ES2244246T3

ES2244246T3 - Utilizacion de una sustancia que se une al receptor periferico de las benzodiazepinas en el tratamiento de estres cutaneo.

Info

Publication number: ES2244246T3
Application number: ES99972094T
Authority: ES
Inventors: Pierre Casellas; Jean-Marie Derocq
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: WO2000028947A3; DE69925928T2; EP1131039B1; HRP20010367A2; US20050090489A1; AU764786B2; DK1131039T3; FR2785803A1; CA2349919A1; US6767533B1; WO2000028947A2; AU1166100A; FR2785803B1; EP1131039A2; DE69925928D1; KR20010089475A; PT1131039E; ATE298230T1; SI1131039T1; HK1037966A1

Abstract

Utilización de al menos una sustancia que se une al receptor periférico de las benzodiazepinas o PBR, para la fabricación de una composición farmacológica o dermatológica tópica en el tratamiento del estrés cutáneo.

Description

Utilización de una sustancia que se une al receptor periférico de las benzodiazepinas en el tratamiento de estrés cutáneo.

La presente invención se refiere a una composición que contiene un ligando de los receptores periféricos de las benzodiazepinas para una utilización por vía tópica.

La invención se refiere a la utilización de una sustancia que se une específicamente al receptor periférico de las benzodiazepinas (PBR) para la fabricación de una composición para la profilaxis o el tratamiento de los estrés cutáneos.

La invención se refiere igualmente a las composiciones que contienen estas sustancias. Estas composiciones pueden ser cosméticas o farmacéuticas, en particular dermatológicas tópicas.

Por estrés cutáneo, se entienden las diferentes situaciones que podrían provocar daños en particular a nivel de la epidermis cualquiera que sea el agente que lo provoca. Este agente puede ser interno y/o externo al organismo como un agente químico o radicalario o bien externo como un rayo ultravioleta.

La composición según la invención está destinada por lo tanto a prevenir y a luchar contra las irritaciones cutáneas, las dartas, los eritemas, las sensaciones disestésicas, las sensaciones de calentamiento, los pruritos de la piel y/o de las mucosas, el envejecimiento y puede utilizarse también en los desórdenes cutáneos tales como, por ejemplo, la psoriasis, las enfermedades pruriginosas, el herpes, las fotodermatosis, las dermatitis atópicas, las dermatitis de contacto, los líquenes, los prurigos, los pruritos, las picaduras de insectos, en las fibrosis y otros trastornos de la maduración de los colágenos, en los desórdenes inmunológicos o también en afecciones dermatológicas como el eccema.

El ligando PBR, igualmente llamado "sustancia", contenido en la composición puede ser un compuesto no peptídico, un péptido, un extracto de células o de tejidos de origen animal o vegetal o un producto obtenido por fermentación de un microorganismo, por ejemplo de una bacteria o de un hongo.

Se describen numerosos ligandos PBR en la bibliografía. Se pueden citar, a título de ejemplo, Ro 5-4864 o clorodiazepam, Ro 5-2807 o diazepam, PK 11195 o se podrá hacer referencia al artículo Peripheral Benzodiazepine Receptors, Ch. III, J. J. Bourguignon, Ed. E. Giesen - Crouse, Academic Press.

El PBR es una proteína de 18 KD situada sobre la membrana externa de las mitocondrias de los tejidos periféricos. Está constituido por cinco dominios transmembranarios y de una parte carboxiterminal dirigida hacia el citosol. Se atribuyen varias funciones al PBR según la naturaleza del tejido considerado: regulación de la esteroidogénesis, biosíntesis de hemo, diferenciación y crecimiento celular, control de la respiración mitocondrial (Krueger KE, Biochimica and Biophysica Acta 1995, 1241, 453-470). Aunque su función exacta no ha sido todavía completamente elucidada, varios datos experimentales recientes sugieren que PBR podría jugar un papel fundamental en la regulación de los procesos de muerte celular programada y en la protección antiradicalaria.

Se ha demostrado que PBR está en efecto estrechamente asociado a nivel de la mitocondria con proteínas reguladoras de la apoptosis tales como Bcl2 que previene la ruptura del potencial de la membrana mitocondrial impidiendo así la apoptosis inducida principalmente por la producción de radicales oxigenados reactivos (Marchetti P. et al, J. Exp. Med. 1996, 184, 1155-1160); (Marchetti P. et al, J. Immunol. 1996, 157, 4830-4836).

En el marco de la presente invención, se ha observado el papel protector antiradicalario de PBR directamente sobre células de origen hematopoyético para las que se ha puesto en evidencia una correlación estrecha entre la densidad de PBR y la protección antiradicalaria. Además, en este mismo estudio, se ha demostrado que la transfección de PBR sobre células desprovistas de este receptor confiere una protección contra los daños causados por especies oxigenadas (Carayon P. et al, Blood 1996, 87, 3170-3178).

Varios datos de la bibliografía indican que PBR jugaría un papel importante en la regulación de los procesos apoptóticos y la protección de las células respecto de los daños causados por los radicales libres.

Estudios filogenéticos recientes refuerzan esta nueva noción de que PBR actúa como modulador de apoptósis implicado en funciones antioxidantes. Existen similitudes significativas en efecto entre PBR y la proteína CrtK de Rhodobacter sphaeroides, una bacteria fotosintética. Esta proteína bacteriana que funciona como un detector de oxígeno fotosensible, regula la expresión de los genes implicados en la fotosíntesis en respuesta a modificaciones medioambientales de la tensión en oxígeno y de la intensidad lumínica. La comparación entre PBR y CrtK revela una identidad de 35% y una conservación de secuencia entre estas dos proteínas que se han diferenciado en la filogenia hace dos millares de años. Esta homología sugiere una función altamente especializada y conservada de PBR que parece similar a la de CrtK en la bacteria. En efecto, se ha demostrado recientemente que el PBR de mamífero transfectado en los mutantes Rhodobacter CrtK complementa la función detector de oxígeno de CrTK. Así, este estudio sugiere un papel clave de PBR en la transducción de las señales que dependen del oxígeno (Yeliseev AA., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 5101-5106).

Sin embargo, a día de hoy, no se ha indicado nunca ninguna sustancia precisamente como ligando específico de los receptores PBR cutáneos.

Con mayor razón, ninguna sustancia activa por vía tópica, y que se une específicamente a los receptores PBR se ha descrito en la bibliografía.

Se ha demostrado ahora, en el marco de la presente invención, que PBR se expresa abundantemente a nivel de la piel sobre los diferentes compartimentos celulares que la componen: queratinocitos, células de Langerhans, folículos pilosos y células endoteliales de la vasculatura dérmica. A nivel de la piel, la expresión de PBR sigue un gradiente creciente de la capa basal hacia la capa córnea. Esta organización remarcable que privilegia las células diferenciadas de la epidermis más expuestas a los estrés externos reviste sin duda una significación fisiológica de primera importancia para la protección de las zonas de la epidermis más vulnerables. Los estudios subcelulares realizados en microscopía confocal indican como esperado una colocalización de PBR con Bcl2 a nivel de la mitocondria. Los estudios histológicos sobre capa de piel han puesto en evidencia una repartición sorprendente de PBR (Figuras 1 y 2).

En efecto, la expresión de este receptor a nivel de la epidermis sigue un gradiente de densidad creciente de las capas basales hacia las capas más diferenciadas de queratinocitos. Esta distribución espacial muy organizada que privilegia en término de densidad las células de la epidermis más externas y por lo tanto más expuestas, deja suponer que PBR a nivel de la piel podría representar un sistema de protección natural contra los radicales libres generados por la exposición a los rayos ultravioletas. La observación concomitante que la distribución de la proteína antiapoptótica Bcl2 obedece a un gradiente estrictamente inverso sugiere un papel compensatorio de PBR para la preservación de las células más diferenciadas.

El conjunto de estos datos que sugieren una función protectora del PBR, más particularmente a nivel de la epidermis, ha conducido a poner en evidencia ligandos naturales o de síntesis que muestran que su interacción con PBR podría ser beneficiosa en diferentes situaciones de estrés cutáneo provocado por agentes químicos o radicalarios o también consecutivos a una exposición UV.

Así, según uno de estos aspectos, la presente invención se refiere a la utilización de un ligando específico del PBR, Ro 5-4864 en los estrés cutáneos. Este ligando es un agonista de PBR.

Según otro aspecto de la invención y en base a estas observaciones, se ha llevado a cabo una criba que intenta buscar ligandos naturales de PBR y ha permitido aislar varias fracciones capaces de interaccionar con este receptor. El efecto potencialmente protector de estos ligandos naturales se ha evaluado posteriormente en diferentes ensayos que inducen un estrés cutáneo y principalmente ensayos de eritemas cutáneos inducidos por irradiaciones UV. Se han buscado igualmente las propiedades antiradicalarias así como las capacidades de reparación cutánea.

Se han utilizado ensayos bioquímicos y farmacológicos para poner en evidencia la actividad y el interés de las sustancias en diversos estrés cutáneos.

Los ensayos realizados con PBR tienen por objetivo mostrar su implicación potencial en la regulación de procesos apoptóticos y la preservación de las células cutáneas respecto de diferentes estrés deletéreos.

Ejemplo 1 Estudios inmuno-histológicos de localización de PBR a nivel cutáneo

Con ayuda del anticuerpo específico anti-PBR, Ac 8D7 (mAb de ratones anti-PBR, isotipo IgG1, Dussossoy et al., Cytometry, 1996, 24:39-48), un análisis por Western Blot ha permitido poner en evidencia la presencia abundante de PBR sobre seis líneas diferentes de queratinocitos humanos así como sobre la piel humana normal (Figura 1).A nivel subcelular, los análisis realizados en microscopía confocal confirman sobre los queratinocitos una colocalización de PBR a nivel mitocondrial (Figura 2).

Un estudio inmuno-histológico realizado sobre una capa de epidermis humana normal con ayuda del mismo anticuerpo revela un ordenamiento muy particular ya que la expresión de PBR aumenta de la capa basal hacia la capa córnea. Por lo tanto este receptor está presente abundantemente sobre los queratinocitos más diferenciados, situados directamente bajo la capa córnea (Figura 3).

Ejemplo 2 Estudios de unión y de especificidad

Los estudios de unión o binding en el idioma inglés, se realizaron sobre la línea de queratinocitos A-431 (carcinoma epidermoide humano (ATCC, CRL-1555)) por desplazamiento del ligando de referencia [^{3}H]-PK11195. El análisis de Scatchard indica un solo sitio de fijación, una densidad de aproximadamente 470 000 receptores por célula y una fuerte afinidad del ligando (KD = 1,5 nM) (Figura 4). La especificidad de la unión sobre el receptor periférico portado por los queratinocitos se testifica por los estudios farmacológicos que muestran una eficacia decreciente del desplazamiento del ligando periférico de referencia (PK 11195) por los ligandos siguientes:

Ro 5-4864 = (CI50 \approx 25 nM) > diazepam (CI50 \approx 100 nM) \ggg clonazepam (inactivo a 3200 nM). Se recuerda que este último es un ligando del receptor central de las benzodiazepinas, el diazepam es mixto, el Ro 5-4864 es específico del PBR (Figura 5).

Ejemplo 3 Implicación del PBR en la protección contra los radicales oxigenados

Se han descrito dos tipos de experiencias en la Figura 6. La primera consistió en comparar diferentes líneas de origen linfoide o mieloide por su capacidad a resistir a la toxicidad de los radicales oxigenados en relación con su nivel de expresión de PBR. Los resultados indican una correlación muy fuerte entre el número de sitios PBR por célula y la resistencia a la toxicidad inducida por H_{2}O_{2}. Existe igualmente una correlación similar cuando se considera esta vez el nivel de expresión de Bcl2, proteína conocida por proteger las células de los daños oxidativos. Este dato, junto con el hecho de que Bcl2 y PBR son dos proteínas localizadas sobre la membrana externa de las mitocondrias, sugiere que podrían presentar funciones comunes en la protección celular. De manera interesante, mientras que la expresión de PBR sigue un gradiente de densidad creciente de la capa basal hacia el límite de la capa córnea, los datos de la bibliografía indican un fenómeno inverso para la expresión de Bcl2, que sugiere que a lo largo de la diferenciación de los queratinocitos, PBR podría tomar el "relevo" de Bcl2 en lo que se refiere a las funciones de protección antiradicalaria.

En la segunda experiencia, el papel posible de PBR en la protección respecto de la toxicidad de los radicales libres está reforzado por la demostración de la mejor viabilidad, en presencia de H_{2}O_{2}, de células Jurkat transfectadas PBR+ en comparación con células homólogas PBR-.

Ejemplo 4

La actividad anti-apoptótica de los activos se midió sobre queratinocitos humanos y fibroblastos (ATCC) que se sembraron en placas Petri de 35 mm (5 X 10^{5} células/pocillos) en DMEM (Dubelco's Mode Eagle Medium) añadiendo 10% de suero de ternero fetal y se dejaron proliferar hasta confluencia. Este medio de cultivo se aspiró luego, las células se enjuagaron y se añadió 0,1% de suero de ternero fetal en presencia de una solución salina. Se añadieron concentraciones crecientes de la sustancia a estudiar. Veinticuatro horas después, se midió la apoptosis con un equipo de dosificación ELISA (del inglés "enzyme-linked immunosorbent assay").

Se sometieron queratinocitos a radiaciones ultravioletas de tipo B (UVB) a la dosis de 250 J/m^{2} durante 16 horas (J. Invest. Dermatol. 1995, 104: 922-927). En presencia del ligando PBR Ro 5-4864, se ha demostrado que se previenen los procesos de alteraciones celulares inducidos por la irradiación en una gama de concentraciones de ligando comprendida entre 10 nM y 10 \muM.

Ejemplo 5

El efecto fotoprotector del ligando se evaluó por aplicación por vía cutánea sobre el cobaya albino.

La vía tópica cutánea se utilizó con el fin de reproducir las condiciones de utilización en el hombre.

Se utilizaron cobayas Hartley, Charles River France, Saint Aubin lès Elbeuf, 76410 Cléon, Francia.

Los animales se rasuraron, luego se depilaron sobre los flancos anteriores derecho e izquierdo, 24 horas antes del comienzo del tratamiento.

Los animales se irradiaron justo antes del primer tratamiento. La energía se verificó antes de cada irradiación realizada sobre los flancos derecho e izquierdo en el espectro UVB a una dosis de 4000 mJ/cm^{2}.

El flanco derecho de los animales se trató con 0,2 ml de solución del ligando inmediatamente después de irradiación luego 2 y 5 horas después de irradiación. El flanco izquierdo no será tratado.

Una lámpara de vapor de Xeron Alta presión (IDEM 300) producirá la irradiación.

Las lecturas de las reacciones locales se hicieron antes de tratamiento, luego 5 y 24 horas después de irradiación.

Eritema y edema se evaluaron como sigue:

Eritema

0 no eritema; 1 eritema muy débil, apenas perceptible; 2 eritema neto, rosa pálido; 3 eritema neto, rojo franco; 4 eritema particularmente intenso

\newpage

Edema

0 no edema; 1 edema muy ligero (apenas visible); 2 edema ligero (contorno bien definido e hinchamiento aparente); 3 edema medio (espesor aproximadamente 1 mm); 4 edema grave (espesor superior a 1 mm y superficie superior a la zona de aplicación).

A continuación se describen ejemplos de ligandos naturales del receptor PBR producidos por fermentación con su actividad.

Una criba o screening en el idioma inglés, efectuado sobre extractos de microorganismos conducido sobre medio sólido o líquido permitió seleccionar tres cepas de microorganismos (bacterias y hongos microscópicos).

Las dos cepas seleccionadas después de diferentes estudios llevados para optimizar las condiciones de producción de cantidades significativas de extractos de cultivos que poseen buenas actividades sobre el ensayo de medida de interacción con el receptor PBR tienen por referencia SRL 4988 y SRL 5186.

Las tres cepas anteriores se depositaron en el CNCM del Instituto Pasteur: fecha de 27 agosto 1999 con los números de orden I-2305, I-2306 respectivamente.

La cepa SRL 4988 clasificada como Nocardia species, aislada de una muestra de suelo tiene por caracteres ecológico-fisiológicos, determinados después de cultivo de dos semanas a 28ºC sobre medio ISP2: fototrofo negativo, quimio-organotrofo, mesófilo y halófilo negativo. Es no móvil y presenta espiras abiertas, no verticiladas.

La cepa SRL 5186 clasificada como Streptomyces, aislada de una muestra de suelo tiene por caracteres ecológico-fisiológicos, determinados después de cultivo de dos semanas a 28ºC sobre medio ISP2: fototrofo negativo, quimio-organotrofo, mesófilo y halófilo negativo. Es no móvil y presenta hifas flexibles y biverticiladas.

Después de cultivos sobre medio nutritivo geloso y varios inóculos sucesivos que permitieron obtener un cultivo abundante y puro, se fabricó un lote 0 de conservación de la cepa madre luego lotes de sembrado primario y secundario.

Para ello, se preparó una suspensión de esporas a partir de un cultivo sobre medio nutritivo geloso en placa Petri y de un medio de recogida; este medio contenía un crioprotector que permite asegurar una buena viabilidad de las esporas durante la conservación por congelación.

La suspensión de esporas obtenida se repartió en criotubos que se conservaron a -80ºC: estos tubos constituyen el lote 0.

Siguiendo el mismo protocolo, pero a partir de un tubo del lote 0, se preparó un lote de sembrado primario. Luego, siempre siguiendo el mismo protocolo, se preparó un lote de sembrado secundario a partir de un criotubo de sembrado primario. La fabricación de los lotes de sembrado 0, 1 y 2 asegura una accesibilidad durable de la cepa y por lo tanto de la actividad buscada. Los cultivos de estas tres cepas que permiten obtener ligandos naturales del receptor PBR pueden llevarse a cabo de manera próxima con los medios de cultivos aerobios habituales, es decir medios líquidos en fermentadores de cualquier capacidad con control en línea del pH y de la aeración.

Ejemplo A SRL 4988

A título de ejemplo de cultivo en matraces Erlenmeyer para la cepa SRL 4988: se utilizó un tubo de sembrado secundario para sembrar placas Petri preparadas con un medio que favorecía la esporulación de actinomicetos según la composición:

Glucosa	20 g
Soyoptim (SIO)	10 g
CaCO_{3} (OMYA)	3 g
Agar tipo E	20 g
Agua destilada CPS	1 l

Se incubaron los cultivos en placas durante 5 días a 28ºC. Entonces se obtuvo una suspensión de esporas al añadir en cada placa Petri, 10 ml de un medio líquido de composición:

\newpage

Glucosa	30 g
Soyoptim (SIO)	10 g
Triptona U.S.P. (BIOKAR)	4 g
Extracto de levaduras (DIFCO)	8 g
NaCl	2,5 g
CaCO_{3}	5 g
Hidrolizado de caseína	5 g
Peptona papaínica de soja	5 g

cuyo pH se ajustó a 7,0 antes de esterilización.

Se utilizaron 5 ml de las suspensiones de esporas para inocular matraces estériles de 250 ml, rellenos con 50 ml del mismo medio, que constituían los precultivos, se incubaron en una cámara caliente a 28ºC sobre un agitador de baldas, o en un incubador autónomo, regulándose las velocidades de rotación sobre uno u otro de los sistemas a 210 rev/mn.

Después de dos días de agitación los matraces de precultivo se utilizaron para sembrar los matraces de cultivo propiamente dicho a razón de 5 ml de medio de precultivo por Erlenmeyer de 500 ml relleno de medio de cultivo (100 ml) de composición:

Glicerol	10 g
Almidón soluble	30 g
Soyoptim	15 g
Triptona	2 g
Extracto de levadura	5 g
CaCO_{3}	5 g
Solución de oligoelementos	10 ml
Agua CPS	1 l
pH 7

Composición de la solución de oligoelementos utilizada:

FeSO_{4}, 7H_{2}O:	1,0 g
MnSO_{4}, 4 H_{2}O	1,0 g
CaCl_{2}, 2H_{2}O:	0,025 g
CaCl_{2}, 2H_{2}O:	0,10 g
H_{3}BO_{3}	0,56 g
(NH_{4})_{6} Mo_{7}O_{24}, 4 H_{2}O	0,002 g
ZnSO_{4}, 7H_{2}O:	0,20 g
Agua CSP	1 l

Así en este caso preciso, se utilizaron 5 matraces de precultivos para inocular 40 matraces de cultivos de 100 ml de medio de cultivo por Erlenmeyer de 500 ml, que después de 6 días de cultivo agitado a 28ºC en cámara caliente sobre un agitador rotativo regulado a 210 rev/mn, proporcionaron 4 litros de suspensión de bacterias.

Se centrifugaron los 4 litros de mosto de fermentación en varias operaciones, a una temperatura de 4ºC, y a un régimen de 13500 rev/mn (es decir 27 500 g con el rotor utilizado), con el fin de separar la biomasa, es decir el fondo que reunía las células del líquido sobrenadante de cultivo constituido mayoritariamente por agua que provenía del medio nutritivo utilizado y que contenía en solución restos de componentes del medio nutritivo así como metabolitos producidos y excretados por las células de las bacterias durante las diversas fases de su crecimiento.

Las biomasas y líquidos sobrenadantes se congelaron entonces a -20ºC.

Extracciones de ligandos naturales del receptor PBR

Los 4 litros de líquido sobrenadante descongelado se cargaron en un vaso de precipitados de 10 litros. Se añadió la solución de 400 g de resina poliestireno-divinilbenceno Amberlite XAD 16 (Rohm & Haas). La suspensión se agitó con un motor equipado de unas palas, girando a 20 rev/mn, durante 15 horas. La solución se filtró luego, el filtrado se eliminó y la resina secada por succión se recogió en 1 litro de metanol. Se mantuvo con agitación suave durante una hora. Se filtró de nuevo la resina que se volvió a tratar de forma idéntica con 1 litro de metanol. Durante una tercera operación la resina se volvió a tratar esta vez con 1 litro de acetona. La resina secada por succión se eliminó luego y los 3 litros de disolvente orgánico reunidos se evaporaron hasta sequedad en un rotavapor a vacío.

El residuo de evaporación (17,7 g) se trituró con 50 ml de metanol, la suspensión obtenida se centrifugó a 3000 rev/mn durante 15 minutos, y el líquido sobrenadante decantado obtenido constituyó el extracto del líquido sobrenadante de cultivo.

Este extracto se ensayó en dilución en inhibición de la unión sobre el receptor PBR y proporcionó una actividad evaluada a 1/200 (50% de inhibición).

Las biomasas reunidas (199 g) en un vaso de precipitados de 2 litros se trataron bajo agitación con una mezcla de 750 ml de cloruro de metileno y de 750 ml de metanol. La agitación se mantuvo durante 15 horas a temperatura ambiente. La suspensión se filtró luego y la solución límpida obtenida se concentró a vacío en un rotavapor. El residuo de evaporación (5,4 g) se trituró luego con 50 ml de metanol y constituyó el extracto de biomasa.

Este extracto se ensayó en inhibición de la unión del receptor PBR y proporcionó una actividad medida a 1/2200 (DI_{50} = 2200^{-1}).

Ejemplo A SRL 5186

Con los mismos protocolos y medios respectivos:

- medio gelosado para las siembras en placa Petri

- medio líquido de precultivo

- medio líquido de producción

14 matraces Erlenmeyer de 500 ml rellenos con 100 ml de medio de producción, e inoculados a 5%, se incubaron a 28ºC en cámara caliente sobre un agitador rotativo que giraba a 210 rev/mn, durante 6 días.

Después de centrifugación y almacenamiento uno a dos días en el congelador a -20ºC de las biomasas y líquidos sobrenadantes de producción, estos productos se descongelaron antes de proceder a su extracción.

Las biomasas (54,9 g) se trataron en un vaso de precipitados, bajo agitación con una mezcla de 250 ml de diclorometano y 250 ml de metanol, durante una decena de horas. La suspensión se filtró luego y la solución límpida obtenida se concentró hasta sequedad en un rotavapor.

El residuo seco (1,4 g) se trituró con 17,5 ml de metanol, et la suspensión obtenida se centrifugó a 3000 rev/mn durante 15 minutos. El líquido sobrenadante de centrifugación tomado, constituyó el extracto de biomasa.

Este extracto, evaluado en dilución sobre el ensayo de inhibición de la unión al receptor PBR proporcionó una inhibición de 50% en el ensayo a la dilución 1/3750 (DI_{50}= 3750^{-1}).

A los 1400 ml de líquido sobrenadante descongelado se añadieron 160 g de resina poliestireno-divinilbenceno XAD 16 (Rohm & Haas) y la suspensión se agitó durante 15 horas. La resina se filtró, el filtrado se eliminó y la resina se volvió a tratar con 200 ml de solución al 25% de metanol en agua durante 3 horas.

\newpage

La resina se filtró, y este segundo filtrado se eliminó. La resina sufrió entonces tres tratamientos semejantes, dos con 200 ml de metanol y el último con 200 ml de acetona. Estos tres últimos filtrados se reunieron en un matraz, luego se concentraron a vacío con ayuda de un rotavapor. El residuo seco obtenido (2,2 g) se trituró luego con 17,5 ml de metanol y la solución obtenida constituyó el extracto del líquido sobrenadante.

Este extracto evaluado en dilución sobre el ensayo de inhibición de la unión al receptor PBR dio una inhibición de 50% a la dilución 1/940 (DI_{50} = 940^{-1}).

En las composiciones según la invención, la sustancia que se unía a PBR se utilizó preferentemente en una cantidad que iba de 0,00001 a 20% en peso con respecto al peso total de la composición, y en particular en una cantidad que iba de 0,001 a 10% en peso con respecto al peso total de la composición.

Las composiciones según la invención pueden presentarse en todas las formas galénicas normalmente utilizadas para una aplicación tópica.

Las cantidades de los diferentes constituyentes de las composiciones según la invención son aquellas utilizadas clásicamente en los dominios considerados y son apropiados a su forma galénica.

Para una aplicación tópica, las composiciones de la invención comprenden un medio compatible con la piel. Estas composiciones pueden presentarse principalmente en forma de soluciones acuosas, alcohólicas o hidroalacohólicas, de geles, de emulsiones de tipo agua-en-aceite o aceite-en-agua teniendo el aspecto de una crema o de un gel, de microemulsiones, de aerosoles, o también en forma de dispersiones vesiculares que contienen lípidos iónicos y/o no iónicos. Estas formas galénicas se preparan según los métodos usuales de los dominios considerados.

Estas composiciones para aplicación tópica pueden constituir principalmente una composición de protección, de tratamiento o de cuidado cosmético o dermatológico para la cara, para el cuello, para las manos o para el cuerpo, (por ejemplo cremas de día, cremas de noche, cremas o aceites solares, leches corporales), una composición de maquillaje (por ejemplo fondo de maquillaje) o una composición de bronceado artificial.

Cuando la composición de la invención es una emulsión, la proporción de cuerpo graso que contiene puede ir de 5% a 80% en peso, et preferentemente de 5% a 50% en peso con respecto al peso total de la composición. Los cuerpos grasos y los emulsionantes utilizados en la composición en forma de emulsión se eligen entre aquellos utilizados clásicamente en el campo cosmético o dermatológico.

Como cuerpos grasos utilizables en la invención, se pueden citar los aceites minerales (vaselina), los aceites vegetales (fracción líquida de manteca de carité) y sus derivados hidrogenados, los aceites animales, los aceites de síntesis (perhidroescualeno), los aceites siliconados (dimetilpolisiloxano) y los aceites fluorados. Como otros cuerpos grasos, se puede citar también alcoholes grasos (alcohol cetílico, alcohol estearílico), ácidos grasos (ácido esteárico) y ceras.

Los emulsionantes pueden estar presentes, en la composición, en una proporción que va de 0,3% a 30% en peso y preferentemente de 0,5 a 30% en peso con respecto al peso total de la composición.

De manera conocida, las composiciones cosméticas o dermatológicas de la invención pueden contener igualmente adyuvantes habituales en los campos correspondientes, tales como gelificantes hidrófilos o lipófilos, conservantes, antioxidantes, disolventes, perfumes, cargas, filtros y materias colorantes. Además, estas composiciones pueden contener activos hidrófilos o lipófilos. Las cantidades de estos diferentes adyuvantes o activos son aquellas utilizadas clásicamente en el campo cosmético o dermatológico, y por ejemplo de 0,01% a 20% en peso total de la composición. Estos adyuvantes o estos activos, según su naturaleza, pueden introducirse en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en vesículas lipídicas.

Entre los activos que pueden contener las composiciones de la invención, se pueden citar principalmente los activos que tienen un efecto sobre el tratamiento de arrugas o pequeñas arrugas y en particular los activos queratolíticos. Por queratolítico, se entiende un activo que tiene propiedades descamantes, exfoliantes o gomantes, o un activo capaz de ablandar la capa córnea.

Entre estos activos que tienen un efecto sobre el tratamiento de arrugas y pequeñas arrugas que pueden contener las composiciones de la invención, se pueden citar en particular hidroxiácidos y retinoides.

Los hidroxiácidos pueden ser por ejemplo \alpha-hidroxiácidos o \beta-hidroxiácidos, que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, saturados o insaturados. Los átomos de hidrógeno de la cadena carbonada pueden, además, estar sustituidos por halógenos, radicales halogenados, alquilados, acilados, aciloxilados, alcoxi=carbonilados o alcoxilados que tienen de 2 a 18 átomos de carbono.

Los hidroxiácidos que pueden utilizarse son principlamente ácidos glicólico, láctico, málico, tártrico, cítrico, 2-hidroxialcanoico, mandélico, salicílico, así como sus derivados alquilados como ácido n-octanoil-5-salicílico, ácido n-dodecanoil-5-salicílico, ácido n-decanoil-5-salicílico, ácido n-octil-5-salicílico, ácido n-heptiloxi-5 o -4-salicílico, ácido 2-hidroxi-3-metilbenzoico, o también sus derivados alcoxilados como ácido 2-hidroxi-3-metoxibenzoico.

Los retinoides pueden ser principalmente ácido retinoico y sus derivados, retinol (vitamina A) y sus ésteres tales como palmitato de retinol, acetato de retinol y propionato de retinol, así como sus sales.

Estos activos pueden utilizarse en particular en concentraciones que van de 0,0001% a 5% en peso con respecto al peso total de la composición.

Claims

1. Utilización de al menos una sustancia que se une al receptor periférico de las benzodiazepinas o PBR, para la fabricación de una composición farmacológica o dermatológica tópica en el tratamiento del estrés cutáneo.

2. Utilización de al menos una sustancia que se une al PBR para la fabricación de una composición farmacológica y/o dermatológica tópica con el fin de disminuir las arrugas, de reducir el eritema solar o proteger contra los radicales libres.

3. Utilización según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la sustancia que se une al PBR es un agonista del PBR elegido entre las moléculas de síntesis, las sustancias naturales de extracción o una sustancia obtenida por fermentación.

4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la sustancia que se une al PBR es Ro 5-4864.

5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la sustancia que se une al PBR es una sustancia obtenida por fermentación.

6. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la sustancia está presente en la composición farmacológica o dermatológica en una cantidad que va de 0,00001 a 20% en peso con respecto al peso total de la composición.

7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la sustancia agonista está presente en la composición farmacológica o dermatológica en una cantidad que va de 0,001 a 10% en peso con respecto al peso total de la composición.

8. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la composición contiene además un hidroxiácido y/o un retinoide.

9. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada porque el hidroxiácido se elige entre \alpha-hidroxiácidos o \beta-hidroxiácidos, que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, saturados o insaturados.

10. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada porque el retinoide se elige entre el grupo que comprende ácido retinoico y sus derivados, retinol y sus ésteres.

11. Composición farmacológica y/o dermatológica tópica, caracterizada porque contiene como sustancia activa una sustancia obtenida por fermentación de la cepa Nocardia especie I-2305 o Streptomyces especie I-2306.