ES2242995T3 - Moduladores de la actividad del receptor de la insulina. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE TIENEN AL MENOS UNA CARACTERISTICA SELECCIONADA DE UN GRUPO CONSISTENTE EN UNA COMPOSICION QUE (A) MODULA LA ACTIVIDAD DE LA QUINASA DEL RECEPTOR DE INSULINA; Y/O (B) POTENCIA LA ACTIVACION DE INSULINA DEL RECEPTOR DE INSULINA; Y/O (C) DIFERENCIA LA ESTIMULACION DE LA CAPTACION DE GLUCOSA CELULAR POR LA INSULINA; (D) ESTIMULA LA ASIMILACION DE GLUCOSA EN LAS CELULAS INDICANDO EL RECEPTOR DE INSULINA; (E) REDUCE LA GLUCOSA EN SANGRE DE INDIVIDUOS DIABETICOS; (F) ESTIMULA LA FOSFORILACION DE IRS - 1; (G) ESTIMULA LA ACTIVIDAD DE QUINASA PL 3 ; Y/O (H) ESTIMULA LA TRANSLOCACION DE GLUT - 4; TODOS LOS CUALES SON DESCRITOS ASI. SUSTANCIAS QUE TIENEN ESTAS CARACTERISTICAS ALTERAN LA CONFORMACION DEL AMBITO DE QUINASA CITOPLASMICA DE LOS LOBULOS O UNEN PREFERENCIALMENTE LOS PUNTOS QUE HAN SIDO IDENTIFICADOS COMO LUGARES DE UNION MODULADORES EN LA CADENA BE RECEPTORA DE INSULINA. ASI MISMO, LA MODULACION DE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR DE INSULINA, EL INCREMENTO DE LA ASIMILACION DE GLUCOSA POR LAS CELULAS, Y OTROS EFECTOS IMPORTANTES EN EL CONTROL Y GESTION DE LA DIABETES SON REALIZADOS UTILIZANDO COMPUESTOS DE LA FORMULA (1) EN DONDE CADA AR ES INDEPENDIENTEMENTE UNA MITAD AROMATICA; CADA A ES INDEPENDIENTEMENTE UN SUSTITUTO ACEPTADOR DE PROTONES; CADA R ES INDEPENDIENTEMENTE UN SUSTITUTO NO INTERFERENTE; M ES 0, 1 O 2; N ES 1 - 6; Y CADA ENLAZADOR ES INDEPENDIENTEMENTE CH 2 -, -N = N-, -CH = CH-, -NHCO-, O -NHCONH O UN ISOSTERO DE LOS MISMOS, EN DONDE CUANDO N ES IGUAL A 1, AL MENOS UN AR DEBE COMPRENDER AL MENOS DOS ANILLOS AROMATICOS FUNDIDOS. LOS COMPUESTOS DEL GENERO DE LA FORMULA (1) PUEDEN UTILIZARSE TAMBIEN PARA ESTUDIOS DE LA ACTIVIDAD ESTRUCTURAL PARA IDENTIFICAR LAS CARACTERISTICAS RESPONSABLES DE LAS ACTIVIDADES CORRESPONDIENTES.

Description

Moduladores de la actividad del receptor de la insulina.

Campo técnico

La invención se refiere a la modulación de la captación de la glucosa y de la actividad del receptor de la insulina, en general. De manera más precisa, la invención se refiere a un método in vitro para modular la actividad cinasa del receptor de la insulina y/o para potenciar la activación por la insulina del receptor de la insulina y/o para potenciar la estimulación mediante la insulina de la captación de glucosa celular o para estimular la captación de glucosa en células que presentan el receptor de la insulina. Además, la invención se refiere a un compuesto específico y a una composición que comprende el mismo.

Técnica anterior

Entre las muchas funciones realizadas por los péptidos y las proteínas en el metabolismo, está la capacidad para estimular receptores en las superficies celulares para efectuar consecuencias intracelulares importantes en el mantenimiento y el desarrollo del organismo. Las hormonas peptídicas y proteicas interaccionan con receptores específicos para ellas, de manera que la actividad de la hormona se sienta sobre las células designadas que muestran esos receptores. El receptor de la insulina está presente en prácticamente todas las células y en elevadas concentraciones en las células del hígado, los músculos esqueléticos y el tejido adiposo. La estimulación del receptor de la insulina con insulina es un elemento esencial en el metabolismo y almacenamiento de carbohidratos.

Los diabéticos, o bien carecen de suficiente secreción endógena de la hormona insulina (Tipo I) o tienen una ruta de señalización mediada por el receptor de la insulina que en cierto grado es resistente a la insulina endógena o exógena, o bien a través de cambios estructurales primarios o tras la traducción, un acoplamiento defectuoso entre los componentes de la señalización (Tipo II)o un número reducido de ellos. Todos los diabéticos de Tipo I, y también muchos sujetos de Tipo II, deben utilizar la inyección para obtener un aumento de la actividad de los receptores de insulina existentes, puesto que la insulina endógena sólo puede sustituirse en la actualidad con un suministro alternativo de la propia insulina, aislada anteriormente de orígenes naturales, y en la actualidad producida por recombinación. Aunque la producción recombinante de insulina permite proporcionar una forma menos inmunogénica y garantiza un suministro fiable de las cantidades necesarias, permanece la necesidad de administrar la hormona mediante inyección, debido a la inestabilidad de los péptidos y las proteínas en el tubo digestivo. Durante mucho tiempo, el objetivo ha sido sustituir los ligandos peptídicos, incluyendo la insulina, por pequeñas moléculas que no se digieran y que puedan absorberse directamente en el torrente circulatorio. Sin embargo, hasta la fecha, las sustancias no peptídicas que pueden ejercer el efecto de la insulina sobre su receptor han sido esquivas a su
descubrimiento.

Ha habido muchos ejemplos en los que se han usado materiales no peptídicos para inhibir enzimas cuyos sustratos naturales son péptidos. Por ejemplo, Brinkworth, R.I. et al. Biochem Biophys Res Comm (1992) 188:624-630, describen la inhibición de la proteinasa del VIH-1 mediante diversos aril disulfonatos. Kirchberger, J. et al. J Chromatog A (1994) 668:153-164, estudió la capacidad de los colorantes de triazina para unirse a la NADH oxidasa de Thermus thermophilus.

También se ha demostrado que ciertos componentes no peptídicos intensifican las propiedades agonistas de una hormona peptídica. Kletzien, R.F. et al. Mol Pharmacol (1992) 41:343-398, han descrito la capacidad de ciertas tiazolidindionas, tales como pioglitazona, para intensificar la diferenciación de los adipocitos mediante la estimulación del efecto de la insulina. Estos representan una clase de compuestos antidiabéticos potenciales que actúan en un sitio desconocido aguas abajo del propio receptor de la insulina e intensifican la respuesta de los tejidos diana a la insulina. Kobayashi, M. Diabetes (1992) 41:476-483. Ahora se sabe que la mayoría de las tiazolidindionas se unen a PPAR\gamma (receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas), desencadenando así ciertos acontecimientos nucleares que pueden dar como resultado un aumento de la sensibilidad de las células diana a la insulina. Sin embargo, todavía no se ha resuelto el mecanismo completo.

Se conoce información considerable acerca del receptor de la insulina en sí mismo. La estructura del receptor de la insulina y ciertos aspectos de su modo de acción tal como se entienden actualmente, se ilustran en la figura 1. El receptor consiste en cuatro subunidades separadas que consisten en dos cadenas \alpha idénticas y dos cadenas \beta idénticas. Las dos cadenas \beta contienen un dominio transmembrana; las partes \alpha están en el dominio extracelular y acomodan la unión de la insulina. La ilustración en la figura 1 muestra el sitio en el que la insulina se une al receptor. Las subunidades \beta contienen una actividad tirosina cinasa, mostrada como los insertos blancos en las subunidades y la cinasa de una subunidad \beta realiza la fosforilación de la subunidad \beta complementaria tal como se muestra; el receptor ilustrado en la figura 1 está en su forma activada cuando se fosforilan los restos de tirosina (Y). Las subunidades \beta también contienen sitios de unión al ATP. La fosforilación estimulada por la insulina del propio receptor se requiere para la actividad posterior y, por tanto, la demostración de la capacidad de un compuesto para llevar a cabo la fosforilación de las subunidades \beta proporciona un medio para ensayar la activación del receptor.

Kohanski, R.A., Biochemistry (1993) 32:5773-5780, ha descrito la distribución de los restos de tirosina fosforilados en los dominios de la cadena \beta citoplasmática del receptor de la insulina (IR). La figura 3 de ese artículo está reimpresa como figura 2 en la presente solicitud y muestra los diversos dominios que contienen tirosina fosforilada cuando el receptor se activa mediante la insulina. Estos incluyen el dominio yuxtamembrana (JM); el dominio central (catalítico) (CD); y el dominio C-terminal (CT). La localización de estas regiones también se indica en la figura 1 en el presente documento. Por tanto, las tirosinas fosforiladas están en las posiciones 965, 972, 1158, 1162, 1163, 1328 y 1334 de la cadena \beta en humanos. El dominio central parece ser responsable de la autofosforilación de los restos de tirosina en la cadena complementaria.

Además, Hubbard, S.R. et al. Nature (1994) 372:746-754, describen la estructura cristalina del dominio de tirosina cinasa (activación) del receptor. Los autores concluyen además que la tirosina en la posición 1162 está presente en el sitio activo de la enzima y realiza la inhibición de la actividad cinasa. Tras la fosforilación, la tirosina 1162 deja de ocupar el sitio activo.

Kole, H.K., et al. J Biol. Chem (1996) 271:31619-31626, citan un trabajo anterior que indica que la regulación de la cinasa mediante secuencias dentro del extremo carboxilo terminal de la cadena \beta del receptor de la insulina puede estar implicada en definir la especificidad de los acontecimientos de señalización corriente abajo. Anticuerpos dirigidos contra epítopos en la región 1294-1317 (numeración utilizada igual que Ulrich, A. et al. Nature (1985) 318:756-761) inhiben la actividad cinasa in vitro con respecto al sustrato exógeno. El trabajo notificado en el artículo de Kole muestra que un péptido que representa las posiciones de aminoácidos 1293-1307 podría potenciar la capacidad de la insulina para activar el receptor in vitro usando receptores de insulina parcialmente purificados de células CHO/HIRc (células CHO (ovario de hámster chino) que expresan de manera estable el receptor humano de la insulina) con un máximo cuando la concentración del péptido oscila entre 50-100 \muM. Esta capacidad para potenciar la activación por la insulina del receptor también podría demostrarse in vivo utilizando células CHO/HIRc semipermeabilizadas. Haciendo que el péptido sea más lipófilo mediante su derivatización con un resto de estearilo, podría mostrarse el mismo efecto en células intactas. Se demostró que la unión del péptido era a través de la cadena \beta utilizando células CHO/EI (células CHO que expresan un gran número de receptores de la insulina y de receptores del EGF) semipermeabilizadas, péptido biotinilado 50 \muM y exposición a BSO-COES (bis[2-succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona) 0,2 mM, un reactivo de reticulación bifuncional, seguido por inmunoprecipitación con anti-\alpha-IR y detección usando enzima conjugada con estreptavidina. La asociación del péptido biotinilado con una proteína de 95 kD indicó la unión a la subunidad \beta. El experimento se repitió utilizando un receptor de insulina mutante que carecía de 43 aminoácidos del extremo carboxilo terminal; se observó la unión del péptido a un nivel superior que en las células CHO/EI. Por tanto, los autores concluyen que el péptido (1293-1307) se une específicamente a la subunidad \beta en una región distinta de los 43 aminoácidos del extremo carboxilo
terminal.

A pesar del conocimiento de la estructura de este receptor, incluyendo el citado artículo de Kole, todavía no ha sido posible utilizar moléculas simples para proporcionar el efecto de una hormona peptídica mediante la estimulación de la actividad del receptor, independientemente del sitio de unión de la hormona peptídica. Sin embargo, varios compuestos descritos en el presente documento pueden unirse al receptor de la insulina en un sitio distinto al normalmente activado por la insulina. Varios compuestos de aril di- o polisulfonato que comparten ciertas características estructurales comunes pueden realizar estimulación del receptor de la insulina para activar la actividad de autofosforilación requerida para la transducción de la señal. La disponibilidad de estos compuestos permite la construcción de ensayos y procedimientos comparativos para evaluar los compuestos candidatos adicionales, así como el diseño y la síntesis de medicamentos para el tratamiento primario de la resistencia a la insulina y la diabetes con las características estructurales apropiadas. Ahora se ha encontrado que varios sitios en la cadena \beta están incluidos en la región de unión para tales compuestos y que estos compuestos alteran la conformación del dominio central citoplasmático de cinasa de la cadena \beta (CKD) que se extiende hacia el citoplasma. Esta idea abre la puerta a métodos para identificar compuestos que tienen características útiles en la regulación del metabolismo en general.

Descripción de la invención

Se ha demostrado que las sustancias que modulan la actividad del IR alteran la conformación de la forma bilobulada del CKD. Esto proporciona la base para los ensayos de detección para los compuestos que modulan el receptor. Los solicitantes no desean constreñirse a ninguna teoría específica, pero parece que los compuestos que se unen a la región "cinturón" del CKD bilobulado, tal como se describe adicionalmente más adelante, alteran esencialmente el contacto interfacial entre los dos lóbulos de la cadena \beta del receptor. Alternativamente, el cambio conformacional puede ser un efecto secundario de la fosforilación facilitada por la unión de un compuesto activador. Cualquiera que sea la secuencia dinámica, dado que hay formas convenientes de medir los cambios en la conformación, este cambio en la estructura tridimensional, que está íntimamente asociado con la activación, es adecuado para evaluar la capacidad de una sustancia de prueba para modular la actividad del receptor. En cierta forma, tales ensayos, pueden adaptarse para conseguir una detección de alto rendimiento.

Además, o como alternativa, la invención se refiere a ensayos que se basan en la identificación de los sitios de unión en las cadenas \beta para pequeñas moléculas que modulan el receptor, o bien directamente o junto con estimulación de insulina o ambos. Una pequeña molécula, TER16998, descrita más adelante, puede activar el receptor de la insulina mediante la interacción con las cadenas \beta solas. Esta activación se inhibe mediante péptidos específicos que representan partes de la cadena \beta. Es de suponer que estos péptidos actúan como una "esponja" para interaccionar con TER16998, evitando así su interacción con las cadenas \beta del receptor per se. Mediante el mapeo de estos péptidos para los sitios que ocupan en las cadenas \beta del receptor se identifican las regiones de unión. Además, la activación del receptor mediante TER16998 proporciona un resultado en el que las tirosinas normalmente fosforiladas con la activación de la insulina en el dominio JM no llegan a fosforilarse y en el que la fosforilación de estos restos se evita, incluso en presencia de insulina, cuando TER16998 está presente. Los cinco restos restantes de tirosina que se fosforila en el receptor activado y que median la actividad del receptor se fosforilan en presencia de insulina, TER16998, y en presencia tanto de insulina como de TER16998. Este resultado puede demostrar que el dominio JM es una diana de activación eficaz. Las regiones que se identifican como sitios de unión pueden usarse eficazmente para identificar sustancias que modularán la actividad de este receptor.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos in vitro para modular la actividad cinasa del receptor de la insulina y/o para potenciar la activación por parte de la insulina del receptor de la insulina y/o para potenciar la estimulación mediante la insulina de la captación celular de la glucosa y/o para estimular la captación de la glucosa en las células que presentan el receptor de la insulina, método que comprende poner en contacto dicho receptor de la insulina o la parte de cinasa del mismo o dichas células con un compuesto que comprende la fórmula

Fórmula (1)

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

en la que

cada Ar es independientemente un resto aromático seleccionado de benceno, naftaleno, piridina, quinolina o benzotiazol;

cada A es independientemente -SO_{3}X, OP(OX)_{3}, -COOX, en las que X es un átomo de hidrógeno o un catión;

cada R es independientemente un resto hidrocarbilo, sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, cíclico, aromático o no aromático, en donde las cadenas de hidrocarbilo no ramificadas pueden estar interrumpidas por uno o más heteroátomos;

o cada R es independientemente OR', NR'_{2} o SR', en las que R' es H o R, tal como se definió anteriormente;

m es 0, 1 ó 2;

n es 1 - 6; y

cada "linker" (molécula de unión) es independientemente -CH_{2}-, -N=N-, -CH=CH-, -NHCO- o -NHCONH- o un isóstero de los mismos, en donde cuando n es 1, al menos un Ar debe comprender al menos 2 anillos aromáticos condensados.

En estos métodos, las células pueden estar contenidas en un sujeto y entrar en contacto con los compuestos de fórmula (1) mediante la administración de estos compuestos al sujeto.

En las realizaciones particulares, el compuesto de fórmula (1) tiene la fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

en la que cada R, A, linker y m son tal como se definieron anteriormente, o de la fórmula

\newpage

Fórmula (3)

3

en la que cada uno de R, A, el linker y m, son tal como se definieron anteriormente y en la que p es 0 ó 1.

En otros aspectos, la invención se refiere a métodos para diseñar y sintetizar moléculas que activen al receptor de la insulina, que se basan en las propiedades caracterizadoras pertinentes de los compuestos de fórmula (1).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un diagrama esquemático del receptor de la insulina y su activación por la insulina.

La figura 2 muestra las localizaciones de los restos de tirosina en la cadena \beta del IR que se fosforilan con la activación del IR por la insulina.

Las figuras 3A a 3D muestran el cambio conformacional en la región del CKD bilobulado del receptor de la insulina cuando se activa, en comparación con su estado inactivado. La figura 3A muestra un modelo de relleno de espacios del estado basal y el estado activado del CKD. El extremo N-terminal, el bucle de ATP, el bucle de activación y el sitio catalítico están marcados con su nombre. La figura 3B muestra una representación esquemática simplificada del CKD mostrado en la figura 3A. Cuando el receptor está activado, el bucle de activación se mueve radicalmente cuando las tirosinas llegan a fosforilarse; el sitio de unión al ATP se expande; la hélice gira hacia abajo cuando el lóbulo superior gira hacia fuera del plano del papel y el sitio catalítico que contiene aspartato, marcado con D en la figura 3B, se expone.

Las figuras 3C y 3D muestran vistas estereoscópicas del estado basal y el estado activado, respectivamente. Las tirosinas 1158, 1162 y 1163 se muestran como esferas blancas y el ácido aspártico 1132 mediante una esfera oscura.

La figura 4A muestra la estructura de TER16998; la figura 4B muestra la capacidad de TER16998 para estimular la autofosforilación del IR; la figura 4C muestra la capacidad de TER16998 para potenciar la captación de glucosa estimulada por la insulina en las células 3T3-L1.

La figura 5 muestra la capacidad de TER16998 para estimular la actividad ATPasa de la región CKD bilobulada del receptor de la insulina humano.

La figura 6 muestra un cromatograma de HPLC de un digesto tríptico de la cadena \beta fosforilada del IR. El trazo A muestra el digesto de longitud completa CKD; el trazo B representa el digesto de una versión truncada que pierde 10 kD del extremo C-terminal.

La figura 7 muestra la ruta sintética para fotoafinidad marcada como TER16998.

Las figuras 8A - 8E muestran las estructuras de varios compuestos pertinentes para la invención que activan el receptor de la insulina. La figura 8A muestra la estructura de TER3935. La figura 8B muestra las estructuras de TER17004 y 17005. La figura 8C muestra la estructura de TER17003. La figura 8D muestra la estructura de TER12, Cibacron Brilliant Red 3BA. La figura 8E muestra la estructura de TER3938, Direct Yellow 27.

La figura 9 muestra una ruta para la síntesis de TER12.

La figura 10 muestra el efecto del Componente A sobre la captación inducida por insulina de la glucosa por los adipocitos.

La figura 11 muestra la ruta sintética para TER16998.

La figura 12 muestra el efecto de TER16998, sola o en combinación con la insulina, en la autofosforilación del receptor IR.

La figura 13 muestra el efecto de TER16998 en la captación de la glucosa inducida por insulina en los adipocitos.

La figura 14 muestra el efecto de TER16998 en los niveles de glucemia en un modelo de ratón diabético.

La figura 15 muestra el método sintético para la preparación de análogos de TER3935 con ligamientos alternativos.

La figura 16 muestra la síntesis de TER17003.

La figura 17 muestra la síntesis de TER17004 y TER17005.

Las figuras 18A y 18B muestran la localización en el CKD del receptor de la insulina humano de péptidos que inhiben la activación de TER16998.

La figura 19 muestra los resultados de un experimento que demuestra que las células captan TER16998 y que concuerda con la capacidad de TER16998 para intensificar la estimulación de captación de glucosa por la insulina mediante su interacción directa con el CKD.

La figura 20 muestra el efecto sensibilizador de la insulina de TER16998 en ratones diabéticos.

Modos de llevar a cabo la invención

La invención se refiere a métodos para regular y tratar sujetos con diabetes en virtud de la administración de compuestos que se observa que modulan al IR en virtud de los ensayos de la invención. Estos compuestos actúan directamente sobre el dominio central de cinasa del receptor y no compiten con la insulina para unirse al sitio de unión de la insulina, ni realizan activación del receptor mediante un mecanismo similar al mostrado por la insulina. Los compuestos de la invención pueden activar directamente la cinasa del receptor para su autofosforilación, para potenciar así el efecto de la insulina sobre el receptor, para activar la función cinasa del receptor en la fosforilación de sustratos exógenos, para llevar a cabo el aumento de la captación de glucosa por los adipocitos y las células que llevan el receptor de la insulina en general, y para disminuir los niveles de glucemia en sujetos diabéticos.

La invención se refiere a la modulación (activación) del receptor de la insulina. Tal como se ha explicado anteriormente en el presente documento, se conocen los aspectos fisiológicos generales que resultan de la activación del receptor: el receptor activado tiene actividad cinasa, la activación de la insulina estimula la captación celular de la glucosa y, si la célula está en un sujeto mamífero, disminuye la glucemia. Los acontecimientos aguas abajo asociados con la activación también se conocen. Éstos incluyen los explicados anteriormente, más la fosforilación de IRS-1, que estimula la actividad cinasa en relación con el fosfoinositol (PI_{3} actividad cinasa) y que finalmente realiza la translocación del transportador de glucosa GLUT-4 hasta la superficie celular. Por tanto, tal como se describe más adelante, los compuestos identificados por el método de la invención y los compuestos específicos descritos más adelante, actúan directamente sobre el CKD del receptor de la insulina y producen estos acontecimientos aguas abajo.

Se ha determinado la estructura cristalina del receptor de la insulina y la conformación general del receptor se muestra en las figuras 3A-3D. Los detalles de la estructura cristalina de la forma basal se explican en Hubbard, S.R. et al. (1994, nombrado anteriormente, incorporado al presente documento mediante referencia) y para el receptor tirosina cinasa activado de la insulina en un complejo con sustrato peptídico y un análogo del ATP se explican en Hubbard, S.R. EMBO J (1997) 16:5572-5581. La estructura tridimiensional del receptor puede estudiarse usando el software Biosym para cambios modelo en la conformación en el estado activado.

Los cambios conformacionales que se producen cuando el se activa el receptor son evidentes a partir de estas figuras. Tal como se muestra, con la activación, el bucle de activación (AL en la figura 3B) mueve su posición radicalmente cuando se fosforilan las tirosinas, tal como se indica en el diagrama. Además, el sitio de unión al ATP se expande y los restos 1038-1051 de la hélice mostrados en la parte superior derecha giran hacia abajo cuando el lóbulo superior N-terminal gira en relación con el lóbulo inferior C-terminal. Finalmente, el aspartato en posición 1132 en el dominio catalítico queda expuesto.

Ensayos de detección para los moduladores del IR

La invención se aprovecha del cambio conformacional que se produce en la región CKD bilobulada del receptor de la insulina con la activación. Con el fin de hacer efectiva la utilización de esta propiedad, debe adaptarse un ensayo que permita la detección de este cambio sin requisitos que lleven demasiado tiempo, por ejemplo, detección directa mediante cristalografía de rayos X. Por el contrario, el cambio conformacional puede detectarse en un ensayo de alto rendimiento evaluando las medidas secundarias de este acontecimiento. Estos incluyen emplear el CKD bilobulado en forma marcada mediante fluorescencia; los lóbulos se marcan con fluoróforos donante y receptor y la distancia entre el donante y el receptor puede medirse mediante técnicas de determinación de transferencia de energía de fluorescencia estándar. Cualquiera de una multiplicidad de fluoróforos está disponible comercialmente para poner en práctica esta técnica, y la determinación de la distancia mediante transferencia de energía de fluorescencia es un procedimiento de laboratorio bien conocido.

También pueden emplearse otras medidas más indirectas del cambio conformacional. Debe observarse que el cambio conformacional, siempre asociado con la activación, puede no ser la respuesta inicial a un activador, sino que puede ser consecuencia de otros cambios de iniciación en el receptor. Por ejemplo, un compuesto activador puede formar un dímero dos CKD dando como resultado una densidad local más elevada del sitio catalítico y el bucle de activación, lo que conduciría entonces a la fosforilación inicial que, a su vez, conduciría al cambio conformacional. El cambio conformacional daría como resultado una actividad cinasa que se puede medir que puede someterse a ensayo sobre sustratos exógenos. Alternativamente, el compuesto activador puede introducirse en el CKD, de manera que el bucle de activación llegue a quedar expuesto al disolvente y, por tanto, que se someta a fosforilación, sin inducir el giro de los dos lóbulos el uno con respecto al otro hasta más tarde. En cualquier caso, está claro que durante la activación del receptor, se produce un cambio conformacional y esto puede medirse tal como se describió anteriormente o, más indirectamente, tal como se describe más adelante.

Por ejemplo, puede medirse la actividad ATPasa del CKD bilobulado. Esto se ha ilustrado utilizando TER16998 como un activador habitual del receptor que interacciona directamente con el CKD. Además, la capacidad de este activador para dar como resultado actividad ATPasa confirma la existencia del cambio conformacional, puesto que el IR basal sólo muestra actividad ATPasa baja. Por tanto, el sitio catalítico se ha expuesto como resultado de la activación.

TER16998 se ha confirmado como un activador del receptor, tal como se ilustra en la figura 4. La figura 4A muestra la estructura de TER16998. La figura 4B muestra la capacidad de TER16998 para activar el receptor solubilizado directamente in vitro tal como se muestra mediante el aumento de la fosforilación de los restos de tirosina. La figura 4C ilustra la capacidad de TER16998 para intensificar el efecto de la insulina sobre el receptor para estimular la captación de glucosa por las células. El aumento de las cantidades de TER16998 en presencia de insulina muestra una curva de respuesta a la dosis que concuerda con esta estimulación.

Se confirma entonces la capacidad del activador establecido, TER16998, para realizar el cambio conformacional que da como resultado la exposición del sitio catalítico de la ATPasa, tal como se muestra en la figura 5. El CKD del receptor de la insulina humano muestra sólo baja actividad ATPasa en ausencia de TER16998, aunque presenta esta actividad en su presencia. Los resultados en la figura 5 se obtuvieron usando un método de HPLC para evaluar el efecto de TER16998 sobre la actividad ATPasa. La mezcla de reacción contiene Tris 25 mM pH 7,4, MnCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 8 mM, 0,4 \mug/ml de IR-CKD humano y ATP 5 mM a 30ºC. La reacción se realiza en presencia y ausencia de 2 \mug/ml de TER16998. La mezcla de reacción se coloca en una columna Rainin Microsorb-MV (4,6 x 150 mm) en un tampón que contiene fosfato de amonio 120 mM e hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio 11,9 mM, pH 6,5 en metanol. Se calculó la tasa de hidrólisis usando las áreas de pico ADP/(ADP+ATP) y ATP/(ADP+ATP) y luego representando como porcentaje de ATP que queda frente al tiempo.

Alternativamente, el cambio conformacional puede medirse indirectamente midiendo el estado de fosforilación del CKD bilobulado. Una realización de este ensayo es una forma modificada de la descrita en Hagino, H. et al. Diabetes (1994) 43:274-280. En resumen, los receptores de la insulina humanos (hIR) se purifican parcialmente a partir de extractos placentarios o a partir de la línea celular IM-9. Los hIR parcialmente purificados se capturan en pocillos de microplacas incubándolos durante 90 minutos con pocillos recubiertos con un anticuerpo monoclonal para hIR. Los pocillos se tratan entonces con varios niveles de dosis de insulina y/o compuestos de prueba durante 15 minutos a temperatura ambiente; después se añadió ATP (10 \muM) para permitir que continúe la actividad cinasa. Tras 60 minutos, los pocillos se lavan y después se tratan durante 60 minutos con anticuerpo biotinilado dirigido contra la fosfotirosina (PY-20) y los materiales no unidos se lavan de nuevo. Los pocillos se incuban entonces con un sistema convencional de estreptavidina - peroxidasa durante 30 minutos para evaluar el nivel de tirosina fosforilada. Cuando se probó en este ensayo, la insulina dio una curva de respuesta a la dosis que mostraba una CE_{50} (concentración eficaz media) de aproximadamente 0,3 nM y una actividad máxima a aproximadamente 100 nM. La CE_{50} es similar a la obtenida durante la unión de la insulina marcada a varias células y tejidos.

La actividad cinasa de un CKD bilobulado también puede medirse sobre sustratos exógenos, como una consecuencia secundaria del cambio conformacional. En una realización, puede usarse poli(Glu_{4}Tyr) como sustrato para la fosforilación. La incorporación de fosfato marcado procedente del ATP marcado en \gamma se mide tras la activación del receptor preparado como anteriormente o sustituyendo, para el receptor de la insulina humano, una cadena \beta producida por recombinación que carece del dominio de unión a la insulina (suministrado por Stratagene, Inc.). Estos ensayos pueden realizarse en una forma no radiactiva en alto rendimiento por medio de un ensayo de desplazamiento de polarización de fluorescencia, por ejemplo.

El cambio conformacional en la región CKD bilobulada está íntimamente asociado con la activación del receptor, independientemente de si es el resultado inicial o secundario de la asociación de una molécula de activador.

El método explicado anteriormente, cuando se usa generalmente para detectar los moduladores del IR, puede optimizarse usando un conjunto de compuestos candidatos sumamente diversos en las detecciones iniciales. Este método comprende, en una realización preferida, poner en contacto cada elemento de un conjunto de compuestos candidatos sumamente diversos con dicho receptor o, en particular, la parte CKD bilobulada del mismo; detectar un cambio conformacional, o actividad cinasa o fosforilación de tirosina en el CKD en contacto con cada elemento del conjunto; e identificar como candidato satisfactorio al menos un elemento del conjunto, en el que se detecta un cambio conformacional, o actividad cinasa, o un aumento de la cantidad de tirosina fosfato, en relación con el receptor no tratado, en el CKD con el se puso en contacto.

En general, una vez que se ha identificado un compuesto con al menos capacidad moderada para activar al receptor de la insulina, pueden identificarse compuestos adicionales comparando las propiedades de los candidatos con las de los compuestos que tienen actividad conocida. Una propiedad particularmente útil para comparar es la huella de afinidad del compuesto frente a un panel de referencia de proteínas, lo que proporciona una primera aproximación de los modos de unión de todas las proteínas, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.587.293. Además, el análisis de los compuestos mostrado para activar el receptor de la insulina usando un análisis estándar de la actividad estructural dará como resultado compuestos adicionales que se comportan como activadores. También puede usarse mutagénesis del receptor y análogos de fotoafinidad, tal como se describe más adelante, para identificar la unión de los compuestos al sitio del receptor, para su uso en el diseño lógico de los fármacos.

Los compuestos activadores pueden alterar la conformación del CKD bilobulado y/o estimular la fosforilación catalizada por la cinasa del IR sola, es decir, para comportarse como agonistas con respecto al receptor y/o poder intensificar la capacidad de la insulina para llevar a cabo la fosforilación del receptor. Cualquiera de estos efectos puede considerarse una activación del receptor de la insulina. Por tanto, con "activación" del receptor de la insulina se quiere decir, tanto la capacidad para comportarse como un agonista, como la capacidad para intensificar la estimulación mediante la insulina u otros agonistas de la actividad del receptor. Ambos efectos pueden probarse mediante el cambio conformacional y/o la autofosforilación del receptor y/o de la actividad cinasa del mismo.

Identificación de los sitios críticos

La invención también se refiere a la identificación de los sitios activos evidentes en el dominio citoplasmático afectados por la interacción con un modulador / activador del receptor. La identificación de tales sitios es útil con el fin de diseñar ensayos para identificar compuestos que tendrán una variedad de efectos metabólicos, todos ellos relacionados con la modulación de la activación del receptor de la insulina. Al menos pueden crearse dos tipos de ensayos basados en la identificación de un sitio que participa directamente en la activación. En primer lugar, las secuencias de aminoácidos asociadas con este sitio pueden usarse directamente en los ensayos para medir la formación de complejos con moduladores potenciales del receptor. Una forma en la que los moduladores pueden activar el receptor es mediante la unión directamente a estos sitios. Un segundo tipo de ensayo supone modificar los sitios que son críticos para la activación y comparar el efecto de los compuestos candidatos con el receptor nativo, en comparación con la forma modificada. La interacción medida puede ser simplemente la unión, u otra medida de la respuesta del receptor, tal como la actividad cinasa.

Tal como se describe adicionalmente más adelante en el presente documento, en la cadena \beta del receptor varios sitios se han identificado como directamente involucrados en la activación del receptor. Estos incluyen tres dominios, lo que se ha deducido a partir de experimentos en los que se ha demostrado que péptidos que representan estas regiones en el CKD se asocian con la unión del modulador TER16998 en virtud de su capacidad para inhibir la activación del CKD mediante este compuesto. Estos dominios comprenden las posiciones 1089-1105, 1120-1137 y 1235-1252. Otro dominio que participa en la activación es el dominio yuxtamembrana (JM) que puede unirse directamente al compuesto activador, o que puede eliminarse del sitio catalítico mediante el cambio conformacional que se produce tras la activación en otra parte de la molécula.

Tal como se describe más adelante, TER16998 o un compuesto alternativo que se sabe que activa las cadenas \beta directamente puede utilizarse per se en la localización del sitio de unión pertinente para la activación o puede usarse un derivado de este compuesto. Mediante "derivado" se quiere decir una forma químicamente modificada del compuesto activador que conserva las actividades de unión con respecto al receptor de la insulina mostradas por el compuesto original. Particularmente, derivados importantes son aquellos que proporcionan un medio para la unión covalente mediante fotoactivación. Otros derivados incluyen formas marcadas que pueden ayudar a la detección del sitio de unión, y modificaciones menores en la estructura que no interfieren con la interacción del compuesto con el sitio de unión del compuesto original en el IR.

Una vez identificado el sitio de unión, pueden identificarse compuestos que activan el receptor mediante la determinación directa de su capacidad para formar complejos con estos sitios; o mediante la determinación, a partir de la estructura tridimensional del receptor, de los restos críticos que participan en la activación del receptor a través de una unión de este tipo, seguida por mutaciones de estos restos, de manera que pueda determinarse un efecto diferencial de unión en los mutantes frente al receptor nativo; y mediante la complementaridad a la estructura tridimensional de la región de unión.

En la determinación de la capacidad de una sustancia candidata para interaccionar con el sitio identificado, se emplea normalmente la experimentación física real. Sin embargo, como alternativa, también puede evaluarse la interacción virtual. Por tanto, el "contacto" del sitio identificado del receptor con una composición de prueba incluye, no sólo el contacto físico, sino también el contacto virtual, es decir, el acoplamiento de un farmacóforo derivado para los restos identificados en la estructura cristalina o en la extensión modelada de la misma. Por tanto, tal como se describe más adelante, las características pertinentes del sitio diana en las regiones apropiadas pueden determinarse mediante la evaluación de la estructura cristalina y los detalles de la unión de un compuesto modelo, tal como TER16998, a este dominio. De acuerdo con esto, el sitio diana tridimensional puede modelarse y las características del farmacóforo pueden deducirse basándose en la complementaridad de la diana. El farmacóforo se definirá en lo que se refiere a parámetros tales como distribución potencial electrostática, es decir, la forma general del modelo de nube electrónica. El farmacóforo así descrito también puede utilizarse para proporcionar un modelo para las características principales de estructuras de moléculas conocidas. Esta información puede combinarse con las huellas determinadas, tal como se describe más adelante para estas moléculas utilizadas como patrones comparativos para seleccionar compuestos adicionales con características similares.

Se ha determinado que partes importantes de la cadena \beta del IR que participan en la unión de compuestos moduladores están representadas por las posiciones 1089-1105, por las posiciones 1120-1137 y por las posiciones 1235-1252 y mediante interferencia, por restos espacialmente adyacentes a los mismos. (Véase el ejemplo 7). Estos dominios críticos se identificaron mediante la construcción de una serie de 14 péptidos que representan varios dominios del CKD de la forma humana del receptor de la insulina y probando la capacidad de estos péptidos para inhibir la activación de la actividad cinasa del CKD por TER16998. En general, los péptidos que pueden unirse al compuesto activador inhibirán esta actividad debido a su comportamiento como señuelos o esponjas para el activador. Por tanto, en general, las posiciones que se unen a los activadores pueden identificarse mediante la construcción de péptidos correspondientes a los dominios pertinentes en la cadena \beta y probando estos péptidos para determinar su capacidad para actuar como esponjas en cualquier ensayo in vitro en el que se determina la capacidad de un activador conocido para realizar el cambio conformacional en el CKD bilobulado mediante cualquier ensayo adecuado tal como se describió anteriormente. Los péptidos que contienen un sitio que participa en la unión del activador inhibirán la activación. Además de los sitios contenidos en los propios péptidos, los restos que están próximos espacialmente al sitio de unión identificado en el péptido inhibidor en la estructura tridimensional del CKD también participan en la unión al
activador.

Además de los dominios explicados anteriormente, el dominio JM también se ha implicado en la activación producida por compuestos como TER16998 en virtud de la demostración de que las tirosinas contenidas en el dominio JM no se fosforilan cuando el receptor se activa por TER16998.

El dominio JM se define de acuerdo con la ilustración en las figuras 1 y 2. Tal como se muestra en la figura 1, el dominio JM está contenido en el citoplasma, inmediatamente adyacente a la región transmembrana de las cadenas \beta del IR. La extensión de esta región es tal como se define por Kohanski, usando la numeración de Ebina, Y. et al. Cell (1985) 40:747. El dominio JM contiene dos tirosinas que se autofosforilan cuando el receptor se activa por la insulina, en las posiciones 965 y 972. La tirosina en la posición 984 aparentemente no está fosforilada.

El estado de fosforilación de las diversas regiones del dominio citoplasmático en diversas condiciones se determina mediante el método de Kohanski (1993, citado anteriormente, usando digestión tríptica de la región citoplasmática fosforilada. Tal como demuestra Kohanski, y se ilustra en la figura 6 en el presente documento (que es la figura 4 en el artículo de Kohanski), la separación de los fragmentos trípticos en HPLC de alta resolución se usa para identificar los restos de tirosina que se han fosforilado. El trazo A muestra el digesto del CKD de longitud completa; el trazo B representa el digesto de una versión truncada que ha perdido 10 kD en el extremo C-terminal.

En resumen, en el trabajo de Kohanski, el dominio citoplasmático se fosforila en presencia de ATP marcado en \gamma. Las condiciones incluyen Mn^{+2} 1-10 mM, ATP total 10 \muM, 10 \mug/ml de CKD, con incubación durante 2 h a 25ºC. En la prueba, se usa TER16998 o insulina o ambos, el receptor intacto solubilizado, que contiene las dos cadenas \alpha y \beta. La cadena \beta fosforilada que contiene el dominio cinasa citoplasmático (CKD) marcado con fosfato radioactivo se recupera entonces y se purifica usando SDS PAGE. Tras localizar el CKD marcado mediante autorradiografía del gel húmedo y no fijado, inmediatamente después de la electroforesis, los segmentos pertinentes se eliminan del gel y se empapan con agua durante 30 min. Los segmentos se prensan y se tratan con tripsina a 0,1 mg/ml añadidos en ácido acético N-etilmorfolina 50 mM (pH 7) durante 15 horas a temperatura ambiente. Los fragmentos trípticos se recuperan entonces mediante filtración y se someten a HPLC en dos etapas. Los digestos se someten primero a intercambio aniónico en intercambio aniónico débil SynChropak AX300 y se eluyeron con gradiente; las fracciones se agruparon según la distribución de la radiactividad.

Cada grupo se somete entonces a HPLC en una columna de fase inversa Spherisorb C8 y tras elución en gradiente se recuperaron fracciones individuales. Las fracciones se identificaron mediante comparación con el recorrido en HPLC comparable con el digesto tríptico original. Las fracciones individuales se secuencian entonces para determinar la localización de las tirosinas fosforiladas.

Este procedimiento se empleó en el CKD fosforilado del receptor intacto que se había tratado con y sin TER16998 y/o insulina.

La tabla 1 muestra los resultados de esta determinación:

TABLA 1

	Yuxtamembrana	Dominio central	C-terminal
Sitios pY	965	972	1158	1162	1163	1328	1334
Estado de reposo	X	X	X	X	X	X	X
con insulina	P	P	P	P	P	P	P

TABLA 1 (continuación)

	Yuxtamembrana	Dominio central	C-terminal
con TER16998	X	X	P	P	P	P	P
con TER16998 e insulina	X	X	P	P	P	P	P

En la tabla 1, "X" indica que la tirosina pertinente no se ha fosforilado; "P" indica que sí.

Es evidente a partir de los resultados en la tabla 1 que la activación por la insulina del receptor da como resultado la fosforilación en todas las regiones; la activación por TER16998 puede realizar fosforilaciones en el dominio central y en el domino C-terminal en virtud de su propia interacción con el domino JM, puesto que cuando se usan tanto insulina y TER16998 en combinación, los sitios de tirosina en JM permanecen sin fosforilarse, mientras que los sitios restantes, característicos del receptor activado, se convierten en fosfotirosina.

La composición o sustrato que puede ser agonista del receptor de la insulina mediante la modulación de la región JM no necesita necesariamente imitar el modelo de nube electrónica de los restos fosforilados en esta región, puesto que parece que las tirosinas de JM no necesitan captar un fosfato para activar al receptor. Esto se sabe porque al mutar las tirosinas de JM no se da como resultado la incapacidad de la insulina para activar al receptor, mientras que al mutar las tirosinas en el dominio catalítico se destruye la activación por la insulina del receptor. Las tirosinas de JM se fosforilan aparentemente en la reacción de la cinasa cis, que a su vez facilita la reacción de la cinasa trans en los restos de tirosina restantes.

Tal como se explicó anteriormente, la localización de la unión de TER16998 u otro activador puede definirse adicionalmente mediante la conversión de la asociación no covalente del activador a la región CKD en una covalente mediante, por ejemplo, el uso de un marcador de fotoafinidad, seguido por la localización de los marcadores unidos covalentemente mediante secuenciación. Por tanto, cuando el activador se asocia con la región diana, la activación de la luz da como resultado la unión covalente. La figura 7 muestra una síntesis ilustrativa de sondas de fotoafinidad para la unión de TER16998. Se muestran las realizaciones de formación de radical y nitreno, aunque también podría usarse la fotoactividad de las uniones azo en el propio TER16998. Tal como se muestra, un sustituyente hidroxi-naftilo se esterifica usando N-hidroxisuccinimida (NHS) para dar como resultado la unión del resto fotoactivador. En la activación con luz de longitud de onda adecuada, el derivado TER16998 llegará a unirse entonces covalentemente a su posición asociada en el receptor, tal como se muestra. Esto permite una definición más exacta del punto en el que se asocia TER16998. Alternativamente, TER16998 puede usarse per se seguido por tratamiento con linkers bifuncionales, tales, como los disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL, de manera que realice la unión covalente de TER16998 al sitio apropiado.

La disponibilidad de la estructura tridimensional del receptor permite la identificación de restos que contribuyen de manera importante a la unión de los activadores en la región CKD. Pueden proporcionarse fácilmente mutaciones de estos restos, debido a la disponibilidad del gen que codifica para el receptor. Dillalba, M. et al. Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:7848-7852. Así, la mutagénesis dirigida al sitio proporcionará formas modificadas de la proteína en la que la unión satisfactoria a un compuesto de prueba no tiene relación con su capacidad para mostrar activación del IR y la pérdida de unión a un compuesto por el IR mutante tiene relación con la activación del IR. Por tanto, estos mutantes pueden usarse como sustratos de detección diferencial en combinación con la proteína nativa o los mutantes irrelevantes para distinguir entre los compuestos que simplemente se unen al receptor y los que pueden activarlo uniéndose a la región CKD.

Entre las sustancias que activan al receptor de la insulina se incluirán anticuerpos o fragmentos de los mismos que son inmunoespecíficos para los sitios de unión identificados del activador, descritos adicionalmente más adelante, puesto que tales anticuerpos se unirán específicamente a esta región, que se demuestra que participa en la activación del receptor. La preparación de tales anticuerpos se lleva a cabo fácilmente mediante métodos bien establecidos, incluyendo normalmente la inmunización de un mamífero u otro vertebrado con el péptido que representa el sitio opcionalmente acoplado con un vehículo inmunogénico. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del plasma del animal inmunizado o, preferiblemente, pueden obtenerse los anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridoma convencional. Tales hibridomas también son fuentes útiles para los genes que codifican para los anticuerpos monoclonales pertinentes que pueden manipularse entonces para obtener estos anticuerpos u otros modificados usando técnicas de recombinación. Esto hace posible la preparación, no sólo de fragmentos del anticuerpo de unión al antígeno (que podrían obtenerse directamente a partir del antisuero policlonal o de los anticuerpos monoclonales segregados por los hibridomas mediante escisión enzimática) sino que también permite que se produzcan formas de cadena simple, por ejemplo, formas Fv. Alternativamente, pueden detectarse librerías aleatorias de formas Fv recombinantes. La disponibilidad de los genes también permite modificaciones de los anticuerpos para investigar el grado crítico de la región variable para elucidar los matices de la interacción con el receptor. Por tanto, tales anticuerpos representan no sólo los compuestos que pueden activar directamente al receptor, sino que también son herramientas útiles para el diseño de pequeñas moléculas que se unen a sitios identificados.

Compuestos que activan al receptor de la insulina

Se han identificado varios compuestos que pueden activar al receptor de la insulina mediante la interacción directa con el CKD. Esta clase de compuestos tiene la fórmula general

Fórmula (1)

4

en la que

cada Ar es independientemente un resto aromático;

cada A es independientemente un sustituyente aceptor de protones;

cada R es independientemente un sustituyente que no interfiere;

m es 0, 1 ó 2;

n es 1-6; y

cada linker es independientemente -CH_{2}-, -N=N-, -CH=CH-, -NHCO- o -NHCONH- o un isóstero de los mismos, en donde cuando n es 1, al menos un Ar debe comprender al menos 2 anillos aromáticos condensados.

Un ejemplo específico del compuesto de fórmula (1) se representa por el componente A de la fórmula:

5

Componente A

En los compuestos de fórmula (1), los sustituyentes aceptores de protones representados por "A" pueden ser aniónicos o pueden ser suficientemente nucleofílicos para aceptar un protón a pH fisiológico. Realizaciones particularmente preferidas de A incluyen -SO_{3}X, OP(OX)_{3} y -COOX, en las que X es un átomo de hidrógeno o un catión, dependiendo del pH. Cationes adecuados incluyen cationes inorgánicos tales como sodio, potasio, calcio y similares o pueden ser cationes orgánicos, tales como los proporcionados por bases orgánicas, por ejemplo, cafeína. También se incluyen en las realizaciones de A sustituyentes amino que incluyen aminas primarias, secundarias y terciarias; bioisósteros habituales de ligandos aniónicos, tales como anillos de tetrazol, incluso cuando no están cargados.

Los restos aromáticos representados por Ar son sistemas aromáticos monocíclicos o bicíclicos, tales como el benceno o el naftaleno o contienen uno o más hetereoátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N. Por tanto, incluidos entre los sistemas aromáticos están benzotiazoles, quinolinas, piridina, y similares. Particularmente preferidos son los restos de naftileno.

Los sustituyentes que no interfieren en los restos de naftilo en la fórmula (1) pueden o estar o no presentes, es decir, cada m es independientemente 0 ó 1. La posición de R es arbitraria en cada caso; las realizaciones preferidas de R incluyen restos de hidrocarbilo sustituidos o no sustituidos, ya sean de cadena simple, ramificada o cíclica, y ya sean aromáticos o no aromáticos. Entre éstos se incluyen, pero no se limitan a, sustituyentes alquilo de 1-6 C, sustituyentes alquenilo de 1-6 C, y sustituyentes alquilo o alquenilo, en los que la cadena carbonada está interrumpida por uno o más heteroátomos, tales como O, N o S. Los sustituyentes también pueden tener la fórmula -OR', NR'_{2} o SR', en las que
R' es H o R, tal como se definió anteriormente. Las realizaciones particularmente preferidas incluyen alquilo (1-6 C).

En los compuestos de fórmula (1), cada linker es independientemente un isóstero de -CH=CH-, tal como -N=N-, -CH=N- o -CH_{2}CH_{2}, o -NHCH_{2}-, o -CH_{2}-, tal como NH u O, o de -NHCO- tal como -OCO- o -COO-. Métodos generales para la formación de todas estas uniones entre sistemas aromáticos son bien conocidos en la técnica.

Compuestos particularmente preferidos de fórmula (1) son aquellos en los que cada R es alquilo (1-6 C). También se prefieren compuestos de fórmula (1) en los que cada m es 0.

También se prefieren las realizaciones en las que el compuesto de fórmula (1) es

6

en la que n es 4 - 6 y A es como se define en la reivindicación 1.

Particularmente preferido es el compuesto mostrado como componente A.

Otra forma preferida del compuesto de fórmula (1) se representa por la fórmula (2):

Fórmula (2)

7

en la que cada R, A, linker y m son tal como se definieron anteriormente.

Se prefieren los compuestos en los que

cada n es independientemente 0, 1 ó 2; y

cada linker es independientemente un isóstero de -NHCONH- o de -N=N- o de -NHCO-.

En los compuestos de formula (2), los sustituyentes aceptores de protones representados por "A" pueden ser aniónicos o pueden ser suficientemente nucleofílicos para aceptar un protón a pH fisiológico. Realizaciones particularmente preferidas de A incluyen -SO_{3}X, OP(OX)_{3} y -COOX, en las que X es un átomo de hidrógeno o un catión, dependiendo del pH. Cationes adecuados incluyen cationes inorgánicos tales como sodio, potasio, calcio y similares o pueden ser cationes orgánicos, tales como los proporcionados por bases orgánicas, por ejemplo, cafeína. También se incluyen en las realizaciones de A sustituyentes amino que incluyen aminas primarias, secundarias y terciarias, así como bioisósteros habituales de ligandos aniónicos, tales como anillos de tetrazol, incluso cuando no están cargados.

Los sustituyentes que no interfieren en los restos de naftilo en la fórmula (2) pueden o estar o no presentes, es decir, cada n es independientemente 0, 1 ó 2. La posición de R es arbitraria en cada caso; las realizaciones preferidas de R incluyen restos de hidrocarbilo sustituidos o no sustituidos, ya sean de cadena simple, ramificada o cíclica, y ya sean aromáticos o no aromáticos. Entre éstos se incluyen, pero no se limitan a, sustituyentes alquilo de 1-6 C, sustituyentes alquenilo de 1-6 C, y sustituyentes alquilo o alquenilo, en los que la cadena carbonada está interrumpida por uno o más heteroátomos, tales como O, N o S. Los sustituyentes también pueden tener la fórmula -OR', NR'_{2} o SR', en las que R' es H o R, tal como se definió anteriormente. Las realizaciones particularmente preferidas incluyen -OH y restos aromáticos adicionales que contienen sustituyentes aceptores de protones.

En los compuestos de fórmula (2), cada linker es independientemente un isóstero de -NHCONH-, tal como
-NHCNHNH-, -NHCOO- o -OCOO- o puede ser un isóstero de -N=N, tal como -CH=CH-, CH=N- o -CH_{2}CH_{2}- o -NHCH_{2}. Los linkers también pueden ser isósteros de -NHCO-, tales como -OCO- o -COO-. Métodos generales de formación de todas estas uniones entre sistemas aromáticos son bien conocidos en la técnica.

Compuestos particularmente preferidos de fórmula (2) son aquellos en los que cada R es independientemente OH o es

8

en las que cada linker es tal como se definió anteriormente. También se prefieren los compuestos de fórmula (2) en los que cada n es 0 ó 1, especialmente en los que R es independientemente OH.

También se prefieren las realizaciones en las que el compuesto de fórmula (2) se selecciona del grupo que consiste en

9

10

11

en las que cada linker es independientemente, o bien -N=N- o -NHCO-.

Se prefieren particularmente TER16998 y los compuestos mostrados en las figuras 8A y 8B en el presente documento.

También se prefieren entre los compuestos de fórmula (1) general aquellos de fórmula (3):

Fórmula (3)

12

en la que cada uno de R, A, linker y m son tal como se definieron anteriormente y

en la que p es 0 ó 1.

Se prefieren las realizaciones en las que

m es 0 ó 1;

n es 0, 1 ó 2; y

cada linker es independientemente un isóstero de -N=N- o de -NHCO-.

En los compuestos de fórmula (3), los sustituyentes aceptores de protones representados por "A" pueden ser aniónicos o pueden ser suficientemente nucleofílicos para aceptar un protón a pH fisiológico. Realizaciones particularmente preferidas de A incluyen -SO_{3}X, OP(OX)_{3} y -COOX, en las que X es un átomo de hidrógeno o un catión, dependiendo del pH. Cationes adecuados incluyen cationes inorgánicos tales como sodio, potasio, calcio y similares o pueden ser cationes orgánicos, tales como los proporcionados por bases orgánicas, por ejemplo, cafeína. También se incluyen en las realizaciones de A sustituyentes amino que incluyen aminas primarias, secundarias y terciarias, así como bioisósteros habituales de ligandos aniónicos, tales como anillos de tetrazol, incluso cuando no están cargados.

Los sustituyentes que no interfieren en los restos de naftilo en la fórmula (3) pueden o estar o no presentes, es decir, cada n es independientemente 0, 1 ó 2. La posición de R es arbitraria en cada caso; las realizaciones preferidas de R incluyen restos de hidrocarbilo sustituidos o no sustituidos, ya sean de cadena simple, ramificada o cíclica, y ya sean aromáticos o no aromáticos. Entre éstos se incluyen, pero no se limitan a, sustituyentes alquilo de 1-6 C, sustituyentes alquenilo de 1-6 C, y sustituyentes alquilo o alquenilo, en los que la cadena carbonada está interrumpida por uno o más heteroátomos, tales como O, N o S. Los sustituyentes también pueden tener la fórmula -OR', NR'_{2} o SR', en las que R' es H o R, tal como se definió anteriormente. Las realizaciones particularmente preferidas incluyen -OH y restos aromáticos adicionales que contienen sustituyentes aceptores de protones.

En los compuestos de fórmula (3), cada linker es independientemente un isóstero de -NHCONH-, tal como
-NHCNHNH-, -NHCOO- o -OCOO- o puede ser un isóstero de -N=N, tal como -CH=CH-, CH=N- o -CH_{2}CH_{2}- o -NHCH_{2}. Los linkers también pueden ser isósteros de -NHCO-, tales como -OCO- o -COO-. Métodos generales de formación de todas estas uniones entre sistemas aromáticos son bien conocidos en la técnica.

Compuestos particularmente preferidos de fórmula (3) son aquellos en los que cada R es independientemente OH o es

13

en las que cada linker es tal como se definió anteriormente. También se prefieren los compuestos de fórmula (3) en los que cada n es 0 ó 1, especialmente en los que cada R es independientemente OH.

También se prefieren las realizaciones en las que cada linker es independientemente, o bien -N=N- o -NHCO-.

Más preferidos son los compuestos de fórmula

14

en la que cada linker es independientemente -CH=CH- o -NHCO-.

Compuestos particularmente preferidos son los mostrados en las figuras 8C y 8D en el presente documento.

La identificación de los compuestos anteriores se realizó de la siguiente forma: Se ordenó una librería de compuestos descrita en la patente de los EE.UU. número 5.587.293, incorporada al presente documento mediante referencia, que contenía las huellas de 10.000 compuestos obtenidas frente a un panel de 18 proteínas de referencia, de manera que las agrupaciones de huellas con características similares se agruparon para seleccionar 50 compuestos representativos como "conjunto de formación". Cada uno de estos 50 compuestos representativos se probó para determinar su capacidad para activar al receptor de la insulina. Una muestra que se cree que consiste sólo en TER12 mostrada en la figura 8D, cuya huella no se agrupó y que no era un elemento de una agrupación fue el único compuesto probado que tuvo éxito en la activación de este receptor usando el ensayo explicado en el ejemplo 1. Aunque más tarde se encontró que el componente de la muestra probada que tenía la estructura de TER12 no era tan activo en este ensayo como un componente presente en concentración inferior, el componente A, las similitudes estructurales de TER12 y el componente A son evidentes y son suficientes para permitir que tanto el componente A como TER12 se utilicen como patrones de comparación de huellas.

El método anterior puede generalizarse, en combinación con el método del ensayo descrito en el ejemplo 1 más adelante en el presente documento para detectar compuestos que activan cualquier receptor que experimente autofosforilación. En general, el método comprende identificar un compuesto que activa un receptor que contiene una parte cinasa mediante autofosforilación. El método comprende poner en contacto cada elemento de un conjunto de compuestos candidatos sumamente diversos con el receptor o la parte de cinasa del receptor y detectar la presencia o ausencia de tirosina fosfato en el receptor o en la parte de cinasa. Un candidato satisfactorio se identifica como un elemento del conjunto en el que se detecta un aumento del nivel de tirosina fosfato, en comparación con el estado basal, en el receptor o la cinasa con la que está en contacto.

Se buscaron catálogos químicos para compuestos con características estructurales similares a las de TER12 o que cuando se probaran tuvieran huellas que mostraran características coincidentes esenciales. De los 42 compuestos identificados que tenían estructuras similares, cuatro mostraron actividad con respecto al receptor; entre ellos, había una muestra que contenía TER3938, mostrada en la figura 2B, aunque más tarde se demostró que la mayor parte de la actividad se debía al componente A, un componente estructuralmente relacionado presente en concentración inferior. Por tanto, pueden utilizarse las huellas de estos compuestos identificados con respecto a un panel de referencia patrón (descrito adicionalmente más adelante en el presente documento) como patrones para su comparación con las huellas de los compuestos candidatos que tienen probablemente las mismas actividades.

Las patentes de los EE.UU. 5.217.869, 5.300.425 y 5.587.293, cuyos contenidos se incorporan al presente documento mediante referencia, describen técnicas para identificar compuestos con propiedades similares mediante la comparación con sus huellas. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, una "huella caracterizadora" se refiere a un perfil de unión tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.587.293, que proporciona información suficiente acerca de la actividad de unión de un compuesto particular para caracterizarlo. Por ejemplo, los perfiles habituales se muestran en la figura 2C de esa patente, que muestra un perfil frente a un panel de sólo nueve elementos. Sin embargo, se prefieren números más elevados de elementos de panel, normalmente pueden usarse paneles de 12, 16 ó 18 elementos. Mediante un perfil de unión "similar" se quiere decir que el patrón general obtenido para el compuesto con un perfil "similar" es el mismo que el patrón general mostrado por la referencia, por ejemplo, TER16998.

En resumen, se obtiene una huella para un compuesto individual (que lo caracteriza) probando la unión o la reactividad del compuesto con respecto a un panel de referencia de sustancias que pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, proteínas en general, u otras sustancias que muestren diversos grados de reactividad con respecto a la mayoría de los compuestos. Los paneles de referencia se escogen de manera que representen prácticamente la totalidad del espacio químico, es decir, un conjunto de sustancias tan variadas en su contorno espacial y de carga que la capacidad para reaccionar con cualquier otra sustancia esté contenida al menos en algún punto dentro del panel. Entonces cada compuesto que se hace reaccionar con el panel da un patrón característico de reactividades que podría considerarse una huella. Los compuestos que muestran huellas similares, muestran patrones de reactividad y propiedades similares. Por tanto, si se sabe que un receptor diana se une a un ligando específico, se puede identificar un compuesto que también se una al receptor escogiendo un compuesto cuya huella sea similar a la del ligando conocido. Aquí, las huellas de los candidatos de, por ejemplo, las librerías de compuestos, se comparan con las huellas correspondientes de TER12, TER3938 u otros compuestos identificados como activadores del receptor, preferiblemente el componente A y TER16998. Se observará que no tiene consecuencias que TER12 y TER3938 se muestren más tarde menos activos en los ensayos del IR cinasa que otros componentes contenidos en las muestras de estos compuestos con respecto a la utilidad de sus huellas para la identificación de compuestos que tienen actividad IR cinasa, puesto que los contaminantes activos son químicamente similares.

Dada la naturaleza modular de los compuestos activos, con el uso repetido de motivos similares, la síntesis de variantes que caen dentro del género explicado en la fórmula (1) es particularmente conveniente usando técnicas de química combinatoria estándar. Normalmente, la síntesis paralela de compuestos con una variedad de bloques componentes alternativos usados en cada etapa sucesiva permite que se efectúen numerosas variantes rápidamente. Comúnmente, pero no necesariamente, se realizan operaciones paralelas sobre precursores inmovilizados en fase sólida. Las librerías resultantes de compuestos que tienen en común su conformidad con la estructura mostrada como fórmula (1) son útiles para identificar nuevos compuestos y también para establecer las características farmacológicamente relevantes de los restos activos que pueden combinarse después adicionalmente.

La evaluación de las características estructurales de un compuesto activo individual, especialmente las compartidas por varios compuestos activos, en contraste, por ejemplo, con los compuestos que no activan al receptor de la insulina, también permite el diseño de candidatos adecuados para la síntesis y las pruebas. Se conocen en la técnica métodos para tal análisis y para la identificación de tales características estructurales. Véase, por ejemplo, Nesnow, S. et al. J Toxicol Environ Health (1988) 24:499-513, que describe la asignación de características estructurales entre un grupo de 36 colorantes arilazo como relacionadas con su capacidad para reducirse por una azorreductasa microsómica del hígado de rata.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar, pero no a limitar, la invención.

Ejemplo 1 Efecto aparente de TER12 sobre la autofosforilación de la cinasa del receptor de la insulina

A. Este ensayo es una forma modificada del descrito en Hagino, H. et al. Diabetes (1994) 43:274-280. En resumen, los receptores de la insulina humanos (hIR) se purificaron parcialmente a partir de extractos placentarios o de la línea celular IM-9. Los hIR parcialmente purificados se capturaron en pocillos de microplaca mediante su incubación durante 90 minutos con pocillos recubiertos con un anticuerpo monoclonal para hIR. Los pocillos se trataron entonces con diversos niveles de dosis de insulina y/o compuestos de prueba durante 15 minutos a temperatura ambiente; se añadió después ATP (10 \muM) para permitir que continuase la actividad cinasa. Tras 60 minutos, se lavaron los pocillos y después se trataron durante 60 minutos con anticuerpo biotinilado dirigido contra la fosfotirosina (PY-20) y los materiales no unidos se lavaron de nuevo. Los pocillos se incubaron entonces con un sistema convencional de estreptavidina - peroxidasa durante 30 minutos para evaluar el nivel de tirosina fosforilada.

Cuando se probó en este ensayo, la insulina dio una curva de respuesta a la dosis que mostró una CE_{50} de aproximadamente 0,3 nM y una actividad máxima de aproximadamente 100 mM. La CE_{50} es similar a la obtenida para la unión de la insulina marcada a diversas células y tejidos.

Dos conjuntos de compuestos de 50 elementos cada uno, seleccionados para que fueran sumamente diversos, tal como se define en la patente de los EE.UU. 5.300.425 e incorporadas al presente documento mediante referencia, se detectaron en el ensayo anterior. De esos 100 compuestos, sólo una muestra compuesta principalmente de TER12 (véase la figura 8C) mostró actividad agonista evidente. En ausencia de insulina, 20 \muM de esta muestra estimularon la autofosforilación por encima de cinco veces más (la insulina 0,3 nM estimula la fosforilación aproximadamente hasta este punto). Por tanto, la actividad de la insulina a aproximadamente 0,3 nM es aproximadamente equivalente a la mostrada por esta muestra a aproximadamente 20 \muM y un componente de esta muestra demuestra la capacidad directamente para estimular autofosforilación.

Además, la muestra intensificó la capacidad de la insulina para estimular la autofosforilación. La adición de muestra 60 \muM a hIR en contacto con insulina 0,3 nM dio como resultado un aumento en la fosforilación de aproximadamente tres veces y hasta el nivel máximo mostrado por la estimulación de la insulina a concentraciones superiores. En experimentos adicionales se demostró que la CE_{50} para este efecto (intensificación de la estimulación de la insulina) era de aproximadamente 20 \muM de muestra calculada como TER12. Estos resultados también se confirmaron mediante ensayo Western blot (inmunotransferencia).

B. En una demostración adicional de la actividad de un componente en la muestra que contenía TER12, el sustrato artificial, poli(Glu_{4}Tyr), se usó como el sustrato para fosforilación. Se midió la incorporación de fosfato marcado a partir de ATP marcado en \gamma tras la activación del receptor preparado como en el apartado A. Aproximadamente 20 \muM de muestra calculada como TER12 proporcionaron el 75% de la actividad máxima estimulada por la insulina; también se intensificó la capacidad de insulina 0,5 nM y 5,0 nM para realizar la fosforilación; la insulina 0,5 nM sola mostró un 60% de fosforilación máxima; la adición de 20 \muM de muestra de TER12 aumentó esto hasta el 120%; en presencia de insulina 5 nM, la fosforilación aumentó desde el 95% de máximo hasta el 140%.

C. Cuando se probó con respecto a la actividad agonista del receptor de la insulina en células completas, es decir, en la línea celular linfocítica humana IM-9, la muestra que contenía TER12 mantuvo su capacidad para estimular al receptor. En este ensayo, 2 x 10^{7} células se trataron con y sin esta muestra y con y sin insulina durante 5 minutos, seguido por tres lavados en medio isotónico para eliminar la muestra que contenía TER12. Las células se lisaron entonces en Tween 20 al 0,5% y los lisados se analizaron en un ensayo ELISA, tal como se describe en el apartado A, sin las etapas de incubación con ATP. Tras 5 minutos de exposición a la muestra que contenía TER12 20 \muM, se aumentó en dos veces la actividad cinasa basal del receptor de la insulina y la actividad cinasa del receptor de la insulina estimulada por la insulina se aumentó en cinco veces.

D. El ensayo descrito en el párrafo B se realizó sustituyendo el receptor de la insulina humano por una cadena \beta producida mediante recombinación que carecía del dominio de unión a la insulina (suministrada por Stratagene, Inc.). La capacidad de esta cinasa para fosforilar un péptido sustrato (Raytide de Oncogene Sciences) se estimula mediante TER12 a 25 \muM. (Además, un inhibidor conocido que se cree que actúa en el sitio del ATP en la cinasa también inhibe esa forma modificada del receptor).

E. La insulina puede inducir la diferenciación de los fibroblastos 3T3-L1 a una morfología similar a la de los adipocitos, tal como se midió mediante la captación de Oil Red O (tinción histoquímica de lípidos). La muestra que contenía TER12 solo no parece realizar la diferenciación; sin embargo, a una concentración de 20 \muM, intensifica el efecto de diferenciación de la insulina. Esta actividad es similar a la mostrada por la pioglitazona descrita anteriormente. La insulina también intensifica el transporte de glucosa en esta línea celular. De nuevo, la muestra sola no estimuló el transporte de glucosa de manera significativa, pero intensificó la capacidad de la insulina para hacerlo.

Ejemplo 2 Compuestos adicionales con actividad similar a la de TER12

Utilizando una búsqueda de subestructuras basada en la molécula TER12, se obtuvieron 42 compuestos candidatos y se sometieron a ensayo, según el procedimiento del ejemplo 1.

Una muestra que contenía TER3938, mostrada en la figura 8E, también mostró actividad agonista. TER3938, mostrada en la figura 8E y conocida como Direct Yellow número 27, mostró una CE_{50} de 8 \muM en este ensayo in vitro; también intensificó la actividad de la insulina en la estimulación de la autofosforilación del receptor de la insulina en las células IM-9 intactas. Además, una muestra que contenía TER3935, mostrada en la figura 8A, fue activa en el ensayo de la cinasa del IR.

Ejemplo 3 Identificación de un componente activo de muestras que contienen TER12 y TER3938

TER12 se sintetizó mediante el esquema de reacción mostrado en la figura 9. TER12 sintetizada usando este esquema y TER12 cuando se purifica exhaustivamente a partir de orígenes comerciales fueron activas en los ensayos explicados en el ejemplo 1.

Además, la muestra que contenía TER3938, también obtenida de orígenes comerciales, cuando se purificó hasta el 95% de pureza por HPLC en fase inversa, mantuvo su actividad; sin embargo, cuando esta muestra se lavó con carbonato sódico acuoso, el compuesto insoluble mostrado en la figura 8E como TER3938 fue menos activo en el ensayo de la cinasa del IR; sin embargo, la capa acuosa, mantuvo su actividad completa. Estos resultados llevaron a la conclusión de que parte de la actividad mostrada en las muestras que supuestamente contenían sólo TER12 y TER3938 se debía a un componente menor. Se supuso que este componente menor era el componente A. El componente A, obtenido de orígenes comerciales, se purificó mediante HPLC preparativa en fase inversa, C-18, y mantuvo su actividad en el ensayo de cinasa del IR. Se demostró posteriormente que el componente A era un componente menor en las muestras que contenían tanto TER12 como TER3938. No se encontró componente A en TER3935 que fuera activo tras purificación exhaustiva.

El componente A, purificado de una muestra suministrada comercialmente, intensifica la captación de glucosa en las células 3T3-L1 diferenciadas y la actividad no depende de la presencia de insulina. Sin embargo, depende de la actividad de la PI-3 cinasa (fosfatidil inositol-3 cinasa), lo que confirma que la captación de la glucosa está mediada por la ruta de señalización de la insulina. La capacidad de concentraciones de 16 \mug/ml del componente A para intensificar la captación de la glucosa a varias concentraciones de insulina se muestra en la figura 10.

En el ensayo, se indujo la diferenciación de los pre-adipocitos 3T3-L1 a morfología de adipocito usando protocolos estándar. Cinco días tras la inducción, las células se trataron con 16 \mug/ml del componente A en presencia de diversos niveles de insulina durante 30 minutos. La captación de la glucosa se midió usando ^{14}C-glucosa como marcador. Tal como se muestra, 16 \mug/ml del componente A sólo realiza la captación a aproximadamente el nivel mostrado por concentraciones de 20 \muM de insulina en ausencia de esta concentración del componente A.

Ejemplo 4 Compuestos adicionales relacionados con TER3935

Un compuesto adicional con una estructura regioisomérica a la de TER3935, el TER16998, se aisló mediante cromatografía preparativa en fase inversa a partir de la mezcla de reacción producida por el esquema sintético mostrado en la figura 11. Los datos espectrales confirman que el compuesto aislado fue de la fórmula mostrada en la figura 5A.

TER16998 activa directamente la cinasa del receptor de la insulina, intensifica la autofosforilación y la fosforilación del sustrato mediada por el receptor de la insulina, potencia el transporte de glucosa y disminuye la glucemia en el modelo de diabetes de ratón db/db. Estos resultados se obtuvieron de la siguiente forma:

El ensayo descrito en el ejemplo 1, párrafo A, se llevó a cabo con un control que carecía de ninguna adición, en presencia de insulina sola a 1 nM, en presencia de TER16998 a 2 \muM y en presencia de una combinación de estos componentes en las concentraciones establecidas. Tal como se muestra en la figura 12, TER16998 solo puede activar la autofosforilación del receptor a esta concentración, así como potenciar el efecto de la insulina.

Además, en un ensayo para la captación de glucosa por adipocitos 3T3-L1, descrita en el ejemplo 3, TER16998 produjo un efecto agudo de sensibilización de las células a la insulina. Esto se inhibió, tal como se esperaba, mediante wortmanina 5 \muM que inhibe a la PI-3 cinasa, lo que confirma que TER16998 ejerce su efecto a través de la ruta de señalización de la insulina. Estos resultados se muestran en la figura 13. Tal como se muestra, 40 \muM de TER16998 potencia el efecto de la insulina en un intervalo de concentraciones.

De manera significativa, TER16998 no pudo estimular la actividad de fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico en un ensayo de la cinasa del receptor de EGF.

El efecto de TER16998, del componente A y de la insulina en la distribución del transportador Glut4 en los adipocitos 3T3-L1 se determinó incubando las células durante 15 minutos con insulina o uno de estos compuestos, tras lo que las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-Glut4 seguido por anticuerpo secundario conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína). Estos resultados se visualizaron al microscopio de fluorescencia. Los resultados mostraron que la insulina y el componente A producen una redistribución espectacular de Glut4 en las superficies de membrana, mientras que en las células no tratadas se obtiene un patrón difuso. TER16998 tiene un efecto similar, pero menos espectacular que el de la insulina o el componente A.

Ejemplo 5 Efecto de TER16998 en ratones diabéticos

A ratones que son modelos estándar de diabetes de tipo II, los ratones db/db, se les permitió comer a voluntad y se les administró TER16998 a 10 mg/kg y 40 mg/kg, o un vehículo como control. La figura 14 muestra el efecto de este compuesto en la concentración de glucosa en la sangre de estos animales. Tal como se muestra en la figura 14, 10 mg/kg hasta cierto punto y 40 mg/kg en un grado apreciable, disminuyeron la glucemia durante un periodo de 24 horas desde el momento de la administración.

Ejemplo 6 Síntesis de los compuestos de la invención

En general, los compuestos aromáticos poliméricos de la invención se sintetizan usando síntesis basada en fase sólida o en fase de disolución. Para la síntesis en fase sólida, los monómeros, por ejemplo, se acoplan a una resina fenólica de fórmula (10) mostrada en la figura 9. Esta resina fenólica se prepara mediante la oxidación de la resina de poliestireno - éster borónico correspondiente descrita por Farrall, M.J. y Frechet, J.M.J. J Org Chem (1976) 41:3877. La resina fenólica se condensa con un monómero inicial, 11, tal como se muestra. El producto de condensación, 12, se trata con N-butil litio para sustituir el ión bromonio con litio y este compuesto intermedio se condensa con un monómero, por ejemplo, de fórmula (13), para proporcionar el dímero de soporte sólido, 14. El -CHOH- de unión puede reducirse, si se desea, a -CH_{2}-. Condensaciones posteriores en presencia de formaldehído y ácido sulfúrico concentrado dan como resultado polímeros de la longitud deseada que pueden eliminarse de la resina en metóxido de sodio. Este proceso se resume en la figura 9.

La síntesis puede variarse alternando la naturaleza del monómero o del dímero añadido al grupo inicial de soporte.

Las síntesis de oligómeros adecuados también se realiza en fase de disolución. En un conjunto de reacciones, la síntesis es una variante de la descrita por Arduini, A. et al. Tetrahedron (1990) 46:3607-3613. Los dímeros o trímeros intermedios se obtienen mediante la condensación de un aldehído aromático con un bromuro aromático y la condensación adicional se realiza en presencia de formaldehído y ácido sulfúrico. Pueden obtenerse los dímeros mostrados como las fórmulas 18, 19 y 20, que contienen el sustituyente aceptor de protones en todas las configuraciones posibles mediante la condensación del naftil-litio apropiado con un derivado de naftil-formilo obtenido mediante el tratamiento del naftil-litio con dimetilformamida (DMF). Si se desea, los compuestos 18, 19 y 20 pueden reducirse con HSiEt_{3}/TFA hasta obtener los dinaftilenos unidos mediante puente metileno correspondientes.

15

El dímero de dibromo de la forma 23 se obtiene tal como se describe por Arduini, A. (citado anteriormente) mediante la condensación del bromuro de naftilo correspondiente con formaldehído en presencia de ácido sulfúrico.

16

Los trímeros correspondientes pueden obtenerse tratando tales dímeros sustituidos con bromo con N-butil litio y después con un aldehído de fórmula 21 ó 22.

17

Los oligómeros también pueden ampliarse mediante el acoplamiento del naftilo u otros restos aromáticos con dialdehídos, por ejemplo, 4,4'-bifenildicarboxaldehído o tereftaldehído.

Mediante la elección apropiada de la posición del sustituyente A aceptor de protones, y de los sustituyentes reactivos en los restos aromáticos, pueden sintetizarse los oligómeros deseados.

Tal como se ha explicado anteriormente, el polímero de fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

18

Componente A

es activo en el ensayo de la cinasa del receptor de la insulina descrito anteriormente y muestra la capacidad de potenciar la activación de la insulina y la captación de glucosa.

El compuesto TER17003 se sintetiza tal como se muestra en la figura 16.

TER17003 se probó en el ensayo de la cinasa de IR explicado en el ejemplo 1, apartado A, y se encontró que es activo en este ensayo.

Los compuestos TER17004 y TER17005 sustituyen ciertos linkers azo de TER3935 por los linkers amida correspondientes. Estos compuestos se sintetizan tal como se muestra en la figura 17.

Los compuestos resultantes, TER17004 y TER17005, se probaron en el ensayo de la cinasa del IR explicado en el ejemplo 1, apartado A, y se encontró que eran activos en este ensayo.

Ejemplo 7 Péptidos que compiten con el receptor para unirse a TER16998

Con el fin de identificar las regiones adicionales del CKD a las que se une TER16998, se sintetizó una serie de 14 péptidos ("péptidos ryan"). Estos péptidos se escogieron para que correspondieran a distintos elementos de superficie del CKD que se evidenciaron mediante la estructura por rayos X. Colectivamente, los 14 péptidos cubren el 85% de los restos expuestos en la superficie. Estos péptidos se probaron para determinar su capacidad para inhibir la activación del receptor de la insulina por TER16998. Los ensayos se realizaron de la siguiente forma:

La mezcla de reacción contiene 10 \mul de Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 8 mM, MnCl_{2} 2 mM, DTT 2 mM, CKD del IR humano 9 \muM, ATP 4 mM y TER16998 14,5 \muM. Las mezclas control no contienen péptidos; los péptidos probados estuvieron presentes a 20 \muM o a 100 \muM. Las reacciones se incubaron durante 5 ó 15 minutos y después se pararon con tampón de muestra en gel que contenía EDTA a una concentración final de 50 mM. Las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida nativo al 10% y se dejaron correr durante 2 horas a 15 mA. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie y se midió el grado de autofosforilación comparando los carriles control usando las posiciones de la banda en el gel nativo como una indicación de la fosforilación.

De los 14 péptidos, se encontró que sólo 3 podían disminuir el efecto de activación de TER16998. Estos péptidos fueron:

"ryan 3" que se extiende desde Met1120 hasta Asn1137 y, por tanto, corresponde al sitio catalítico en el extremo de la hélice E;

"ryan 6" que se extiende desde Pro1235 hasta Thr1252, es decir, la hélice H y la hélice I; y

"ryan 9" que se extiende desde Arg1089 hasta Thr1105.

La siguiente tabla explica la localización y la secuencia de aminoácidos de los 14 péptidos preparados.

19

La localización de los péptidos activos en lo que se refiere a la estructura tridimensional de CKD se muestra en las figuras 18A y 18B. La figura 18A muestra la localización de los péptidos en el estado basal; la figura 18B muestra la posición de estos péptidos cuando el receptor está activado. Se observa que estos péptidos forman un "cinturón" aproximado alrededor del receptor.

Ejemplo 8 Penetración en la célula de TER16998

Con el fin de evaluar si el TER16998, que potencia la estimulación mediante la insulina del receptor de la insulina cuando se usan células completas en el ensayo, se cree que es eficaz, mediante su capacidad para entrar en las células. Esto está establecido en el protocolo descrito a continuación:

Las células JM-9 se trataron con TER16998 (40 \muM) en presencia y ausencia de insulina y después se lavaron repetidamente con suero bovino fetal al 10% en PBS con el fin de eliminar cualquier TER16998 que se adhiera a las células. Cuando ya no se detectó más TER16998 en los lavados, las células se lisaron y se encontró que el compuesto estaba presente en el lisado por espectrofotometría. Estos resultados se muestran en la figura 19.

Tal como se muestra, TER16998 se encontró en el lisado. Por tanto, está claro que este compuesto puede entrar en las células e interaccionar directamente con la región CKD.

Ejemplo 9 Capacidad de TER16998 para intensificar el efecto de la insulina en los niveles de glucemia

En este estudio se determinó la captación de glucosa en ratones diabéticos db/db en presencia y ausencia de insulina y en presencia y ausencia de 10 mg/kg de TER16998. En este ejemplo, a diferencia del ejemplo 5, los animales ayunaron. En ausencia de insulina, la glucosa se mantuvo a niveles elevados en sangre. En presencia de insulina, tal como se esperaba, la glucemia disminuyó, pero comenzó a aumentar de nuevo tras aproximadamente una hora. Sin embargo, en presencia de TER16998, la glucemia disminuyó más drásticamente y no se recuperó hasta los niveles mostrados en los ratones tratados con insulina sola tras 4 horas. Estos resultados se muestran en la figura 20 en la que los rombos y los triángulos negros indican ratones tratados con placebo o con TER16998 solo, respectivamente. Los cuadrados negros muestran los niveles de glucemia para los ratones tratados con insulina sola y los datos "X" muestras niveles de glucemia para los ratones tratados con insulina y TER16998.

Claims (16)

1. Método in vitro para modular la actividad cinasa del receptor de la insulina y/o para potenciar la activación por la insulina del receptor de la insulina y/o para potenciar la estimulación mediante la insulina de la captación celular de glucosa o para estimular la captación de glucosa en células que presentan el receptor de la insulina, cuyo método comprende poner en contacto dicho receptor de la insulina o la parte cinasa del mismo o dichas células con un compuesto que comprende la fórmula

Fórmula (1)

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

en la que:

cada Ar es independientemente un resto aromático seleccionado de benceno, naftaleno, piridina, quinolina o benzotiazol;

cada A es independientemente -SO_{3}X, OP(OX)_{3}, -COOX, donde X es un átomo de hidrógeno o un catión;

cada R es independientemente un resto hidrocarbilo, sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, cíclico, aromático o no aromático, en donde las cadenas de hidrocarbilo no ramificadas pueden estar interrumpidas por uno o más heteroátomos de O, N o S; o cada R es independientemente OR', NR'_{2} o SR', en donde R' es H o R, tal como se definió anteriormente;

m es 0, 1 ó 2; n es 1-6; y

cada linker es independientemente -CH_{2}, -N=N-, -CH=CH-, -NHCO- o -NHCONH- o un isóstero de los mismos, en la que cuando n es 1, al menos un Ar debe comprender al menos 2 anillos aromáticos condensados.

2. Método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de fórmula (1) tiene la fórmula

Fórmula (2)

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

en la que cada R, A, linker, y m son tal como se definen en la reivindicación 1.

3. Método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de fórmula (1) tiene la fórmula

\newpage

Fórmula (3)

22

en la que cada uno de R, A, linker y m son tal como se definen en la reivindicación 1 y en la que p es 0 ó 1.

4. Método de la reivindicación 1, en el que m es 0 ó 1, n es 4 - 6, y cada linker es independientemente -CH_{2}-, -CH=CH- o -NHCO- o un isóstero de los mismos.

5. Método de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es de fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

en la que n es 4 - 6 y A es tal como se define en la reivindicación 1.

6. Método de la reivindicación 2 ó 3, en el que cada R es independientemente OH o

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

en las que A y linker son tal como se definen en la reivindicación 1.

7. Método de la reivindicación 2 ó 3, en el que m es 0 ó 1 y cada R es independientemente OH.

8. Método de la reivindicación 1 ó 4, en el que cada R es independientemente alquilo (1-6C).

9. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que cada A es independientemente -SO_{3}X o -COOX, en donde X es H o un catión.

10. Método de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que todos los m son 0.

11. Método de la reivindicación 3, en el que dicho compuesto es de fórmula

25

en la que cada linker es independientemente, o bien -NHCO- o -CH=CH-, y cada A es independientemente -SO_{3}X o -COOX, en donde X es H o un catión.

12. Método de la reivindicación 2, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en

\vskip1.000000\baselineskip

Fórmula (2A)

26

\vskip1.000000\baselineskip

Fórmula (2B)

27

\newpage

Fórmula (2C)

28

en las que cada linker es independientemente o bien -N=N- o -NHCO-.

13. Método para diseñar y sintetizar una molécula que active al receptor de la insulina, cuyo método comprende:

evaluar un activador que es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para determinar características estructurales que se correlacionan con dichas actividades; sintetizar un compuesto que contenga estas características estructurales; y probar dicho compuesto para determinar su capacidad para activar al receptor de la insulina para verificarlo como un activador.

14. Método para detectar compuestos candidatos con capacidad para activar al receptor de la insulina, cuyo método comprende:

obtener una huella de cada candidato con respecto a un panel de referencia;

obtener una huella de un activador que es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12 con respecto al mismo panel de referencia;

comparar la huella de cada candidato con la de dicho activador; e

identificar como candidato satisfactorio un compuesto cuya huella se parece a la de dicho activador.

15. Compuesto de la fórmula

29

16. Composición que comprende el compuesto de la reivindicación 15 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable.