ES2245000T3 - Membranas de electrodos enzimaticos de capas multiples y sus procedimientos de produccion. - Google Patents

Abstract

SENSOR PARA SU UTILIZACION EN UN ANALITO EN UNA SOLUCION DE MUESTRA. EL SENSOR TIENE UNA VIDA UTIL MAS LARGA, UNA ESTABILIDAD MEJORADA Y UN TIEMPO DE RESPUESTA MEJORADO PARA UNA O VARIAS APLICACIONES DE USO. EN UN ASPECTO, ALGUNAS DE ESTAS METAS SE ALCANZAN GRACIAS A LA MEMBRANA DE ELECTRODOS ENZIMATICOS DE CAPAS MULTIPLES CON CAPAS NO POROSAS Y CON MICROPOROS. LA CAPA DE MICROPOROS ESTA FORMADA A PARTIR DE UN FIJADOR DE POLIMERO, UN POLVO DE POLIMERO, UN TENSIOACTIVO Y UN POLVO MINERAL. EN OTRO ASPECTO, ALGUNAS DE ESTAS METAS SE ALCANZAN UTILIZANDO UNA CAPA QUE CONSTA DE UN ENZIMA DISPUESTO DENTRO DE UNA MATRIZ DE POLIMERO. EN ALGUNAS REALIZACIONES DEL INVENTO, LA MEMBRANA DE ELECTRODOS ENZIMATICOS DE CAPAS MULTIPLES INCLUYE UNA CAPA EXTERNA CAPAZ DE DISOLVERSE EN LA SOLUCION DE MUESTRA DE TAL MANERA QUE LA CONEXION ENTRE LA MEMBRANA DE ELECTRODOS ENZIMATICOS DE CAPAS MULTIPLES Y LA SOLUCION DE MUESTRA SE RENUEVE CONTINUAMENTE.

Description

Membranas de electrodos enzimáticos de capas múltiples y sus procedimientos de producción.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a membranas de electrodos de enzimas de capas múltiples, que tienen un diseño de capas múltiples y a métodos de fabricación de las mismas y, más específicamente, a aquellas membranas que proporcionan un tiempo de respuesta y estabilidad mejorados así como un tiempo de vida útil más largo en sensores de electrodos diseñados para fines de usos sencillos o múltiples.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los sensores de electrodos diseñados para supervisar la concentración de analitos en fluidos biológicos, tales como sangre, sudor, saliva, plasma, desgarros y orina, son bien conocidos. En particular, han sido desarrollados sensores basados en encimas electroquímicas que pueden ser utilizados para medir la concentración de varios analitos, tales como glucosa o lactato, en fluidos biológicos. La capacidad de supervisar la concentración de estos analitos en fluidos biológicos es importante porque, sobre la base de la concentración de lactato o glucosa, se pueden detectar una variedad de potenciales problemas de salud. Por ejemplo, una concentración de glucosa por debajo del rango normal puede provocar inconsciencia, baja presión sanguínea y posiblemente incluso la muerte. Sin embargo, una concentración de glucosa por encima de la normal puede conducir a coma para los diabéticos. Además, una concentración de lactato por encima de un cierto nivel puede indicar una variedad de problemas que incluyen hemorragia, deshidratación, el inicio potencial de ataque cardíaco, sepsis y otras infecciones.

Los sensores de electrodos de enzimas conocidos incluyen habitualmente una capa que contiene enzima, que imparte especificidad, depositada sobre una capa de material conductor de electricidad que sirve como el electrodo. El material conductor de electricidad está depositado sobre un substrato, y una estructura de membrana recubre el electrodo. Los objetivos generales de la estructura de membrana incluyen inmovilizar y atrapar la encima, proteger el sensor frente a la putrefacción de la proteína, proteger el sensor de posibles agentes de interferencia y regular la difusión del analito para linealizar la respuesta del sensor a la concentración de analito. Típicamente, la estructura de la membrana está constituida por técnicas de película fina o gruesa, tales como, por ejemplo, impresión con tamiz de seda, estarcido, hilado, inmersión o pulverización.

Las membranas de electrodos de enzimas disponibles están diseñadas para permitir al analito de interés ser convertido por la enzima, formando un producto. Este producto de reacción participa entonces en una reacción de
reducción - oxidación en el electrodo, dando como resultado la formación de electrones. La corriente medida de los electrones es indicativa de la concentración de analitos. Por ejemplo, cuando se mide la concentración de glucosa o de lactato en sangre, el analito es oxidado en primer lugar por oxidasa de glucosa por oxidasa de lactato, respectivamente, para formar peróxido de hidrógeno, como se muestra en las reacciones 1A y 1B. El peróxido de hidrógeno es oxidado entonces para crear una corriente eléctrica (reacción 2) que indica la concentración de la glucosa o lactato en la sangre.

(1A)C_{6}H_{12}O_{6} + O_{2} ___ C_{6}H_{10}O_{6} + H_{2}O_{2}

[oxidasa de glucosa]

\vskip1.000000\baselineskip

(1B)C_{3}H_{6}O_{3} + O_{2} + H_{2}O ___ C_{3}H_{4}O_{3} + H_{2}O_{2}

[oxidasa de lactato]

La oxidación del analito por la enzima da como resultado la formación de la forma reducida de la enzima. Si una cantidad insuficiente de oxígeno es capaz de alcanzar el electrolito, la enzima puede permanecer en su forma reducida, reduciendo la utilidad del electrodo de enzima. Por lo tanto, los materiales utilizados para formar la membrana del electrodo deberían tener permeabilidades relativamente altas al oxígeno, de tal manera que puede alcanzar el electrodo de enzima para reconvertir la enzima desde su forma reducido de retorno a su forma oxidada. Además de permitir un buen transporte de oxígeno a través de la membrana para reconvertir la enzima, es deseable proporcionar un transporte de oxígeno suficiente a través de la membrana para que el oxígeno no sirve como reactivo de limitación en la reacción general.

Para proporcionar un incremento constante de la señal por unidad de incremento de concentración de analito (es decir, para conseguir buena reproducibilidad), el analito debería ser el reactivo de limitación de la velocidad. Por lo tanto, como se describe en el párrafo anterior, la membrana debería proporcionar buen transporte de oxígeno. Además, la cantidad de enzima inmovilizada en el electrodo debería ser suficiente para reaccionar con el analito que llega al electrodo de enzima sin que la enzima reaccione como un reactivo de limitación de la velocidad. Para conseguir este objetivo, la membrana debería estar formada a partir de materiales capaces de controlar el flujo del analito a través de la membrana y el electrodo debería contener una cantidad comparativamente grande de enzima, o ambas cosas.

Se puede utilizar una solución de muestra para calibrar los electrodos de enzima midiendo la salida de corriente eléctrica para una concentración fija de analito. La solución de muestra utilizada para esta calibración es con preferencia una solución acuosa para facilitar la fabricación y para mejorar la estabilidad de almacenamiento (es decir, el tiempo de conservación). Aunque la solución de la muestra utilizada para calibrar el sensor es una solución acuosa que contiene sales de bajo peso molecular, las solucione a medir son fluidos biológicos, tales como sangre entera que contiene proteínas y otros orgánicos. Con frecuencia existe una diferencia inherente en respuesta al analito entre el electrodo de enzima en la solución de muestra de calibración acuosa y el electrodo de enzima en la porción que contiene solución de analito. Sin embargo, para asegurar la calibración fiable, esta diferencia de respuesta entre los electrodos de enzima de las dos soluciones, referida comúnmente como la relación proporcional inestable de sangre / acuosa, no debería cambiar con el tiempo.

Ciertas membranas de electrodos de enzimas, tales como membranas de policarbonato de trayectoria decapada químicamente, son capaces de regular el flujo de analito y de reducir la putrefacción de la proteína del electrodo. Sin embargo, estas membranas son membranas autónomas, de manera que no se pueden preparar fácilmente sobre la parte superior de un microsensor plano.

De acuerdo con ello, es deseable proporcionar una membrana de electrodos de enzimas de capas múltiples que se forma a partir de materiales que dan como resultado una relación proporcional estable de sangre / acuosa, permitiendo al mismo tiempo que el analito sirva como el reactivo de limitación de la velocidad. Además, es particularmente deseable proporcionar una membrana de electrodos de enzima que sea capaz de supervisar la concentración de glucosa y lactato en sangre.

Resumen de la invención

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar una membrana de electrodos de enzimas que es capaz de proporcionar una relación proporcional estable de sangre / acuosa.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una membrana de electrodos de enzimas de capas múltiples diseñada de tal manera que el analito es el reactivo de limitación de la velocidad.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar una membrana de electrodos de enzimas de capas múltiples, que prolonga la vida útil del sensor.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar una membrana de electrodos de enzimas de capas múltiples que reduce la putrefacción de la enzima por proteínas y bloquea los agentes de interferencia de peso molecular relativamente alto.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una membrana de electrodos de enzimas de capas múltiples que tiene una membrana formada por más que una capa.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar una membrana de electrodos de enzimas de capas múltiples que tiene al menos una capa microporosa para controlar el caudal de analito a través de la membrana.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos de fabricación de una cualquiera o de todas estas membranas de electrodos de enzimas de capas múltiples.

En una forma de realización ilustrativa, la presente invención proporciona un sensor para medir una concentración de un analito en una solución, comprendiendo el sensor:

un substrato (12) formado a partir de un material de aislamiento eléctrico:

una capa de electrodo (15) formada a partir de un material conductor de electricidad, estando soportada la capa de electrodo por el substrato (12);

una capa de enzima inmovilizada (20) que incluye una enzima inmovilizada en un miembro de soporte, estando soportada la capa de enzima inmovilizada por la capa de electrodo (15);

una capa de adhesivo (30) formada a partir de un silano, apoyándose dicha capa de adhesivo a tope en dicha capa de enzima inmovilizada (20);

una capa de polímero de enzima (35) que se apoya a tope en dicha capa de adhesivo (30); y

una capa de polímero de enzima (35) que se apoya a tope en dicha capa de adhesivo (30); y

una capa microporosa (40) que se apoya a tope en dicha capa de polímero de enzima (35).

En otra forma de realización ilustrativa, la presente invención proporciona un método de medición de una concentración de un analito dispuesto dentro de una solución, conteniendo la solución, además, al menos un agente de interferencia, comprendiendo el método las etapas de:

acoplar operativamente un sensor de electrodo de acuerdo con la invención con la solución en la que está dispuesto el analito; y

hacer pasar la solución, en la que está dispuesto el analito a través de la capa microporosa, reduciendo al mínimo al mismo tiempo el paso de al menos un agente de interferencia a través de la capa microporosa hasta la capa del electrodo.

Breve descripción de los dibujos

Las características, objetos y ventajas de la presente invención se comprenderán mejor a partir de la siguiente descripción de la invención cuando se lee en combinación con los dibujos que se acompañan, en los que:

La figura 1 es una vista de la sección transversal de una forma de realización de una membrana de electrodo de enzima de capas múltiples de acuerdo con la presente invención; y

La figura 2 es una representación esquemática de una forma de realización de una estación de trabajo que se puede utilizar para aplicar una capa de enzima de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada

La presente invención proporciona un sensor de electrodo que proporciona una relación proporcional estable de sangre / acuosa, proporcionando al mismo tiempo una restricción a la difusión, de tal forma que el analito es el reactivo de limitación de la velocidad. Al menos en parte, la difusión restringida se consigue por el uso de al menos una capa microporosa que limita el transporte del analito a través del sensor. Variando el tamaño de los poros de la capa microporosa y/o el espesor de la capa microporosa, se puede controlar el transporte de analito a través de la membrana de capas múltiples. Además, al menos en parte, la estabilidad de la relación proporcional de sangre / acuosa es proporcionada por una capa del sensor que comprende una enzima dispuesta dentro de una matriz de polímero.

La figura 1 ilustra un sensor 10 de acuerdo con una forma de realización de la presente invención. El sensor 10 incluye una porción de electrodo 100 y una porción de membrana 90. La porción de electrodo incluye una capa de substrato 12, una capa de electrodo 15, una capa de enzima inmovilizada 20, una capa dieléctrica 25, una capa de adhesivo 30 y una capa de enzima / polímero 35. La porción de membrana 90 incluye una capa microporosa 40, una capa de agente tensioactivo / polímero 45 y una capa de estabilización 50.

Como se muestra en la figura 1, la capa de substrato 12 soporta la capa 15 y la capa dieléctrica 25. La capa adhesiva 30 está soportada por la capa de enzima inmovilizada 20 y la capa dieléctrica 25. La capa microporosa 40 está soportada por la capa de enzima / polímero 35 y por la capa adhesiva 30. La capa de agente tensioactivo / polímero 45 está soportada por la capa microporosa 40, y la capa de estabilización 50 está soportada por la capa 45.

El substrato 12 puede estar formado a partir de cualquier material substancialmente de aislamiento eléctrico, tal como, por ejemplo, cerámica, vidrio, refractarios, polímeros o combinaciones de los mismos. La formación de un substrato de aislamiento como un soporte mecánico o base es bien conocida por los técnicos ordinarios en la materia. Con preferencia, el substrato 12 está formado substancialmente por alúmina. En una forma de realización particularmente preferida, el substrato 12 comprende aproximadamente 96% de alúmina y aproximadamente 4% de aglutinante de vidrio (disponible a partir de Coors Ceramic Company, Grand Juntion, Colorado). El substrato 12 tiene con preferencia un espesor entre aproximadamente 0,02 pulgadas y aproximadamente 0 m,05 pulgadas y tiene más preferentemente 0,025 pulgadas aproximadamente.

La capa de electrodo 15 está formada a partir de un material conductor de electricidad, tal como un metal o aleación. Con preferencia, la capa 15 comprende un metal del grupo de platino (platino, paladio, iridio, rodio) y mezclas de los mismos. Más preferentemente platino, paladio y mezclas de los mismos, y más preferentemente platino. Aunque se han descrito aquí materiales particulares adecuados para la construcción de la capa 15, debería entenderse que está lista no es limitativa y que la capa 15 puede comprender también otros materiales conductores de electricidad. No obstante, la capa 15 debería estar compuesta por un material que no se oxida o se reduce en un rango potencial, en el que se produce la oxidación o reducción del analito. Adicionalmente, los materiales selectivos para la fabricación de la capa 15 están de una manera deseable libres de impurezas de cualquier tipo, tales como metales de baterías (electroquímicamente activos en agua), que están presentes típicamente en los materiales en existencias que están disponibles en el comercio para impresión con tamiz, adhesión de alambre, estañado o soldadura. Con preferencia, la capa 15 tiene un espesor entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 20 micrómetros y más preferentemente tiene 15 micrómetros aproximadamente.

En una forma de realización particularmente preferida, la capa 15 está formada a partir de una pasta de platino, tal como el producto Nº PC10208/Pt disponible de Metech, Inc. localizada en Elverson, PA. Otras pastas de metal que son adecuadas para uso en la formación de la capa 15 serán evidentes para los técnicos en la materia.

Por encima de la capa 15 está localizada la capa de enzima inmovilizada 20, que comprende una enzima inmovilizada en un miembro de soporte conductor de electricidad, que comprende una capa porosa de partículas de carbono o de grafito adheridas con resina. Las partículas tienen una metal del grupo de platino dividido finamente mezclado íntimamente con ellas o depositado o adsorbido sobre la superficie de las partículas individuales antes de la adhesión para formar la capa. Esto forma una capa de substrato porosa, en la que la enzima está inmovilizada y comprende una capa substancialmente heterogénea de partículas de carbono o de grafito adheridas con resina para el metal del grupo de platino adsorbido sobre las partículas de carbono o grafito. Una enzima inmovilizada o adsorbida sobre una capa porosa de partículas de platino adheridas con resina es útil en la presente invención, como se describe por Mullen, en la patente de los Estados Unidos Nº 5.160.418 y por Benneto y col. en la patente de los estados Unidos Nº 4.970.145, las cuales son incorporadas aquí por referencias. La capa de enzima inmovilizada 20 puede estar formada de una manera alternativa depositando en primer lugar el metal del grupo de platino finamente dividido, opcionalmente preadsorbido sobre o mezclado con carbono o grafito finamente dividido, con o sin todo o parte del aglutinante de resina, si se usa, sobre la superficie de la capa 15.

El metal del grupo de platino en forma elemental finamente dividida, que incluye latino, paladio, iridio, o rodio, puede ser sustituido por los óxidos correspondientes, tales como óxido de platino o de paladio. Por lo tanto, todas las referencias indicadas aquí con respecto al material de platino deben entenderse en el sentido de que incluyen un metal del grupo de platino, como se ha descrito anteriormente y/u óxido correspondiente, que contiene metales, a no ser que el contexto requiera otra cosa.

Se puede utilizar cualquier polvo de carbono o grafito adecuado, que permita fácilmente la inmovilización siguiente de una enzima para formar la capa de enzima inmovilizada 20. Con este fin, el polvo de carbón debería utilizarse con una alta densidad de grupos funcionales, tales como grupos que contienen carboxilato, amino y azufre, sobre la superficie, en oposición a los carbonos más vítreos y vidriosos, que solamente aglutinan las enzimas escasamente. Típicamente, el tamaño de las partículas de polvo de carbono o grafito varía entre aproximadamente 3,0 nm y aproximadamente 50,0 nm; particularmente, los tamaños de las partículas oscilan entre aproximadamente

\hbox{5,0 nm y 30,0
nm.}

El platino se puede depositar sobre las partículas de carbón de cualquier manera conveniente. Por ejemplo, deposición de fase de vapor, deposición electroquímica o absorción simple a partir de suspensión coloidal para proporcionar cargas de metal del grupo de platino en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20,0% en peso, sobre la base del peso de carbono. Con preferencia, las cargas de metal del grupo de platino están entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 15,0% en peso. Sin embargo, estos límites son más prácticos que críticos. Por debajo de aproximadamente 1,0% de metal del grupo de platino, la señal de salida cae hasta un nivel que, en términos prácticos, puede ser demasiado bajo para ser medido, excepto por aparatos muy sensibles; por encima de aproximadamente 20,0%, la carga de metal del grupo de platino puede llegar a ser antieconómica, con poca ventaja adicional en términos de incremento de la respuesta o sensibilidad. En la técnica preferida, el polvo de carbono es platinizado por la descomposición oxidada de un compuesto de platino, tal como un ácido cloroplatínico o, más preferentemente, un complejo de platino o paladio con un ligando oxidable, en la presencia del polvo de carbono, para depositar de esta manera platino o paladio de tamaño coloidal directamente sobre la superficie de la partícula de carbono, de la manera enseñada, por ejemplo, por Petrow y col., en las patentes de los Estados Unidos Nº 4.044.193 y 4.166.143, las cuales se incorporan aquí por referencia. Con preferencia, las partículas de metal o de óxido del grupo de platino tienen un tamaño de partículas en el intervalo entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 20,0 nm, y más preferentemente tienen un tamaño coloidal en el intervalo entre aproximadamente 1,0 nm y aproximadamente 4,0 nm.

Los materiales de substrato preferidos utilizados en la capa de enzima inmovilizada 20 son materiales disponibles en el comercio, vendidos bajo el nombre Platinum o Carbon Black de E-TEK, localizados en Framingham, MA. Una enzima, tal como oxidasa de glucosa u oxidasa de lactato, se puede inmovilizar sobre partículas de polvo de carbono platinizado, preparado por la deposición de latino coloidal que tiene un tamaño de partículas entre aproximadamente 1,5 nm y aproximadamente 2,5 nm sobre el polvo de carbono, que tiene un tamaño nominal de aproximadamente 30,0 nm, por la composición oxidada de ácido de platino sulfito complejo (II) utilizando peróxido de hidrógeno.

En la presente invención, el carbono activado de platino es tratado en formulación de tampón de fosfato que tiene un pH de aproximadamente 7,5. El carbono activado de platino se añade al tampón para neutralizar cualquier ácido sulfúrico presente a partir de la formulación de las partículas de polvo de carbono platinizado. A la mezcla de carbono activado de platino y tampón se añade una co-proteína, tal como albúmina de suero bovino, para adsorber sobre el carbono. La albúmina de suero bovino se añade para ayudar a estabilizar la enzima, como se conoce por los técnicos en la materia. Un aglutinante hidrófobo, tal como un poliéster formado a partir de un diácido y un diol, se añade entonces a la mezcla de albúmina de suero bovino / carbono activado de platino. Un ejemplo de un aglutinante hidrófobo es la solución de resina disponible comercialmente vendida bajo el nº de producto 8101RS de Metech. Aunque se han descrito aquí formulaciones particulares del aglutinante hidrófobo, se entiende que se contemplan otros aglutinantes hidrófobos que son adecuados para uso en la presente invención. Tales aglutinantes hidrófobos deberían ser capaces de retener los componentes de la capa activa juntos después de la evaporación del disolvente. Con preferencia, estos aglutinantes hidrófobos deberían ser capaces de servir como modificadores de la reología que permiten la impresión de la mezcla con una resolución más alta.

Con este fin, se puede añadir un agente tensioactivo para proporcionar mejores características de flujo de impresión cuando la capa de enzima inmovilizada 20 es impresa por tamiz sobre la capa 15. Una ventaja adicional del agente tensioactivo puede ser que actúa como un agente humectante para electrodo de capas múltiples 90 durante el uso, puesto que la capa de enzima inmovilizada 20 puede comprender el aglutinante hidrófobo (descrito anteriormente) que resulta difícil de humedecer con agua después de que está totalmente seco. El agente tensioactivo contribuye a facilitar la humidificación de la capa de enzima inmovilizada 20 en estas condiciones. De acuerdo con la presente invención, el material tensioactivo puede ser cualquier tensioactivo líquido, que es soluble en agua y que muestra un balance hidrófilo lipófilo (HLB) en el intervalo entre aproximadamente 12 y aproximadamente 16. Tales materiales son conocidos por los técnicos en la materia, y son típicamente materiales tensioactivos que incluyen alcoholes alquilarilpoliéter, tal como alquilfenoxipolietoxietanol. Un material de este tipo es vendido bajo la marca comercial Triton® de Union Carbide Chemicals y Plastics Company, Inc., localizada en Danbury, CT. El material preferido para uso en la presente solicitud es el agente tensioactivo Triton® X-100 (HLB 13,5).

Después de que estos componentes han sido molidos, se puede añadir un diluyente de resina para ajustar la viscosidad de la capa de enzima inmovilizada 20 para fines de impresión. Típicamente, se utiliza un diluyente de resina a base de disolvente de petróleo para llevar la viscosidad de la pasta dentro del intervalo entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 100.000 centipoise. Los diluyentes de resina para esta finalidad están disponibles en el comercio como diluyente con el número de producto 8101 de Metech. Típicamente, tales diluyentes son mezclas de glimas de alto punto de ebullición y destilados de petróleo. Una enzima, tal como oxidasa de lactato u oxidasa de glucosa, se añade entonces a la mezcla y la pasta final es impresa con tamiz sobre la capa 15. Se pueden añadir otras enzimas de una manera similar a la mezcla para preparar la capa activa especifica de otros analitos.

La capa dieléctrica 25, que está formada a partir de dos porciones, está dispuesta sobre el substrato 12. Cuando se observa desde una vista superior del sensor 10, cada una de las dos porciones de la capa dieléctrica 25 aparecen como láminas alargadas individuales. Con preferencia, estas láminas tienen un área aproximadamente rectangular cuando se observa desde una vista superior del sensor 10. El material seleccionado para la fabricación de la capa dieléctrica 25 es de una manera deseable aislante eléctricamente y no poroso, libre de impurezas, que puede ser sometido a oxidación o reducción en el intervalo potencial de cualquier analito a medir. Este material es seleccionado, además, para que esté libre de iones móviles, que llevarían potencialmente carga e interferirían con la actividad de cualquier electrolito empleado en una membrana de capas múltiples 100. Además, la capa dieléctrica 25 debería adherirse firmemente al substrato 12 para permitir al sensor 10 poder ser dirigido eléctricamente con contactos eléctricos, tales como conductores eléctricos o similares, aunque las porciones de aislamiento eléctrico efectivo cubiertas por los materiales dieléctricos, que son adecuados para uso en la capa dieléctrica 25, incluyen, pero no están limitados a cerámica, vidrio, materiales refractarios, materiales poliméricos o combinaciones de ellos. Un material cerámico preferido para uso en la capa dieléctrica 25 está disponible como producto número 9615 de E. I. DuPont de Nemours & Co., Electronics Department, localizado en Wilmington, DE. Con preferencia, la capa dieléctrica 25 tiene un espesor entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 50 micrómetros y más preferentemente 20 micrómetros aproximadamente. Estos espesores se miden después de la combustión o curado. Como se conoce por los técnicos en la materia, la capa dieléctrica 25 puede depositarse sobre el substrato 10 utilizando una variedad de técnicas conocidas por los técnicos en la materia, tales como, por ejemplo, estarcido o impresión con tamiz de seda.

La capa adhesiva 30 está diseñada para promocionar la adhesión entre la capa de enzima inmovilizada 20 y la capa de enzima / polímero 35 así como entre la capa dieléctrica 25 y la capa microporosa 40. Adicional o alternativamente, la capa adhesiva 30 está diseñada para aislar la capa 35 de la capa 20 con el fin de prolongar la vida de la enzima depositada dentro de la capa 35 (descrita a continuación). Los materiales que son capaces de conseguir estos objetivos y, por lo tanto, son adecuado para uso como capa adhesiva 30 están limitados a silanos, que incluyen aminosilanos, estiril silanos, aminoalquilalcoxisilanos, clorosilanos, alquilsilanos y alquilalcoxisilanos. En una forma de realización preferida, la capa 30 está formada de aminopropil-trietoxisilano (APTES).

La capa 30 debería ser capaz de transportar peróxido y/o ácido láctico a la capa 20 desde la solución de analito. No obstante, si la capa 30 es demasiado gruesa, puede estar limitado el transporte de peróxido y/o de ácido láctico a la capa 20. Por lo tanto, la capa adhesiva 30 tiene con preferencia un espesor entre aproximadamente 0,1 micrómetro y aproximadamente 1 micrómetro.

La capa 30 se puede aplicar utilizando una variedad de técnicas conocidas que incluyen técnicas de revestimiento, de pulverización y de inmersión. Debido a que la capa 30 se aplica sobre la capa de enzima inmovilizada, se prefiere que la capa 30 sea aplicada utilizando un proceso que no es perjudicial para la enzima inmovilizada dispuesta dentro de la capa 20. De acuerdo con ello, en una forma de realización preferida, la capa adhesiva 30 se forma vertiendo una solución acuosa de uno de los materiales mencionados anteriormente sobre la parte superior de las capas 20 y 25 (figura 1), dejando que la solución repose durante un periodo de tiempo, drenando la solución y retirando el exceso de solución girando con un aparato de revestimiento giratorio. La superficie es secada a continuación a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas para eliminar el disolvente remanente y para endurecer el material de silano. En una forma de realización particularmente preferida, esta técnica es utilizada con un 5% en peso de solución acuosa de APTES con una etapa de secado que se realiza a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo de aproximadamente 24 horas a una humedad relativa menor que aproximadamente 60%. Hay que indicar que se ha encontrado que es ventajoso reducir al mínimo la cantidad de tiempo entre la preparación de la solución y la aplicación de la solución. Con preferencia, este periodo de tiempo es a lo sumo aproximadamente 30 minutos.

La capa de enzima / polímero 35 está diseñada para incrementar el periodo de tiempo durante el que el sensor proporcional de sangre / acuosa 10 es constante. Para ayudar a con seguir este objetivo, la capa 35 debería disponerse solamente en un área por encima del área definida por la capa de enzima inmovilizada 20 (es decir, que la capa 35 debería disponerse solamente por encima de la porción de electrodo 10 sensible al analito formado por la capa 20). En particular, puesto que el sensor 10 puede ser parte de un sistema general, que incluye varios electrodos, al menos uno de los cuales puede estar inactivo, la capa 35 debería disponerse de tal manera que no cubra un electrodo inactivo incluido en un sistema, del que puede formar parte la capa 35 (es decir, que la capa 35 no debería cubrir tal electrodo in activo). "Electrodo inactivo" como se utiliza aquí se refiere a un electrodo corrector que no incluye una cantidad catalíticamente activa de una enzima activa catalíticamente. De una manera típica, tales electrodos incluyen al menos un substrato, un electrodo y capas de enzima inmovilizadas, en las que la capa de enzima inmovilizada incluye, por ejemplo, albúmina de suero bovino. Con preferencia, el área de la capa 35, en una dirección perpendicular a la sección transversal mostrada en la figura 1 (es decir, a lo lado de una vista superior del sensor 10) representa entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 100% del área de la capa 20, más preferentemente entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 95%, y más preferentemente entre el 60% y el 90% aproximadamente. Con preferencia, la capa 35 tiene un espesor entre aproximadamente 1 micrómetro y aproximadamente 30 micrómetros, más preferentemente entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 20 micrómetros y más preferentemente entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 15 micrómetros.

La capa 35 debería incluir la misma enzima que está dispuesta dentro de la capa de enzima inmovilizada 20. Por ejemplo, si la capa 20 incluye sidaza de lactato dispuesta allí, la capa 35 debería comprender también oxidasa de glucosa.

Además de la enzima, la capa 35 comprende un polímero que debería tener una solubilidad comparativamente baja en agua en las condiciones de uso del sensor 10 (es decir, aproximadamente 37ºC). Con preferencia, el polímero se puede aplicar desde líquido, o bien como una solución en agua o puro. Una vez aplicada, la capa 35 se puede secar o endurecer para conseguir baja solubilidad del polímero. Los materiales adecuados para uso en la capa 35 deberían proporcionar también un entorno que contribuya al mantenimiento de la conformación normal de la enzima. Por lo tanto, si la enzima es oxidasa de lactato, el polímero debería ser capaz de proporcionar un entorno de adhesión de oxígeno. Una lista ejemplar y no limitativa de polímeros adecuados para uso en la capa de enzima / polímero 35 incluye polivinil pirrolidona, gelatina, polihidroxietil-metacrilato (PHEMA) y alcoholes polihídricos, tales como alcohol de polivinilo (PVOH). Para algunos de estos materiales, que son relativamente solubles en agua, tales como PVOH y polivinilpirrolidona, puede ser deseable hacerlos menos solubles en agua a través de la reticulación después de la deposición. Los métodos adecuados de reticulación de tales materiales son conocidos por los técnicos en la materia y están destinados para estar dentro del alcance de la presente invención. Con esta disposición, la enzima de la capa 35 está dispuesta dentro de una matriz de polímero formada por el polímero de la capa 35.

En formas de realización, en las que la enzima en la capa 35 es oxidasa de lactato, el polímero de la capa 35 debería ser un alcohol polihídrico, tal como PVOH. Con preferencia, el polímero es PVOH hidrolizado al 99,9% (es decir, que tiene menos que aproximadamente 0,1% de grupos acetato). Hay que indicar que el incremento de la cantidad de hidrólisis hace que el PVOH sea más difícil de disolver en agua a temperatura ambiente, pero utilizando una forma más soluble de PVOH se puede provocar que la membrana de capas múltiples 100 se hinche, provocando en último término que la enzima sea eliminada por lavado de la membrana de capas múltiples 100. Con preferencia, el PVOH tiene un peso molecular entre aproximadamente 70.000 y aproximadamente 300.000. El PVOH que tiene un peso molecular más alto es más difícil de manipular cuando se prepara la capa 35 como se describe a continuación, y el PVOH que tiene un peso molecular más bajo puede hacer que el material sea demasiado soluble.

La capa de enzima / polímero 35 se puede preparar por el método descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos asignada en común con el nº de serie _____ presentada en la misma fecha que la presente solicitud, y titulada Sensors for Measuring Analyte Concentrations and Methods of Making Same, que se incorpora aquí, por lo tanto, por referencia. Este método incluye las etapas siguientes. Se forma una suspensión de polímero y agua a temperatura ambiente, luego se calienta para disolver el polímero. La solución se refrigera a temperatura ambiente y se añade la enzima. La cantidad de polímero disuelto en el agua varía en función de la enzima, el polímero, el peso molecular del polímero, y el analito a detectar. Por ejemplo, cuando se utiliza oxidasa de lactato como la enzima y se utiliza PVOH hidrolizado al 99,9%, que tiene un peso molecular entre aproximadamente 70.000 y aproximadamente 300.000 como la solución de polímero, el porcentaje en peso de PVOH disuelto en agua está con preferencia entre aproximadamente 2% y aproximadamente 15%, más preferentemente entre aproximadamente 5% y aproximadamente 10% y con más preferencia 7% aproximadamente. A medida que se reduce el peso molecular del PVOH, se incrementa la solubilidad en agua del PVOH. Por lo tanto, para PVOH de peso molecular más alto, estos rangos se reducen y para PVOH de peso molecular más bajo, estos rangos se pueden incrementar. La cantidad de enzima disuelta en la solución de PVOH/agua varía en función de la enzima, el PVOH y el analito a detectar. Cuando la enzima es oxidasa de lactato y el polímero es PVOH hidrolizado al 99,9%, que tiene un peso molecular entre aproximadamente 70.000 y aproximadamente 300.000, el porcentaje en peso de oxidasa de lactato disuelta en la solución de PVOH / agua está con preferencia entre aproximadamente 2% y aproximadamente 20%, más preferentemente entre aproximadamente 4% y aproximadamente 8% y con más preferencia aproximadamente 6%. Estos pesos se refieren a oxidasa de lactato de actividad unitaria entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 unidades por miligramo de polvo. Alternativamente, la oxidasa de lactato se puede añadir en base a la actividad. Por ejemplo, para proporcionar una enzima que tiene una actividad de aproximadamente 35 unidades por miligramo, deberían añadirse entre aproximadamente 1000 unidades y aproximadamente 8000 unidades de enzima a aproximadamente 2,0 gramos de PVOH al 7% en agua, más preferentemente entre aproximadamente 2000 unidades y aproximadamente 7000 unidades de enzima y más preferentemente entre aproximadamente 4000 unidades y aproximadamente 5000 unidades de enzima.

La capa 35 se puede aplicar a la capa de adhesivo 30 utilizando cualquiera de las técnicas conocidas por los técnicos en la materia, que sea capaz de limitar la localización de la capa 35 como se ha descrito anteriormente. En una forma de realización preferida, la solución descrita anteriormente se aplica a la capa de adhesivo 30 utilizando una estación de trabajo de localización, que comprende una bomba de jeringa con conexiones de fluido hasta una aguja de distribución. Una estación de trabajo de este tipo 200 se ilustra en la figura 2 e incluye un conmutador de pedal 201, una bomba de jeringa 204, una jeringa de relleno 206, un entubado 208, un microscopio 210, un adaptador macho 212, una luz de microscopio 214, una aguja de distribución 216, una válvula de tres pasos 218 y un posicionador vertical 220. La posición de la capa 20 con respecto a la aguja de distribución 216 se verifica utilizando el microscopio 210. Cuando la capa 30 está localizada debajo de la aguja 216, el conmutador de pedal 201 es presionado por el usuario de manera que la bomba de jeringa 202 distribuye una pequeña cantidad de solución utilizada a través de la aguja de distribución 216. Típicamente, la estación de trabajo 200 está prevista de tal manera que se distribuye una parte alícuota de 20 nanolitros (nL) de solución por medio de la aguja 216, pero se pueden distribuir otras cantidades de solución, con tal que la capa 35 tenga las dimensiones descritas aquí. Después de haber sido depositada sobre la capa de adhesivo 30, la capa 35 debería secarse al aire a una temperatura de aproximadamente 25ºC durante un periodo de tiempo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4
horas.

Se cree que el comportamiento proporcional de sangre / acuosa no lineal de los sensores de la técnica anterior puede resultar de la difusión de la enzima desde estos sensores hasta la solución que contiene el analito. De acuerdo con la presente invención, la capa 35 incrementa la cantidad de enzima presente en el sensor 10, que puede contribuir al retraso del comienzo de tal comportamiento no lineal por el sensor 10. Además, el polímero de la capa 35 puede actuar para inmovilizar la enzima, reduciendo de esta manera la velocidad de la difusión de la enzima desde el electrodo 10 hasta la solución de analito. Además, la capa 35 puede reducir la velocidad de la difusión de la enzima desde el electrodo 10 hasta la solución de analito incrementando la distancia entre la capa de enzima inmovilizada 20 y la solución de analito.

En algunas formas de realización, cuando la capa 40 comprende la composición preferida como se describe aquí, el sensor 10 no tiene que incluir la capa 45 o la capa 50 (descrita a continuación) para reducir o eliminar la putrefacción de la proteína del sensor 10. Esto puede ser particularmente deseable cuando el sensor 10 es utilizado en aplicaciones de un solo uso.

La capa microporosa 40 está diseñada para impartir un rendimiento mejorado y para incrementar el tiempo de vida útil del sensor 10. La capa 40 consigue este objetivo limitando la velocidad a la que el analito alcanza la capa de enzima inmovilizada 20 proporcionando al mismo tiempo un buen transporte de oxígeno, de manera que el oxígeno no funciona como el reactivo de limitación de la velocidad en la reacción, que ocurre en las capas 20 y 55. Además, la capa 40 es capaz con preferencia de contribuir a la prevención de la putrefacción de la capa de enzima inmovilizada 20, impidiendo que los agentes de interferencia contenidos en la solución de analito alcancen la capa 20 y atrapando la enzima contenida en las capas 20 y 35 para reducir la proporción a la que la enzima es retirada del sensor 10. Con preferencia, la capa 40 puede excluir que las moléculas, que tienen un peso molecular de al menos aproximadamente 10.000, alcancen la capa 20. La capa microporosa 40 tiene con preferencia un espesor desde aproximadamente 10 micrómetros hasta aproximadamente 40 micrómetros, más preferentemente entre aproximadamente 15 micrómetros y aproximadamente 30 micrómetros y con más preferencia entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 25 micrómetros.

La copa microporosa 40 incluye un polvo de polímero, un polvo mineral, un aglutinante de polímero y al menos un agente tensioactivo. Los polvos de polímero adecuados para uso en la presente invención deberían tener un transporte de oxígeno relativamente alto. Además, estos polvos de polímero deberían ser comparativamente inmiscibles con la mayoría de los otros materiales polímeros. Los polifluorocarburos, incluyendo el Teflón® de la familia de los polvos de politetrafluoretileno disponibles de DuPont, son adecuados para uso como el polvo de polímero de la capa 40. Un ejemplo de un polvo de polímero de hidrocarburo fluorado es MP1100 Teflon® (duPont). Con preferencia, el polvo de polímero tiene un tamaño medio de las partículas entre aproximadamente 0,02 micrómetros y aproximadamente 10 micrómetros, más preferiblemente entre aproximadamente 0,05 micrómetros y aproximadamente 5 micrómetros, y con más preferencia entre aproximadamente 0,1 micrómetro y aproximadamente 1 micrómetro. En una forma de realización particularmente preferida, el polvo de polímero comprende polvo de Teflón® MP1100 de DuPont que tiene un tamaño medio de las partículas de aproximadamente 0,2 micrómetros.

El polvo mineral puede ser cualquier material sólido inerte, capaz de incrementar la capacidad hidrófila de la capa 40. Puesto que los agentes tensioactivos, descritos más adelante, pueden disolverse fuera de la membrana de capas múltiples 100 de la presente invención sobre el tiempo, el polvo mineral de la capa 40 permite a la membrana de capas múltiples 100 permanecer humedecida durante periodos relativamente largos de exposición a la solución de analito. Tales polvos incluyen polvo de alúmina, polvo de sílice, polvos de óxidos de metal, polvos de materiales poliméricos y combinaciones de los mismos. Con preferencia, el polvo mineral comprende polvo de alúmina. El polvo mineral tiene con preferencia un tamaño medio de las partículas que varía entre aproximadamente 0,1 micrómetro y aproximadamente 5 micrómetros, más preferentemente entre aproximadamente 0,2 micrómetros y aproximadamente 3 micrómetros, y más preferentemente entre aproximadamente 0,3 micrómetros y aproximadamente 1 micrómetro. En una forma de realización particularmente preferida, el polvo mineral comprende polvo de \alpha-alúmina, adquirido en forma de una emulsión y que tiene un tamaño medio de las partículas de aproximadamente 0,3 micrómetros número de producto 40-6352-006, disponible de Buehler Laboratory, localizado en Lake Bluff, IL). Hay que indicar que se ha encontrado que este polvo mineral es ventajoso debido a que contribuye a mantener la integridad mecánica del sensor 10 (es decir, que este polvo mineral ayuda a las capas del sensor 10 a adherirse juntas).

El aglutinante polímero de la capa compuesta 40 debería ser compatible con el polvo de polímero de la capa 40. Por ejemplo, si el polímero comprende un polvo de Teflón®, un aglutinante de polímero adecuado es un aglutinante de perfluorohidrocarburo. Tales aglutinantes de polímeros de perfluorohidrocarburos incluyen aglutinante de polímero Teflon® disponible de duPont.

Se considera que el agente tensioactivo en la capa 40 permite que la membrana de capas múltiples 100 se hidrate después de la primera exposición a la solución de analito. Por lo tanto, el agente tensioactivo debería ser compatible con el agua. Además, el agente tensioactivo de la capa 40 debería mejorar la compatibilidad entre el polvo de polímero y el polvo mineral. Típicamente, el agente tensioactivo es un agente tensioactivo no iónico. Tales agentes tensioactivos no iónicos son con preferencia agentes tensioactivos no iónicos de alquil alcoxilato, tales como agente tensioactivo FC-171 Fluorad® de la 3-M Company, localizada en St. Paul, MN. Otros agentes tensioactivos adecuados para uso en la capa 40 son conocidos por los técnicos en la materia y están destinados para estar dentro del alcance de la presente invención.

En la preparación de la capa 40, se pueden utilizar uno o más disolventes para formar una suspensión o emulsión que incluye el polvo de polímero, el aglutinante de polímero, el agente tensioactivo y el polvo mineral. Los disolventes utilizados en la preparación de la capa 40 pueden ser cualquier disolvente, con tal que sea capaz de disolver el aglutinante de polímero de la capa 40. Además, el disolvente debería ser inocuo para la enzima. Con preferencia, los disolventes de la capa 40 tienen puntos de ebullición comparativamente altos, de manera que se puede utilizar la impresión con tamiz o el estarcido cuando se aplica la capa 40. Por lo tanto, si el sensor 10 incluye oxidasa de lactato y la capa 40 incluye un polvo de polímero de hidrocarburo fluorado así como un aglutinante de polímero de hidrocarburo fluorado, los disolventes adecuados para la capa 40 incluyen hidrocarburos fluorados. Con preferencia, el disolvente es un hidrocarburo perfluorado que tiene aproximadamente 12 átomos de carbono. En una forma de realización preferida, los disolventes de la capa 40 comprenden disolvente FC-43 Fluorinert® y disolvente FC-70 Fluorinert®, ambos disponibles de 3-M.

De acuerdo con una forma de realización, la capa compuesta 40 se forma disolviendo el aglutinante polímero en una solución formada a partir del / los disolvente(s). El agente tensioactivo se añade entonces seguido por el polvo de polímero y el polvo mineral. Para reducir el tamaño del aglomerado de la mezcla resultante, la mezcla se puede triturar con rodillos, trituras con bolas, o manipular de otra manera para reducir el tamaño del aglomerado de la mezcla. La mezcla se aplica entonces a porciones de capa de adhesivo 30 y a la capa de enzima / polímero 35, como se indica en la figura 1 utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los técnicos en la materia, tales como revestimiento giratorio, inmersión, pulverización, impresión con tamiz o estarcido. En una forma de realización preferida, la mezcla es estarcida sobre capas 30 y 35 utilizando un patrón de estarcido de acero inoxidable de 0,002 pulgadas de espesor. Aunque no se muestra en las figuras, el sensor 10 es típicamente parte de una oblea que puede comprender una pluralidad de tales sensores (típicamente 40 aproximadamente). Para tales formas de realización, la capa de estarcido 40 confina esta capa sobre las áreas de electrodos del sensor 10. Este proceso es similar a la impresión con tamiz, excepto que se utiliza un estarcido en lugar de un tamiz. Después de haber sido aplicada, la capa 40 debería secarse al aire en condiciones entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 25ºC y entre aproximadamente 35% de humedad relativa y aproximadamente 60% de humedad relativa.

Con preferencia, la capa microporosa 40 tiene un porcentaje de alúmina entre aproximadamente 5% y aproximadamente 70%, más preferentemente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 60% y con más preferencia entre aproximadamente 20% y aproximadamente 50%. Por "porcentaje de alúmina" se entiende aquí que se refiere al peso de la alúmina dentro de la capa 40 dividido por la suma de los pesos de la alúmina y el polvo de polímero en la capa 40. La capa microporosa 40 tiene con preferencia una relación entre relleno y aglutinante entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:4, más preferentemente entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:2 y más preferentemente entre aproximadamente 7:1 y aproximadamente 1:1. La "relación entre relleno y aglutinante" designa la relación de la suma de los pesos de la alúmina y el polvo de polímero en la capa 40 con respecto al peso del aglutinante de polímero en la capa 40.

Hay que indicar que, puesto que los hidrocarburos fluorados son relativamente hidrófobos, tal implementación con éxito de estos materiales en la capa 40 ha sido sorprendente, debido a que no sería previsible que estos materiales hidrófobos pudieran ser incorporados dentro de la membrana de capas múltiples 100 que, en al menos ciertas formas de realización, está diseñada para transportar soluciones hidrófilas.

La capa de agente tensioactivo / polímero 45 debería ser capaz de proporcionar adhesión mejorada entre la capa 40 y la capa 50. De acuerdo con ello, la capa 45 se puede formar a partir de un material polimérico y un agente tensioactivo seleccionado de tal manera que la capa 45 es compatible con ambas capas 40 y 50. El material polimérico de la capa 45 es con frecuencia el mismo material polimérico que se emplea en la capa 50 (descrita a continuación). Por lo tanto, un a lista ilustrativa y no limitativa de materiales poliméricos adecuados para uso en la preparación de la capa 45 incluye polivinil pirrolidona, gelatina, PVOH y HEMA. Cuando la capa 50 incluye PVOH, el material polimérico de la capa 45 es con preferencia PVOH. Para tales formas de realización, el PVOH utilizado en la preparación de la capa 45 tiene con preferencia entre aproximadamente 1 por ciento en peso y aproximadamente 10 por ciento en peso de sólidos, más preferentemente entre aproximadamente 2,5 por ciento en peso y aproximadamente 7 por ciento en peso, y con más preferencia aproximadamente 5 por ciento en peso de sólidos (en base al peso total de la solución de PVOH y agente tensioactivo).

El agente tensioactivo de la capa 45 puede comprender cualquier material capaz de mejorar la adhesión entre las capas 40 y 50, sin reducir substancialmente al mismo tiempo las características ventajosas del sensor 10, como se describe aquí. Con preferencia, el agente tensioactivo es un agente tensioactivo no iónico. Por lo tanto, el agente tensioactivo de la capa 45 puede comprender agentes tensioactivos de alquilalcoxilato perfluorados. Tales agentes tensioactivos incluyen, por ejemplo, FC-171 Fluorad®, FC-430 Fluorad® y FC-176 Fluorad(® (todos disponibles de 3M). Otros agentes tensioactivos de este tipo son conocidos por los técnicos en la materia y están destinados a estar dentro del alcance de la presente invención. En una forma de realización preferida, el agente tensioactivo de la capa 45 es un agente tensioactivo no iónico de alquil alcoxilato fluorado, tal como FC-171 Fluorad® de 3-M. Con preferencia, la capa 45 comprende entre aproximadamente 0,01 por ciento en peso y aproximadamente 1 por ciento en peso de agente tensioactivo no iónico, más preferentemente entre aproximadamente 90,05 por ciento en peso y aproximadamente 0,5 por ciento en peso de agente tensioactivo no iónico, y más preferentemente aproximadamente 0,1 por ciento en peso de agente tensioactivo no iónico (basado en el peso total de la solución de material polimérico y agente tensioactivo).

Para optimizar el rendimiento del sensor 10, la capa 45 debería tener un espesor entre aproximadamente 0,5 micrómetros y aproximadamente 5 micrómetros, más preferentemente entre aproximadamente 1 micrómetro y aproximadamente 3 micrómetros y más preferentemente 1 micrómetro. En una forma de realización particularmente preferida, la capa 45 tiene un espesor de aproximadamente 1 micrómetro y comprende aproximadamente 0,1 por ciento en peso de FC-171 Fluorad® y aproximadamente 5 por ciento en peso de PVOH.

La capa 45 se puede aplicar a la capa 40 utilizando cualquiera de una variedad de técnicas estándar conocidas por los técnicos en la materia. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, revestimiento por rotación, inmersión y pulverización. Preferentemente, la capa 45 se aplica a la capa 40 por medio de revestimiento por rotación. La capa 45 debería secarse antes de la aplicación de la capa 50 (descrita a continuación)- En una forma de realización, la capa 45 se seca al aire durante 15 minutos aproximadamente a temperatura ambiente.

La capa de estabilización 50 está diseñada para efectuar una adsorción mínima de proteína. La capa 50 puede proporcionar continuamente una superficie fresca de membrana de capas múltiples 100 en la interfaz de la membrana de capas múltiples 100 con la solución de analito, de manera que es difícil que las proteínas dentro de la solución de analito sean adsorbidas por la superficie exterior de la membrana de capas múltiples 100 (es decir, para reducir la putrefacción del sensor 10). De acuerdo con ello, la capa 50 se puede formar a partir de cualquier material polimérico hidrófilo, permeable al agua, capaz de reducir al mínimo la adsorción de proteína. Esto se puede conseguir formando una superficie renovable en la interfaz entre la membrana de capas múltiples 100 y la interfaz de solución de analito, en función de la composición de la solución de analito. Por ejemplo, cuando la solución de analito comprende sangre, la capa 50 se forma típicamente a partir de un material polimérico, que es al menos parcialmente soluble en agua, de manera que el material polimérico se elimina lentamente por lavado en la solución de analito, proporcionando constantemente una nueva superficie en la interfaz entre la membrana de capas múltiples 100 y la solución de analito.

Los materiales poliméricos adecuados para uso en la preparación de la capa 50 incluyen, pero no están limitados a polivinil pirrolidona, gelatina, PHEMA y PVOH. Con preferencia, la capa 50 se forma utilizando PVOH que tiene entre aproximadamente 5 por viento en peso y aproximadamente 25 por ciento en peso de sólidos, más preferentemente entre aproximadamente 8 por ciento en peso y aproximadamente 12 por ciento en peso de sólidos y con más preferencia aproximadamente 10 por ciento en peso de sólidos.

El espesor de la capa 50 debería elegirse para optimizar las características ventajosas de la presente invención. Con preferencia, la capa 50 tiene un espesor entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 10 micrómetros, con más preferencia entre aproximadamente 8 micrómetros y aproximadamente 12 micrómetros y con más preferencia aproximadamente 10 micrómetros.

La capa 50 se puede formar de acuerdo con una variedad de procesos conocidos por los técnicos en la materia, que incluyen, por ejemplo, técnicas de revestimiento por rotación, pulverización e inmersión. Con preferencia, la capa 50 está formada a través de la fundición por rotación del material polimérico de la capa 50 sobre la capa 45, seguido por secado. En ciertas formas de realización, la capa 50 se puede secar al aire durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.

Las membranas de capas múltiples de acuerdo con la presente invención pueden incluir, además, los elementos típicos que se utilizan para tales membranas de capas múltiples, por ejemplo conductores eléctricos, soportes o sondas (de aislamiento) no conductores de electricidad y otros elementos que son conocidos por los técnicos en la materia.

Ejemplo

La capa de substrato de aislamiento eléctrico se formó a partir de alúmina al 96% aproximadamente y aglutinante de vidrio al 4% aproximadamente, disponibles de Coors Ceramic Company, Grand Junction, CO. La capa de electrodo fue aplicada a la capa de substrato como una emulsión de pasta de platino de alta pureza, disponible como número de producto PC10208 de Metech, a través de impresión con tamiz con una pantalla de acero inoxidable de malla 325. Un horno de zona BTU con un secador de tres zonas, de Fast Fire of Billerica, MA, fue utilizado en la combustión de la emulsión de platino. La combustión se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se elevó gradualmente la temperatura hasta 750ºC durante un pico de trece minutos.

La capa dieléctrica fue impresa con tamiz como una emulsión de 15 micrómetros sobre porciones de la capa de substrato no cubierta por la capa de electrodo utilizando una pantalla de acero inoxidable de malla 325. El material utilizado para la capa dieléctrica fue el producto número 9615 de duPont Electronics, Wilmington, DE. Después de la aplicación sobre la capa de substrato, la capa dieléctrica fue quemada a 750ºC durante un pico de diez minutos.

Una capa de enzima inmovilizada fue depositada sobre la capa de electrodo utilizando un método de impresión con tamiz. La capa de enzima inmovilizada comprendía una cantidad catalíticamente activa de oxidasa de lactato (número de catálogo 1381), Genzyme, Cambridge, MA) inmovilizada con partículas de polvo de carbono platinizado, disponible de E-TEK, Inc. Framingham, MA.

Una solución acuosa de APTES fue preparada pipetando aproximadamente 1 gramo de APTES (producto número A0750, United Chemical Technologies, Bristol, PA) en un matraz y añadiendo aproximadamente 19 gramos de agua desionizada. Esta mezcla fue terminada, agitada y se dejó reposar durante aproximadamente cinco minutos. Las capas de enzima dieléctrica e inmovilizada fueron inundadas con solución de APTES y se dejaron reaccionar durante aproximadamente noventa minutos. La solución excesiva fue drenada después de este periodo de tiempo, y el sensor fue agitado en rotación sobre un dispositivo de revestimiento por rotación de Integrated Technologies aproximadamente a 4000 rpm durante noventa minutos aproximadamente. La solución fue secada entonces a temperatura ambiente y a menos de aproximadamente 60% de humedad relativa durante aproximadamente 24 horas para formar la capa adhesiva.

La capa de polímero de enzima fue preparada de la siguiente manera. En primer lugar, se preparó una suspensión de aproximadamente 0,7 gramos de PVOH en aproximadamente 9,3 gramos de agua desionizada mezclando los líquidos a temperatura ambiente. El PVOH era PVOH hidrolizado aproximadamente al 99,9% con un peso medio molecular entre aproximadamente 89.000 y aproximadamente 98.999 (producto número 34,158-4, Aldrich, Milwaukee, WI). La suspensión fue hervida para disolver el PVOH y luego fue refrigerada a temperatura ambiente. Aproximadamente 2 gramos de esta solución de PVOH fueron añadidos a aproximadamente 0,08 gramos de oxidasa de lactato (número de catálogo 1381, Genzyme, Cambridge, MA) a temperatura ambiente, y la oxidasa de lactato fue disuelta agitando moderadamente el matraz con la mano.

Esta solución fue aplicada a la capa de adhesivo utilizando una estación de trabajo de localización que comprendía un adhesivo de alambre modificado (número de parte 827, Mech-Rl Industries, Woburn, MA) del que se había desconectado la caja ultrasónica, y se retiraron la abrazadera de alambre, el capilar, el carrete y el calentador de cuña. El alambre capilar fue sustituido por un anillo que monta la aguja de distribución (descria a continuación) para proporcionar un mecanismo manual de captura y colocación, y se montó un conjunto de estantes en el lado derecho de la estación de trabajo para soportar la bomba de jeringa. La estación de trabajo incluía un microscopio, una bomba de jeringa (número de parte 74900, Cole Palmer Instrument Co., Niles, IL), una jeringa de distribución de 50 microlitos (número de parte 1705, Hamilton), una jeringa de relleno de un mililitro (Moject) y una aguja de distribución (número de parte Blunt-26G-7/16, Popper and Sons, New Hyde Park, NY). Se utilizaron adaptadores de bloqueo Luer hembra (número de parte 20055, Alltech, Deerfield, IL) para conectar la jeringa de distribución y la jeringa de relleno a una válvula de tres pasos (número de parte 86727, Alltech). Un casquillo PEEK (número de parte 20114, Alltech) unió al adaptador de compresión PEEK (número de parte 20124, Alltech) a la válvula de tres pasos y a un entubado de aproximadamente doce pulgadas de PEEK de 0,31 de diámetro interior (número de parte 35710, Alltech). El entubado PEEK se conectó a un casquillo PEEK (número de parte 20114, Alltech) u al adaptador de compresión PEEK que estaba conectado a un adaptador de unión PEEK (número de parte 20088, Alltech). Un adaptador de bloqueo Luer macho (número de parte90044, Alltech) conectaba el adaptador de unión PEEK a la aguja de distribución. La bomba de jeringa estaba en comunicación con un conmutador de pedal, de tal manera que la depresión del conmutador de pedal daba como resultado a la distribución de solución desde la aguja de distribución. El microscopio estaba colocado adyacente a la aguja de distribución, de tal forma que cuando se distribuyó una parte alícuota de una solución desde la aguja de distribución sobre una superficie (descrita a continuación), la superficie resultante se podía observar a través del microscopio.

Una porción de la solución de oxidasa de lactato / PVOH fue colocada dentro de la bomba de jeringa y la aguja de distribución fue colocada adyacente a la capa de adhesivo en una zona por encima de la capa de enzima inmovilizada. El pedal fue pulsado para distribuir una parte alícuota de aproximadamente 0,02 microlitros de la solución sobre la capa adhesiva, de tal manera que la solución cubría una zona desde aproximadamente 60% hasta aproximadamente 90% de la zona de la capa de enzima inmovilizada.

La capa microporosa fue realizada preparando en primer lugar una solución de aglutinante polímero Teflón® AF1600 (duPont) en disolvente FC-43 Fluorinert® (3M) pipetando aproximadamente 15 gramos del disolvente en un matraz, en el que se habían dispuesto aproximadamente 0,963 granos del aglutinante polímero. Esta mezcla fue calentada desde aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 70ºC durante aproximadamente ocho horas hasta que se disolvió el aglutinante. El polvo de \alpha-alúmina (número de producto 40-6352-006, disponible de Buehler Laboratory, localizado en Lake Bluff, IL) fue preparado a continuación calentando en un horno de secado hasta aproximadamente 80ºC entre aproximadamente 16 hasta aproximadamente 20 horas para secar esta suspensión. Se añadieron de forma secuencial al matraz aproximadamente 0,119 gramos de agente tensioactivo FC-171 (3M), aproximadamente 8,3 gramos de solución aglutinante, aproximadamente 6,2 gramos de disolvente FC-43 (3M), aproximadamente 4,28 gramos de polvo Teflón® MP1100 (duPont) y aproximadamente 1,07 gramos de \alpha-alúmina seca. Se añadieron 41 bolas de carburo de volframio a esta mezcla, y se tapó el matraz y se invirtió para humedecer las bolas. La mezcla fue triturada con rodillos a continuación entre aproximadamente 16 y aproximadamente 20 horas para formar una tinta. La tinta fue estarcida manualmente a continuación utilizando un ADO Hand Stenciler para formar la capa microporosa.

La capa de estabilización fue preparada formando una solución al 10% en peso de solución acuosa de acuerdo con el método descrito anteriormente, pero utilizando aproximadamente 45 gramos de agua desionizada y aproximadamente 5 gramos de PVOH. La capa microporosa fue inundada con esta solución utilizando una pipeta de repetición Eppendorf con una jeringa de 250 microlitos. El sensor fue colocado entonces sobre un dispositivo de revestimiento por rotación de Integrated Technologies y girando aproximadamente a 4000 rpm durante aproximadamente cuatro minutos. El sensor fue secado entonces en condiciones atmosféricas.

Habiendo descrito de esta manera ciertas formas de realización de la presente invención, varias alteraciones, modificaciones y mejoras serán evidentes para los técnicos en la materia. Los materiales empleados, así como sus formas y dimensiones, pueden ser como se requieran. De acuerdo con ello, la descripción anterior se presenta sólo a modo de ejemplo y no está destinada como limitación. La invención solamente está limitada como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (27)

1. Un sensor para medir una concentración de un analito en una solución, comprendiendo el sensor:

un substrato (12) formado a partir de un material de aislamiento eléctrico:

una capa de electrodo (15) formada a partir de un material conductor de electricidad, estando soportada la capa de electrodo por el substrato (12);

una capa de enzima inmovilizada (20) que incluye una enzima inmovilizada en un miembro de soporte, estando soportada la capa de enzima inmovilizada por la capa de electrodo (15);

una capa de adhesivo (30) formada a partir de un silano, apoyándose dicha capa de adhesivo a tope en dicha capa de enzima inmovilizada (20);

una capa de polímero de enzima (35) que se apoya a tope en dicha capa de adhesivo (30); y

una capa microporosa (40) que se apoya a tope en dicha capa de polímero de enzima (35).

2. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la capa adhesiva está formada a partir de aminopropiltrietoxisilano.

3. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la enzima de la capa de enzima inmovilizada es oxidasa de lactato.

4. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la enzima de la capa de polímero de enzima es oxidasa de lactato.

5. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la capa de polímero de enzima comprende un polímero capaz de asistir en el mantenimiento de una conformación natural de la enzima de la capa de polímero de enzima.

6. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la capa de polímero de enzima comprende un alcohol polihídrico.

7. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, una capa de polímero tensioactivo (45), que comprende un tensioactivo y un polímero.

8. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el agente tensioactivo es un agente tensioactivo no iónico.

9. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el agente tensioactivo no iónico es un alquilalcoxilato perfluorado.

10. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 7, 8 ó 9, en el que el polímero de la capa de polímero tensioactivo está seleccionado a partir de polivinil pirrolidona, gelatina, alcohol de polivinilo, polihidroxi etilmetacrilato y mezclas de los mismos.

11. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el polímero de la capa de polímero de agente tensioactivo es un alcohol de polivinilo.

12. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, una capa de estabilización (50) formada a partir de un polímero.

13. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el polímero de la capa de estabilización está seleccionado a partir de polivinil pirrolidona, gelatina, alcohol de polivinilo, polihidroxietilmetacrilato y mezclas de los mismos.

14. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el polímero de la capa de estabilización es un alcohol de polivinilo.

15. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además:

una capa dieléctrica dispuesta entre dicho substrato y dicha capa adhesiva;

una capa de polímero tensioactivo que se apoya a tope en dicha capa microporosa; y

una capa de estabilización que se apoya a tope en dicha capa de polímero tensioactivo.

16. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la capa de polímero de enzima está dispuesta solamente en una región por encima de la capa de enzima inmovilizada.

17. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la capa microporosa está formada a partir de un polvo de polímero, un polvo mineral o un aglutinante de polímero.

18. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el aglutinante de polímero es un hidrocarburo fluorado.

19. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que el polvo de polímero es un polvo de hidrocarburo fluorado.

20. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el polvo de polímero es un polvo de polímero de hidrocarburo perfluorado.

21. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el polvo de polímero tiene un tamaño medio de las partículas desde aproximadamente 0,2 hasta 10 micrómetros.

22. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el polvo mineral es polvo de alúmina, el substrato está formado a partir de alúmina, y la capa de electrodo está formada a partir de platino, la capa dieléctrica está formada a partir de una cerámica, la capa de enzima inmovilizada incluye oxidasa de lactato, la capa adhesiva está formada a partir de aminopropiltrietoxisilano y la capa de polímero de enzima incluye oxidasa de lactato.

23. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que el polvo mineral es un polvo de alúmina.

24. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el polvo mineral tiene un tamaño medio de las partículas entre aproximadamente 0,01 y 5 micrómetros.

25. Un sensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, que comprende una capa de estabilización formada a partir de alcohol de polivinilo, una capa de polímero tensioactivo formada a partir de un alcohol de polivinilo y un agente tensioactivo de alquil alcoxilato perfluorado no iónico, y en el que el aglutinante polímero de la capa microporosa es un polímero de hidrocarburo perfluorado, el polvo de polímero de la capa microporosa es un polímero perfluorado que tiene un tamaño medio de las partículas desde aproximadamente 0,2 hasta 10 micrómetros, y el polvo mineral de la capa microporosa es un polvo de alúmina que tiene un tamaño medio de las partículas de aproximadamente 3 micrómetros.

26. Un método de medición de una concentración de un analito dispuesto dentro de una solución, conteniendo la solución, además, al menos un agente de interferencia, comprendiendo el método las etapas de:

acoplar operativamente un sensor de electrodo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, con la solución en la que está dispuesto el analito; y

hacer pasar la solución, en la que está dispuesto el analito a través de la capa microporosa, reduciendo al mínimo al mismo tiempo el paso de al menos un agente de interferencia a través de la capa microporosa hasta la capa del electrodo.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, que comprende, además, la etapa de hacer pasar la solución, en la que está dispuesto el analito, a través de una capa exterior formada a partir de un polímero, que es capaz de disolverse en un disolvente del polímero.