. Esto demuestra claramente
la capacidad del procedimiento para separar el ADN diana del resto
del ADN, primero gracias a la trituración y a la sedimentación
diferencial en un gradiente de densidad (ADN genómico), y después
gracias a la electroforesis de campo alterno (ADN mitocondrial).
Se efectúa mediante una gelasa (Epicentre TEBU)
que digiere la agarosa según las indicaciones dadas por el
fabricante.
- -
- La banda de agarosa que contiene el ADN se incuba en tres volúmenes del tampón de reacción de la enzima (1 hora a temperatura ambiente);
- -
- el tampón se elimina y la banda de agarosa se incuba 5 minutos a 70ºC; La agarosa así licuada se equilibra a la temperatura de 45ºC durante 5 minutos;
- -
- se añade una cantidad de enzima que comprende 1 a 3 unidades de gelasa, y se incuba el conjunto 1 hora a 45ºC hasta digestión completa de la agarosa (se verifica la digestión sumergiendo el tubo de muestra en hielo);
- -
- el ADN se utiliza directamente en el medio de reacción de la gelasa para reacciones enzimáticas o cualquier otra manipulación, o bien el ADN se precipita con acetato de amonio como se describe por el fabricante (Epicentre Technologies).
Se recogen 7,5 g de suelo en 50 ml de una
disolución tampón que comprende sacarosa 30 mM, EDTA 25 mM, TES 50
mM.
- a)
- el material se tritura en un bol de trituración mediante un WaringBlender durante 1 minuto a la potencia máxima;
- b)
- el triturado se recoge en un tubo Falcon de 50 ml, y se centrifuga a 6.000 rpm a 10ºC durante 10 minutos;
- c)
- se elimina el sobrenadante y el pellet se recoge con 50 ml de NaCl 0,8%;
- d)
- se efectúa 2 trituraciones de 1 minuto con un WaringBlender a la potencia máxima con una pausa de 5 minutos entre las dos en hielo (enfriamiento del triturado de suelo);
- e)
- el triturado se recoge en un tubo Falcon de 50 ml y se mantiene en hielo.
Se prepara una disolución de NYCODENZ al 60%
peso/volumen (30 g en 50 ml final de agua ultrapura), que
corresponde a una densidad de 1,32. Entonces, se coloca una
almohadilla de 10 ml de NYCODENZ en el tubo ultraclear mediante una
pipeta, bajo la suspensión que procede de la trituración. Entonces,
la sedimentación se acelera durante 10 minutos a una temperatura de
4ºC mediante centrifugación a 10.000 rpm, usando un rotor de cubeta
giratoria, sin freno de tipo TST 2838 (KONTRON).
Al final de la etapa de sedimentación, se
observan en el tubo ultraclear varias capas sucesivas desde la parte
superior hasta el fondo:
- \bullet
- capa 1: fracción acuosa translúcida;
- \bullet
- capa 2: fracción bacteriana blanquecina;
- \bullet
- capa 3: almohadilla translúcida de NYCODENZ;
- \bullet
- capa 4: sedimentación del suelo.
Se recuperan 4 a 5 ml de la fracción bacteriana
de la capa 2 mediante un cono estéril. Después, se desactivan las
nucleasas mediante incubación de la fracción bacteriana a 65ºC
durante 10 minutos. El volumen recuperado se recoge con 20 ml de
agua ultrapura. A continuación, se procede a una centrifugación
usando un rotor de cubeta para peletizar las bacterias con una
velocidad de 9.000 rpm a una temperatura de 4ºC durante 20 minutos
con freno. El sobrenadante se elimina y el pellet bacteriano se
recoge con aproximadamente 1,5 ml de agua ultrapura. Después, se
procede a una nueva centrifugación de lavado a 9.000 rpm a 4ºC
durante 5 minutos. Finalmente, se elimina el sobrenadante y el
pellet se almacena a -20ºC.
Se repite el ejemplo 1.
Cada uno de los bloques lisados se coloca en los
pocillos de gel de agarosa constituido por 100 ml de agarosa de bajo
punto de fusión (BIORAD) al 0,8%. El gel de agarosa se somete a una
electroforesis de campo alterno usando un dispositivo Chef DR II
Pulsed Field Electrophoresis System (BIORAD) para realizar una
electroforesis preparativa. Se utiliza un tampón de migración
constituido por TrisBorate EDTA (0,5x). La migración electroforética
preparativa se lleva a cabo en un voltaje de 150V durante 20 horas
con pulsos de 10 a 25 segundos.
Al igual que en el ejemplo 1, el ADN extraído al
final de la primera migración se visualiza y se localiza sobre gel
(véase pista 3 de la figura 1).
Entonces, los bloques de agarosa (aproximadamente
100 mg) se recuperan y se someten a una restricción enzimática
mediante HindIII:
- -
- incubación durante 1 hora en 500 \mul de tampón de enzima (1X) a 4ºC;
- -
- sustitución del tampón por 250 \mul del mismo tampón con 10U de enzima;
- -
- incubación durante 2 horas en hielo;
- -
- transferencia a 37ºC e incubación durante 1 hora.
El bloque de agarosa que contiene el ADN digerido
se recoge en un gel de agarosa constituido por 100 ml de agarosa de
bajo punto de fusión (Biorad) al 0,8%. Se efectúa a continuación una
segunda migración electroforética con campos pulsados en un voltaje
de 150V a 5/15 segundos durante 17 horas. El "frotis" de
digestión se localiza (Fig 2A); como se ha descrito anteriormente en
la presente memoria y se cortan zonas de gel según el tamaño
deseado. Después, los bloques se colocan en sentido inverso en un
nuevo gel estrictamente idéntico, y se somete a una tercera
migración electroforética con campos pulsados en condiciones
estrictamente idénticas (concentración). Se visualizan los
fragmentos de ADN contenidos en las distintas bandas cortadas y
concentradas mediante la tercera migración (Fig. 2B). Después, los
fragmentos de ADN concentrados se someten a una cuarta migración
electroforética en un voltaje de 150V, 1/5 segundos durante 10
horas.
Se repite el ejemplo 1.
Se recogen 3 g de heces en 50 ml de NaCl 0,8%
La trituración se efectúa mediante una rejilla de
teflón estéril en un cilindro de vidrio de borosilicato;
- a)
- trituración durante 2 a 5 minutos en hielo;
- b)
- suponiendo que la trituración con rejilla no sea suficiente, el material se somete a una trituración muy rápida en WaringBlender (5 a 10 segundos);
- c)
- se filtra el triturado sobre gasa estéril.
Se prepara una disolución de NYCODENZ al 30%
peso/volumen (15 gramos en 50 ml final de agua ultrapura) que
corresponde a una densidad de 1,16. A continuación, se coloca una
almohadilla de 10 ml de NYCODENZ en el tubo ultraclear mediante una
pipeta, bajo la suspensión que procede de la trituración. A
continuación, se acelera la sedimentación durante 30 minutos a una
temperatura de 4ºC mediante ultracentrifugación a 9.000 rpm.
Al final de la etapa de sedimentación, se
observan en el tubo ultraclear varias capas sucesivas desde la parte
superior hasta el fondo:
\bullet capa 1: fracción acuosa muy
coloreada;
\bullet capa 2: fracción bacteriana
blanquecina;
\bullet capa 3: almohadilla translúcida de
NYCODENZ;
\bullet capa 4: pellet que corresponde a los
restos orgánicos densos.
Se recuperan aproximadamente 4 a 5 ml de la
fracción bacteriana contenida en la capa 2 mediante un cono estéril.
Se recoge el volumen recuperado con 20 ml de agua ultrapura.
Después, se procede a una centrifugación con un rotor de cubeta,
para peletizar las bacterias con una velocidad de 9.000 rpm a una
temperatura de 4ºC durante 20 minutos con freno. El sobrenadante se
elimina y el pellet bacteriano se recoge con aproximadamente 1,5 ml
de agua ultrapura. A continuación, se procede a una nueva
centrifugación de lavado a 6.000 rpm y 4ºC. Se elimina el
sobrenadante, y el pellet se almacena a -20ºC.
Se repite el ejemplo 2.
Se repite el ejemplo 2.
En la figura 1 adjunta, se representa el perfil
de migración del ADN extraído (pista 4). Se observa que el tamaño
del fragmento de ADN extraído es superior a 300 kb.
Se repite el ejemplo 1.
Claims (13)
1. Procedimiento de extracción indirecta de ADN
diana de organismos no cultivables contenidos en una muestra
medioambiental según el cual:
- \bullet
- se tritura en medio líquido dicha muestra;
- \bullet
- se recupera el triturado obtenido;
- \bullet
- se separan los organismos del resto del triturado mediante sedimentación en almohadilla de densidad superior a 1;
- \bullet
- se recuperan los organismos aislados en la superficie de la almohadilla que se incluyen en un bloque de agarosa;
- \bullet
- se extrae el ADN mediante lisis en el bloque de agarosa;
- \bullet
- se coloca el bloque en un gel de agarosa que se somete a al menos una electroforesis de campo alterno;
- \bullet
- finalmente, se recuperan las hebras de ADN extraídas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las hebras de ADN, separadas y
purificadas al final de la etapa de electroforesis de campo alterno
(primera migración electroforética), se someten a una etapa de
restricción enzimática seguida de al menos una electroforesis de
campo alterno (segunda migración electroforética).
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la etapa de restricción enzimática es
seguida de dos electroforesis de campo alterno (segunda y tercera
migración electroforética).
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque la segunda y la tercera migración se
llevan a cabo en un mismo gel, siendo opuesta la orientación de los
fragmentos de ADN entre la segunda y la tercera migración.
5. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la etapa de restricción enzimática es
seguida de tres electroforesis de campo alterno (respectivamente
segunda, tercera y cuarta migración electroforética).
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque la segunda y la tercera migración se
llevan a cabo en dos geles distintos, siendo opuesta la orientación
de los fragmentos de ADN entre la segunda y la tercera
migración.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el sentido de orientación de la cuarta
migración es idéntico al de la tercera migración.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las hebras de ADN se recuperan mediante
electroelución o digestión de la agarosa.
9. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra medioambiental es un
insecto.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque el ADN se extrae a partir de huevos no
fecundados de hembras vírgenes de la mosca del vinagre.
11. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra medioambiental es una muestra
de suelo, una subfracción granulométrica o una fracción de la capa
superficial del suelo.
12. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra medioambiental se presenta en
forma de una muestra biológica humana o animal.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la muestra biológica se presenta en
forma de heces de origen humano.
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