ES2238495T3

ES2238495T3 - Combinacion de la catequina y la quercetina para su empleo farmaceutico o alimenticio.

Info

Publication number: ES2238495T3
Application number: ES01988587T
Authority: ES
Inventors: Domenico Trimboli; Valter Gatti; Gian Carlo Naccari
Original assignee: Giuliani SpA
Current assignee: Giuliani SpA
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: ITMI20002312A1; AU2002220617B2; JP2004512304A; PT1328268E; WO2002034262A1; DE60109632T2; ATE291424T1; US7956040B2; DE60109632D1; IT1320080B1; CA2425933A1; CA2425933C; EP1328268A1; NZ525339A; US20040014686A1; EP1328268B1; AU2061702A

Abstract

Composición para uso farmacéutico o alimenticio que posee actividad antioxidante y caracterizada por el hecho de que contiene como principio activo una combinación de catequina y quercetina en una proporción molar comprendida entre 6:1 y 3:1.

Description

Combinación de la catequina y la quercetina para su empleo farmacéutico o alimenticio.

Se sabe que el consumo moderado de vino tinto está relacionado con un descenso en la frecuencia de sucesos cardiovasculares (More, Medicine 1986:65:245-67; Graziano, N. Engl. J. Med. 1993:329:1829-34). Se considera que determinadas sustancias constituyentes del vino tinto tal como los flavonoides están implicadas en los efectos beneficiosos sobre el sistema cardiovascular mencionados anteriormente debido a su capacidad para inhibir la función plaquetaria. En efecto, los estudios experimentales in vivo realizados en animales demostraron que tanto el vino tinto como el mosto reducían la activación de los trombocitos en las arterias coronarias caninas afectadas por estenosis. Se observó un efecto similar con flavonoides extraídos del vino tino, la quercetina entre otros, indicando que dichos constituyentes del vino tinto se veían implicados en la eliminación de la reducción del flujo causada por la agregación de los trombocitos. (Slane, Clin. Res. 1994; 42; 169A (abstr.)). Diversos estudios in vitro han demostrado que flavonoides tales como el resveratrol, la quercetina y la catequina inhiben la agregación de los trombocitos; sin embargo, surge una limitación potencial en dichos estudios debida al hecho que la concentración empleada para obtener dicha inhibición era demasiado elevada. Por lo tanto, algunos autores han puesto en cuestión la actividad que dichos constituyentes del vino tinto ejercen sobre los trombocitos in vivo (Janssen, Am. J. Clin. Nutr. 1998; 67; 255-62). Se ha de tener en cuenta que dicha investigación sobre los efectos de los flavonoides en la función plaquetaria hasta ahora se ha centrado en cada componente considerado de forma individual; nunca se ha realizado una investigación sobre si los flavonoides pueden actuar de manera combinada para inhibir la activación de los trombocitos. Después del consumo de vino tinto, más de un flavonoide circula por el cuerpo humano, de manera que dicha sinergia puede ser significativa, a concentraciones de flavonoides menores que las estudiadas previamente y que podrían modular la actividad plaquetaria.

Otro tema relacionado con el efecto antiagregante plaquetario de los flavonoides es su mecanismo de acción, A pesar de que los resultados de la mayoría de los estudios concuerdan en el hecho de que los flavonoides interaccionan con el metabolismo del ácido araquidónico y, por lo tanto, inhiben la producción de tromboxano A_{2}, nunca ha sido estudiado el mecanismo en el que se basa dicha acción. Los flavonoides son compuestos fenólicos cuyos efectos antioxidantes están más correlacionados con la desoxidación del radical que con la quelación del metal. Se ha sugerido que la inhibición tanto de la función tanto de la función plaquetaria como del metabolismo de los ácidos araquidónicos depende de la actividad antioxidante, pero ningún estudio planteó investigaciones para descubrir si los flavonoides interactúan con la activación de los trombocitos contrastando el efecto de las especies oxidantes formadas in situ. La presente invención, por lo tanto, se basó en investigar si los flavonoides, o algunos de ellos, de forma selectiva, podían actuar sinérgicamente en la inhibición de la función plaquetaria e interferir con dicha función basándose en el efecto antioxidante.

Como consecuencia de este estudio, la presente invención propone una composición para uso farmacéutico o alimenticio que presenta alta actividad antioxidante, caracterizada porque dicho principio activo comprende una combinación de catequina y quercetina en una proporción molar que se encuentra entre 6:1 y 3:1.

Según la invención, de hecho se ha encontrado, sorprendentemente, que estos dos flavonoides específicos combinados en dichas proporciones de concentración son capaces de ejercer su actividad antioxidante de forma sinérgica.

Para una mejor comprensión de las características y ventajas de la invención, los detalles del estudio que condujeron a ella se describen a continuación.

Materiales y métodos

El ^{32}Pi y el ácido [^{3}H]oleico se obtuvo de Amersham (Arlington Heights, IL). El fluorocromo Fura 2/AM y el diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR) y la Sefarosa 2B se obtuvo de Pharmacia (Uppsala, Suecia). El tetrapéptido Arg-Gly-Asp-Ser (RDGS) se obtuvo de Bachem Feinchemikalien AG (Budendorf, Suiza). El colágeno tipo I se obtuvo de Mascia Brunelli (Milan, Italia). Las columnas HPLC (Partisil 10 SAX) se obtuvieron de Whatman (Clifton, NJ). La albúmina de suero bovino, HEPES, el ácido acetilsalicílico, la catequina, la quercetina, el fibrinógeno, la pirofosfatasa inorgánica, la digitonina, el formaldehído, la indometacina, la fosfocreatina y la creatina quinasa se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis).

Preparaciones de trombocitos

La sangre humana sin productos farmacéuticos se obtuvo a partir de voluntarios sanos y se mezcló con la asociación de glucosa, citrato sódico y ácido cítrico. El plasma rico en trombocitos se centrifugó a 800 g durante 20 minutos a temperatura ambiente y el sedimento se suspendió en un volumen igual a la mitad del volumen inicial de plasma autógeno, bajo en trombocitos. Las suspensiones de trombocitos se incubaron durante una hora a 37ºC en 3 \mumol de Fura 2/AM por L, 40 \mumol de DCFH-DA/L, 7,4 GBq (2Ci) de ^{32}Pi/L o 3,7 Mbq (1mCi) de ácido [^{3}H]oleico/L. Los trombocitos se lavaron mediante la técnica de cromatografía de exclusión en sefarosa 2B empleando una disolución amortiguadora Tyrodes sin Ca^{2+} (134 mmol de NaCl/L, 2,9 mmol de KCI/L, 0,34 mmol de Na_{2}HPO_{4}/L y 2 mmol de MgCl_{2}/L) que contenía un 0,2% de albúmina de suero bovino, 5 mmol de glucosa/L y 10 mmol de HEPES/L, de pH 7,35. Los trombocitos que se habían sometido a cromatografía de exclusión (PSEC) se ajustaron a una concentración final de 2 x 10^{11} células/L. Debido a que la adición de metanol a las suspensiones de PSEC a concentraciones < 0,5% no causaron ningún cambio en la respuesta de los PSEC al colágeno, esta proporción fue la que se empleó para obtener las concentraciones finales de quercetina que variaron entre 5 y 20 \mumol/L. La catequina y la quercetina se añadieron a las suspensiones de PSEC mientras se agitaban de forma continua durante 30 minutos a 37ºC y a continuación se procedió a su extracción mediante centrifugación a 800 g durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Análisis del flujo y de la agregación de los trombocitos mediante citrometría

Se añadió DCFH-DA a los PSEC (concentración final: 40 \mumol/L); después de 15 minutos de incubación con o sin catequina o quercetina, los PSEC se activaron con colágeno. La reacción se paró con 2 mmol de EGTA/L después de 1 minuto. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Coulter XL-MCL (Hialeah, FL) equipado con un láser de argón (emisión de 480 nm) ajustado para determinar la difusión logarítmica de la luz directa, que es la medida de las dimensiones de la partícula; la difusión logarítmica de la luz a 90º, que es la medida de la granularidad de la célula; y la fluorescencia verde (DCF) a 510 - 550 nm. La señal de fluorescencia generada por la sonda se expresó como el índice de estimulación, es decir, la intensidad del canal medio de fluorescencia de los trombocitos estimulados / la intensidad del canal medio de fluorescencia de los trombocitos sin estimular. La agregación de los trombocitos in vitro se evaluó según el método de Born. El colágeno se empleó a concentraciones de 2 – 4 mg/L.

Concentraciones de Ca^{2+} en el citosol de los trombocitos

Las concentraciones de Ca^{2+} en el citosol de los trombocitos se determinaron empleando la tintura Fura 2 como indicador de fluorescencia, según Grynkiewicz et al.; los cambios en la fluorescencia se verificaron con un fluorímetro SFM 25 (Kontron, Zurich, Suiza) ajustado a una longitud de onda de emisión de 510 nm y a una longitud de onda de excitación de 340 nm.

Activación de la fosfolipasa C - adherencia de los trombocitos al colágeno

Se analizó la producción de 1,3,4-inositol trifosfato (IP_{3}), un indicador de la activación de la fosfolipasa C, 30 segundos después de la estimulación según Pulcinelli et al. El colágeno se empleo a una concentración de 10 mg/L, que era la menor concentración capaz de inducir una respuesta reproducible. Las suspensiones de trombocitos identificadas con el ácido [^{3}H]oleico se utilizaron para evaluar la adherencia de los trombocitos al colágeno (50 mg/L) según Smith y Dangelmaier.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como los valores medios \pm el error estándar de la media (SEM). Las respuestas en las distintas condiciones experimentales se compararon con la prueba t de Student y la prueba de Bonferroni para evaluar las diferencias específicas entre los grupos. El nivel de significación se ajustó a P < 0,05. El análisis se llevó a cabo empleando el programa StatView (Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA).

Los resultados del estudio se examinarán a continuación, haciendo especial referencia a las Figuras de la 1 a la 5 de los gráficos adjuntos que presentan los siguientes diagramas:

Fig. 1

La producción media (\pm SEM) de peróxido de hidrógeno en los trombocitos cargados con diacetato de diclorofluoresceína en la línea de referencia, después de la estimulación con colágeno solo, y después de la estimulación con 10 mg de colágeno/L (A) o 20 mg de colágeno/L (B) con catequina sola (Cat; 50 y 100 \mumol/L), quercetina sola (Q; 10 y 20 \mumol/L), y una combinación según la invención de catequina (Cat) + quercetina (Q) en una proporción de 5:1, es decir, Cat (25 \mumol/L) + Q (5 \mumol/L). Los resultados se determinaron mediante citofluorimetría. n = 5 pruebas. SI, índice de estimulación. ^{*} \cdot ^{#} Significativamente diferentes en relación con el colágeno solo ^{*}P < 0,05, ^{#}P < 0,01.

Fig. 2

La agregación de los trombocitos media (\pm SEM) en la línea de referencia, después de la estimulación con colágeno solo, y después de la estimulación con 2 mg de colágeno/L (A) o 4 mg de colágeno/L (B) con catequina (Cat; 50 y 100 \mumol/L), quercetina (Q; 10 y 20 \mumol/L), o Cat (25 \mumol/L) + Q (5 \mumol/L). n = 5 pruebas. ^{*} \cdot ^{#} Significativamente diferentes en relación con el colágeno solo: ^{*}P < 0,05, ^{#}P < 0,01.

Fig. 3

El valor medio (\pm SEM) de los cambios en el porcentaje (\Delta) en las concentraciones de calcio intraplaquetario en la línea de referencia, después de la estimulación con colágeno solo, y después de la estimulación con 4 mg de colágeno/L (A) o 8 mg de colágeno/L (B) con catequina (Cat; 50 y 100 \mumol/L), quercetina (Q; 10 y 20 \mumol/L), o Cat (25 \mumol/L) + Q (5 \mumol/L). n = 5 pruebas. ^{*} \cdot ^{#} Significativamente diferentes en relación con el colágeno solo: ^{*}P < 0,05, ^{#}P < 0,01.

\newpage

Fig. 4

El valor medio (\pm SEM) de los cambios en el porcentaje (\Delta) en la formación de 1,3,4-inositol trifosfato (IP_{3}) en los trombocitos en la línea de referencia, después de la estimulación con colágeno solo, y después de la estimulación con 10 mg de colágeno/L (A) o 20 mg de colágeno/L (B) con catequina (Cat; 50 y 100 \mumol/L), quercetina (Q; 10 y 20 \mumol/L), o Cat (25 \mumol/L) + Q (5 \mumol/L). n = 5 pruebas. ^{*} \cdot ^{#} Significativamente diferentes en relación con el colágeno solo: ^{*}P < 0,05, ^{#}P < 0,01.

Fig. 5

El valor medio (\pm SEM) de los cambios en el porcentaje (\Delta) en la adherencia al colágeno en la línea de referencia, después de la estimulación con colágeno solo, y después de la estimulación con 50 mg de colágeno/L con catequina (Cat; 50 y 100 \mumol/L), quercetina (Q; 10 y 20 \mumol/L), o Cat (25 \mumol/L) + Q (5 \mumol/L). n = 5 pruebas. ^{#} Significativamente diferentes en relación con el colágeno solo: ^{#}P < 0,01.

Resultados Análisis mediante la citrometría de flujo

La citometría de flujo emplea las propiedades del DCFH-DA, el cual se difunde rápidamente a través de las membranas celulares y entonces se ve retenido en el interior de la célula gracias a una reacción de desacetilación. En presencia de peróxido de hidrógeno, este compuesto se oxida a diclorofluoresceína (DCF), que es altamente fluorescente. El efecto de las concentraciones escalares de quercetina y catequina en la producción de peróxido de hidrógeno inducida con 10 y 20 mg de colágeno/L se presenta en la Fig. 1 En comparación con los trombocitos sin tratar, los trombocitos estimulados con colágeno aumentaron la producción de peróxido de hidrógeno, que depende de la concentración de colágeno empleada. La catequina y la quercetina inhibieron la producción del peróxido de hidrógeno causada por el colágeno de los trombocitos. La combinación de 5 \mumol de quercetina/L y de 25 \mumol de catequina/L supuso una reducción significativa en la formación de peróxido de hidrógeno causada por los 10 y 20 mg de colágeno/L; no se ha publicado de ninguno de los dos compuestos por separado que en dichas bajas cantidades presente algún efecto inhibitorio.

Agregación de los trombocitos

El efecto de la catequina y la quercetina en la agregación se determinó empleando dos concentraciones distintas de colágeno. Tanto la catequina como la quercetina inhibieron la agregación de los trombocitos causada por el colágeno. El grado de inhibición dependía de la concentración de colágeno empleada. De este modo, 100 \mumol de catequina/L inhibieron \approx 75% de la agregación de los trombocitos inducida por 2 mg de colágeno/L e inhibieron \approx 39% de la agregación de los trombocitos inducida por 4 mg de colágeno/L. En los trombocitos tratados con 20 \mumol de quercetina/L, el grado de inhibición de la agregación de los trombocitos inducida por el colágeno (2 y 4 mg/L) fue de un 50% y un 43% respectivamente. La combinación de 25 \mumol de catequina/L y 5 \mumol de quercetina/L, que no presentan influencia en la agregación de los trombocitos cuando se emplean por separado, produjo una inhibición significativa (55%) de la agregación de los trombocitos inducida por ambas concentraciones de colágeno (Fig. 2).

Cambios en la concentración del calcio intracelular

La catequina y la quercetina inhibieron la movilización del calcio, expresado como un cambio en el porcentaje de la concentración del calcio intracelular. En los trombocitos estimulados con 4 mg de colágeno/L, 100 \mumol de catequina/L y 20 \mumol de quercetina/L, se produjo un descenso significativo en la movilización del calcio, de un 71% y un 65% respectivamente.

La incubación de los trombocitos con 25 \mumol de catequina/L más 5 \mumol de quercetina/L según la invención, produjo una inhibición significativa de la movilización del calcio, de un 71%. Un resultado parecido también se observó cuando la movilización del calcio fue inducida por 8 mg de colágeno/L (Fig. 3).

Activación de la fosfolipasa C

La producción de [^{32}Pi]IP_{3} en trombocitos estimulados con el colágeno se inhibió con la catequina y la quercetina: 10 mg de colágeno/L, 100 \mumol de catequina/L y 20 \mumol de quercetina/L, produjeron un descenso significativo en la producción de IP_{3}, de un 50% y un 93% respectivamente. La incubación de los trombocitos con 25 \mumol de catequina/L más 5 \mumol de quercetina/L según la invención, produjo una inhibición significativa de la producción de IP_{3}, de un 72%; unos efectos similares se observaron cuando los trombocitos se estimularon con 20 mg de colágeno/L (Fig. 4), pero el grado de inhibición resultó menor, aunque todavía significativo.

Adherencia de los trombocitos al colágeno

La activación de los trombocitos con el colágeno es un proceso que consta de varias etapas. De este modo, después de que se una inicialmente a los trombocitos siguiendo la vía del segundo mensajero, el colágeno estimula la liberación de tromboxano y ADP, los cuales son importantes agonistas de los trombocitos que inducen la agregación. Para estudiar la adherencia de los trombocitos al colágeno (50 mg/L) sin la interferencia de la agregación y de la activación inducida por todos los agonistas conocidos liberados por los gránulos de los trombocitos debido a la estimulación del colágeno, los trombocitos fueron sometidos a preincubación con aspirina, un inhibidor de la ciclooxigenasa, con la eliminación del sistema fosfocreatina y creatina quinasa ADP, y con el antagonista del fibrinógeno-fibronectina RDGS (13).

La adherencia de los trombocitos a los 50 \mumol de colágeno/L en presencia de catequina (50 y 100 \mumol/L), quercetina (10 y 20 \mumol/L), y catequina (25 \mumol/L) más quercetina (5 \mumol/L) según la invención se presenta en la Fig. 5 La catequina o la quercetina por su parte inhiben la adherencia de los trombocitos al colágeno, que se vio inhibido de significativamente por 100 \mumol de catequina/L y 20 \mumol de quercetina/L. La incubación de los trombocitos con 25 \mumol de catequina/L más 5 \mumol de quercetina/L produjo una inhibición significativa de la adherencia de los trombocitos, de un 85%.

Las siguientes conclusiones generales pueden extraerse del estudio descrito anteriormente.

Tal como ya se ha mencionado, en la técnica anterior la relación entre el consumo del vino tinto y la inhibición de la función plaquetaria ha sido observada en diversos estudios experimentales. De hecho, la administración intragástrica de 4,0 mL de vino tinto/kg de peso corporal suprimió completamente la activación de los trombocitos en un modelo canino de estenosis coronaria. A pesar de que no se han determinado las concentraciones de flavonoides en la sangre periférica después de la administración de vino tinto, otros estudios sobre el mismo modelo experimental demostraron que los flavonoides inhibían la activación de los trombocitos, sugiriendo de este modo su posible implicación en la inhibición de la función plaquetaria. Según el estudio de la presente invención, la incubación de los trombocitos con 20 \mumol de catequina/L más 5 \mumol de quercetina/L, que no presentaron ningún efecto en la función plaquetaria cuando se emplean individualmente a estas concentraciones, se asocia con una inhibición significativa de la activación de los trombocitos. Se debería señalar que a pesar de que la estimulación se llevó a cabo con concentraciones elevadas de colágeno (8 - 20 mg/L), necesarias para identificar la movilización del calcio y la producción de IP_{3}, la combinación de la quercetina y la catequina inhibe la función plaquetaria en cada caso.

La combinación de la quercetina y la catequina produce incluso efectos más profundos en la adherencia de los trombocitos, que se ve inhibida casi completamente cuando los trombocitos son tratados según la presente invención. En vista de la importancia biológica de la adherencia de los trombocitos al colágeno en la iniciación y la progresión del proceso arterioesclerótico, se espera que la presente invención resulte útil en concreto en el tratamiento o la prevención de los trastornos cardiovasculares (arterioesclerosis, trombosis, infarto, etc.) para mejorar la funcionalidad cerebral y para el tratamiento del deterioro mental en la senectud.

Otras indicaciones útiles, basadas fundamentalmente en la actividad antioxidante del principio activo y su facilidad para combinarse con los radicales libres, comprenden aquéllas adecuadas para el tratamiento o la prevención de la celulitis, del envejecimiento de la piel y la aparición de arrugas, la pérdida de cabello, para contrarrestar la acción de la radiación UV y los contaminantes ambientales.

Como conclusión general, la presente invención demuestra que los flavonoides quercetina y catequina actúan sinérgicamente según las concentraciones indicadas para inhibir la adherencia de los trombocitos al colágeno y la agregación de los trombocitos causada por el colágeno, contraponiéndose a la producción intracelular de peróxido de hidrógeno.

A continuación se describen unos ejemplos de aplicaciones prácticas de composiciones farmacéuticas o alimenticias según la presente invención.

Se debería explicar que dichos ejemplos están relacionados con un principio activo que consiste en una combinación de catequina-quercetina en una proporción molar de aproximadamente 5:1.

En concreto, dicha combinación de los dos flavonoides, a la que se refiere como "complejo" en los ejemplos, se obtienen según los ejemplos a partir de un extracto de partes, tales como semillas y hojas, de Vitis vinifera que contienen aproximadamente 7,5 g de catequina y 1,5 g de quercetina por cada 100 g de extracto. Dichas composiciones se han de tomar preferiblemente con el estómago lleno para optimizar la biodisponibilidad del principio activo.

Ejemplo 1 Producto alimenticio para prevenir y combatir la celulitis

1

Ejemplo 2 Producto alimenticio para prevenir y combatir la celulitis

2

Ejemplo 3 Producto para reforzar el cabello y reducir la pérdida de cabello

3

Ejemplo 4 Producto para prevenir las enfermedades cardiovasculares

4

Ejemplo 5 Producto alimenticio para prevenir el envejecimiento de la piel y la aparición de arrugas

5

Ejemplo 6 Producto alimenticio para mejorar la funcionalidad cerebral y prevenir el deterioro mental en la senectud

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Otras composiciones farmacéuticas o alimenticias adecuadas según la invención se pueden seleccionar de entre un amplio campo, que incluye cada forma adecuada de administración oral como comprimidos gránulos, polvos y otros.

Claims

1. Composición para uso farmacéutico o alimenticio que posee actividad antioxidante y caracterizada por el hecho de que contiene como principio activo una combinación de catequina y quercetina en una proporción molar comprendida entre 6:1 y 3:1.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que dichas catequina y quercetina se encuentran en una proporción de 5:1.

3. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que es indicada para usar como agente para la prevención de la agregación de los trombocitos en el tratamiento y la prevención de los trastornos cardíacos y circulatorios.

4. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que es indicada para la mejora de la funcionalidad cerebral, en concreto para la prevención y el tratamiento del deterioro mental en la senectud.

5. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que es indicada para utilizarla en el tratamiento y la prevención de la celulitis.

6. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que es indicada para utilizarla en el tratamiento y la prevención del envejecimiento de la piel y la aparición de arrugas.

7. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que es indicada para utilizarla en el tratamiento y la prevención de la pérdida de cabello.

8. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que es indicada para utilizarla en el tratamiento y la prevención de los daños producidos en la piel por la radiación UV.

9. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que dicho principio activo se deriva de un extracto de partes, tales como semillas y hojas, de Vitis vinifera.

10. Composición según la reivindicación 9, caracterizada por el hecho de que en dicho extracto hay 7,5 g de catequina y 1,5 g de quercetina por cada 100 g de extracto.

11. El uso de una combinación de catequina y quercetina en una proporción molar comprendida entre 6:1 y 3:1, como principio activo en la preparación de una composición para uso farmacéutico o alimenticio que presenta actividad antioxidante.