CN105566447A - 一种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂及其制备方法与应用，旨提供一种具有较好抗癌效果的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂其结构式：属于药物合成技术领域。
Description
技术领域
本发明公开了一种能够诱导细胞凋亡的新型小分子抗癌药物，具体地说，是一种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂，属于医药技术领域。
背景技术
根据世界卫生组织的数据，癌症是人类死亡的主要原因之一，2012年820万人死于癌症。据估计，二十年之后癌症的发病率将从每年1400万例上升至2200万例。癌症治疗对人类来说一直是巨大的挑战，目前癌症治疗方法包括手术切除、化疗、放射性治疗、临终关怀等，但无论是哪种方式都很难彻底治愈。在过去的几十年间，随着医药技术的进步，癌症治疗手段也在不断进步和发展。但是，现有的抗癌药物有着各种各样的局限性，这也是癌症治疗中需要逾越的巨大障碍。
当今应用在癌症临床治疗的大部分细胞毒疗法(包括化疗和放射治疗)都是基于诱导癌细胞凋亡。细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，它并不是病理条件下自体损伤，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。凋亡通路功能紊乱是癌症重要的病理学特征，而癌细胞对各种细胞毒刺激产生耐受，从而使得细胞凋亡机制失效，是当今许多癌症治疗临床应用失败的原因。过去二十年的研究表明，凋亡抑制蛋白(IAPs)是细胞凋亡的关键调节子，以凋亡抑制蛋白为靶点，开发能够诱导细胞凋亡的新型小分子抗癌药物成为癌症研究的热点。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种具有较好抗癌效果的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂本发明还提供该拮抗剂的制备方法。
针对上述问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂，其结构式如式1所示：
其中：R1选自下述取代基的其中之一：
R2选自下述取代基的其中之一：
上述X选自F、Cl、Br、Me、OMe的其中之一；
Y选自S或O；
式1。
本发明的第二个技术方案是提供该凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，该方法依次包括下述步骤：
1)-10～15℃下，将甲磺酰氯、DMAP、有机碱加入至中间体A的氯代烃溶液中，搅拌2～60分钟，反应液用氯代烃稀释，依次经过弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，无需进一步纯化，得到中间体B。在-10～15℃下，将NaH加入至Boc-Cys-OH的溶液中，悬浮液搅拌1～60分钟的反应液，再将中间体B的溶液加入至反应液中，混合室温搅拌0.5～10小时，浓缩，分别收集有机相和残留液，残留液用水稀释，调节pH值至酸性，采用有机溶剂萃取后，合并有机相后，再经水洗涤，干燥，减压浓缩，所得粗产品过柱纯化，得到淡黄色油状中间体C；
其中，所述的甲磺酰氯、DMAP、中间体A、NaH、Boc-Cys-OH的摩尔比为：0.9～5：0.05～3：1：1.6～10：0.8～5；
2)将金属催化剂加入至中间体C的极性溶液中，悬浮液在H2中搅拌过夜，反应完毕后，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状中间体D；-10～15℃下，将缩合剂加入至中间体D的氯代烃溶液中，再加入有机碱，混合液室温搅拌4～72小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次经过弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，纯化，得到无色油状物中间体E；
其中：所述的缩合剂、中间体D的摩尔比为：0.8～20：1；
3)-10～15℃下，将TIPS加入至中间体E的氯代烃溶液中，再加入TFA，混合液搅拌0.5～10小时，蒸干溶剂，收集水相层，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次，再与收集到的水相层合并，干燥，得到中间体F。将其溶于MeCN/H2O中，加入Boc2O、有机碱，混合液室温搅拌过夜，浓缩，分别收集有机相和残留液，残留液用水稀释，调节pH值至酸性，采用有机溶剂萃取后，合并有机相后用水洗涤，洗剂、干燥，得到中间体G；
其中：所述的TIPS、中间体E、Boc2O摩尔比为：0.1～10：1：0.9～3；
4)-10～15℃下，将中间体G溶于有机溶剂中，加入芳香胺、缩合剂和添加剂，然后加入有机碱，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化，得到无色油状物中间体H。
其中，所述的中间体G、芳香胺、缩合剂、添加剂的摩尔比为1：0.9～10：0.9～20：0.1～20；
5)-10～15℃下，将TFA加入至中间体H的氯代烃溶液中，混合液搅拌0.1～5小时，浓缩得到中间体I；
6)-10～15℃下，将叔丁氧羰基保护的氨基酸、缩合剂和添加剂加入至中间体I的溶液中，再加入有机碱，混合液室温搅拌过夜，依次用弱酸溶液、弱碱溶液、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩得到粗产品J；-10～15℃下将此粗产品溶于氯代烃溶液中，加入TFA，混合液搅拌0.1～5小时，浓缩，再纯化，冷冻干燥，得到白色固体成品K。
其中，所述的中间体I、叔丁氧羰基保护的氨基酸、缩合剂、添加剂的摩尔比为：1：0.95～5：0.95～20：0.2～20。
优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的有机碱为三乙胺或吡啶、或DBU、或DIEA、或N-甲基吗啉。
优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的有机金属催化为雷尼镍水悬浮液、或钯催化剂。
优选的，上述的缩合剂为BOP、或DCC、或EDCI、或DIC、或PyBOP、或TBTU、或HBTU、或HATU、或TATU。
优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的添加剂为HOBt、或HOOBt、或HOSu。
优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的芳香胺为二苯基甲胺、或苯甲胺、或5,6,7,8-四氢-1-萘胺、或(R)-2,3-二氢-1H-茚-1-胺、或(S)-萘-2-基(苯基)甲胺、或2-苯基乙胺、或2-(三氟乙基)苯甲胺、或4-苯基-1,2,3,-噻二唑-5-胺、或3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-胺、或(4-氟代)苯甲胺、或(4-氯代)苯甲胺、或(4-溴代)苯甲胺、或(4-甲基)苯甲胺、或(4-甲氧基)苯甲胺、或2-呋喃甲胺、或2-噻吩甲胺。
优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的叔丁氧羰基保护的氨基酸为N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸、或(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丙酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丁酸。
优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的中间体A的结构式为：
本发明的最后一个技术方案是凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂作为抗肿瘤药物的应用。
与现有技术相比，本发明的提供的技术方案与XIAP-BIR3的结合亲和力强，是一种新型、高效的XIAP类肽拮抗剂，具有较好抗癌效果，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是化合物K1的1HNMR检测谱图；
图2是化合物K2的1HNMR检测谱图；
图3是化合物K3的1HNMR检测谱图；
图4是化合物K4的1HNMR检测谱图；
图5是化合物K5的1HNMR检测谱图；
图6是化合物K5与XIAP-BIR3竞争性结合抑制曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明。
所有试剂未经特别说明，均为市售分析纯，无进一步纯化，直接使用。无水无氧反应的玻璃仪器在使用前，在烘箱中干燥，反应在Ar保护下进行。溶剂重蒸均在Ar保护下进行，THF在金属钠和二苯甲酮的条件下干燥，二氯甲烷、乙酸乙酯用氢化钙干燥。柱层析使用63～200目硅胶，薄层层析使用MerckTLCsilicagel60F254塑料色谱板，用254nm紫外光照、或碘蒸气、或2％茚三酮的乙醇溶液显色检测。核磁共振谱使用BrukerAVANCEIII400NMR谱仪测定，化学位移值以ppm为单位记录。质谱使用LCTPremierXE型飞行时间质谱仪测定。旋光值用JASCOP-1010旋光仪测定。
高效液相色谱(HPLC)条件：(1)制备型HPLC：PerkinElmerSeries200UV/VIS检测器；PerkinElmerSeries200二相泵；真空除气器；GilsonFC203b馏分接收仪；(2)分析型HPLC：PerkinElmerSeries225自动进样器；PerkinElmerSeries220UV/VIS检测器；PerkinElmerSeries200四相泵；真空除气器。流动相：(1)流动相A：水+0.045％TFA；(2)流动相B：10％水+90％乙腈+0.038％TFA。
实施例1
中间体A的合成方法如下：
(S)-1-苄基-5-氧代吡咯烷-2-羧酸(2)
将三乙胺(38mL,0.273mol)加入至L-谷氨酸(20.0g,0.140mol)和苯甲醛(17.4g,0.160mol)的甲醇溶液(200mL)中。混合物室温搅拌1小时后，将溶液温度降低至0℃，然后将NaBH4(5.67g,0.150mol)缓慢加入至反应液中。搅拌2小时后，将反应液倒入冰的4MHCl溶液(50mL)中。将所形成的悬浮液减压浓缩和加热至固体全部溶解。冷却一段时间后，过滤得到的固体便是化合物1。无需纯化，可直接进行下一步反应。将1的水溶液(300mL)加热至回流，搅拌过夜。将反应液冷却至室温，用二氯甲烷萃取3次，有机相用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，粗产品过柱纯化(流动相：从环己烷/乙酸乙酯＝1/1至二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到无色油状物2(17.4g，三步总产率为58％)
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ11.10(br,1H),7.35-7.22(m,5H),5.17(d,J＝14.8Hz,1H),4.05-3.98(m,2H),2.70-2.61(m,1H),2.56-2.48(m,1H),2.35-2.24(m,1H),2.21-2.14(m,1H).
(S)-1-苄基-5-氧代吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(3)
在Ar保护和0℃下，将草酰氯(6.40mL,70.0mmol)的乙腈溶液(5.2mL)加入至乙腈(40mL)和DMF(15mL)的混合溶剂中，搅拌15分钟，加入化合物2(14.8g,70.0mmol)。再搅拌15分钟后，加入叔丁醇(16.2mL,0.170mol)的吡啶(16.5mL)溶液。混合液室温搅拌15小时。反应完毕后，用20％KHCO3溶液(150mL)淬灭反应。有机相用乙醚(2×150mL)萃取，然后依次用1MHCl溶液(2×100mL)、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，浓缩，所得粗产品蒸馏纯化(0.07mbar,155℃)，得到白色固体3(11.24g,60％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.25-7.12(m,5H),4.97(d,J＝14.7Hz,1H),3.88(d,J＝14.8Hz,1H),3.82-3.74(m,1H),2.51-2.42(m,1H),2.35-2.27(m,1H),2.18-2.07(m,1H),1.98-1.90(m,1H),1.35(s,9H).
(S)-1-苄基-5-硫代吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(4)
将P4S10(10.7g,20.0mmol)分三批，在2小时内加入至化合物3(10.9g,40.0mmol)的THF溶液(400mL)中。室温搅拌8小时，过滤，所得固体用乙醚(500mL)洗涤。将滤液浓缩，残留物溶于乙醚(250mL)，依次用20％KHCO3溶液(170mL)和饱和食盐水(170mL)洗涤。同时，水相再次用乙醚萃取。将有机相合并，硫酸镁干燥，减压浓缩，所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝6/1)，得到淡黄色油状物4(9.69g,83％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.37-7.28(m,5H),5.82(d,J＝14.6Hz,1H),4.29(dd,J＝14.6,0.8Hz,1H),4.16(dd,J＝9.6,3.6Hz,1H),3.21-3.05(m,2H),2.30-2.20(m,1H),2.14-2.07(m,1H),1.45(s,9H).
(S,E)-1-苄基-5-(2-甲氧基-2-氧代亚乙基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(5)
将化合物4(9.60g,30.0mmol)和溴代乙酸甲酯(6.05g,40.0mmol)溶于乙腈(27mL)中，所得混合液室温搅拌42小时，然后冷却至-5℃。在20分钟之内，将三苯基膦(13.0g,50.0mmol)的二氯甲烷溶液(200mL)加入至反应液中，接着加入三乙胺(13.8mL,100mmol)。室温搅拌30小时，有机相用1MNaH2PO4溶液(75mL)洗涤，水相再用二氯甲烷(3×20mL)萃取。合并有机相，硫酸镁干燥，减压浓缩，过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝15/1)，得到淡黄色油状物5(8.97g,82％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.36-7.19(m,5H),4.77(s,1H),4.55(d,J＝15.6Hz,1H),4.21(d,J＝15.6Hz,1H),3.96(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H),3.63(s,3H),3.46-3.38(m,1H),3.14-3.05(m,1H),2.27-2.17(m,1H),2.12-2.05(m,1H),1.43(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.43,169.89,165.42,135.88,129.04,127.94,127.91,82.36,80.57,65.42,50.41,49.75,31.30,28.23,26.64.
(2S,5R)-1-苄基-5-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(6)
将化合物5(500mg,1.50mmol)溶于乙酸乙酯(10mL)中，在Ar保护下用冷冻解冻泵循环法除气，然后加入5％Pt/C(250mg)，悬浮液在H2(3.2bar)中搅拌20小时，硅藻土过滤，滤液浓缩，得到无色油状物6(390mg,78％)。无需纯化，直接进行下一步反应。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.20(m,5H),3.86,3.80(ABq,J＝13.9Hz,2H),3.62(s,3H),3.30-3.16(m,2H),2.57(dd,J＝15.4,4.0Hz,1H),2.33(dd,J＝15.1,8.9Hz,1H),2.07-1.81(m,3H),1.70-1.61(m,1H),1.35(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ173.88,172.96,139.13,129.35,128.41,127.26,80.47,67.17,61.77,58.11,51.62,40.67,31.06,28.61,28.20.
(2S,5R)-1-苄基-5-(2-羟乙基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(A)
将LiBH4(26mg,1.20mmol)加入至化合物6(333mg,1.00mmol)的乙醚溶液(5mL)中，室温搅拌4小时。反应加入1MK2CO3溶液(10mL)淬灭，有机相用饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，减压浓缩。粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到无色油状物中间体A(221mg,72％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.22(m,5H),5.21(br,1H),4.08-3.99(m,2H),3.76-3.71(m,1H),3.56(d,J＝12.9Hz,1H),3.28(dd,J＝8.6,5.6Hz,1H),3.24-3.18(m,1H),2.11-2.02(m,2H),1.93-1.81(m,3H),1.55-1.49(m,1H),1.27(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ173.99,137.73,130.23,128.62,127.68,81.02,67.03,64.22,60.28,58.73,32.56,29.72,28.62,28.05.
实施例2(凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂K1)
(R)-3-(2-((2R,5S)-1-苄基-5-叔丁酯基)吡咯烷)乙硫基)-2-(叔丁氧基甲酰胺基)丙酸(中间体C)
-10℃下，将甲磺酰氯(174μL,2.25mmol)、DMAP(15mg,0.125mmol)、三乙胺(1mL)加入至中间体A(765mg,2.5mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)中，搅拌60分钟，反应液用二氯甲烷稀释，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩，得到中间体B。无需纯化，直接进行下一步反应。在-10℃下，将NaH(96mg,4mmol)加入至Boc-Cys-OH(443mg,2mmol)的DMF溶液(10mL)中，悬浮液搅拌60分钟。然后将B的DMF溶液(10mL)加入至反应液中，混合液室温搅拌10小时，浓缩，残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩。所得粗产品过柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到淡黄色油状物C(813mg，两步总产率为64％)。
1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.37-7.22(m,5H),4.25-4.16(m,1H),4.08(d,J＝13.4Hz,1H),3.80(d,J＝13.5Hz,1H),3.42(t,J＝8.1Hz,1H),3.11-2.97(m,2H),2.83(dd,J＝13.6,7.2Hz,1H),2.74-2.68(m,1H),2.58-2.51(m,1H),2.12-1.98(m,3H),1.86-1.58(m,3H),1.44(s,9H),1.32(s,9H)；13CNMR(100MHz,MeOD):δ175.27,173.90,157.75,136.93,131.31,129.61,129.19,83.00,80.56,68.03,66.79,58.82,55.44,35.35,34.25,30.47,29.92,29.06,28.76,28.14；MS(ESI):m/z509.3(M+H)+；[α]D 24:45.99(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-叔丁酯(中间体E)
将足量的雷尼镍的水悬浮液(活性催化剂，Ni≥89％，Al:6-9％)加入至化合物C(908mg,1.79mmol)的甲醇溶液(20mL)中，悬浮液在H2中搅拌过夜。反应完毕后，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物D(648mg,87％)。无需纯化，直接进行下一步反应。0℃下，将PyBOP(4.033g,7.75mmol)加入至化合物D(648mg,1.55mmol)的干燥二氯甲烷溶液(310mL)中，接着加入DIEA(1.5mL)。混合液室温搅拌72小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品，然后过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到无色油状物E(373mg,60％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5.96(d,J＝6.8Hz,1H),4.70-4.64(m,1H),4.60-4.55(m,1H),4.37(t,J＝8.8Hz,1H),2.97-2.90(m,2H),2.77-2.69(m,2H),2.41-2.34(m,1H),2.12-1.91(m,3H),1.81-1.65(m,2H),1.47(s,9H),1.41(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.45,169.95,154.71,81.56,79.65,60.58,56.56,55.98,38.26,36.86,31.00,30.38,28.35,28.05,26.79；ESIMS:m/z401.2(M+H)+；HRESIMSforC19H33N2O5Srequired401.2110,found:401.2107；[α]D 24:-110.23(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-二苯甲基5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(中间体H1)
0℃下，将TIPS(181μL,0.88mmol)加入至化合物E(353mg,0.88mmol)的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入TFA(8mL)的二氯甲烷溶液(4mL)。混合液搅拌0.5小时，蒸干溶剂，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次。将水相冷冻干燥，得到粗产品F。将其溶于MeCN/H2O(10mL/0.5mL)中，加入Boc2O(576mg,2.64mmol)、三乙胺(500μL)，混合液室温搅拌过夜，浓缩。残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，得到粗产品G(270mg，两步反应总产率为89％)。0℃下，将G(89mg,0.26mmol)溶于干燥的二氯甲烷(5mL)中，加入二苯基甲胺(43mg,0.23mmol)、BOP(102mg,0.23mmol)、HOBt(4mg,0.03mmol)，然后加入DIEA(0.5mL)，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到无色油状物H1(88mg,75％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.23(m,10H),6.23(d,J＝8.7Hz,1H),5.81(d,J＝7.5Hz,1H),4.77-4.67(m,2H),4.51-4.47(m,1H),2.97(dd,J＝13.9,3.4Hz,1H),2.60-2.50(m,2H),2.30(dd,J＝13.8,10.9Hz,1H),2.19-1.97(m,3H),1.84-1.74(m,2H),1.70-1.60(m,1H),1.44(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ170.98,169.62,154.67,141.88,141.17,128.64,128.51,127.75,127.53,127.29,80.12,60.24,58.11,57.03,54.35,37.57,36.16,30.95,29.66,28.36,24.39；ESIMS:m/z510.2(M+H)+；[α]D 21:-52.22(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-二苯基甲基5-((S)-2-氨基丙酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(K1)
10℃下，将TFA(0.60mL)的二氯甲烷溶液(1.0mL)加入至化合物H1(10mg,0.020mmol)的二氯甲烷溶液(2.0mL)中。混合液搅拌0.5小时，浓缩得到I1。10℃下，将Boc-Ala-OH(3.6mg,0.019mmol)、EDCI(3.6mg,0.019mmol)、HOBt(5.4mg,0.04mmol)加入至I1的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入DIEA(100μL)。混合液室温搅拌过夜，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品J1。无需纯化，10℃下将此粗产品溶于二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(600μL)的二氯甲烷溶液(1mL)。混合液搅拌1小时，浓缩，再用HPLC纯化，冷冻干燥，得到白色固体K1(7.7mg，三步总产率为68％)，检测色谱图参阅图1。
1HNMR(400MHz,D2O):δ8.67(d,J＝6.0Hz,1H),7.36-7.12(m,10H),6.01-5.99(m,1H),4.91(dd,J＝11.8,5.4Hz,1H),4.51-4.38(m,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,1H),3.06(dd,J＝13.4,5.4Hz,1H),2.79-2.66(m,2H),2.40-2.29(m,2H),2.17-2.04(m,1H),2.03-1.68(m,4H),1.43(d,J＝7.2Hz,3H)；13CNMR(100MHz,D2O):δ173.45,171.58,170.18,140.27,140.20,128.90,128.74,127.97,127.87,127.63,127.61,62.56,60.37,57.57,51.80,48.77,35.48,33.42,31.38,28.68,27.62,16.39；ESIMS:m/z481.2(M+H)+；HRESIMSforC26H33N4O3Srequired481.2273,found:481.2271
实施例3(化合物K2)
(R)-3-(2-((2R,5S)-1-苄基-5-叔丁酯基)吡咯烷)乙硫基)-2-(叔丁氧基甲酰胺基)丙酸(中间体C)
0℃下，将甲磺酰氯(387μL,5mmol)、DMAP(92mg,0.75mmol)、三乙胺(1mL)加入至中间体A(765mg,2.5mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)中，搅拌40分钟，反应液用二氯甲烷稀释，再依次用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩，得到中间体B。无需纯化，直接进行下一步反应。在0℃下，将NaH(180mg,7.5mmol)加入至Boc-Cys-OH(830mg,3.75mmol)的DMF溶液(10mL)中，悬浮液搅拌45分钟。然后将B的DMF溶液(10mL)加入至反应液中，混合液室温搅拌8小时，浓缩，残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩。所得粗产品过柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到淡黄色油状物C(919mg，两步总产率为72％)。
1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.37-7.22(m,5H),4.25-4.16(m,1H),4.08(d,J＝13.4Hz,1H),3.80(d,J＝13.5Hz,1H),3.42(t,J＝8.1Hz,1H),3.11-2.97(m,2H),2.83(dd,J＝13.6,7.2Hz,1H),2.74-2.68(m,1H),2.58-2.51(m,1H),2.12-1.98(m,3H),1.86-1.58(m,3H),1.44(s,9H),1.32(s,9H)；13CNMR(100MHz,MeOD):δ175.27,173.90,157.75,136.93,131.31,129.61,129.19,83.00,80.56,68.03,66.79,58.82,55.44,35.35,34.25,30.47,29.92,29.06,28.76,28.14；MS(ESI):m/z509.3(M+H)+；[α]D 24:45.99(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-叔丁酯(中间体E)
将足量的雷尼镍的水悬浮液(活性催化剂，Ni≥89％，Al:6-9％)加入至化合物C(908mg,1.79mmol)的甲醇溶液(20mL)中，悬浮液在H2中搅拌过夜。反应完毕后，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物D(630mg,84％)。无需纯化，直接进行下一步反应。-10℃下，将TBTU(4.977g,15.5mmol)加入至化合物D(631mg,1.51mmol)的干燥二氯甲烷溶液(310mL)中，接着加入三乙胺(1.5mL)。混合液室温搅拌24小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产品，然后过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到无色油状物E(323mg,53％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5.96(d,J＝6.8Hz,1H),4.70-4.64(m,1H),4.60-4.55(m,1H),4.37(t,J＝8.8Hz,1H),2.97-2.90(m,2H),2.77-2.69(m,2H),2.41-2.34(m,1H),2.12-1.91(m,3H),1.81-1.65(m,2H),1.47(s,9H),1.41(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.45,169.95,154.71,81.56,79.65,60.58,56.56,55.98,38.26,36.86,31.00,30.38,28.35,28.05,26.79；ESIMS:m/z401.2(M+H)+；HRESIMSforC19H33N2O5Srequired401.2110,found:401.2107；[α]D 24:-110.23(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-苯乙基5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(中间体H2)
-10℃下，将TIPS(1810μL,8.8mmol)加入至化合物E(353mg,0.88mmol)的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入TFA(8mL)的二氯甲烷溶液(4mL)。混合液搅拌5小时，蒸干溶剂，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次。将水相冷冻干燥，得到粗产品F。将其溶于MeCN/H2O(10mL/0.5mL)中，加入Boc2O(384mg,1.76mmol)、DIEA(500μL)，混合液室温搅拌过夜，浓缩。残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，得到粗产品G(265mg，两步反应总产率为88％)。-10℃下，将G(89mg,0.26mmol)溶于干燥的二氯甲烷(5mL)中，加入2-苯基乙胺(157mg,1.3mmol)、EDCI(399mg,2.08mmol)、HOBt(281mg,2.08mmol)，然后加入三乙胺(0.5mL)，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝1/1)，得到无色油状物H2(103mg,89％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.37(br,1H),7.32-7.15(m,5H),5.65(d,J＝7.9Hz,1H),4.76-4.66(m,1H),4.57(t,J＝8.2Hz,1H),4.40-4.29(m,1H),3.70-3.64(m,1H),3.51-3.40(m,1H),3.07(dd,J＝13.5,4.5Hz,1H),2.89-2.77(m,2H),2.73-2.61(m,1H),2.53-2.42(m,1H),2.32(dd,J＝13.1,11.5Hz,1H),2.25-2.13(m,2H),2.11-2.00(m,1H),1.74-1.47(m,4H),1.42(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.82,170.91,155.09,139.28,129.18,128.81,126.69,80.53,61.51,59.27,52.94,40.43,37.26,36.50,35.57,31.86,30.03,28.65,26.74；ESIMS:m/z448.2(M+H)+,470.2(M+Na)+；HRESIMSforC23H34N3O4Srequired448.2270,found:448.2276；[α]D 23:-47.82(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-苯乙基5-((S)-2-氨基丙酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(K2)
0℃下，将TFA(0.60mL)的氯仿溶液(1.0mL)加入至化合物H2(8.9mg,0.02mmol)的氯仿溶液(2.0mL)中。混合液搅拌3小时，浓缩得到I2。0℃下，将Boc-Ala-OH(7.6mg,0.04mmol)、DCC(82mg,0.4mmol)、HOSu(23mg,0.2mmol)加入至I2的氯仿溶液(4mL)中，再加入三乙胺(100μL)。混合液室温搅拌过夜，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品J2。无需纯化，0℃下将此粗产品溶于氯仿(2mL)中，加入TFA(600μL)的氯仿溶液(1mL)。混合液搅拌1小时，浓缩，再用HPLC纯化，冷冻干燥，得到白色固体K2(6.8mg，三步总产率为64％)，检测色谱图参阅图2。
1HNMR(400MHz,D2O):δ7.30-7.14(m,5H),4.85(dd,J＝11.8,5.8Hz,1H),4.33(dd,J＝11.2,8.0Hz,1H),4.23(t,J＝9.0Hz,1H),3.97(q,J＝7.1Hz,1H),3.65-3.56(m,1H),3.34-3.25(m,1H),3.07(dd,J＝13.3,5.8Hz,1H),2.83-2.66(m,2H),2.65-2.57(m,2H),2.36-2.22(m,2H),2.05-1.93(m,1H),1.75-1.59(m,3H),1.38(d,J＝7.1Hz,3H),1.21-1.08(m,1H)；13CNMR(100MHz,D2O):δ174.13,171.33,170.15,138.97,129.05,128.75,126.61,62.35,60.51,51.40,48.71,39.41,34.63,34.08,33.28,31.23,28.70,27.82,16.36；ESIMS:m/z419.2(M+H)+；HRESIMSforC21H31N4O3Srequired419.2117,found:419.2136.
实施例4(化合物K3)
(R)-3-(2-((2R,5S)-1-苄基-5-叔丁酯基)吡咯烷)乙硫基)-2-(叔丁氧基甲酰胺基)丙酸(中间体C)
5℃下，将甲磺酰氯(252μL,3.25mmol)、DMAP(306mg,2.5mmol)、三乙胺(1mL)加入至中间体A(765mg,2.5mmol)的氯仿溶液(10mL)中，搅拌30分钟，反应液用氯仿稀释，再依次用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩，得到中间体B。无需纯化，直接进行下一步反应。在5℃下，将NaH(300mg,12.5mmol)加入至Boc-Cys-OH(1383mg,6.25mmol)的DMF溶液(10mL)中，悬浮液搅拌30分钟。然后将B的DMF溶液(10mL)加入至反应液中，混合液室温搅拌5小时，浓缩，残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。水相用氯仿萃取三次，合并有机相，有机相用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。所得粗产品过柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到淡黄色油状物C(890mg，两步总产率为70％)。
1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.37-7.22(m,5H),4.25-4.16(m,1H),4.08(d,J＝13.4Hz,1H),3.80(d,J＝13.5Hz,1H),3.42(t,J＝8.1Hz,1H),3.11-2.97(m,2H),2.83(dd,J＝13.6,7.2Hz,1H),2.74-2.68(m,1H),2.58-2.51(m,1H),2.12-1.98(m,3H),1.86-1.58(m,3H),1.44(s,9H),1.32(s,9H)；13CNMR(100MHz,MeOD):δ175.27,173.90,157.75,136.93,131.31,129.61,129.19,83.00,80.56,68.03,66.79,58.82,55.44,35.35,34.25,30.47,29.92,29.06,28.76,28.14；MS(ESI):m/z509.3(M+H)+；[α]D 24:45.99(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-叔丁酯(中间体E)
将足量的20％的Pd(OH)2/C加入至化合物C(908mg,1.79mmol)的乙酸乙酯溶液(20mL)中，悬浮液在H2中搅拌过夜。反应完毕后，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物D(556mg,74％)。无需纯化，直接进行下一步反应。5℃下，将BOP(8.828g,19.95mmol)加入至化合物D(556mg,1.33mmol)的干燥氯仿溶液(310mL)中，接着加入三乙胺(1.5mL)。混合液室温搅拌42小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品，然后过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到无色油状物E(353mg,66％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5.96(d,J＝6.8Hz,1H),4.70-4.64(m,1H),4.60-4.55(m,1H),4.37(t,J＝8.8Hz,1H),2.97-2.90(m,2H),2.77-2.69(m,2H),2.41-2.34(m,1H),2.12-1.91(m,3H),1.81-1.65(m,2H),1.47(s,9H),1.41(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.45,169.95,154.71,81.56,79.65,60.58,56.56,55.98,38.26,36.86,31.00,30.38,28.35,28.05,26.79；ESIMS:m/z401.2(M+H)+；HRESIMSforC19H33N2O5Srequired401.2110,found:401.2107；[α]D 24:-110.23(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1)5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(中间体H3)
5℃下，将TIPS(18μL,0.09mmol)加入至化合物E(353mg,0.88mmol)的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入TFA(8mL)的二氯甲烷溶液(4mL)。混合液搅拌2小时，蒸干溶剂，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次。将水相冷冻干燥，得到粗产品F。将其溶于MeCN/H2O(10mL/0.5mL)中，加入Boc2O(173mg,0.79mmol)、DBU(500μL)，混合液室温搅拌过夜，浓缩。残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，得到粗产品G(256mg，两步反应总产率为94％)。5℃下，将G(89mg,0.26mmol)溶于干燥的二氯甲烷(5mL)中，加入5,6,7,8-四氢-1-萘胺(382mg,2.6mmol)、DCC(1072mg,5.2mmol)、HOSu(599mg,5.2mmol)，然后加入N-甲基吗啉(0.5mL)，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝1/1)，得到无色油状物H3(96mg,78％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.60(d,J＝8.2Hz,1H),7.23-7.04(m,4H),5.70(d,J＝7.7Hz,1H),5.18-5.09(m,1H),4.76-4.60(m,2H),4.48-4.39(m,1H),3.04(dd,J＝13.7,4.1Hz,1H),2.84-2.66(m,3H),2.50-2.31(m,3H),2.30-2.19(m,1H),2.18-2.05(m,1H),2.04-1.94(m,1H),1.92-1.69(m,6H),1.41(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ170.75,170.11,154.72,137.51,136.51,129.22,128.75,127.26,125.95,80.12,61.19,58.55,53.35,47.51,37.34,36.35,31.49,29.94,29.67,29.09,28.34,25.96,19.60；ESIMS:m/z474.2(M+H)+,496.2(M+Na)+；HRESIMSforC25H36N3O4Srequired474.2427,found:474.2447；[α]D 23:-57.60(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘)5-((S)-2-氨基丙酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(K3)
-10℃下，将TFA(0.60mL)的二氯甲烷溶液(1.0mL)加入至化合物H3(9.5mg,0.02mmol)的二氯甲烷溶液(2.0mL)中。混合液搅拌5小时，浓缩得到I3。-10℃下，将Boc-Ala-OH(11.3mg,0.06mmol)、DIC(7.6mg,0.06mmol)、HOOBt(0.7mg,0.004mmol)加入至I3的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入DIEA(100μL)。混合液室温搅拌过夜，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品J3。无需纯化，-10℃下将此粗产品溶于二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(600μL)的二氯甲烷溶液(1mL)。混合液搅拌3小时，浓缩，再用HPLC纯化，冷冻干燥，得到白色固体K3(7.8mg，三步总产率为70％)，检测色谱图参阅图3。
1HNMR(400MHz,D2O):δ8.31(d,J＝8.2Hz,1H),7.18-7.05(m,4H),4.93-4.84(m,2H),4.47-4.34(m,2H),3.98(q,J＝7.1Hz,1H),3.10(dd,J＝13.3,5.7Hz,1H),2.73-2.54(m,4H),2.48-2.35(m,2H),2.16-1.95(m,2H),1.88-1.50(m,7H),1.40(d,J＝7.1Hz,3H)；13CNMR(100MHz,D2O):δ172.94,172.86,171.49,170.22,138.32,135.01,134.97,129.30,128.82,127.76,126.23,62.64,62.61,60.56,51.47,48.71,48.01,47.91,34.86,33.17,31.40,28.90,28.71,28.32,27.88,18.92,16.38；ESIMS:m/z445.2(M+H)+；HRESIMSforC23H33N4O3Srequired445.2273,found:445.2272.
实施例5(化合物K4)
(R)-3-(2-((2R,5S)-1-苄基-5-叔丁酯基)吡咯烷)乙硫基)-2-(叔丁氧基甲酰胺基)丙酸(中间体C)
15℃下，将甲磺酰氯(677μL,8.75mmol)、DMAP(917mg,7.5mmol)、三乙胺(1.5mL)加入至中间体A(765mg,2.5mmol)的二氯甲烷溶液(15mL)中，搅拌2分钟，反应液用二氯甲烷稀释，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩，得到中间体B。无需纯化，直接进行下一步反应。在10℃下，将NaH(600mg,25mmol)加入至Boc-Cys-OH(2766mg,12.5mmol)的DMF溶液(10mL)中，悬浮液搅拌10分钟。然后将B的DMF溶液(10mL)加入至反应液中，混合液室温搅拌2小时，浓缩，残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩。所得粗产品过柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到淡黄色油状物C(950mg，两步总产率为75％)。
1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.37-7.22(m,5H),4.25-4.16(m,1H),4.08(d,J＝13.4Hz,1H),3.80(d,J＝13.5Hz,1H),3.42(t,J＝8.1Hz,1H),3.11-2.97(m,2H),2.83(dd,J＝13.6,7.2Hz,1H),2.74-2.68(m,1H),2.58-2.51(m,1H),2.12-1.98(m,3H),1.86-1.58(m,3H),1.44(s,9H),1.32(s,9H)；13CNMR(100MHz,MeOD):δ175.27,173.90,157.75,136.93,131.31,129.61,129.19,83.00,80.56,68.03,66.79,58.82,55.44,35.35,34.25,30.47,29.92,29.06,28.76,28.14；MS(ESI):m/z509.3(M+H)+；[α]D 24:45.99(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-叔丁酯(中间体E)
将足量的10％的Pd/C加入至化合物C(908mg,1.79mmol)的乙酸乙酯溶液(20mL)中，悬浮液在H2中搅拌过夜。反应完毕后，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物D(638mg,85％)。无需纯化，直接进行下一步反应。-5℃下，将BOP(542mg,1.22mmol)加入至化合物D(640mg,1.53mmol)的干燥氯仿溶液(310mL)中，接着加入DBU(1.5mL)。混合液室温搅拌36小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品，然后过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到无色油状物E(311mg,64％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5.96(d,J＝6.8Hz,1H),4.70-4.64(m,1H),4.60-4.55(m,1H),4.37(t,J＝8.8Hz,1H),2.97-2.90(m,2H),2.77-2.69(m,2H),2.41-2.34(m,1H),2.12-1.91(m,3H),1.81-1.65(m,2H),1.47(s,9H),1.41(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.45,169.95,154.71,81.56,79.65,60.58,56.56,55.98,38.26,36.86,31.00,30.38,28.35,28.05,26.79；ESIMS:m/z401.2(M+H)+；HRESIMSforC19H33N2O5Srequired401.2110,found:401.2107；[α]D 24:-110.23(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-二苯甲基5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(中间体H1)
15℃下，将TIPS(905μL,4.4mmol)加入至化合物E(353mg,0.88mmol)的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入TFA(8mL)的二氯甲烷溶液(4mL)。混合液搅拌10小时，蒸干溶剂，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次。将水相冷冻干燥，得到粗产品F。将其溶于MeCN/H2O(10mL/0.5mL)中，加入Boc2O(231mg,1.06mmol)、吡啶(500μL)，混合液室温搅拌过夜，浓缩。残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。用氯仿萃取三次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，得到粗产品G(232mg，两步反应总产率为77％)。15℃下，将G(89mg,0.26mmol)溶于干燥的二氯甲烷(5mL)中，加入二苯基甲胺(143mg,0.78mmol)、EDCI(249mg,1.3mmol)、HOOBt(212mg,1.3mmol)，然后加入DBU(0.5mL)，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到无色油状物H1(108mg,82％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.23(m,10H),6.23(d,J＝8.7Hz,1H),5.81(d,J＝7.5Hz,1H),4.77-4.67(m,2H),4.51-4.47(m,1H),2.97(dd,J＝13.9,3.4Hz,1H),2.60-2.50(m,2H),2.30(dd,J＝13.8,10.9Hz,1H),2.19-1.97(m,3H),1.84-1.74(m,2H),1.70-1.60(m,1H),1.44(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ170.98,169.62,154.67,141.88,141.17,128.64,128.51,127.75,127.53,127.29,80.12,60.24,58.11,57.03,54.35,37.57,36.16,30.95,29.66,28.36,24.39；ESIMS:m/z510.2(M+H)+；[α]D 21:-52.22(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-二苯基甲基5-((S)-2-氨基丁酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(K4)
15℃下，将TFA(0.60mL)的二氯甲烷溶液(1.0mL)加入至化合物H1(10mg,0.020mmol)的二氯甲烷溶液(2.0mL)中。混合液搅拌0.1小时，浓缩得到I1。15℃下，将(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸(20.3mg,0.1mmol)、EDCI(38.3mg,0.2mmol)、HOBt(32.4mg,0.24mmol)加入至I1的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入DIEA(100μL)。混合液室温搅拌过夜，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品J4。无需纯化，15℃下将此粗产品溶于二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(600μL)的二氯甲烷溶液(1mL)。混合液搅拌0.1小时，浓缩，再用HPLC纯化，冷冻干燥，得到白色固体K4(7.3mg，三步总产率为60％)，检测色谱图参阅图4。
1HNMR(400MHz,D2O):δ8.67(d,J＝6.6Hz,1H),7.38-7.12(m,10H),6.04-5.97(m,1H),4.94(dd,J＝11.8,5.5Hz,1H),4.52-4.39(m,2H),3.89(t,J＝6.4Hz,1H),3.06(dd,J＝13.3,5.4Hz,1H),2.80-2.65(m,2H),2.40-2.30(m,2H),2.17-1.67(m,7H),0.89(t,J＝7.5Hz,3H)；13CNMR(100MHz,D2O):δ173.44,171.33,169.40,140.26,140.18,128.90,128.73,127.97,127.86,127.64,127.62,62.52,60.42,57.55,53.93,51.69,35.47,33.38,31.41,28.64,27.64,24.32,8.23；ESIMS:m/z495.2(M+H)+；HRESIMSforC27H35N4O3Srequired495.2430,found:495.2444.
实施例7(化合物K5)
(R)-3-(2-((2R,5S)-1-苄基-5-叔丁酯基)吡咯烷)乙硫基)-2-(叔丁氧基甲酰胺基)丙酸(中间体C)
10℃下，将甲磺酰氯(967μL,12.5mmol)、DMAP(611mg,5mmol)、三乙胺(1.5mL)加入至中间体A(765mg,2.5mmol)的二氯甲烷溶液(15mL)中，搅拌20分钟，反应液用二氯甲烷稀释，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩，得到中间体B。无需纯化，直接进行下一步反应。在15℃下，将NaH(420mg,17.5mmol)加入至Boc-Cys-OH(1936mg,8.75mmol)的DMF溶液(10mL)中，悬浮液搅拌1分钟。然后将B的DMF溶液(10mL)加入至反应液中，混合液室温搅拌0.5小时，浓缩，残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩。所得粗产品过柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)，得到淡黄色油状物C(870mg，两步总产率为68％)。
1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.37-7.22(m,5H),4.25-4.16(m,1H),4.08(d,J＝13.4Hz,1H),3.80(d,J＝13.5Hz,1H),3.42(t,J＝8.1Hz,1H),3.11-2.97(m,2H),2.83(dd,J＝13.6,7.2Hz,1H),2.74-2.68(m,1H),2.58-2.51(m,1H),2.12-1.98(m,3H),1.86-1.58(m,3H),1.44(s,9H),1.32(s,9H)；13CNMR(100MHz,MeOD):δ175.27,173.90,157.75,136.93,131.31,129.61,129.19,83.00,80.56,68.03,66.79,58.82,55.44,35.35,34.25,30.47,29.92,29.06,28.76,28.14；MS(ESI):m/z509.3(M+H)+；[α]D 24:45.99(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-叔丁酯(中间体E)
将足量的雷尼镍的水悬浮液(活性催化剂，Ni≥89％，Al:6-9％)加入至化合物C(908mg,1.79mmol)的甲醇溶液(20mL)中，悬浮液在H2中搅拌过夜。反应完毕后，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物D(648mg,87％)。无需纯化，直接进行下一步反应。15℃下，将EDCI(5.943g,31mmol)加入至化合物D(648mg,1.55mmol)的干燥二氯甲烷溶液(310mL)中，接着加入N-甲基吗啉(1.5mL)。混合液室温搅拌4小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品，然后过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到无色油状物E(301mg,49％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5.96(d,J＝6.8Hz,1H),4.70-4.64(m,1H),4.60-4.55(m,1H),4.37(t,J＝8.8Hz,1H),2.97-2.90(m,2H),2.77-2.69(m,2H),2.41-2.34(m,1H),2.12-1.91(m,3H),1.81-1.65(m,2H),1.47(s,9H),1.41(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ171.45,169.95,154.71,81.56,79.65,60.58,56.56,55.98,38.26,36.86,31.00,30.38,28.35,28.05,26.79；ESIMS:m/z401.2(M+H)+；HRESIMSforC19H33N2O5Srequired401.2110,found:401.2107；[α]D 24:-110.23(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-二苯甲基5-(叔丁氧基甲酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(中间体H1)
10℃下，将TIPS(1267μL,6.16mmol)加入至化合物E(353mg,0.88mmol)的氯仿溶液(4mL)中，再加入TFA(8mL)的氯仿溶液(4mL)。混合液搅拌7小时，蒸干溶剂，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次。将水相冷冻干燥，得到粗产品F。将其溶于MeCN/H2O(10mL/0.5mL)中，加入Boc2O(307mg,1.4mmol)、三乙胺(500μL)，混合液室温搅拌过夜，浓缩。残留物用水稀释，用稀盐酸调节PH值至2。用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，得到粗产品G(287mg，两步反应总产率为95％)。10℃下，将G(89mg,0.26mmol)溶于干燥的氯仿(5mL)中，加入二苯基甲胺(381mg,2.08mmol)、DIC(394mg,3.12mmol)、HOBt(351mg,2.6mmol)，然后加入DIEA(0.5mL)，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到无色油状物H1(98mg,74％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.23(m,10H),6.23(d,J＝8.7Hz,1H),5.81(d,J＝7.5Hz,1H),4.77-4.67(m,2H),4.51-4.47(m,1H),2.97(dd,J＝13.9,3.4Hz,1H),2.60-2.50(m,2H),2.30(dd,J＝13.8,10.9Hz,1H),2.19-1.97(m,3H),1.84-1.74(m,2H),1.70-1.60(m,1H),1.44(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ170.98,169.62,154.67,141.88,141.17,128.64,128.51,127.75,127.53,127.29,80.12,60.24,58.11,57.03,54.35,37.57,36.16,30.95,29.66,28.36,24.39；ESIMS:m/z510.2(M+H)+；[α]D 21:-52.22(C1.0,CHCl3).
(5R,8S,10aR)-N-二苯基甲基5-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-6-羰基硫杂氮杂卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酰胺(K5)
5℃下，将TFA(0.60mL)的二氯甲烷溶液(1.0mL)加入至化合物H1(10mg,0.020mmol)的二氯甲烷溶液(2.0mL)中。混合液搅拌1小时，浓缩得到I1。5℃下，将(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸(6.1mg,0.03mmol)、EDCI(57.5mg,0.3mmol)、HOBt(54mg,0.4mmol)加入至I1的二氯甲烷溶液(4mL)中，再加入DIEA(100μL)。混合液室温搅拌过夜，再依次用稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品J5。无需纯化，5℃下将此粗产品溶于二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(600μL)的二氯甲烷溶液(1mL)。混合液搅拌5小时，浓缩，再用HPLC纯化，冷冻干燥，得到白色固体K5(7.5mg，三步总产率为62％)，检测色谱图参阅图5。
1HNMR(400MHz,D2O):δ8.65(d,J＝7.2Hz,1H),7.33-7.10(m,10H),6.00-5.95(m,1H),4.90(dd,J＝11.8,5.4Hz,1H),4.49-4.35(m,2H),3.86(q,J＝7.0Hz,1H),3.04(dd,J＝13.3,5.4Hz,1H),2.77-2.63(m,2H),2.57(s,3H),2.39-2.27(m,2H),2.14-1.65(m,5H),1.41(d,J＝7.1Hz,3H)；13CNMR(100MHz,D2O):δ173.40,171.30,169.30,140.23,140.17,128.87,128.72,127.94,127.84,127.60,127.57,62.52,60.34,57.54,56.79,51.84,35.45,33.39,31.40,30.90,28.67,27.60,15.14；ESIMS:m/z495.2(M+H)+；HRESIMSforC27H35N4O3Srequired495.2430,found:495.2423.
化合物K6～K64可采用与制备K1相同的方法制得，所不同是：
采用BOP、或DCC、或EDCI、或DIC、或TBTU、或HBTU、或HATU、或TATU替换实施例2中的PyBOP；
采用HOOBt、或HOSu代替实施例2中的HOBt；
采用苯甲胺、或5,6,7,8-四氢-1-萘胺、或(R)-2,3-二氢-1H-茚-1-胺、或(S)-萘-2-基(苯基)甲胺、或2-苯基乙胺、或2-(三氟乙基)苯甲胺、或4-苯基-1,2,3,-噻二唑-5-胺、或3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-胺、或(4-氟代)苯甲胺、或(4-氯代)苯甲胺、或(4-溴代)苯甲胺、或(4-甲基)苯甲胺、或(4-甲氧基)苯甲胺、或2-呋喃甲胺、或2-噻吩甲胺替换实施例2中的二苯基甲胺；
采用(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丙酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丁酸替换实施2中氨基酸为N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸。
为了更好的说明本发明的效果，下面结合给出本发明的实验证明例：
以K5为例，在荧光偏振试验中，测定K5拮抗X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的活性。
1、实验部分
1.1材料及仪器
(1)荧光标记的多肽配体
由同事合成七肽分子H-AVPFAQK-(6-FAM)-NH2，在其赖氨酸支链的ε氨基上做荧光标记。该荧光肽的结构由ESI-MS确认，经HPLC分析，其纯度高于98％。荧光肽溶于超纯水中，其溶液浓度经紫外吸收法确定为467μM。溶液每10μL分装，用锡纸包裹避光，-20℃保存。
(2)XIAP-BIR3重组蛋白
XIAP-BIR3重组蛋白购于R&DSystemsInc.。蛋白是大肠杆菌来源的，含Asn252-Thr356残基，带一个N端Met和6-His标签。每50μg分装，-20℃下保存在50μL的pH值为8.0，含50mMTris–HCl、300mMKCl、50μM醋酸锌、1mMDTT的缓冲溶液中。
(3)反应缓冲液
本测试使用的反应缓冲液包含20mMHepes、2mMdithiothreitol(DTT)、100mMNaCl、0.1％Bovineserumalbumin(BSA)，pH仪调节其pH值至7.4。所用试剂均购于Sigma-Aldrich公司，纯度为最高级别。
(4)样品溶液的配制
将化合物K5溶于超纯水，配制为10mM的母液，然后将母液稀释至所需浓度。
(5)实验仪器
PerkinElmerEnVision多标记微孔板检测仪(EnVisionMultilabelReader)，pH计，紫外吸收检测仪，384孔检测板。
1.2实验方法
(1)准备384孔检测板
首先，将2.5nM的荧光肽和250nM的XIAP-BIR3蛋白加入至反应缓冲液中，形成测试缓冲溶液，并孵化半小时。与此同时，将样品母液稀释成一系列浓度，浓度范围为5mM至5nM。
然后，在384孔检测板上，每一个浓度点三个重复样。首先，用移液枪向384孔检测板的孔中加入16μL的测试缓冲溶液，再加入4μL样品溶液。混合之后，孔中溶液体积变为20μL，于是，荧光肽和XIAP-BIR3的浓度分别变为最佳测试浓度，即2nM和200nM。样品的最终浓度变为1mM至1nM。将384孔检测板室温孵化20～30分钟，用微孔板检测仪读数。然后将检测板再孵化20～30分钟，再次读数。
(2)数据处理
所有数据均运用GraphPadPrism的非线性回归曲线拟合程序分析。
1.3结果与讨论
荧光肽和XIAP-BIR3蛋白的最终测试浓度分别固定为2nM和200nM，所测试样品的最终浓度范围为1mM至1nM。化合物K5与XIAP-BIR3竞争性结合抑制曲线如图6所示，以mP值为Y轴，logC为X轴(C为测试样品的浓度)。结果表明，化合物K5具有较好的与XIAP-BIR3的结合亲和力。由于化合物K5对XIAP-BIR3竞争性结合抑制，其结合曲线为S型，即mP值随测试样品浓度的增加而减小，当样品浓度足够低时，mP值达到最大值，不再变化。反之，当样品浓度足够高时，mP值达到最小值，抑制饱和。所测数据经GraphPadPrism分析，得出化合物K5的IC50值为0.4μM，在同样的条件下，阳性对照物——四肽分子AVPI(Ala-Val-Pro-Ile)的IC50值为0.8μM。荧光偏振试验结果表明，化合物K5是一种新型、高效的XIAP类肽拮抗剂。
缩略词表(按字母顺序)
Claims (10)
1.一种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂，其特征在于，其结构式如式1所示：
其中：
R1选自下述取代基的其中之一：
R2选自下述取代基的其中之一：
上述X选自F、Cl、Br、Me、OMe的其中之一；
Y选自S或O；
式1。
2.制备权利要求1所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的方法，其特征在于，依次包括下述方法：
1)-10～15℃下，将甲磺酰氯、DMAP、有机碱加入至中间体A的氯代烃溶液中，搅拌2～60分钟，反应液用氯代烃稀释，依次经过弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，无需进一步纯化，得到中间体B；在-10～15℃下，将NaH加入至Boc-Cys-OH的溶液中，悬浮液搅拌1～60分钟的反应液，再将中间体B的溶液加入至反应液中，混合室温搅拌0.5～10小时，浓缩，分别收集有机相和残留液，残留液用水稀释，调节pH值至酸性，采用有机溶剂萃取后，合并有机相后，再经水洗涤，干燥，减压浓缩，所得粗产品过柱纯化，得到淡黄色油状中间体C；
其中，所述的甲磺酰氯、DMAP、中间体A、NaH、Boc-Cys-OH的摩尔比为：0.9～5：0.05～3：1：1.6～10：0.8～5；
2)将金属催化剂加入至中间体C的极性溶液中，悬浮液在H2中搅拌过夜，反应完毕后，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状中间体D；-10～15℃下，将缩合剂加入至中间体D的氯代烃溶液中，再加入有机碱，混合液室温搅拌4～72小时，反应完毕后，将反应液浓缩至一半体积，依次经过弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，纯化，得到无色油状物中间体E；
其中，所述的缩合剂、中间体D的摩尔比为：0.8～20：1；
3)-10～15℃下，将TIPS加入至中间体E的氯代烃溶液中，再加入TFA，混合液搅拌0.5～10小时，蒸干溶剂，收集水相层，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次，再与收集到的水相层合并，干燥，得到中间体F；将其溶于MeCN/H2O中，加入Boc2O、有机碱，混合液室温搅拌过夜，浓缩，分别收集有机相和残留液，残留液用水稀释，调节pH值至酸性，采用有机溶剂萃取后，合并有机相后用水洗涤，洗剂、干燥，得到中间体G；
其中：所述的TIPS、中间体E、Boc2O摩尔比为：0.1～10：1：0.9～3；
4)-10～15℃下，将中间体G溶于有机溶剂中，加入芳香胺、缩合剂和添加剂，然后加入有机碱，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩所得粗产品过柱纯化，得到无色油状物中间体H；
其中，所述的中间体G、芳香胺、缩合剂、添加剂的摩尔比为1：0.9～10：0.9～20：0.1～20；
5)-10～15℃下，将TFA加入至中间体H的氯代烃溶液中，混合液搅拌0.1～5小时，浓缩得到中间体I；
6)-10～15℃下，将叔丁氧羰基保护的氨基酸、缩合剂和添加剂加入至中间体I的溶液中，再加入有机碱，混合液室温搅拌过夜，依次用弱酸溶液、弱碱溶液、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩得到粗产品J；-10～15℃下将此粗产品溶于氯代烃溶液中，加入TFA，混合液搅拌0.1～5小时，浓缩，再纯化，冷冻干燥，得到白色固体成品K；
其中，所述的中间体I、叔丁氧羰基保护的氨基酸、缩合剂、添加剂的摩尔比为：1：0.95～5：0.95～20：0.2～20。
3.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的有机碱为三乙胺、或吡啶、或DBU、或DIEA、或N-甲基吗啉。
4.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的有机金属催化为雷尼镍水悬浮液、或钯催化剂。
5.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为BOP、或DCC、或EDCI、或DIC、或PyBOP、或TBTU、或HBTU、或HATU、或TATU。
6.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的添加剂为HOBt、或HOOBt、或HOSu。
7.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的芳香胺为二苯基甲胺、或苯甲胺、或5,6,7,8-四氢-1-萘胺、或(R)-2,3-二氢-1H-茚-1-胺、或(S)-萘-2-基(苯基)甲胺、或2-苯基乙胺、或2-(三氟乙基)苯甲胺、或4-苯基-1,2,3,-噻二唑-5-胺、或3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-胺、或(4-氟代)苯甲胺、或(4-氯代)苯甲胺、或(4-溴代)苯甲胺、或(4-甲基)苯甲胺、或(4-甲氧基)苯甲胺、或2-呋喃甲胺、或2-噻吩甲胺。
8.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的叔丁氧羰基保护的氨基酸为N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸、或(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丙酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丁酸。
9.根据权利要求2所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述的中间体A的结构式为：
10.权利要求1所述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂作为抗肿瘤药物的应用。
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