ES2250163T3

ES2250163T3 - Metodo para enternecer carne.

Info

Publication number: ES2250163T3
Application number: ES00947580T
Authority: ES
Inventors: Isaac Ashie; Thomas Sorensen; Per Munk Nielsen
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: AU781792B2; CN1368854A; ATE305236T1; AU6116000A; EP1199951B1; DE60022885T2; JP2003508084A; BR0012654A; DE60022885D1; CN1268235C; EP1199951A1; WO2001006875A1; US6149950A; NZ516715A

Abstract

Método para enternecer carne, dicho método comprendiendo el poner en contacto la carne con una cantidad enternecedora eficaz de una proteasa hecha termolábil por tratamiento químico de la enzima nativa.

Description

Método para enternecer carne.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para enternecer carne utilizando enzimas termolábiles que tienen una limitada especificidad de sustrato.

Antecedentes de la invención

La ternura es un atributo de calidad principal que afecta los precios del mercado y la aceptación por parte del consumidor de los productos de carne. La falta de consistencia de la ternura de la carne bovina es uno de los motivos principales del consumo disminuido de carne bovina en los Estados Unidos. Existen diferentes métodos para mejorar la ternura de la carne, incluyendo el enternecimiento mecánico, el almacenamiento a temperaturas elevadas, la inyección de cloruro de calcio, la estimulación eléctrica, la extensión muscular, la presión de ondas de choque, maduración en seco y mojado, y el tratamiento enzimático. Uno de los más usados es el tratamiento con una enzima, tal como, por ej., papaina, bromelaina, o ficina. Estas enzimas, no obstante, tienen especificidades muy amplias y en consecuencia hidrolizan indiscriminadamente las principales proteínas de la carne (tejido conectivo/proteínas colágenas y miofibrilares) dando como resultado un producto excesivamente enternecido (es decir, blando). Además, la papaina, que es la más comúnmente usada, es relativamente termoestable, permitiendo un deterioro de textura descontrolado durante y después de la cocción.

EP 0362177 expone un relleno de carne que comprende una proteasa sensible al calor. Cronlund et al. J. Agric. Food Chem., col. 34, 1986; 502-505 expone el efecto de los cuajos microbianos en las proteínas de la carne, y US 4677069 expone el uso de proteinasas derivadas de las vísceras de la almeja blanca o de almeja fina para enternecer la carne.

Así, hay una necesidad en la técnica de los métodos de enternecimiento de la carne de utilizar enzimas que, al contrario que la papaina, tengan una especificidad de sustrato estrecha; expresan una hidrólisis autolimitadora de las proteínas de la carne; hidrolicen uno cualquiera de los dos principales componentes proteicos de la carne, pero no ambos; sean termolábiles y de ese modo fácilmente desactivadas a temperaturas de cocción; y no tengan ningún efecto adverso en el sabor.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos para enternecer la carne, que son realizados poniendo en contacto la carne con una solución comprendiendo una cantidad eficaz de una proteasa termolábil enternecedora. Preferiblemente, la proteasa tiene una especificidad de sustrato limitada de modo que (a) asimila proteínas de carne sólo en una extensión limitada y/o (b) asimila sólo uno de los dos componentes principales de la proteína de la carne. En unas formas de realización, la proteasa es derivada de una especie Rhizomucor, preferiblemente R. miehei. En unas formas de realización, la proteasa es derivada de un mamífero, tal como, por ej., la quimosina bovina. La proteasa puede ser aislada directamente de las células de R. miehei o, alternativamente, de células huéspedes recombinantes transformadas con ácido nucléico que codifiquen la proteasa. Preferiblemente, la proteasa es tratada con peroxiácidos para hacerla más termolábil.

La fase de contacto comprende, sin limitación, la inyección de carne; marinación; o la inyección de un animal antes de ser sacrificado, y puede también incluir el remover la carne en contacto con la solución enternecedora. Normalmente, la carne es puesta en contacto con la proteasa en una proporción en peso de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,1 AU/100 g de carne, preferiblemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,05 AU/100 g de carne.

Los métodos de la invención proporcionan carne enternecida exhibiendo una fuerza de cizallamiento relativa (medido por el método Warner-Bratzler) que es aproximadamente entre el 50% y aproximadamente el 90%, preferiblemente entre aproximadamente el 60% y aproximadamente el 80%, de la fuerza de cizallamiento relativa de la carne antes del enternecimiento.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de la termolabilidad de la proteasa termolábil de R. miehei (diamantes) y de la papaina (recuadros).

La Figura 2 es una representación esquemática de la fuerza relativa de cizallamiento de carne tratada con proteasa de R. miehei termolábil (diamantes) y papaina (círculos).

La Figura 3 es una representación esquemática del efecto del almacenamiento refrigerado en la fuerza de cizallamiento relativa de la carne enternecida. Diamantes, control; recuadros, proteasa de R. miehei termolábil; triángulos, papaina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para enternecer la carne. La invención se basa en el descubrimiento de que tratando la carne con proteasas termolábiles con una especificidad de sustrato limitada se obtiene carne que exhibe propiedades superiores respecto a la carne no enternecida o a la carne tratada con enzimas enternecedoras convencionales tal como, por ej., la papaina.

Proteasas

Tal y como se usa aquí, una proteasa termolábil se refiere a una proteasa cuya actividad enzimática es expresada a niveles reducidos a altas temperaturas, tal como, por ej., aproximadamente por encima de 50°C, debido a (a) la termolabilidad de la reacción enzimática catalizada por la proteasa y/o (b) la termolabilidad estructural de la proteasa misma. Según la invención, una proteasa termolábil exhibe aproximadamente menos del 75%, preferiblemente menos de aproximadamente el 50%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 25%, y más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% de su actividad enzimática máxima cuando la reacción enzimática se realiza a una temperatura de al menos aproximadamente 70°C, preferiblemente al menos aproximadamente 60°C y más preferiblemente al menos aproximadamente 50°C. Alternativamente, o en combinación con lo anterior, una proteasa termolábil es una proteasa cuya actividad disminuye a menos de aproximadamente el 75%, preferiblemente menos de aproximadamente el 50%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 25%, y más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, de sus actividad enzimática máxima tras la incubación durante 5-30 minutos a una temperatura de al menos aproximadamente 70°C, preferiblemente al menos aproximadamente 60°C, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 50°C, cuando la actividad enzimática es medida en la temperatura en la que la enzima no tratada exhibe normalmente su máxima actividad.

Tal y como se utiliza aquí, una proteasa con especificidad de sustrato limitada es una que reconoce sólo un subconjunto de aminoácidos dentro de un polipéptido particular como objetivos para la incursión proteolítica. Las proteasas con especificidad de sustrato limitada que son útiles para poner en práctica la presente invención incluyen, sin limitación, las que (a) asimilan uno o ambos de los componentes proteicos de la carne con un grado de hidrólisis (DH) inferior a aproximadamente el 10%, preferiblemente menos de aproximadamente el 5%, y más preferiblemente menos de aproximadamente el 2%, y/o (b) asimilan sólo uno de los dos componentes principales de la proteína de la carne, cuando la carne es puesta en contacto como se describe, por ej., en el ejemplo 2 abajo. El DH puede ser medido usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, la medición de los grupos amino libres usando el método OPA (del inglés o-phthaldialdehyde o-ftaldialdehido) (Church et al., Anal. Biochem. 146:343; 1985) (ver, Ejemplo 3 abajo); midiendo una reducción en pH; y midiendo un aumento en osmolalidad. Los métodos para comparar la hidrólisis del colágeno y las proteínas miofibrilares se describen, por ej., en el ejemplo 4 abajo.

Las proteasas para el uso en la presente invención pueden comprender enzimas de tipo salvaje o mutantes. Las enzimas pueden ser aisladas de su célula de origen o pueden ser producidas por recombinación usando métodos convencionales bien conocidos en la técnica. El único requisito es que la proteasa exhiba termolabilidad y, preferiblemente, la especificidad del sustrato limitada y sea capaz de ejercer un efecto enternecedor en la carne como se describe aquí.

En una forma de realización, la proteasa usada para poner en práctica la presente invención deriva de una especie Rhizomucor, que incluye, sin limitación, Rhizomucor miehei o Rhizomucor pusillus, preferiblemente R. miehei. La secuencia de proteasa de R. miehei está descrita en la Patente U.S. No. 5.800.849.

En otra forma de realización, la proteasa usada para poner en práctica la presente invención deriva de un mamífero, tal como, por ej., la quimosina bovina (que es comercialmente disponible de, por ejemplo, Chris Hansen, Inc.)

La enzima puede ser intrínsecamente termolábil o puede ser hecha termolábil por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, tratamientos químicos u otros de la enzima nativa, o por introducción de mutaciones en la secuencia de la enzima que supongan una mejora de su termolabilidad. En unas formas de realización, la proteasa de R. miehei es hecha más termolábil por tratamiento con agentes oxidantes conteniendo cloro activo (Patente U.S. N°. 4.357.357) o peroxiácidos alifáticos o inorgánicos (Patente U.S. N°. 4.591.565).

Métodos para enternecer la carne

La presente invención proporciona métodos para enternecer la carne que comprenden el poner en contacto la carne con una solución comprendiendo una cantidad enternecedora eficaz de una proteasa termolábil. En formas de realización preferidas, la proteasa tiene una especificidad de sustrato limitada.

Tal y como se utiliza aquí, el término "carne" engloba, sin limitación, músculo de carne, ya sea presente en un animal vivo o carcasa o en carne fresca obtenida de la carnicería, al igual que carne congelada, carne liofilizada, y carne reestructurada en cualquier forma.

El enternecimiento se refiere a un proceso por el que la textura de la carne se hace más masticable o de otro modo más aceptable para el consumidor. El enternecimiento es normalmente calculado midiendo la fuerza relativa de cizallamiento de la carne o por análisis sensorial. La fuerza relativa de cizallamiento puede ser medida usando el método Warner-Bratzler (Olson et al., J. Food Sci. 42:506, 1977; y Fogle et al., J. Food Sci 47:1113; 1982). En este método se cortan muestras de carne en formas cilíndricas de 0,75 cm de diámetro con el eje del cilindro a lo largo de las secciones longitudinales de las fibras de la carne. Las muestras son colocadas en una cizalla Warner-Bratzler en forma de "V" moviéndose hacia abajo a una velocidad estable de 2 mm/seg a través de una distancia fija (30-50 mm) cortando en rodajas a lo largo de la longitud de la muestra. La fuerza máxima requerida para cortar en rodajas a través de cada muestra es una indicación de la fuerza de cizallamiento.

Una cantidad enternecedora eficaz de una proteasa es una cantidad que genere una reducción de la fuerza relativa de cizallamiento de entre aproximadamente el 50-90%, preferiblemente de entre aproximadamente el 60-80%, de la fuerza relativa de cizallamiento exhibida por la carne no tratada.

En la puesta en práctica de la invención, la carne es puesta en contacto con la enzima en una proporción (en peso) de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,1 Unidades Anson (AU)/100 g de carne, preferiblemente entre aproximadamente 0,0025 y aproximadamente 0,05 AU/100 g de carne y más preferiblemente entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,05 AU/100 g de carne. Un AU es definido como la cantidad de enzima que asimila la hemoglobina desnaturalizada a 25°C, pH 7,5 en 10 minutos, a una velocidad inicial que libere una cantidad de material ácido-soluble tricloroacético equivalente a un miliequivalente de tirosina, cuando se mide por la producción de color usando un reactivo de fenol.

La fase de contacto puede comprender uno o más de (a) la inyección directa de la carne; (b) la marinación de la carne; o (c) la inyección de un animal vivo antes de sacrificarlo. Se entenderá que el tiempo durante el que la carne está en contacto con la proteasa, al igual que la temperatura a la que la carne está en contacto, dependerá del modo (o combinación de modos) que se emplee. Por ejemplo, la carne puede ser inyectada con una proteasa conteniendo una solución y almacenada hasta aproximadamente dos semanas a 5°C. Alternativamente, la carne puede ser marinada durante aproximadamente 0,5-10 h a 5-10°C. Además, la carne estará en contacto con la proteasa durante la cocción.

El método puede comprender además el remover la carne en, por ej., la solución de marinación, tal como, por ej., durante 1-3 h a 5-10°C.

Se entenderá que cada una de las condiciones de reacción (tal como, por ej., la concentración de proteasa, la proporción de proteasa:carne, el modo de contactar, el pH, la temperatura, y el tiempo) puede ser variada, dependiendo de la fuente de carne y/o enzima y el grado de enternecimiento requerido. Además se entenderá que la optimización de las condiciones de reacción puede ser conseguida usando la experimentación rutinaria para establecer una matriz de condiciones y probar puntos diferentes en la matriz.

Los ejemplos siguientes deben entenderse como ilustraciones no limitativas de la presente invención.

Ejemplo 1 Termolabilidad de la Proteasa de R. Miehei

El siguiente experimento fue realizado para comparar la termolabilidad de la proteasa de R. miehei con la de la papaina, la enzima más utilizada para el enternecimiento de la carne.

Las enzimas fueron termotratadas durante 30 minutos a 50, 60, y 70°C, tras lo cual se determinó su actividad residual de la siguiente manera, usando un kit con Protazime (Megazyme Internacional Irleland Ltd.)

Se añadió 1 ml de enzima (en 100 mM de fosfato de hidrógeno de sodio, 30 mM de hidrocloruro de cisteína, 30 mM de EDTA, pH 7,0) a 1 ml de protazime conteniendo tampón (100 mM de fosfato de hidrógeno de sodio, 1% de sulfato dodecilo de sodio p/v, pH 7,0) e incubó durante 10 minutos a 40°C con agitación continua, después de esto se detuvo la reacción con la adición de 10 ml 2% (p/v) de fosfato trisódico a pH 12,3 con agitación fuerte. Las reacciones fueron dejadas a temperatura ambiente durante otros 2 minutos, después de lo cual fueron filtradas a través de un filtro Whatman N°. 2. La absorbencia del sobrenadante a 590 nm fue medida contra un sustrato en blanco (que contenía los mismos componentes, excepto que 1 ml de tampón fue añadido en lugar de la enzima).

Los resultados (Figura 1) indican que la termolabilidad de la proteasa de R. miehei pierde rápidamente actividad a temperaturas superiores a los 60°C.

Ejemplo 2 Enternecimiento de la carne usando la proteasa de R. Miehei

El siguiente experimento fue realizado para valorar el enternecimiento de la carne usando la proteasa de R. miehei.

Métodos

Se compró carne bovina (carne de cuarto trasero superior post rigor, es decir, 72 hr después de la muerte) de un matadero local y se usó fresca. Las muestras fueron pesadas e inyectadas con solución de enzimas para proporcionar un aumento de peso neto del 5% (peso de la carne mojada) a una presión de 50 psi con agujas de inyección de aproximadamente 1 pulgada. La carne fue removida durante 2 hr a 7 rpm en una cámara frigorífica (5°C) después de cortar unas muestras en rodajas de 1'' de espesor.

Se almacenaron las muestras durante 1 semana a 5°C y se analizaron en los días 1, 7 y 14, tras lo cual se midió la fuerza de cizallamiento Warner-Bratzler como sigue: Se sometieron las muestras de los centros (de 1'' de diámetro) de carne cocinada a la fuerza de cizallamiento Warner-Bratzler en un Analizador de textura TA-XT2 y la fuerza máxima estimada como indicador de ternura. La velocidad de prueba fue 2 mm/s a través de una distancia fija de 30 mm.

Resultados

De las dos enzimas evaluadas, la papaina exhibió el mayor efecto en el enternecimiento de la carne bovina. En la concentración más baja, la papaina redujo el enternecimiento en más del 40% y redujo la carne a puré a concentraciones más altas, haciendo imposible obtener cualquier evaluación de enternecimiento (Fig.2). Como contraste, la proteasa de R. miehei termolábil proporcionó un óptimo nivel de enternecimiento de la carne. Además, el uso de esta enzima permite un almacenamiento refrigerado de la carne macerada sin degradación hidrolítica adicional de la carne (Figura 3).

Ejemplo 3 Medición del grado de hidrólisis (DH)

Se analizó el DH de hidrolizados proteínicos por OPA como sigue: se preparó reactivo OPA disolviendo 7,620 g de decahidrato tetraborato di-sódico (Aldrich 22.133-3) y 200 mg de sulfato dodecilo de sodio (Sigma L-3771) en 150 ml de agua.

Se disolvió 160 mg de o-ftaldialdehido 97% (Sigma P-0657) en 4 ml de etanol y se añadió a la mezcla, llevado a 200 ml con agua desionizada. Se añadió 3 ml de reactivo OPA en una probeta, después de lo cual se añadió 400 \mul de serina estándar o muestra. Después de mezclar, se incubaron las mezclas durante exactamente 2 minutos, después de lo cual se midió la absorbencia a 340 nm. El DH es calculado usando las fórmulas siguientes:

a.

Serina NH_{2} = \frac{OD_{muestra}-OD_{bianco}}{OD_{standard}-OD_{bianco}} * 0,9516 meqv/l \frac{0,1\text{*}100 \ l/g \ \text{proteína}}{X\text{*}P}

Serina NH_{2} = meqv serina NH_{2}/g proteína

X = g muestra

P = % proteína en muestra

0,1 = volumen de muestra en litros

h = Serina-NH_{2}-\beta (meqv/g proteína)

b.

DH = H/h_{tot} * 100%

Ejemplo 4 Medición del potencial hidrolítico de una proteasa para colágeno y miofibrilas

Se realizaron los experimentos siguientes para valorar la actividad relativa de una proteasa en cada uno de los dos componentes proteínicos principales de la carne.

Actividad Colagenasa

1.: A 20 mg de colágeno de tendón bovino (Sigma) suspendido en 3,8 ml de tampón Tris (0,02 M Tris, 0,005 M CaCl_{2}, pH 7,4) se añaden 200 \mul de solución de colagenasa (o proteasa) (1 mg/ml en el tampón Tris) para hacer un volumen total de 4,0 ml.

2.: La mezcla es incubada a 40°C durante 3 hr o 70°C durante 30 minutos.

3.: Las mezclas de reacción son centrifugadas en una centrífuga Microfuge durante 10 minutos a 14.000 rpm.

4.: 1,5 ml de sobrenadante es mezclado con 4,5 ml de 5 N HCl y mantenido en un horno de secado a 110°C durante 16 hrs (durante toda la noche) para la hidrólisis completa de los péptidos solubles.

5.: A continuación se analiza el contenido de hidroxiprolina del hidrolizado como sigue:

Contenido de Hidroxiprolina

1.: El hidrolizado es diluido 25 veces con agua destilada.

2.: A 1,00 ml de hidrolizado diluido se añade 1,00 ml de solución de cloramina-T y se dejar reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.

3.: Se añade 1,00 ml de reactivo de color después de este periodo y se transfiere la mezcla reactiva a un baño de agua a 60°C e incuba durante 15 minutos.

4.: Se extraen los tubos y se dejan enfriar a temperatura ambiente.

5.: Se mide la absorbencia a 560 nm.

Extracción de Miofibrilas (Olson et al., 1976, J.Food Sci. 41: 1036-1041).

1.: Se homogeneiza 100 g de carne picada durante 30 seg en 10 vols (v/p) de tampón de fosfato KCl (100 mM, KCl, 20 mM de fosfato potásico - pH 7,0) a 11.000 rpm.

2.: El homogeneizado es centrifugado a 1.000 g durante 15 minutos y el granulado suspendido otra vez en 5 vols (v/p) de tampón y centrifugado otra vez bajo las mismas condiciones.

3.: El granulado es nuevamente suspendido en 5 vols de tampón y vertido a través de un colador para eliminar el tejido conjuntivo y los residuos.

4.: La suspensión de miofibrilas obtenida es centrifugada a 1.000 g durante 15 minutos, suspendida otra vez, y lavada dos veces más con el tampón.

5.: La miofibrila extraída es suspendida en tampón y el contenido proteínico es estimado usando el analizador proteínico Leco.

Análisis de Proteínas solubles

1.: A 2,9-3,0 ml de extracto de miofibrilas se añade 0-100 \mul de solución enzimática (1 mg proteína/ml) y se incuban las mezclas de reacción a 70°C durante 30 minutos.

2.: La reacción es detenida añadiendo 1,5 ml de ácido tricloroacético al 15% y dejando las mezclas a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3.: La suspensión es centrifugada a 10.000 rpm durante 8 minutos y la absorbencia del sobrenadante es medida a 280 nm.

De forma alternativa,

1.: Se añade 50 \mul de enzimas (1 mg de proteína/ml) a 1,95 ml de extracto de miofibrilas e incuba a 70°C durante 30 minutos.

2.: La reacción es detenida añadiendo 2 ml de ácido tricloroacético al 15% y dejando la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Ejemplo 5 Termolabilidad de la Quimosina Bovina

El siguiente experimento ha sido realizado para probar la termolabilidad de la quimosina bovina.

La enzima (Chy-Max de Chris Hansen, Inc.) fue termotratada durante 30 minutos a 55, 65, y 75°C, tras lo cual se determinó su actividad residual (expresada en Unidades Anson usando hemoglobina como sustrato) usando una Neutrasa estándar a pH 7,5.

Los resultados indican que la quimosina bovina rápidamente pierde actividad a temperaturas superiores a 60°C y retiene sólo el 10-15% de la actividad después del calentamiento a 75°C.

Claims

1. Método para enternecer carne, dicho método comprendiendo el poner en contacto la carne con una cantidad enternecedora eficaz de una proteasa hecha termolábil por tratamiento químico de la enzima nativa.

2. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha proteasa tiene una especificidad de sustrato limitada.

3. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha proteasa deriva de una especie Rhizomucor.

4. Método tal y como se define en la reivindicación 3, donde dicha especie Rhizomucor es R. miehei.

5. Método tal y como se define en la reivindicación 4, donde dicha proteasa es tratada con peroxiácidos antes de dicho contacto.

6. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha proteasa es derivada de un mamífero.

7. Método tal y como se define en la reivindicación 6, donde dicho mamífero es bovino.

8. Método tal y como se define en la reivindicación 7, donde dicha proteasa es quimosina.

9. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha proteasa se obtiene de una célula huésped recombinante transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteasa.

10. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha carne después del enternecimiento muestra una fuerza de cizallamiento relativa de entre el 50% y el 90% de dicha carne antes del enternecimiento.

11. Método tal y como se define en la reivindicación 10, donde dicha carne después del enternecimiento muestra una fuerza de cizallamiento relativa de entre el 60% y el 80% de dicha carne antes del enternecimiento.

12. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicho contacto comprende la inyección o marinación.

13. Método tal y como se define en la reivindicación 12, comprendiendo además el remover dicha carne.

14. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha carne es puesta en contacto con dicha proteasa en una proporción de entre 0,001 y 0,05 AU/g de carne.

15. Método tal y como se define en la reivindicación 1, donde dicha carne es seleccionada del grupo consistente en carne fresca, carne congelada, carne liofilizada, y carne reestructurada.