ES2238685T3 - Nueva quimioquina expresada en un adenoide inflamado, su produccion y sus utilizaciones. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPONE SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y AMINOACIDOS QUE IDENTIFICAN Y CODIFICAN UNA NUEVA QUIMIOCINA (ADEC) EXPRESADA EN TEJIDO ADENOIDE INFLAMADO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN PROPONE MOLECULAS ANTISENTIDO PARA LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN ADEC, VECTORES DE EXPRESION PARA PRODUCIR ADEC PURIFICADO, ANTICUERPOS CAPACES DE FIJARSE ESPECIFICAMENTE A ADEC, SONDAS DE HIBRIDACION U OLIGONUCLEOTIDOS PARA DETECTAR SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFIQUEN ADEC, CELULAS HUESPED OBTENIDAS POR INGENIERIA GENETICA PARA EXPRESAR ADEC, PRUEBAS PARA DIAGNOSTICAR INFLAMACIONES O ENFERMEDADES BASADAS EN LAS MOLECULAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN ADEC O ANTICUERPOS CAPACES DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE A ADEC.

Description

Nueva quimioquina expresada en un adenoide inflamado, su producción y sus utilizaciones.

Antecedentes

Los leucocitos, incluyendo monocitos, macrófagos, basófilos y eosinófilos, desempeñan importantes funciones en los mecanismos patológicos iniciados por los linfocitos T y/o B. Los macrófagos, en particular, producen potentes oxidantes y proteasas que contribuyen a la destrucción tisular y secretan un rango de citoquinas que reclutan y activan otras células inflamatorias.

La investigación de los procesos reguladores críticos mediante los cuales los glóbulos blancos se dirigen hacia su destino apropiado e interaccionan con otras células está en curso. El modelo actual del movimiento o tráfico de los leucocitos desde la sangre hacia los tejidos lesionados o inflamados comprende las etapas siguientes. La primera etapa es la adhesión por rodamiento del leucocito a lo largo de las células endoteliales de la pared de los vasos sanguíneos. Este movimiento está mediado por interacciones transitorias entre las selectinas y sus ligandos. Una segunda etapa implica la activación celular que estimula una interacción leucocito-células endoteliales más estable mediada por las integrinas y sus ligandos. Esta adhesión más potente, más estable, precipita las etapas finales de diapédesis y extravasación de los leucocitos hacia los tejidos.

La familia de quimioquinas de las citoquinas polipeptídicas, conocidas también como intercrinas, posee la especificidad celular requerida para explicar el tráfico de leucocitos en diferentes situaciones inflamatorias. En primer lugar, las quimioquinas median la expresión de moléculas de adhesión particulares en las células endoteliales; y en segundo lugar, generan gradientes de factores quimioatrayentes que activan tipos celulares específicos. Además, las quimioquinas estimulan la proliferación de tipos celulares específicos y regulan la activación de células portadoras de receptores específicos. Estas actividades demuestran ambas un alto grado de especificidad por la célula diana.

Las quimioquinas son pequeños polipéptidos, generalmente de 70-100 aminoácidos (aa) de longitud aproximadamente, de 8-11 kD de peso molecular y activos a lo largo de un rango de concentración de 1-100 ng/ml. Inicialmente, fueron aisladas y purificadas a partir de tejidos inflamados y caracterizadas con relación a su bioactividad. Más recientemente, se han descubierto quimioquinas mediante técnicas de clonaje molecular y se han caracterizado por análisis estructural además de funcional.

Las quimioquinas están relacionadas a través de un motivo de cuatro cisteínas que se basa primariamente en la separación de los dos primeros residuos de cisteína en la molécula madura. Actualmente las quimioquinas están asignadas a una de dos familias, las quimioquinas C-X-C (\alpha) y las quimioquinas C-C (\beta). Aunque existen excepciones, las quimioquinas C-X-C activan generalmente neutrófilos y fibroblastos, mientras que las quimioquinas C-C actúan sobre un grupo más diverso de células diana que incluyen monocitos/macrófagos, basófilos, eosinófilos, linfocitos T y otras. Las quimioquinas conocidas de ambas familias son sintetizadas por tipos celulares muy diversos según ha sido revisado en Thomson, A. (1994) The Cytokine Handbook, 2ª Ed., Academic Press, NY. Los dos grupos de quimioquinas serán descritos sucesivamente.

La quimioquina C-X-C arquetipo y más extensamente estudiada es el factor plaquetario 4 (PF4). Esta proteína de 70 aa presenta las cuatro cisteínas definitivas y es liberada junto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) y la tromboglobulina \beta (\beta-TG) de los gránulos de las plaquetas estimuladas. Esta molécula homotetramérica comparte similitud estructural con la interleuquina-8 (IL-8), induce la migración de fibroblatos, neutrófilos y monocitos, y se une a heparina. El PF4 proporciona el modelo biológico de una conexión entre trombosis, inflamación y cicatrización de heridas.

Otras quimioquinas encontradas en los gránulos de las plaquetas incluyen \beta-TG, la proteína activadora del tejido conectivo III (CTAP-III) y el péptido activador de neutrófilos 2 (NAP-2). Los tres péptidos derivan todos del procesamiento diferencial de una molécula precursora, la proteína plaquetaria básica (PBP). La \beta-TG es una proteína de 81 aa, muy básica, que influye sobre la migración de fibroblastos pero no tiene efecto sobre los neutrófilos ni los monocitos. La CTAP-III tiene 85 aa de longitud, y los aa 4-85 son idénticos a los de la \beta-TG. Como la CTAP-III es la proteína primaria en el gránulo y no se ha elucidado su función como proteína purificada, puede ser un precursor secundario, inactivo hasta su procesamiento posterior. El NAP-2 parece atraer neutrófilos pero no monocitos.

Las quimioquinas C-X-C no plaquetarias incluyen IL-8, la proteína inducible por interferón \gamma (IP-10), las proteínas con actividad estimulante del crecimiento de melanocitos (MGSA o gro), el atrayente de neutrófilos derivado del epitelio-78 (ENA-78), la proteína quimiotáctica de glanulocitos-2 (GPC-2) y los factores derivados de células del estroma 1\alpha y 1\beta (SDF-1\alpha y 1\beta). La IL-8 (conocida también como NAP-1) es secretada por monocitos/macrófagos, neutrófilos, fibroblastos, células endoteliales, queratinocitos y linfocitos T como respuesta a las citoquinas proinflamatorias IL-1 y 3, IFN-\gamma y TNF, así como a endotoxina, mitógenos, partículas, bacterias y virus. La IL-8 estimula la inflamación aguda, incluyendo la regulación por incremento de la adhesión de neutrófilos y del crecimiento de queratinocitos y la regulación por disminución de la producción de histamina por los basófilos.

IP-10 es una proteína de 10 kD de función no definida cuyo ARNm ha sido encontrado en monocitos, fibroblastos y células endoteliales. Los monocitos, queratinocitos y células T activadas secretan la proteína IP-10 que ha sido localizada en lugares de reacciones de hipersensibilidad retardada. El ADNc de MGSA/gro produce una proteína de 15 kD que aparece en fibroblastos. Su transcripción está relacionada con el crecimiento y funciona como un factor de crecimiento autocrino. Las formas distintas y no alélicas gro \beta y gro g son un 90% y un 86% idénticas a gro a, respectivamente. Proteínas gro a recombinantes atraen y activan a los neutrófilos. El ENA-78 fue purificado de sobrenadantes de células de los alvéolos pulmonares. Igual que gro \gamma, atrae y activa neutrófilos in vitro.

GCP-2 es una proteína de 6 kD aislada de los sobrenadantes de células de osteosarcoma. GCP-2 existe en varias formas truncadas N-terminalmente, y atrae y activa neutrófilos in vitro y produce la acumulación de granulocitos in vivo. SDF-1\alpha y 1\beta son ADNcs recién aislados que codifican moléculas secretadas y proteínas de membrana de tipo I.

Strieter y col. (1995) Journal of Leukocyte Biology, 57:752-762 ("Strieter A") y Strieter y col. (1985) The Journal Biological Chemistry, 270:27348-27357 ("Strieter B"), demuestran que la familia de quimioquinas C-X-C presenta una actividad angiogénica dispar dependiendo de la presencia o ausencia del motivo ELR (Glu-Leu-Arg) NH_{2}-terminal que precede al primer residuo de aminoácido cisteína del miembro de la familia de quimioquinas C-X-C. Por ejemplo, se ha demostrado que IL-8, una quimioquina C-X-C ELR, presenta propiedades angiogénicas, mientras que se ha demostrado que PF4, una no ELR, inhibe la angiogénesis. La angiogénesis, caracterizada por la neoformación de vasos sanguíneos, es un acontecimiento biológico esencial en la embriogénesis, en la cicatrización de heridas, en la inflamación crónica y en el crecimiento de tumores sólidos malignos.

Strieter B sugiere que un desequilibrio biológico en la producción de factores angiogénicos y angiostáticos contribuye a la patogénesis de varias enfermedades dependientes de angiogénesis, incluyendo artritis reumatoide, escleroderma, psoriasis y tumorigénesis. Strieter A sugiere además que las quimioquinas C-X-C no ERL, tales como IP-10 y PF4, tendrán un efecto negativo sobre la tumorigénesis a través de una reducción de la actividad angiogénica derivada del tumor.

Las técnicas actuales para el diagnóstico de anormalidades en tejidos inflamados o enfermos se basan principalmente en la observación de los síntomas clínicos o en análisis serológicos de tejidos o fluidos corporales para determinar hormonas, polipéptidos o varios metabolitos. Frecuentemente, los pacientes no manifiestan síntomas clínicos en las etapas tempranas de la enfermedad o del desarrollo del tumor. Además, los análisis serológicos no diferencian siempre entre enfermedades invasivas y síndromes genéticos que tienen rangos solapantes o muy similares. Por tanto, es importante el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico que comprendan moléculas pequeñas tales como las quimioquinas expresadas para proporcionar diagnósticos tempranos y precisos, para permitir un mejor entendimiento de la patogénesis molecular, y para ser utilizadas en el desarrollo de terapias eficaces.

Las moléculas de quimioquinas fueron revisadas en Schall, T.J. (1994) Chemotactic Cytokines: Targets for Therapeutic Development. International Business Communications, Southborough, MA, pp. 180-270; y en Paul, W.E. (1993) Fundamental Immunology, 3ª Ed. Raven Press NYC, pp. 822-826.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica únicamente una nueva proteína humana procedente de adenoide inflamado. El nuevo gen, que es conocido como quimioquina expresada por adenoide, o adec (Clon Nº 20293 de Incyte), codifica un polipéptido denominado ADEC, de la familia de quimioquinas C-X-C. La invención comprende también ensayos de diagnóstico para determinar condiciones inflamatorias que incluyen etapas para analizar una muestra o un extracto de la misma con ADN de adec, fragmentos u oligómeros del mismo. Aspectos de la invención incluyen moléculas de adec antisentido; vectores de clonaje o expresión que contienen ácido nucleico que codifica ADEC; células u organismos huésped transformados con vectores de expresión que contienen ácido nucleico que codifica ADEC; ADEC purificado y métodos para la producción y recuperación de ADEC purificado a partir de células huésped.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de la quimioquina expresada por adenoide (adec) y la secuencia de aminoácidos (aa) pronosticada de ADEC (SEC ID Nº:1 y SEC ID Nº:2).

La Figura 2 muestra la alineación de aminoácidos de ADEC con otras quimioquinas humanas de la familia C-X-C. Las alineaciones mostradas fueron producidas utilizando el programa de alineación de multisecuencias de DNASTAR Software (DNASTAR Inc., Madison, WI).

La Figura 3 muestra un árbol de relación de quimioquinas C-X-C humanas. El árbol filogenético fue generado mediante un programa de árboles filogenéticos de DNASTAR Software ((DNASTAR Inc., Madison, WI) utilizando el Método Clustal con la tabla de pesos residuales PAM250.

La Figura 4 muestra un análisis de las características de hidrofobicidad e inmunogénicas de ADEC basado en la secuencia y composición de aminoácidos pronosticadas.

Modos de llevar a cabo la invención Definiciones

Según se utiliza en la presente, "quimioquina expresada por adenoide" o ADEC, se refiere a un polipéptido descrito en la SEC ID Nº:2, o a un fragmento del mismo, que está codificado por un ARNm transcrito del ácido nucleico de SEC ID Nº:1. La ADEC puede ser natural o sintetizada químicamente. Según se utiliza en la presente, la "adec" en minúsculas se refiere a una secuencia de ácido nucleico, mientras que la "ADEC" en mayúsculas se refiere a una proteína, a un péptido o a una secuencia de aminoácidos.

Según se utiliza en la presente, el término "activa" se refiere a aquellas formas de ADEC que conservan las actividades biológicas y/o inmunológicas de la ADEC que existe en la naturaleza.

Según se utiliza en la presente, el término "ADEC que existe en la naturaleza" se refiere a ADEC producida por células humanas que no han sido manipuladas genéticamente y contempla específicamente varias formas de ADEC procedentes de modificaciones post-traduccionales del polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación.

Según se utiliza en la presente, el término "derivado" se refiere a polipéptidos derivados de la ADEC existente en la naturaleza mediante modificaciones químicas tales como ubiquitinación, marcaje (por ejemplo con radionúclidos, varias modificaciones enzimáticas), pegilación (derivatización con polietilén glicol) o por inserción o sustitución mediante síntesis química de aa tales como ornitina, que no existen normalmente en las proteínas humanas.

Según se utiliza en la presente, el término "variante" o "mutante" o "variante recombinante" se refiere a cualquier polipéptido que difiera de la ADEC existente en la naturaleza por inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos creadas utilizando técnicas de ADN recombinante. Puede encontrarse una guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, añadidos o eliminados sin suprimir las actividades de interés, adhesión celular y quimiotaxis, mediante comparación de la secuencia de la ADEC particular con la de citoquinas homólogas y la minimización del número de cambios en la secuencia de aminoácidos producidos en regiones de alta homología.

Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos son el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una isoleucina o una valina, un aspartato por un glutamato o una treonina por una serina, esto es, sustituciones de aa conservadoras. Las inserciones o deleciones son típicamente del rango de 1 a 5 aminoácidos aproximadamente. La variación permitida puede ser determinada experimentalmente produciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en ADEC utilizando técnicas de ADN recombinante y analizando las variantes recombinantes resultantes para determinar su actividad.

Cuando se desee, la ADEC o una variante de ADEC puede ser manipulada genéticamente con el fin de que contenga una "secuencia señal o líder" que pueda dirigir el polipéptido a través de la membrana de una célula. Tal secuencia puede estar presente de forma natural en los polipéptidos de la presente invención o puede ser proporcionada a partir de fuentes de proteínas heterólogas mediante técnicas de ADN recombinante.

Según se utiliza en la presente, un "fragmento", una "porción" o un "segmento" de ADEC se refiere a cualquier tramo de aminoácidos que tenga longitud suficiente para presentar actividad biológica y/o inmunológica, y en las realizaciones preferidas contendrá al menos 5 aminoácidos aproximadamente, al menos 7 aminoácidos aproximadamente, al menos de 8 a 13 aminoácidos aproximadamente y en realizaciones adicionales 17 o más aminoácidos aproximadamente.

Según se utiliza en la presente, un "oligonucleótido" o un "fragmento", "porción" o "segmento" polinucleotídico se refiere a cualquier tramo de ácidos nucleicos que codifique ADEC y que sea de longitud suficiente para ser utilizado como cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o en varios procedimientos de hibridación conocidos por los expertos en la técnica, que tienen la finalidad de identificar o amplificar ácidos nucleicos idénticos o relacionados.

La presente invención incluye polipéptidos ADEC purificados procedentes de fuentes naturales o recombinantes, vectores y células huésped transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican ADEC. Diferentes métodos para el aislamiento de los polipéptidos ADEC pueden ser realizados mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, tales polipéptidos pueden ser purificados mediante cromatografía de inmunoafinidad empleando los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Otros métodos diferentes de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica incluyen los descritos en Deutscher, M. (1990) Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press, San Diego; y Scopes, R. (1982) Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NYC.

Según se utiliza en la presente, el término "recombinante" se refiere a un polinucleótido que codifica ADEC que es preparado utilizando técnicas de ADN recombinante. El ADN que codifica ADEC puede incluir también variantes alélicas o recombinantes y mutantes de las mismas.

Según se utiliza en la presente, el término "sonda" o "sonda de ácido nucleico" o "sonda polinucleotídica" o "sonda oligonucleotídica", se refiere a una porción, fragmento o segmento de ADEC que es capaz de hibridarse con una secuencia diana deseada. Una sonda puede ser utilizada para detectar, amplificar o cuantificar ADNcs o un ácido nucleico endógeno que codifique ADEC mediante el empleo de técnicas convencionales en biología molecular. Una sonda puede tener una longitud variable, preferiblemente desde 10 nucleótidos aproximadamente hasta varios cientos de nucleótidos. Como comprenderán los expertos en la técnica, las condiciones de la hibridación y el diseño de la sonda variarán dependiendo de la utilización deseada. Por ejemplo, una sonda destinada a ser utilizada en PCR tendrá de 15 a 30 nucleótidos de longitud aproximadamente y puede ser parte de un grupo de sondas degeneradas, esto es, oligonucleótidos que toleran un desapareamiento de nucleótidos pero que se adaptan uniéndose a una secuencia desconocida; mientras que una sonda para ser utilizada en hibridaciones Southern o Northern puede ser una única secuencia de nucleótidos específica que tenga varios cientos de nucleótidos de longitud. Por consiguiente, una sonda preferida para la detección específica de ADEC comprenderá un fragmento polinucleotídico u oligonucleotídico de una región de nucleótidos no conservada de la SEC ID Nº:1. Según se utiliza en la presente, el término "región de nucleótidos no conservada" se refiere a una región de nucleótidos que es exclusiva de la SEC ID Nº:1 y no comprende una región que esté conservada en la familia de quimioquinas C-X-C. Las sondas pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra y pueden tener especificidad en hibridaciones en solución, en células, tejidos o en hibridaciones basadas en membranas, incluyendo las tecnologías in situ y las tecnologías similares a ELISA. La presente invención incluye oligonucleótidos, fragmentos o porciones de los polinucleótidos descritos en la presente o sus hebras complementarias, utilizados como sondas.

Los "oligonucleótidos" o "sondas oligonucleotídicas" son preparados sobre la base de las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC descritas en la presente. Los oligonucleótidos comprenden porciones de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente y contienen al menos 15 nucleótidos aproximadamente, normalmente al menos 20 nucleótidos aproximadamente, y pueden incluir hasta 60 nucleótidos. Las sondas de ácido nucleico pueden comprender porciones de la secuencia que tengan menos nucleótidos de 6 kb aproximadamente, normalmente menos de 1 kb aproximadamente. Los oligonucleótidos y las sondas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizados para determinar si el ácido nucleico que codifica ADEC está presente en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácido nucleico similares procedentes de ADN cromosómico según está descrito por Walsh, P.S. y col. (1992) PCR Methods Appl. 1:241-250.

Las sondas de ácido nucleico de la presente invención pueden derivar de ácidos nucleicos de hebra sencilla o de doble hebra existentes en la naturaleza o recombinantes, o pueden ser sintetizadas químicamente. Pueden ser marcadas mediante traducción con muescas, reacción de relleno con Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las sondas de la presente invención, su preparación y/o su marcaje se describen con detalle en Sambrook, J. y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, NY; o Ausubel, F.M. y col. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, John Wiley & Sons.

Alternativamente, pueden sintetizarse o identificarse variantes recombinantes que codifiquen los polipéptidos de la presente invención, o polipéptidos relacionados, mediante técnicas de hibridación conocidas por los expertos en el oficio utilizando la "redundancia" del código genético. Pueden introducirse diferentes sustituciones de codones, tales como los cambios silentes que producen varios sitios de restricción, con el fin de optimizar el clonaje en un plásmido o en un vector vírico o la expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. Pueden introducirse también mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, para cambiar las afinidades de unión a ligandos, las afinidades entre cadenas o la tasa de degradación o de renovación del polipéptido.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que identifica exclusivamente una nueva quimioquina de la familia C-X-C, referida en la presente como ADEC. Las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC han sido identificadas en una biblioteca de ADNc producida a partir de tejido adenoide inflamado, en una biblioteca de ADNc producida a partir de tejido esplénico fetal y en una biblioteca de ADNc producida a partir de líquido sinovial reumatoide derivado de la cadera. Se han identificado también secuencias de nucleótidos que codifican ADEC en monocitos adherentes cultivados durante 3 horas y en células T cultivadas. No se han encontrado secuencias de nucleótidos que codifiquen ADEC en monocitos adherentes cultivados durante 72 horas ni en células T tratadas con ácido forbol mirístico (PMA).

Sería útil tener un test de diagnóstico para la detección de la expresión de ADEC en los tejidos en los que se identifique. La activación de neutrófilos y fibroblastos que responden produciendo abundantes proteasas y otras moléculas que pueden dar lugar a un daño tisular o a la destrucción del tejido. Por tanto, un test de diagnóstico para determinar la expresión excesiva de ADEC puede acelerar el diagnóstico y el tratamiento apropiado de la inflamación antes de que tenga lugar un daño o una destrucción tisular extensa.

Pruebas recientes sugieren que aunque la familia de quimioquinas C-X-C de citoquinas quimiotácticas parece tener actividades inflamatorias, éstas muestran efectos dispares en la mediación de angiogénesis como función de la presencia o ausencia del dominio ELR (Strieter A y B, supra). Se ha demostrado que las quimioquinas C-X-C no ELR inhiben la angiogénesis. Por consiguiente, ADEC o fragmentos de la misma pueden ser utilizados para prevenir o tratar enfermedades dependientes de angiogénesis tales como tumorigénesis, artritis reumatoide, escleroderma y psoriasis.

Las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC, o sus complementos, tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas por los expertos en la disciplina de la biología molecular. Estas técnicas incluyen la utilización como sondas de hibridación, la utilización como oligómeros para PCR, la utilización para la construcción de mapas de cromosomas y genes, la utilización en la producción recombinante de ADEC y la utilización en la producción de ADN o ARN antisentido, de sus análogos químicos y similares. Las utilizaciones de los nucleótidos que codifican ADEC descritas en la presente son ejemplos de técnicas conocidas y no tienen la intención de limitar su empleo en ninguna técnica conocida por las personas con experiencia habitual en el oficio. Además, las secuencias de nucleótidos descritas en la presente pueden ser utilizadas en técnicas de biología molecular que no hayan sido desarrolladas todavía, siempre que las nuevas técnicas se basen en propiedades de las secuencias de nucleótidos que sean actualmente conocidas, por ejemplo el código genético de los tripletes, las interacciones de pares de bases específicas.

Los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, pueden producirse una multitud de secuencias de nucleótidos que codifiquen ADEC, teniendo algunas una homología mínima de secuencias de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen conocido y existente en la naturaleza, siempre que la secuencia de nucleótidos codifique ADEC. La invención ha contemplado específicamente cada variación y todas las variaciones posibles de la secuencia de nucleótidos que pudieran ser producidas mediante la selección de combinaciones basadas en las posibles elecciones de codones. Estas combinaciones se han realizado de acuerdo con el código genético de tripletes estándar según se aplica a la secuencia de nucleótidos de la ADEC existente en la naturaleza, y tales variaciones deben ser consideradas todas como descritas específicamente.

Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC y/o variantes de ADEC son preferiblemente capaces de hibridar con la secuencia de nucleótidos del gen de ADEC que existe en la naturaleza bajo condiciones rigurosas, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifiquen ADEC o derivados de ADEC que posean una utilización de codones sustancialmente diferente. Pueden seleccionarse codones para incrementar la velocidad a la cual tiene lugar la expresión del péptido en un huésped de expresión procariótico o eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la cual los codones particulares son utilizados por el huésped. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos que codifica ADEC y/o derivados de ADEC sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada, incluyen la producción de transcritos de ARN que tengan propiedades más deseables, por ejemplo una mayor semivida, que los transcritos producidos a partir de la secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza.

Las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC pueden ser unidas a una variedad de otras secuencias de nucleótidos por medio de técnicas de ADN recombinante bien establecidas (cf. Sambrook, J. y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, NY).

Secuencias de nucleótidos útiles para ser unidas a adec incluyen una variedad de vectores de clonaje, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, derivados del fago lambda, fagémidos y similares, que son conocidos en la técnica. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores para la generación de sondas, vectores de secuenciación y similares. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios sensibles a endonucleasas de restricción convenientes y marcadores seleccionables para la célula huésped.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar sondas de hibridación de ácidos nucleicos específicas de adec capaces de hibridar con secuencias de nucleótidos existentes en la naturaleza que codifiquen ADEC. Tales sondas para la detección de secuencias que codifiquen ADEC deben contener preferiblemente un fragmento nucleotídico procedente de una región no conservada de la SEC ID Nº:1. Tales sondas para la detección de secuencias codificadoras de quimioquinas relacionadas deben contener preferiblemente al menos un 50% de los nucleótidos procedentes de una secuencia codificadora de C-X-C o C-C. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden derivar de las secuencias de nucleótidos de la SEC ID Nº:1 o de secuencias genómicas que incluyan promotores, elementos intensificadores e intrones del adec existente en la naturaleza. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas con una variedad de grupos informadores, incluyendo radionúclidos tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina, acoplados a la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidina/biotina y similares por medio de técnicas conocidas por los expertos en el oficio.

La PCR, según está descrita en las Patentes de EE.UU. 4.965.188 y 4.683.195 y 4.800.195, proporciona utilizaciones adicionales de los oligonucleótidos basados en las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC. Tales sondas utilizadas en PCR pueden ser de origen recombinante, pueden ser sintetizadas químicamente o una mezcla de ambas cosas y comprenden una secuencia de nucleótidos discreta para uso diagnóstico o un grupo degenerado de posibles secuencias para la identificación de secuencias genómicas estrechamente relacionadas.

Otro medio para producir sondas de hibridación específicas de adec incluye el clonaje en vectores de secuencias de ácido nucleico que codifican ADECs y derivados de ADEC para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente y pueden ser utilizados para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de la ARN polimerasa apropiada, como la ARN polimerasa de T7 o SP6, y los nucleótidos marcados radiactivamente apropiados.

Es actualmente posible producir una secuencia de ADN, o porciones de la misma, que codifique ADEC y derivados de ADEC totalmente mediante química sintética, después de lo cual el gen puede ser insertado en cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles utilizando reactivos, vectores y células que son conocidos en la técnica en el momento del registro de esta solicitud. Además, puede utilizarse la química de síntesis para introducir mutaciones en la secuencia polinucleotídica de adec o en cualquier porción de la misma.

Los métodos para secuenciar ADN son bien conocidos en la técnica. Los métodos enzimáticos convencionales empleaban el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, SEQUENASE® (US Biochemical Corp., Cleveland, OH) o polimerasa Taq para extender las cadenas de ADN a partir de un cebador oligonucleotídico hibridado al molde de ADN de interés. Se han desarrollado métodos para la utilización del moldes de hebra sencilla y de doble hebra. Los productos de reacción al finalizar la cadena eran sometidos a electroforesis en geles de urea-acrilamida y detectados mediante autorradiografía (para precursores marcados con radionúclidos) o mediante fluorescencia (para precursores marcados con fluorescencia). Mejoras recientes en la mecanización de la preparación de la reacción, la secuenciación y el análisis utilizando el método de detección de fluorescencia, han permitido la expansión del número de secuencias que pueden ser determinadas por día (utilizando máquinas tales como Catalyst 800 y el secuenciador de ADN de Applied Biosystems 373).

La secuencia de nucleótidos puede ser utilizada con el fin de construir un ensayo para detectar inflamación y enfermedades asociadas con niveles anormales de expresión de ADEC. La secuencia de nucleótidos puede ser marcada por métodos conocidos en la técnica y añadida a una muestra de fluido o tejido de un paciente bajo condiciones de hibridación. Después de un periodo de incubación, la muestra es lavada con un fluido compatible que contiene opcionalmente un colorante (u otra marca que requiera un revelador) si el nucleótido ha sido marcado con un enzima. Después de eliminar mediante lavado el fluido compatible, el colorante es cuantificado y comparado con un estándar. Si la cantidad de colorante está significativamente elevada, la secuencia de nucleótidos ha hibridado con la muestra. Si está presente adec en un nivel anormal, el ensayo indica la presencia de inflamación y/o enfermedad.

La secuencia de nucleótidos de adec puede ser utilizada para construir sondas de hibridación con el fin de generar mapas de ese gen. La secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente puede ser utilizada para construir mapas de un cromosoma y de regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas bien conocidas de construcción de mapas genéticos y/o cromosómicos. Estas técnicas incluyen hibridación in situ, análisis de ligamiento frente a marcadores cromosómicos conocidos, selección por hibridación con bibliotecas o preparaciones cromosómicas seleccionadas por flujo específicas para cromosomas conocidos, y similares. La técnica de hibridación in situ fluorescente de extensiones cromosómicas ha sido descrita, entre otros lugares, en Verma y col. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, NYC.

La hibridación in situ fluorescente de preparaciones cromosómicas y otras técnicas físicas de construcción de mapas cromosómicos pueden ser correlacionadas con datos de mapas genéticos adicionales. Ejemplos de datos de mapas genéticos pueden encontrarse en O'Brien (1990) Genetic Maps: Locus Maps of Complex Genomes, Libro 5: Human Maps, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. La correlación entre la posición de adec en un mapa cromosómico físico y una enfermedad específica (o la predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociada con esa enfermedad genética. La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser utilizada para detectar diferencias de la secuencia génica entre individuos normales, portadores y afectados, esto es individuos sometidos a una enfermedad o condición.

Las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC pueden ser utilizadas para producir ADEC purificada utilizando métodos bien conocidos de la tecnología de ADN recombinante. Entre las muchas publicaciones que describen métodos para la expresión de genes una vez que han sido aislados, está Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego. La ADEC puede ser expresada en una variedad de células huésped, procarióticas o eucarióticas. Las células huésped pueden ser de la misma especie o de una especie diferente de la que las secuencias de nucleótidos de adec son endógenas. Las ventajas de producir ADEC mediante la tecnología de ADN recombinante incluyen la obtención de fuentes muy enriquecidas de las proteínas para purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados.

La ADEC puede ser expresada como una proteína quimérica con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, WA). La inclusión de una secuencia adaptadora susceptible de ser cortada (tal como el Factor XA o enteroquinasa) entre el dominio para la purificación y la secuencia que codifica ADEC, puede ser útil para facilitar la producción de ADEC.

Células transformadas con ADN que codifique ADEC pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de ADEC y la recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La ADEC producida por una célula recombinante puede ser secretada o puede estar contenida en el interior de la célula, dependiendo de la construcción genética particular utilizada. En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada. Las etapas de purificación dependen de la naturaleza del proceso de producción utilizado y de la ADEC particular producida.

La traducción del ADNc de adec de la presente invención a una proteína puede ser realizada subclonando el ADNc en un vector de expresión apropiado y transfectando este vector a un huésped de expresión apropiado. Según se describe en el Ejemplo VII, un vector de expresión preferido para la expresión y purificación de ADEC es uno que proporcione la expresión de una proteína de fusión que contenga ADEC y que contenga un ácido nucleico que codifique seis residuos de histidina seguidos por tiorredoxina y un sitio de corte de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad por un ión metálico inmovilizado, según está descrito en Porath y col. (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281), mientras que el sitio de corte de enteroquinasa proporciona un medio para purificar la quimioquina de la proteína de fusión.

El vector de expresión utilizado para la producción de las bibliotecas de ADNc descritas en la presente, que proporciona una promotor de la \beta-galactosidasa corriente arriba del sitio de clonaje, seguido por una secuencia de nucleótidos que contiene la Met aminoterminal y los 7 residuos siguientes de la \beta-galactosidasa seguidos por un promotor de un bacteriófago útil para el cebado y la transcripción artificiales y varios sitios de restricción únicos (incluyendo Eco RI), puede ser también utilizado para la expresión de las quimioquinas de la presente invención. La inducción de la cepa bacteriana aislada con IPTG utilizando métodos estándar, producirá una proteína de fusión correspondiente a los siete primeros residuos de la \beta-galactosidasa, alrededor de 15 residuos de adaptador y la ADEC codificada en el ADNc. Como los insertos de clones de ADNc son generados mediante un proceso esencialmente aleatorio, existe una posibilidad entre tres de que el ADNc incluido esté en el marco correcto para una traducción apropiada. Si el ADNc no está en el marco de lectura correcto, puede ser obtenido por deleción o inserción del número de bases apropiado mediante métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa III o con nucleasa de la judía mungo, o la inclusión de un adaptador oligonucleotídico. La ADEC será expresada en el sistema bacteriano según se ha descrito.

Una secuencia de nucleótidos que codifique ADEC de la presente invención puede ser enviada a vectores que se sabe que son útiles para la expresión de proteínas en huéspedes específicos. Pueden sintetizarse químicamente mediante métodos estándar amplímeros oligonucleotídicos que contengan sitios de clonaje además de un segmento de ADN suficiente para hibridar con tramos en ambos extremos del ADNc diana (25 bases). Estos cebadores pueden ser luego utilizados para amplificar los segmentos génicos deseados mediante PCR. Los nuevos segmentos génicos resultantes pueden ser digeridos con los enzimas de restricción apropiados bajo condiciones estándar y aislados mediante electroforesis en gel. Alternativamente, pueden producirse segmentos génicos similares sometimiento a digestión la secuencia de nucleótidos con los enzimas de restricción apropiados y rellenando los segmentos génicos que faltan con oligonucleótidos sintetizados químicamente. Segmentos de la secuencia codificadora procedentes de más de un gen pueden ser ligados entre sí y clonados en vectores apropiados con el fin de optimizar la expresión de la secuencia recombinante.

Huéspedes de expresión adecuados para tales moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero tales como células de Ovario de Hámster Chino y células 293 humanas, células de insecto tales como células Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae y bacterias tales como E. coli. Para cada uno de estos sistemas celulares, un vector de expresión útil puede incluir también un origen de replicación para permitir la propagación en bacterias y un marcador seleccionable, tal como el gen de resistencia al antibiótico \beta-lactamasa, para permitir la selección en bacterias. Además, los vectores pueden incluir un segundo marcador seleccionable, tal como el gen de la fosfotransferasa de neomicina, para permitir la selección en células huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para ser utilizados en huéspedes de expresión eucarióticos pueden requerir elementos para el procesamiento del ARN, tales como secuencias de poliadenilación 3', si los mismos no son parte del ADNc de interés.

Adicionalmente, el vector puede contener promotores o intensificadores que incrementen la expresión génica. Tales promotores son específicos del huésped e incluyen los promotores de MMTV, SV40 o metalotionina para las células CHO; los promotores trp, lac, tac o T7 para huéspedes bacterianos, o los promotores del factor alfa, la alcohol oxidasa o PGH para levaduras. Pueden utilizarse intensificadores de la transcripción, tales como el intensificador de RSV, en células huésped de mamífero. Una vez que se han obtenido cultivos homogéneos de células recombinantes mediante métodos de cultivo estándar, pueden recuperarse grandes cantidades de la ADEC producida recombinantemente del medio condicionado y analizarse utilizando métodos cromatográficos conocidos en la técnica.

Además de la producción recombinante, pueden producirse fragmentos de ADEC mediante síntesis de peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida (cf. Stewart y col. (1969) Solid-Phase Peptide Syntesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield, R. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Puede realizarse una síntesis de proteínas in vitro utilizando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede ser realizada, por ejemplo, utilizando el Sintetizador Peptídico de Applied Biosystems 431A (Foster City, California) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Varios fragmentos de ADEC pueden ser sintetizados químicamente de forma separada y combinados utilizando métodos químicos para producir ADEC de longitud completa.

La ADEC para ser utilizada en la inducción de anticuerpos debe tener actividad inmunogénica. Los péptidos para ser utilizados en la inducción de anticuerpos específicos hacia ADEC comprenderán una secuencia de aminoácidos que conste de al menos cinco aminoácidos, y preferiblemente de al menos 10 aminoácidos, de tal manera que el péptido conserve la configuración tridimensional de una porción de la ADEC que existe en la naturaleza, y pueden contener la secuencia de aminoácidos completa de la ADEC que existe en la naturaleza. Tramos cortos de aminoácidos de ADEC pueden ser fusionados con los de otra proteína tal como la hemocianina de la lapa ojo de cerradura y la molécula quimérica puede ser utilizada para la producción de anticuerpos.

Los expertos en la técnica conocen diferentes métodos para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales hacia las ADECs de la presente invención. En un procedimiento, se obtiene ADEC desnaturalizada procedente de la separación por HPLC de fase reversa y se utiliza para inmunizar ratones o conejos utilizando técnicas conocidas por los expertos en el oficio. Son adecuados 100 microgramos aproximadamente para la inmunización de un ratón, mientras que puede utilizarse hasta 1 mg para la inmunización de un conejo. Para la identificación de hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada puede ser radioyodada y utilizada para someter a selección potenciales hibridomas de células B murinos por la producción de anticuerpos. Este procedimiento requiere solamente pequeñas cantidades de proteína, de tal manera que 20 mg serían suficientes para el marcaje y la selección de varios miles de clones.

En otro procedimiento, la secuencia de aminoácidos de ADEC, deducida de la secuencia del ADNc, es analizada con el fin de determinar las regiones de alta inmunogenicidad. Polipéptidos que contienen estas regiones son sintetizados y utilizados en protocolos de inmunización adecuados para producir anticuerpos. El análisis para seleccionar los epítopos apropiados está descrito por Ausubel, F.M. y col. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, John Wiley & Sons). Las secuencias de aminoácidos óptimas para inmunización están normalmente en el extremo C, en el extremo N y en las regiones hidrofílicas intermedias del polipéptido que es probable que estén expuestas al entorno externo cuando la proteína está en su conformación natural.

Típicamente, los péptidos seleccionados, de 15 residuos de longitud aproximadamente, son sintetizados utilizando un Sintetizador Peptídico de Applied Biosystems Modelo 431A utilizando la química de fmoc y acoplados a la hemocianina de la lapa ojo de cerradura (KLH, Sigma) mediante reacción en el éster M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS; cf. Ausubel, F.M. y col., supra). Si es necesario, puede introducirse una cisteína en el extremo N del péptido para permitir el acoplamiento a KLH, y los animales son inmunizados con el complejo péptido-KLH en adyuvante completo de Freund. Los antisueros resultantes son analizados para determinar su actividad antipéptido mediante la unión del péptido a un plástico, el bloqueo con BSA 1%, la reacción con los antisueros, el lavado y la reacción con anti-IgG de conejo específico producido en cabra, purificado por afinidad, marcado (radioactivo o fluorescente).

Pueden prepararse también y someterse a selección hibridomas utilizando técnicas estándar. Los hibridomas de interés son detectados mediante la selección con ADEC marcada para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. Por ejemplo, en un protocolo típico, los pocillos de placas (FAST, Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) son revestidos con anticuerpos anti-ratón específicos producidos en conejo (o con una Ig anti-especie adecuada) purificados por afinidad a 10 mg/ml aproximadamente. Los pocillos revestidos son bloqueados con BSA 1%, lavados y expuestos a los sobrenadantes de los hibridomas. Después de la incubación, los pocillos son expuestos a ADEC marcada a una concentración de 1 mg/ml aproximadamente. Los clones productores de anticuerpos se unirán a una cantidad de ADEC marcada que es detectable por encima del fondo. Tales clones son expandidos y sometidos a dos ciclos de clonaje a una dilución limitante (1 célula/3 pocillos). Los hibridomas clonados son inyectados en ratones tratados con pristano para producir líquido ascítico, y el anticuerpo monoclonal es purificado a partir del fluido ascítico del ratón mediante cromatografía de afinidad utilizando Proteína A. Se producirán típicamente anticuerpos monoclonales con afinidades de al menos 10^{8} M^{-1}, preferiblemente 10^{9} a 10^{10} o mayor, mediante los procedimientos estándar según está descrito en Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY o Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª Ed. Academic Press New York City.

Pueden producirse anticuerpos específicos para una secuencia de ADEC particular mediante la inoculación a un animal apropiado de la secuencia de ADEC. Un anticuerpo es específico para ADEC si el anticuerpo es producido contra todo o parte del polipéptido ADEC según está descrito en la SEC ID Nº:2 y se une a toda o a parte de la proteína. La inducción de anticuerpos incluye no sólo la estimulación de una respuesta inmune por la inyección a animales, sino también etapas análogas en la producción de anticuerpos sintéticos o de otras moléculas de unión específica tales como el proceso de selección de bibliotecas de inmunoglobulinas recombinantes (cf. Orlandi y col. (1989) PNAS 86:3833-3837 o Huse y col. (1989) Science 256:1275-1281) o la estimulación in vitro de poblaciones de linfocitos. La tecnología actual (Winter y Milstein (1991) Nature 349:293-299) proporciona varios reactivos de unión muy específicos basados en los principios de la formación de anticuerpos. Estas técnicas pueden ser fácilmente adaptadas para producir moléculas capaces de unirse específicamente a ADEC.

Un polinucleótido que codifique ADEC puede ser útil en el tratamiento de diferentes condiciones anormales asociadas con la angiogénesis, tales como por ejemplo tumorigénesis, artritis reumatoide, escleroderma y psoriasis. Mediante la introducción de secuencias génicas de ADEC en células, puede utilizarse terapia génica para tratar condiciones caracterizadas por una baja expresión de ADEC o por la sobreexpresión de secuencias que están asociadas con estados de enfermedad asociados a la angiogénesis. En algunos casos, el polinucleótido que codifica ADEC está destinado a sustituir o a actuar en lugar de un gen endógeno funcionalmente deficiente. Alternativamente, puede utilizarse ADEC, o fragmentos de la misma, en el tratamiento de enfermedades o condiciones asociadas con la angiogénesis.

Pueden utilizarse vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus herpes o virus del papiloma bovino, para la administración de secuencias de nucleótidos que codifiquen ADEC a la población celular diana. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores víricos recombinantes que contengan una secuencia polinucleotídica de ADEC. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y en Ausubel y col., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. Alternativamente, moléculas de ADEC recombinantes pueden ser reconstituidas en liposomas para su administración a células diana. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de estados de enfermedad asociados con la angiogénesis que comprende una cantidad eficaz de la secuencia polinucleotídica que codifica ADEC y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona además un método para el tratamiento de un paciente sometido a un estado de enfermedad asociado con la angiogénesis, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz del polinucleótido que codifica ADEC. Alternativamente, condiciones anormales caracterizadas por la sobreexpresión de ADEC, tales como condiciones asociadas con inflamación, pueden ser tratadas utilizando técnicas de terapia génica para introducir en las células un ácido nucleico antisentido con el fin de inhibir la traducción del ARNm de ADEC.

Anticuerpos, inhibidores, moléculas antisentido, receptores o análogos de ADEC (tratamientos para la producción excesiva de ADEC, abreviados de aquí en adelante "TEC") pueden proporcionar diferentes efectos cuando son administrados terapéuticamente. Los TECs serán formulados en un medio vehículo acuoso no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable, preferiblemente a un pH de 5 a 8 aproximadamente, más preferiblemente de 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo con las características del anticuerpo, el inhibidor, el receptor o el análogo que esté siendo formulado y la condición a tratar. Las características del TEC incluyen la solubilidad de la molécula, la semivida y la antigenicidad/inmunogenicidad, y pueden ayudar a definir un vehículo eficaz. Se prefieren las proteínas humanas que existen en la naturaleza como TECs, pero moléculas orgánicas resultantes de procesos de selección de fármacos pueden ser igualmente eficaces en situaciones particulares.

Los TECs pueden ser administrados por las vías de administración conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, cremas o geles tópicos; pulverizadores o aerosoles transmucosales, parches o vendajes transdérmicos; formulaciones inyectables, intravenosas o de lavado; o líquidos o píldoras administrados oralmente. La formulación particular, la dosis exacta y la vía de administración serán determinadas por el médico asistente y variarán de acuerdo con cada situación específica.

Tales determinaciones se realizan considerando múltiples variables tales como la condición a tratar, el TEC a administrar y el perfil farmacocinético del TEC particular. Factores adicionales que pueden ser tenidos en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, el paciente, la edad, el peso, el género, la dieta, la hora de administración, la combinación de fármacos, las reacciones de sensibilidad y la tolerancia/respuesta a la terapia. Podrían administrarse formulaciones para TEC de larga duración cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, dependiendo de la semivida y de la velocidad de aclaramiento del TEC particular.

Las cantidades de dosificación normales pueden variar de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de 1 g aproximadamente, dependiendo de la vía de administración. Una guía de dosificaciones particulares para los TECs está proporcionada en la literatura; ver las Patentes de EE.UU. 4.657.760; 5.206.344 ó 5.225.212. Se anticipa que formulaciones diferentes serán eficaces para diferentes TECs y que la administración dirigida al hígado puede necesitar ser de manera diferentes a la administración dirigida a la glándula pituitaria.

Se contempla que una condición asociada con adenoide inflamado o con una enfermedad que active leucocitos, particularmente monocitos y macrófagos, y que precipite un daño permanente pueda ser tratable con TECs. Estas condiciones o enfermedades pueden ser diagnosticadas específicamente por medio de los test de diagnóstico discutidos infra; tales análisis deberán ser realizados, por ejemplo, en pacientes sospechosos de estar sometidos al virus de Epstein-Barr, a la enfermedad de Hodgkin y a diferentes neoplasmas o a faringitis no específica.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos se proporcionan a manera de ilustración y no se incluyen con el fin de limitar la invención.

Ejemplos I Aislamiento de ARNm y construcción de bibliotecas de ADNc

La secuencia del ADNc de adec fue identificada inicialmente entre las secuencias polinucleotídicas que componen la biblioteca de adenoide inflamado. Esta biblioteca fue construida a partir de tejido adenoide y tejido linfoide de las amígdalas extraído quirúrgicamente de un niño durante una amigdalatomía mezclados. El tejido adenoide fue obtenido de la University of California en Los Angeles y congelado para uso futuro. El tejido congelado fue triturado en un mortero con la mano del mortero y lisado inmediatamente en tampón que contenía isotiocianato de guanidinio (cf. Chirgwin, J.M. y col. (1979) Biochemistry 18:5294). La lisis fue seguida por varias extracciones en fenol-cloroformo y precipitaciones con etanol. Se aisló el ARNm poli A+ utilizando oligo d(T) biotinilado y estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas (Poly(A) Tract Isolation Systems; Promega, Madison, WI).

El ARNm poli A procedente del tejido adenoide inflamado fue utilizado por Stratagene Inc. (11011 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037) para construir una biblioteca de ADNc. La síntesis de ADNc fue cebada utilizando oligo dT y/o hexámeros aleatorios. Adaptadores oligonucleotídicos sintéticos fueron ligados en los extremos del ADNc facilitando su inserción en el sistema de vectores UNI-ZAP™ (Stratagene Inc.). Esto permite la construcción de una biblioteca de lambda unidireccional (orientación sentido) de alta eficacia y la conveniencia de un sistema plasmídico con selección por color azul/blanco para detectar los clones con inserciones de ADNc.

La calidad de cada biblioteca de ADNc fue sometida a selección utilizando sondas de ADN o sondas de anticuerpos, y posteriormente el fagémido pBluescript® (Stratagene Inc.) fue escindido rápidamente en las células vivas. El fagémido permite la utilización de un sistema plasmídico para una fácil caracterización del inserto, secuenciación, mutagénesis dirigida a un sitio, la creación de deleciones unidireccionales y la expresión de proteínas de fusión. Partículas de fago de cada biblioteca fueron infectadas en la cepa huésped de E. coli XL-1 BLUE® (Stratagene Inc.). La elevada eficacia de transformación de XL1 BLUE incrementa la probabilidad de obtener clones poco frecuentes, sub-representados, de la biblioteca de ADNc.

II Aislamiento de los clones de ADNc

Las formas fagémido de los clones individuales de ADNc fueron obtenidas mediante el proceso de escisión in vivo, en el cual XL-1 BLUE fue coinfectada con un fago cooperador f1. Las proteínas derivadas del fago lambda y del fago cooperador f1 iniciaron una nueva síntesis de ADN a partir de secuencias definidas en el ADN diana de lambda y crearon una molécula de ADN fagémido más pequeña, circular de hebra sencilla que incluía todas las secuencias de ADN del plásmido pBluescript y el inserto de ADNc. Este ADN del fagémido fue liberado de las células y purificado, y utilizado posteriormente para volver a infectar células huésped bacterianas nuevas (SOLR, Stratagene Inc.), en las que se produjo el ADN del fagémido de doble hebra. Como el fagémido lleva el gen de la \beta-lactamasa, las bacterias recién transformadas fueron seleccionadas en un medio que contenía ampicilina.

El ADN del fagémido fue purificado utilizando el Sistema de Purificación de Plásmidos QIAWELL-8 de
QUIAGEN® DNA Purification System (QIAGEN Inc., 9259 Eton Ave., Chatsworth, CA 91311). Esta técnica proporciona un método de selección automatizada de alto rendimiento rápido y fiable para lisar las células bacterianas y aislar ADN del fagémido altamente purificado. El ADN eluido de la resina de purificación era adecuado para la secuenciación de ADN y otras manipulaciones analíticas.

III Secuenciación de los clones de ADNc

Los insertos de ADNc procedentes de aislados aleatorios de la biblioteca de adenoide inflamado fueron secuenciados en parte. Los ADNcs fueron secuenciados por el método de Sanger, F. y A.R. Coulson (1975; J. Mol. Biol. 94:441f) utilizando un Micro Lab 2200 de Hamilton (Hamilton, Reno, NV), en combinación con cuatro Cicladores Térmicos Peltier (PTC200 de MJ Research, Watertown, MA) y los Sistemas de Secuenciación de ADN 377 ó 373 de Applied Biosystems (Perkin Elmer) y se determinó el marco de lectura.

IV Búsqueda de homología de los clones de ADNc y de la proteína deducida

Cada ADNc fue comparado con secuencias del GenBank utilizando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems e incorporado en el Sistema de Análisis de Secuencias INHERIT™ 670. En este algoritmo, se utilizó el Lenguaje de Especificación de Patrones (TRW Inc., Los Angeles, CA) para determinar las regiones de homología. Los tres parámetros que determinan cómo se procesan las comparaciones de secuencias fueron el tamaño de la ventana, el desplazamiento de la ventana y la tolerancia de errores. Utilizando una combinación de estos tres parámetros, se buscó en la base de datos de ADN para encontrar secuencias que contuvieran regiones de homología con la secuencia problema, y las secuencias apropiadas fueron puntuadas con un valor inicial. Posteriormente, estas regiones homólogas fueron examinadas utilizando representaciones gráficas de homología de matrices de puntos con el fin de distinguir las regiones de homología de las coincidencias por azar. Se utilizaron las alineaciones de Smith-Waterman para presentar los resultados de la búsqueda de homología.

Las homologías de las secuencias de péptidos y proteínas fueron determinadas utilizando el Sistema de Análisis de Secuencias INHERIT™ 670 de una forma similar a la utilizada en las homologías de secuencias de ADN. Se utilizaron el Lenguaje de Especificación de Patrones y los parámetros de las ventanas para buscar en bases de datos de proteínas las secuencias que contenían regiones de homología, las cuales fueron puntuadas con un valor inicial. Se examinaron las representaciones gráficas de homología de matrices de puntos para distinguir las regiones de homología significativa de las coincidencias por azar.

Se utilizó BLAST, que significa Basic Local Aligment Search Tool (Herramienta de Búsqueda de Alineaciones Locales Básicas) (Altschul, S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, S.F. y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10), para buscar alineaciones de secuencias locales. BLAST produce alineaciones de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para determinar similitudes de secuencia. Debido a la naturaleza local de las alineaciones, BLAST es especialmente útil para determinar coincidencias exactas o para identificar homólogos. BLAST es útil para coincidencias que no contengan huecos. La unidad fundamental del resultado del algoritmo de BLAST es el Par de Segmentos de Alta Puntuación (HSP).

Un HSP consta de dos fragmentos de secuencias de longitudes arbitrarias pero iguales cuya alineación es localmente máxima y para las cuales la puntuación de alineación alcanza o excede un umbral o puntuación de corte fijada por el usuario. El procedimiento de BLAST es buscar HSPs entre una secuencia problema y una secuencia de una base de datos, evaluar la significación estadística de las coincidencias encontradas e informar solamente de aquellas coincidencias que satisfacen el umbral de significación seleccionado por el usuario. El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para informar de las coincidencias con secuencias de la base de datos. E es interpretado como el límite superior de la frecuencia esperada de la existencia casual de un HSP (o un conjunto de HSPs) dentro del contexto de la búsqueda en toda la base de datos. Cualquier secuencia de la base de datos cuya coincidencia satisfaga E es presentada en el resultado del programa.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la quimioquina expresada por adenoide, ADEC, están mostradas en la SEC ID Nº:1 y en la SEC ID Nº:2, respectivamente.

V Identificación y secuenciación del gen de longitud completa

De todos los clones recogidos aleatoriamente y secuenciados de la biblioteca de adenoide inflamado, las secuencias de adec eran homólogas a, pero claramente diferentes de, cualquier molécula de quimioquina C-X-C conocida. La secuencia de nucleótidos de adec fue encontrada en el clon de Incyte 20293. Cuando las tres posibles traducciones pronosticadas de la secuencia fueron buscadas en bases de datos de proteínas tales como SwissProt y PIR, no se encontraron coincidencias exactas para las posibles traducciones de adec. La Figura 2 muestra la comparación de ADEC con otras moléculas de quimioquinas; las regiones sustanciales de homología, incluyendo el motivo C-X-C, están sombreadas. El análisis filogenético muestra, sin embargo, que ADEC no está relacionada muy estrechamente con otras quimioquinas C-X-C humanas bien caracterizadas (Figura 3). Las más relacionadas de estas moléculas se agrupan juntas en el lado derecho de la figura. Parece que ADEC puede representar una nueva subfamilia o variante de las quimioquinas C-X-C.

VI Análisis antisentido

El conocimiento de las secuencias completas de ADNc correctas de ADEC permite su utilización en la tecnología antisentido para la investigación de la función génica. Oligonucleótidos, fragmentos de ADN genómico o de ADNc que comprendan la hebra antisentido de secuencias polinucleotídicas que codifican ADEC pueden ser utilizados in vitro o in vivo para inhibir la expresión de la proteína específica. Tal tecnología es actualmente bien conocida en el oficio y pueden diseñarse sondas en diversas posiciones a lo largo de la secuencia de nucleótidos. Mediante el tratamiento de células o de animales de ensayo completos con tales secuencias antisentido, puede desactivarse eficazmente el gen de interés. Frecuentemente, la función del gen puede ser determinada observando el comportamiento a nivel celular, tisular o del organismo (por ejemplo, letalidad, pérdida de la función diferenciada, cambios de la morfología, etc.).

Además de utilizar secuencias construidas para interrumpir la transcripción del marco de lectura abierto, pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica diseñando secuencias antisentido para regiones intrónicas, para elementos promotores/intensificadores o incluso para genes reguladores que actúan en trans. De manera similar, puede conseguirse inhibición utilizando la metodología de apareamiento de bases de Hogeboom, conocida también como apareamiento de bases en "triple hélice".

VII Expresión de ADEC

Las secuencias de nucleótidos que codifican ADEC fueron clonadas en un vector de expresión que comprende un promotor de T7 seguido por un codón de metionina de inicio (ATG), seguido por seis codones de histidina, seguidos por el gen TrxA de E coli (que codifica tiorredoxina), seguido por una secuencia que codifica un sitio de corte de enteroquinasa y secuencias de nucleótidos que codifican ADEC. Para ADEC, el residuo N-terminal de la proteína expresada es el residuo 24, Leu, de la SEC ID Nº:2.

Los vectores de expresión descritos anteriormente que contienen los 6 codones de histidina fueron utilizados para transformar una célula huésped, el cultivo de la célula huésped fue inducido con IPTG y la proteína expresada fue sometida a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante. El ácido nucleico del vector de expresión fue purificado parcialmente utilizando el procedimiento miniprep de Sambrook, supra, que produjo ADN superenrollado. Se utilizaron 100 ng de ADN aproximadamente para transformar la célula bacteriana huésped, W3110/DE3. W3110/DE3 fue construida utilizando W3110 de la ATCC y el kit de lisogenización de DE3 con lambda disponible comercialmente en Novagen. Las formas lisógenas de DE3 son a menudo menos competentes que su parental W3110, y están adaptados a la utilización de ADN superenrollado para una transformación eficaz.

Se seleccionó un único transformante de cada transformación con quimioquina y se utilizó para inocular un cultivo de 5 ml de caldo L que contenía ampicilina. Cada cultivo de 5 ml fue cultivado durante una noche (12-15 horas) a 37ºC con agitación. Al día siguiente, se utilizó 1 ml del cultivo de una noche para inocular un cultivo de 100 ml de caldo L con ampicilina en un matraz de 500 ml y se dejó crecer a 37ºC con agitación hasta que la DO600 del cultivo alcanzó 0,4-0,6. Si las células inoculadas se dejan crecer por encima de una DO600 de 0,6, comenzarán a alcanzar la fase estacionaria y se reducirán los niveles de inducción.

En el momento de la inoculación, se extrajo una muestra de 5 ml, se colocó sobre hielo y se utilizó como muestra preinducción (u hora 0). Cuando el cultivo celular alcanzó una DO600 de 0,6, se añadieron 400 \mul de una solución madre de IPTG 100 mM para obtener una concentración final de 0,4 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 9 horas a 37ºC con agitación. El análisis de la inducción fue determinado tomando muestras de alícuotas del cultivo de 5 ml a intervalos de 1 hora hasta 6 horas y analizándolas en una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante. La proteína de fusión parecía acumularse en la fracción insoluble de las células.

La inducción máxima de ADEC tenía lugar hacia las 2 horas. El crecimiento más allá de 4 horas tenía como resultado la lisis del cultivo y rendimientos totales reducidos de la proteína deseada debido a proteolisis. Se obtuvieron alícuotas de 5 ml de los cultivos celulares a las 0, 1 y 2 horas y se centrifugaron durante 5 minutos a 3000 RPM a 4ºC. El sobrenadante fue aspirado y las pellas fueron sometidas a una etapa de congelación-descongelación para facilitar la lisis de las células. La pella fue resuspendida en TE [Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0] a 4ºC y a un volumen calculado como: vol TE(\mul) = (DO600)(250), y se añadió a cada muestra un volumen equivalente de SDS 2X Tampón de Carga de Muestra (Novex). Las muestras fueron sometidas a ebullición durante 5 minutos y se cargaron 10 \mul de cada muestra por calle. Los resultados de la electroforesis en gel muestran que la proteína de fusión de ADEC migraba a un peso molecular de 24 kD (con un peso esperado de 24093 Dalton) en un gel de SDS desnaturalizante).

VIII Aislamiento de ADEC recombinante

La ADEC fue expresada como una proteína quimérica que tenía seis histidinas seguidas por el gen de la tiorredoxina (TrxA) de E. coli con un sitio de corte de enteroquinasa entre la proteína TrxA y ADEC. Las histidinas fueron añadidas para facilitar la purificación de la proteína. La presencia de las histidinas permite la purificación en cromatografía IMIAC (Porath, supra).

IX Producción de anticuerpos específicos hacia ADEC

Se prepararon anticuerpos policlonales hacia PGEC inyectando a conejos 100 \mug aproximadamente de la proteína de fusión PGEC purificada por electroforesis según se describió en la Sección VII. Ocho semanas aproximadamente después de la inyección del antígeno primario, se recogió el antisuero policlonal. Se prepararon anticuerpos policlonales hacia un péptido de ADEC, que constaba de los residuos 25 a 42 de ADEC de la SEC ID Nº:2, mediante métodos estándar.

X Análisis de diagnóstico utilizando anticuerpos específicos hacia ADEC

Anticuerpos hacia ADEC particulares son útiles para el diagnóstico de condiciones prepatológicas y de enfermedades crónicas o agudas que se caracterizan por diferencias en la cantidad o en la distribución de ADEC. Es probable que ADEC sea específica de anormalidades o patologías de tejidos particulares en los que se ha identificado.

Los análisis de diagnóstico de ADEC incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una marca para detectar ADEC en fluidos corporales, tejidos o extractos de tales tejidos humanos. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados uniendo los mismos, covalentemente o no covalentemente, a una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y han sido descritas extensamente en la literatura científica y en la literatura de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Patentes que describen la utilización de tales marcas incluyen las Patentes de EE.UU. N^{os} 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Pueden producirse también inmunoglobulinas recombinantes según se muestra en la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567.

Se conocen en la técnica una variedad de protocolos para medir ADEC soluble o unida a membranas, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para esa ADEC. Los ejemplos incluyen el ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y la selección de células activadas por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo basado en monoclonales hacia dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos no interferentes de ADEC, pero puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos ensayos están descritos, entre otros lugares, en Maddox, D.E. y col. (1983, J. Exp. Med. 158:1211).

XI Purificación de ADEC nativa utilizando anticuerpos específicos

Se purificó la ADEC nativa o recombinante mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos hacia ADEC. En general, una columna de inmunoafinidad se construye acoplando covalentemente el anticuerpo anti-ADEC a una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales son preparadas como en el Ejemplo IX y los anticuerpos monoclonales son preparados a partir de fluido ascítico de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada es unida covalentemente a un resina cromatográfica tal como Sefarosa activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo es acoplado a la resina, la resina es bloqueada y la resina derivatizada es lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Tal columna de inmunoafinidad es utilizada en la purificación de ADEC mediante la preparación de una fracción de las células que contienen ADEC en una forma soluble. La ADEC soluble es derivada solubilizando la célula completa o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial por la adición de detergente o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, ADEC soluble conteniendo una secuencia señal puede ser secretada en una cantidad útil al medio en el que las células son cultivadas.

Una preparación conteniendo ADEC soluble es pasada sobre una columna de inmunoafinidad y la columna es lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de ADEC (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). La ADEC es eluida de la columna bajo condiciones que rompen la unión anticuerpo/ADEC (por ejemplo, un tampón de pH 2-3 o una concentración elevada de un agente caotrópico tal como urea o ión tiocianato) y se recoge la ADEC.

XII Determinación de quimiotaxis o de activación celular inducidas por ADEC

La actividad quimiotáctica de ADEC es medida en una cámara de microquimiotaxis de 48 pocillos (Falk, W.R. y col. (1980) J. Immunol. Methods 33:239). En cada pocillo, dos compartimentos están separados por un filtro que permite el paso de las células como respuesta a un gradiente químico. En un lado del filtro, normalmente de policarbonato, se coloca medio de cultivo celular tal como RPMI 1640 conteniendo ADEC y las células suspendidas en el mismo medio son colocadas en el lado opuesto del filtro. Se deja un tiempo de incubación suficiente para que las células atraviesen el filtro como respuesta al gradiente de concentración a través del filtro. Se recuperan los filtros de cada pocillo y se tipifican y cuantifican las células adheridas al lado del filtro expuesto a ADEC.

Se determina la especificidad de la quimioatracción realizando el ensayo de quimiotaxis en poblaciones específicas de células. Primeramente, células sanguíneas obtenidas de punción venosa son fraccionadas mediante centrifugación en gradiente de densidad y se analiza la actividad quimiotáctica de ADEC en poblaciones enriquecidas de neutrófilos, células mononucleares de sangre periférica, monocitos y linfocitos. Opcionalmente, tales poblaciones celulares enriquecidas son fraccionadas adicionalmente utilizando anticuerpos específicos hacia CD8+ y CD4+ para la selección negativa de poblaciones de células T enriquecidas en CD4+ y CD8+, respectivamente.

Otro ensayo determina el efecto quimiotáctico de ADEC sobre células T activadas. En el mismo, se cultivan células T no fraccionadas o subgrupos de células T fraccionadas durante 6 a 8 horas en recipientes para cultivo de tejidos revestidos con un anticuerpo hacia CD3. Después de esta activación de CD3, se analiza la actividad quimiotáctica de ADEC según se describió anteriormente. Otros muchos métodos para obtener poblaciones celulares enriquecidas son conocidos por los expertos en la técnica.

Tales quimioquinas producen también una activación celular no quimiotáctica de neutrófilos y monocitos. Ésta es analizada mediante medidas estándar de la activación de neutrófilos tales como la polimerización de actina, el incremento de la actividad del estallido respiratorio, la desgranulación de los gránulos azurofílicos y la movilización de Ca++ como parte de la ruta de transducción de señales. El ensayo de movilización de Ca++ implica la precarga de los neutrófilos con una sonda fluorescente cuyas características de emisión han sido alteradas por la unión a Ca++. Cuando las células son expuestas a un estímulo activador, se determina el flujo de Ca++ por observación de las células en un fluorímetro. La medida de la movilización de Ca++ ha sido descrita en Grynkievicz, G. y col. (1983) J. Biol. Chem. 260:3440 y McColl, S. y col. (1993) J. Immunol. 150:4550-4555.

Las respuestas de desgranulación y del estallido respiratorio son medidas también en monocitos (Zachariae, C.O.C. y col. (1990) J. Exp. Med. 171:2177-82). Medidas adicionales de la activación de monocitos son la regulación de la expresión de moléculas de adhesión y la producción de citoquinas (Jiang, Y. y col. (1992) J. Immunol. 148:2423-8). La expresión de moléculas de adhesión varía también con la activación de linfocitos (Taub, D. y col. (1993) Science 260:355-358).

XIII Procedimiento de selección de fármacos

La ADEC, o fragmentos de la misma, son particularmente útiles para la selección de compuestos en cualquiera de una amplia variedad de técnicas de selección de fármacos. El polipéptido ADEC o el fragmento empleado en tal ensayo puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, llevado en la superficie de una célula o localizado intracelularmente. Un método de selección de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que son transformadas de manera estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o los fragmentos del mismo. Los fármacos son sometidos a selección frente a tales células transformadas en ensayos de unión competitiva. Tales células, en forma viable o fijada, pueden ser utilizadas para ensayos de unión estándar. Puede medirse, por ejemplo, la formación de complejos entre ADEC o un fragmento y el agente que está siendo analizado, o examinarse la disminución de la formación de complejos entre ADEC y un neutrófilo o un fibroblasto causada por el agente que está siendo analizado.

Por tanto, la presente invención proporciona métodos de selección de fármacos o de otros agentes que puedan tener efecto sobre la inflamación y enfermedades. Estos métodos comprenden la puesta en contacto de tal agente con un polipéptido ADEC o un fragmento del mismo y el análisis (i) para determinar la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido ADEC o el fragmento, o (ii) para determinar la presencia de un complejo entre el polipéptido ADEC o el fragmento y la célula, por métodos bien conocidos en la técnica. En tales ensayos de unión competitiva, el polipéptido ADEC, o el fragmento, está típicamente marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido ADEC o el fragmento libre es separado del que está presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o no acomplejada es una medida de la capacidad del agente particular para unirse a ADEC o para interferir con el complejo ADEC/célula.

Otra técnica para la selección de fármacos proporciona una selección automatizada de alto rendimiento de compuestos que tengan una afinidad de unión adecuada a los polipéptidos ADEC y está descrita con detalle en la Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. Explicada brevemente, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos peptídicos de ensayo pequeños sobre un sustrato sólido, tal como púas de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con el polipéptido ADEC y se lavan. Posteriormente se detecta el polipéptido ADEC unido mediante métodos bien conocidos en la técnica. ADEC purificada puede ser también revestida directamente sobre placas para ser utilizadas en las técnicas de selección de fármacos anteriormente mencionadas. Además, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.

Esta invención contempla también la utilización de ensayos competitivos para la selección de fármacos en los que anticuerpos neutralizantes capaces de unirse específicamente a ADEC, compiten con un compuesto de ensayo para unirse al polipéptido ADEC o a fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con ADEC.

XIV Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de pequeñas moléculas con las que los cuales interaccionan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede ser utilizado para idear fármacos que sean formas más activas o estables del polipéptido o que incrementen o interfieran con la función de un polipéptido in vivo (cf. Hodgson, J. (1991) Bio/Technology 9:19-21).

En un procedimiento, se determina la estructura tridimensional de ADEC, o de un complejo ADEC-inhibidor, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelización por ordenador o, más típicamente, mediante una combinación de ambos procedimientos. La forma y las cargas del polipéptido deben ser determinadas para elucidar la estructura y determinar el(los) sitio(s) activo(s) de la molécula. Menos frecuentemente, puede obtenerse información útil concerniente a la estructura de un polipéptido mediante modelización basada en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, se utiliza la información estructural relevante para diseñar moléculas similares a quimioquinas análogas o para identificar inhibidores eficaces. Ejemplos útiles de diseño racional de fármacos pueden incluir moléculas que tengan actividad o estabilidad mejoradas según está mostrado por Braxton, S. y Wells, J.A. (1992, Biochemistry 31:7796-7801) o que actúen como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos según está mostrado por Athauda, S.B. y col. (1993, J. Biochem. 113: 742-746).

Es posible también aislar un anticuerpo específico de una diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, según se describió anteriormente, y determinar posteriormente su estructura cristalina. Este procedimiento, en principio, da lugar a un farmacóforo sobre el que puede basarse el posterior diseño de fármacos. Es posible evitar del todo la cristalografía de proteínas generando anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) hacia un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen especular, se espera que el sitio de unión de los anti-ids sea un análogo del receptor original. El anti-id podría ser utilizado posteriormente para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos químicamente o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían luego como farmacóforo.

En virtud de la presente invención, puede hacerse disponible una cantidad suficiente de polipéptido para llevar a cabo tales estudios analíticos tales como la cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de ADEC proporcionada en la presente proporcionará una orientación a aquellas personas que empleen técnicas de modelización por ordenador en lugar de, o además de, la cristalografía de rayos X.

XV Identificación de receptores de ADEC

La ADEC purificada es útil para la caracterización y purificación de receptores específicos en la superficie celular y de otras moléculas de unión. Es probable que células que respondan a ADEC por quimiotaxis o mediante otras respuestas específicas expresen un receptor de ADEC. Pueden incorporarse marcas radioactivas a la ADEC mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Una realización preferida es el marcaje de grupos amino primarios de ADEC con el reactivo de Bolton-Hunter ^{125}I (Bolton, A.E. y Hunter, W.M. (1973) Biochem. J. 133:529), que ha sido utilizado para marcar otras quimioquinas sin la pérdida concomitante de actividad biológica (Hebert, C.A. y col. (1991) J. Biol. Chem. 266:18989; McColl, S. y col. (1993) J. Immunol. 150:4550-4555). Células portadoras de receptores son incubadas con ADEC marcada. Las células son lavadas posteriormente para eliminar el ADEC no unido y se cuantifica el ADEC unido a receptores. Los datos obtenidos utilizando diferentes concentraciones de ADEC son utilizados para calcular los valores del número y la afinidad de los receptores.

La ADEC marcada es útil como reactivo para la purificación de su receptor específico. La ADEC es acoplada covalentemente a una columna de cromatografía. Se extraen las células portadoras de receptores y se pasa el extracto sobre la columna. El receptor se une a la columna en virtud de su afinidad biológica por ADEC. El receptor es recuperado de la columna y sometido a secuenciación proteica N-terminal. Esta secuencia de aminoácidos es utilizada posteriormente con el fin de diseñar sondas oligonucleotídicas degeneradas para el clonaje del gen del receptor.

En un método alternativo, clonaje por expresión, se obtiene ARNm de células portadoras de receptores y se convierte en una biblioteca de expresión de ADNc. La biblioteca es transfectada a una población de células, y aquellas células de la población que expresen el receptor son seleccionadas utilizando ADEC marcada con fluorescencia. El receptor es identificado mediante la recuperación y secuenciación del ADN recombinante procedente de las células intensamente marcadas.

En otro método alternativo, se producen anticuerpos monoclonales contra la superficie de las células portadoras de receptores y se someten a selección para identificar aquellos que inhiben la unión de ADEC marcada. Estos anticuerpos monoclonales son utilizados posteriormente en la purificación por afinidad o en el clonaje por expresión del receptor.

Los receptores solubles u otras moléculas de unión solubles son identificadas de manera similar. Se incuba ADEC marcada con extractos o con otros materiales apropiados derivados de adenoide inflamado. Después de la incubación, se identifican los complejos de ADEC más grandes que el tamaño de la ADEC purificada mediante una técnica de determinación de tamaños tal como la cromatografía de exclusión de tamaños o la centrifugación en gradiente de densidad y se purifican por métodos conocidos en la técnica. Los receptores solubles o la(s) proteína(s) de unión son sometidos a secuenciación N-terminal con el fin de obtener una información suficiente para la identificación en bases de datos, si la proteína soluble es conocida, o para el clonaje, si la proteína soluble es desconocida.

Se considera que la anterior especificación escrita es suficiente para permitir a una persona experta en la técnica practicar la invención. En efecto, diferentes modificaciones de los modos de llevar a cabo la invención anteriormente descritos que sean obvias para los expertos en el campo de la biología molecular o en campos relacionados, están destinadas a estar dentro del ámbito de las reivindicaciones siguientes.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UNA NUEVA QUIMIOQUINA EXPRESADA EN ADENOIDE INFLAMADO, SU PRODUCCIÓN Y USOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 3174 Porter Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Palo Alto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 94304

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: WordPerfect 6.1/MS-DOS 6.2

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOLICITUD DE PCT Nº: Por Asignar

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 07-DIC-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nº DE SERIE DE LA SOLICITUD: US 08/352.324

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 07-DIC-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: LUTHER, BARBARA J.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33954

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: PF-0025 PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415-855-0555

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415-852-0195

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 330 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Adenoide Inflamado

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(B)

CLON: 20293

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Adenoide Inflamado

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(B)

CLON: 20293

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

6

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 99 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:

9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 109 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:

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12

Claims (17)

1. Un polipéptido que comprende la secuencia peptídica de la SEC ID Nº:2, un derivado del mismo o una variante o fragmento de la SEC ID Nº:2 que tenga actividad quimiotáctica o que sea capaz de activar neutrófilos o monocitos, donde la variante es el resultado de sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o de inserciones o deleciones de aminoácidos de 1 a 5 aminoácidos.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene:

(a) un residuo de aminoácido N-terminal del residuo 24, leucina, de la SEC ID Nº:2;

(b) un residuo de aminoácido N-terminal del residuo 25, ácido glutámico, de la SEC ID Nº:2; o

(c) un péptido purificado que consta de los residuos de aminoácidos 25 a 42 de la SEC ID Nº:2.

3. Un polinucleótido que comprende una secuencia que:

(a) codifica un polipéptido como el definido en cualquiera de las reivindicaciones precedentes;

(b) es capaz de hibridar con el polinucleótido de (a) bajo condiciones rigurosas; o

(c) es un fragmento de (a) o (b) de al menos 15 nucleótidos.

4. Un polinucleótido purificado de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido que tiene la secuencia representada en la SEC ID Nº:2, o su complemento, o la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº:1.

5. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, que es una sonda que contiene un fragmento no conservado de al menos 15 nucleótidos del polinucleótido de la SEC ID Nº:1 o una molécula antisentido que comprende una secuencia polinucleotídica complementaria a al menos 15 nucleótidos del polinucleótido de SEC ID Nº:1.

6. Un vector que comprende un polinucleótido como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Una célula huésped que comprende, o ha sido transfectada con, un vector de expresión como el definido en reivindicación 6, o que ha sido transformada o transfectada con un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

8. Un método para producir un polipéptido, comprendiendo el método:

(a) el cultivo de células huésped como las definidas en la reivindicación 7 bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido; y

(b) la recuperación del polipéptido del cultivo celular.

9. Un método de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótidos que codifiquen una quimioquina expresada en adenoide en una muestra biológica, comprendiendo el método:

(a) la combinación de una muestra biológica con una primera secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº:1, o un fragmento de la misma, bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo de hibridación del ácido nucleico;

(b) la detección de cualquier complejo de hibridación, donde la presencia de tal complejo se correlaciona con la presencia en la muestra biológica de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la quimioquina 1 expresada en adenoide; y

(c) la comparación de la cantidad de la segunda secuencia de nucleótidos en la muestra con un estándar, determinando de este modo si la cantidad de la segunda secuencia de nucleótidos varía del estándar, donde la presencia de un nivel anormal de la segunda secuencia de nucleótidos se correlaciona positivamente con una condición asociada a inflamación.

10. Un método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la primera secuencia de nucleótidos está marcada con una molécula informadora y el complejo de hibridación es detectado midiendo la molécula informadora.

11. Un método de ensayo de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótidos que codifiquen una quimioquina expresada en adenoide en una muestra biológica, comprendiendo el método:

(a) la combinación de una muestra biológica con cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificación del ácido nucleico, donde los cebadores comprenden fragmentos de la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº1;

(b) la detección de cualquier secuencia de nucleótidos amplificada; y

(c) la comparación de la cantidad de secuencias de nucleótidos amplificadas en la muestra biológica con un estándar, determinando de este modo si la cantidad de dicha secuencia de nucleótidos varía del estándar, donde la presencia de un nivel anormal de la secuencia de nucleótidos se correlaciona positivamente con una condición asociada a inflamación.

12. Un anticuerpo específico para un polipéptido como el definido en la reivindicación 1 ó 2, o un hibridoma productor de tal anticuerpo.

13. Una composición farmacéutica que contiene un polipéptido como el definido en la reivindicación 1 ó 2, un polinucleótido como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, para ser utilizados en un método de tratamiento o diagnóstico practicado en un organismo humano o animal.

15. La utilización de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, de un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, para la fabricación de un medicamento para tratar un estado de enfermedad asociado con angiogénesis.

16. La utilización de acuerdo con la reivindicación 15, para el tratamiento de tumorigénesis, artritis reumatoide, escleroderma o psoriasis.

17. Un kit de diagnóstico que contiene un polinucleótido como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o un anticuerpo como el definido en la reivindicación 12.