ES2244785T3 - Procedimiento para la prevision de riesgo de trasplante y conjunto de pruebas inmunologicas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la previsión de riesgo de rechazo de trasplante, caracterizado porque se detectan in vitro autoanticuerpos anti-receptor de AT1 en materiales biológicos de un paciente a diagnosticar, de manera que existe riesgo de rechazo del trasplante si se detectan autoanticuerpos.

Description

Procedimiento para la previsión de riesgo de rechazo de trasplante y conjunto de pruebas inmunológicas.

La presente invención se refiere a un procedimiento y a un conjunto ("kit") de pruebas inmunológicas para la previsión de un riesgo de rechazo de un trasplante, mediante la detección de autoanticuerpos anti-receptor de AT_{1} en materiales biológicos del paciente a examinar, por ejemplo, por una reacción inmunológica con el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas del mismo con función análoga. También es objeto de la invención la utilización del receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga para la previsión (el diagnóstico) de un riesgo de rechazo del trasplante. Dicho riesgo existe cuando se detectan autoanticuerpos anti-receptor de AT_{1} en los materiales biológicos, por ejemplo, en los líquidos corporales o tejidos.

Para que un trasplante de órgano tenga éxito, es necesario que entre el órgano del donante y el tejido del receptor haya la máxima concordancia histológica posible. Esta concordancia se determina mediante el sistema HLA, o de antígenos leucocitarios humanos (abreviación del inglés human leucocyte antigen). Se trata de un sistema complejo de antígenos tisulares que se encuentran en casi todas las células. Este sistema tiene un importante papel fisiológico en las reacciones de rechazo inmunológicas (reconocimiento del "Yo" y "No Yo"). Por esta razón, antes de proceder a un trasplante, se realiza lo que se denomina una tipificación del tejido del donante y del receptor del órgano, para garantizar la más amplia compatibilidad HLA posible.

Debido al polimorfismo genético extremo, existe un número extraordinariamente grande de moléculas HLA diferentes. Una concordancia total se observa exclusivamente en gemelos univitelinos, por lo demás, las moléculas HLA de cada persona son únicas.

Sin embargo, resulta problemático que, a pesar de una amplia concordancia HLA entre receptor y donante, no se pueda excluir una reacción de rechazo contra el órgano trasplantado.

A. Pitotti y otros (1986) dan a conocer en el "Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis" 4 (5), 677-683, que en la orina de pacientes que sufren diversas enfermedades o que se han sometido a una operación de trasplante se detectan enzimas convertidoras de la angiotensina (ECA, EC 3.4.15.1), presentando algunos de estos pacientes valores elevados de ECA, mientras que la mayoría presenta valores normales de la misma.

En el documento WO 00/39154, se describe péptidos del receptor de AT_{1} y su utilización en casos de preeclampsia e hipertonía maligna. Los péptidos se describen como componente del conjunto o kit, que puede ser utilizado para el diagnóstico de las enfermedades mencionadas.

El objetivo de la presente invención es, por lo tanto, dar a conocer un procedimiento eficaz y fiable, que facilite la previsibilidad segura y rápida del riesgo de una reacción de rechazo del trasplante.

La presente invención resuelve este problema técnico dando a conocer un procedimiento de este tipo, con el que se pueden detectar autoanticuerpos anti-receptor de AT_{1} en materiales biológicos del paciente a diagnosticar, y según el cual, al detectarse autoanticuerpos, existe o se puede prever un riesgo de rechazo del trasplante. De acuerdo con la invención, la detección de los autoanticuerpos se realiza, preferentemente, mediante una reacción inmunológica con el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga. Pero también es posible detectar los autoanticuerpos por medio de otros procedimientos, en sí conocidos por los expertos, por ejemplo, mediante un procedimiento de separación por electroforesis. La invención se basa en la detección sorprendente de que pacientes que tienen una reacción de rechazo del trasplante, sin que exista riesgo inmunológico previsible, presentan autoanticuerpos anti-receptor de AT_{1}.

Se pudo comprobar que existe una relación entre la presencia de los autoanticuerpos y el rechazo del trasplante. Mediante estudios citológicos e inmunohistoquímicos, así como el estudio de material de biopsias, se pudo comprobar que no hubo otros factores de riesgo inmunológicos para el rechazo del trasplante. Sin embargo, se pudo demostrar que la presencia de autoanticuerpos provoca reacciones de rechazo en órganos trasplantados.

En relación con la presente invención se utiliza una serie de términos generales de la siguiente manera:

Un "trasplante", a efectos de la presente invención, es un órgano o tejido trasplantado o a trasplantar. A efectos de la presente invención, sin embargo, también pueden ser trasplantes determinados implantes, que están compuestos de tejidos o elementos, que se introducen en un cuerpo durante un período de tiempo determinado o de por vida para que cumplan ciertas funciones sustitutivas. Los implantes pueden estar formados, por ejemplo, por materia inorgánica que está recubierta de sustancias orgánicas como, por ejemplo, células de cartílago o de hueso.

Con el término de "rechazo de trasplante" se entiende, de acuerdo con la invención, la inducción de una reacción inmunológica del receptor contra el trasplante. Una reacción inmunológica del receptor es una reacción de protección o defensa específica del cuerpo contra los antígenos del trasplante.

El "receptor de AT_{1}", según la invención, puede estar presente en su entorno natural celular y se puede utilizar tanto con el material al que está asociado en su estado natural como también de forma aislada. El receptor de AT_{1} es conocido por los expertos en sus estructuras primaria, secundaria y terciaria. Haciendo referencia al peso del receptor total que, de acuerdo con la invención, se ha de utilizar en la preparación, el receptor aislado debería pesar al menos 0,5%, preferentemente al menos 5%, muy preferentemente al menos 25% y de forma especialmente preferente al menos 50%. Preferentemente, se utilizará el receptor de forma aislada, es decir, esencialmente libre de otros lípidos, hidratos de carbono, proteínas u otras sustancias a las que está asociado de forma natural. Esencialmente libre significa que el receptor está libre de otros lípidos, hidratos de carbono, proteínas u otras sustancias, a las que está asociado de forma natural, al menos en un 75%, preferentemente al menos en un 85%, muy preferentemente al menos en un 95%, y de forma especialmente preferente al menos en un 99%.

En relación con la presente invención, se pueden utilizar tanto el receptor presente de forma natural como también todas las modificaciones, las mutantes o los derivados del receptor de AT_{1}. Asimismo, el receptor de AT_{1}, obtenido mediante técnicas de recombinación y que contiene modificaciones de aminoácido como inversiones, deleciones, inserciones, adiciones etc., podrá aplicarse, de acuerdo con la invención, si existe al menos una parte de la función esencial del receptor de AT_{1}, es decir, la capacidad de fijar anticuerpos. El receptor de AT_{1} utilizado puede también comprender aminoácidos inusuales y/o modificaciones como una alquilación, oxidación, modificación del tiol, desnaturalización y oligomerización y similares. También puede ser sintetizado químicamente. De acuerdo con la invención, el receptor de AT_{1} puede ser, sobre todo, una proteína y/o un péptido, o también una proteína de fusión que contiene, además de otras proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, el receptor de AT_{1} en su totalidad o parcialmente. Mediante los procedimientos conocidos, el experto podrá determinar aquellos péptidos o polipéptidos del receptor de AT_{1}, que presentan propiedades de función análoga. Estos polipéptidos o péptidos tienen, por ejemplo, 50%, 60%, 70% u 80%, preferentemente, 90%, más preferentemente, 95% y, todavía más preferentemente, 98% de homología con los péptidos identificados como receptor de AT_{1}, pudiéndose determinar dicha homología, por ejemplo, mediante el algoritmo de Smith Waterman de búsqueda de homología, por ejemplo, con el programa "MPSRCH" (Oxford Molecular). El término de péptido de un receptor de AT_{1}, que se utiliza en la presente invención, comprende moléculas que se diferencian con respecto a la secuencia original por deleción o deleciones, inserción o inserciones, intercambio o intercambios y/o otras modificaciones conocidas según el estado de la técnica, o que contienen un fragmento de la molécula de aminoácido original, presentando el receptor de AT_{1} todavía las propiedades antes mencionadas. También se consideran como tales las variantes alélicas y modificaciones. Los expertos conocen los procedimientos para producir los cambios anteriormente citados en la secuencia de los aminoácidos, los cuales también se describen en obras de referencia de la biología molecular, por ejemplo, en Sambrook y otros, supra. El experto también es capaz de determinar si un receptor de AT_{1}, modificado de esta manera, todavía posee las propiedades antes mencionadas. Entre los péptidos del receptor de AT_{1}, que se aplican, de acuerdo con la invención, se encuentran, por ejemplo: AVHYQSN, SHFYQTR ó GYYFDTN. En la memoria descriptiva se utilizará simplemente el término "péptidos o proteínas con función análoga" para designar todas las modificaciones del receptor de AT_{1}, que se han descrito
anteriormente.

A efectos de la presente invención, los "materiales biológicos" pueden ser todos los tejidos y líquidos biológicos como, por ejemplo, sangre, linfas, orina, líquido cerebral. El material biológico se extrae al paciente para hacer un diagnóstico del mismo, de acuerdo con la invención. Naturalmente, es posible tratar la prueba con medios o métodos bioquímicos y químicos especiales, o prepararla para el análisis.

A efectos de la presente invención, los "autoanticuerpos" a detectar se ligan al receptor de AT_{1} de forma específica. Dichos autoanticuerpos también pueden ser anticuerpos modificados (por ejemplo, anticuerpos oligómeros, reducidos, oxidados y marcados). El término de autoanticuerpo, que se utiliza en la presente invención, comprende tanto moléculas intactas como también fragmentos de autoanticuerpos como Fab, F(ab')_{2} y Fv, que son capaces de ligar ciertas determinantes epitópicas del receptor de AT_{1}. En estos fragmentos se ha conservado parcialmente la capacidad del autoanticuerpo de ligarse selectivamente a un antígeno o receptor, estando los fragmentos definidos de la siguiente manera:

(1) Fab es el fragmento, que contiene un fragmento de unión al antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, y se puede obtener de la disociación de un anticuerpo entero con la enzima papaína, obteniendo una cadena ligera entera y un fragmento de una cadena pesada;

(2) el fragmento Fab' de una molécula de un anticuerpo se puede obtener tratando un anticuerpo entero con pepsina y subsiguiente reducción, obteniendo una cadena ligera entera y un fragmento de una cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por cada molécula de anticuerpo;

(3) el F(ab')_{2}, el fragmento del anticuerpo que se puede obtener tratando un anticuerpo entero con la enzima pepsina, sin subsiguiente reducción; el F(ab')_{2} es un dímero de dos fragmentos Fab' que permanecen unidos por enlaces disulfuro;

(4) el Fv se define como fragmento modificado por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada y se expresa en forma de dos cadenas; y

(5) el anticuerpo de cadena única ("SCA") se define como molécula modificada genéticamente, que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, las cuales están unidas por medio de un enlazador de polipéptidos apropiado para formar una molécula de cadena única fusionada genéticamente.

El término "epítopo", que se utiliza en la presente invención, significa un determinante antigénico cualquiera sobre el receptor de AT_{1}. Los determinantes epitópicos están formados, normalmente, por agrupaciones de superficies químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y poseen, generalmente, tanto características específicas de la estructura tridimensional como también características de carga específicas.

El autoanticuerpo "se liga de forma específica" al receptor de AT_{1} o muestra una reactividad inmunológica específica con el mismo si, en presencia de una populación heterogénea de receptores de AT_{1} o sus fragmentos, dicho autoanticuerpo ejerce su función en una reacción de enlace, según la cual se puede determinar si el receptor de AT_{1} u otra estructura biológica están presentes. En las condiciones prefijadas de una prueba inmunológica, los autoanticuerpos indicados se ligan, preferentemente, a un fragmento específico del receptor de AT_{1}, mientras no se produce ninguna unión significativa con otras proteínas presentes en la muestra.

A efectos de la presente invención, con el término "pacientes" se ha de comprender todos los seres humanos, animales, plantas o microorganismos, independientemente de que presenten alteraciones patológicas o no. Todos los materiales biológicos, que se extraen de células, tejidos, órganos u organismos o similares, pueden considerarse, a efectos de la presente invención, material biológico de pacientes a diagnosticar.

Una "reacción inmunológica" es, a efectos de la presente invención, una interacción específica entre el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función analógica y los autoanticuerpos. La reacción inmunológica se puede detectar mediante diferentes ensayos inmunológicos.

Los "ensayos inmunológicos" son, a efectos de la presente invención, pruebas que aprovechan la interacción específica entre el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga y los autoanticuerpos para determinar la presencia o la concentración de los autoanticuerpos. La detección y cuantificación de los autoanticuerpos se puede realizar, por ejemplo, con la ayuda de péptidos o proteínas con función análoga como, por ejemplo, mediante una inmunoprecipitación o el inmunoblot. Ensayos inmunológicos, según la invención, pueden dividirse, por ejemplo, en los siguientes pasos:

1) la reacción autoanticuerpo-receptor de AT_{1},

2) eventualmente, la separación del complejo autoanticuerpo-receptor de AT_{1} de otros componentes de la mezcla de reacción, sobre todo, de autoanticuerpos y receptores AT_{1} no ligados, y

3) la medición de la respuesta.

Para la reacción autoanticuerpo-receptor de AT_{1}, existen distintas configuraciones posibles, por ejemplo:

a) la precipitación de un reactante con un exceso del otro, o bien

b) la competencia entre cantidades conocidas del autoanticuerpo o receptor de AT_{1} y el material que se quiere examinar.

Una prueba de autoanticuerpos se puede realizar, por ejemplo, mediante

a) la utilización de receptores de AT_{1}/péptidos o proteínas con función análoga en exceso, o bien

b) la competencia entre un autoanticuerpo marcado de cantidad conocida y un autoanticuerpo no marcado de cantidad no conocida por una cantidad determinada de receptores de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga.

Para facilitar la separación del complejo autoanticuerpo-receptor de AT_{1}, dicho receptor de AT_{1} puede encontrarse inmovilizado sobre un portador fijo. El sustrato fijo puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, policloruro de vinilo o poliestireno como, por ejemplo, el pocillo de una placa de microtítulo. Para medir la interacción entre autoanticuerpo y receptor de AT_{1}, se pueden utilizar, por ejemplo, autoanticuerpos marcados, receptores de AT_{1} marcados o reactivos secundarios. Es posible, por ejemplo, marcar el receptor de AT_{1} con radioactividad o con enzimas o con fluorescencia. Independientemente del marcaje aplicado, se puede reforzar la respuesta de la interacción autoanticuerpo-receptor de AT_{1}, aprovechando la afinidad de las proteínas avidina o estreptavidina por la biotina. Los ensayos inmunológicos, utilizados según la invención, pueden ser:

1) Inmunoensayos que aplican un marcaje con radioactividad:

a)

ensayos radioinmunológicos con unión competitiva (RIA) y

b)

ensayo de inmunoradiometría (IRMA);

2) inmunoensayos que aplican un marcaje enzimático:

a)

ensayo inmunoenzimático (EIA) y

b)

ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA);

3) inmunoensayos que aplican una combinación de radioisotopos y marcaje enzimático (inmunoensayo radioenzimático ultrasensitivo (USERIA)).

Según un modo de realización de la invención, se ha dispuesto que los autoanticuerpos a detectar sean IgA humanas y/o autoanticuerpos IgG. Los autoanticuerpos son glicoproteínas, que también se denominan inmunoglobulinas. Los anticuerpos humanos se dividen en cinco clases de inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas de la clase A (IgA) existen tanto de forma disuelta en la sangre como también en una variante secretora. Las IgA se dividen en dos subclases. La IgA secretora se compone de dos moléculas básicas de inmunoglobulina junto con una cadena J y un componente secretor. Las moléculas IgA pueden predominar, sobre todo, en las secreciones del cuerpo. Las inmunoglobulinas de la clase IgG constituyen la mayoría de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos de la respuesta inmunológica secundaria, que se produce como consecuencia de un contacto del sistema inmunológico con un antígeno determinado, pertenecen mayoritariamente a la clase IgG.

Para obtener una información cuantitativa de la reacción autoanticuerpo-receptor de AT_{1}, uno de los reactivos ha de ser conjugado con una sustancia de marcaje de tal manera que se conservan mayoritariamente las propiedades inmunológicas de los componentes, por ejemplo, mediante el sistema estreptavidina/biotina o utilizando anticuerpos secundarios.

Según otro modo de realización preferente, como inmunoensayo se puede utilizar una inmunoprecipitación, un ensayo radioinmunológico, un ensayo enzimático, un inmunoensayo fluorescente, un inmunoensayo quimioluminiscente, un ensayo con unión competitiva, un ensayo ELISA y/o un inmunoensayo homogéneo, preferentemente, un ELISA. En la inmunoprecipitación se puede observar in vitro la reacción entre el autoanticuerpo y el receptor de AT_{1} directamente en el punto de equilibrio, en el que las concentraciones de ambos componentes son iguales. En este punto se produce una inmunoprecipitación. Dicha inmunoprecipitación puede llevarse a cabo, por ejemplo, en medios semisólidos como el gel de agar. La difusión de los componentes inmunoqulmicos por un gel de este tipo produce un gradiente de concentración, que garantiza que en un punto determinado se cumplen las condiciones necesarias para la inmunoprecipitación, siempre que se constituyan inmunocomplejos. La posición y la naturaleza de los inmunoprecipitados en el gel dan información sobre la concentración de los inmunocomponentes. Un indicio cualitativo de una reacción entre inmunocomplejos se puede obtener a través de una doble inmunodifusión. En su forma más sencilla de la inmunoprecipitación, una capa delgada de gel de agarosa es provista de dos pequeños pocillos en los que se introducen pequeñas cantidades del receptor de AT_{1} y del material biológico, que contiene los autoanticuerpos. Al cabo de una difusión de 24 horas de duración, se puede comprobar la formación de los inmunocomplejos mediante la línea de precipitado blanca que aparece entre los dos pocillos. Una versión más costosa es la prueba de Ochterlony, en la que los pocillos están dispuestos de forma circular sobre la placa de gel, con un pocillo adicional en el centro del círculo. Los pocillos exteriores se inoculan con distintas diluciones del material biológico, que contiene los autoanticuerpos, mientras que la solución con el receptor de AT_{1}/péptidos con función análoga se inocula en el pocillo del centro.

Un análisis cuantitativo es posible mediante una simple inmunodifusión. Mientras un componente se encuentra homogéneamente distribuido en el gel, el otro puede difundirse desde un pocillo. Se puede, por ejemplo, entremezclar la solución con el gel, que contiene el receptor de AT_{1}/péptidos con función análoga, e inocular el pocillo con una muestra del material biológico, del que se ha de comprobar si contiene autoanticuerpos, en cuyo caso se formaría un anillo de precipitación.

Otro ensayo posible para determinar los autoanticuerpos es el ensayo radioinmunológico (RIA). El RIA es un inmunoensayo sensitivo, que se basa en la unión competitiva de un antígeno a un anticuerpo, en el que la fracción ligada se determina cuantitativamente con la ayuda de antígenos marcados con radioactividad. Mediante el RIA se pueden determinar, ventajosamente, cantidades de sustancias hasta niveles de un picogramo.

Otro ensayo para determinar los autoanticuerpos es el ensayo inmunoenzimático. El marcaje de un reactivo, por ejemplo, de un anticuerpo secundario con enzimas constituye la base para este inmunoensayo. Resultan ventajosos los sistemas de fase sólida como recipientes o glóbulos recubiertos de anticuerpos o antígenos, ya que su separación no provoca la desnaturalización de las proteínas. La cuantificación de la fase ligada o de la fase libre se realiza midiendo la actividad enzimática. Se puede, por ejemplo, añadir un sustrato incoloro que, debido a la transformación enzimática, da lugar a un producto coloreado, que se puede detectar espectroscópicamente y cuantificar mediante una prueba estándar. Generalmente, se añade la solución de sustrato una vez separada la fase ligada de la fase libre y, después de un período de tiempo predeterminado, se interrumpe la reacción y se determina la densidad óptica del producto. De ello resulta una medida para la cantidad existente de autoanticuerpos en la muestra. Es posible aumentar la sensibilidad de la reacción enzimática de distintas maneras. Un método es el principio de la amplificación enzimática, según el cual el producto de la primera reacción enzimática produce en un segundo sistema enzimático un circuito cerrado en sí mismo, lo que provoca el aumento de la cantidad del producto final coloreado. Un ejemplo de un circuito enzimático cerrado en sí mismo es la enzima fosfatasa alcalina, que hidroliza NADP+ a NAD+ que entra, a continuación, en un circuito enzimático para formar grandes cantidades de un producto coloreado de nitrotetrazolio. Otras enzimas pueden ser la peroxidasa o la \beta-galactosidasa. Como sustrato se utiliza, por ejemplo, luminol, \beta-galactosa y p-nitrofenilfosfato. La detección del autoanticuerpo ligado se puede realizar, por ejemplo, en un segundo paso de incubación con un anti-autoanticuerpo marcado. En un inmunoensayo homogéneo, no se separan los inmunocomplejos que se han formado.

Otra posibilidad para la detección de autoanticuerpos consiste en la utilización de un inmunoensayo con fluorescencia en el que marcadores fluorescentes constituyen la base del ensayo. Es posible cuantificar la formación de los inmunocomplejos, por ejemplo, mediante el marcaje de receptores AT_{1}/péptidos con función análoga de la fracción ligada o de la fracción libre de la mezcla de reacción inmunoquímica. Como portadores de fluorescencia, se han de utilizar, por ejemplo, fluoresceína o rodamina o marcajes a base de complejos de quelado de tierras raras como los complejos de coordinación organometálicos de europio.

Además, los autoanticuerpos pueden detectarse mediante un inmunoensayo quimioluminiscente que será, ventajosamente, un sistema de ensayo sencillo y estable. Se observa quimioluminiscencia cuando una reacción química altamente energética produce moléculas, que se encuentran en un estado de excitación electrónica. Al volver estas moléculas excitadas a su estado inicial, emiten fotones. Moléculas quimioluminiscentes de este tipo se pueden conjugar con receptores AT_{1} o péptidos de función análoga para ser utilizadas en el inmunoensayo. Los receptores AT_{1}/péptidos con función análoga se pueden marcar, por ejemplo, con luminol o sales de acridinio. Las sales de acridinio llevan a cabo reacciones quimioluminiscentes sin que sea necesario un catalizador como en los derivados del luminol. Los catalizadores comprenden un amplio abanico de sustancias desde sencillos cationes metálicos de transición hasta enzimas complejas. Las sales de acridinio necesitan, de manera ventajosa, sólo la adición de una solución alcalina de peróxido de hidrógeno diluida para desencadenar una reacción quimioluminiscente.

También es posible detectar los autoanticuerpos por medio de un ensayo con unión competitiva, en el que se utilizan cantidades limitadas del receptor de AT_{1} marcado o de péptidos con función análoga marcados, que compiten con el autoanticuerpo. Un método de este tipo puede ser ventajoso si se dispone de un receptor de AT_{1} o péptido con función análoga purificados para el marcaje. Se puede aplicar, por ejemplo, un receptor de AT_{1}, ligado a una fase sólida, al que se puede ligar el autoanticuerpo presente en la
muestra.

La presente invención se refiere también a la utilización del anti-receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga para pronosticar el riesgo de un rechazo del trasplante. A tal efecto, la detección de los autoanticuerpos se realiza del modo en sí conocido mediante los inmunoensayos antes descritos.

La presente invención se refiere también a la utilización de un kit de pruebas inmunológicas, que detecta el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas del mismo con función análoga. El kit de pruebas, según la invención, comprende al menos un receptor de AT_{1} completo o péptidos o proteínas de este receptor con función análoga que, en su caso, están ligados a una fase sólida. Además, el kit de pruebas también puede comprender tampones, un conjugado específico, aparte de la enzima, una solución limpiadora, una solución de substrato para detectar la reacción inmunológica y/o una solución de paro. Gracias a sustancias de este tipo, el experto puede realizar, por ejemplo, un ensayo ELISA para detectar los autoanticuerpos. El tampón, el conjugado específico, aparte de la enzima, la solución limpiadora, la solución de substrato para detectar la reacción enzimática y la solución de paro son conocidos por los expertos. Sería suficiente, por ejemplo, que el kit de pruebas comprenda un receptor de AT_{1} liofilizado o péptidos o proteínas con función análoga al receptor de AT_{1}, y que los tampones y otras soluciones no se añadiesen hasta poco antes de realizar las pruebas con el material biológico. Pero también es posible facilitar el kit de pruebas de manera que el receptor de AT_{1} o sus péptidos o proteínas con función análoga estén ligados a una fase sólida. En este caso, los conjugados específicos, la solución limpiadora, la de substrato y la solución de paro, que pueden formar parte del kit de pruebas, deberían añadirse del modo conocido por los expertos para detectar los autoanticuerpos.

La presente invención se refiere también a un kit de pruebas en forma de tira de prueba, que contiene el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas del mismo con función análoga inmovilizados en fase sólida. Se puede, por ejemplo, sumergir o incubar la tira de prueba en suero - o en otra muestra biológica. Una vez constituido el complejo receptor de AT_{1}/autoanticuerpo, se puede desencadenar, por medio de una reacción bioquímica específica sobre la tira de prueba, una reacción cromática específica que nos facilita la detección de los autoanticuerpos.

El sistema de pruebas, según la invención, permite cuantificar los autoanticuerpos anti-receptor de AT_{1} directamente en el material biológico, por ejemplo, en el plasma del paciente. El procedimiento de detección, según la invención, ahorra tiempo y costes. Es posible analizar grandes cantidades de muestras y, debido al reducido aparato técnico también se puede llevar a cabo en laboratorios de rutina.

A continuación, se describirá un ejemplo de realización que sirve para ilustrar la invención sin limitarla al mismo.

Ejemplo AT_{1}-ELISA

Una placa de microtítulo adecuadamente recubierta de estreptavidina se carga con el péptido biotinilado SAFHY-ESQNSTL. A tal efecto, se inoculan 100 \muL de una solución por pocillo sobre la placa de microtítulo con 5 \mug/mL en un tampón de dilución apropiado. Para medir la unión inespecífica, los pocillos se llenan paralelamente sólo con 100 \muL de tampón de dilución.

Trascurrido el tiempo de reacción, la solución de péptidos se elimina vertiéndola y los pocillos se lavan tres veces con 250 \mul, respectivamente, de un tampón limpiador apropiado.

A continuación, los sueros diluidos en el tampón de dilución se inoculan, a razón de 100 \mul/pocillo, tanto en la placa cargada de péptidos como también en la placa de comparación, y se incuban. Los pocillos se lavan, seguidamente, tal como se ha descrito anteriormente.

Los anticuerpos ligados se detectan con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa. A tal efecto, se diluye el anticuerpo en un tampón de dilución, y se incuba (100 \mul/pocillo), a lo cual siguen tres pasos de lavado (véase arriba).

Luego de adición de 100 \mul de una solución de sustrato lista para usar (por ejemplo, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) se desarrolla un color en función de la cantidad de peroxidasa que se encuentra en el pocillo. La reacción del sustrato se termina añadiendo 100 \mul 0,5 M de ácido sulfúrico. La absorción se mide a 450 nm.

Para la evaluación se calcula la diferencia de absorción entre la placa de microtitulo cargada de péptidos y la placa de comparación sin péptidos. Muestras cuya absorción sea superior al "cut-off" serán positivas. El "cut-off" (punto de corte) se calcula añadiendo al valor medio de absorción de donantes negativos la triple desviación estándar. Habitualmente, la prueba se acompaña de un control de "cut-off" o de una serie de dilución estándar, que hace posible una cuantificación en unidades relativas.

Claims (9)

1. Procedimiento para la previsión de riesgo de rechazo de trasplante, caracterizado porque se detectan in vitro autoanticuerpos anti-receptor de AT_{1} en materiales biológicos de un paciente a diagnosticar, de manera que existe riesgo de rechazo del trasplante si se detectan autoanticuerpos.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección se realiza mediante una reacción inmunológica con el receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se detectan autoanticuerpos IgA y/o IgG humanos.

4. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los autoanticuerpos se detectan mediante un inmunoensayo.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, caracterizado porque como inmunoensayo se utiliza una inmunoprecipitación, un ensayo radioinmunológico, un inmunoensayo enzimático, un inmunoensayo fluorescente, un inmunoensayo quimioluminiscente, un ensayo con unión competitiva, un ELISA o un inmunoensayo homogéneo, preferentemente un ELISA.

6. Utilización del receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas con función análoga para la previsión in vitro de un riesgo de rechazo del trasplante.

7. Utilización, según la reivindicación 6, caracterizada porque se utiliza un conjunto o kit de pruebas inmunológicas, que comprende un receptor de AT_{1} o péptidos o proteínas del mismo con función análoga, para la previsión de un riesgo de rechazo del trasplante.

8. Utilización, según una de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizada porque se utiliza una tira de prueba, que comprende un receptor de AT_{1} inmovilizado o péptidos o proteínas del mismo con función análoga, para la previsión de un riesgo de rechazo de trasplante.

9. Conjunto de pruebas para la previsión de un riesgo de rechazo del trasplante, caracterizado porque comprende una tira de prueba, sobre la que se encuentra inmovilizado el receptor de AT_{1} o los péptidos o proteínas del mismo con función análoga.