JP7444363B2 - ２－（２－オキソ－４－置換ピペラジニル）シクロアルキルカルバメート化合物又はその塩、当該化合物を用いる鏡像異性体の分析方法 - Google Patents
２－（２－オキソ－４－置換ピペラジニル）シクロアルキルカルバメート化合物又はその塩、当該化合物を用いる鏡像異性体の分析方法 Download PDFInfo
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- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
本発明は、2-(2-オキソ-4-置換ピペラジニル)シクロアルキルカルバメート化合物又はその塩、及び鏡像異性体の分析方法に関する。
生体内には様々なキラル化合物が存在しており、それらの鏡像異性体の一方と他方とで生体内での機能が異なることが多々ある。従って、鏡像異性体を区別するキラル分析技術が求められている。
例えば、生体内のアミノ酸は通常Ｌ体と考えられていたが、近年の分析技術の進展に伴い、微生物、植物を始め、哺乳動物にも様々なＤ－アミノ酸が少なからず存在していることが明らかになった。Ｄ－アミノ酸はＬ－アミノ酸とは異なる機能を有し、新しい生理活性物質として診断マーカや創薬ターゲットとして注目されていると共に、様々なＤ－アミノ酸に関する基礎応用両面の総合的研究も進展しつつある。そこで、タンパク構成アミノ酸をはじめとする、Ｄ,Ｌ－アミノ酸の効率的な一斉分析法が求められている。しかし、鏡像異性体は生理活性等が異なっていても、旋光性（±）以外の物理的性質等は同等であるため、複数のキラル化合物の鏡像異性体を同一分析条件で一斉に分離・検出して識別することは容易ではない。
かかる状況において、二次元HPLC法（特許文献1、非特許文献1）、非誘導体化LC-MS/MS法（非特許文献2）等、様々なＤ,Ｌ－アミノ酸の分析法の研究が進められている。また、酵素法においては迅速な分析を期待出来るが、一般に複数の各D-アミノ酸を一斉分析するには適していない。二次元HPLC法は、アミノ酸の蛍光誘導体を逆相カラムと光学分割カラムを連結した二次元HPLCで分離して蛍光検出する方法であり、従来より広く知られている。しかしかかる方法は、蛍光検出であるため選択性が低く、長い分析時間を要することが課題点となっている。また、アミノ酸を誘導体化せずに光学分割カラムでキラル分離するLC-MS/MS法は、プロリン以外の微量Ｄ－アミノ酸を短時間で一斉に分離・検出できるもののマトリックス効果や生体試料由来の夾雑成分の妨害を受けやすく、感度不足となるケースが懸念される。
また、鏡像異性体の関係にあるアミノ酸をキラル誘導体化試薬と反応させ、ジアステレオマーの関係にある誘導体に変換することで(キラルでないカラムの)LC-MS/MS法で分離・検出するキラル誘導体化法（特許文献2、非特許文献3）も知られている。かかる方法は、誘導体化による高感度化、さらに夾雑成分の分離・影響緩和やジアステレオマーの関係にある各誘導体の一斉分離に有利である。キラル誘導体化法において、タンパク構成アミノ酸を一斉にキラル分離し検出することを可能にする優れたキラル誘導体化試薬は数えるほどの報告例があるにすぎない。かかる方法においても、Ｄ－スレオニンとＤ－アロスレオニンのような立体異性体の各誘導体においては構造差異が現れにくく、分離は困難である。このような立体異性体の誘導体も分離出来ることが理想的であり改善の余地はある。また、微量のサンプル注入量で測定可能な通常のキャピラリー電気泳動(CE)で分析するには、疎水性構造の大きな誘導体化試薬及びその誘導体の水溶性が十分ではなく、キラル分離に関しても困難であると思われる。よって、Ｄ－スレオニンとＤ－アロスレオニンのような異性体の誘導体の分離・検出も可能にし、キャピラリー電気泳動(CE)によるキラル分析にも適応可能な新たなキラル誘導体化試薬の開発が望まれている。
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Devine W. D., Diaz-Gonzalez R., Ceballos-Perez G., Rojas D., Satoh T., Tear W., Ranade R. M., Barros-ine, (±)‐Anagyrine, and (±)‐Thermopsinedetection of proteinogenic a. From Cells to Mice to Target: Characterization of NEU-1053 (SB-443342) and Its Analogues for Treatment of Human African Trypanosomiasis, ACS infectious diseases 3, 225-236 (2017).
本発明は、鏡像異性体の一斉分析をすることができる新たな分析方法を提供することを課題とする。
かかる状況の下、本発明者らは、鋭意検討した結果、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を用いることにより、かかる課題を解決し得ることを見出した。従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
［式中、Ｒ１は求核性化合物と反応する基を示す。Ｒ２はアルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基又は二環式炭化水素基を示す。ｍは１～２の自然数を示す。ｎは１又は２を示す。ｎが２の場合、２つのＲ２は共にメチル基を示す。
は、
を示す。
は、
を示す。］
項１．一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
項２．Ｒ２がアルキル基である、項１に記載の化合物又はその塩。
項３．ｍが２である、項１に記載の化合物又はその塩。
項４．被検体試料に項１～３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を添加して、当該被検体試料が互いに鏡像異性体である化合物の対、又は該鏡像異性体のうち一方の化合物を含む場合に、該鏡像異性体の対又はその一方の化合物と項１～３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩とを反応させて誘導体混合物を生成する工程、及び
該誘導体を分離し検出する工程
を含む、鏡像異性体の分析方法。
該誘導体を分離し検出する工程
を含む、鏡像異性体の分析方法。
項５．互いに鏡像異性体である化合物の対がL-アミノ酸とD-アミノ酸である、項４に記載の方法。
本発明によれば、鏡像異性体の一斉分析をすることができる新たな分析方法を提供することができる。鏡像異性体の対を一斉分析により同時に検出できるため、サンプル中の鏡像異性体を効率的に分析できる。
2-(2-オキソ-4-置換ピペラジニル)シクロアルキルカルバメート化合物又はその塩
本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
［式中、Ｒ１は求核性化合物と反応する基を示す。Ｒ２はアルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基又は二環式炭化水素基を示す。ｍは１～２の自然数を示す。ｎは１又は２を示す。ｎが２の場合、２つのＲ２は共にメチル基を示す。
は、
を示す。
は、
を示す。］
を提供する。本明細書において、一般式（Ｉ）で表される化合物を単に化合物（Ｉ）と表すことがある。
本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
を提供する。本明細書において、一般式（Ｉ）で表される化合物を単に化合物（Ｉ）と表すことがある。
前記一般式（１）において示される各基は、具体的には次の通りである：
アルキル基は、直鎖又は分枝鎖状の飽和炭化水素を示し、例えば、炭素数１～１０（好ましくは炭素数１～８、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４、さらに好ましくは炭素数１）の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基等を挙げることができる。より具体的には、アルキル基には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル基等が包含される。
アルキル基は、直鎖又は分枝鎖状の飽和炭化水素を示し、例えば、炭素数１～１０（好ましくは炭素数１～８、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４、さらに好ましくは炭素数１）の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基等を挙げることができる。より具体的には、アルキル基には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル基等が包含される。
シクロアルキル基は、二重結合、三重結合及び橋架け構造を有さない環状の炭化水素基を示し、例えば、炭素数３～７（好ましくは炭素数５～６）のシクロアルキル等を挙げることができる。より具体的には、シクロペンチル、シクロヘキシル基等が包含される。
アリール基としては、例えば、単環式又は二環式の芳香族環基が挙げられ、具体的には、フェニル基、トルイル基、キシリル基、ナフチル基等が挙げられる。
アラルキル基は、１個の上記アリール基で置換された上記アルキル基を示し、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、５－フェニルペンチル基等が挙げられる。
アリール基としては、例えば、単環式又は二環式の芳香族環基が挙げられ、具体的には、フェニル基、トルイル基、キシリル基、ナフチル基等が挙げられる。
アラルキル基は、１個の上記アリール基で置換された上記アルキル基を示し、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、５－フェニルペンチル基等が挙げられる。
二環式炭化水素基は、２つの単環式炭化水素が縮合してなる二環式炭化水素から１個の水素が脱離した一価の基を意味し、典型的には、二環式炭化水素基は少なくとも１個（好ましくは１～５個、より好ましくは２～４個）の二重結合を有する。二環式炭化水素基の炭素数は限定されないが、例えば、炭素数７～１１、好ましくは炭素数８～１０、より好ましくは炭素数９のものが挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、二環式炭化水素基としては、ベンゼン環と飽和炭化水素環（例えば、炭素数３～７、好ましくは炭素数４～６、より好ましくは炭素数５の飽和炭化水素環）との縮合環から１個の水素が脱離した一価の基が好ましい。二環式炭化水素基がベンゼン環と飽和炭化水素環との縮合環から１個の水素が脱離した一価の基である場合、一般式（Ｉ）におけるオキソピペラジニル基に対し、当該縮合環のうちベンゼン環側ではなく飽和炭化水素環側で結合することが好ましい。二環式炭化水素基としては、例えば、インダニル基（２－インダニル基等）、テトラリン基（１－テトラリン基等）等が挙げられ、インダニル基等が好ましい。
一般式（Ｉ）においてＲ１は求核性化合物と反応する基を示す。求核性化合物とは、求核性官能基を有する化合物を示し、典型的には、１級アミン・２級アミン・チオール・アルコキシド・ヒドロキシドのような構造を有する化合物が挙げられる。また、本発明においては、求核性化合物としては不斉炭素等のキラル要素を有するものが好ましい。より具体的には、求核性化合物としては、例えば、アミノ酸（好ましくはαアミノ酸）、オリゴペプチド、アルカロイド、アミノ糖、アミノアルコール、スフィンゴ脂質等が挙げられる。求核性化合物と反応する基としては、上記求核性化合物（例えば、αアミノ酸、より具体的にはＤＬ－アスパラギン等）と反応して、求核置換反応により脱離し得る基が挙げられる。より具体的には、求核性化合物と反応する基としては、電子吸引性置換基を有し、脱離化学種のアニオンの安定性が高い基が挙げられ、より具体的には、例えば、２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ基、ｐ－ニトロフェニルオキシ基、パーフルオロフェニルオキシ基等が包含される。
ｎが１を示す場合、Ｒ２はアルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基又は二環式炭化水素基を示し、好ましくはアルキル基である。ｍは１～２の自然数を示し、好ましくは２である。ｎは１又は２を示す。
一般式（Ｉ）において
は、
を示し、
が好ましい。
一般式（Ｉ）において
は、
を示す。一般式（Ｉ）がトランス型の場合、一般式（Ｉ）に含まれるオキソピペラジニル基の配向は
であることが好ましい。一方、一般式（Ｉ）がシス型の場合、一般式（Ｉ）に含まれるオキソピペラジニル基の配向は
であることが好ましい。
一般式（I）で表される化合物の塩としては、酸付加塩、４級アンモニウム塩等が挙げられる。酸付加塩としては、特に限定されないが、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩；グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩等が挙げられる。また、本発明の有効成分である一般式（１）で表される化合物がカチオンすなわち４級アンモニウムである場合、一般式（１）で表される化合物の塩には、ハロゲン化物（ヨウ化物、塩化物等）、等も包含される。
本発明の化合物（Ｉ）又はその塩は、後述する鏡像異性体の分析方法等に用いることができる。本発明によれば、一般式（Ｉ）で表される構造上の特徴により、試料中に、互いに鏡像異性体である化合物の対、もしくは一方の鏡像異性体のみを含む場合、それらに含まれる鏡像異性体を分離、もしくは識別し、検出することができる。また、本発明によれば、複数のキラル化合物のそれぞれの鏡像異性体の対、もしくは一方の鏡像異性体のみを含む混合物について、それらに含まれる鏡像異性体を同一分析条件で一斉分析することができるため有用である。特に、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩を用いるキラル誘導体化法は、タンパク構成キラルアミノ酸を液体クロマトグラフィー質量分析法によって一斉にＤＬ分離し検出することが出来る。さらに、従来のキラル誘導体化法では分析が困難であったD,L-スレオニンとD,L-アロスレオニンの4異性体をすべて分離・検出することも出来るため有用である。また、アミノ酸の種類によっては、通常のキャピラリー電気泳動質量分析法によるキラル分析も出来る。
本発明の化合物（Ｉ）又はその塩において
の部分が分析対象となる鏡像異性体と反応して結合する反応活性基となる。
また、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩において
の部分は、光学活性なシクロアルカン構造を有し、キラル分離に有効な空間的に広いキラル環境を提供するキラルセレクターの基盤構造になると考えられる。
また、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩において、
の部分は、質量分析計を用いる分析において、高いイオン化効率を期待できるため高感度検出に寄与するものと考えられる。
また、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩において
また、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩において、
本発明において、一般式（１）で表される化合物のうちtrans-型は、例えば、下記反応式により製造することができるが、当該化合物の製法は以下に限られない。
［式中、Ｒ１、Ｒ２
、ｍは前記に同じ。
は、
を示す。］
上記反応式において、まず、化合物１と化合物２とを反応させて、化合物３を生成する。当該反応において、化合物１と化合物２との使用割合は特に限定されないが、化合物１が水溶性の場合、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．５：１．０、好ましくは１．０：１．０～１．１５：１．０、化合物１が非水溶性かつ高沸点の場合、１．０：１．０～１．０：１．５、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．１５の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～５０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは４～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、塩基として、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ），Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）等を用いてもよい。これらの塩基を用いる場合、その量は化合物１よりも多く加える必要があり、例えば、化合物１とのモル比で、１．０：１．１～１．０：２．０、好ましくは１．０：１．１～１．０：１．３の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
また、上記反応式においては、化合物４と２－Ｎｉｔｒｏbｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＮｓＣｌ）とを反応させてノシル基を付加し、化合物５を生成する。当該反応において、化合物４とＮｓＣｌとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．０：１．２、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．１の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは４～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、塩基として、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＰＥＡ等を用いてもよい。これらの塩基を用いる場合、その量はＮｓＣｌよりも多く加える必要があり、例えば、1．１～２．０モル当量、好ましくは１．１～１．３モル当量の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
次に、上記反応式においては、化合物３と化合物５とを反応させて化合物６を生成する。当該反応において、化合物３と化合物５との使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．５：１．０、好ましくは１．０：１．０～１．３：１．０の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは４～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ＤＭＦ、酢酸エチル等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、当該反応は、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）及びトリフェニルホスフィン（Ｐｈ３Ｐ）の存在下で行うことができる。ＤＩＡＤの量は、限定されないが、例えば、化合物５とのモル比で、１．０：１．０～１．０：１．４、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．２の範囲で適宜設定できる。Ｐｈ３Ｐの量は、限定されないが、化合物５とのモル比で、１．０：１．０～１．０：１．４、好ましくはＤＩＡＤと同じモル量で適宜設定できる。
次に、上記反応式においては、化合物６に塩基およびチオフェノールを作用させてノシル基を脱離して、化合物７を生成する。チオフェノールの量は、限定されないが、化合物６とのモル比で、例えば、１．０：１．０～１．０：４．０、好ましくは１．０：１．５～１．０：２．５の範囲で適宜設定できる。塩基として、Ｋ２ＣＯ３、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等を用いることができる。これらの塩基を用いる場合、その量は、チオフェノールのモル量と同じかそれ以上、例えば、チオフェノールとのモル比で、１．０：１．０～１．０：４．０、好ましくは１．０：１．０～１．０：２．５の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、２５～６０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは２～６時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
次に、上記反応式においては、化合物７を酸の存在下で加熱して環形成させて、化合物8を生成する。酸として、酢酸を用いることができる。トリフルオロ酢酸やパラトルエンスルホン酸等の強酸はＢｏｃ基が脱保護されるため使用できない．酢酸の量は、限定されないが、化合物７とのモル比で、例えば、１．０：０．５～１．０：２．０、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．５の範囲で適宜設定できる。反応温度は、例えば、７０～１１０℃、好ましくは１００～１１０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１２～４８時間、好ましくは１２～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
次に、上記反応式においては、化合物８を脱保護して、化合物９を生成する。酸として、４Ｎ塩酸ジオキサン溶液、トリフルオロ酢酸等を用いることができる。これらの酸の量は、化合物8のモル量より大過剰必要とし、例えば、モル比で、１：５～１：２０、好ましくは１：１０～１：２０の範囲で適宜設定できる。反応温度は特に限定されないが、例えば、０～２５℃、好ましくは０～１０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１～４時間、好ましくは２～４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、ジオキサン等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。中和用の塩基として、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＰＥＡ等を用いることができる。これらの塩基の量は、化合物８のモル量より大過剰必要とし、例えば、１：２～１：１０、好ましくは１：５～１：１０の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。中和処理の後、濃縮して過剰な塩基を除去し、アミノ置換シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＷＡＫＯＧＥＬ（登録商標）５０ＮＨ２）にて脱塩処理を行う。
次に、上記反応式においては、化合物９と化合物１０とを反応させて、一般式（Ｉ）’で表される化合物を生成する。当該反応において、化合物９と化合物１０との使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：０．７～１．０：１．３、好ましくは１．０：０．８～１．０：１．１の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは０～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは４～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、当該反応は、特に化合物１０がＤｉ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＳＣ）の場合、反応性を向上させるためにルイス酸である過塩素酸リチウムの存在下で行うことができる。過塩素酸リチウムの量は、限定されないが、例えば、化合物９とのモル比で、１．０：０．１～１．０：０．８、好ましくは１．０：０．１～１．０：０．２の範囲で適宜設定できる。
また、上記反応式においては、一般式（Ｉ）’’で表される化合物とヨウ化メチルとを反応させて、一般式（Ｉ）’’’で表される化合物のヨウ化物を得ることができる。ここで、一般式（Ｉ）’’で表される化合物は、一般式（Ｉ）’においてＲ２がメチル基である化合物に相当する。当該反応において、一般式（Ｉ）’’で表される化合物とヨウ化メチルとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１：１０～１：４０、好ましくは、１：１０～１：２０の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは０～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１２～４８時間、好ましくは１２～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
本発明において、一般式（１）で表される化合物のうちcis-型は、例えば、下記反応式により製造することができるが、当該化合物の製法は以下に限られない。
［式中、Ｒ１、Ｒ２
、ｍは前記に同じ。
は、
を示す。］。
上記反応式において、まず、化合物３とＮ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）とを反応させて、化合物１１を生成する。当該反応において、化合物３とＮＢＳとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．０：１．５、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．２の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、－１０～２５℃、好ましくは０～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１０～６０分間、好ましくは２０～３０分間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ＤＭＦ等を用いることができる。当該反応はＰｈ３Ｐの存在下で行うことができる。Ｐｈ３Ｐの量は、限定されないが、例えば、化合物３とのモル比で、１．０：１．０～１．０：１．５、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．２の範囲で適宜設定できる。
また、上記反応式においては、化合物１２とジベンジルジカーボネート（Ｃｂｚ２Ｏ）とを反応させて化合物１３を生成する。当該反応において、化合物１２とＣｂｚ２Ｏとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．０：１．５、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．２の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～３０℃、好ましくは１５～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、８～２４時間、好ましくは１２～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ＤＭＦ等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、塩基として、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＰＥＡ等を用いてもよい。これらの塩基を用いる場合、その量は化合物１２よりも多く加える必要があり、例えば化合物１２とのモル比で、１．０：１．１～１．０：２．０、好ましくは１．０：１．３～１．０：１．５の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
また、上記反応式においては、化合物１２とジベンジルジカーボネート（Ｃｂｚ２Ｏ）とを反応させて化合物１３を生成する。当該反応において、化合物１２とＣｂｚ２Ｏとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．０：１．５、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．２の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～３０℃、好ましくは１５～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、８～２４時間、好ましくは１２～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ＤＭＦ等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、塩基として、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＰＥＡ等を用いてもよい。これらの塩基を用いる場合、その量は化合物１２よりも多く加える必要があり、例えば化合物１２とのモル比で、１．０：１．１～１．０：２．０、好ましくは１．０：１．３～１．０：１．５の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
次に、上記反応式においては、化合物１３と４Ｎ塩酸ジオキサン溶液とを反応させて脱Ｂｏｃ化した後、精製せずにＮｓＣｌとを反応させてノシル基を付加し、化合物１４を生成する。当該反応において、化合物１３の脱Ｂｏｃ体（塩酸塩）とＮｓＣｌとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．０：１．２、好ましくは１．０：１．０～１．０：１．１の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは４～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ＤＭＦ等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、塩基として、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＰＥＡ等を用いてもよい。これらの塩基を用いる場合、その量は例えば、２．１～３．０モル当量、好ましくは２．１～２．３モル当量の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
次に、上記反応式においては、化合物１４と化合物１１とを反応させて化合物１５を生成する。当該反応において、化合物１４と化合物１１との使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：１．０～１．０：２．５、好ましくは１．０：１．０～１．０：２．０の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～６０℃、好ましくは２５～６０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１～２４時間、好ましくは１～４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。塩基として、Ｋ２ＣＯ３、Ｅｔ３Ｎ等を用いることができる。これらの塩基を用いる場合、その量は、限定されないが、例えば化合物１４とのモル比で、１．０：１．５～１．０：３．０、好ましくは１．０：１．５～１．０：２．０の範囲で適宜設定できる。
次に、上記反応式においては、化合物１５に塩基およびチオフェノールを作用させてノシル基を脱離して、化合物１６を生成する。チオフェノールの量は、限定されないが、化合物１５とのモル比で、例えば、１．０：１．０～１．０：４．０、好ましくは１．０：１．５～１．０：２．５の範囲で適宜設定できる。塩基として、Ｋ２ＣＯ３、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等を用いることができる。これらの塩基を用いる場合、その量は、チオフェノールのモル量と同じかそれ以上、例えば、チオフェノールとのモル比で、１．０：１．０～１．０：４．０、好ましくは１．０：１．０～１．０：２．５の範囲で適宜設定できる。これらの塩基を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。反応温度は特に限定されないが、例えば、２５～６０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは２～６時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
次に、上記反応式においては、酸の存在下で化合物１６のｔｅｒｔ－ブチルエステルを脱保護した後、精製せずに塩化チオニルにより酸クロリド化し、そのまま環形成させて、化合物１７を生成する。酸としては、溶媒としても利用でき、減圧により容易に除去可能なトリフルオロ酢酸が望ましい。トリフルオロ酢酸の量は、限定されないが、例えば化合物１６とのモル比で、１：１００～１：２００、好ましくは１：１００～１：１５０の範囲で適宜設定できる。反応温度は特に限定されないが、例えば、０～３０℃、好ましくは０～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１～６時間、好ましくは１～２時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸を用いることができる。酸クロリド化と続く環化反応においては、塩化チオニルの量は、限定されないが、例えば化合物１６とのモル比で、１：８～１：２０、好ましくは１：１０～１：１２の範囲で適宜設定できる。酸クロリド化を加速させるため、触媒としてＤＭＦを一滴加えてもよい。反応温度は特に限定されないが、例えば、０～３０℃、好ましくは０～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、４～２４時間、好ましくは４～８時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、ジクロロメタンが望ましい。
次に、上記反応式においては、化合物１７を脱保護して、化合物１８を生成する。触媒として、Ｃｂｚの脱保護に適した含水タイプのパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ，ＮＸタイプ、１０％、富士フイルム和光純薬製）が望ましい。この触媒の量は、限定されないが、例えば化合物１７との重量比で、１．０：０．０５～１．０：０．３、好ましくは１．０：０．１～１．０：０．２の範囲で適宜設定できる。当該反応は、水素雰囲気下で行うことができる。反応温度は特に限定されないが、例えば、０～２５℃、好ましくは１５～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、６～２４時間、好ましくは１２～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、２－プロパノールが望ましい。
次に、上記反応式においては、化合物１８と化合物１０とを反応させて、一般式（Ｉ）’’’’で表される化合物を生成する。当該反応において、化合物１８と化合物１０との使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１．０：０．７～１．０：１．３、好ましくは１．０：０．８～１．０：１．１の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは０～２５℃℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、２～２４時間、好ましくは４～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、当該反応はルイス酸触媒である過塩素酸リチウムの存在下で行うことができる。過塩素酸リチウムの量は、限定されないが、例えば、化合物１８とのモル比で、１．０：０．１～１．０：０．８、好ましくは１．０：０．１～１．０：０．２の範囲で適宜設定できる。
また、上記反応式においては、一般式（Ｉ）’’’’’で表される化合物とヨウ化メチルとを反応させて、一般式（Ｉ）’’’’’’で表される化合物のヨウ化物を得ることができる。ここで、一般式（Ｉ）’’’’’で表される化合物は、一般式（Ｉ）’’’’においてＲ２がメチル基である化合物に相当する。当該反応において、一般式（Ｉ）’’’’’で表される化合物とヨウ化メチルとの使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、１：１０～１：４０、好ましくは、１：１０～１：２０の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、０～４０℃、好ましくは０～２５℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、１２～４８時間、好ましくは１２～２４時間の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
本発明の化合物（Ｉ）又はその塩は、非常に光学純度の高い（例えば、９９.９０％ｅｅ以上、好ましくは９９．９９％ｅｅ以上）ものを立体保持して合成出来るため、有用である。
鏡像異性体の分析方法
別の実施形態において、本発明は、被検体試料に本発明の化合物（Ｉ）又はその塩を添加して、当該被検体試料が互いに鏡像異性体である化合物の対、又は該鏡像異性体のうち一方の化合物を含む場合に、該鏡像異性体の対又はその一方の化合物と本発明の化合物（Ｉ）又はその塩とを反応させて誘導体混合物を生成する工程、及び
該誘導体を分離し、検出する工程
を含む、鏡像異性体の分析方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、被検体試料に本発明の化合物（Ｉ）又はその塩を添加して、当該被検体試料が互いに鏡像異性体である化合物の対、又は該鏡像異性体のうち一方の化合物を含む場合に、該鏡像異性体の対又はその一方の化合物と本発明の化合物（Ｉ）又はその塩とを反応させて誘導体混合物を生成する工程、及び
該誘導体を分離し、検出する工程
を含む、鏡像異性体の分析方法を提供する。
本発明の分析対象となる鏡像異性体を有する化合物としては、特に限定されないが、本発明の化合物（Ｉ）又はその塩における反応活性基と反応して、誘導体を形成する観点から、１級アミン・２級アミン・チオール等を有する求核性化合物が好ましい。より具体的には、鏡像異性体を有する可能性のある化合物としては、アミノ酸、オリゴペプチド、アルカロイド、アミノ糖、アミノアルコール、スフィンゴ脂質等が挙げられる。好ましい実施形態において、互いに鏡像異性体である化合物の対がＬ－アミノ酸とＤ－アミノ酸との対であることが好ましい。また、アミノ酸には、必須アミノ酸、非必須アミノ酸のいずれも含まれ得る。また、アミノ酸としては、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸が挙げられ、α－アミノ酸が好ましい。より具体的には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、メチオニン、スレオニン、アロスレオニン、シスチン、システイン、ホモセリン、ホモアルギニン、ホモシステイン、オルニチン、シトルリン、セレノシステイン、ピロリシン、ホスホセリン、ドーパ等が挙げられる。本発明において、被検体試料が互いに鏡像異性体である化合物の対、又は該鏡像異性体のうち一方の化合物を含む場合、互いに鏡像異性体である化合物の対もしくは一方の鏡像異性体のみを含む混合物は、複数種類のキラル化合物の鏡像異性体の対もしくは一方の鏡像異性体のみを含む混合物であってもよい。被検体試料としては、生体由来の試料（血液(全血、血清、血漿)、尿、脳脊髄液、唾液、汗、涙、糞便、羊水、細胞、組織等）、食品サンプル（肉類、魚介類、果実類等、及びそれらの加工品類等）、有機反応生成物、環境試料（隕石、海水、工業用水等）等が挙げられる。
本発明において、まず、被検体試料に前記本発明の化合物（Ｉ）又はその塩を添加する。被検体試料が互いに鏡像異性体である化合物の対、又は該鏡像異性体のうち一方の化合物を含む場合、互いに鏡像異性体である化合物の対もしくは一方の鏡像異性体のみを含む混合物と前記本発明の化合物（Ｉ）又はその塩が反応して誘導体混合物を生成する。当該工程において、被検体試料に含まれる求核性化合物の合計量と本発明の化合物（Ｉ）又はその塩との使用割合は特に限定されないが、例えば、モル比で、1：1～1：10000、好ましくは1：10～1：1000の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、20～60℃、好ましくは25～50℃の範囲で適宜設定できる。反応時間も限定されないが、例えば、2～30分、好ましくは5～15分の範囲で適宜設定できる。反応溶媒としては、例えば、水、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等を用いることができる。これらの溶媒は、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。また、水溶媒として、ほう酸ナトリウム緩衝液、りん酸ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液等を用いてもよい。これらの緩衝液を用いる場合、その濃度は、限定されないが、例えば、50～300mM、好ましくは100～200mMの範囲で適宜設定できる。これらの緩衝液を用いる場合、一種単独で又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
例えば、互いに鏡像異性体である化合物の対としてＳ体（Ｈ－ＲＳ）及びＲ体（Ｈ－ＲＲ）を含む混合物と前記本発明の化合物（Ｉ）又はその塩を反応させることにより誘導体混合物を得ることができる。
式中、Ｒ１、Ｒ２
、ｍ、ｎ及び結合
は前記に同じ。ＲＳは鏡像異性体である化合物のうちＳ体から水素を除去してなる基（例えば、鏡像異性体である化合物がアミノ酸である場合、Ｓ体アミノ酸中のアミノ基に含まれる水素を除去してなる基）であり、ＲＲは鏡像異性体である化合物のうちＲ体から水素を除去してなる基（例えば、鏡像異性体である化合物がアミノ酸である場合、Ｒ体アミノ酸中のアミノ基に含まれる水素を除去してなる基）である。より具体的には、例えば、鏡像異性体である化合物がα－アミノ酸の場合、下記のような鏡像異性体の対を有し得る。
この場合、基ＲＳに対応する基は
であり、ＲＲに対応する基は
である。互いに鏡像異性体である化合物の対を含む混合物と本発明の化合物（Ｉ）を反応させて誘導体化することにより、少なくとも３つのキラル要素を有する、互いに性質が異なり分離に適するジアステレオマー混合物を得ることができる。例えば、本発明の化合物（Ｉ）のうち（１Ｒ，２Ｒ）－トランス型の化合物：
と前述のα－アミノ酸とを反応させることにより、以下のジアステレオマーを得ることができる：
本発明によれば、鏡像異性体の対を上記のような互いにジアステレオマーである化合物に誘導体化することにより、キラル分離しやすくすることができる。
次に、得られた誘導体を分離し、検出を行う。分離方法としては、ジアステレオマーを分離することができる方法を広く証することができ、特に限定されないが、例えば、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、イオンクロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、イオン移動度分光法等が挙げられる。液体クロマトグラフィーを用いる実施形態において、カラムとしては、ＰＦＰカラム、ＯＤＳカラム、フェニルカラム、シアノカラム、アミドカラム等が挙げられ、ＰＦＰカラム等が好ましい。移動相としては、水、ぎ酸アンモニウム水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、炭酸水素アンモニウム水溶液、ぎ酸水溶液、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、アンモニア水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等が挙げられる。移動相に用いるこれらの液体は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの移動相には、イオン対試薬として、パーフルオロカルボン酸類、ジアルキルアンモニウム酢酸塩類、アルキルスルホン酸塩類、テトラアルキルアンモニウム塩類等を添加してもよい。検出方法としては特に限定されないが、選択性や感度に優れた質量分析法が好ましい。質量分析法は、特に限定されず、イオン化法、イオン分離法、検出法の各種を組み合わせた質量分析法が挙げられる。得られた誘導体を分離し、検出を行う工程は、分離装置と検出装置の併用、もしくはそれらが組み合わさった分離検出装置によって行うことが出来る。分離検出装置を用いる方法としては、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS法、LC-MS/MS法）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS法、CE-MS/MS法）等を利用することができる。キャピラリー電気泳動質量分析法としては、例えば、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ等が挙げられる。
本発明の方法によれば、鏡像異性体の対もしくは一方の鏡像異性体のみを含む混合物中の各鏡像異性体を一斉分析できる。また典型的な実施形態において、本発明の方法によれば、それらの鏡像異性体の誘導体のLCにおける溶出順序（Ｄ体、Ｌ体の溶出順序）が揃う点でも有用である。
本発明の方法によれば、鏡像異性体の対もしくは一方の鏡像異性体のみを含む混合物中の各鏡像異性体を一斉分析できる。また典型的な実施形態において、本発明の方法によれば、それらの鏡像異性体の誘導体のLCにおける溶出順序（Ｄ体、Ｌ体の溶出順序）が揃う点でも有用である。
以下に、合成例、実施例及び比較例を用いて本発明の特定の実施形態について、例示的かつ具体的に説明を行うが、本発明は以下の実施例に限定されない。
合成例１: 1R,2R-NHS1及び1R,2R-NHS2の調製
本合成例では、以下に示す方法に従って光学活性誘導体化試薬1R,2R-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1R,2R-NHS2を調製した。
本合成例では、以下に示す方法に従って光学活性誘導体化試薬1R,2R-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1R,2R-NHS2を調製した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.47 (brs, 1 H), 3.05-3.25 (m, 1 H), 2.32 (dt, J = 10.4, 3.4 Hz, 1 H), 1.90-2.08 (m, 2 H), 1.62-1.82 (m, 2 H), 1.45 (s, 11 H), 1.00-1.40 (m, 4 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 8.06-8.18 (m, 1 H), 7.80-7.88 (m, 1 H), 7.67-7.78 (m, 2 H), 5.83 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 4.49 (d, J = 7.0 Hz, 1 H), 3.28-3.50 (m, 1 H), 3.05-3.26 (m, 1 H), 1.97-2.10 (m, 1 H), 1.85-1.97 (m, 1 H), 1.58-1.76 (m,2 H), 1.40 (s, 9 H), 1.07-1.36 (m, 4 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 3.58 (t, J = 5.29 Hz, 2 H), 3.22 (s, 2 H), 2.96 and 2.89 (brs, total 1 H), 2.69 (t, J = 5.29 Hz, 2 H), 2.41 (s, 3 H), 1.47 (s, 9 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 3.20-3.34 (m, 1 H), 3.18 (s, 2 H), 2.76-2.86 (m, 1 H), 2.63-2.75 (m, 1 H), 2.51-2.62 (m, 2 H), 2.37 (s, 3 H), 2.25 (dt, J = 3.59, 10.0 Hz, 1 H), 2.08-2.18 (m, 1 H), 1.95-2.05 (m, 1 H), 1.62-1.76 (m, 2 H), 1.46 (s, 9 H), 1.44 (s, 9 H), 1.05-1.35 (m, 6 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.65 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 4.40 (dt, J = 3.2, 11.5 Hz, 1 H), 3.57 (ddd, J = 4.2, 9.8, 11.0 Hz, 1 H), 3.36 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 3.31 (dd, J = 3.8, 4.4 Hz, 2 H), 2.87 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 2.73-2.83 (m, 1 H), 2.41 (ddd, J = 5.7, 7.7, 11.5 Hz, 1 H), 2.30 (s, 3 H), 2.00-2.14 (m, 1 H), 1.66-1.86 (m, 3 H), 1.46-1.58 (m, 1 H), 1.42 (s, 9 H), 1.15-1.36 (m, 3 H).
ヘキサン中で結晶化した1R,2R-6のX線結晶構造解析結果を図１に示す。二分子のうち、下側の分子がディスオーダーしているものの、上側の分子よりシクロヘキサン環から２つの側鎖がエクアトリアル位に配向しているのが確認できる。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.23 (brs, 1 H), 3.29 (t, J = 5.3 Hz, 2 H), 3.20 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 3.13 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 2.58-2.74 (m, 3 H), 2.33 (s, 3 H), 1.98-2.04 (m, 1 H), 1.60-1.84 (m, 5 H), 1.10-1.56 (m, 4 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 6.10 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 5.93 (brs, 2.75 H, hydroxy proton of NHS), 4.40-4.54 (m, 1 H), 3.50-3.77 (m, 4 H), 3.27 (d, J = 11.5 Hz, 1 H), 3.19 (d, J = 11.7 Hz, 1 H), 2.81 (s, 4 H), 2.73 (dd, J = 3.8, 11.7 Hz, 1 H), 2.66 (s, 5.52 H, methylene protons of NHS), 2.62 (s, 3 H), 2.05-2.18 (m, 1 H), 1.74-1.93 (m, 3 H), 1.18-1.60 (m, 4 H).
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz); δ 8.52 (d, J = 9.3 Hz, 1 H), 4.08-4.44 (m, 3 H), 3.72-3.84 (m, 1 H), 3.48-3.71 (m, 4 H), 3.20 (s, 3 H), 3.16 (s, 3 H), 2.79 (s, 4 H), 2.59 (s, 0.48 H, methylene protons of NHS), 1.15-1.97 (m, 8 H).
合成例２: 1S,2S-NHS1及び1S,2S-NHS2の調製
本合成例では、(1S,2S)-1,2-Cyclohexanediamineを出発原料として、合成例１と同様の方法で光学活性化誘導体化試薬1S,2S-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1S,2S-NHS2を調製した。
本合成例では、(1S,2S)-1,2-Cyclohexanediamineを出発原料として、合成例１と同様の方法で光学活性化誘導体化試薬1S,2S-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1S,2S-NHS2を調製した。
合成例３: 1R,2S-NHS1及び1S,2R-NHS2の調製
本合成例では、(1S,2R)-N1-(tert-Butoxycarbonyl)-1,2-cyclohexanediamine (TCI, 1S,2R-2, 98.8%ee) を出発原料として、光学活性誘導体化試薬1R,2S-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1S,2R-NHS2を調製した。合成例１と同様の方法では脱Ns化後の分子内環化反応が立体障害によりほとんど進行しなかったため、酸に弱いBoc基から酸に強いCbz基に変更し、tert-ブチルエステル部分を酸クロリド化することで分子内環化を行った。
本合成例では、(1S,2R)-N1-(tert-Butoxycarbonyl)-1,2-cyclohexanediamine (TCI, 1S,2R-2, 98.8%ee) を出発原料として、光学活性誘導体化試薬1R,2S-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1S,2R-NHS2を調製した。合成例１と同様の方法では脱Ns化後の分子内環化反応が立体障害によりほとんど進行しなかったため、酸に弱いBoc基から酸に強いCbz基に変更し、tert-ブチルエステル部分を酸クロリド化することで分子内環化を行った。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 7.28-7.40 (m, 5 H), 5.10 (s, 2 H), 5.00-5.25 (m, 1 H), 4.65-4.90 (m, 1 H), 3.70-3.94 (m, 2 H), 1.65-1.85 (m, 2 H), 1.35-1.60 (m, 6 H), 1.44 (s, 9 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 8.11 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.57-7.83 (m, 3 H), 7.28-7.42 (m, 5 H), 5.71 (brs, 1 H), 5.09 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 5.01 (d, J = 12.1 Hz, 1 H), 4.91 (d, J = 12.1 Hz, 1 H), 3.72-3.84 (m, 1 H), 3.58-3.72 (m, 1 H), 1.23-1.87 (m, 8 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 7.98-8.08 (m, 1 H), 7.52-7.78 (m, 3 H), 7.29-7.42 (m, 5 H), 5.57 (brs, 1 H), 5.09 (d, J = 12.1 Hz, 1 H), 5.03 (d, J = 12.1 Hz, 1 H), 4.00-4.20 (m, 1 H), 3.82-4.00 (m, 1 H), 3.44 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.07 (s, 2 H), 2.70 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.29 (s, 3 H), 1.76-1.94 (m, 2 H), 1.46-1.76 (m, 6 H), 1.45 (s, 9 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 7.25-7.42 (m, 5 H), 5.72 (d, J = 5.3 Hz, 1 H), 5.09 (s, 2 H), 3.60-3.80 (m, 1 H), 3.14 (d, J = 1.3 Hz, 2 H), 2.66-2.80 (m, 2 H), 2.50-2.65 (m, 3 H), 2.34 (s, 3 H) 1.45 (s, 9 H), 1.35-1.73 (m, 9 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 7.28-7.43 (m, 5 H), 5.41 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 5.12 (d, J = 11.7 Hz, 1 H), 5.04 (d, J = 11.7 Hz, 1 H), 4.22-4.45 (m, 1 H), 4.02-4.21 (m, 1 H), 3.23-3.40 (m, 2 H), 3.17 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 3.02 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 2.44-2.60 (m, 1 H), 2.26 (s, 3 H), 2.08-2.42 (m, 1 H), 1.52-1.96 (m, 6 H), 1.15-1.48 (m, 2 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.33 (dt, J = 12.8, 3.4 H, 1 H), 3.75 (ddd, J = 4.3, 5.4, 11.9 Hz, 1 H), 3.34-3.47 (m, 2 H), 3.20 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 3.17 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 2.50-2.70 (m, 2 H), 3.32 (s, 3 H), 1.26-1.98 (m, 10 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 6.03 (d, J =8.7 Hz, 1 H), 4.94 (brs, 3.78 H, hydroxy proton of NHS), 4.24-4.35 (m, 1 H), 4.12-4.24 (m, 1 H), 3.57-3.70 (m, 1 H), 3.52 (d, J = 16.1 Hz, 1 H), 3.40-3.52 (m, 1 H), 3.13 (d, J = 16.1 Hz, 1 H), 3.00-3.12 (m, 1 H), 2.84 (s, 4 H), 2.69-2.82 (m, 1 H), 2.67 (s, 5.57 H, methylene protons of NHS), 2.51 (s, 3 H), 1.60-2.00 (m, 6 H), 1.20-1.52 (m, 2 H).
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz); δ 8.64 (d, J =8.6 Hz, 1 H), 4.19-4.29 (m, 1 H), 4.00-4.19 (m, 3 H), 3.58-3.84 (m, 3 H), 3.43-3.57 (m, 1 H), 3.18 (s, 3 H), 3.08 (s, 3 H), 2.79 (s, 4 H), 2.59 (s, 0.13 H, methylene protons of NHS), 1.25-2.05 (m, 8 H).
合成例４: 1S,2R-NHS1及び1R,2S-NHS2の調製
本合成例では、(1R,2S)-N1-(tert-Butoxycarbonyl)-1,2-cyclohexanediamine (TCI, 1R,2S-2, 99.3%ee) を出発原料として、合成例３と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2R-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1R,2S-NHS2を調製した。
本合成例では、(1R,2S)-N1-(tert-Butoxycarbonyl)-1,2-cyclohexanediamine (TCI, 1R,2S-2, 99.3%ee) を出発原料として、合成例３と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2R-NHS1及びその四級アンモニウム塩型1R,2S-NHS2を調製した。
合成例５: 1S,2R-BuNHS1の調製
本合成例では、合成例４で調整した(1S,2R)-5を出発原料として、合成例４と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2R-BuNHS1を調製した。
本合成例では、合成例４で調整した(1S,2R)-5を出発原料として、合成例４と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2R-BuNHS1を調製した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 3.54 (t, J = 5.3 Hz, 2 H), 3.24 (s, 2 H), 2.75 (t, J = 5.3 Hz, 2 H), 2.62 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.47 (s, 9 H), 1.23-1.46 (m, 4 H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 7.28-7.44 (m, 5 H), 5.66 (d, J = 4.5 Hz, 1 H), 5.09 (s, 2 H), 3.57-3.75 (m, 1 H), 3.20 (s, 2 H), 2.62-2.79 (m, 4 H), 2.53-2.61 (m, 2 H), 2.45-2.52 (m, 1 H), 1.53-1.74 (m, 5 H), 1.45 (s, 9 H), 1.20-1.43 (m, 8 H), 0.89 (s, J = 7.2 Hz, 3 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 7.28-7.46 (m, 5 H), 5.44 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 5.13 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 5.04 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 4.04-4.46 (m, 2 H), 3.23-3.44 (m, 2 H), 3.24 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 3.03 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 2.46-2.66 (m, 1 H), 2.13-2.40 (m, 2 H), 1.53-1.97 (m, 7 H), 1.14-1.52 (m, 6 H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 3 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.33 (dt, J = 12.8, 3.4 Hz, 1 H), 3.79 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 3.35-3.55 (m, 2 H), 3.31 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 3.06 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 2.80-2.93 (m, 1 H), 2.67-2.80 (m, 1 H), 2.04-2.53 (m, 4 H), 1.88-2.02 (m, 1 H), 1.29-1.85 (m, 11 H), 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 6.90-7.85 (brs, 3 H, hydroxy proton of NHS), 6.44 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 4.18-4.45 (m, 2 H), 3.90-4.10 (m, 1 H), 3.93 (d, J = 15.9 Hz, 1 H), 3.50-3.72 (m, 2 H), 3.45 (d, J= 15.9 Hz, 1 H), 2.93-3.25 (m, 3 H), 2.85 (s, 4 H), 2.67 (s, 6.26 H, methylene protons of NHS), 1.54-2.09 (m, 8 H), 1.27-1.54 (m, 4 H), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 3 H).
合成例６: 1S,2S-BuNHS1の調製
本合成例では、合成例２で調製した(1S,2S)-3を出発原料として、合成例１と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2S-BuNHS1を調製した。
本合成例では、合成例２で調製した(1S,2S)-3を出発原料として、合成例１と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2S-BuNHS1を調製した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 5.05 (brs, 1 H), 3.20-3.31 (m, 1 H), 3.25 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 3.17 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 2.59-2.84 (m, 3 H), 2.57 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.42-2.52 (m, 1 H), 2.18-2.31 (m, 1 H), 2.06-2.18 (m, 1 H), 1.90-2.06 (m, 2 H), 1.60-1.76 (m, 2 H), 1.46 (s, 9 H), 1.44 (s, 9 H), 1.04-1.43 (m, 8 H), 0.90 (s, J = 7.2 Hz, 3 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.66 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 4.38 (dt, J = 11.5, 3.2 Hz, 1 H), 3.49-3.69 (m, 1 H), 3.41 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 3.24-3.36 (m, 2 H), 2.90 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 2.78-2.90 (m, 1 H), 2.26-2.54 (m, 2 H), 1.98-2.16 (m, 1 H), 1.67-1.88 (m, 3 H), 1.42-1.60 (m, 3 H), 1.41 (s, 9 H), 1.16-1.39 (m, 6 H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.00-4.45 (m, 1 H), 3.22-3.34 (m, 2 H), 3.19 (s, 2 H), 2.67 (t, J = 5.4 Hz, 2 H), 2.55-2.70 (m, 1 H), 2.38 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.95-2.10 (m, 1 H), 1.60-1.70 (m, 3 H), 1.10-1.61 (m, 10 H), 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3 H).
1S,2S-BuNH2 100 mg (0.395 mmol) を乾燥ジクロロメタン5 mLに溶解し、DSC (111 mg, 1.1 equiv.) 及びLiClO4 (4.6 mg, 0.2 equiv.) を加え室温で一晩撹拌した。フィルターろ過後、溶媒を留去し、再度乾燥ジクロロメタン2 mLに溶解させた。ジエチルエーテルを添加し、生じた沈殿を回収した（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl ((1S,2S)-2-(4-butyl-2-oxopiperazin-1-yl)cyclohexyl)carbamate, 1S,2S-BuNHS1, 155 mg）。1H NMRより、夾雑物としてNHSが1.95 equiv.含まれていることを確認した。見かけの分子量を618.90とした場合の収率は20.5%であった。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 6.07 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 5.63 (brs, 3.89 H, hydroxy proton of NHS), 4.36-4.54 (m, 1 H), 3.88 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 3.50-3.75 (m, 2 H), 3.68 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 3.42 (d, J = 11.3 Hz, 1 H), 3.31 (d, J = 11.3 Hz, 1 H), 2.82-3.35 (m, 3 H), 2.82 (s, 4 H), 2.68 (s, 7.81 H, methylene protons of NHS), 2.05-2.18 (m, 1 H), 1.75-1.92 (m, 3 H), 1.65 (quintet, J = 7.4 Hz, 2 H), 1.18-1.56 (m, 6 H), 0.94 (t, J = 7.4 Hz, 3 H).
合成例７: 1S,2S-cHxNHS1の調製
本合成例では、合成例２で調整した1S,2S-3を出発原料として、側鎖導入用のtert-Butyl N-cyclohexyl-N-(2-hydroxyethyl)glycinateを用い、合成例２と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2S-cHxNHS1を調製した。
本合成例では、合成例２で調整した1S,2S-3を出発原料として、側鎖導入用のtert-Butyl N-cyclohexyl-N-(2-hydroxyethyl)glycinateを用い、合成例２と同様の方法で光学活性誘導体化試薬1S,2S-cHxNHS1を調製した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 3.48 (t, J = 5.1 Hz, 2 H), 3.21 (s, 2 H), 2.74 (t, J = 5.1 Hz, 2 H), 2.50 (tt, J = 11.1, 3.2 Hz, 1 H), 1.73-1.86 (m, 4 H), 1.56-1.67 (m, 1 H), 1.46 (s, 9 H), 0.95-1.32 (m, 5 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 5.45-5.75 (m, 1 H), 3.38 (d, J = 17.4 Hz, 1 H), 3.22-3.38 (m, 1 H), 3.00 (d, J = 17.4 Hz, 1 H), 2.65-2.83 (m, 3 H), 2.40-2.58 (m, 2 H), 2.05-2.35 (m, 3 H), 1.93-2.04 (m, 1 H), 1.53-1.91 (m, 7 H), 1.48 (s, 9 H), 1.42(s, 9 H), 0.95-1.38 (m, 9 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.67 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 4.37 (ddd, J = 11.7, 11.1, 3.2 Hz, 1 H), 3.50-3.64 (m, 1 H), 3.44 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 3.18-3.36 (m, 2 H), 3.12 (d, J = 16.6 Hz, 1 H), 2.85-2.96 (m, 1 H), 2.49 (ddd, J = 4.2, 9.4, 11.5 Hz, 1 H), 2.18-2.31 (m, 1 H), 1.97-2.12 (m, 1 H), 1.44-1.91 (m, 8 H), 1.41 (s, 9 H), 1.02-1.39 (m, 9 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.20-4.60 (m, 1 H), 3.38 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 3.28 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 3.15-3.35 (m, 2 H), 2.50-2.95 (m, 4 H), 2.20-2.36 (m, 1 H), 1.95-2.12 (m, 1 H), 1.57-1.95 (m, 8 H), 1.00-1.56 (m, 10 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 6.92 (brs, 2.58 H, hydroxy proton of NHS), 6.31 (d, J = 9.1 Hz, 1 H), 4.30-4.58 (m, 1 H), 3.45-3.86 (m, 4 H), 3.19-3.43 (m, 2 H), 2.65-2.90 (m, 2 H), 2.80 (s, 4 H), 2.65 (s, 6.21 H, methylene protons of NHS), 1.00-2.24 (m, 18 H).
合成例８: rac-trans-NHS1の調製
本合成例では、トランス型新規光学活性誘導体化試薬の光学純度を確かめるため、その比較物質としてラセミ型のrac-trans-NHS1及びrac-trans-NHS2を合成例１と同様の方法で調製した。
本合成例では、トランス型新規光学活性誘導体化試薬の光学純度を確かめるため、その比較物質としてラセミ型のrac-trans-NHS1及びrac-trans-NHS2を合成例１と同様の方法で調製した。
合成例９: 1R,2R-NPh1の調製
本合成例では、合成例１で調製した(1R,2R)-NH2を原料として、脱離基の導入用にBis(4-nitrophenyl) Carbonate (BNPC) を用い、p-ニトロフェニルカルバメート型光学活性誘導体化試薬1R,2R-NPh1を調製した。
本合成例では、合成例１で調製した(1R,2R)-NH2を原料として、脱離基の導入用にBis(4-nitrophenyl) Carbonate (BNPC) を用い、p-ニトロフェニルカルバメート型光学活性誘導体化試薬1R,2R-NPh1を調製した。
BNPCが残存しているとアミノ酸との反応の際にアミノ酸の二量体が生じてしまい、正確な分析ができなくなることから残存量を最小限にする必要がある。表１より、1当量のBNPCを用いた場合では1R,2R-Dimerの生成割合は低いものの、未反応BNPCが約10%残存した。一方、0.8当量では1R,2R-Dimerが約12%生じるものの、残存BNPCを約1%に抑えれることを確認した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 8.35 (d, J = 9.3 Hz, 0.04 H, phenyl protons of BNPC), 8.23 (d, J = 9.3 Hz, 2 H), 8.14 (d, J = 9.1 Hz, 2.46 H, phenyl protons of p-Nitrophenol), 7.51 (d, J = 9.3 Hz, 0.04 H, phenyl protons of BNPC), 7.29 (d, J = 9.3 Hz, 2 H), 6.90, (d, J = 9.1 Hz, 2.46 H, phenyl protons of p-Nitrophenol), 5.52 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 4.78 (d, J = 9.6 Hz, 0.23 H, amide proton of 1R,2R-Dimer), 4.43-4.60 (m, 1 H), 4.25-4.40 (m, 0.29 H, two methine protons of 1R,2R-Dimer on (2R)-carbon), 3.60-3.76 (m, 1 H), 3.32-3.40 (m, 2 H), 3.35 (d, J =16.8 Hz, 1 H), 3.01 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 2.90 (d, J = 16.6 Hz, 0.22 H, one side (×2) of α-protons of 1R,2R-Dimer), 2.71-2.83 (m, 1 H), 2.43-2.57 (m, 1 H), 2.33 (s, 3 H), 2.30 (s, 0.60 H, N-methyl protons of 1R,2R-Dimer), 2.15-2.27 (m, 1 H), 1.20-1.94 (m, 9 H, including 2 H of 1R,2R-Dimer).
1R,2R-Dimer
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.95 (d, J = 9.6 Hz, 2 H), 4.31 (dt, J = 3.4, 11.5 Hz, 2 H), 3.61-3.80 (m, 2 H), 3.23-3.32 (m, 4 H), 3.30 (d, J = 16.6 Hz, 2 H), 2.84 (d, J = 16.6 Hz, 2 H), 2.65-2.78 (m, 2 H), 2.34-2.46 (m, 2 H), 2.28 (s, 6 H), 1.97-2.10 (m, 2 H), 1.18-1.87 (m, 14 H).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 4.95 (d, J = 9.6 Hz, 2 H), 4.31 (dt, J = 3.4, 11.5 Hz, 2 H), 3.61-3.80 (m, 2 H), 3.23-3.32 (m, 4 H), 3.30 (d, J = 16.6 Hz, 2 H), 2.84 (d, J = 16.6 Hz, 2 H), 2.65-2.78 (m, 2 H), 2.34-2.46 (m, 2 H), 2.28 (s, 6 H), 1.97-2.10 (m, 2 H), 1.18-1.87 (m, 14 H).
合成例１０: p-ニトロベンジルアミン反応物の調製
本合成例では、合成例１及び２で調製した1R,2R-NHS1及び1S,2S-NHS1の光学純度を決定するため、p-ニトロベンジルアミンを誘導体化した。比較用として、合成例８で調製したrac-trans-NHS1についても同様の誘導体化を行った。
本合成例では、合成例１及び２で調製した1R,2R-NHS1及び1S,2S-NHS1の光学純度を決定するため、p-ニトロベンジルアミンを誘導体化した。比較用として、合成例８で調製したrac-trans-NHS1についても同様の誘導体化を行った。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz); δ 8.17 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.46 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.72 (t, J = 5.5 Hz, 1 H), 5.29 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 4.44 (dd, J = 2.1, 5.9 Hz, 2 H), 4.21-4.36 (m, 1 H), 3.70-3.90 (m, 1 H), 3.21-3.40 (m, 2 H), 3.14 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 2.74 (d, J = 16.4 Hz, 1 H), 2.61-2.73 (m, 1 H), 2.35 (ddd, J = 4.2, 3.8, 12.1 Hz, 1 H), 2.24 (s, 3 H), 2.06-2.19 (m, 1 H), 1.12-1.98 (m, 7 H).
実施例１：1R,2R-3及び1S,2S-3の光学純度の分析
出発原料として入手可能な(1R,2R)-及び(1S,2S)-1,2-Cyclohexanediamine (TCI)、もしくはそれらのモノBoc体の光学純度は>98%eeである。合成例１及び２でそれぞれ合成した1R,2R-3及び1S,2S-3は再結晶可能で光学純度の向上が期待できる。またUV検出が可能なNs基を有しているため、キラルカラムHPLCによりそれぞれの光学純度を決定した。ラセミ体であるrac-trans-3も比較用として用いた。
出発原料として入手可能な(1R,2R)-及び(1S,2S)-1,2-Cyclohexanediamine (TCI)、もしくはそれらのモノBoc体の光学純度は>98%eeである。合成例１及び２でそれぞれ合成した1R,2R-3及び1S,2S-3は再結晶可能で光学純度の向上が期待できる。またUV検出が可能なNs基を有しているため、キラルカラムHPLCによりそれぞれの光学純度を決定した。ラセミ体であるrac-trans-3も比較用として用いた。
1R,2R-3及び1S,2S-3はそれぞれ100%ee及び98.9%eeの出発原料から合成したものを用い、0.25 mg/mLとなるようヘキサン－エタノール混合溶媒 (50/50, v/v) に溶解し、サンプルとした。rac-trans-3は0.5 mg/mLとなるように調製した。分析条件は下記の通りである。
結果を図２に示す。図２に示したように、100%eeの出発原料から合成した1R,2R-3は100%eeを維持していた。また、98.9%eeの出発原料から合成した1S,2S-3でもエナンチオマーのピークは見られず、精製時の再結晶操作により光学純度がほぼ100%eeにまで向上した。
実施例２：1R,2R-NHS1及び1S,2S-NHS1の光学純度の分析
合成例１及び２で調製した1R,2R-NHS1及び1S,2S-NHS1がそれぞれ1R,2R-3及び1S,2S-3の高い光学純度を維持しているか確かめるため、p-ニトロベンジルアミンを誘導体化した1R,2R-NBn1及び1S,2S-NBn1を用い、キラルHPLCによる光学純度の測定を行った。
合成例１及び２で調製した1R,2R-NHS1及び1S,2S-NHS1がそれぞれ1R,2R-3及び1S,2S-3の高い光学純度を維持しているか確かめるため、p-ニトロベンジルアミンを誘導体化した1R,2R-NBn1及び1S,2S-NBn1を用い、キラルHPLCによる光学純度の測定を行った。
1R,2R-NBn1及び1S,2S-NBn1はそれぞれ100%ee及び98.9%eeの出発原料から合成したものを用い、ラセミ体のものも含めそれぞれ1 mg/mLとなるようヘキサン－エタノール混合溶媒 (50/50, v/v) に溶解し、サンプルとした。分析条件は下記の通りである。
結果を図３に示す。図３に示したように、p-ニトロベンジルアミンを誘導体化した1R,2R-NBn1及び1S,2S-NBn1について、それぞれ対応するエナンチオマーのピークは確認されず、1R,2R-NHS1及び1S,2S-NHS1はどちらも高い光学純度が維持されていることを確認した。活性化部位の異なる1R,2R-NPh1及び1S,2S-NPh1についても同じ前駆体 (1R,2R-NH2及び1S,2S-NH2) を用いているため、高い光学純度が期待できる。
実施例３
CE-TOFMS (Cation Mode)測定用誘導体化反応操作手順
[cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
CE-TOFMS (Cation Mode)測定用誘導体化反応操作手順
[cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（ 当該DL-アミノ酸混合標準濃度溶液の調製方法及び組成を表４に示す。当該DL-アミノ酸混合標準濃度溶液は、表４に記載の各アミノ酸を全て含む。以下同様。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（ 当該DL-アミノ酸混合標準濃度溶液の調製方法及び組成を表４に示す。当該DL-アミノ酸混合標準濃度溶液は、表４に記載の各アミノ酸を全て含む。以下同様。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQ（超純水装置「Milli-Q」で精製した水。以下同様）で約27倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図４～１１に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図４～１１に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（当該L-アミノ酸混合標準濃度溶液の調製方法及び組成を表５に示す。当該L-アミノ酸混合標準濃度溶液は、表５に記載の各アミノ酸を全て含む。以下同様。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（当該L-アミノ酸混合標準濃度溶液の調製方法及び組成を表５に示す。当該L-アミノ酸混合標準濃度溶液は、表５に記載の各アミノ酸を全て含む。以下同様。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１２～１９に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１２～１９に示す。
[trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
以下に示す方法に従って、trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図２０～２７に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図２０～２７に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図２８～図３５に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図２８～図３５に示す。
[cis-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2S-NHS2を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、cis-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2S-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
以下に示す方法に従って、cis-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2S-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図３６～図４２に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図３６～図４２に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図４３～図４９に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図４３～図４９に示す。
[trans-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2R-NHS2を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、 trans-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2R-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
以下に示す方法に従って、 trans-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2R-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、CE-TOFMS (Cation Mode)測定を実施した。測定条件を表９に示す。測定中のサンプル注入口の圧力は 0 mbar、-15 mbar、-30 mbarに設定し、それぞれ測定した。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図５０～図５６に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図５０～図５６に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで約27倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図５７～図６３に示す。
結果として、抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図５７～図６３に示す。
LC-OrbitrapMS (Positive)測定用誘導体化反応操作手順
[cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
[cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
アミノ酸ブランクサンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸ブランクサンプルとして測定に用いた。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図６４に示す。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図６４に示す。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図６５～図６８に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図６５～図６８に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図６９～図７２に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図６９～図７２に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（１）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（アミノ酸混合標準濃度溶液（１）の調製方法及び組成を表６に示す。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（アミノ酸混合標準濃度溶液（１）の調製方法及び組成を表６に示す。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（１）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７３に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７３に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（２）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（アミノ酸混合標準濃度溶液（１）の調製方法及び組成を表７に示す。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（アミノ酸混合標準濃度溶液（１）の調製方法及び組成を表７に示す。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（２）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７４に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７４に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（３）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（アミノ酸混合標準濃度溶液（１）の調製方法及び組成を表８に示す。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（アミノ酸混合標準濃度溶液（１）の調製方法及び組成を表８に示す。） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1S,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（３）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７５に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７５に示す。
[trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
以下に示す方法に従って、trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
アミノ酸ブランクサンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸ブランクサンプルとして測定に用いた。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７６に示す。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７６に示す。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７７～図８０に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図７７～図８０に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８１～図８４に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８１～図８４に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（１）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（表６） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（表６） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（１）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８５に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８５に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（２）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（表７） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（表７） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（２）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８６に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８６に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（３）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（表８） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（表８） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（３）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８７に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８７に示す。
[cis-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2S-NHS2を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、cis-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2S-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
以下に示す方法に従って、cis-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2S-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
アミノ酸ブランクサンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸ブランクサンプルとして測定に用いた。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８８に示す。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８８に示す。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８９～図９２に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図８９～図９２に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９３～図９６に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９３～図９６に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（１）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（表６） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（表６） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（１）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９７に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９７に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（２）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（表７） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（表７） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（２）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９８に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９８に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（３）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（表８） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（表８） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2S-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（３）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９９に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図９９に示す。
[trans-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2R-NHS2を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、 trans-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2R-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
以下に示す方法に従って、 trans-4級アンモニウム型誘導体化試薬 1R,2R-NHS2を用いアミノ酸誘導体サンプルを調製し、LC-OrbitrapMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１０に示す。
アミノ酸ブランクサンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、MilliQ (25 μL)の混合溶液を調製した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸ブランクサンプルとして測定に用いた。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１００に示す。
結果として、副生成物の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１００に示す。
DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１０１～図１０４に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１０１～図１０４に示す。
L-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表５） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１０５～図１０８に示す。
結果として、トータルイオンクロマトグラム (TIC)、及び各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１０５～図１０８に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（１）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（表６） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（１）（表６） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（１）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１０９に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１０９に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（２）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（表７） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（２）（表７） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（２）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１１０に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１１０に示す。
アミノ酸誘導体サンプル（３）の調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（表８） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したアミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)_（３）（表８） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS2アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をアミノ酸誘導体サンプル（３）として測定に用いた。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１１１に示す。
結果として、各誘導体の抽出イオンクロマトグラム (EIC)を図１１１に示す。
LC-TOFMS (Positive)測定用誘導体化反応操作手順
[trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1 / 1R,2R-NPh1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1 / 1R,2R-NPh1を用いて調製した各DL-アミノ酸誘導体サンプルのLC-TOFMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１１に示す。
[trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1 / 1R,2R-NPh1を用いた誘導体化アミノ酸の調製・測定]
以下に示す方法に従って、trans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1 / 1R,2R-NPh1を用いて調製した各DL-アミノ酸誘導体サンプルのLC-TOFMS (Positive)測定を実施した。測定条件を表１１に示す。
1R,2R-NHS1を用いた DL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.6 (20 μL)、200 mM NaOH aq. (5 μL)の混合溶液を調製した後、予め調製したDL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４） (20 μL)を加え混合した。そこに、25 mM 1R,2R-NHS1アセトニトリル溶液 (45 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、50℃の条件下で 10分間振盪することにより反応した。反応溶液に 0.1% ギ酸水溶液 (90 μL)を加え希釈・混合し、氷上冷却した。
さらに MilliQで100倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、EIC及びMSスペクトルを図１１２～図１３２に示す。
結果として、EIC及びMSスペクトルを図１１２～図１３２に示す。
1R,2R-NPh1を用いたDL-アミノ酸誘導体サンプルの調製
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.2 (50 μL)、DL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４）の100倍希釈水溶液 (50 μL)を加え混合した。そこに、10 mM 1R,2R-NPh1アセトニトリル溶液 (100 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、25℃の条件下に 10分間静置することにより反応した。
1.5mL型エッペンチューブに、200 mM ほう酸ナトリウム緩衝溶液, pH 9.2 (50 μL)、DL-アミノ酸混合標準濃度溶液 (in 0.04N HCl aq.)（表４）の100倍希釈水溶液 (50 μL)を加え混合した。そこに、10 mM 1R,2R-NPh1アセトニトリル溶液 (100 μL)を加えボルテックスミキサーで混合した後、25℃の条件下に 10分間静置することにより反応した。
この反応溶液 20 μLと 0.1% ギ酸水溶液 20 μLとの混合溶液を MilliQで4倍希釈した溶液をDL-アミノ酸誘導体サンプルとして測定に用いた。
結果として、EIC及びMSスペクトルを図１３３～図１５３に示す。
結果として、EIC及びMSスペクトルを図１３３～図１５３に示す。
[結果・まとめ]
実施例のCE-TOFMS測定結果によれば、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1やtrans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1等を用いた誘導体化により、アミノ酸の種類によってはCEによるキラル分離が可能であることがわかった。また、CE測定条件の最適化により、キラル分離が可能になると期待できるアミノ酸もあると思われた。
実施例のCE-TOFMS測定結果によれば、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1やtrans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1等を用いた誘導体化により、アミノ酸の種類によってはCEによるキラル分離が可能であることがわかった。また、CE測定条件の最適化により、キラル分離が可能になると期待できるアミノ酸もあると思われた。
実施例の LC-OrbitrapMS測定結果によれば、cis-3級アミン型誘導体化試薬 1S,2R-NHS1やtrans-3級アミン型誘導体化試薬 1R,2R-NHS1等を用いた誘導体化により、表４に記載されているキラルアミノ酸をすべてDL分離し検出出来ることがわかった。また、cis-型、trans-型いずれの誘導体化試薬を用いた場合においても、各アミノ酸のD-アミノ酸誘導体とL-アミノ酸誘導体の溶出順序が揃っていることを確認出来た。Thr、allo-Thrの異性体に関しては、cis-型の誘導体においてはすべて分離出来、trans-型の誘導体においても、LC測定条件の最適化によりすべて分離出来ることを期待できる。
実施例の LC-TOFMS測定結果によれば、1R,2R-NHS1のDL-アミノ酸誘導体と1R,2R-NPh1のDL-アミノ酸誘導体において、いずれも同等のDL分離を示すことを確認出来た。また、1R,2R-NHS1の DL-アミノ酸誘導体サンプルにおいては、Asp誘導体と同等組成の副生成物ピークが観られるが、1R,2R-NPh1のDL-アミノ酸誘導体サンプルにおいては、その副生成物ピークは観られなくなったことを確認出来た。
Claims (5)
- 一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
- Ｒ２がアルキル基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
- ｍが２である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
- 被検体試料に請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を添加して、当該被検体試料が互いに鏡像異性体である化合物の対、又は該鏡像異性体のうち一方の化合物を含む場合に、該鏡像異性体の対又はその一方の化合物と請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩とを反応させて誘導体混合物を生成する工程、及び
該誘導体を分離し検出する工程
を含む、鏡像異性体の分析方法。 - 互いに鏡像異性体である化合物の対がL-アミノ酸とD-アミノ酸である、請求項４に記載の方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2021103757A JP7444363B2 (ja) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | ２－（２－オキソ－４－置換ピペラジニル）シクロアルキルカルバメート化合物又はその塩、当該化合物を用いる鏡像異性体の分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2021103757A JP7444363B2 (ja) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | ２－（２－オキソ－４－置換ピペラジニル）シクロアルキルカルバメート化合物又はその塩、当該化合物を用いる鏡像異性体の分析方法 |
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ID=84817100
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| CN102408344A (zh) | 2011-08-01 | 2012-04-11 | 温州大学 | 一类手性溶剂化试剂 |
| WO2017057433A1 (ja) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | 味の素株式会社 | 鏡像異性体の分析方法 |
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2021
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Tetrahedron Letters，2005年，46，6907-6910，doi:10.1016/j.tetlet.2005.08.009 |
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