ES2244646T3 - Biosensor electroquimico desechable para la determinacion cuantitativ a de concentraciones de analitos en liquidos. - Google Patents
Biosensor electroquimico desechable para la determinacion cuantitativ a de concentraciones de analitos en liquidos.Info
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Abstract
Biosensor desechable que comprende un material (1) de soporte sobre el que se aplican pistas (2) conductoras eléctricas, así como un sistema de electrodos que comprende un contraelectrodo (6) y un electrodo de trabajo formado a partir de una capa (5) reactiva, una capa (3) de aislante dieléctrico que cubre el material (1) de soporte, así como las pistas (2) conductoras eléctricas y presenta entalladuras para el contacto (4) de una unidad potenciostática y para el sistema de electrodos, así como un biocomponente que reconoce analitos, caracterizado porque: - la capa reactiva contiene, además de un material que conduce electrones, un mediador de transferencia electrónica que posee una presión de vapor de al menos 1, 33u10-3 N/m2 (1u10-5 mmHg) a 25ºC y - el sistema de electrodos de una capa (8) polimérica protectora está cubierto.
Description
Biosensor electroquímico desechable para la
determinación cuantitativa de concentraciones de analitos en
líquidos.
La presente invención se refiere a un biosensor
desechable que comprende un material de soporte, pistas conductoras
eléctricas, un sistema de electrodos que comprende un
contraelectrodo y un electrodo de trabajo formado a partir de una
capa reactiva, una capa de aislante dieléctrico que cubre el
material de soporte, así como las pistas conductoras eléctricas, y
presenta entalladuras para el contacto de una unidad potenciostática
y para el sistema de electrodos, así como un biocomponente que
reconoce analitos. La invención se refiere además a un procedimiento
para determinar analitos en una muestra líquida con el uso de los
biosensores desechables según la invención, al uso de compuestos que
subliman fácilmente como mediadores de transferencia electrónica de
un sensor electroquímico para la conversión de electrones de una
enzima en un material que conduce electrones, así como al uso de los
biosensores desechables según la invención para determinar
concentraciones de analitos en líquidos corporales o de muestra.
Los sistemas de detección electroquímicos basados
en biosensores modificados por mediadores para la determinación
cuantitativa específica de un analito en una muestra líquida ya se
han descrito detalladamente en la bibliografía y en muchas patentes
(por ejemplo en los documentos EP 0 552 223, US 5.288.636, US
4.711.245). En este sentido, la mayoría de las veces se trata de
biosensores para analitos que pueden reaccionar específicamente
mediante enzimas de la clase de las oxidorreductasas (lactato,
colesterol, etanol, peróxido de hidrógeno, ácido úrico, etc.). Los
biosensores modificados por mediadores ya pueden obtenerse
parcialmente como productos comerciales. El ejemplo más conocido de
un biosensor de este tipo es el biosensor de glucosa, que se utiliza
en el diagnóstico médico de diabéticos para determinar
concentraciones de glucosa en sangre completa. El principio de
detección de un biosensor modificado por mediadores se describe, por
ejemplo, en el documento EP 0 552 223 para un biosensor de
glucosa.
La enzima utilizada en un biosensor de glucosa es
la glucosa-oxidasa (GOD). La GOD posee un grupo
prostético en forma de una molécula de flavina adenina dinucleótido
(FAD) y cataliza la reacción de la glucosa para dar gluconolactona
según la ecuación (I):
(I)Glucosa +
GOD-FAD \Leftrightarrow Gluconolactona +
GOD-FADH_{2}
Básicamente es ahora posible, en una reacción
redox adicional, oxidar la enzima reducida
(GOD-FADH_{2}) con oxígeno (O_{2}) para dar
GOD-FAD con la formación de peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) según la ecuación (IIa) y a continuación determinar
directamente la concentración de glucosa en la muestra mediante la
determinación de la concentración de peróxido de hidrógeno por medio
de un electrodo de platino.
(IIa)GOD-FADH_{2}
+ O_{2} \Leftrightarrow GOD-FAD +
H_{2}O_{2}
Sin embargo, en la mayoría de las realizaciones
del biosensor de glucosa se utiliza un mediador de transferencia
electrónica para cuantificar la cantidad de glucosa en la muestra.
Este mediador oxida la enzima en una segunda etapa de reacción de
manera que ésta está de nuevo a disposición para la reacción
(I):
(IIb)GOD-FADH_{2}
+ MED_{ox} \Leftrightarrow GOD-FAD +
MED_{red}
La concentración de glucosa en la muestra puede
determinarse ahora mediante la oxidación de nuevo del mediador
reducido (MED_{red}) en el electrodo de trabajo del biosensor en
una medición amperométrica y en este sentido cuantificar la
corriente que fluye:
(III)MED_{red} \Leftrightarrow
MED_{ox} +
e^{-}
Para que esta reacción pueda transcurrir se
necesita una unidad potenciostática que preestablece un potencial de
medición adecuado y mide la corriente que fluye. En este sentido, la
corriente es proporcional a la concentración de glucosa en la
muestra.
El principio de detección de un biosensor
modificado por mediadores tiene la ventaja, frente a la
cuantificación directa del peróxido de hidrógeno en un electrodo de
platino, de que puede trabajarse a un potencial de trabajo bajo
(0-350 mV frente a Ag/AgCl). Esto sirve para
disminuir, en el caso ideal incluso evitar, interferencias
perturbadoras que pueden aparecer mediante la oxidación de
sustancias acompañantes (las sustancias interferentes en sangre son,
por ejemplo, ácido ascórbico, ácido úrico o paracetamol).
Otra posibilidad adicional para utilizar
biosensores modificados consiste en cuantificar analitos que pueden
incluirse específicamente en un ensayo marcado con enzimas. Para
esto, el analito se une específicamente a una molécula de captura
inmovilizada sobre la superficie del sensor (biocomponente que
reconoce analitos). En este complejo de molécula de captura y
analito se acopla de nuevo una molécula marcada con una enzima. La
concentración del analito unido puede determinarse mediante la
cuantificación de la cantidad de enzima que se inmoviliza por el
ensayo en la superficie del biosensor. Esto tiene lugar mediante la
adición de una concentración definida de un sustrato que reacciona
mediante la enzima. El mediador del biosensor regenera la enzima
unida en el ensayo de manera correspondiente a la ecuación (IIb). La
reacción de detección es de nuevo la oxidación o reducción del
mediador en la superficie del biosensor (véase la ecuación III). En
este sentido, la corriente que va a medirse es proporcional a la
cantidad de enzima marcada y, por tanto, también es proporcional a
la cantidad de analito unida en el ensayo. Este principio de sensor
se aplica, por ejemplo, en la tecnología de inmunosensores o en el
análisis de ADN.
Los compuestos que se utilizan como mediadores en
los biosensores deberían destacarse por presentar un bajo potencial
redox, por alcanzan altas velocidades de reacción con la enzima, por
no ser fácilmente solubles en estado reducido y por ser estables e
inertes frente a otras sustancias acompañantes. En la bibliografía y
en numerosas patentes se publican muchos compuestos que pueden
utilizarse como mediadores en biosensores. Los compuestos
organometálicos representan un gran grupo de mediadores. Ejemplos de
éstos son derivados del ferroceno (patente británica 8132034,
documento US 4.711.245), complejos de metales de transición (US
5.710.011), por ejemplo, hexacianoferrato de potasio (documento US
5.645.709), bipiridilo de níquel o cobalto, así como compuestos
orgánicos que contienen osmio (documento US 5.846.702). Sin embargo,
estos mediadores organometálicos presentan la desventaja de que
presentan una velocidad de reacción comparativamente baja y por
tanto deben utilizarse en altas concentraciones. Esto no es
favorable, sobre todo para el uso de estos mediadores en biosensores
desechables en forma de tiras de prueba. Una ventaja adicional de
los mediadores organometálicos es su buena solubilidad en agua. Ésta
tiene como consecuencia que los mediadores pueden difundir de manera
relativamente sencilla de la cámara de los electrodos mediante un
contacto con el líquido de muestra, de manera que empeora, por un
lado, la sensibilidad del biosensor debido a una disminución de la
concentración de mediador en la cámara de los electrodos y, por otro
lado, puede llegarse a reacciones secundarias interferentes mediante
el contacto de los mediadores con las sustancias acompañantes, que
sobre todo están presentes en el caso del análisis de muestras de
sangre. Por tanto, son más ventajosos los compuestos que presentan
una solubilidad más baja y también interaccionan en menor medida con
las sustancias acompañantes.
Estas propiedades ventajosas, deseadas, se
cumplen normalmente en moléculas que forman estructuras quinoides
(hidroquinona/benzoquinona,
p-aminofenol/p-iminoquinona) y que
por tanto también pueden utilizarse como mediadores en biosensores.
Compuestos frecuentemente utilizados son también el
tetratiafulvaleno (TTF), tetracianoquinodimetano (TCNQ) o
N-metil-fenazinio (NMP) (documento
US 5.876.952). Muchos de estos compuestos destacan sobre todo debido
a sus propiedades fotosensoras, como buenos donantes o aceptores de
electrones, y por tanto se utilizan frecuentemente como mediadores
en biosensores. En este contexto se mencionan, por ejemplo,
N,N,N',N'-tetrakis-(2'-hidroxietil)-p-fenilendiamina
(THEPD) y
N,N,N',N'-tetrakiscarboximetil-p-fenilendiamina
(TCPD) (documento US 5.609.749), así como
1,4-diamino-2,3,5,6-tetrametilbenceno,
2,5-dietil-1,4-bis(dimetilaminobenceno),
N-(4-morfolinofenilhexahidroazepina), azul de
Meldola, entre otros (documento WO 9207263). Estas moléculas son
esencialmente derivados de las fenilendiaminas (PPD), que, como al
igual que la N,N,N',N'-tetrafenilendiamina (TMPD),
también presenta buenas propiedades donadoras/aceptoras (J. Anal.
Chem. URSS 45 (1990)). En comparación con los mediadores
organometálicos, los derivados de las PPD destacan concretamente por
una velocidad de reacción aumentada, así como por una solubilidad
más baja, sin embargo, la desventaja de estos compuestos que
subliman fácilmente consiste en que poseen una presión de vapor
relativamente alta. Esta conduce a que el mediador se volatilice en
el transcurso del tiempo después de que se aplicara sobre el
sustrato del biosensor y así disminuye la sensibilidad del biosensor
en el caso de un almacenamiento más largo. Además, es problemático
el hecho de que los derivados de la PPD difundan de la cámara de los
electrodos en caso de contacto con el líquido de muestra acuoso
debido a una solubilidad baja en agua aunque en comparación con los
mediadores organometálicos y como consecuencia se observa una
sensibilidad más baja del biosensor mediante la disminución de la
concentración de mediador.
Por tanto, el objetivo en el que se basa la
presente solicitud consistió en el desarrollo de un biosensor
modificado por mediadores que, a pesar del uso de compuestos que
subliman fácilmente como mediadores, no presenta las desventajas
anteriormente mencionadas de una pérdida de sensibilidad debido a un
almacenamiento más largo o como consecuencia del contacto con el
líquido de muestra.
El objetivo se alcanzó según la invención
mediante la provisión del sistema de electrodos en un biosensor del
tipo nombrado al principio con una capa protectora polimérica.
Mediante esta capa protectora no sólo puede aumentarse la
sensibilidad del biosensor mediante el mantenimiento de la capa
protectora con respecto al mediador, que se despega del electrodo,
en la proximidad del electrodo, sino también conseguirse sobre todo
una mejora considerable de la estabilidad de larga duración del
biosensor, a pesar del uso de mediadores que subliman fácilmente.
Esto se atribuye sobre todo a que la capa protectora polimérica
contrarresta la evaporación del mediador. También puede alargarse el
intervalo de medición lineal del biosensor mediante el efecto de
esta capa protectora polimérica como barrera de difusión.
Debido a los motivos más diferentes se han
provisto muchos biosensores presentados en publicaciones y patentes
de capas poliméricas. Así se utilizan, por ejemplo, membranas
poliméricas para inmovilizar las enzimas sobre la superficie del
sensor (documentos EP 0 851 244, EP 0 894 869, EP 0 856 586, EP 0
909 952). En otras aplicaciones se forma con ayuda de un polímero
una denominada capa reactiva sobre el electrodo de trabajo, que
contiene tanto el mediador como también la enzima (patentes de
Matsushita Electric Ind. Co. LTD, JP, por ejemplo: US 5.192.415, EP
0 901 018, WO9835225). Las capas poliméricas pueden servir además
para evitar interferencias mediante sustancias interferentes o para
protegen la superficie del sensor de la contaminación (éste último
es de gran importancia especialmente en el caso de biosensores
reutilizables y del desarrollo de sensores in vivo).
Frecuentemente se utilizan capas de nafión para disminuir las
inferencias mediante sustancias interferentes aniónicas (por
ejemplo, ascorbato) (documento US 5.312.590). Una capa de
poliacrilamida puede servir además para reducir la influencia del
hematocrito de una muestra de sangre en la señal del sensor
(documento EP 0 769 558). Finalmente, las capas poliméricas también
pueden ser útiles para generar una capa de pasivación que evite
uniones no específicas en el electrodo del sensor (documento DE 198
06 642). Por el contrario, hasta la fecha no se ha descrito todavía
en la bibliografía el uso de una capa polimérica protectora para
evitar la evaporación de un mediador que sublima fácilmente y, por
tanto, para mejorar también la estabilidad de larga duración de
biosensores.
El objeto de la presente invención se refiere a
un biosensor desechable que comprende un material de soporte, pistas
conductoras eléctricas, un sistema de electrodos que comprende un
contraelectrodo y un electrodo de trabajo formado a partir de una
capa reactiva, una capa de aislante dieléctrico que cubre el
material de soporte, así como las pistas conductoras eléctricas, y
presenta entalladuras para el contacto de una unidad potenciostática
y para el sistema de electrodos, así como un biocomponente que
reconoce analitos. El biosensor desechable según la invención se
caracteriza porque la capa reactiva contiene un mediador que sublima
fácilmente y porque el sistema de electrodos de una capa polimérica
protectora está cubierto. El biosensor desechable según la invención
se produce en forma de una pastilla y se aplica en combinación con
una unidad potenciostática. Sirve para la cuantificación in situ de
concentraciones de analitos en líquidos. Los analitos que van a
detectarse son sustancias que reaccionan específicamente mediante
oxidorreductasas o que pueden incluirse en un inmunoensayo o ensayo
de receptores marcados con enzimas. La cuantificación tiene lugar de
manera amperométrica o ciclovoltamétrica.
La construcción de una de las formas de
realización preferidas del biosensor según la invención está
representada como ejemplo en la figura 1. El biosensor comprende un
material (1) de soporte sobre el que se han aplicado sucesivamente
pistas (2) conductoras eléctricas, una capa (3) de aislante, un
sistema de electrodos que comprende un contraelectrodo (6) y un
electrodo (5) de trabajo, así como una capa (8) protectora
polimérica que cubre el sistema de electrodos, preferiblemente
mediante impresión por máscara o serigráfica, así como un
biocomponente que reconoce analitos. El electrodo (5) de trabajo
está formado de un mediador que sublima fácilmente, así como de una
capa reactiva que contiene un material que conduce electrones. Las
pistas conductoras sirven para conectar los electrodos respectivos a
los puntos (4) de conexión por medio de los que se pone en contacto
el biosensor con la unidad potenciostática. La capa (3) de aislante
cubre las pistas conductoras y presenta entalladuras para los puntos
(4) de conexión y así como para el sistema de electrodos y sirve
para evitar corrientes parásitas. En la forma de realización
preferida representada en esta figura 1 del biosensor desechable
según la invención, el sistema de electrodos comprende, además del
contraelectrodo (6) y del electrodo (5) de trabajo, todavía un
electrodo (7) de referencia. Mediante el uso de este electrodo de
referencia puede alcanzarse una clara mejora de la exactitud de
medición.
Las pistas (2) conductoras constan de una pasta
polimérica que contiene partículas de carbono, plata, platino u oro
como constituyentes esenciales. Las pistas (2) conductoras se
aplican preferiblemente mediante impresión por máscara o serigráfica
sobre el material (1) de soporte y a continuación se endurecen.
El material (1) de soporte utilizado para la
producción de biosensores desechables consiste preferiblemente en
policarbonato, poli(cloruro de vinilo) (PVC),
poli(tereftatalo de etileno) (PET), polipropileno, poliéster
o poliestireno.
Para la producción del contraelectrodo (6) y del
electrodo (7) de referencia se utiliza preferiblemente una pasta
conductora que contiene partículas de plata y cloruro de plata a la
que se ha añadido una sal de cloruro ligeramente soluble (por
ejemplo, cloruro de sodio o cloruro de potasio). El contraelectrodo
(6) y el electrodo (7) de referencia se aplican preferiblemente
sobre material (1) de soporte mediante impresión por máscara o
serigráfica y a continuación se endurecen.
La capa reactiva, a partir de la que se ha
formado el electrodo (5) de trabajo, contiene, además del mediador
de transferencia electrónica que sublima fácilmente, un material que
conduce electrones que consta de una pasta polimérica que puede
endurecerse que contiene partículas de carbono, platino, paladio,
rodio u oro como constituyentes esenciales. La capa reactiva se
aplica preferiblemente mediante impresión por máscara o serigráfica
sobre el material (1) de soporte y a continuación se endurece.
En el caso de los mediadores que subliman
fácilmente utilizados en la presente invención se trata de
compuestos que presentan una presión de vapor de al menos
1\cdot10^{-5} mmHg a 25ºC. Los mediadores poseen preferiblemente
la estructura representada en la figura 2, en la que los restos
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes
y representan un átomo de hidrógeno, un resto alquilo
C_{1}-C_{10}, preferiblemente un resto alquilo
C_{1}-C_{5} o un resto arilo. Los mediadores
preferidos son p-aminodifenilamina,
p-fenilendiamina o
N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina.
El sistema de electrodos completo está cubierto
por una capa (8) protectora hidrófila en forma de un hidrogel
polimérico que estabiliza al mediador, que contrarresta la
evaporación del mediador de transferencia electrónica y aumenta
simultáneamente la sensibilidad del biosensor y hace de barrera de
difusión. La capa (8) protectora polimérica, preferiblemente impresa
por máscara o por serigrafia, consiste esencialmente de un hidrogel
de polivinilpirrolidona (PVP), poli(óxido de etileno) (PEO), almidón
o gelatina.
Una enzima, una molécula de ADN, un anticuerpo de
captura o una molécula receptora pueden hacer de biocomponente que
reconoce analitos. Como enzima se utiliza preferiblemente una
oxidorreductasa, una deshidrogenasa, una
\beta-galactosidasa o una fosfatasa alcalina. Las
enzimas especialmente preferidas son glucosa-oxidasa
(GOD), lactato-oxidasa (LOD), uricasa,
ascorbato-oxidasa, etanol-oxidasa,
colesterol-oxidasa o peroxidasa (POD).
Además, en la forma de realización preferida
representada en la figura 1 del biosensor según la invención, un
tejido (9) plástico con una cinta (10) parcialmente adhesiva está
fijado sobre el sistema de electrodos del biosensor. La cinta (10)
parcialmente adhesiva presenta una entalladura en la que puede
aplicarse la muestra líquida, de manera que por el tejido (9)
plástico la muestra entra en contacto con los electrodos que se
abastecen por la unidad potenciostática con una corriente de
medición. Pero este tejido no sólo sirve para la distribución rápida
y homogénea de la muestra sobre los electrodos, sino también para
proteger la superficie del sensor de la destrucción o contaminación
que puede aparecer, por ejemplo, cuando se aplica como muestra
sangre capilar con el dedo. El tejido (9) plástico consta
preferiblemente de una red de polietileno, polipropileno o
poliamida, mientras que la cinta (10) consta de una lámina
parcialmente adhesiva de poliéster, PVC o papel.
Dependiendo de la localización del biocomponente
que reconoce analitos y de la estructura de la capa reactiva pueden
diferenciarse básicamente cinco formas de realización diferentes del
biosensor según la invención.
1. En una primera forma de realización del
biosensor según la invención, la capa reactiva consta de una única
capa que contiene la pasta polimérica conductora de electrones, el
mediador que sublima fácilmente, así como el biocomponente que
reconoce analitos.
2. En una segunda forma de realización del
biosensor según la invención, la capa reactiva consta de una única
capa que contiene la pasta polimérica conductora de electrones y el
mediador que sublima fácilmente. Sin embargo, en esta forma de
realización, el biocomponente que reconoce analitos está localizado
en la capa (8) polimérica protectora.
3. En una tercera forma de realización del
biosensor según la invención, la capa reactiva consta de dos capas,
de modo que la primera capa se forma a partir de la pasta polimérica
conductora de electrones, así como del mediador que sublima
fácilmente, y de una segunda capa polimérica superficial, hidrófila,
que hace de soporte del biocomponente que reconoce analitos.
4. En una cuarta forma de realización del
biosensor según la invención, la capa reactiva también consta de dos
capas, de modo que en este caso la primera capa se forma a partir de
la pasta polimérica conductora de electrones y está cubierta de una
segunda capa polimérica superficial, hidrófila, que hace de soporte
del biocomponente que reconoce analitos y del mediador que sublima
fácilmente.
5. En una quinta forma de realización del
biosensor según la invención, la capa reactiva también consta de dos
capas, de modo que la primera capa se forma a partir de la pasta
polimérica conductora de electrones y está cubierta de una segunda
capa polimérica superficial, hidrófila, que hace de soporte del
mediador que sublima fácilmente. En esta forma de realización, el
biocomponente que reconoce analitos está localizado en la capa (8)
polimérica protectora.
El biocomponente que reconoce analitos puede
estar inmovilizado o bien directamente o bien sobre una interacción
avidina/biotina (véase las figuras 8 y 20) en la capa reactiva o
bien en la capa (8) polimérica protectora.
La capa polimérica superficial contenida
opcionalmente en la capa reactiva consta esencialmente de un
hidrogel de polivinilpirrolidona (PVP), poli(óxido de etileno)
(PEO), almidón o gelatina, que se ha impreso preferiblemente
mediante impresión por máscara o serigráfica.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para determinar concentraciones de analitos en
soluciones acuosas con el uso de los biosensores desechables según
la invención.
En el uso de la forma de realización del
biosensor, en el que el biocomponente que reconoce analitos es una
enzima, por ejemplo, glucosa-oxidasa,
lactato-oxidasa, alcohol-oxidasa,
peroxidasa o uricasa, se aplica una muestra líquida sobre el sistema
de electrodos del biosensor. El analito que va a determinarse, por
ejemplo, glucosa, se reduce entonces mediante la enzima
correspondiente, como se describe para el caso de la detección de
glucosa en la ecuación (I). La enzima reducida reduce entonces en
una etapa de reacción adicional al mediador de manera
correspondiente a la ecuación (IIb). Por medio de una unidad
potenciostática que preestablece un potencial de medición adecuado,
se oxida entonces el mediador y en este sentido se determina la
corriente que fluye, que es proporcional a la concentración de
analito.
Cuando el biosensor según la invención se utiliza
como inmunoensayo marcado por enzima, como ensayo de ADN o ensayo de
ligando, en este caso también se aplica en primer lugar un muestra
líquida sobre el sistema de electrodos del biosensor. Entonces, el
antígeno contenido en el líquido de muestra, la molécula de ADN
específica de secuencia o el ligando se une al biocomponente que
reconoce analitos (anticuerpo, sonda de ADN o receptor) inmovilizado
en la capa reactiva o en la capa (8) polimérica protectora. A
continuación se lava la superficie del sensor y después se cubre con
una solución que contiene un conjugado enzimático específico para el
analito que reconoce el ADN específico de secuencia, el antígeno o
los ligandos. Este conjugado enzimático se une a los analitos
(anticuerpo, sonda de ADN o receptor) y la cantidad de conjugado
enzimático unido en la capa reactiva o en la capa (8) polimérica
protectora es proporcional a la cantidad de analito en la muestra de
líquido que se aplicó al principio. Después de un nuevo lavado a
fondo de la superficie del electrodo de trabajo, éste se recubre con
una solución adicional que contiene un sustrato del conjugado
enzimático. El sustrato reacciona con la enzima y la enzima reducida
u oxidada reacciona entonces de manera correspondiente a la ecuación
(IIb) con el mediador. Por medio de una unidad potenciostática que
preestablece un potencial de medición adecuado, en este sentido se
determina entonces la corriente que fluye.
La presente invención se refiere también al uso
de compuestos que subliman fácilmente con una presión de vapor de al
menos 1\cdot10^{-5} mmHg a 25ºC como mediadores de transferencia
electrónica para la conversión de electrones de una enzima en un
material que conduce electrones, de modo que estos mediadores se
encuentran en una capa reactiva que está cubierta por una capa (8)
protectora polimérica. La capa (8) protectora polimérica
contrarresta la sublimación del mediador, de manera que se puede
alargar considerablemente la estabilidad de larga duración del
sensor. En el caso de los mediadores utilizados preferiblemente para
la conversión de electrones de una enzima en un material que conduce
electrones preferiblemente se trata de compuestos que subliman
fácilmente con la estructura (I),
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en los que los restos R^{1},
R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes y
representan un átomo de hidrógeno, un resto alquilo
C_{1}-C_{10}, preferiblemente un resto alquilo
C_{1}-C_{5} o un resto arilo. Los mediadores
preferidos utilizados para la conversión de electrones de una enzima
en un material que conduce electrones son
p-aminodifenilamina,
p-fenilendiamina o
N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina.
La presente invención se refiere además al uso
del biosensor desechable según la invención para determinar
concentraciones de analitos en líquidos corporales o de muestra. En
el caso de los analitos que pueden detectarse con el biosensor según
la invención se trata preferiblemente de glucosa, lactato, ácido
úrico, ascorbato, etanol, colesterol o peróxido de hidrógeno.
También pueden detectarse fragmentos de ADN específicos de
secuencia, antígenos específicos o también ligandos con formas de
realización especiales del biosensor según la invención. En el caso
de los líquidos que pueden analizarse con el presente biosensor se
trata de disoluciones sintéticas acuosas, caldos de cultivo, pero
también sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo u orina.
El comportamiento redox del mediador utilizado en
el biosensor desechable puede representarse mediante voltamogramas
cíclicos en una solución tamponada (PBS, pH 7,4, Cl^{-} 154 mM).
Los máximos que aparecen en los mismos aclaran la capacidad de
oxidación o la capacidad de reducción electroquímica del mediador.
Los potenciales máximos determinan el potencial de trabajo del
biosensor. Las corrientes máximas son una medida de la cantidad de
sustancia oxidada o reducida. Las corrientes máximas descendientes
después de tiempos de almacenamiento más largos de los biosensores
muestran por tanto la pérdida o la descomposición del mediador.
Para comprobar la estabilidad de un mediador se
llevan a cabo voltamogramas cíclicos en soluciones acuosas
tamponadas en intervalos de tiempo regulares cada vez con
biosensores no utilizados y se comparan las corrientes máximas
obtenidas.
Tanto los voltamogramas cíclicos como también las
mediciones amperométricas en el tampón que contiene analito muestran
la capacidad del mediador respectivo para regenerar la enzima y
transferir los electrones a los electrodos. Esto se manifiesta en
ambas formas experimentales en un aumento de los potenciales frente
a las mediciones que se llevan a cabo en tampón sin analito. La
sensibilidad de los biosensores se determina con ayuda de mediciones
amperométricas a distintas concentraciones de analito. Ésta se
define como el aumento del potencial con concentración creciente.
Tanto el cambio de la sensibilidad que aparece con la edad creciente
del sensor como también el cambio de los potenciales máximos en el
voltamograma cíclico sirven para la caracterización de la
estabilidad prolongada.
Con la construcción de sensor descrita
anteriormente pueden producirse biosensores configurados de manera
diferente. En este sentido, las diferentes modificaciones de este
biosensor de glucosa se diferencian, entre otras, en la elección del
compuesto que se utiliza como mediator o bien en el material de la
capa polimérica protectora. Como enzima se utiliza
glucosa-oxidasa (de Aspergillus niger) en los
ejemplos 1-3 explicados. El efecto protector y de
aumento de la sensibilidad de la capa polimérica protectora se
explica mediante la presentación de los resultados de medición de
los biosensores con y sin capa protectora unos frente a los
otros.
| Material de los electrodos: | Pasta de carbono |
| Mediador: | p-Aminodifenilamina (ADPA) |
| Enzima: | Glucosa-oxidasa (Aspergillus niger) |
| Capa protectora: | Polivinilpirrolidona (PVP) |
| Forma de realización | \begin{minipage}[t]{110mm} La capa reactiva consta de una capa única que contiene un material que conduce electrones, el mediador y el biocomponente que reconoce analitos (glucosa-oxidasa)\end{minipage} |
La corriente máxima (corriente de oxidación) de
un biosensor modificado con ADPA sin capa protectora es 200 mV
(frente a Ag/AgCl) al principio de la serie de mediciones a 216 nA
(figura 3). Mediante el efecto de aumento de la señal de una capa
protectora de PVP puede amplificarse la corriente máxima hasta 2000
nA (figura 4). Mientras que los biosensores de ADPA sin capa
protectora pierden en el plazo de 54 días el 55% de la cantidad de
ADPA que puede oxidarse, esta cantidad permanece constante en este
periodo de tiempo en los biosensores con capa protectora de PVP.
Los voltamogramas cíclicos en solución de glucosa
tamponada (c_{glucosa}= 15 mM) muestran que la ADPA es adecuada
como mediador. La corriente en el intervalo de potencial de la
oxidación de ADPA aumenta con la ausencia de glucosa en los
biosensores sin capa protectora hasta 550 nA, en los biosensores con
capa protectora hasta aproximadamente 6000 nA. Mientras que los
biosensores de ADPA sin capa protectora presentan en el plazo de 54
días una pérdida considerable de señal (figura 5), el valor de la
señal de los biosensores recubiertos con PVP permanece constante en
este periodo de tiempo (figura 6). El uso de la capa protectora de
PVP en los biosensores de ADPA provoca una mejora considerable
también en lo referente a la sensibilidad de los sensores.
Inicialmente, la sensibilidad de los biosensores de ADPA no
protegidos es de 204 nA/mM (figura 7). En los biosensores protegidos
la sensibilidad es inicialmente de 325 nA/mM (figura 8). Mientras
que la capa protectora de PVP cuida que esta sensibilidad de 325
nA/mM también se mantenga después de 54 días, en los biosensores no
protegidos ya disminuye en el plazo de 54 días hasta 136 nA/mM.
Además, es llamativo el aumento del intervalo de medición del
biosensor de ADPA mediante la capa protectora de PVP. Sin esta capa
protectora ya se observa para glucosa 4 mM la aparición de una
saturación de la señal del sensor, mientras que en los biosensores
protegidos esta concentración se engloba todavía en el intervalo
lineal del biosensor.
| Material de los electrodos: | Pasta de carbono |
| Mediador: | N,N,N',N'-tetrametil-fenilendiamina (TMPD) |
| Enzima: | Glucosa-oxidasa (Aspergillus niger) |
| Capa protectora: | Polivinilpirrolidona (PVP) |
| Forma de realización | \begin{minipage}[t]{110mm} La capa reactiva consta de una única capa que contiene un material que conduce electrones, el mediador y el biocomponente que reconoce analitos (glucosa-oxidasa)\end{minipage} |
Los biosensores modificados con TMPD sin capa
protectora presentan al principio de la serie de mediciones en el
voltamograma cíclico en tampón sin glucosa a 100 mV un máximo de
oxidación con una corriente máxima de 90 nA (frente a Ag/AgCl)
(figura 9). Mediante una capa protectora de PVP puede amplificarse
esta señal hasta 850 nA (figura 10). En el plazo de 46 días se
reduce la cantidad de TMPD oxidable del biosensor no protegido el
57%. Por el contrario, en los biosensores de TMPD con capa
protectora de PVP la corriente de oxidación y por tanto la cantidad
de TMPD que puede oxidarse en este periodo de tiempo permanece casi
constante.
La TMPD muestra en los voltamogramas cíclicos en
solución de glucosa tamponada (c_{glucosa} = 15 mM) la utilizada
como mediador. La corriente en el intervalo de potencial oxidación
de TMPD es inicialmente en biosensores sin capa protectora de 450 nA
(figura 11), en los biosensores con capa protectora de 3500 nA
(figura 12). Este valor también puede mantenerse sólo en los
biosensores con capa protectora de PVP aproximadamente constante.
Sin capa protectora disminuye la corriente de oxidación en el plazo
de 46 días hasta 160 nA. El efecto estabilizante y de aumento de la
señal de la capa protectora de PVP también es claro en la
consideración de la sensibilidad. Esta aumenta mediante la capa
protectora de PVP de 60 nA/mM (figura 13) a 341 nA/mM (figura 14) y
puede mantenerse constante durante 46 días a este nivel. Como ya se
observa en el biosensor de ADPA, la capa protectora de PVP también
alarga el intervalo de medi-
ción lineal en el biosensor de TMPD, de manera que todavía puede englobarse una concentración de glucosa de 4 mM.
ción lineal en el biosensor de TMPD, de manera que todavía puede englobarse una concentración de glucosa de 4 mM.
| Material de los electrodos: | Pasta de carbono |
| Mediador: | N,N,N',N'-Tetrametil-fenilendiamina (TMPD) |
| Enzima: | Glucosa-oxidasa (Aspergillus niger) |
| Capa protectora: | Almidón |
| Forma de realización | \begin{minipage}[t]{110mm} La capa reactiva consta de una única capa que contiene un material que conduce electrones, el mediador y el biocomponente que reconoce analitos (glucosa-oxidasa)\end{minipage} |
Un biosensor de TMPD también pueden estabilizarse
mediante una capa protectora de almidón. La intensidad de señal en
el voltamograma cíclico en esta solución de glucosa tamponada
aumenta mediante esta capa hasta 175 nA (figura 15) (en comparación
con 90 nA sin capa protectora, figura 9) y permanece aproximadamente
constante durante un periodo de tiempo de 46 días. En una solución
de glucosa tamponada (c_{glucosa} = 15 mM) se obtiene en un
periodo de tiempo de 46 días corrientes de oxidación de entre 470 y
520 nA (figura 16) en comparación con 450 nA sin capa protectora
(figura 11). Por tanto, el efecto de aumento de la señal del almidón
no es tan intenso como en la PVP, sin embargo, puede conseguirse una
estabilización con esta capa protectora. Esto también es claro en
los análisis de sensibilidad (figura 17).
B) Biosensores para determinar concentraciones de
fragmento de cadena sencilla de ADN específico de secuencia (ejemplo
4) o de antígenos en líquidos de muestra (ejemplo 5)
Con la construcción de sensor descrita
anteriormente también pueden cuantificarse, además de analitos que
reaccionan mediante enzimas específicas, fragmentos de cadena
sencilla de ADN o antígeno en líquidos de muestras o corporales.
| Material de los electrodos: | Pasta de carbono |
| Mediador: | p-Aminodifenilamina (ADPA) |
| Enzima: | Peroxidasa |
| Biocomponente: | ADN de cadena sencilla biotinilado |
| Capa protectora: | Almidón |
| Forma de realización: | \begin{minipage}[t]{110mm} La capa reactiva consta de una capa única que contiene un material que conduce electrones, el mediador y el biocomponente que reconoce analitos (sonda de ADN).\end{minipage} |
La sonda de ADN biotinilada específica de
secuencia está presente inmovilizada sobre avidina en la capa
reactiva (figura 18). La cantidad de cadena de ADN complementaria
que va a determinarse se marca con digoxigenina. Después de la
hibridación de esta cadena de ADN complementaria en la cadena
sencilla de ADN inmovilizada tiene lugar la detección después de la
adición de un conjugado
anti-digoxigenina-anticuerpo
(conjugado enzimático). La peroxidasa cataliza la reducción de
peróxido de hidrógeno (sustrato del conjugado enzimático) para dar
agua, oxidándose la peroxidasa. La regeneración de la peroxidasa
tiene lugar mediante la ADPA del mediador, a continuación se reduce
de nuevo el mediador oxidado en el electrodo de trabajo a un
potencial de -150 mV (frente a Ag/AgCl). En la figura 19 se
representa una recta de calibrado para la detección de un
oligonucleótido de 20 monómeros. El límite de detección está en 80
amol de ADN.
| Material de los electrodos: | Pasta de carbono |
| Mediador: | p-Aminodifenilamina (ADPA) |
| Enzima: | Peroxidasa |
| Biocomponente: | Anticuerpo de captura |
| Capa protectora: | Almidón |
| Forma de realización: | \begin{minipage}[t]{110mm} La capa reactiva consta de una capa única que contiene un material que conduce electrones, el mediador y el biocomponente que reconoce analitos (anticuerpo de captura).\end{minipage} |
El anticuerpo de captura está presente o bien
directamente inmovilizado o se fija a la superficie por medio de la
avidina anteriormente inmovilizada (figura 20). Después de la unión
del analito de la muestra que va a analizarse al anticuerpo de
captura específico de analito tiene lugar la detección tras al
adición de un segundo conjugado anticuerpo -
peroxidasa específico de analito (conjugado enzimático). La peroxidasa cataliza la reducción de H_{2}O_{2} para dar H_{2}O, oxidándose la peroxidasa. La regeneración de la peroxidasa tiene lugar mediante la ADPA del mediador; el mediador oxidado se reduce de nuevo en el electrodo de trabajo (a E = -150 mV frente a Ag/AgCl). En la figura 21 está representado el ejemplo de una recta de calibrado de interleucina-4. El límite de detección está en 200 amol de interleucina-4.
peroxidasa específico de analito (conjugado enzimático). La peroxidasa cataliza la reducción de H_{2}O_{2} para dar H_{2}O, oxidándose la peroxidasa. La regeneración de la peroxidasa tiene lugar mediante la ADPA del mediador; el mediador oxidado se reduce de nuevo en el electrodo de trabajo (a E = -150 mV frente a Ag/AgCl). En la figura 21 está representado el ejemplo de una recta de calibrado de interleucina-4. El límite de detección está en 200 amol de interleucina-4.
Claims (30)
1. Biosensor desechable que comprende un material
(1) de soporte sobre el que se aplican pistas (2) conductoras
eléctricas, así como un sistema de electrodos que comprende un
contraelectrodo (6) y un electrodo de trabajo formado a partir de
una capa (5) reactiva, una capa (3) de aislante dieléctrico que
cubre el material (1) de soporte, así como las pistas (2)
conductoras eléctricas y presenta entalladuras para el contacto (4)
de una unidad potenciostática y para el sistema de electrodos, así
como un biocomponente que reconoce analitos, caracterizado
porque
- la capa reactiva contiene, además de un
material que conduce electrones, un mediador de transferencia
electrónica que posee una presión de vapor de al menos
1,33\cdot10^{-3} N/m^{2} (1\cdot10^{-5} mmHg) a 25ºC y
- el sistema de electrodos de una capa (8)
polimérica protectora está cubierto.
2. Biosensor desechable según la reivindicación
1, caracterizado porque el mediador de transferencia
electrónica en la capa reactiva es un compuesto de estructura
(I),
en el que los restos R^{1},
R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes y
representan un átomo de hidrógeno, un resto alquilo
C_{1}-C_{10}, preferiblemente un resto alquilo
C_{1}-C_{5} o un resto
arilo.
3. Biosensor desechable según la reivindicación 1
a 2, caracterizado porque el mediador de transferencia
electrónica en la capa reactiva es o bien
p-fenilendiamina,
N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina
(TMPD) o bien p-aminodifenilamina (ADPA).
4. Biosensor desechable según la reivindicación 1
a 3, caracterizado porque el sistema de electrodos comprende
adicionalmente un electrodo (7) de referencia.
5. Biosensor desechable según la reivindicación
4, caracterizado porque el electrodo (7) de referencia consta
de una pasta polimérica que contiene partículas de plata, cloruro de
plata y una sal de cloruro ligeramente soluble como constituyentes
esenciales.
6. Biosensor desechable según la reivindicación 1
a 5, caracterizado porque el material (1) de soporte consta
de policarbonato, poli(cloruro de vinilo) (PVC),
poli(tereftatalo de etileno) (PET), polipropileno, poliéster
o poliestireno.
7. Biosensor desechable según la reivindicación 1
a 6, caracterizado porque las pistas (2) conductoras constan
de una pasta polimérica que contiene partículas de carbono, plata,
platino u oro como constituyentes esenciales.
8. Biosensor desechable según la reivindicación 1
a 7, caracterizado porque para la producción de la capa
reactiva se ha utilizado una pasta polimérica como material
conductor de electrones que contiene partículas de carbono, platino,
paladio, rodio u oro como constituyentes esenciales.
9. Biosensor desechable según la reivindicación 1
a 8, caracterizado porque el contraelectrodo (6) consta de
pasta polimérica que contiene partículas de plata, cloruro de plata
y una sal de cloruro ligeramente soluble como constituyentes
esenciales.
10. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 9, caracterizado porque la capa (8) protectora
polimérica, hidrófila consta esencialmente de un hidrogel de
polivinilpirrolidona (PVP), poli(óxido de etileno) (PEO), almidón o
gelatina.
11. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 10, caracterizado porque sobre el sistema de electrodos
está localizado un tejido (9) plástico que está fijado con una cinta
(10) que cubre la capa (8) protectora polimérica sobre los
electrodos, de modo que la cinta (10) presenta una entalladura para
alojar un líquido.
12. Biosensor desechable según la reivindicación
11, caracterizado porque el tejido (9) plástico consta de una
red de polietileno, polipropileno o poliamida.
13. Biosensor desechable según la reivindicación
11, caracterizado porque la cinta (10) consta de una lámina
parcialmente adhesiva de poliéster, PVC o papel.
14. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 13, caracterizado porque el biocomponente que reconoce
analitos es una enzima.
15. Biosensor desechable según la reivindicación
14, caracterizado porque la enzima es una oxidorreductasa,
una deshidrogenasa, una \beta-galactosidasa o una
fosfatasa alcalina.
16. Biosensor desechable según la reivindicación
14 a 15, caracterizado porque la enzima es o bien
glucosa-oxidasa (GOD),
lactato-oxidasa (LOD), uricasa,
ascorbato-oxidasa, etanol-oxidasa,
colesterol-oxidasa o bien peroxidasa (POD).
17. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 13, caracterizado porque el biocomponente que reconoce
analitos es una molécula de ADN, un anticuerpo de captura o un
receptor.
18. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 17, caracterizado porque la capa reactiva está formada de
una única capa que contiene la pasta polimérica conductora de
electrones, el mediador de transferencia electrónica, así como el
biocomponente que reconoce analitos.
19. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 17, caracterizado porque la capa reactiva está formada de
una única capa que contiene la pasta polimérica conductora de
electrones y el mediador de transferencia electrónica y porque el
biocomponente que reconoce analitos está localizado en la capa (8)
polimérica protectora.
20. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 17, caracterizado porque la capa reactiva consta de dos
capas, de modo que la primera capa contiene una pasta polimérica
conductora de electrones, así como un mediador de transferencia
electrónica y está cubierta de una segunda capa polimérica
superficial, hidrófila, que hace de soporte del biocomponente que
reconoce analitos.
21. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 17, caracterizado porque la capa reactiva consta de dos
capas, de modo que la primera capa está formada de una pasta
polimérica conductora de electrones y está cubierta de una segunda
capa polimérica superficial, hidrófila, que hace de soporte del
biocomponente que reconoce analitos y del mediador de transferencia
electrónica.
22. Biosensor desechable según la reivindicación
1 a 17, caracterizado porque la capa reactiva consta de dos
capas, de modo que la primera capa está formada de una pasta
polimérica conductora de electrones y está cubierta de una segunda
capa polimérica superficial, hidrófila, que hace de soporte del
mediador de transferencia electrónica y porque el biocomponente que
reconoce analitos está localizado en la capa (8) polimérica
protectora.
23. Biosensor desechable según la reivindicación
20 a 22, caracterizado porque la capa polimérica superficial
hidrófila consta esencialmente de un hidrogel de
polivinilpirrolidona (PVP), poli(óxido de etileno) (PEO), almidón o
gelatina.
24. Procedimiento para determinar un analito en
una muestra líquida con el uso del biosensor según la reivindicación
14, caracterizado porque se aplica una muestra líquida sobre
el sistema de electrodos del biosensor y a continuación se determina
mediante una unidad potenciostática, con la que se predetermina un
potencial de medición definido, la corriente proporcional a la
concentración de analito que representa la señal de medición del
biosensor.
25. Procedimiento para determinar un analito en
una muestra líquida con el uso del biosensor según la reivindicación
17, caracterizado porque una muestra líquida que contiene un
ADN específico de secuencia, un antígeno o un ligando se aplica
sobre el sistema de electrodos del biosensor, después se lava el
sensor a fondo con una solución tampón, a continuación se cubren los
electrodos en primer lugar con una solución que contiene un
conjugado enzimático que reconoce el ADN específico de secuencia, el
antígeno o los ligandos y después de lavar de nuevo se recubre con
una solución que contiene un sustrato y finalmente se determina por
medio de una unidad potenciostática, con la que se preestablece un
potencial de medición definido, la corriente proporcionar a la
concentración de ADN, a la concentración de antígeno o a la
concentración de ligando que representa la señal de medición del
biosensor.
26. Uso de compuestos que poseen una presión de
vapor de al menos 1\cdot10^{-5} mmHg a 25ºC como mediadores de
transferencia electrónica de un sensor electroquímico para la
conversión de electrones de una enzima en un material conductor de
electrones, de modo que el compuesto se encuentra en una denominada
capa reactiva.
27. Uso de compuestos que poseen una presión de
vapor de al menos 1\cdot10^{-5} mmHg a 25ºC como mediadores de
transferencia electrónica según la reivindicación 26,
caracterizado porque el compuesto presenta una estructura
según la fórmula (I)
en la que en el que los restos
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes
y representan un átomo de hidrógeno, un resto alquilo
C_{1}-C_{10}, preferiblemente un resto alquilo
C_{1}-C_{5} o un resto
arilo.
28. Uso de compuestos que poseen una presión de
vapor de al menos 1\cdot10^{-5} mmHg a 25ºC como mediadores de
transferencia electrónica según la reivindicación 26 y 27,
caracterizado porque en el caso del compuesto se trata de
p-fenilendiamina,
N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina
(TMPD) o p-aminodifenilamina (ADPA).
29. Uso de un biosensor desechable según la
reivindicación 1 a 23 para la determinación
"in-vitro" de concentración de analito
en una solución sintética, en un caldo de cultivo o en un fluido
corporal como por ejemplo, sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo
u orina.
30. Uso de un biosensor desechable según la
reivindicación 29, caracterizado porque el analito es
glucosa, lactato, ácido úrico, ascorbato, etanol, colesterol o
peróxido de hidrógeno.
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