MXPA97004276A - Una quimiocina novedosa expresada en adenoides inflamadas, su produccion y usos - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos y aminoácidos que identifican y codifican una quimiocina novedosa expresada (ADEC) de tejido adenoideo inflamado. La presente invención también proporciona moléculas anti-sentido a las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC, vectores de expresión para la producción de ADEC purificado, anticuerpos capaces de fijarse específicamente a ADEC, sondas de hibridación u oligonucleótidos para la detección de secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC, células huésped genéticamente diseñadas para la expresión de ADEC, pruebas de diagnóstico para detectar inflamación o enfermedades en base a las moléculas deácido nucleico que codifican a ADEC o anticuerpos capaces de fijarse específicamente ADEC.

Description

UNA OÜIMIOCINA NOVEDOSA EXPRESADA EN ADENOIDES INFLAMADAS. SU PRODUCCIÓN Y USOS.

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud está relacionada con la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica copendiente con Número de Serie 08/ 194,317 titulada Novedosos Polipéptidos Derivados de Células de Adenoides Humanas, Su Producción y Usos, presentada el 4 de febrero de 1994.

TÉCNICA ANTERIOR Los leucocitos, incluyendo monocitos, macrófagos, basófilos, y eosinófilos, juegan papeles importantes en los mecanismos patológicos iniciados por linfocitos T y/o B. Los macrófagos, en particular, producen oxidantes y proteasas poderosos que contribuyen a la destrucción del tejido y segregan un rango de citocinas que alistan y activan otras células inflamatorias. La investigación de los procesos críticos, reguladores mediante los cuáles las células blancas avanzan a su destino apropiado e interactúan con otras células está en camino. El modelo actual del movimiento o tráfico de los leucocitos desde la sangre hacia tejidos dañados* o inflamados comprende los siguientes pasos. El primer paso es la adhesión enrolladora del leucocito a lo largo de las células endoteliales de la pared del vaso sanguíneo. Este movimiento está mediado por interacciones transitorias entre selectinas y sus ligandos. Un segundo paso envuelve la activación celular que promueve una interacción celular leucocito-endotelial más estable mediada por las integrinas y sus ligandos. Esta adhesión más fuerte, más estable precipita los pasos finales de diapédesis y extravasación del leucocito dentro de los tejidos . La familia quimiocina de las citocinas de polipéptido, también conocidas como intercrinas, posee la especificidad celular requerida para explicar el tráfico del leucocito en diferentes situaciones inflamatorias. En primer lugar, las quimiocinas median la expresión de moléculas de adhesión particulares en células endoteliales; y en segundo lugar, éstas generan gradientes de factores quimioatrayentes, los cuáles activan tipos específicos de células. En adición, las quimiocinas estimulan la proliferación de tipos específicos de células y regulan la activación de células que portan receptores específicos. Ambas actividades demuestran un alto grado de especificidad celular objetivo. Las quimiocinas son polipéptidos pequeños, generalmente de aproximadamente 70-100 amino ácidos (aa) de longitud, 8-10 kD de peso molecular y activas sobre un rango de concentración de 1-100 ng/mililitro. Inicialmente, éstas se aislaron y purificaron a partir de tejidos inflamados y caracterizados con relación a su bioactividad. Más recientemente, se han descubierto quimiocinas a través de técnicas de clonación molecular y se han caracterizado mediante análisis estructurales, así como funcionales. Las quimiocinas están relacionadas a través de un motivo de cuatro cisteínas, el cuál se basa principalmente en el espaciamiento de los dos primeros residuos de cisteína en la molécula madura. Actualmente las quimiocinas están asignadas a una de dos familias, las quimiocinas C-X-C (a) y las quimiocinas C-C ( ß) . Aunque existen excepciones, las quimiocinas C-X-C generalmente activan los neutrófilos y los fibroblastos, mientras que las quimiocinas C-C actúan sobre un grupo más diverso de células objetivo que incluyen monocitos/macrófagos, basófilos, eosinófilos, linfocitos T y otros. Las quimiocinas conocidas de ambas familias se sintetizan mediante muchos tipos diferentes de células, como se revisa en Thomson A. (1994) The Cytokine Handbook, 2a Edición, Academic Prese, NY. Se describirán a su vez los dos grupos de quimiocinas. La quimiocina. C-X-C arquetípica y más extensamente estudiada es el factor de plaquetas 4 (PF4) . Esta proteína de 70 amino ácidos despliega las cuatro cisteínas definitivas y se libera junto con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , el factor de crecimiento transformante ß (TGF-/3) y la 0-tromboglobulina i ß-TG) , de los granulos de las plaquetas estimuladas . Esta molécula homotetramérica comparte similitud estructural con la interleucina-8 (IL-8) , induce la migración de los fibroblastos, neutrófilos y monocitos, y fija la heparina. El factor de plaquetas 4 proporciona el modelo biológico para un enlace entre trombosis, inflamación y curación de heridas . Otras quimiocinas encontradas en el granulo a de la plaqueta incluyen la ß-tromboglobulina, la proteína de activación de tejido conectivo III (CTAP-III) y el péptido de activación de neutrófilos 2 (NAP-2) . Los tres péptidos se derivan a partir del procesamiento diferencial de una molécula precursora, la proteína básica de plaquetas (PBP) . La ß-tromboglobulina es una proteína de 81 amino ácidos, altamente básica que tiene influencia en la migración de los fibroblastos, pero que no tiene ningún efecto sobre los neutrófilos ni los monocitos. La proteína de activación de tejido conectivo III tiene 85 amino ácidos de largo, y los amino ácidos 4-85 son idénticos a la ß-tromboglobulina. , ?e?;to que la proteína de activación de tejido conectivo III es la proteína primaria en el granulo a, y no se ha aclarado su papel como una proteína purificada, ésta pudiera ser un precursor secundario, inactivo hasta que se procesará más. Parece que el péptido de activación de neutrófilos 2 atrae neutrófilos, pero no monocitos. Las quimiocinas C-X-C no plaquetas incluyen la interleucina-8, la proteína inducible por y interferón (IP-10) , proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos (MGSA o gro) , atrayente-78 de neutrófilos derivados epiteliales (ENA-78) , proteína quimiotáctica de granulocitos 2 (GCP-2) y factores-lo; y -1/3 derivados de células estromales (SDF-IQÍ y - Iß) . La interleucina-8 (también conocida como NAP-1) la secretan monocitos/macrófagos, neutrófilos, fibroblastos, células endoteliales, queratinocitos y linfocitos T, en respuesta a citocinas proinflamatorias, interleucina-1 y 3, IFN-? y TNF, así como a endotoxinas, mitógenos, particulados, bacterias y virus. La interleucina-8 estimula la inflamación aguda, incluyendo la regulación ascendente tanto de la adhesión de neutrófilos, como del crecimiento de queratinocitos, y la regulación descendente de la producción de histamina por los basófilos. La proteína inducible por ? interferón es una proteína de 10 kD de función indefinida, cuyo ARNm se ha encontrado en monocitos, fibroblastos y células endoteliales. Los monocitos, queratxnocitos y las células T activadas segregan la proteína inducible por ? interferón que se ha localizado en sitios de reacciones de hipersensibilidad retardada. El ADNc de las proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos a produce una proteína de 15 kD que aparece en los fibroblastos. Su transcripción está relacionada con el crecimiento, y ésta funciona como un factor de crecimiento autocrino. Las formas distintas y no alélicas, proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos ß y proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos g son 90 por ciento y 86 por ciento idénticas a las proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos a, respectivamente. Las proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos a recombinantes atraen y activan a los neutrófilos. El atrayente-78 de neutrófilos derivados epiteliales se purificó a partir de sobrenadantes de células alveolares del pulmón. Al igual que las proteínas de actividad estimulante de crecimiento de melanocitos ?, éste atrae y activa a los neutrófilos in vitro. La proteína quimiotáctica de granulocitos 2 es una proteína de 6 kD aislada a partir de los sobrenadantes de las células del osteosarcoma. La proteína quimiotáctica de granulocitos 2 existe en diferentes formas truncadas de terminal N, y ésta atrae y activa a los neutrófilos in vitro. y ocasiona la acumulación de granulocitos in vivo. Los factores-la y -13 derivados de células estromales son ADNc's recién aislados que codifican moléculas segregadas y proteínas de membrana tipo I. Strieter y colaboradores (1995) Journal'of'Leukocyte Biology.» 57:752-762 ("Strieter A") y Strieter y colaboradores (1995) The Journal of Bioloaical Chemistrv. 270:27348-27357 ("Strieter B"), demuestran que la familia C-X-C de las quimiocinas despliega actividad angiogénica distinta, dependiendo de la prese cia o ausencia del motivo ELR (Glu-Leu-Arg) con terminal NH2 que procede del primer residuo amino ácido de cisteína del miembro de la familia de quimiocinas C-X-C. Por ejemplo, se ha mostrado que la interleucina-8, una quimiocina C-X-C de ELR, exhibe propiedades angiogénicas, mientras que se ha mostrado que el factor de plaquetas 4, un no ELR, inhibe la angiogénesis . La angiogénesis, caracterizada por la neoformación de vasos sanguíneos, es un evento biológico esencial en la embriogénesis, la curación de heridas, la inflamación crónica y el crecimiento de tumores sólidos malignos. Strieter B sugiere que un desbalance biológico en la producción de factores angiogénicos y angiostáticos contribuye a la patogénesis de muchos desórdenes dependientes de la angiogénesis, incluyendo artritis reumatoide, esclerodermia, psoriasis y tumorogénesis . Strieter A también sugiere que las quimiocinas C-X-C no ELR, tales como la proteína inducible por interferón y el factor de plaquetas 4, tendrán un efecto negativo sobre la tumorogénesis a través de una reducción en la actividad angiogénica derivada del tumor. Las técnicas actuales para el diagnóstico de anormalidades en los tejidos inflamados o enfermos dependen principalmente de la observación de síntomas clínicos o análisis serológicos de tejidos o fluidos del cuerpo para hormonas, polipéptidos o diferentes metabolitos. Frecuentemente los pacientes no manifiestan síntomas clínicos en las etapas tempranas del desarrollo de la enfermedad o el tumor. Por otra parte, los análisis serológicos no siempre diferencian entre enfermedades invasivas y síndromes genéticos que tienen rangos traslcipados o muy similares. De esta manera, es importante el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico que comprendan moléculas pequeñas tales como las quimiocinas expresadas, para proporcionar diagnósticos tempranos y exactos, para dar un mejor entendimiento de la patogénesis molecular, y para usarse en el desarrollo de terapias efectivas . En Schall TJ (1994) Chemotactic Cytokines: Targets for Therapeutic Development, International Business Communications, Southborough, MA, pp 180-270; y en Paul WE (1993) Fundamental Immunology, 3a Edición, Raven Press, NYC, pp 822-826, se revisaron las moléculas de quimiocina.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifican de manera única a una proteína humana novedosa de adenoide inflamada. El nuevo gen, que se conoce como quimiocina expresada en adenoides, o adec (Incyte Clone No. 20293) , codifica un polipéptido designado ADEC, de la familia de la quimiocina C-X-C. La invención también comprende pruebas de diagnóstico para condiciones inflamatorias que incluyen pasos para probar una muestra o un extracto de la misma con DNA de adec, fragmentos u oligómeros del mismo. Los aspectos de la invención incluyen moléculas anti -sentido de adec; vectores de clonación o expresión que contienen ácido nucleico que codifica a ADEC; células huésped u organismos transformados con vectores de expresión que contienen ácido nucleico que codifica a ADEC; ADEC purificado y métodos para la producción y recuperación de ADEC purificado de células huésped.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos para la quimiocina expresada en adenoides (adec) y la secuencia de amino ácidos (aa) predicha de ADEC (SEQ ID NO:l y SEQ ID NO : 2 ) . La Figura 2 muestra el alineamiento de amino --idos de ADEC con otras quimiocinas humanas de la familia C-X-C. Los alineamientos que se muestran se produjeron usando el programa de alineamiento de secuencia múltiple del software DNASTAR (DNASTAR Inc, Madison Wl) . La Figura 3 muestra un árbol familiar de las quimiocinas C-X-C humanas. El árbol filogenético se generó mediante el programa de árbol filogenético del software DNASTAR (DNASTAR Inc, Madison Wl) , usando el método Clustal con la tabla de peso de residuo PAM250. La Figura 4 muestra un análisis de hidrofobicidad y características inmunogénicas de ADEC, en base a la secuencia de amino ácidos y composición predichas .

MANERAS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Definiciones Como se usa en la presente, "quimiocina expresada en adenoides" o ADEC, se refiere a un polipéptido descrito en el SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo, que se codifica mediante un ARNm transcrito a partir del ácido nucleico del SEQ ID NO:l. El ADEC puede ocurrir de manera natural o ser sintetizado químicamente. Como se usa en la presente, "adec" en letras minúsculas se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos, mientras que "ADEC" en letras mayúsculas se refiere a una proteína, un péptido, o una secuencia de amino ácidos. Como se usa en la presente, el término "activo" se refiere a aquellas formas de ADEC que retienen las actividades biológicas e/o inmunológicas del ADEC que ocurre de manera natural . Como se usa en la presente, el término "ADEC que ocurre de manera natural" se refiere a ADEC producido por células humanas que no se han diseñado genéticamente, y específicamente contempla diferentes formas de ADEC que surgen de modificaciones post-traslacionales del polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como se usa en la presente, el término "derivado" se refiere a polipéptidos derivados de ADEC que ocurre de manera natural, mediante modificaciones químicas tales como ubicuitinación, etiquetación (por ejemplo, con radionúclidos, diferentes modificaciones enzimáticas) , pegilación (derivatización con glicol de polietileno) , o mediante inserción o sustitución mediante la síntesis química de amino ácidos tal como omitiría, que no ocurren normalmente en las proteínas humanas . Como se usa en la presente, el término "variante" o "mutante" o "variante recombinante" se refiere a cualquier polipéptido que difiere del ADEC que ocurre de manera natural, mediante inserciones, supresiones, y sustituciones de amino ácidos, que se crean usando técnicas de ADN recombinante. Se puede encontrar guía al determinar qué residuos de amino ácidos se pueden reemplazar, agregar o suprimir sin anular las actividades de interés, la adhesión de células y la quimiotaxis, mediante la comparación de la secuencia del ADEC particular con aquellas de citocinas homologas, y minimizando el número de cambio de secuencia de amino ácici, s .hechos en regiones de homología elevada. De preferencia, las sustituciones de amino ácidos son el resultado del reemplazo de un amino ácido con otro amino ácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina, es decir, reemplazos conservadores de amino ácidos. Las inserciones o supresiones típicamente están en el rango de aproximadamente 1 a 5 amino ácidos . La variación permitida se puede determinar experimentalmente por medio de hacer inserciones, supresiones, o sustituciones de amino ácidos de manera sistemática, en el ADEC usando técnicas de ADN recombinante y haciendo ensayos con las variantes recombinantes resultantes para ver su actividad. En donde se desee, el ADEC o una variante de ADEC se puede diseñar genéticamente para que contenga una "secuencia de señal o líder" que pueda dirigir al polipéptido a través de la membrana de una célula. Tal secuencia puede estar presente de manera natural en los polipéptidos de la presente invención, o se puede proporcionar a partir de fuentes de proteína heterólogas mediante técnicas de ADN recombinante. Como se usa. en la presente, un "fragmento", "porción", o "segmento" de ADEC se refiere a cualquier estiramiento de amino ácidos que tenga suficiente longitud para desplegar actividad biológica e/o inmunológica, y en las modalidades preferidas contendrá cuando menoe aproximadamente 5 amino ácidos, cuando menos aproximadamente 7 amino ácidos, cuando menos aproximadamente de 8 a 13, y en modalidades adicionales aproximadamente 17 o más amino ácidos. Como se usa en la presente, un "oligonucleótido" o "fragmento", "porción", o "segmento" de polinucleótido se refiere a cualquier estiramiento de ácidos nucleicos que codifique a ADEC, que sea de suficiente longitud para usarse como un cebador en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) , o diferentes procedimientos de hibridación conocidos para aquellos expertos en la técnica, con el propósito de identificar o amplificar ácidos nucleicos idénticos o relacionados. La presente invención incluye polipéptidos ADEC purificados de fuentes naturales o recombinantes, vectores y células huésped transformados con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican a ADEC. Se pueden realizar diferentes métodos para el aislamiento de los polipéptidos ADEC mediante procedimientos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden purificar tales polipéptidos mediante cromatografía de inmunoafinidad, por medio de emplear los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Otros métodos diferentes de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology Volumen 182, Academic Press, San Diego; y Scopes R (1982) Protein Purification: Principies and Practice. Springer-Verlag, NYC, ambos incorporados en la presente para referencia. Como se usa en la presente, el término "recombinantes" se refiere a un polinucleótido que codifica a ADEC, que está preparado usando técnicas de ADN recombinante. El ADN que codifica a ADEC también puede incluir variantes y mutantes alélicos o recombinantes del mismo. Como se usa en la presente, el término "sonda" o "sonda de ácido nucleico" se refiere a una porción, fragmento o segmento de ADEC que es capaz de ser hibridizado a una secuencia objetivo deseada. Una sonda se puede usar para detectar, amplificar o cuantificar los ADNc's o ácido nucleico endógeno que codifica a ADEC, mediante el empleo de técnicas convencionales en biología molecular. Una sonda puede ser de longitud variable, de preferencia de aproximadamente 10 nucleótidos hasta muchos cientos de nucleótidos. Como entenderán aquellos expertos en la técnica, las condiciones de hibridación y el diseño de la sonda variarán dependiendo del uso pretendido. Por ejemplo, una sonda que se pretenda para usarse en la reacción de cadena de polimerasa, tendrá de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos de longitud, y pude ser parte de un grupo de sondas degeneradas, es decir, oligonucleótidos que toleran malos acoplamientos de nucleótidos pero que se acomodan fijándose a una secuencia desconocida; mientras que una sonda para usarse en hibridaciones Southern o Northern puede ser una secuencia de nucleótidos única, específica que tiene muchos cientos de nucleótidos de longitud. De conformidad, una sonda preferida para la detección específica de ADEC, comprenderá un fragmento de polinucleótido u oligonucleótido de una región de nucleótido no conservada del SEQ ID N0:1. Como se usa en la presente, "región de nucleótido no conservada" se refiere a una región de nucleótido que es única para el SEQ ID N0:1, y no comprende una región que esté conservada en la familia de las quimiocinas C-X-C. Las sondas pueden ser de una sola cadena o de doble cadena, y pueden tener especificidad en hibridaciones basadas en solución, células, tejidos o membranas, incluyendo tecnologías in situ y parecidas al ensayo inmunosorbente enlazado con enzima. La presente invención abarca oligonucleótidos, fragmentos o porciones de los polinucleótidos descritos en la presente, o sus cadenas complementarias usadas como sondas . Los "oligonucleótidos" de las "sondas de oligonucleótido" se preparan en base a las secuencias de nucleótidos descritas en la presente, que codifican a ADEC. Los oligonucleótidos comprenden porciones de la secuencia de nucleótidos descrita en la presente, y contienen cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos, y usualmente cuando menos aproximadamente 20 nucleótidos y pueden incluir hasta 60 nucleótidos. Las sondas de ácidos nucleicos pueden comprender porciones de la secuencia que tiene menos nucleótidos de aproximadamente 6 kb, usualmente menos de aproximadamente lkb. Las sondas de oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar para determinar si el ácido nucleico que codifica a ADEC está presente en una célula o un tejido, o para aislar secuencias similares de ácidos nucleicos de ADN cromosomal, como lo describió Walsh PS y colaboradores (1992) PCR Methods Appl. 1:241-250. Las sondas de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden derivar a partir de ácidos nucleicos que ocurren de manera natural o recombinantes, de una sola cadena o de doble cadena, o se puede sintetizar químicamente. Estos se pueden etiquetar mediante traslación de muesca, reacción de relleno de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. En Sambrook J y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY; o Ausubel FM y colaboradores (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, John Wiley & Sons, ambos incorporados en la presente para referencia, se describen las sondas de la presente invención, su preparación y/o etiquetación. De manera alternativa, las variantes recombinantes que codifican a los poLipéptidos de la presente invención o polipéptidos relacionados, se pueden sintetizar identificar a través de técnicas de hibridación conocidas por aquellos de experiencia en la técnica, por medio de hacer uso de la "redundancia" en el código genético. Se pueden introducir diferentes sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen diferentes sitios de restricción, para optimizar la clonación dentro de un plásmido o vector viral o expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. También se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, para cambiar afinidades de ligando a fijación, afinidades de intercadena, o degradación de polipéptido o índice de rotación.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que identifica de manera única una quimiocina de la familia C-X-C, a la que se hace referencia en la presente como ADEC. Se han identificado las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC en una genoteca de ADNc hecha a partir de tejido adenoideo inflamado, en una genoteca de ADNc hecha a partir de tejido de bazo fetal, y en una genoteca de ADNc hecha a partir de sinovio reumatoide derivado de la cadera. También se han identificado las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC en monocitos adherentes cultivados durante 3 horas y en células T cultivadas. No se han encontrado secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC en monocitos adherentes cultivados durante 72 horas o en células T tratadas con ácido mirístico de forbol (PMA) .

Sería útil tener una prueba de diagnóstico para la detección de la expresión de ADEC en tejidos en donde se identifica éste. La activación de los neutrófilos y los fibroblastos que responden por medio de producir abundantes proteasas y otras moléculas, lo cuál puede llevar a daño o destrucción del tejido. Por lo tanto, una prueba de diagnóstico para ver la expresión en exceso de ADEC pude acelerar el diagnóstico y tratamiento apropiado de la inflamación antes de que ocurra un daño o destrucción extensos del tejido. Evidencia reciente sugiere que mientras la familia de la quimiocina C-X-C de las citocinas quimiotácticas parece tener actividades inflamatorias, éstas despliegan efectos distintos al mediar la angiogénesis como una función, o la presencia o ausencia del dominio ELR (Strieter A y B supra) . Se ha mostrado que las quimiocinas C-X-C de ELR inhiben la angiogénesis. De conformidad, se puede usar el ADEC, o fragmentos del mismo, para evitar o tratar los desórdenes dependientes de la angiogénesis, tales como tumorogénesis, artritis reumatoide, esclerodermia, y psoriasis. Las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC, o sus complementos, tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica de biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación, el uso como oligómeros para reacción de cadena de polimerasa, el uso para mapeo de cromosomas y genes, el uso en la producción recombinante de ADEC, y el uso en la generación de ADN o ARN anti-sentido, sus análogos químicos y similares. Los usos de los nucleótidos que codifican a ADEC, descritos en la presente, son ejemplos de técnicas conocidas y no se pretende que limiten su uso en ninguna técnica conocida para una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Por otra parte, se pueden usar las secuencias de nucleótidos descritas en la presente en técnicas de biología molecular que todavía no se han desarrollado, con la condición de que las nuevas técnicas dependan de las propiedades de las secuencias de nucleótidos que se conocen actualmente, por ejemplo, el código genético de triplete, interacciones específicas de pares de base. Aquellos expertos en la técnica notarán que como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC, algunas llevando mínima ho oloa- de secuencia de nucleótidos a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen conocido y que ocurre de manera natural, siempre y cuando la secuencia de nucleótidos codifique a ADEC. La invención ha contemplado específicamente cada y toda variación posible de secuencia de nucleótidos que se pudiera hacer mediante la selección de combinaciones basadas en posibles selecciones de codón. Estas combinaciones ee hacen de conformidad con el código genético de triplete estándar como se aplica c la secuencia de nucleótidos del ADEC que ocurre de manera natural, y todas tales variaciones se considerarán como estando descritas específicamente. Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC y/o a variantes de ADEC de preferencia son capaces de hibridizar a la secuencia de nucleótidos del gen ADEC que ocurre de manera natural bajo condiciones estringentes, pudiera ser conveniente producir secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC o a derivados de ADEC que poseen un uso de codón sustancialmente diferente. Los codones se pueden seleccionar para que incrementen el índice al que ocurre la expresión del péptido en un huésped de expresión procariótico o eucariótico particular, de conformidad con la frecuencia con la que el huésped utiliza los codones particulares. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos que codifica a ADEC y/o derivados de ADEC sin alterar la secuencia de amino ácidos codificada, incluyen la producción de transcritos de ARN que tienen propiedades más deseables, por ejemplo, una mayor vida media, que los transcritos producidos a partir de la secuencia de nucleótidos que ocurre de manera natural . Las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC se pueden unir a una diversidad de otras secuenciae de nucleótidoe por medio de técnicas recombinantee de ADN bien establecidas (cf Sambrcok J y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY) . Las secuencias de nucleótidos útiles para unirse a adec incluyen una variedad de vectores de clonación, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, derivados de fago lamda, fagémidos, y similares, que son conocidos en la técnica. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de réplica, vectores de generación de sonda, vectores de secuenciación, y similares. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de réplica funcional en cuando menos un organismo, sitios de restricción convenientes sensibles a la endonucleasa, y marcadores que se pueden seleccionar para la célula huésped. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar sondas de hibridación de ácido nucleico específicas para adec, capaces de hibridizar con secuencias de nucleótidos que ocurren de manera natural que codifi.-c.s- a ADEC. Tales sondas péira la detección de secuencias que codifican a ADEC deben contener de preferencia un fragmento de nucleótido de una región no conservada del SEQ ID N0:1. Tales sondas para la detección de secuencias que codifican a la quimiocina relacionada deben contener de preferencia cuando menos el 50 por ciento de los nucleótidos de una secuencia de codificación de C-X-C o C-C. Las sondas de hibridación de la presente invención se pueden derivar a partir de las secuencias de nucleótidos del SEQ ID N0:1, o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos incrementadores e intrones de adec que ocurre de manera natural . Se pueden etiquetar las sondas de hibridación mediante una diversidad de grupos reporteros, incluyendo radionuclidos tales co o J¿P o JJS , o etiquetas enzimaticas tales como fosfatasa alcalina, acopladas a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina, y similares, a través de técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica. La reacción de cadena de polimerasa, según se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,965,188 y 4,683,195 y 4,800,195, proporciona usos adicionales para los oligonucleótidos basados en las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC. Tales sondas que se usan en la reacción de cadena de polimerasa pueden ser de origen recombinante, se pueden sintetizar químicamente, o una mezcla de ambas, y comprenden una secuencia de nucleótidos discreta para uso de diagnóstico, o un grupo degenerado de posibles secuencias para la identificación de secuenciae genómicas muy relacionadas . Otros medios para producir sondas de hibridación específicas para adec incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican ADECs y derivados de ADEC en vectores para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro, por medio de la adición de la polimerasa de ARN apropiada como polimerasa de ARN T7 ó SP6 y los nucleótidos apropiados etiquetados radioactivamente. Ahora es posible producir una secuencia de ADN, o porciones de la misma, codificando a ADEC y derivados de ADEC completamente mediante química sintética, después de lo cuál se puede insertar el gen dentro de cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles, usando reactivos, vectores y células que son conocidos en la técnica, al momento de la presentación de esta soLicitud. Por otra parte, se puede usar química sintética para introducir mutaciones dentro de la secuencia de polinucleótidos de adec o cualquier porción de la misma. Los métodos para la secuenciación del ADN son bien conocidos en la técnica. Los métodos enzimáticos convencionales empleaban el fragmento Klenow de polimerasa de ADN, SEQUENASE® (US Biochemical Corp, Cleveland, OH) o polimerasa de taq, para extender las cadenas de ADN de un cebador de oligonucleótido templado a la plantilla de ADN de interés. Se han desarrollado métodos para el uso de plantillas tanto de una sola cadena como de doble cadena. Se electroforesaron los productos de reacción de terminación de cadena en geles de urea-acrilamida y se detectaron ya sea mediante autorradiografía (para precursores etiquetados por radionúclido) o mediante fluorescencia (para precursores etiquetados por fluorescencia) . Mejoras recientes en la preparación, secuenciación y análisis mecanizados de la reacción, usando el método de detección fluorescente, han permitido la expansión en el número de secuencias que se pueden determinar por día (usando máquinas tales como el Catalyst 800 y el secuenciador de ADN Applied Biosystems 373) . La secuencia de nucleótidos se puede usar para construir un ensayo para detectar inflamación y enfermedad asociadas con niveles anormales de expresión del ADEC. Se puede etiquetar la secuencia de nucleótidos mediante métodos conocidos en la técnica, y añadir a una muestra de fluido o tejido de un paciente, bajo condiciones de hibridación. Después de un período de incubación, se lava la muestra con un fluido compatible que contiene opcionalmente un tinte (u otra etiqueta que requiera un revelador) si se ha etiquetado el nucleótido con una enzima. Después de enjuagar el fluido compatible, se cuantifica el tinte y se compara con un estándar. Si la cantidad de tinte es significativamente elevada, la secuencia de nucleótidoe se ha hibridizado con la muestra. Si hay adec presente a un nivel anormal, el ensayo indica la presencia de inflamación y/o enfermedad. Se puede usar la secuencia de nucleótidos para adec para construir sondas de hibridación para mapear ese gen. Se puede mapear la secuencia de nucleótidos que se proporciona en la presente a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma, usando técn cas bien conocidas de mapeo genético y/o cromosomal . Estas técnicas incluyen hibridación in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosomales conocidos, clasificación por hibridación con genotecas de preparaciones cromosomales seleccionadas por flujo, específicas para cromosomas conocidos, y similares. En Verma y colaboradores (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, NYC, entre otros lugares, se ha descrito la técnica de hibridación fluorescente in situ de diseminaciones de cromosomas . La hibridación fluorescente in situ de preparaciones cromosomales y otras técnicas de mapeo físico de cromosomas pueden estar correlacionadas con datos de mapas genéticos adicionales. Los ejemplos de datos de mapas genéticos se pueden encontrar en O'Brien (1990) Genetic Maps -. Locus Maps of Complex Genomes, Libre 5: Human Maps, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. La correlación entre la localización de adec en un mapa cromosomal físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociada con esa enfermedad genética. Se puede usar la secuencia de nucleótidos de la presente invención para detectar diferencias en la secuencia de genes entre individuos normales, portadores y afectados, es decir, individuos sujetos a una enfermedad o condición. Se pueden usar las secuencias de nucleótidos que codifican a ADEC para producir ADEC purificado, usando métodos bien conocidos de tecnología de ADN recombinante. Entre las muchas publicaciones que enseñan métodos para la expresión de genes después de que ee han aislado estos, está Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Volumen 185, Academic Press, San Diego. El ADEC puede estar expresado en una diversidad de células huésped, ya sea procarióticas o eucarióticas. Las células huésped pueden ser de especies ya sea iguales o diferentes de las especies en las cuáles las secuencias de nucleótidos de adec son endógenas. Las ventajas de producir ADEC mediante tecnología de ADN recombinante, incluyen la obtención de fuentes altamente enriquecidas de las proteínas para la purificación, y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados. El ADEC puede estar expresado como una p?¡ ^ína , quimérica con uno o máe dominios de polipéptido adicionales, agregados para facilitar la purificación de las proteínas. Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos de quelación de metal tales como módulos de histidina-triptofano, que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA) . La inclusión de una secuencia enlazadora que se puede disociar (tal como el Factor XA o la enteroquinasa) entre el dominio de purificación y la secuencia de codificación de ADEC, puede ser útil para facilitar la producción de ADEC. Las células transformadas con ADN que codifica a ADEC se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión del ADEC y la recuperación de la proteína a partir del cultivo de células. El ADEC producido mediante una célula recombinante se puede secretar o puede estar contenido intracelularmente, dependiendo de la construcción genética particular usada. En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada. Los pasos de purificación dependen de la naturaleza del proceso de producción usado y del ADEC particular producido. La traslación del ADNc de adec de la presente invención a proteína se puede llevar a cabo mediante la subclonación del ADNc en un vector de expresión apropiado y transfectando este vector en un huésped de expresión apropiado. Como se describe en el Ejemplo VII, un vector de expresión preferido para la expresión y purificación de ADEC es uno que permite la expresión de una proteína de fusión que comprende ADEC y contiene ácido nucleico que codifica 6 residuos de histidina seguidos por tiorredoxina y un sitio de disociación de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (que en español significa cromatografía de afinidad de ion de metal inmovilizado, según se describe en Porath y colaboradores (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281) mientras que el sitio de disociación de enteroquinasa proporciona un medio para purificar la quimiocina de la proteína de fusión. El vector de expresión usado para la generación de las genotecas de ADNc descritas en la presente, que proporciona un promotor para la corriente arriba de jS-galactosidasa del sitio de clonación, seguido por una secuencia de nucleótidos que contiene el Met con terminal amino, y los 7 residuos subsecuentes de ß-galactosidasa seguidos por un promotor bacteriófago útil para cebación y transcripción artific ales, y un número de sitios de restricción únicos (incluyendo Eco Rl) , también se puede usar para la expresión de lae quimiocinas de la presente invención. La inducción de la cadena bacteriana aislada con IPTG, usando métodos estándar producirá una proteína de fusión que corresponde a los primeros eiete residuos de jS-galactosidasa, aproximadamente 15 residuos de enlazador, y ADEC codificado adentro del ADNc. Puesto que los insertos de, clon de ADNc se generan mediante un proceso esencialmente aleatorio, existe una posibilidad en tres de que el ADNc incluido estará situado en el marco correcto para una traslación apropiada. Si el ADNc no está en el marco de lectura apropiado, éste se puede obtener mediante la supresión o inserción del número de bases apropiado, mediante métodos bien conocidos incluyendo mutagénesis in vitro. digestión con exonucleasa III o nucleasa de frijol, o inclusión de enlazador de oligonucleótido. El ADEC se expresará en el sistema bacteriano según se describió. Una secuencia de nucleótidos que codifican a ADEC de la presente invención se puede lanzar a vectores conocidos como útiles para la expresión de proteínas en huéspedes específicos. Los amplímeros de oligonucleótido que contienen sitios de clonación, así como un segmento de ADN suficiente para hibridizarse a estiramientos a ambos extremos del ADNc objetivo (25 bases) se puede sintetizar químicamente mediante métodos estándar. Estos cebadores se pueden usar después para amplificar los segmentos deseados del gen mediante reacción de cadena de polimerasa. Los nuevos segmentos de gen resultantes se pueden digerir con enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones estándar y aislar mediante electroforésis de gel. Alternativamente, se pueden producir segmentos similaree de gen mediante la digeetión de la eecuencia de nucleótidoe con enzimas de restricción apropiadas, y llenando los segmentos de gen perdidos con oligonucleótidos químicamente sintetizados. Se pueden ligar juntos los segmentoe de la secuencia de codificación de más de un gen, y clonar en vectores apropiados para optimizar la expresión de la secuencia recombinante.

Los huéspedes de expresión adecuados para tales moléculas quiméricas incluyen, pero no están limitados a células de mamífero tales como células de Ovario de Hámster Chino y humanas 293, células de insecto tales como las células Sf9, células de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae. y células de bacterias tal como E. coli. Para cada uno de estos sistemas celulares, un vector de expresión útil también puede incluir un origen de réplica para permitir la propagación en las bacterias y un marcador seleccionable, tal como el gen de resistencia antibiótica de /3-lactamasa, para permitir la selección en la bacteria. En adición, los vectores pueden incluir un segundo marcador seleccionable, tal como el gen de fosfotransferasa de neomicina, para permitir la selección en células huésped eucarióticas transfectadas . Los vectores para uso en huéspedes de expresión eucarióticos pueden requerir elementos de proceeamiento de ARN tal como secuencias de poliadenilación de 3 ' , si las tales no son parte del ADNc de interés . Adicionalmente, el vector puede contener promotores o incrementadores que incrementan la expresión del gen. Tales promotores son específicos del huésped e incluyen MMTV, SV40, o promotores de metalotionina para células CHO; promotores trp, lac, tac ó T7 para huéepedee bacterianoe, o factor alfa, oxidaea de alcohol o promotores PGH para levadura. Los incrementadores de transcripción, tales como el incrementador RSV, se pueden usar en células huésped de mamífero. Una vez que se obtienen cultivos homogéneos de células recombinantes a través de métodos de cultivo estándar, se pueden recuperar grandes cantidades de ADEC producido de manera recombinante del medio condicionado y analizado usando métodos cromatográficos conocidos en la técnica. En adición a la producción recombinante, los fragmentos de ADEC se pueden producir mediante síntesis directa de péptido usando técnicas de fase sólida (cf Stewart y colaboradores (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co. San Francisco,- Merrifield R (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales, o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando el Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) , de conformidad con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se pueden sintetizar químicamente diversos fragmentos de ADEC por separa ->,_ y , combinar usando métodos químicos para producir ADEC de longitud completa. El ADEC para usarse en la inducción de anticuerpos debe tener actividad inmunogénica. Los péptidos para uso en la inducción de anticuerpos específicos de ADEC comprenderán una secuencia de amino ácidos que consiste de cuando menos cinco amino ácidos y de preferencia cuando menoe 10 amino ácidos, de tal manera que el péptido retiene la configuración tridimensional de una porción del ADEC que ocurre de manera natural, y puede contener toda la secuencia de amino ácidos del ADEC que ocurre de manera natural. Los estiramientos cortos de los amino ácidos de ADEC se pueden fusionar con aquellos de otra proteína tal como la hemocianina limpete de orificio y la molécula quimérica usada para la producción de anticuerpos. Aquellos de experiencia en la técnica conocen diferentes métodos peira la preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales para los ADECs de la presente invención. En un planteamiento, se obtiene ADEC desnaturalizado de la separación de cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa, y se usa para inmunizar ratones o conejos, usando técnicas conocidas para aquellos de experiencia en la técnica. Para la inmunización de un ratón son adecuados aproximadamente 100 microgramos, mientras que se puede usar hasta l miligramo para la inmunización de un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, se puede radioyodurar la proteína desnaturalizada, y usarse para clasificar hibridomas de células B de murino potenciales para encontrar aquellas que producen anticuerpos. Este procedimiento requiere eolamente cantidades pequeñas de proteína, de tal manera que 20 miligramos serían suficientes para la etiquetación y clasificación de muchos miles de clones . En otro planteamiento, se analiza la secuencia de amino ácidos de ADEC, como se deduce de la secuencia de ADNc, para determinar regiones de alta inmunogenicidad. Los polipéptidos que comprenden estas regiones se sintetizan y usan en protocolos adecuados de inmunización para generar anticuerpos. Ausubel FM y colaboradores (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, John Wiley & Sons) describe el análisis para seleccionar los epítopos apropiados. Las secuencias de amino ácidos óptimas para inmunización están usualmente en el término C, el término N y aquellas regiones hidrofílicas intermedias del polipéptido, las cuáles probablemente se expongan al medio ambiente externo cuando la proteína está en su conformación natural . Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente 15 residuos de longitud, se sintetizan usando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer Modelo 43ÍA, usando química de fmoc, y se acoplan a la hemocianina limpete de orificio (KLH, Sigma) mediante la reacción con éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS; cf Aueubel FM y colaboradores, supra) . Si es necesario, se puede introducir una cieteína en el término N del péptido para permitir el acoplamiento a la hemocianina limpete de or-...-' ció, y se inmunizan los animales con el complejo péptido-hemocianina limpete de orificio en adyuvante de Freund completo. Se prueban los antisueros resultantes para ver la actividad antipéptido por medio de fijar el péptido a plástico, bloqueando con albúmina de suero bovino al 1 por ciento, haciendo reaccionar con antisueros, lavando y haciendo reaccionar con IgG anti-conejo de cabra específico, purificado por afinidad, etiquetado (radioactivo o fluorescente) . Los hibridomas también se pueden preparar y clasificar usando técnicas estándar. Los hibridomas de interés se detectan mediante clasificación con ADEC etiquetado para identificar aquellas fusiones que producen los anticuerpos monoclonales con la especificidad deseada. Por ejemplo, en un protocolo típico, se recubren pozos de placas (FAST, Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) con anticuerpos específicos conejo-anti-ratón (o anti-especies Ig adecuadae) a aproximadamente 10 miligramos/mililitro. Los pozos recubiertos se bloquean con albúmina de suero bovino al l por ciento, se lavan y se exponen a sobrenadantes de los hibridomae . Después de incubación, se exponen los pozos a ADEC etiquetado a una concentración de aproximadamente 1 miligramo/mililitro. Los clonee que producen anticuerpoe ee fijarán en una cantidad de ADEC etiquetado, el cuál ee puede detectar eobre el fondo. Talee clones se expanden y someten a 2 ciclos de clonación en dilución limitante (1 célula/3 pozos) . Los hibridomas clonados se inyectan en ratones tratados con pristano para producir aecitie, y el anticuerpo monoclonal se purifica de fluido ascítico de ratón mediante cromatografía de afinidad, usando Proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de cuando menos 10° M , de preferencia de 109 a 1010 o más fuertes, típicamente se harán mediante procedimientos estándar como lo describen Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, o Goding (1986) Monoclonal Antibodiee: Principlee and Practice, 2a Edición, Academic Prese NYC, ambos incorporados en la presente para referencia. Los anticuerpos específicos para una secuencia de ADEC particular se pueden producir mediante la inoculación de un animal apropiado con la secuencia de ADEC. Un anticuerpo es específico para ADEC si el anticuerpo se produce contra todo o parte del polipéptido ADEC, como se describe en el SEQ ID NO: 2, y se fija a toda o parte de la proteína. La inducción de anticuerpos incluye no solamente la estimulación de una respueeta inmune mediante inyección en animalee, eino también pasos análogos en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de fijación específicae, tal como la claeificación de genotecae de inmunoglobulina recombinante (cf Orlandi y colaboradores (1989) PNAS 86:3833-3837, o Huee y colaboradores (1989) Science 256:1275-1281) o la estimulación in vitro de poblaciones de linfocitoe. La tecnología actual (Winter y Miletein (1991) Nature 349:293-299) permite un número de reactivoe de fijación altamente eepecífieos basados en los principios de la formación de anticuerpoe. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para producir moléculas capaces de fijar específicamente a ADEC. Un polinucleótido que codifica a ADEC puede ser útil en el tratamiento de diferentes condiciones anormales asociadas con la ang ogénesie, tales como por ejemplo, tumorogénesis, artritis reumatoide, esclerodermia, y psoriasis . Por medio de introducir secuencias de genes de ADEC dentro de las células, se puede usar terapia de gen para tratar condiciones caracterizadas por la subexpresión de ADEC o la eobreexpresión de secuencias que están asociadas con estadoe de enfermedad asociados con la angiogénesis. En algunos casos, se pretende que el polinucleótido que codifica a ADEC reemplace o actúe en lugar de un gen endógeno funcionalmente deficiente. De manera alternativa, se puede usar a ADEC o fragmentos del mismo en el tratamiento de enfermedades o condiciones aeociadas con la angiogénesie. Loe vectores de expresión derivados de virus , ales como retrovirus, virus de vacuna, virue aeociadoe con adenoidee, virue de herpee, o virue de papiloma bovino, ee pueden uear para el envío de eecuenciae de nucleótidos que codifican a ADEC dentro de la población celular objetivo. Se pueden uear métodoe que eon bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, para conetruir vectores virales recombinantes que contienen una secuencia de polinucleótidos de ADEC. Ver, por ejemplo, las técnicas descritae en Maniatie y colaboradores, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel y colaboradores, 1989, Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. De manera alternativa, se pueden reconstituir las moléculas de ADEC recombinante en liposomas para envío a células objetivo. De conformidad, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar estados de enfermedad asociadoe con la angiogéneeie, que comprende una cantidad efectiva de la secuencia de polinucleótidos que codifican a ADEC y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona un método para tratar a un paciente sujeto a un estado de enfermedad asociado con la angiogénesis, que comprende administrar una cantidad efectiva del polinucleótido que codifica a ADEC a dicho paciente. De manera alternativa, se pueden tratar condiciones anormales caracterizadas por la sobreexpreeión de ADEC, tales como condiciones aeociadae con inflamación, mediante el ueo de técnicas de terapia genética para introducir ácido nucleico anti-sentido dentro de lae célulae para inhibir la traelación de ARNm de ADEC. Los anticuerpos, inhibidores, moléculas anti-sentido, receptores o análogos de ADEC (tratamientos para la producción excesiva de ADEC, abreviada de aquí en adelante "TEC") pueden proporcionar diferentes efectos cuando se ad inietran terapéuticamente. Los TECs se formularán en un medio portador acuoeo no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable, de preferencia a un pH de aproximadamente 5 a 8, de máe preferencia de 6 a 8, aunque el pH puede variar de conformidad con lae caracteríeticae del anticuerpo, inhibidor, receptor o análogo que se esté formulando y de la condición que se va a tratar. Las característicae del TEC incluyen eolubilidad de la molécula, vida media y antigenicidad/inmunogenicidad, y pueden ayudar a definir un portador efectivo. Se prefieren las proteínas humanas que ocurren de manera natural como TECs, pero las moléculae orgánicae que resultan de clasificaciones de fármacos pueden ser igualmente efectivas en situaciones particulares. Los TECs se pueden enviar mediante rutas de administración conocidas, incluyendo pero no limitándose a cremas o geles tópicos; rocío o aerosol transmucosal, parche o venda transdérmico; formulaciones inyectablee, intravenoeae o lavadoe; o líquidoe c píldorae administrados oralmente. La formulación particular, dosie exacta, y ruta de adminietración lae determinará el médico que atiende y variarán de conformidad a cada eituación específica. Tales determinaciones se hacen mediante la coneideración de múltiplee variablee tales come ,i , condición que se va a tratar, el TEC que se va a administrar, y el perfil farmacocinético del TEC particular. Factores adicionales que se pueden tomar en cuenta incluyen la severidad del eetado de enfermedad, el paciente, la edad, el peso, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la combinación de fármacos, las eensibilidades a la reacción, y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de TEC de acción prolongada se pueden administrar cada 3 o 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanae, dependiendo de la vida media y del índice de evacuación del TEC particular. Las cantidades de dosie normalee pueden variar desde 0.1 a 100,000 microgramoe, hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la ruta de administración. En la literatura se proporciona guía en cuanto a las dosis particulares para loe TECe; ver las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,657,760; 5,206,344; ó 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes TECs, y que la administración que se dirige al hígado puede necesitar envío de una manera diferente de aquella para el envío dirigido a la glándula pituitaria. Se contempla que una condición asociada con adenoides inflamadae o enfermedad que activa a loe leucocitoe, particularmente loe monocitoe y loe macrófagoe, y precipita daño permanente, puede eer tratable con loe TECe. Eetas condiciones o enfermedadee ee pueden diagnoeticar eepecíficamente mediante lae pruebae de diagnóetico diecutidae infra. tales pruebas se deben realizar, por ejemplo, en pacientes de los que se sospecha que son sujetos al virus de Eostein-Barr, la enfermedad de Hodgkins, y diferentee neoplasmas o faringitis no específica. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos se proporcionan para ilustración y no se incluyen con el propósito de limita la invención.

EJEMPLOS I Aislamiento del ARNm v Construcción de Genotecas de ADNc Se identificó inicialmente la secuencia de quimiocina expresada en adenoides del ADNc entre las secuencias de polinucleótidos que comprenden la genoteca de lae adenoidee inflamadas. Se construyó la genoteca a partir de adenoides mixtas y del tejido linfoideo de la angina removido quirúrgicamente de un niño durante una amigdalectomía . Se obtuvo el tejido de las adenoides de la Universidad de California en Los Angeles y se congeló para uso futuro. Se sembró el tejido congelado en un mortero y se disolvió inmediatamente en un regulador del pH que contenía isotiocianato de guanidinio (cf Chirgwin JM y colaboradoree (1979) Biochemietry 18:5294). Deepués de la disolución se continuó con varias extraccionee de fenol-cloroformo y precipitaciones de eta ol . Se aisló el ARNm poli-A+ usando oligo d(T) biotinilado y estreptavidina unida a partículas paramagnéticas (Poli (A) Sistema de Aislamiento de Trayectoria,-Promega, Madison, Wl) . Stratagene Inc (11011 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037) usó el ARNm poli A del tejido de las adenoides inflamadas para construir una genoteca de ADNc. Se cebó la sínteeis del ADNc usando oligo dT y/o hexámeros aleatorioe . Se ligaron loe oligonucleótidoe adaptadoree sintéticos encima de los extremos del ADNc permitiendo su inserción dentro del sistema del vector UNI-ZAP™ (Stratagene, Inc) . Esto permite una construcción de la genoteca lambda de mayor eficiencia unidireccional (orientación de sentido) y la conveniencia de un sistema de plásmido con la selección de color azul/blanco para detectar clones con inserciones del ADNc. Se clasificó la calidad de cada genoteca del ADNc usando ya fuera sondas de ADN o sondae de anticuerpo, y después se extirpo r pidamente el fagemido pBluee^ppt (Stratagene Inc) en las células vivas. El fagémido permite el ueo de un eietema de pláemido para la caracterización eencilla del ineerto, la eecuenciación, la mutagénesis dirigida al sitio, la creación de supreeiones unidireccionales y la expresión de proteínas de fusión. Se infectaron las partículas del fago de cada genoteca dentro de la cepa huésped de E. coli XL1-BLUE (Stratagene Inc) . La elevada eficiencia de transformación del XLl-BLUE aumenta la probabilidad de obtener clones raros, subrepresentados de la genoteca del ADNc.

II Aislamiento de Clones del ADNc Se obtuvieron lae formae del fagémido de clones del ADNc individuales mediante el proceso de extirpación in vivo, en el cual se infectó al mismo tiempo el XLl-BLUE con un fago auxiliar fl. Lae proteínae derivadas tanto del fago lambda como del fago auxiliar fl iniciaron una nueva síntesis de ADN a partir de las secuenciae definidas sobre el ADN lambda objetivo y crearon una molécula más pequeña, de ADN de fagémido circular de una sola cadena, que incluía las secuenciae de ADN del pláemido Pblueecript y el ineerto del ADNc. Se liberó el fagémido de ADN de las células y se purificó, después se usó para infectar nuevamente células huésped bacterianas frescas (SOLR, Stratagene Inc) , en donde se produjo el ADN fagémido de cadena doble. Debido a que el fagémido porta el gen para la ß-lactamasa, se seleccionaron las bacterias recientemente transformadas sobre un medio que contenía ampicilina. Se purificó el ADN fagémido usando el Sistema de Purificación de Plásmiclo QIAWELL-8 a partir del Sistema de Purificación QIAGENDNA (QIAGEN Inc., 9259 Eton Ave., Chatsworth, CA 91311) . Eeta técnica proporciona un método rápido y confiable de alto rendimiento para disolver lae células bacterianas y para aislar el ADN fagémido altamente purificado. El ADN levigado de la reeina de purificación fue adecuado para la secuenciación de ADN y otrae manipulacionee analíticae.

III Secuenciación de los Clones del ADNc Se secuenciaron en parte los insertos del ADNc a partir de aislados aleatorios de la genoteca de las adenoides inflamadas. Se secuenciaron los ADNSc por medio del método de Sanger F. Y AR Coulson (1975; J. Mol. Biol. 94:441f), usando una Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV) en combinación con cuatro Cicladores Térmicos Peltier (PTC200 de MJ Research, Watertown MA) y los Sistemae de Secuenciación de ADN 377 ó 377 de Bioeistemas Aplicados (Perkin Elmer) y el marco de lectura determinado.

IV Búsqueda de Homología de los Clones del ADNc v Proteína Deducida Se comparó cada ADNc a las secuencias en el Banco de Genes usando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosyeteme y ee incorporaron dentro del Sietema de Análieis de Secuencia INHERIT™. En este algoritmo, se usó el Lenguaje de Especificación de Patrón (TRW Inc, Los Ang les ' CA) para determinar las regiones de homología. Los tres parámetros que determinaron cómo se corrieron las comparacionee de eecuencia fueron el tamaño de ventana, el desfasado de ventana y la tolerancia de error. Usando una combinación de estos tres parámetros, se examinó la base de datos del ADN para buscar secuencias que contuvieran regiones de homología a la secuencia en cuestión, y se etiquetaron con un valor inicial las secuencias apropiadas. Subsecuentemente, se examinaron estas regiones de homología usando diagramas de homología de matriz de punto para distinguir las regiones de homología de los acoplamientos casuales. Se usaron alineamientos de S ith-Waterman para desplegar visualmente los resultados de la búsqueda de homología. Se averiguaron las homologías de secuencia del péptido y la proteína usando el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT™ 670 de una manera similar a la usada en las homologías de secuencia del ADN. Se usaron el Lenguaje de Especificación de Patrón y las ventanas de parámetro para buscar las bases de datos de la proteína para las sécuenciae que contenían regiones de homología a las cuales se mail ?OI ' un valor inicial . Se examinaron diagramas de homología de matriz de punto para distinguir las regionee de homología eignificativa de acoplamientos casuales. Se usó la BLAST, que en español significa Herramienta de Búequeda de Alineamiento Local Báeico (Altechul SF (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altechul, SF y colaboradoree (1990) J Mol Biol 215:403-10), para buecar alineamientos de secuencia locales. La Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico produce alineamientos tanto de secuencias de nucleótidos como de amino ácidos para determinar la similitud de la secuencia. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico es especialmente útil al determinar acoplamientos exactos o al identificar homólogos de identificación. La Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico es útil para acoplamientos que no contienen brechas. La unidad fundamental de la información de salida del algoritmo de la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico es el Par de Segmento de Marcación Elevada (HSP) . Un Par de Segmento de Marcación Elevada consiste de dos fragmentos de secuencia de longitudes arbitrarias pero iguales cuyo alineamiento ee localmente máximo y para los cuales la marcación de alineamiento se aproxima o se excede a una marcación de umbral o de limitación establecida por el usuario. El enfoque de la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico es buscar Pares de Segmentos de Marcación Elevada entre una secuencia en cuestión y una secuencia de base de datos, para evaluar la eignificancia eetadística de cualesquier acoplamientos encontrados, y para reportar solamente aquellos acoplamientos que satisfagan el umbral de significancia seleccionado por el usuario, el parámetro E eetablece el umbral eetadísticamente significativo para reportar los acoplamientos de la secuencia de la base de datos. Se interpreta E como el límite superior de la frecuencia esperada de la ocurrencia casual de un Par de Segmento de Marcación Elevada (o conjunto de Pares de Segmentos de Marcación Elevada) dentro del contexto de la búsqueda completa de la base de datos . Se reporta cualquier secuencia de base de datos cuyo acoplamiento satisfaga a E en la información de salida del programa. Las secuencias del nucleótido y del amino ácido para la quimiocina expresada en adenoides, ADEC se muestran en las SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO : 2 , respectivamente.

V Identificación y. Secuenciación &» la Longitud Completa del Gen De todos loe clones escogidos aleatoriamente y secuenciados de la gencteca de las adenoides inflamadas, las secuencias de quimiocina expresada en adenoides fueron homologas a, pero claramente diferentes de cualquier molécula de quimiocina C-X-C conocida. Se encontró la secuencia del nucleótido para la quimiocina expresada en adenoides dentro del clon Incyte 20293. Cuando se examinaron las tres traelacionee poeibles predichas de la eecuencia en comparación con la baee de datoe de la proteína tal como Swi?ePirot y PIR, no ee encontraron acoplamientoe exactoe para lae poeibles traelaciones de la quimiocina expresada en adenoides. La Figura 2 muestra la comparación de ADEC con otras moléculas de quimiocina; las regiones substanciales de homología incluyendo el motivo C-X-C están sombreadas. El análisis de filogenética, sin embargo, muestra que ADEC no está estrechamente relacionada con otras quimiocinas C-X-C humanas bien caracterizadas (Figura 3) . Las más relacionadas de estae moléculas se agrupan juntas en el lado derecho de la figura. Parece ser que ADEC puede representar una nueva subfamilia o una variante de las quimiocinas C-X-C.

VI Análisis Anti -sentido El conocimiento de las secuencias de ADNc correctas, completas de ADEC permite su uso en la tecnología anti-sentido en la investigación del funcionamiento del gen. Se pueden usar ya sea oligonucleótidos, fragmentos genómicoe o ADNc que comprenden cadenae anti-eentido de eecuenciae de polinucleótidos que codifican ADEC tanto in vitro como in vivo para inhibir la expresión de la proteína específica. Dicha tecnología es actualmente bien conocida en la técnica, y se pueden designar sondas en varios lugares a lo largo de la eecuencia del nucleótido. Se puede deeviar de manera efectiva el gen de interée mediante el tratamiento de células o de animales de prueba completos con dichas secuenciae anti-eentido. Frecuentemente, ee puede averiguar la función del gen por medio de obeervar el comportamiento a nivel celular, del tejido o del organismo (por ejemplo, mortalidad, pérdida de función diferenciada, cambios en la morfología, etcétera) . Además de usar las secuencias construidas para interrumpir la transcripción del marco de lectura abierto, se pueden obtener modificaciones de la expresión del gen por medio de designar secuenciae anti-sentido a regionee de intrón, elementos promotores/incrementadores, y aún a genes reguladores de trans-acción. De manera similar, se puede lograr la inhibición usando la metodología de pareamiento base de Hogeboom, también conocida como pareamiento base de "triple hélice" .

VII Exresión d ADEC Se clonaron las secuencias del nucleótido que codifica ADEC en un vector de expresión que incluye un promotor T7 seguido de un codón de metionina iniciadora (ATG) , seguido por seis codones de histidina, seguido por un gen TrxA de E. coli (el cual codifica la tiorredoxina) , seguido por una codificación de secuencia para un lugar de disociación de la enteroquinasa y de las eecuenciae del nucleótido que codifican ADEC. Para ADEC, el residuo con terminal N de la proteína expresada es el residuo 24, Leu, de la SEQ ID NO: 2. Se usaron los vectores de expresión deecritoe anteriormente que contienen loe 6 codonee de hietidina para traneformar una célula huéeped, ee indujo el cultivo de la célula huésped con IPTG y la proteína expresada se sometió a electroforesia de gel de poliacrilamida de SDS de desnaturalización, se purificó parcialmente el ácido nucleico del vector de expresión usando el procedimiento miniprep de Sambrook supra el cual produjo el ADN super enrollado. Se usaron aproximadamente 100 ng de ADN para transformar la célula bacteriana huésped, W3110/DE3. Se construyó la W3110/DE3 usando la W3110 del ATCC y el juego de lisogenización DE3 lambda disponible comercialmente con Novagen. Los lisógenos DE3 son usualmente menos adecuados que su origen, el W3110, y se adaptan para que usen el ADN super enrollado para una transformación eficiente. Se seleccionó y se usó un transformante único de cada transformación de quimiocina para inocular un cultivo de 5 mililitros de caldo L que contenía ampicilina. Se cultivó cada cultivo de 5 mililitros durante la noche (de 12-15 horas) a 37°C con agitación. Al siguiente día, se usó 1 mililitro del cultivo de la noche anterior para inocular un cultivo c. .,00 • mililitros de caldo L con ampicilina en un matraz de 500 mililitros y se permitió que creciera a 37°C con agitación hasta que el OD600 del cultivo alcanzó 0.4-0.6. Si se permite que las células inoculadas crezcan más allá de un OD600 de 0.6, empezarán a alcanzar una fase estacionaria y se reducirán los niveles de inducción. Al tiempo de la inoculación, se removió una muestra de 5 mililitros, se colocó sobre hielo y se usó como una muestra de inducción previa (u hora 0) . Cuando el cultivo celular alcanzó un OD600 de 0.6, se agregaron 400 µl de una solución de extracto de IPTG de lOOmM para una concentración final de 0.4mM. Se permitió que los cultivos crecieran durante 3 horas a 37°C con agitación. Se determinaron los análisie de inducción mediante el muestreo de alícuotas de 5 mililitros del cultivo a intervalos de 1 hora hasta 6 horas y analizándolos sobre una electroforesia de gel de poliacrilamida de SDS de desnaturalización. Parece que la proteína de fusión se acumuló en la fracción insoluble de las células . La inducción máxima de ADEC ocurrió a las 2 horas . El crecimiento por más de 4 horas resultó en disolución en el cultivo y rendimientos totales reducidos de la proteína deseada debido a la proteólisis. Se obtuvieron cinco mililitros de alícuotas de los cultivos celulares a las 0, 1 y 2 horas y se centrifugaron durante 5 minutos a 3000 RPM a 4°C. Se aspiró el sobrenadante y se sometieron loe gránuloe a un paeo de congelación-deehielo para ayudar a dieolver lae células. Se suependió nuevamente el granulo en TE (10 mM de Trie-HCL pH de 8.0, lmM de EDTA pH de 8.0) a 4°C a un volumen calculado como: vol TE(µl) = (OD600) (250), y ee agregó un volumen equivalente de Regulador de pH de Carga de Mueetra (Novex) de 2X SDS a cada mueetra. Se hirvieron las mueetrae durante 5 minutos y se cargaron lOµl de cada muestra por hilera. Los resultadoe de la electroforesia de gel mostraron que la proteína de fusión de ADEC migró a un peso molecular de 24 KD (con un peso esperado de 24093 Daltones) sobre un gel de SDS de desnaturalización.

VIII Aislamiento de ADEC Recombinante Se expresó ADEC como una proteína quimérica que tenía seis histidinas seguida por el gen de tiorredoxina (TrxA) de la E. coli con un lugar de disociación de la enteroquinasa entre la proteína TrxA y ADEC. Se agregaron las histidinas para facilitar la purificación de la proteína. La presencia de las histidinas permite la purificación sobre cromatografía IMIAC (Porath supra) .

IX Producción de Anticuerpos de Ouimiocina Expresada en Adenoides Específicos Se prepararon anticuerpos policlonales al PGEC por medio de inyectar a conejoe con aproximadamente 100 microgramos de proteína de fusión PGEC purificada por electroforesia como se describió en la Sección VII. A aproximadamente 8 semanas despuée de la inyección del antígeno primario, se recolectaron los antisueroe policlohales . Se prepararon los anticuerpos policlonales a un péptido de ADEC, que consistían de los residuoe 25 haeta 42 de ADEC del SEQ ID NO: 2, mediante métodos estándar.

X Prueba de Diagnóstico Usando Anticuerpos de Ouimiocina Expresada en Adenoides Específicos Los anticuerpos de quimiocina expresada en adenoides particulares son útiles para el diagnóstico de condiciones prepatológicas, y crónicas o enfermedades agudas que están caracterizadas por diferencias en la cantidad o la distribución de ADEC. Es posible que ADEC sea específica para anormalidades o patologías de tejidos particulares a partir de los cuales ésta ha sido identificada. Las pruebas de diagnóstico para ADEC incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una etiqueta para detectar ADEC en fluidos corporales, tejidos o extractos de dichos tejidos humanos. Se pueden usar loe polipéptidoe y anticuerpos de la presente invención con o sin modificación. Frecuentemente, se etiquetarán los polipéptidos y los anticuerpos por medio de unirlos, ya sea de manera covalente o no covalente, con una sustancia que proporciona una señal que se puede detectar. Se conocen una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación y ee han reportado exteneamente en la literatura tanto científica como de patente. Lae etiquetas apropiadae incluyen radionúclidos, enzimas, suetratoe, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentee, partículae magnéticas y similares. Las patentes que instruyen sobre el uso de dichas etiquetas incluyen las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. Asimismo, se pueden producir las inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en la Patente de los Estadoe Unidos de Norteamérica Número 4,816,567, incorporada en la presente por referencia. En la técnica se conoce una" variedad de protocolos para medir ADEC soluble o fijada a membrana, usando anticuerpos ya sea policlonales o monoclonales específicoe para esa quimiocina expresada en adenoides. Los ejemploe incluyen el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) , el radioinmunoensayo (RÍA) y la clasificación de célula activada fluorescente (FACS) . Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitioe que utilice anticuerpoe monoclonales reactivos a dos epítopee de no interferencia sobre ADEC, pero se puede emplear un ensayo de fijación competitivo. Estos ensayos se describen, entre otros lugares, en Maddox, DE y colaboradores (1983, J Exp Med 158:1211) .

XI Purificación de ADEC Nativa Usando Anticuerpos Específicos Se purificó ADEC nativa o recombinante mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpoe de quimiocina expresada en adenoides específicos. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplar de manera covalente el anticuerpo anti-quimiocina expresada en adenoides a una resina cromatográfica activada. Se preparan las inmunoglobulinas policlonales como en el Ejemplo IX y los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido de ascitis de ratón mediante la precipitación de eulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. Se une de manera covalente la inmunoglobulina parcialmente purificada a una resina cromatográfica tal como la Sefarosa activada de CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . Se acopla el anticuerpo a la resina, se bloquea la resina, y se lava la resina derivada de conformidad con las instrucciones del fabricante . Se utiliza dicha columna de inmunoafinidad en la purificación de ADEC por medio de preparar una fracción a partir de las células que contienen quimiocina expresada en adenoides en una forma soluble. ADEC soluble se deri> > sor ' medio de solubilizar la célula completa o una fracción subcelular obtenida vía la centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, se puede secretar ADEC soluble que contiene una secuencia de señal en una cantidad útil dentro del medio en el cual están creciendo las células.

Se pasa una preparación que contiene quimiocina expresada en adenoides soluble sobre una columna de inmunoafinidad, y se lava la columna bajo condiciones que permitan la absorbencia preferencial de ADEC (por ejemplo, la fuerza iónica se regula en la presencia de un detergente) . Se leviga ADEC de la columna bajo condiciones que rompen el enlace anticuerpo/quimiocina expresada en adenoides (por ejemplo, un regulador del pH de 2-3 o una concentración elevada de un caótropo tal como la urea o el ion de tiocianato) , y se recolectó ADEC.

XII Determinación de la Quimiotaxis Inducida por ADEC o Activación Celular Se mide la actividad quimiotáctica de ADEC en una cámara de microquimiotaxis de 48 pozos (Falk WR y colaboradores (1980) J Immunol Methods 33:239) . En cada pozo, se separan dos compartimientos separados por un filtro que permite el paso de las células en respuesta al gradiente químico. El medio de cultivo celular tal como RPMI 1640 que contiene ADEC se coloca eobre el lado de un filtro, usualmente policarbonato, y las células suspendidas en el miemo medio ee colocan en el lado opueeto del filtro. Se permite un tiempo euficiente de incubación para que lae célulae recorran el filtro en reepueeta al gradiente de concentración a travée del filtro. Se recuperan loe filtros de cada pozo, y se determinan y cuantifican las células que están adheridas en el lado del filtro que está frente al ADEC. Se determina la especificidad de la qui ioatracción por medio de realizar el ensayo de quimiotaxis sobre poblaciones específicas de células. Primero, se fraccionan las células sanguíneas obtenidas mediante venepuntura por medio de la centrifugación del gradiente de densidad y se prueba la actividad quimiotáctica del ADEC sobre poblaciones enriquecidas de neutrófilos, células mononucleares de sangre periférica, monocitos y linfocitos. Opcionalmente, dichas poblaciones de células enriquecidas son fraccionadas adicionalmente usando anticuerpos específicos CD8+ y CD4+ para la selección negativa de poblaciones de células T enriquecidas CD4+ y CD8+. Otro ensayo dilucida el efecto quimiotáctico del ADEC sobre células T activadas. Allí, se cultivan subconjuntoe de célulae T sin fraccionar o células T fraccionadas durante 6 a 8 horas en recipientes de cultivo de tejido recubiertos con el anticuerpo CD-3. Despuée de eeta activación del CD-3, se prueba la actividad quimiotáctica como se describió anteriormente. Aquellos de experiencia en la técnica conocen muchos otros métodos para obtener las poblacio es de células enriquecidas . Algunas quimiocinas también producen una activación celular no quimiotáctica de neutrófilos y monocitos. Esto se prueba vía medidas estándar de activación neutrófila tal como la polimerización de la actina, el aumento en la actividad del estallido respiratorio, la degranulación del granulo asurofílico y la movilización del Ca++ como parte de la trayectoria de transducción de la señal. El ensayo para la movilización del Ca+- envuelve cargar previamente los neutrófilos con una sonda fluorescente cuyas características de emisión se han alterado mediante la fijación del Ca++. Cuando se exponen las célulae a un estímulo de activación, se determina el flujo de Ca++ por medio de la observación de las células en un fluorómetro. Se ha descrito la medida de la movilización del Ca++ en Grynkievicz G y colaboradores (1985) J Biol Chem 260:3440, y en McColl S y colaboradores (1993) J Immunol 150:4550-4555, incorporadae en la presente por referencia. También se miden las respuestas de degranulación y estallido respiratorio en los monocitos (Zachariae COC y colaboradores (1990) J Exp Med 171:2177-82). Lae medidae adicionales de la activación de monocito son la regulación de la expresión de la molécula de adhesión y la producción de citocina (Jiang Y y colaboradores (1992) J Immunol 148:2423-8) . La expresión de las moléculae de adheeión también varía con la activación del linfocito (Taub D y colaboradores (1993) Science 260:355-358) .

XIII Clasificación de Fármacos El ADEC, o los fragmentos del mismo, son particularmente útiles para clasificar los compuestos en cualesquiera de las variedades de técnicas de clasificación de fármacos. El polipéptido ADEC o el fragmento empleado en dicha prueba puede estar ya sea libre en la solución, adherido a un soporte sólido, sostenido sobre una superficie celular o localizado intracelularmente . Un método para la clasificación de fármacos utiliza células huéspedes eucarióticas o procarióticas las cuales son transformadas de manera estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o los fragmentos del mismo. Los fármacos se clasifican en comparación con dichas células transformadas en ensayos de fijación competitivos. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, se pueden usar para ensayos de fijación estándar. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el ADEC o el fragmento y el agente que se está probando o examinar las disminución en la formación del complejo entre el ADEC y un neutrófilo o fibroblasto causado por el agente que se está probando. De esta manera, la presente invención proporciona métodos de clasificación de fármacos u otroe agentee loe cualee pueden producir inflamación y enfermedad. Eetoe métodos comprenden poner en contacto dicho agente con un polipéptido ADEC o fragmento del mismo y hacer ensayoe para (i) buscar la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido ADEC o el fragmento, o (ii) buscar la presencia de un complejo entre el polipéptido ADEC o el fragmento y la célula, mediante métodos bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de fijación competitivos, el polipéptido ADEC o el fragmento están típicamente etiquetados. Después de una incubación adecuada, se separa el polipéptido ADEC o el fragmento de aquel que está presente en la forma fijada, y la cantidad de la etiqueta libre o sin complejar es una medida de la capacidad del agente particular para fijarse al ADEC o para interferir con el complejo ADEC/célula. Otra técnica para la clasificación de fármacos proporciona una clasificación de rendimiento elevado para los compuestos que tienen una afinidad de fijación adecuada a los polipéptidos ADEC y se describe con detalle en la Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984, incorporada en la presente por referencia. Brevemente expresado, se sintetizan grandes cantidades de difei; r.r.ee compueetoe de prueba de péptido pequeño eobre un sustrato sólido, tal como espigas de plástico o alguna otra superficie. Se reaccionan los compuestos de prueba del péptido mediante métodos bien conocidoe en la técnica. El ADEC purificado también ee puede recubrir directamente encima de placae para usarse en las técnicas de claeificación de fármacoe mencionadae anteriormente. En adición, ee pueden uear anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de clasificación de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de fijar el ADEC compiten específicamente con un compuesto de prueba para fijarse al polipéptido ADEC o a los fragmentos del mismo. En esta forma, se pueden usar los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el ADEC.

XIV Diseño Racional del Fármaco El objetivo del diseño racional del fármaco es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales aquellos interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Se puede usar cualquiera de estos ejemplos para formar fármacos que son formae más activas o estables del polipéptido o los cuales intensifican o interfieren con la función de un polipéptido in vivo (cf. Hodgson J (1991) Bio/Technology 9:19-21, incorporada en la presente por referencia) . En un planteamiento, ee determina la eetructura tridimensional del ADEC, o de un complejo inhibidor de ADEC, mediante cristalografía de rayos x, mediante modelación de computadora o, más típicamente, mediante una combinación de dos planteamientos . Se debe averiguar tanto la forma como las cargas del polipéptido para dilucidar la estructura y para determinar el (los) sitio (s) activo (s) de la molécula. Con menos frecuencia, se puede obtener información útil con respecto a la estructura del polipéptido por medio de la modelación basada en la estructura de las proteínas homologas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para designar moléculas parecidas a quimiocina o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles del diseño racional de fármacos pueden incluir moléculas las cuales han mejorado la actividad o la estabilidad como se muestra en Braxton S y Wells JA (1992 Biochemistry 3:7796-7801) o los cuales actúan como inhibidores, agonistas, o antagonistas de péptidos nativos como se muestra en Athauda SB y colaboradores (1993 J Biochem 113:742-746), incorporada en la presente por referencia. También es posible aislar un anticuerpo específico objetivo, seleccionado mediante ensayo funcional, como se describió anteriormente, y después disolver su estructura de cristal. Este planteamiento, en principio, rinde un farmanúcleo sobre el cual se puede basar ? etl „ diseño, del fármaco. Ee poeible deeviar la crietalografía de proteína en eu totalidad por medio de generar anticuerpoe antiidiotípicoe (anti-ide) a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Al igual que la imagen de espejo de una imagen de espejo, se esperaría que el sitio de fijación de los antiidiotípicos fuera un análogo del receptor original . Entonces se pueden usar los antiidiotípicos para identificar cualesquier péptidos aislados de bancos de péptidos química o biológicamente producidos . Los péptidos aislados actuarían entonces como el farmanúcleo. En virtud de La presente invención, se puede hacer disponible una cantidad suficiente de polipéptido para realizar dichoe estudios analíticos como la cristalografía de rayos x. En adición, el conocimiento de la secuencia de amino ácidos del ADEC proporcionado en la presente, dará una guía a aquellos que emplean las técnicas de modelación por computadora en lugar de o además de la cristalografía de rayos X.

XV Identificación de Receptores del ADEC El ADEC purificado es útil para la caracterización y purificación de receptoree superficiales de célula específicoe y otrae moléculas de fijación. Es muy probable que las células que responden al ADEC mediante la quimiotaxie u otrae respuestas específicae expreeen un receptor para ADEC. Lae etiquetae radioactivae deben eetar incorporadae dentro del ADEC mediante diferentee métodos conocidos por aquellos expertoe en la técnica. Una modalidad preferida ee la etiquetación de grupos amino primarios en ADEC con 125j reactivo de Bolton-Hunter (Bolton, AE y Hunter, WM (1973) Biochem J 133:529), el cual se ha usado para etiquetar otras quimiocinas sin una pérdida concomitante de la actividad biológica (Hebert CA y colaboradores (1991) J Biol Chem 266:18989; McColl S y colaboradores (1993) J Immunol 150:4550-4555) . Se incuban las células portadoras del receptor con ADEC etiquetado. Después se lavan las células para remover el ADEC no fijado, y se cuantifica el ADEC fijado al receptor. Se usan los datos obtenidos usando diferentes concentraciones de ADEC para calcular los valores para el número y afinidad de receptores . El ADEC etiquetado es útil como un reactivo para la purificación de su receptor específico. El ADEC ee acopla de manera covalente a una columna de cromatografía. Se extraen lae célulae portadorae del receptor, y ee paea el extracto sobre la columna. El receptor se fija a la columna en virtud de su afinidad biológica por el ADEC. Se recupera el receptor de la columna y se somete a la secuenciación de la proteína con terminal N. Después se uea eeta eecuencia de amino ácidoe para deeignar lae eondas de oligonucleótido degenerado para la clonación del gen receptor. En un método alternativo, la clonación de la expreeión, se obtiene el ARNm de las células portadoras del receptor y se convierte en una genoteca de expresión de ADNc.

La genoteca se transfecta dentro de una población de células, y se seleccionan aquellas células en la población que expresen el receptor usando ADEC etiquetado de manera fluorescente. Se identifica el receptor mediante la recuperación y 5 secuenciación del ADN recombinante a partir de células altamente etiquetadas. En otro método alternativo, se ponen los anticuerpos monoclonales contra la superficie de las células portadores del receptor y se clasifican para identificar aquellas que 0 inhiben la fijación del ADEC etiquetado. Después se usan estos anticuerpos monoclonales en la purificación de la afinidad o la clonación de expresión del receptor. Se identifican de manera similar los receptores solubles u otras moléculas de fijación solubles. Se incuba el 5 ADEC etiquetado con extractos u otros materiales apropiados derivados de la adenoide inflamada. Después de la incubación, se identifican los complejos de ADEC más grandes que el tamaño * ,„ , .. ,del ADEC purificado mediante una técnica de claeifi' .¿ón según el tamaño tal como la cromatografía de exclusión de 0 tamaño o la centrifugación de gradiente de deneidad y se purifican mediante métodos conocidos en la técnica. Se somete a los receptoree solubles o a la(s) proteína (e) de fijación a una eecuenciación con terminal N para obtener información suficiente para la identificación de la baee de datoe, ei ee 5 conoce la proteína soluble, o a clonación, ei ee deeconoce la proteína soluble. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior están incorporadas en la presente por referencia. Se considera que la especificación por escrito precedente es suficiente para permitirle a alguien experto en la técnica practicar la invención. De hecho, se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones diferentes modificaciones de las maneras descritas anteriormente para llevar a cabo la invención las cuales son obvias para aquellos expertos en el campo de la biología molecular o campos relacionados.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS , INC. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: UNA QUIMIOCINA NOVEDOSA EXPRESADA EN ADENOIDES INFLAMADAS, SU PRODUCCIÓN Y USOS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (B) CALLE: 3174 Porter Drive (C) CIUDAD: Palo Alto (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE NORTEAMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 94304 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Disco de 5 1/4 (B) COMPUTADORA: PC compatible con JBM , (C) SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WordPerfect 6.1/MS-DOS 6.2 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD DEL TCP: Para Ser Asignado (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de diciembre de 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SERIE DE LA SOLICITUD: US 08/352,324 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de diciembre de 1994 (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE : (A) NOMBRE: LUTHER, BARBARA J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 33954 (C) NUMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: PF-0025 TCP (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 415-855-0555 (B) TELEFAX: 415-852-0195 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 330 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Adenoide Inflamada (B) CLON: 20293 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: ATGAAGTTCA TCTCGACATC TCTGCTTCTC ATGCTGCTGG TCAGCAGCCT CTCTCCAGTC ? CAAGGTGTTC TGGAGGTCTA TTACACAAGC TTGAGGTGTA GATGTGTCCA AGAGAGCTCA 120 GTCTTTATCC CTAGACGCTT CATTGATCGA ATTCAAATCT TGCCCCGTGG GAATGGTTGT 180 CCAAGAAAAG AAATCATAGT CTGGAAGAAG AACAAGTCAA TTGTGTGTGT GGACCCTCAA 240 GCTGAATGGA TACAAAGAAT GATGGAAGTA TTGAGAAAAA GAAGTTCTTC AACTCTACCA 300 GTTCCAGTGT TTAAGAGAAA GATTCC'CTGA 330 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 109 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Adenoide Inflamada (B) CLON : 20293 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 2 Met Lys Phe lie Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe lie Pro Arg Arg Phe lie 35 40 45 Asp Arg lie Gln lie Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60 lie lie Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser l ie Val Cys Val Asp Pro Gln 65 70 75 80 Ala Glu Trp lie Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys lie Pro 100 105 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 114 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido . - (C) TIPO DE CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : Met Ser Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ala Arg Val Pro Gly Pro Ser Ser 1 5 10 15 Ser Leu Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gln Pro Gly 20 25 30 Pro lie Ala Ser Ala Gly Pro Ala Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg 35 40 45 Cys Val Cys Leu Gln Thr Thr Gln Gly Val His Pro Lys Met lie Ser 50 55 60 Asn Leu Gln Val Phe Ala He Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val 65 70 75 80 Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly Lys Glu He Cys Leu Asp Pro Glu Ala 85 90 95 Pro Phe Leu Lys Lys Val He Gln Lys He Leu Asp Gly Gly Asn Lys 100 105 110 Glu Asn ( 2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 4 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 107 amino ácidos (B) TIPO : amino ácido ( C) TIPO DE CADENA : única (D) TOPOLOGÍA : lineal i ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 4 : Met Ala Arg Ala Thr Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ser Arg Arg Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr 35 40 45 ,. Z1 Leu Gln Gly He His Leu Lys Asn He Gln Ser Val Lys Val Lys Ser 50 55 60 Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val He Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80 Gly Gln Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys He 85 90 95 He Glu Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn 100 105 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 106 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE CADENA: Única (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 5 Met Ala His Ala Thr Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Ser Arg Arg Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu 35 40 45 Gln Gly He His Leu Lys Asn He Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro 50 55 60 i > Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val He Ala Thr Leu Lys A- . Gly 65 70 75 80 Lys Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys He He 85 90 95 Glu Lys He Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn 100 105 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 99 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu He Ser 1 5 10 15 Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 20 25 30 Arg Cys Gln Cys He Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 35 40 45 He Lys Glu Leu Arg Val He Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 50 55 60 Glu He He Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 65 70 75 80 Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 85 90 95 Glu Asn Ser (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 107 amino ácidoe (B) TIPO : amino ácido (C) TIPO DE CADENA : única (D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 7 Met Ala Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Arg Arg Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr 40 45 Leu Gln Gly He His Pro Lys Asn He Gln Ser Val Asn Val Lys Ser 50 55 60 Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val He Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80 Gly Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro He Val Lys Lys He 85 90 95 He Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn 100 105 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 101 amino ácidoe (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 8 Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu 20 25 30 Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser 35 40 45 Gln Val Arg Pro Arg His He Thr Ser Leu Glu Val He Lys Ala Gly 50 55 60 Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu He Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg 65 70 75 80 Lys He Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Thr Lys Lys He He Lys 85 90 95 Lys Leu Leu Glu Ser 100 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 109 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido ' (C) TIPO DE CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 Met Lys Phe He Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe He Pro Arg Arg Phe He 35 40 45 Asp Arg He Gln He Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60 He He Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser He Val Cys Val Asp Pro Gln 65 70 75 80 Ala Glu Trp He Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys He Pro 100 105

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifican al polipéptido que tiene la secuencia como se representa en el SEQ ID NO: 2 o su complemento.

2. El polinucleótido de la Reivindicación 1, en donde la secuencia de polinucleótidos consiste del SEQ ID N0:1.

3. Un polinucleótido purificado capaz de hibridizar al polinucleótido de la Reivindicación 2 bajo condiciones estringentes.

4. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido purificado de la Reivindicación 2.

5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la Reivindicación 4.

6. Una sonda de polinucleótido que comprende un fragmento no conservado del polinucleótido de la Reivindicación 2.

7. una molécula anti-sentido que comprende una secuencia de polinucleótidoe complementaria a cuando menoe una porción del polinucleótido de la Reivindicación 2.

8. Un método para producir un polipéptido que comprende la eecuencia según ee repreeenta en el SEQ ID NO: 2, comprendiendo el método: a) cultivar lae células huésped de la Reivindicación 5 bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y b) recuperar dicho polipéptido del cultivo celular. . Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótidos que codifican la quimiocina expresada en adenoides en una muestra biológica, que comprende los pasoe de: a) combinar la muestra biológica con una primera secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID N0:1, o un fragmento de la misma, bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo de hibridación de ácido nucleico, b) detectar dicho complejo de hibridación, en donde la presencia de dicho complejo se correlaciona con la presencia de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica a la quimiocina 1 expresada en adenoides en la mueetra biológica, y c) comparar la cantidad de la segunda secuencia de nucleótidos en dicha muestra con un estándar, determinando mediante lo mismo ei la cantidad de la eegunda eecuencia de nucleótidoe varía de dicho eetándar, en donde la preeencia de un nivel anormal de dicha eegunda secuencia de nucleótidos se correlaciona positivamente con una condición aeociada con inflamación. 10. La prueba de diagnóstico de la Reivindicación 9, en donde la primera secuencia de nucleótidos está etiquetada con una molécula reportera, y el complejo de hibridación se detecta mediante la medición de dicha molécula reportera. 11. Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótidos que codifican quimiocina expresada en adenoides en una muestra biológica, que comprende los pasoe de: a) combinar la muestra biológica con cebadores de reacción de cadena de polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificación de ácido nucleico, en donde los cebadores comprenden fragmentos de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID N0:1, c) detectar secuencias de nucleótidos amplificadas, y d) comparar la cantidad de secuencias de nucleótidos amplificadas en dicha muestra biológica con un estándar, determinando mediante lo mismo si la cantidad de la secuencia de nucleótidos varía de dicho estándar, en donde la presencia de un nive;l anormal de dicha eecuencia de nucleótidoe ee correlaciona poeitivamente con una condición aeociada con inflamación. 12. Un polipéptido purificado, en donde la secuencia de polipéptidos comprende el SEQ ID NO: 2. 13. Un anticuerpo específico para el polipéptido purificado de la Reivindicación 12. 14. Una quimiocina expresada en adenoide purificada que tiene un residuo de amino ácido con terminal N del residuo 24, leucina, del SEQ ID NO: 2. 15. Una quimiocina expresada en adenoide purificada que tiene un residuo de amino ácido con terminal N del residuo 25, ácido glutámico, del SEQ ID NO: 2. 16. Un péptido purificado de quimiocina expresada en adenoide que consiste de los residuos de amino ácidos 25 a 42 del SEQ ID NO:2. 17. Una composición farmacéutica para tratar estados de enfermedad asociados con la angiogénesis, que comprende una cantidad efectiva de la secuencia de polinucleótidos de la Reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable. 18. Un método para tratar a un paciente sujete - un eetado de enfermedad asociado con la angiogénesis, que comprende la administración de una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la Reivindicación 17 a dicho paciente .