ES2241744T3 - Ligandos de union a la ciclofilina. - Google Patents
Ligandos de union a la ciclofilina.Info
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Abstract
Compuesto de fórmula I en la que (i) cuando a y c son dobles enlaces, R2 está ausente, b es un enlace simple, R1 es o (ii) cuando a y c son enlaces simples, b es un doble enlace, y R1 es H, R2 es en la que X es alquilo C1-6 de cadena lineal o ramificada, -(CH2)nAr, cicloalquilo C1-6 o ¿(CH2)nR¿¿, en la que R¿¿ es un grupo hidrocarbilo cíclico; Y es una cadena lateral de aminoácido natural o no natural; W es OH o NHR3, en la que R3 es ¿CH(Y¿)CO2X¿, en la que X¿ e Y¿ están definidas por X e Y respectivamente, y pueden ser iguales o diferentes a X e Y respectivamente; y Z1 y Z2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-6 de cadena lineal o ramificada, alquenilo C1-6 de cadena lineal o ramificada, -(CH2)nAr, -(CH2)n-CO2R¿, -(CH2)p-CH=CH-(CH2)qAr en la que p y q son cada uno independientemente 0 a 5, R¿ es alquilo C1-6; y cada n puede ser igual o diferente y es de 1 a 5.
Description
Ligandos de unión a la ciclofilina.
La presente invención se refiere a derivados de
péptidos modificados.
Muchos agentes terapéuticos operan interactuando
con enzimas o receptores para modificar su actividad de una manera
terapéuticamente beneficiosa. Así pues, la búsqueda de nuevos
agentes terapéuticos es sensible a concentrarse en las moléculas que
poseen algún grado de analogía estructural y conformacional con el
sustrato o ligando natural. Muy a menudo la identidad del sustrato o
ligando natural es desconocida, pero en muchos casos se puede
deducir que está implicado un polipéptido. Es por lo tanto deseable
centrarse en los compuestos basados en estructuras peptídicas
naturales, cuya eficacia se puede detectar interactuando con las
enzimas y/o los receptores de interés.
Es conocido que la interacción de las proteínas
controla los aspectos clave de la función celular. Por ejemplo las
interacciones proteína-proteína controlan los
procesos de señalización que dan lugar a que se dividan las células,
cuyo mal funcionamiento puede conducir al cáncer y a otras
enfermedades proliferantes. Se ha demostrado anteriormente que se
puede utilizar un péptido aislado que tiene la misma secuencia que
la parte activa de una proteína natural para unirse con el socio de
enlace a la proteína natural y para producir la misma respuesta
biológica. Procesos de este tipo se describen, por ejemplo, en los
documentos WO 97/1174, WO 96/14339, WO 96/35715 y WO 97/42222.
Los estudios anteriores por el solicitante han
puesto de manifiesto que se puede utilizar una gama de moléculas no
peptídicas para simular la estructura de los péptidos específicos
dentro de los socios de enlace al polipéptido natural de varias
proteínas que unen de forma natural los ligandos de la proteína y
que pueden utilizarse para interactuar con esas proteínas. Este
trabajo se describe más en el documento WO 99/64574.
Son de particular interés para el solicitante los
nuevos ligandos de unión a la ciclofilina. Las ciclofilinas son
proteínas omnipresentes muy conservadas durante la evolución. Se
encuentran en las bacterias, hongos, plantas y vertebrados, y se
expresan ampliamente en muchos tejidos. Se han identificado, por lo
menos, ocho formas diferentes de ciclofilinas humanas, que oscilan
desde 18 kDa a 150 kDa de masa molecular [Göthel et al.,
Cell. Mol. Life Sci 1999, 55, 433-436].
La ciclofilina es el principal receptor
intracelular para el fármaco ciclosporina A inmunosupresor
[Handschumacher et al., Science 1984, 226,
544-547]. En particular, la ciclosporina A actúa
como inhibidor de la activación de los linfocitos T y puede impedir
el rechazo del trasplante en órganos y los trasplantes de médula
ósea [Borel, Pharmac. Review, 1969, 41,
259-371]. Se cree que la ciclofilina es responsable
de la mediación de esta respuesta inmunosupresora.
Además, la ciclofilina es también conocida por
catalizar la interconversión de los isómeros cis y
trans de los enlaces de peptidil-prolil amida
de los substratos del péptido y de la proteína [Takahashi et
al., Nature 1989, 337, 473-375; Fischer
et al., Nature 1989, 227, 476-478]. De
hecho, se ha descrito que la ciclofilina acelera la isomerización de
los enlaces peptidil-prolil en el plegamiento de las
proteínas [Fisher et al., Biochemistry 1990, 29,
2205-2212]. Se han propuesto varios mecanismos
incluyendo la catálisis por (i) formación de un intermedio
tetraédrico, (ii) distorsión, (iii) protonación del nitrógeno de la
amida, (iv) desolvatación, o (v) un mecanismo asistido en
disolvente.
Con el fin de elucidar el punto de unión de la
ciclosporina A, se han realizado estudios cristalográficos por
rayos-X en numerosos complejos de ciclosporina
A-ciclofilina. Por ejemplo, Kallen et al.
[Nature 1991, 353, 276-279] da a conocer la
estructura cristalina por rayos-X de la ciclofilina
recombinante humana acomplejada con un tetrapéptido e identifica el
punto de unión específico de la ciclosporina A mediante la
espectroscopía por RMN. Se han puesto de manifiesto además que el
punto de unión del substrato de la prolil isomerasa es coincidente
con el punto de unión de la ciclosporina A. Dichos resultados ayudan
a proporcionar una base estructural para racionalizar la función
inmunosupresora del sistema ciclosporina
A-ciclofilina y puede ser también importante en el
diseño racional de mejores fármacos inmunosupresores.
Los estudios de Zhao et al.
[Biochemistry 1996, 35, 7362-7368] dan a
conocer estructuras de alta resolución de ciclofilina A acomplejadas
con dipéptidos de Ser-Pro, His-Pro y
gly-Pro. En comparación con estos complejos de
ciclofilina se pone de manifiesto que las estructuras dipeptídicas
presentan la misma confomación molecular y se unen de una manera
similar. Además, las cadenas laterales de los aminoácidos
N-terminales de los dipéptidos no interactúan
fuertemente con la ciclofilina, lo que implica una contribución
menor a cualquier actividad de isomerización
cis-trans, justificando de este modo la
amplia especificidad catalítica de la enzima.
El documento WO 98/25950 (Guildford
Pharmaceuticals Inc.) da a conocer que pequeños tetra- o
pentapéptidos que contienen prolina presentan una gran afinidad para
las inmunofilinas de tipo ciclofilina. Asimismo, los estudios por
rayos-X de Kallen y Walkinshaw [FEBS Letters,
1992, vol. 300, nº 3, 286-290] dan a conocer la
estructura de un enlace tetrapéptido en el punto activo de la
ciclofilina A, mientras que Gallo et al. [Biopolymers
1995, 36, 273-8] da a conocer los experimentos de
unión de ciclolinopéptido A
[ciclo(-Pro^{1}-Pro^{2}-Phe^{3}-Ph^{4}-Leu^{5}-Ile^{6}-Ile^{7}-Leu^{8}-Val
^{9})] con ciclofilina A.
A la vista de las propiedades descritas
anteriormente, es probable que los ligandos que se unen a la
ciclofilina sean clínicamente útiles como fármacos inhibidores. De
hecho, el reciente descubrimiento de que la inhibición de la
ciclofilina impide su incorporación en la capa de proteína del VIH
sugiere que las familias de inhibidores no relacionadas con las
ciclosporinas inmunosupresoras pueden proporcionar fármacos
anti-VIH potenciales. Además, el desarrollo de
inhibidores de ciclosporina específicos de la especie pueden
proporcionar asimismo una vía a los nuevos fármacos
anti-parasitarios.
La conexión entre la ciclofilina A y el VIH ha
sido el tema de una reciente publicación de Braaten D. y Luban J.
[EMBO J 15 de Marzo de 2001;
20(6):1300-9] que confirma el papel de la
ciclofilina A en la regulación de la infectividad de los viriones de
VIH-1.
La ciclofilina también ha estado implicada en
determinados tipos de cáncer. Por ejemplo, es conocido que la
ciclofilina 40 se sobreexpresa en los tumores de mama, en
comparación con el tejido de mama normal [Breast Cancer Research
and Treatment, 58, 267-280]. El tratamiento con
estradiol durante un periodo de 24 horas ha demostrado que conduce a
un aumento de 5 veces en la expresión del ARNm de la ciclofilina 40
en las células MCF-7 del cáncer de mama
[Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001,
284, 219-225]. Estudios adicionales han puesto de
manifiesto que se detecta pérdida alélica en el 30% de los
carcinomas de mama de pacientes heterozigóticos para el marcador de
ciclofilina 40, lo que sugiere que las deleciones del gen de la
ciclofilina 40 pueden ser un caso último en la evolución del tumor
de mama [Journal Of Cancer Research And Clinical Oncology,
2001, 127, 109-115]. La ciclofilina 40 se cree
también que desempeña una función en el cáncer de hígado
[Carcinogenesis, 2000, 21, 647-652].
La ciclofilina B ha estado también implicada en
el cáncer. A este respecto, Gomi et al. han descrito que el
gen de la ciclofilina B codifica epítopos antigénicos reconocidos
por HLA-A24-restringidos y CTL
específicos del tumor [Gomi S., Nakao M., Niiya F., Imamura Y.,
Kawano K., Nishizaka S., Hayashi A., Sobao Y., Oizumi K., Itoh K.,
J. Immunol. 1 Nov. 1999;
163(9):4994-5004]. Tamura et al. ha
identificado numerosos péptidos derivados de ciclofilina B capaces
de provocar histocompatibilidad restringida del
antígeno-A2 por el leucocito y de los linfocitos T
citotóxicos específicos del tumor [Tamura M., Nishizaka S., Maeda
Y., Ito M., Harashima N., Harada M., Shichijo S., Itoh K., Jpn J.
Cancer Res., julio de 2001;
92(7):762-7].
La presente invención pretende proporcionar
nuevos compuestos que sean capaces de unirse a la ciclofilina o
inhibirla.
En un primer aspecto, la invención proporciona un
compuesto de fórmula I
en la
que
(i) cuando a y c son dobles enlaces, R^{2} está
ausente, b es enlace simple,
R^{1} es
o
(ii) cuando a y c sean enlaces simples, b es un
doble enlace, y R^{1} es H,
R^{2} es
en la que X es alquilo
C_{1-6} de cadena lineal o ramificada,
-(CH_{2})_{n}Ar, cicloalquilo C_{1-6} o
-(CH_{2})_{n}R'', en la que R'' es un grupo hidrocarbilo
cíclico;
Y es una cadena lateral de aminoácido natural o
no natural;
W es OH o NHR^{3}, en la que R^{3} es
-CH(Y')CO_{2}X', en la que X' e Y' están definidas por X e
Y respectivamente, y pueden ser iguales o diferentes a X e Y
respectivamente; y
Z_{1} y Z_{2} son cada uno independientemente
H, alquilo C_{1-6} de cadena lineal o ramificada,
alquenilo C_{1-6} de cadena lineal o ramificada,
-(CH_{2})_{n}Ar,
-(CH_{2})_{n}-CO_{2}R',
-(CH_{2})_{p}-CH=CH-(CH_{2})_{q}Ar
en la que p y q son cada uno independientemente 0 a 5, R' es alquilo
C_{1-6};
y cada n puede ser igual o diferente y es de 1 a
5.
En una forma de realización preferida, el
compuesto tiene la fórmula Ia
en la
que
(i) cuando a y c sean dobles enlaces, R^{2}
está ausente, b es enlace simple,
R^{1} es
o
(ii) cuando a y c son enlaces simples, b es un
doble enlace, y R^{1} es H,
R^{2} es
en la que X es alquilo
C_{1-6} de cadena lineal o ramificada,
-(CH_{2})_{n}Ar, cicloalquilo C_{1-6} o
-(CH_{2})_{n}R'', en la que R'' es un grupo hidrocarbilo
cíclico;
Y es una cadena lateral de aminoácido natural o
no natural;
W es OH o NHR^{3}, en la que R^{3} es
-CH(Y')CO_{2}X', en la que X' e Y' están definidas por X e
Y respectivamente, y pueden ser iguales o diferentes a X e Y
respectivamente; y
Z es H, alquilo C_{1-6} de
cadena lineal o ramificada, alquenilo C_{1-6} de
cadena lineal o ramificada, -(CH_{2})_{n}Ar,
-(CH_{2})_{n}-
CO_{2}R', -(CH_{2})_{p}-CH=CH-(CH_{2})_{q}Ar en la que p y q son cada uno independientemente 0 a 5, R' es alquilo C_{1-6};
CO_{2}R', -(CH_{2})_{p}-CH=CH-(CH_{2})_{q}Ar en la que p y q son cada uno independientemente 0 a 5, R' es alquilo C_{1-6};
y cada n puede ser igual o diferente y es de 1 a
5.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "alquilo" se refiere a una cadena que contiene carbonos
saturados C_{1-6} que puede ser lineal o
ramificada, y sustituida (mono- o poli-) o no sustituida.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "alquenilo" se refiere a una cadena que contiene
carbonos no saturados C_{2-6} que puede ser
ramificada o no ramificada, y sustituida (mono- o poli-) o no
sustituida.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "grupo hidrocarbilo cíclico" se refiere a un grupo
mono- o policíclico C_{4-10} que comprende
hidrógeno y carbono y que opcionalmente puede comprender uno o más
sustituyentes adecuados. Dicho grupo mono- o policíclico puede ser
saturado o insaturado, aromático o no aromático.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Ar" (arilo) se refiere a un grupo aromático
C_{6-10}, sustituido (mono- o poli-) o
insustituido.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico
que puede estar sustituido (mono- o poli-) o insustituido.
Cuando X, X' o Z están sustituidos, los
sustituyentes adecuados comprenden aquellos que no presentan ningún
efecto desfavorable significativo sobre la unión del compuesto a la
ciclofilina. Ejemplos de dichos sustituyentes pueden comprender
halo-, alcoxi-, nitro-, un grupo alquilo o un grupo cíclico. El
grupo X, X' o Z puede comprender además uno o más heteroátomos. Los
heteroátomos adecuados serán evidentes para los expertos en la
materia e incluyen, por ejemplo, azufre, nitrógeno, oxígeno y
fósforo.
En la estructura de fórmula I, el fragmento
-NH-CH(Y)-CO- de R^{2} y el
fragmento
-NH-CH(Y)-C(=C)-W
de R^{1} simulan la estructura de un aminoácido de fórmula
NH_{2}CH(Y)CO_{2}H. Tal como se utiliza en la
presente memoria, la expresión "cadena lateral de aminoácido
natural o no natural" se refiere por consiguiente al
correspondiente sustituyente en Y en cualquier aminoácido natural o
no natural conocido.
Por ejemplo, para simular aminoácidos naturales,
Y se puede seleccionar de la forma siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Y \+ \+ aminoácido \cr H \+ \hskip4cm \+
glicina\cr Me \+ \+ alanina\cr CH (Me) _{2} \+ \+
valina\cr CH _{2} CH (Me) _{2} \+ \+ leucina\cr
CH (Me) Et \+ \+ isoleucina\cr CH _{2} Ph \+ \+
fenilalanina\cr CH _{2} C _{6} H _{4} OH \+ \+ tirosina\cr
CH _{2} C _{8} NH _{6} \+ \+ triptófano\cr CH _{2} SH \+ \+
cisteína\cr CH _{2} CH _{2} SMe \+ \+ metionina\cr CH _{2} OH \+
\+ serina\cr CH (OH) Me \+ \+ treonina\cr
(CH _{2} ) _{4} NH _{3} ^{+} \+ \+ lisina\cr
(CH _{2} ) _{3} NH (C=NH _{2} ^{+} ) NH _{2} \+
\+ arginina\cr CH _{2} C _{3} N _{2} H _{4} ^{+} \+ \+
histidina\cr CH _{2} CO _{2} ^{-} \+ \+ aspartato\cr
CH _{2} CH _{2} CO _{2} ^{-} \+ \+ glutamato\cr
CH _{2} CONH _{2} \+ \+ asparagina\cr CH _{2} CH _{2} CONH _{2}
\+ \+
glutamina\cr}
Se pueden también seleccionar otros sustituyentes
Y para producir una gama de diferentes moléculas que simulan
aminoácidos. Por ejemplo, Y puede ser una cadena lateral de
aminoácidos no naturales.
La expresión "aminoácido no natural" se
refiere a un derivado de un aminoácido y puede, por ejemplo,
comprender aminoácidos alfa y alfa-disustituidos,
aminoácidos de N-alquilo, ácido láctico, derivados
de haluro de aminoácidos naturales tales como trifluortirosina,
p-Cl-fenilalanina,
p-Br-fenilalanina,
p-I-fenilalanina,
L-alil-glicina,
\beta-alanina, ácido
L-\alpha-amino butírico, ácido
L-\gamma-amino butírico, ácido
L-\alpha-amino isobutírico, ácido
L-\varepsilon-amino caproico,
ácido 7-amino heptanoico,
L-metionina sulfona, L-norleucina,
L-norvalina,
p-nitro-L-fenilalanina,
L-hidroxiprolina, L-tioprolina,
derivados metílicos de fenilalanina (Phe) tales como
4-metil-Phe,
pentametil-Phe, L-Phe
(4-amino), L-Tyr (metil),
L-Phe (4-isopropil),
L-Tic (ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilo),
ácido L-diaminopropiónico y L-Phe
(4-bencilo).
En una forma de realización preferida de la
invención, X y X' se seleccionan cada uno independientemente de
entre metilo, t-butilo,
2-metilpropilo, etilo, bencilo y
Más preferentemente bencilo o
t-butilo.
En una forma de realización particularmente
preferida de la invención, X y X' son diferentes.
En otra forma de realización preferida de la
invención, Y e Y' se seleccionan cada uno independientemente de
entre metilo, bencilo, iso-propilo y
2-metilpropilo, y se seleccionan más preferentemente
de entre iso-propilo y bencilo.
En una forma de realización particularmente
preferida de la invención, Y e Y' son diferentes.
Aún en otra forma de realización preferida de la
invención, Z se selecciona de entre H, metilo, bencilo, alilo,
-CH_{2}CO_{2}Me y
-CH_{2}-CH=CH-Ph, y más
preferentemente H o metilo.
En una forma de realización preferida, el
compuesto de la invención es un racemato. Tal como se utiliza en la
presente memoria, el término "racemato" se refiere a una mezcla
de cantidades iguales de los enantiómeros (+) o (R) y (-) o
(S) de un compuesto ópticamente activo. Dicha mezcla no
presenta actividad óptica, es decir, no rota el plano de la luz
polarizada. Los expertos apreciarán que los compuestos de la
invención que contienen más de un centro quiral pueden existir en
dos estereoisómeros diferentes, cada uno de los cuales puede existir
en dos formas enantioméricas. Preferentemente, la estereoquímica del
sustituyente Y (y del sustituyente Y', cuando está presente) de los
compuestos de la invención es tal que el centro quiral al que está
unido está en la forma (S).
En una forma de realización, la invención
proporciona un compuesto de fórmula II
en la que W, X, Y y Z son tal como
se definieron anteriormente en esta
memoria.
Preferentemente, Z es H, Y es isopropilo y W es
OH o NHR^{3}, en la que R^{3} es tal como se definió
anteriormente.
Aún más preferentemente, W es OH o
NHCH(CH_{2}Ph)CO_{2}Me.
Preferentemente, el compuesto de fórmula II se
selecciona de entre los siguientes:
En otra forma de realización preferida, la
invención proporciona un compuesto de fórmula III
en la que X, Y y Z_{1} y Z_{2}
son tal como se definieron en la presente memoria
anteriormente.
En una forma de realización particularmente
preferida,
- -
- Z_{1} y Z_{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre H, un grupo alquilo C_{1-6} lineal o ramificado, o CH_{2}Ph;
- -
- Y es isopropilo, 2-metilpropilo o CH_{2}Ph;
- -
- X es CH_{2}Ph o un grupo alquilo C_{1-6} lineal o ramificado.
Aún más preferentemente, X es ^{t}Bu o
CH_{2}Ph.
En una forma de realización particularmente
preferida, la invención proporciona un compuesto de fórmula IIIa
en la que X, Y y Z son tal como se
definieron anteriormente en la presente
memoria.
En una forma de realización particularmente
preferida,
- -
- Z es H, un grupo alquilo C_{1-6} lineal o ramificado, o CH_{2}Ph;
- -
- Y es isopropilo, 2-metilpropilo o CH_{2}Ph;
- -
- X es CH_{2}Ph o un grupo alquilo C_{1-6} lineal o ramificado.
Aún más preferentemente, X es ^{t}Bu o
CH_{2}Ph.
Aún más preferentemente, el compuesto de fórmula
III se selecciona de entre los siguientes:
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
un complejo que comprende ciclofilina y un compuesto tal como se
describió anteriormente en esta memoria. Preferentemente, la
ciclofilina del complejo es ciclofilina A, ciclofilina D o
ciclofilina 40.
Las interacciones de enlace entre un compuesto de
fórmula III (EM 2/34) y la ciclofilina se determinaron a partir de
la inspección de la estructura por rayos-X del
complejo y se muestran en forma esquemática a continuación.
Preferentemente, un compuesto de fórmula III
interactúa con uno o más de los siguientes restos de aminoácidos de
ciclofilina: Phe 113, Arg 55, Gln 111 y Asn 102.
Los estudios de enlaces han puesto de manifiesto
que la constante de enlace (K_{d}) del compuesto EM 2/34 para
ciclofilina está en la zona de 1 \muM. A título de comparación,
K_{d} para Ciclosporina A es 30 nM, mientras que K_{d} para
dimedona es 22 mM.
Cuando el compuesto de la invención está en forma
de una mezcla de isómeros, es posible que un isómero pueda unirse a
la ciclofilina con preferencia sobre el otro. En otras palabras,
cada isómero puede presentar una afinidad de enlace diferente a la
ciclofilina. Hasta cierto punto, dichas diferencias en la afinidad
de enlace pueden permitir a la proteína resolver con eficacia
parcial o totalmente una mezcla de isómeros. Los estudios
cristalográficos de alta resolución pueden permitir a un experto
determinar cuál de los isómeros es el ligando preferido.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la
invención como el descrito anteriormente en la presente memoria
junto con un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente
aceptable.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para
utilización humana o animal en medicina humana y veterinaria y
comprenderán normalmente uno o más de entre un diluyente, portador o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes
aceptables para utilización terapéutica son bien conocidos en la
técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit.
1985).
Ejemplos de portadores adecuados incluyen
lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio,
manitol, sorbitol y similares. Ejemplos de diluyentes adecuados
incluyen etanol, glicerol y agua.
La selección del portador, excipiente o diluyente
farmacéutico puede realizarse con respecto a la vía pretendida de
administración y a la práctica farmacéutica habitual. Las
composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además del,
portador, excipiente o diluyente cualquier/cualesquiera
aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de
suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) de
solubilización adecuado(s).
Ejemplos de aglutinantes adecuados comprenden el
almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa
anhidra, lactosa suelta, beta-lactosa, edulcorantes
de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto
o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol.
Ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato
de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de
sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares.
Los conservantes, estabilizantes, colorantes e
incluso los agentes potenciadores del sabor pueden proporcionarse en
la composición farmacéutica. Ejemplos de conservantes incluyen el
benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido
p-hidroxibenzoico. Se pueden también utilizar
antioxidantes y agentes de suspensión.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula
III,
comprendiendo dicho procedimiento
las etapas
siguientes:
(i) hacer reaccionar un compuesto de fórmula V
con un compuesto de fórmula VI para formar un compuesto de fórmula
VII;
(ii) transformar dicho compuesto de fórmula VII
en un compuesto de fórmula VIII;
(iii) hacer reaccionar dicho compuesto de fórmula
VIII con un compuesto de fórmula IV
En una forma de realización preferida, el
compuesto de fórmula VII se transforma en un compuesto de fórmula
VIII por tratamiento con (CFN_{3})/piridina.
En una forma de realización más preferida, la
etapa (iii) comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula VIII
con un compuesto de fórmula IV en presencia de
N,N'-diisopropiletilamina.
Tal como se mencionó en la presente memoria
anteriormente, preferentemente la estereoquímica del sustituyente Y
(y del sustituyente Y', cuando está presente) de los compuestos de
la invención es tal que el centro quiral al que está unido está en
la forma (S).
Los compuestos de la presente invención se pueden
preparar por una vía más general que es adecuada para la síntesis
paralela del banco en formato de serie. Esto se ilustra más
claramente en el esquema 1, representado a continuación.
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
La variación del grupo protector de N puede
conseguirse haciendo reaccionar el aminoácido libre con un
cloroformiato, XI, utilizando las condiciones descritas en Hartwig,
W., Schöllkopf, U., Liebigs Ann. Chem., 1982,
1952-1970.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a la
utilización de un compuesto de la invención para la preparación de
un medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de
trastornos inmunosupresores, infecciones por parásitos, artritis
reumatoide, cáncer o trastornos relacionados con VIH.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "preparación de un medicamento" incluye la utilización de
un compuesto de la invención directamente como medicamento además de
su utilización en un programa de cribado para la identificación de
más agentes o en alguna etapa de la preparación de dicho
medicamento.
Dicho programa de cribado puede comprender, por
ejemplo, un ensayo para determinar el enlace o el punto de enlace de
la ciclofilina y determinar si una sustancia experimental es capaz
de simular la actividad de un compuesto de fórmula I.
Así pues, en una forma de realización adicional,
la invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula
I o de una sal, forma cristalina, complejo o hidrato
farmacéuticamente aceptables del mismo, en un ensayo para determinar
el enlace al punto de enlace de la PPIasa de la ciclofilina y
opcionalmente para la identificación de compuestos experimentales
que actúen de una manera similar.
En una forma de realización preferida, la
invención se refiere a un ensayo que puede identificar compuestos
experimentales que influyen en la actividad por la PPIasa de la
ciclofilina.
En una forma de realización particularmente
preferida de la invención, el ensayo es un ensayo de enlace
competitivo.
En una forma de realización particularmente
preferida, el ensayo de enlace competitivo comprende la puesta en
contacto de un compuesto de la invención con ciclofilina en
presencia de un sustrato conocido de ciclofilina y la detección de
cualquier cambio en la actividad de ciclofilina en dicho sustrato
conocido.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para la detección del enlace de un ligando al punto de
enlace de PPIasa de la ciclofilina, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas siguientes:
- (i)
- poner en contacto un ligando con ciclofilina en presencia de un sustrato conocido de ciclofilina; y
- (ii)
- detectar cualquier cambio en la actividad de la actividad por PPIasa de la ciclofilina en dicho sustrato conocido;
y en la que dicho ligando es un compuesto según
la invención.
Un séptimo aspecto de la invención proporciona un
procedimiento de selección de un ligando capaz de unirse a un
dominio de enlace del ligando de una ciclofilina, que comprende:
- (a)
- incubar una ciclofilina, un compuesto experimental y un compuesto de la invención;
- (b)
- observar cualquier cambio en la constante de disociación de enlace (K_{d}) en comparación con la incubación idéntica que carece del compuesto experimental y, si la K_{d} ha disminuido,
- (c)
- preparar opcionalmente el compuesto experimental por medios convencionales.
Preferentemente, dicho compuesto experimental se
genera por modificación SAR convencional de un compuesto de la
invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "modificación SAR convencional" se refiere a los
procedimientos normalizados conocidos en la técnica para variar un
compuesto dado mediante modificación química.
Los procedimientos anteriores se pueden utilizar
para identificar un ligando útil como un inhibidor de
ciclofilina.
En los procedimientos descritos la ciclofilina es
preferentemente la ciclofilina A, la ciclofilina D o la ciclofilina
40.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- realizar un procedimiento de ensayo descrito anteriormente en la presente memoria;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio del enlace del ligando; y
- (c)
- preparar una cantidad de uno o más de dichos ligandos.
Se da a conocer además, un procedimiento que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- realizar un procedimiento de ensayo descrito anteriormente en la presente memoria;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio del enlace del ligando; y
- (c)
- preparar una composición farmacéutica que comprende uno o más de dichos ligandos.
Aún se da a conocer además, un procedimiento que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- realizar un procedimiento de ensayo descrito anteriormente en la presente memoria;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio del enlace del ligando;
- (c)
- modificar dicho uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio de enlace del ligando;
- (d)
- realizar el procedimiento de ensayo descrito anteriormente en la presente memoria; y
- (e)
- preparar opcionalmente una composición farmacéutica que comprende uno o más de dichos ligandos.
La presente invención se describe a continuación
únicamente a título de ejemplo, y haciendo referencia a las
siguientes figuras, en las que:
La Figura 1 presenta un espectro de masas por
electroatomización para el complejo del compuesto EM2/34 unido a la
ciclofilina A.
La Figura 2 (línea superior) presenta el espectro
de masas por electroatomización para el compuesto E11.
La Figura 2 (línea inferior) presenta el espectro
de masas para el complejo de E11 unido a la ciclofilina.
\newpage
Se prepararon compuestos de fórmula III según el
esquema 2, representado a continuación.
Esquema
2
A una solución agitada de
N-benciloxicarbonil-L-valina
(0,50 g, 2,00 mmol) y piridina (0,16 ml, 2,00 mmol) en DCM anhidro
(5 ml) mantenida bajo una atmósfera de N_{2} se añadió fluoruro
cianúrico (0,90 ml, 10,00 mmol) entre -15 y -10ºC. Se formó un
precipitado blanco. La reacción fue seguida por TLC
CHCl_{3}/MeOH/AcOH (9:1:0,1) en una pequeña cantidad de mezcla de
reacción enfriada en MeOH. Tras 1 h 40 min, se añadió hielo
machacado junto con DCM (10 ml). Se separó la capa orgánica y se
extrajo la capa acuosa con DCM (5 ml). Se lavaron las capas
combinadas de DCM con agua enfriada con hielo (10 ml), se secaron
(MgSO_{4}) y se concentraron a presión reducida para dar un aceite
incoloro (0,60 g, 119%) que se utilizó en las reacciones posteriores
sin purificación ulterior: Rf=0,78 CHCl_{3}/MeOH/AcOH (9:1:0,1);
\nu_{max} (tarjeta de polietileno) 3320 (N-H),
1843 (fluoruro ácido), 1738 (uretano, C=O), 1538 (amida II);
\delta_{H} (200 MHz, CDCl_{3}) 1,01 (3H, d, J 7,0,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 1,05 (3H, d,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 2,26
(1H, m, CH(CH_{3})_{2}), 4,49 (1H, m,
NHCH), 5,14 (3H, m, OCH_{2}Ph y NH
(enmascarado)), 7,37 (5H, s, Ar-H); MS ES (+ve) obtenido m/z
233,8
(C_{6}H_{5}CH_{2}CONHCH(CH(CH_{3})_{2})CO-,
41%), 251,8 (N-Cbz-Val, 58), 268,9
(N-Cbz-ValNH_{4}^{+}, 64), 273,8
(N-Cbz-ValNa^{+}, 33), 289,9 (N-Cbz,
ValK^{+}, 22), 341,9 (100), 502,1
(N-Cbz-Val dímero, 53), 507,1 (M^{+}
dímero, 55).
A una solución agitada a temperatura ambiente de
N-benciloxicarbonil-L-valinilfluoruro
(1) (0,48 g, 1,89 mmol) en DCM (20 ml) se añadieron dimedona (0,27
g, 1,89 mmol) y DIPEA (0,66 ml, 3,78 mmol). Además de DIPEA se
produjo un cambio de color inmediato desde incoloro a verde/marrón
luego a azul/púrpura. IR (solución en bruto; disco de polietileno)
indicó la desaparición del pico de fluoruro de acilo @ 1842
cm^{-1}. Tras la agitación durante 1/2 h se lavó la solución con
HCl 1N (2 \times 5 ml), solución saturada de NaHCO_{3} (2
\times 5 ml), agua (2 \times 5 ml), se secó (MgSO_{4}) y se
concentró a presión reducida hasta un aceite azul/púrpura (0,62 g).
La cromatografía en columna de flash sobre gel de sílice utilizando
CHCl_{3}/MeOH (9:1) como eluyente dio un aceite amarillo pálido
(0,58 g, 82%); [\alpha]_{D} -15,6 (c 1,4, CHCl_{3});
Rf=0,75 CHCl_{3}/MeOH (9:1); \nu_{max} (NaCl) 3326br
(N-H), 1769 (éster vinílico), 1715 (uretano, C=O),
1668 (\alpha,\beta-cetona insaturada), 1532
(amida II); \delta_{H} (250 MHz, CDCl_{3}) 0,95 (3H, d,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 1,02
(3H, d, J 7,0,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 1,10 (6H, s,
C(CH_{3})_{2}), 2,20-2,27
(1H, m, CH(CH_{3})_{2}), 2,27 (2H, s,
CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 2,39 (2H, s,
CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 4,39 (1H, dd,
J 9,0, 5,0, NHCH), 5,12 (2H, s, OCH_{2}Ph),
5,19 (1H, d, J 9,0, NH), 5,89 (1H, s, COCH=CO),
7,35 (5H, s, Ar-H), \delta_{C} (63 MHz, DEPT,
CDCl_{3}), 17,5 (CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 18,9
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 27,9
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 28,0
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 30,9
(CH(CH_{3})_{2}), 33,1
(C(CH_{3})_{2}), 41,8
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 50,7
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 59,1
(NHCH), 67,2 (OCH_{2}Ph), 116,8 (COCH=CO),
[128,0 (CH), 128,2 (CH), 128,5 (CH), 5C, Ar-H], 135,9
(OCH_{2}Ph), 156,1 (CONH), 167,7 (COOC=CH),
169,1 (NHCHCO), 199,0 (COCH=COCO); MS ES (+ve) m/z
obtenida 396,0 (MNa^{+}, 100%), 437,1 (22); HRMS FAB (+ve) m/z
obtenida 374,19741 (MH^{+}), C_{21}H_{28}NO_{5} requiere
374,19675.
A una solución agitada de
N-benciloxicarbonil-L-leucina
(0,50 g, 1,87 mmol) y piridina (0,15 ml, 1,88 mmol) en DCM anhidro
(5 ml) mantenida bajo una atmósfera de N_{2} se añadió fluoruro
cianúrico (0,51 ml, 5,64 mmol) entre -15 y -10ºC. Se formó un
precipitado blanco. Tras agitar durante 1 h a -5ºC, la IR de la
mezcla de reacción en bruto indicó la formación de fluoruro de
acilo. A las 2 h se añadió hielo machacado junto con DCM (10 ml). Se
separó la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con DCM (5 ml).
Se lavaron las capas combinadas de DCM con agua enfriada con hielo
(10 ml), se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a presión
reducida para dar un aceite incoloro (0,36 g, 73%) que se utilizó en
las reacciones posteriores sin purificación ulterior: \nu_{max}
(tarjeta de polietileno) 3317 (N-H), 1843 (fluoruro
ácido); \delta_{H} (200 MHz, CDCl_{3}) 0,97 (6H, d, J
6,0, CH(CH_{3})_{2}), 1,62-1,78
(3H, m, CH(CH_{3})_{2}) y
CH_{2}CH(CH_{3})_{2}),
4,54-4,61 (1H, m, NHCH), 5,02 (1H, m,
NH), 5,14 (2H, s, CH_{2}Ph), 7,36 (5H, s,
Ar-H).
Procedimiento
A
Se agitó
N-benciloxicarbonil-L-leucinilfluoruro
(3) (0,36 g, 1,36 mmol) a temperatura ambiente en DCM (15 ml) con
dimedona (0,19 g, 1,36 mmol) y DIPEA (0,47 ml, 2,72 mmol). La
solución cambió de color desde amarillo pálido a azul/púrpura. A los
20 min la IR (mezcla en bruto; disco de polietileno) indicó la
desaparición del fluoruro de acilo. Se lavó la solución con HCl 2N
(2 \times 5 ml), solución saturada de NaHCO_{3} (2 \times 5
ml), agua (2 \times 5 ml), se secó (MgSO_{4}) y se concentró a
presión reducida para dar un aceite azul/púrpura (0,42 g). La
cromatografía en columna de flash en gel de sílice utilizando
ciclohexano/éter dietílico (1:1) como eluyente dio un aceite
incoloro (0,16 g, 29%); [\alpha]_{D}-18,0
(c 2,2, CHCl_{3}); Rf=0,33 ciclohexano/éter dietilo (1:1);
\nu_{max} (tarjeta de polietileno) 3322 (N-H),
1770 (éster vinílico), 1715 (uretano, C=O), 1674
(\alpha,\beta-cetona insaturada), 1532 (amida
II); \delta_{H} (250 MHz, CDCl_{3}) 0,96 (6H, d, J
6,0), CH(CH_{3})_{2}), 1,06 (6H, s,
C(CH_{3})_{2}), 1,58-1,76
(3H, m, CH_{2}CH(CH_{3})_{2}), 2,25 (2H,
s, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 2,38 (2H, s,
CH_{2}C(CH_{3})_{2}),
4,42-4,46 (1H, m, CHNH), 5,11 (2H, s,
CH_{2}Ph), 5,21 (1H, d, J 8,0, NH), 5,90 (1H,
s, COCH=CO), 7,33 (5H, s, Ar-H); \delta_{C} (63
MHz, DEPT, CDCl_{3}) 21,5
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 22,7
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 24,7
(CH(CH_{3})_{2}), 27,9
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 28,0
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 33,0
(C(CH_{3})_{2}), 40,9
(CH_{2}CH(CH_{3})_{2}), 41,7
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 50,6
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 52,6
(NHCH), 67,1 (OCH_{2}Ph), 116,1
(COCH=COCH_{2}), [127,9 (CH), 128,2 (CH), 128,4 (CH), 5C,
Ar-H], 135,9 (OCH_{2}Ph), 155,8 (OCONH),
167,8 (COOC=CH), 170,0 (NHCHCO), 199,2
(COCH=COCO); MS ES (+ve) m/z obtenida 410,2 (MNa^{+},
100%), 426,0 (MK^{+}, 17), 433,3 (17), 451,2 (48); HRMS FAB (+ve)
m/z obtenida 388,21214 (MH^{+}), C_{22}H_{30}NO_{5} requiere
388,21240.
Procedimiento
B
A una solución fría (-10ºC) de
N-benciloxicarbonil-L-leucina
(0,73 g, 2,74 mmol) en EtOH (5 ml), se añadieron trietilamina (0,38
ml, 2,74 mmol) y cloroformiato de etilo (0,26 ml, 2,74 mmol). Se
agitó la mezcla durante 15 min a -5ºC, y se añadió dimedona (0,38 g,
2,74 mmol). Tras agitación durante 1 h 20 min a 0ºC, la TLC
hexano/EtOAc (1:1) indicó la formación de productos. Se dejó
calentar la reacción a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h
antes de la concentración a presión reducida para dar un aceite
incoloro (1,66 g). La cromatografía en columna de flash en gel de
sílice utilizando hexano/EtOAc (4:1\rightarrow2:1) dio un aceite
incoloro (0,34 g, 32%). Ensayo idéntico a (4).
Se preparó EM 3/26/2/5 mediante el fluoruro ácido
(Procedimiento A) y mediante el anhídrido mixto (Procedimiento
B).
Se preparó EM 3/26/1/2 utilizando el
Procedimiento B.
Se disolvió el éster enólico (2) (0,56 g 1,50
mmol) en MeCN (8 ml) conteniendo trietilamina (0,84 ml, 6,00 ml) y
acetonacianohidrina (14 \mul, 0,15 mmol). Tras 2,5 h, la TLC
hexano/EtOAc (1:1) indicó el éster enólico (2) restante. Se agitó la
solución a temperatura ambiente toda la noche, a continuación se
dividió entre hexano (8 ml) y HCl 1N (8 ml) frío. Se lavó la fase de
hexano con agua (2 ml), se secó (MgSO_{4}) y se concentró a
presión reducida para dar un sólido blanco desvahído (0,26 g, 66%):
punto de fusión 72ºC; [\alpha]_{D} +12,4 (c 2,1,
CHCl_{3}); Rf=0,41 hexano/EtOAc (1:1); \nu_{max} (KBr) 3424
(O-H & N-H), 1722 (uretano,
C=O), 1667 (\alpha,\beta-cetona insaturada),
1513 (amida II); \delta_{H} (200 MHz, CDCl_{3}) 0,75 (3H, d,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})),
0,86-1,27 (9H, m,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}) &
CH(CH_{3})_{2}), 2,07-2,13
(1H, m, CH(CH_{3})_{2}), 2,28-2,35
(2H, m, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 2,54 (2H,
s, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 5,08 (2H, s,
CH_{2}Ph), 5,49 (1H, d, J 9,5, NH), 5,60 (1H,
dd, J 9,5, 3,0, CHCH(CH_{3})_{2}),
7,34 (5H, s, Ar-H), 17,54 (1H, s, OH); \delta_{C}
(63 MHz, DEPT, CDCl_{3}) 15,6
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 20,3
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 27,7
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 28,3
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 30,6
(C(CH_{3})_{2}), 45,9
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 52,2
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 60,9
(CHCH(CH_{3})_{2}), 66,8
(CH_{2}Ph), 110,8 (C=COH), [128,0 (CH), 128,4 (CH),
5C, Ar-H], 136,3 (OCH_{2}Ph), 156,2 (OCONH),
[194,4 (C), 196,7 (C), 203,5 (C), COC=C(OH)CO];
MS ES (+ve) m/z obtenida 373,9 (MH^{+}, 90%), 396,0 (MNa^{+},
100); HRMS FAB (+ve) m/z obtenida 374,19769 (MH^{+}),
C_{21}H_{28}NO_{5} requiere 374,19675.
(diastereómeros en proporción
60:40,
X:Y)
Se disolvió
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-2-benciloxicarbonilamino-3-metil-butanol
(5) (0,11 g, 0,29 mmol) en DMF (1 ml). Se añadió la sal HCl del
éster metílico de L-fenilalanina (0,06 g, 0,29 mmol)
seguida de DIPEA (0,05 ml, 0,29 mmol) y se agitó la mezcla a
temperatura ambiente toda la noche tras cuyo periodo la TLC
hexano/EtOAc (1:1) indicó el restante (5). Se calentó la reacción a
50ºC durante 7 h antes de la eliminación del disolvente a presión
reducida para dar un aceite amarillo (0,19 g). La cromatografía en
columna de flash utilizando hexano/EtOAc (1:1) como eluyente dio un
aceite incoloro (0,05 g, 34%); [\alpha]_{D} -30,5 (c 2,5,
CHCl_{3}); Rf=0,64 hexano/EtOAc (1:1); \nu_{max} (tarjeta de
polietileno) 3352 (N-H), 1748 (éster), 1713
(uretano, C=O), 1634 (\alpha,\beta-cetona
insaturada), 1565 (amida II); \delta_{H} (360 MHz, COSY,
CDCl_{3}) 0,33 (3H, d, J 7,0,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), Y), 0,76 (3H, d,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), X)
0,92 (3H, d, J 6,5, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}),
Y), 1,01 (3H, d, J 6,5,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), X),
1,04-1,07 (12H, m,
C(CH_{3})_{2}, X & Y),
2,02-2,11 (1H, m, CH(CH_{3})_{2},
Y), 2,19-2,26 (1H, m,
CH(CH_{3})_{2}, X), 2,30-2,52 (8H,
m, CH_{2}C(CH_{3})_{2}CH_{2}, X
& Y), 3,17 (1H, dd, J 14,0, 9,0,
CHCH_{A}H_{B}Ph, Y), 3,29 (2H, d, J 7,0,
CHCH_{2}Ph, X), 3,40 (1H, dd, J 14,0, 4,5,
CHCH_{A}H_{B}Ph, Y), 3,69 (3H, s, OCH_{3}, Y),
3,72 (3H, s, OCH_{3}, X), 4,30 (1H, dd, J 10,5,
10,5, CHCH(CH_{3})_{2}, Y), 4,48 (1H, dd,
J 10,5, 10,5, CHCH(CH_{3})_{2}, X),
5,05-5,19 (5H, m, OCH_{2}Ph, X & Y,
CHCH_{2}Ph, Y), 5,37 (1H, dt, J 8,0, 7,0,
CHCH_{2}Ph, X), 7,22-7,39 (20H, m,
Ar-H, X & Y), 7,69 (1H, d, J 12,5, CONH,
Y), 7,72 (1H, d, J 10,5, CONH, X), 14,61 (1H, d,
J 8,0, COCHNH, Y), 14,71 (1h, d, J 8,0,
COCHNH, X); \delta_{C} (63 MHz, DEPT, CDCl_{3}) 19,2
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), Y), 19,3 (2C,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), X & Y), 19,9
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), X), 27,4
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), Y), 27,5
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), X), 28,5
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), X), 28,6
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3}), Y), 29,1
(CH(CH_{3})_{2}, Y) 29,4
(CH(CH_{3})_{2}, X), 29,8 (2C,
C(CH_{3})_{2}, X & Y), 39,3
(CHCH_{2}Ph, Y), 39,8 (CHCH_{2}Ph, X), 52,0
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}, X), 52,1
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}, Y), 52,4
(OCH_{3}, X), 52,7 (OCH_{3}, Y), 53,4 (2C,
CH_{2}C(CH_{3})_{2}, X & Y), 55,8
(CHCH(CH_{3})_{2}, Y), 56,1
(CHCH(CH_{3})_{2}, X), 59,1
(CHCH_{2}Ph, X), 59,7 (CHCH_{2}Ph, Y), 66,5
(OCH_{2}Ph, Y), 66,6 (OCH_{2}Ph, X), 107,0
(COC=CNH, X), 107,2 (COC=CNH, Y), [127,2 (CH), 127,3
(CH), 127,6 (CH), 127,7 (CH), 127,9 (CH), 128,0 (CH), 128,2 (CH),
128,3 (CH), 128,4 (CH), 128,6 (CH), 129,2 (CH), 129,3 (CH) 20C,
Ar-H, X & Y), 134,5 (CHCH_{2}Ph, X), 135,2
(CHCH_{2}Ph,Y), 136,4 (OCH_{2}Ph, X), 136,5
(OCH_{2}Ph, Y), 156,4 (2C, OCONH, X & Y), 169,8
(COC=CNH, Y), 169,9 (COC=CNH, X), 173,0
(COOCH_{3}, X), 173,6 (COOCH_{3}, Y), 197,2 (2C,
COC=CNH, X & Y), 200,3 (2C, COC=CNH, X & Y);
MS ES (+ve) m/z obtenida 535,2 (MH^{+}, 29%), 557,1 (MNa^{+},
100); HRMS FAB (+ve) m/z obtenida 535,28083 (MH^{+}),
C_{31}H_{39}N_{2}O_{6} requiere 535,28081.
A una solución fría (-10ºC) de
terc-butiloxicarbonil-L-valina
(5,0 g, 23,0 mmol) en THF (50 ml), se añadió trietilamina (3,21 ml,
23,0 mmol) y cloroformiato de metilo (1,96 ml, 25,0 mmol). Se formó
un precipitado blanco y se añadió más THF (30 ml). Se agitó la
mezcla durante 5 min a -5ºC y se añadió dimedona (3,22 g, 23,0
mmol). Se dejó calentar la reacción a temperatura ambiente y se
agitó en continuo toda la noche. Se diluyó la mezcla con EtOAc (100
ml), se lavó con salmuera (3 \times 50 ml), se secó sobre
MgSO_{4} y se concentró a presión reducida hasta un aceite
incoloro (4,48 g). La cromatografía en columna de flash en gel de
sílice utilizando hexano/EtOAc (3:2) dio un aceite incoloro (0,29 g,
37%); Rf=0,49 hexano/EtOAc (3:2); \delta_{H} (250 MHz,
CDCl_{3}) 0,92 (3H, d, J 7,0,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 0,99 (3H, D,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 1,07
(6H, s, C(CH_{3})_{2}), 1,41 (9H, s,
C(CH_{3})_{3}), 2,16-2,21
(1H, m, CH(CH_{3})_{2}), 2,24 (2H, s,
CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 2,38 (2H, s,
CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 4,26 (1H,
dd, J 9,0, 5,0, NHCH), 4,99 (1H, d, J 9,0,
NH), 5,87 (1H, s, COCH=CO); \delta_{C} (63 MHz,
DEPT, CDCl_{3}) 17,5 (CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})),
18,9 (CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 28,0
(C(CH_{3})_{2}), 28,1
(C(CH_{3})_{3}), 30,8
(CH(CH_{3})_{2}), 33,0
(C(CH_{3})_{2}), 41,8
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 50,6
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 58,7
(NHCH), 80,1 (C(CH_{3})_{3}),
116,6 (COCH=CO), 155,5 (CONH), 67,8 (COOC=CH), 169,3 (NHCHCO), 199,1 (COCH=COCO).
116,6 (COCH=CO), 155,5 (CONH), 67,8 (COOC=CH), 169,3 (NHCHCO), 199,1 (COCH=COCO).
Se preparó según el procedimiento indicado por
Halpern, B.; James, L.B., Aust. J. Chem., 1964, 17,
1282-1287.
A una solución de dimedona (1,00 g, 7,1 mmol) en
CHCl_{3} (20 ml) se le añadió éster metílico de
L-valina. Se neutralizó la sal HCl (1,20 g, 7,1
mmol) y la suspensión mediante adición de trietilamina (1,0 ml, 7,1
mmol). Se agitó la solución resultante a temperatura ambiente toda
la noche. Se concentró a continuación la solución a presión reducida
hasta un residuo amarillo, que se disgregó con éter caliente, se
filtró y se lavo con éter para dar un sólido blanco (1,66 g). Se
disolvió el sólido en CHCl_{3}, se lavó con HCl 2N y se secó
(MgSO_{4}) antes de la concentración a presión reducida hasta un
residuo incoloro (1,02 g, 57%); Rf=0,44 DCM/MeOH (9:1);
\delta_{H} (200 MHz, CDCl_{3}) 0,92 (3H, d, J 7,0,
CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 0,94 (3H, d,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 1,06
(6H, s, C(CH_{3})_{2}),
1,82-1,95 (1H, m,
CH(CH_{3})_{2}),
2,17 (2H, s, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 2,23 (2H, s, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 3,91 (1H, dd, J 8,0, 5,0, NHCH), 4,88 (1H, d, J 8,0, NH), 5,06 (1H, s, COCH=CO); MS ES (+ve) m/z obtenida 253,9 (MH^{+}, 100%), 276,1 (MNa^{+}, 16%), 317,0 (MNa^{+}MeCN,
64%).
2,17 (2H, s, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 2,23 (2H, s, CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 3,91 (1H, dd, J 8,0, 5,0, NHCH), 4,88 (1H, d, J 8,0, NH), 5,06 (1H, s, COCH=CO); MS ES (+ve) m/z obtenida 253,9 (MH^{+}, 100%), 276,1 (MNa^{+}, 16%), 317,0 (MNa^{+}MeCN,
64%).
Este compuesto se preparó según el procedimiento
descrito por Dendrinos, K.G.; Kalivretenos, A.G., J. Chem.
Soc., Perkin Trans 1, 1998, 9, 1463-1464.
La vía mostrada en el Esquema 2 se puede ampliar
para incorporar los derivados de 4-alquil dimedona,
tal como se muestra a continuación en el Esquema 3. Los derivados de
4-alquil dimedona tal como EM 4/33/1 se pueden
preparar según el procedimiento descrito por Berry, N.M., Darey,
M.C.P., Harwood, L.M., Synthesis Commun., 1986,
476-480.
Esquema
3
\vskip1.000000\baselineskip
(mezcla
diastereomérica)
Se disolvió
N-benciloxicarbonil-L-valina
(0,20 g, 0,8 mmol) en DCM anhidro (2 ml) y se enfrió la solución a
-10ºC. Se añadieron piridina (0,06 ml, 0,8 mmol) y fluoruro
cianúrico (0,2 ml, 2,3 mmol) y la solución se volvió
naranja/amarilla. Tras agitación durante 0,5 h, la TLC DCM/MeOH
(9:1) indicó la formación del producto. Se añadió hielo machacado
junto con DCM. Se extrajo la capa acuosa con 2 \times DCM y se
lavaron las capas orgánicas combinadas con agua con hielo y se secó
sobre MgSO_{4}. Se concentró la solución a presión reducida hasta
un líquido incoloro (0,14 g), que se utilizó en la etapa siguiente
sin purificación ulterior. Se disolvio el líquido en DCM (2 ml) y EM
4/33/1 (0,09 g, 0,6 mmol) se añadió, seguido de DIPEA (0,10 ml, 0,6
mmol). Se agitó toda la noche la solución naranja/roja resultante a
temperatura ambiente, tras cuyo periodo se observó un color
azul/rosa. La TLC indicó la reacción completa de EM 4/33/1. Se
concentró la solución a presión reducida hasta un aceite azul/rosa.
La cromatografía en columna de flash sobre gel de sílice utilizando
DCM/MeOH (9:1) dio un aceite incoloro (0,17 g, 78%); Rf=0,83
DCM/MeOH (9:1); \delta_{H} (250 MHz, CDCl_{3}) 0,92 (3H, d,
J 7,0, CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 0,99
\delta_{H} (250 MHz, CDCl_{3}) 0,93-1,11 (15H,
m, CH(CH_{3})_{2},
C(CH_{3})_{2}CH(CH_{3})),
2,19-2,58 (4H, m,
CH(CH_{3})_{2},CH_{2}C(CH_{3})_{2}CH(CH_{3})),
4,38 (1H, dd, J 9,0, 5,0, NHCH), 5,11 (2H, s,
OCH_{2}Ph), 5,25 (1H, d, J 9,0, NH), 5,85
(1H, s, COCH=CO), 7,35 (5H, s, Ar-H); \delta_{C}
(63 MHz, DEPT, CDCl_{3}), 9,4 (COCHCH_{3}), 17,4
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 18,9
(CH(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 22,0
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 28,4
(C(C^{A}H_{3}C^{B}H_{3})), 31,0
(CH(CH_{3})_{2}), 35,9
(C(CH_{3})_{2}), 41,9
(CH_{2}C(CH_{3})_{2}), 51,3
(COCHCH_{3}), 59,0 (NHCH), 67,1
(OCH_{2}Ph), 116,3 (COCH=CO), [128,0 (CH), 128,2
(CH), 128,5 (CH), 5C, Ar-H], 135,9 (OCH_{2}Ph),
156,1 (CONH), 166,2 (COOC=CH), 169,1 (NHCHCO),
201,7 (COCH=COCO); MS ES (+ve) m/z obtenida 387,9 (MH^{+},
20%), 404,9 (MNH_{4}^{+}, 51%), 410,04 (MNa^{+}, 100%); HRMS
FAB (+ve) m/z obtenida 388,21228 (MH^{+}),
C_{22}H_{29}NO_{5} requiere 388,21240.
Se concentró la ciclofilina A recombinante humana
hasta 14 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 100 mM y NaN_{3} al 0,02%
(p/v). Se desarrollaron cristales de CyP-A por
difusión de vapor a 17ºC por el procedimiento de la gota pendiente.
La solución precipitante en el pocillo estaba constituida por
Tris\cdotHCl 100 mM (pH 8,0), 22% (p/v) de PEG 8000, 5% (v/v) de
DMSO y 0,02% de NaN_{3}. La gota de 8 ml inicial estaba
constituida por Tris\cdotHCl 50 mM, (pH 8,0), 11% (p/v) de PEG
8000, 2,5% (v/v) de DMSO, 0,02% de NaN_{3}, y
CyP-A 0,4 mM.
Se introdujo el ligando dentro de los cristales
de ciclofilina A humana natural que se habían desarrollado hasta
aproximadamente 0,2 mm \times 0,1 mm \times 0,1 mm. Se
transfirieron a continuación los cristales naturales a soluciones
que contenían el ligando de interés entre 20 mM y 100 mM. Se
pusieron a remojo los cristales entre 10 y 20 minutos antes de
transferirlos brevemente (20 segundos) a una solución criopectante
constituida por Tris\cdotHCl 100 mM (pH 8,0), 22% p/v de PEG 8000
y 26% de glicerol. El cristal se liofilizó a continuación
sumergiéndolo en nitrógeno líquido.
Se recogieron datos utilizando un generador con
ánodo rotativo Nonius. La resolución de los datos mejoró al recoger
el mismo cristal en Daresbury SRS (l=1,488). Las series de datos se
procesaron en DENZO y se dibujaron a escala con SCALEPACK.
Se han resuelto y purificado (parcialmente) las
estructuras por rayos-X de los tres complejos del
ligando (fórmulas mostradas a continuación y datos mostrados en la
Tabla 1). Las estructuras por rayos-X presentan de
manera inequívoca cada enlace del ligando al punto activo de la
ciclofilina A humana y proporcionan información útil acerca de qué
características son importantes para el enlace y también qué nuevos
derivados son los que producen probablemente un mejor enlace.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron estudios de caracterización
adicionales en el complejo EM2/34-ciclofilina A y en
el complejo E11-ciclofilina utilizando
espectrometría de masas con electroatomización. Los resultados se
representan en las Figuras 1 y 2.
Se adquirió ciclofilina A en Novartis AG. La
ciclosporina se adquirió en Sigma. Los análogos de ciclosporina se
adquirieron en Mutter en Suiza. El acetato de amonio se adquirió en
Sigma.
Se registraron espectros de masas ESI en un
espectrómetro de masas Micromass Platform II con interfase de
electroatomización y operado en modo ión positivo. El cuadripolo
tenía una banda ampliada a 4000 m/z. Los datos se obtuvieron en toda
la banda de 500 m/z a 3500 m/z (a menos que se indique de otro modo)
con un tiempo de exploración de 15 s. El voltaje capilar fue de 3,5
kV, el electrodo contador 0,5 kV, el voltaje del cono 50 V, el
desfase del desnatador 5 V. La temperatura de la fuente se mantuvo a
65ºC. El nebulizador y los gases del baño eran nitrógeno
suministrado a caudales de 30 y 300 l/h, respectivamente. Se
introdujeron todas las muestras utilizando una bomba de infusión de
Harvard Apparatus, a un caudal de 8 \mul/min.
Se preparó la proteína ciclofilina en Hepes 50
mM, \beta-mercaptometanol 5 mM, NaCl 0,1 mM, 1 ml
de 13 mg/ml (mediante ensayo de Bradford). Se dializó esta
preparación frente a 2 a 3 litros de acetato de amonio 10 mM, pH
6,8, ajustado mediante amoniaco. La muestra dializada se diluyó a
continuación hasta una solución madre de 100 \muM de concentración
de ciclofilina para su utilización en los experimentos. La
concentración de proteína para los experimentos era de 20 \muM a
menos que se especifique de otra manera.
Se prepararon los inhibidores hasta 1 mM en
metanol y a continuación se diluyeron hasta 10 \muM en acetato de
amonio. La concentración final del inhibidor en solución fue de 20
\muM.
A continuación en la Tabla 2 se presentan las
constantes de enlace que miden la afinidad de los compuestos
seleccionados de la invención. En cada caso, se midió la constante
de enlace por un ensayo de fluorescencia como dan a conocer, por
ejemplo, Husi, H. y Zurini, M.G.M. [Comparative binding studies
of cyclophilins to cyclosporin-A and derivatives by
fluorescence measurements, Analytical Biochemistry, 1994, 222,
251-255].
Se obtuvo la constante de disociación (K_{d})
para numerosos ligandos mediante mediciones de fluorescencia. La
ciclofilina A tiene sólo un triptófano, situado aproximadamente a
8\ring{A} del centro del punto activo formando un enlace de
hidrógeno con el inhibidor ciclosporina cuando se une. Después de
cada adición de ligando, la parte de la proteína unida es
proporcional al cambio de fluorescencia fraccionado. Se realizaron
mediciones utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin
Elmer LS50B. Los experimentos tuvieron lugar a 20ºC. Se mantuvo la
temperatura constante en el interior de la cubeta mediante un
control de temperatura. La solución de proteína se equilibró hasta
que la señal fue estable. Se utilizó una cubeta de fluorescencia de
1,4 ml (Hellma 6140F). La longitud de onda de excitación fue de 280
nm y la longitud de onda de emisión se varió desde 330 a 345 nm
según la proteína y el ligando. Las rendijas de emisión y excitación
variaron desde 2,5 a 10 nm, determinadas por parámetros
experimentales.
Se ha estimado la K_{d} (constante de
disociación) suponiendo una ocupación del 50% de la proteína al
cambio de fluorescencia fraccionada del 50%. En este punto la
concentración del ligando del enlace iguala a la proteína libre.
Para cada concentración de ligando se mide un valor de fluorescencia
y a las mismas concentraciones se toma un valor de emisión de
referencia. La diferencia entre los dos valores se calculó y se
utilizó un nuevo valor corregido para determinar gráficamente la
K_{d}.
Se utilizaron soluciones de Cyp-A
de 5 a 0,5 mM en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH=7,4. La concentración
de proteína varió según el ligando a prueba.
Se evaluó la actividad de PPIasa mediante el
ensayo enzimático acoplado a
\alpha-quimiotripsina [Determination of kinetic
constants for peptidyl cis-trans isomerase by an
improved spectrophotometric assay (1991); Kofron JL, Kuzmic P.,
Kishore V., Colón-Bonilla E. y Rich D.,
Biochemistry 30, 6127-3134]. La
\alpha-quimiotripsina hidroliza de forma selectiva
el enlace C-terminal de
p-nitroanilina del substrato solamente en el
indicador trans X-Pro. Esta hidrólisis libera un
cromóforo 4-nitroanilina, cuya acumulación se
registra midiendo la absorbancia a 400 nm en función del tiempo. El
péptido trans se escinde en el tiempo muerto, así que la escisión no
contribuye al tiempo total de reacción. Se disolvió el substrato
(solución madre de 100 mM) en LiCl/TFE. El experimento tuvo lugar a
4ºC. Se mantuvo la temperatura constante dentro de la cubeta
mediante una unidad de control de temperatura Peltier
(PTP-1). Se utilizó un mini sistema de agitación
magnético (telemoduel de Variomag) para mezclar la solución en la
cubeta tras la adición del substrato. Se utilizó un
espectrofotómetro Perkin Elmer UV/VIS Lambda 20.
Se utilizaron los siguientes materiales:
- Substrato: Suc-Ala-Ala-Pro-pNA (Bachem AG) (N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida)
- Proteínas: Se preparó solución reciente de Cyp-A antes del experimento a partir de la solución madre congelada, a la concentración apropiada por dilución en tampón Hepes 50 mM, NaCl 100 mM pH=8,0. \alpha-quimiotripsina (Sigma).
En un experimento típico se llevaron 90 \mul de
ciclofilina 2,5 a 30 nM hasta 2520 \mul con tampón A en una cubeta
de vidrio de 3 ml. La cubeta se preincubó a continuación durante 30
min en hielo. Inmediatamente antes del ensayo, se añadieron 300
\mul de solución de quimiotripsina (50 mg/ml en HCl 10 mM),
seguida de 90 \mul de una solución madre 3,7 mM de
Suc-Ala-Ala-Pro-PNA
en LiCl (470 mM)/TFE. Se controló la evolución de la reacción por el
cambio de absorbancia a 400 nm que acompaña a la hidrólisis del
enlace amida y la liberación del producto
4-nitroanilina.
En la Tabla 2 se presenta la actividad de PPIasa
de algunos de los compuestos de la presente invención. Los
compuestos con asterisco (*) no forman parte de la invención.
Se realizaron estudios adicionales de valoración
por fluorescencia para investigar la interacción con la ciclofilina
D de los compuestos de la invención seleccionados. El ensayo se
realizó según el procedimiento descrito en Maurice R. Eftink y
Camillo A. Ghiron, [Fluorescence Quenching Studies with Proteins,
Analytical Biochemistry 114, 199-227 (1981)].
Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 3, junto con
datos adicionales que muestran la actividad de la rotamasa,
determinada según el procedimiento de Kofron et al.
(ibid). Los compuestos con asterisco (*) no forman parte de
la invención.
Claims (40)
1. Compuesto de fórmula I
en la
que
(i) cuando a y c son dobles enlaces, R^{2} está
ausente, b es un enlace simple,
R^{1} es
o
(ii) cuando a y c son enlaces simples, b es un
doble enlace, y R^{1} es H,
R^{2} es
en la que X es alquilo
C_{1-6} de cadena lineal o ramificada,
-(CH_{2})_{n}Ar, cicloalquilo C_{1-6} o
-(CH_{2})_{n}R'', en la que R'' es un grupo hidrocarbilo
cíclico;
Y es una cadena lateral de aminoácido natural o
no natural;
W es OH o NHR^{3}, en la que R^{3} es
-CH(Y')CO_{2}X', en la que X' e Y' están definidas por X e
Y respectivamente, y pueden ser iguales o diferentes a X e Y
respectivamente; y
Z_{1} y Z_{2} son cada uno independientemente
H, alquilo C_{1-6} de cadena lineal o ramificada,
alquenilo C_{1-6} de cadena lineal o
ramificada,
-(CH_{2})_{n}Ar,
-(CH_{2})_{n}-CO_{2}R',
-(CH_{2})_{p}-CH=CH-(CH_{2})_{q}Ar
en la que p y q son cada uno independientemente 0 a 5, R' es alquilo
C_{1-6};
y cada n puede ser igual o diferente y es de 1 a
5.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
X y X' se seleccionan cada uno independientemente de entre metilo,
t-butilo, 2-metilpropilo, etilo,
bencilo y
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el
que X y X' son diferentes.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que Y e Y' se seleccionan cada
uno independientemente de entre metilo, bencilo, isopropilo y
2-metilpropilo.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que Y e Y' son diferentes.
6. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que Z_{1} y Z_{2} se
seleccionan cada uno independientemente de entre H, metilo, bencilo,
alilo, -CH_{2}-CO_{2}Me y
-CH_{2}-CH=CH-Ph.
7. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto es un
racemato.
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la estereoquímica del
sustituyente Y es tal que el centro quiral al que está unido esta en
la forma (S).
9. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la estereoquímica del
sustituyente Y' es tal que el centro quiral al que está unido esta
en la forma (S).
10. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, de fórmula II
11. Compuesto según la reivindicación 10, en el
que Z es H, Y es isopropilo y W es OH o NHR^{3}, en el que R^{3}
es tal como se definió en la reivindicación 1.
12. Compuesto según la reivindicación 10 u 11, en
el que W es OH o NHCH(CH_{2}Ph)CO_{2}Me.
13. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, seleccionado de entre los siguientes:
14. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, de fórmula III
15. Compuesto según la reivindicación 14, en el
que
- -
- Z_{1} y Z_{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre H o un grupo alquilo C_{1-6} lineal o ramificado;
- -
- Y es isopropilo, 2-metilpropilo o CH_{2}Ph;
- -
- X es CH_{2}Ph o un grupo alquilo C_{1-6} lineal o ramificado.
16. Compuesto según la reivindicación 14 ó 15, en
el que X es ^{t}Bu o CH_{2}Ph.
17. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, seleccionado de entre los siguientes:
18. Complejo que comprende ciclofilina y un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
19. Complejo según la reivindicación 18, en el
que la ciclofilina es la ciclofilina A, la ciclofilina D o la
ciclofilina 40.
20. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, junto con
un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
21. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula III,
comprendiendo dicho procedimiento
las etapas
de
- (i)
- hacer reaccionar un compuesto de fórmula V con un compuesto de fórmula VI para formar un compuesto de fórmula VII;
- (ii)
- transformar dicho compuesto de fórmula VII en un compuesto de fórmula VIII;
- (iii)
- hacer reaccionar dicho compuesto de fórmula VIII con un compuesto de fórmula IV
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicho compuesto de fórmula VII se transforma en un compuesto
de fórmula VIII mediante tratamiento con
(CFN)_{3}/piridina.
23. Procedimiento según la reivindicación 21 ó
22, en el que la etapa (iii) comprende hacer reaccionar un compuesto
de fórmula VIII con un compuesto de fórmula IV en presencia de
N,N'-diisopropiletilamina.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23, en el que la estereoquímica del
sustituyente Y es tal que el centro quiral al que está unido está en
la forma (S).
25. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17, para la preparación de un
medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de
trastornos inmunosupresores.
26. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17, para la preparación de un
medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de
infecciones por parásitos.
27. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17, para la preparación de un
medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de la
artritis reumatoide.
28. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17, para la preparación de un
medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de los
trastornos relacionados con el VIH.
29. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17, para la preparación de un
medicamento destinado a su utilización en el tratamiento del
cáncer.
30. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17, en un ensayo para la determinación
del enlace al sitio de enlace de PPIasa de la ciclofilina.
31. Utilización según la reivindicación 30, en el
que dicho ensayo puede identificar compuestos candidatos que
influyen en la actividad por PPIasa de la ciclofilina.
32. Utilización según la reivindicación 30 ó 31,
en la que dicho ensayo es un ensayo competitivo del enlace.
33. Utilización según la reivindicación 32, en el
que dicho ensayo competitivo del enlace comprende poner en contacto
un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 con
ciclofilina en presencia de un sustrato conocido de ciclofilina y
detector de cualquier cambio en la actividad de la ciclofilina en
dicho sustrato conocido.
\newpage
34. Procedimiento para la detección del enlace de
un ligando al sitio de enlace de PPIasa de la ciclofilina,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
- (i)
- poner en contacto un ligando con la ciclofilina en presencia de un sustrato conocido de la ciclofilina; y
- (ii)
- detectar cualquier cambio en la actividad de la actividad por PPIasa de la ciclofilina en dicho sustrato conocido;
y en el que dicho ligando es un compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
35. Procedimiento para la selección de un ligando
capaz de unirse a un dominio del enlace del ligando de una
ciclofilina, que comprende:
- (a)
- incubar una ciclofilina, un compuesto candidato y un compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17;
- (b)
- observar cualquier cambio en la constante de disociación del enlace (K_{d}) en comparación con la incubación idéntica que carece del compuesto candidato y, si la K_{d} ha disminuido,
- (c)
- preparar opcionalmente el compuesto experimental por medios convencionales.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en
el que dicho compuesto candidato se genera mediante modificación SAR
convencional de un compuesto definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17.
37. Procedimiento según la reivindicación 35 ó
36, en el que dicho procedimiento se utiliza para seleccionar un
ligando útil como inhibidor de ciclofilina.
38. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 35 a 37, en el que dicha ciclofilina es la
ciclofilina A, la ciclofilina D o la ciclofilina 40.
39. Procedimiento que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- realizar el procedimiento de ensayo según las reivindicaciones 35 a 38;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio del enlace del ligando; y
- (c)
- preparar una cantidad de dicho uno o más ligandos.
40. Procedimiento que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- realizar el procedimiento de ensayo según las reivindicaciones 35 a 38;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio del enlace del ligando.
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