ES2236917T3 - Sensor polimero fluorescente para la deteccion de urea. - Google Patents

Sensor polimero fluorescente para la deteccion de urea.

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ES2236917T3 ES98933853T ES98933853T ES2236917T3 ES 2236917 T3 ES2236917 T3 ES 2236917T3 ES 98933853 T ES98933853 T ES 98933853T ES 98933853 T ES98933853 T ES 98933853T ES 2236917 T3 ES2236917 T3 ES 2236917T3
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Abstract

La presente invención se refiere a un material sensor de urea que comprende una primera capa de un fluoróforo protonado sensible al pH inmovilizado en un polímero hidrofóbico, en el que el fluoróforo puede reaccionar cuantitativamente con el amonio y el elemento que transduce el fluoróforo tiene carga neutra cuando se desprotona; una segunda capa de ureasa y un polímero; y una tercera capa de un polímero. La presente invención también proporciona un procedimiento para detectar urea empleando material sensor de urea y dispositivos sensores ópticos que incluyen al material sensor de urea.

Description

Sensor polimérico fluorescente para la detección de urea.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a sensores para detección de urea.
Descripción de técnicas relacionadas
El seguimiento continuo de urea se ha llevado a cabo por un número de métodos electroquímicos (Goldfinch, M.J.; Lowe, C.R. Anal. Biochem. 138: 430-436 (1983); Luo, S.; Walt, D.R. Anal. Chem. 61: 1069-1072 (1989)). Los sensores que utilizan estos métodos son creados por inmovilización de la enzima ureasa sobre la superficie de un electrodo. La hidrólisis enzimática de urea produce amoníaco y dióxido de carbono, que están protonados a pH fisiológico para formar iones amonio y carbonato, lo que aumenta la conductividad eléctrica del proximal de la solución al electrodo.
También se puede hacer el seguimiento de la urea empleando un sensor óptico. La detección de analitos por sensores ópticos requiere habitualmente el desarrollo de transductores fluorescentes que son específicos para diferentes analitos. Los transductores ópticos han sido acoplados también para detección de urea vía hidrólisis de urea conducida por ureasa, con el transductor óptico modulado por amonio o amoníaco.
La detección de amonio requiere un ionóforo específico de amonio copulado con un cromóforo que cambia su espectro de absorción al protonarse, y una sede aniónica lipófila. Según esto, los sensores basados en la detección de amonio pueden ser caros y complejos.
Por ejemplo, Kawabata y col. en Anal. Chim. Acta 283:689-694 (1993) describen un optrodo de urea que utiliza una membrana de polímero ópticamente sensible a iones amonio y una membrana con ureasa inmovilizada. La membrana de polímero sensible a amonio de Kawabata y col. consiste en una sonda fluorescente (naranja de hexadecilo-acridina cargada positivamente) y un ionóforo de amonio, que responde a iones de amonio que se difunden desde la capa que contiene ureasa tras la escisión de la urea desde la muestra. El tinte fluorescente se inmoviliza sobre una membrana de PVC plastificada con una membrana de poliacrilamida.
La detección de amoníaco requiere un indicador protonado sensible a pH (INDH') que cambia su espectro de absorción o fluorescencia en la desprotonación:
INDH^{+} + NH_{3} \rightarrow IND + NH_{4}{}^{+}
Al diseñar un sensor basado en la detección de amoniaco existe la desventaja de la rápida protonación de amoníaco a pH fisiológico. El pK_{a} de amonio es 9,3 que no es un pH que apoye una actividad enzimática máxima.
Los polímeros hidrófobos, ópticamente transparentes y permeables al analito que interesa, se utilizan con sensores ópticos cuando el analito es un vapor o gas y es capaz de difundirse en una membrana hidrófoba. Aparece una complicación cuando se utilizan polímeros hidrófobos con ciertos tintes fluorescentes. Los sensores para amoniaco requieren un indicador protonado. Cuando se combinan con una membrana hidrófoba para detección de amoníaco, los indicadores de pH polianiónicos, que son la variedad común de indicador protonado y el tipo empleado como sensor de urea fluorescente descrito en Rhines y Arnold (Anal. Chim. Acta, 231:231-235 (1990), no producen un fluoróforo activado y protonado.
Aunque se conocen varios indicadores para urea, muchos sensores de urea presentan problemas con interferencias de efectos de pH y CO_{2}, baja sensibilidad, tiempos de respuesta lentos y reversibilidad. Desde el punto de vista de la manufactura, sería deseable por tanto el desarrollo de un sensor barato capaz de detectar urea que tuviera una alta sensibilidad, tiempo rápido de respuesta, y que fuera reversible. Sería ventajoso también que el sensor fuese capaz de funcionar en unión de sensores que detectan otros analitos.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un material sensor de urea que comprende:
una primera capa, que consiste en un fluoróforo sensible al pH inmovilizado dentro de un primer polímero hidrófobo, donde el fluoróforo está protonado dentro del primer polímero hidrófobo en ausencia de amoníaco, puede reaccionar cuantitativamente con amoníaco y tiene una fracción transductora neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoníaco, donde la concentración de amoníaco presente está indicada por un cambio en la fluorescencia directamente resultante de la desprotonación del fluoróforo y donde la primera capa se prepara por combinación del fluoróforo y el primer polímero hidrófobo en presencia de un disolvente orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un segundo polímero, y
una tercera capa que comprende un tercer polímero.
La presente invención proporciona también un método para determinar la concentración de urea en una solución, por medición de la concentración de amoniaco que comprende: medir la fluorescencia de un material sensor de la invención; exponer el material sensor a una solución que comprende urea; medición de la fluorescencia del material sensor después de la etapa de exposición; determinación de la carga de fluorescencia; y determinación de la concentración de urea en la solución.
La presente invención proporciona también un procedimiento de preparación de un material sensor de urea que comprende;
combinación de un fluoróforo sensible al pH y un primer polímero hidrófobo para formar una primera mezcla, en presencia de un disolvente orgánico, donde el fluoróforo está protonado dentro del primer polímero hidrófobo en ausencia de amoníaco, y tiene una fracción transductora que queda neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoníaco;
formación de una primera capa de la primera muestra sobre un substrato;
combinación de ureasa y un segundo polímero para formar una segunda mezcla;
formación de una segunda capa de la segunda mezcla sobre la primera capa; y
formación de una tercera capa de un tercer polímero sobre la segunda capa.
La presente invención proporciona también un dispositivo de sensor óptico para determinar la concentración de urea en una solución que comprende urea por medición de la concentración de amoníaco, que comprende:
un componente óptico que es transparente para las ondas electromagnéticas incidente y emisivas,
una primera capa depositada sobre una superficie de los componentes ópticos, comprendiendo la primera capa un fluoróforo sensible al pH inmovilizado en un primer polímero hidrófobo, fluoróforo que puede reaccionar cuantitativamente con amoníaco, y forma una fracción transductora que queda neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoníaco y donde la primera capa se prepara por combinación del fluoróforo y el primer polímero hidrófobo en presencia de un disolvente orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un segundo polímero, depositada sobre la primera capa, y
una tercera capa que comprende un tercer polímero, depositada sobre la segunda capa; donde el componente óptico está conectado ópticamente a medios que recogen la emisión radiante para medir la fluorescencia indicativa de la concentración de amoníaco.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención se comprenderá mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de los modos de realización específicos aquí presentados.
La figura 1 muestra una configuración de sensor de urea.
La figura 2 representa la curva de respuestas de tres sensores de urea en unidades de intensidad de fluorescencia en función de la concentración (mM) de urea.
Descripción de modos de realización ilustrativos
La presente invención se refiere a un sensor para la detección de urea. El sensor de la presente invención comprende un fluoróforo inmovilizado en un polímero hidrófobo, donde el fluoróforo puede reaccionar cuantitativamente con amoníaco y la fracción transductora del fluoróforo queda neutra en cuanto a carga cuando se desprotona.
La fracción transductora es el anillo o grupo de anillos en la estructura molecular del fluoróforo sensible al pH, que produce la fluorescencia cuando se radia con la particular energía de excitación requerida para la excitación. Este mismo segmento de la molécula sufre una carga de resonancia debido a la protonación y desprotonación, y esta carga da lugar a un cambio en la fluorescencia que permite calibrar la fluorescencia como una función de la alteración del pH. Un anillo sustituyente que no está implicado en el cambio de resonancia basado en el pH se puede cargar negativamente cuando se desprotona: véase, por ejemplo, el radical de ácido benzoico sobre rodamina.
En la presente invención, la detección de urea en una solución depende de la presencia de la enzima ureasa, que cataliza la hidrólisis de urea a NH_{3} y CO_{2}. Los sensores de la presente invención detectan el amoníaco que se produce. La detección de amoníaco se basa en cambios en el espectro de fluorescencia del fluoróforo en la desprotonación, como se muestra en la siguiente reacción:
INDH^{+} + NH_{3} \rightarrow IND + NH_{4}{}^{+}
El material sensor comprende tres capas: una capa de transductor, una capa de enzima, y una capa protectora. La capa de transductor está formada por el fluoróforo inmovilizado en un polímero hidrófobo. La capa de enzima está formada por la enzima ureasa inmovilizada en un polímero. La tercera es la capa protectora, que es otro polímero.
Fluoróforos adecuados en los sensores de esta invención son indicadores del pH fluorescente que quedan neutros en cuanto a carga cuando se desprotonan, y que existen en el estado protonado en el microentorno del polímero. Estos fluoróforos incluyen naranja de acridina:
1
y tintes de rodamina:
2
donde R^{1} y R^{2} son, independientemente, un alquilo que tiene entre aproximadamente 2 y 20 átomos de carbono y R^{3} es hidrógeno o un alquilo que tiene entre aproximadamente 2 y 20 átomos de carbono. El naranja de acridina y los tintes de rodamina son los fluoróforos preferidos. La modulación de la fluorescencia de acridina se mide por lo general con una excitación a 489 nm y una emisión a 540 nm, pero se puede excitar a otras longitudes de onda. Se puede conseguir una lectura radiométrica por excitación a dos longitudes de onda y generar una relación de las dos emisiones como una función del amoníaco. La modulación de fluorescencia de un derivado de rodamina, donde R^{1} y R^{2} son, ambos C_{18}H_{37}, se mide por lo general con una excitación a 530 nm y emisión a 590 nm.
Los polímeros hidrófobos útiles en la presente invención son, preferiblemente, polímeros en los que el fluoróforo es al menos parcialmente soluble. Estos polímeros incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, poliestireno, poliuretano, poli(etil celulosa), polidienos tales como poli(1,3-butadieno), copolímero de butadieno-acrilonitrilo, poli(dimetilbutadieno) y poliisopreno, polialquenos tales como polietileno, copolímero de isobuteno-isopreno, poli(4-metilpenteno), polipropileno, poli metacrilato de etilo, politetrafluoroetileno, poli(alcohol vinílico), poli(cloruro de vinilo), y polioximetileno, celulosa y derivados de celulosa, tales como hidrato de celulosa, acetato de celulosa, nitrato de celulosa, etil celulosa, etil metacrilato de celulosa, polimetacrilatos tales como poli(metacrilato de metilo) y poli(metacrilato de etilo) así como polisiloxanos, poliésteres y policarbonatos. Un polímero preferido es etil celulosa. Estos polímeros hidrófobos se pueden utilizar tanto en la capa transductora como en la capa protectora del modo de realización preferido.
El fluoróforo y polímero hidrófobo se combinan para formar un polímero fluorescente. Las intensidades de señal del polímero fluorescente son altas ya que el tinte es muy soluble en el medio orgánico del polímero y no hay apagado de la fluorescencia (como en la Patente estadounidense número 5.506.148) debido a la ausencia de cargas negativas sobre la molécula del tinte. En la exposición a amoniaco, la fluorescencia del polímero fluorescente decrece, lo cual es consistente con la desprotonación que tiene lugar en el tinte al formarse el ión amonio en el polímero fluorescente. Esta respuesta del sensor es reversible cuando la fuente de amoniaco se retira y el amoniaco del sensor se difunde hacia fuera de la membrana.
Se puede añadir opcionalmente un compuesto onio al polímero fluorescente. El compuesto onio ajusta el pH del microentorno del polímero fluorescente para potenciar la sensibilidad a amoníaco. Los compuestos onio incluyen compuestos de amonio, fosfonio y piridinio. Entre los ejemplos de compuestos onio adecuados se incluyen hidróxido de tetrabutilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, hidrogeno sulfato de tetrabutilamonio trifluorometano, acetato de tetrabutilamonio, bromuro de tetraetilamonio, p-toluensulfonato de tetraetilamonio, cloruro de feniltrimetilamonio, bromuro de benciltrimetilamonio, bromuro de tetra-n-propilamonio, tetrafluoroborato de benciltrietilamonio, bromuro de n-dodeciltrimetilamonio, cloruro de tetrafenilfosfonio, bromuro de n-hexadecilpiridinio, cloruro de trifenilfosfonio, bromuro de tetrabutilfosfonio e hidróxido de hexadeciltrimetilamonio. Los compuestos onio preferidos son compuestos de amonio cuaternario, tal como hidróxido de tetrabutilamonio.
El material sensor se puede preparar por disolución del fluoróforo y polímero en un disolvente adecuado, tal como un alcohol, tolueno, tetrahidrofrano u otro disolvente orgánico conocido en la técnica para disolver el polímero hidrófobo. En general, la cantidad de fluoróforo utilizada estará entre aproximadamente 0,05% y 0,5% de la masa total. El fluoróforo se distribuye, preferiblemente, de manera uniforme a través del polímero fluorescente resultante.
Se puede formar entonces una membrana o película del polímero fluorescente disuelto por cualquier método conocido en la técnica, tal como recubrimiento por movimiento de rotación o brocha sobre un substrato no reactivo, tal como vidrio, plástico o cerámica. Alternativamente, el fluoróforo se puede unir covalentemente al polímero, como se describe en la Patente estadounidense número 5.005.572.
La capa de enzima está formada por la enzima ureasa disuelta en un polímero hidrófilo o hidrófobo, que se deposita entonces sobre la capa de transductor. La capa de enzima se puede depositar sobre la capa de transductor de manera similar al depósito de la capa de transductor sobre el substrato. El polímero puede estar reticulado y la enzima se puede modificar químicamente para su unión al polímero. Los polímeros útiles para la capa de enzima incluyen polialcohol vinílico, poliacrilato de hidroxibutilo, hidroxi-propilcelulosa, derivados de acrilamida, y otros polímeros hidrófilos o hidrófobos conocidos por los especialistas en la técnica.
La capa protectora está formada por un polímero que es permeable al analito al mismo tiempo que no es rápidamente soluble en la matriz de la muestra. El polímero se puede disolver en un disolvente y depositarse entonces sobre la capa de enzima de una manera similar. Los polímeros adecuados para uso en la capa protectora son por lo general los polímeros antes descritos, preferiblemente poli metacrilato de hidroxietilo (poliHEMA). Este polímero se aplica como recubrimiento protector para evitar la disolución inmediata de la muestra.
Los polímeros fluorescentes se pueden utilizar como recubrimientos de transductores para sensores ópticos. Los sensores ópticos tradicionales para CO_{2}, NH_{3} y otras especies detectadas por vía de un transductor modulado para el pH se basan en el modelo de Severinghaus (Severinghaus, J.W.; Bradley, A.F. J. Appl. Physiol., 13:515 (1958) donde este tiene una capa de transductor que contiene fluoróforo o cromóforo sensibles a pH, recubierta con un material de membrana de cubierta, tal como un polímero basado en siloxano (Munkholm, C., Walt, D. R. Milanovich, F.P., Talanta, 35: 109-112 (1988). Una dificultad inherente a los sensores Severighaus es su potencial de fallos debido a que los poros de la membrana de cubierta gotean. Los sensores preparados por la presente invención proporcionarán medidas cuantitativas de niveles de amoniaco a través de la modulación del microentorno del fluoroforo. Dado que los microentornos del sensor se dispersan a través del polímero, la preparación de un sensor tal requiere únicamente de una sola aplicación del material de membrana, y esta configuración de membrana única hace irrelevante el problema de la pérdida por los poros. Los sensores no responden a los cambios en pH global, lo que indica que los microdominios del transductor están secuestrados por la muestra. Este sensor se puede utilizar en un sistema que mide la fluorescencia de superficie reflejada así como en un sistema de medida de una señal de onda evanescente.
Una ventaja de los sensores ópticos es su capacidad para resolver información de diferentes analitos a través de sus bandas de ondas discretas. De esta forma se pueden acoplar juntos un sensor de amoníaco con un sensor para un analito diferente en la misma membrana, pero recogiendo la información de lectura a longitudes de onda separadas. Los microdominios del sensor estarán poblados por múltiples transductores, pero la química y el procesado de las señales se llevaría a cabo como si los sensores estuvieran en capas separadas. En este sensor de analito múltiple, el transductor para el analito no-amoniaco puede ser un tinte polianiónico, tal como los descritos en la Patente estadounidense número 5.506.148.
El material sensor se puede utilizar como un recubrimiento sobre cualquier superficie y utilizarse para medir urea en cualquier solución, tal como en la sangre, saliva u orina. Podría tomar parte en los productos y sistemas utilizados en la medición de analitos críticos de la sangre, en aplicaciones utilizadas para seguimiento de la diálisis, y en todos los casos clínicos de seguimiento de urea en tratamientos. Es concebible que este material sensor se pueda emplear en proyectos de investigación académica, ya que podrá ser adaptado a una diversidad de sistemas de medida, tales como fibras ópticas.
Utilizando los métodos de esta invención se puede preparar películas de sensor extremadamente delgadas, de aproximadamente 0,5 a 5 \mum de grueso, que tienen un nivel de fluorescencia detectable. Estas finas películas pueden proporcionar un tiempo de respuesta inusualmente rápido y resultan ideales para recubrir los sensores planos utilizados en métodos de detección de ondas evanescentes donde se desea un recubrimiento fluorescente que esté dentro de las mismas dimensiones que la onda de propagación. Los sensores preparados con este método no se verán afectados por las pérdidas de los poros ya que el material sensor es continuo en el recubrimiento. Estas películas pueden tener además una vida en depósito más larga debido a la ausencia de una capa acuosa, que sería susceptible de deshidratación.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar los modos de realización preferidos de la invención. Un especialista se dará cuenta que las técnicas descritas en los ejemplos que se dan a continuación representan técnicas descubiertas por el autor de la invención para un buen funcionamiento de la práctica de la invención, y así se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.
Ejemplo 1
Se añadió tinte naranja de acridina a una solución al 10% de etil celulosa para que fuera 5 x 10^{-4} M. Se añadió hidróxido de tetrabutilamonio para dar una solución final 0,0045 M. La solución se sometió a ultrasonidos hasta que la mezcla era completa. Se recubrió entonces con movimiento de rotación sobre un substrato de vidrio y se curó en condiciones ambiente durante 24 horas. Se preparó una solución al 5% de poli alcohol vinílico en agua desionizada utilizando poli alcohol vinílico de peso molecular M.W. 124.000 - 186.000. El recubrimiento de enzima se preparó por adición de 90 mg de ureasa (Signa U 4002, Actividad: 50.000 - 100.000 unidades/gramo) a 1,5 ml de polialcohol vinílico, y se aplicó entonces a una capa de etil celulosa con movimiento de rotación. Se aplicó un tercer recubrimiento de poliHEMA (10% en metanol) a la capa de enzima por recubrimiento de rotación. Se curó el sensor en condiciones ambiente durante 24 horas. Se ensayó entonces con un fluorímetro comercial, equipado con montaje para el sensor, empleando solución recién preparada de urea en tampón fosfato (0,05 M, pH 7,8). La Figura 1 muestra la configuración del sensor. La Figura 2 muestra la curva de respuestas de tres sensores de urea en unidades de intensidad de fluorescencia en función de la concentración de urea (mM). La señal decrece a medida que aumenta la concentración de urea, lo que está de acuerdo con la desprotonación del fluoróforo, naranja de acridina, por la producción de amoníaco por hidrólisis de urea catalizada por enzima.
Ejemplo 2
Se preparó un sensor como en el Ejemplo 1, excepto en que no se añadió capa protectora de poliHEMA como tercer recubrimiento. El sensor mostraba respuesta a urea, pero se perdía continuamente la respuesta a urea debido a la pérdida de la capa de enzima.
Ejemplo 3
Se preparó una solución de enzima por adición de 10 mg de ureasa (lo mismo que antes) a 200 \mul de acrilato de polihidroxibutilo (27% en isopropanol). La solución se aplicó mediante movimiento de rotación sobre la capa de transductor preparada con etil celulosa, naranja de acridina, e hidróxido de tetrabutilamonio (lo mismo que antes). El sensor se curó en condiciones ambiente durante 24 horas y después se ensayó en cuanto a la respuesta de urea. Respondía a concentraciones de 5, 10, 20, 50 y 100 mM, preparadas en tampón Tris 0,05 M, pH 8,0.
Ejemplo 4
Se disolvió poli metacrilato de hidroxietilo (poliHEMA) en metanol para dar una solución al 10%. Se disolvió ureasa en agente tampón, 100 mg en 1 ml de tampón Tris 0,05 M, pH 8,0. Se prepararon tres concentraciones de ureasa en poliHEMA y cada una se aplicó con movimiento de rotación sobre un transductor preparado con etil celulosa, naranja de acridina, e hidróxido de tetrabutilamonio. El sensor se curó en condiciones ambiente durante 24 horas y después se ensayó en cuanto a respuesta a urea, como antes. El sensor mostró respuesta a urea, pero la respuesta era lenta y sujeta a desplazamiento.
Ejemplo 5
Se preparó hidroxipropilcelulosa como solución al 25% en tampón acuoso, pH 8. Se añadieron 10 mg de ureasa de alta actividad (Sigma, U 0251, Actividad: 600.000 - 1.200.000 unidades/g) a 250 \mul de solución de polímero y se aplicó con movimiento de rotación sobre un transductor preparado con etil celulosa, naranja de acridina e hidróxido de tetrabutilamonio. Sobre la capa de enzima de aplicó con movimiento de rotación una capa de cierre de acrilamida al 5% en metanol. El sensor mostró una respuesta reversible a urea 100 mM, y no se ensayó con concentraciones más bajas.
Ejemplo 6
Se copuló covalentemente ureasa con poli alcohol vinílico porel método de Narinesingh y col. (Anal. Chim. Acta 249: 387-393 (1991). Para preparar un sensor, se disolvieron 0,16 g del polímero de la enzima en 1 ml de NaHCO_{3} 0,05 M, pH 8,0 y se aplicó con movimiento de rotación sobre un transductor preparado por etil celulosa, naranja de acridina, e hidróxido de tetrabutilamonio. El sensor mostraba una respuesta a urea 100 mM que era reversible y presentaba una recuperación superior a la de los sensores preparados sin la unión covalente de la enzima.
Ejemplo 7
Se disolvió en metanol (100 ml) un derivado de acrilamida (15 g) sintetizado por Joseph Berger, Ciba-Geigy, Basilea, Suiza (JB 2701155). Se disolvió ureasa en tampón Tris, (100 mg en 1 ml). La solución de enzima se disolvió en la solución de polímero, a diferentes concentraciones. Se prepararon sensores por aplicación con movimiento de rotación de las soluciones de polímero sobre transductores preparados con etil celulosa, naranja de acridina e hidróxido de tetrabutilamonio. La mitad de los sensores se cubrieron también con poliHEMA. Todos los sensores se ensayaron con soluciones de urea de un intervalo de concentraciones de 2-5 mM. Los sensores respondieron a todos los niveles de urea, con y sin recubrimiento de poliHEMA.
Ejemplo 8
Se repitió la misma preparación del Ejemplo 1 con la sustitución de la enzima de actividad normal (Sigma U 4002) por la ureasa de alta actividad (U0251), y esta preparación daba por resultado un sensor con una fuerte respuesta a urea, tanto en el tiempo de respuesta hasta el equilibrio como en la magnitud de la reacción a urea.
Ejemplo comparativo 1
Se repitió la misma preparación del Ejemplo 5 excepto en que no se utilizó capa de cierre. El sensor no daba respuesta a urea.
Ejemplo comparativo 2
Se repitió la misma preparación del Ejemplo 1 con sustitución de poli alcohol vinílico de peso molecular M.W. 11.000. Después de un inicio nítido decrece la señal a la exposición a la muestra, presentando entonces el sensor muy poca respuesta a urea. Esto se confirmó en varias preparaciones. Por reemplazamiento del poli alcohol vinílico de bajo peso molecular (M.W.) por el polímero de M.W. 124.000 se cubrió la respuesta a urea.
Todas las composiciones y métodos aquí descritos y reivindicados se pueden hacer y llevar a cabo sin experimentación indebida a la luz de la presente invención. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modos de realización preferidos, quedará claro para los especialistas en esta área que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método aquí descrito, de acuerdo con la invención reivindicada. Más específicamente quedará claro que ciertos agentes que químicamente relacionados pueden sustituir a los agentes específicos aquí descritos y podría alcanzarse el mismo o similar resultado según la invención definida en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (31)

1. Un material sensor de urea que comprende:
una primera capa formada por un fluoróforo sensible al pH inmovilizado dentro de un primer polímero hidrófobo, donde el fluoróforo que está protonado dentro del primer polímero hidrófobo en ausencia de amoniaco, puede reaccionar cuantitativamente con amoniaco, y tiene una fracción transductora que es neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoniaco, donde la concentración de amoniaco presente está indicada por un cambio en la florescencia directamente resultante de la desprotonación del fluoróforo y donde la primera capa se prepara por combinación del fluoróforo y el primer polímero hidrófobo en presencia de un disolvente orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un segundo polímero, y una tercera capa que comprende un tercer polímero.
2. Un material sensor según la reivindicación 1, donde la primera capa comprende además un compuesto onio.
3. Un material sensor según la reivindicación 2, donde el compuesto onio es un compuesto de amonio cuaternario.
4. Un material sensor según la reivindicación 3, donde el compuesto onio es hidróxido de tetrabutilamonio.
5. Un material sensor según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el fluoróforo es naranja de acridina.
6. Un material sensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el fluoróforo es un tinte de rodamina.
7. Un material sensor según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el primer polímero hidrófobo es etil celulosa.
8. Un material sensor según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el polímero de la segunda capa es poli alcohol vinílico.
9. Un material sensor según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el tercer polímero es poli metacrilato de hidroxietilo.
10. Un procedimiento para preparación de un material sensor de urea, que comprende:
combinar un fluoróforo sensible al pH y un primer polímero hidrófobo para formar una primera mezcla en presencia de un disolvente orgánico, donde el fluoróforo está protonado dentro del primer polímero hidrófobo en ausencia de amoniaco, y tiene una fracción transductora neutra en cuanto carga cuando se desprotona en presencia de amoníaco;
formación de una primera capa de la primera mezcla sobre el substrato;
combinación de ureasa y un segundo polímero para formar una segunda mezcla;
formación de una segunda capa de la segunda mezcla sobre la primera capa; y
formación de una tercera capa de un tercer polímero sobre la segunda capa;
11. Un procedimiento según la reivindicación 10 donde el fluoróforo es naranja de acridina.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10 donde el fluoróforo es un tinte de rodamina.
13. Un procedimiento según la reivindicación 10, 11 ó 12 donde el primer polímero hidrófobo es etil celulosa.
14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 donde el polímero de la segunda capa es poli alcohol vinílico.
15. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 donde el tercer polímero de la tercera capa es poli metacrilato de hidroxietilo.
16. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 donde la substancia es vidrio, plástico o cerámica.
17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 donde la primera mezcla comprende un compuesto onio.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17 donde el compuesto onio es un compuesto amonio cuaternario.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18 donde el compuesto onio es hidróxido de tetrabutilamonio.
20. Un método para determinar la concentración de urea en una solución, por medida de la concentración de amoniaco, que comprende:
medir la fluorescencia del material sensor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
exponer el material sensor a la solución que comprende urea,
medir la fluorescencia del material sensor después de la etapa de exposición,
determinar el cambio de fluorescencia, y
determinar la concentración de la urea en la solución.
21. Un dispositivo de sensor óptico para determinar la concentración de urea en una solución que comprende urea por medición de la concentración de amoniaco, que comprende:
un componente óptico que es transparente a las ondas electromagnéticas incidentes y emisivas,
una primera capa depositada sobre una superficie de los componentes ópticos, comprendiendo la primera capa un fluoróforo sensible al pH inmovilizado en un primer polímero hidrófobo, el cual fluoróforo puede reaccionar cuantitativamente con amoníaco, y forma una fracción transductora que es neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoniaco y donde la primera capa se prepara por combinación del fluoróforo y el primer polímero hidrófobo en presencia de un disolvente orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un segundo polímero, depositado sobre la primera capa; y
una tercera capa que comprende un tercer polímero, depositado sobre la segunda capa, donde el componente óptico está conectado ópticamente a medios para recoger la emisión radiante para medir la fluorescencia indicativa de la concentración de amoníaco.
22. Un dispositivo según la reivindicación 21, donde el fluoróforo es naranja de acridina.
23. Un dispositivo según la reivindicación 21, donde el fluoróforo es un tinte de rodamina.
24. Un dispositivo según las reivindicaciones 21, 22 ó 23, donde el primer polímero hidrófobo es etil celulosa.
25. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, donde el polímero de la segunda capa es poli alcohol vinílico.
26. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, donde el tercer polímero es poli metacrilato de hidroxietilo.
27. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, donde el componente óptico es una fibra óptica.
28. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, donde el componente óptico es una guía de ondas plana.
29. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, donde el componente óptico es un sensor de ondas evanescente.
30. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, que comprende además uno o más sensores capaces de detectar analitos distintos a amoníaco.
31. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, donde la primera capa comprende además un compuesto onio.
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