ES2236917T3 - Sensor polimero fluorescente para la deteccion de urea. - Google Patents
Sensor polimero fluorescente para la deteccion de urea.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un material sensor de urea que comprende una primera capa de un fluoróforo protonado sensible al pH inmovilizado en un polímero hidrofóbico, en el que el fluoróforo puede reaccionar cuantitativamente con el amonio y el elemento que transduce el fluoróforo tiene carga neutra cuando se desprotona; una segunda capa de ureasa y un polímero; y una tercera capa de un polímero. La presente invención también proporciona un procedimiento para detectar urea empleando material sensor de urea y dispositivos sensores ópticos que incluyen al material sensor de urea.
Description
Sensor polimérico fluorescente para la detección
de urea.
La presente invención se refiere a sensores para
detección de urea.
El seguimiento continuo de urea se ha llevado a
cabo por un número de métodos electroquímicos (Goldfinch, M.J.;
Lowe, C.R. Anal. Biochem. 138: 430-436
(1983); Luo, S.; Walt, D.R. Anal. Chem. 61:
1069-1072 (1989)). Los sensores que utilizan estos
métodos son creados por inmovilización de la enzima ureasa sobre la
superficie de un electrodo. La hidrólisis enzimática de urea produce
amoníaco y dióxido de carbono, que están protonados a pH
fisiológico para formar iones amonio y carbonato, lo que aumenta la
conductividad eléctrica del proximal de la solución al
electrodo.
También se puede hacer el seguimiento de la urea
empleando un sensor óptico. La detección de analitos por sensores
ópticos requiere habitualmente el desarrollo de transductores
fluorescentes que son específicos para diferentes analitos. Los
transductores ópticos han sido acoplados también para detección de
urea vía hidrólisis de urea conducida por ureasa, con el
transductor óptico modulado por amonio o amoníaco.
La detección de amonio requiere un ionóforo
específico de amonio copulado con un cromóforo que cambia su
espectro de absorción al protonarse, y una sede aniónica lipófila.
Según esto, los sensores basados en la detección de amonio pueden
ser caros y complejos.
Por ejemplo, Kawabata y col. en Anal. Chim.
Acta 283:689-694 (1993) describen un optrodo de
urea que utiliza una membrana de polímero ópticamente sensible a
iones amonio y una membrana con ureasa inmovilizada. La membrana de
polímero sensible a amonio de Kawabata y col. consiste en una sonda
fluorescente (naranja de hexadecilo-acridina
cargada positivamente) y un ionóforo de amonio, que responde a
iones de amonio que se difunden desde la capa que contiene ureasa
tras la escisión de la urea desde la muestra. El tinte fluorescente
se inmoviliza sobre una membrana de PVC plastificada con una
membrana de poliacrilamida.
La detección de amoníaco requiere un indicador
protonado sensible a pH (INDH') que cambia su espectro de absorción
o fluorescencia en la desprotonación:
INDH^{+} +
NH_{3} \rightarrow IND +
NH_{4}{}^{+}
Al diseñar un sensor basado en la detección de
amoniaco existe la desventaja de la rápida protonación de amoníaco
a pH fisiológico. El pK_{a} de amonio es 9,3 que no es un pH que
apoye una actividad enzimática máxima.
Los polímeros hidrófobos, ópticamente
transparentes y permeables al analito que interesa, se utilizan con
sensores ópticos cuando el analito es un vapor o gas y es capaz de
difundirse en una membrana hidrófoba. Aparece una complicación
cuando se utilizan polímeros hidrófobos con ciertos tintes
fluorescentes. Los sensores para amoniaco requieren un indicador
protonado. Cuando se combinan con una membrana hidrófoba para
detección de amoníaco, los indicadores de pH polianiónicos, que son
la variedad común de indicador protonado y el tipo empleado como
sensor de urea fluorescente descrito en Rhines y Arnold (Anal.
Chim. Acta, 231:231-235 (1990), no producen un
fluoróforo activado y protonado.
Aunque se conocen varios indicadores para urea,
muchos sensores de urea presentan problemas con interferencias de
efectos de pH y CO_{2}, baja sensibilidad, tiempos de respuesta
lentos y reversibilidad. Desde el punto de vista de la manufactura,
sería deseable por tanto el desarrollo de un sensor barato capaz de
detectar urea que tuviera una alta sensibilidad, tiempo rápido de
respuesta, y que fuera reversible. Sería ventajoso también que el
sensor fuese capaz de funcionar en unión de sensores que detectan
otros analitos.
La presente invención proporciona un material
sensor de urea que comprende:
una primera capa, que consiste en un fluoróforo
sensible al pH inmovilizado dentro de un primer polímero hidrófobo,
donde el fluoróforo está protonado dentro del primer polímero
hidrófobo en ausencia de amoníaco, puede reaccionar
cuantitativamente con amoníaco y tiene una fracción transductora
neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de
amoníaco, donde la concentración de amoníaco presente está indicada
por un cambio en la fluorescencia directamente resultante de la
desprotonación del fluoróforo y donde la primera capa se prepara
por combinación del fluoróforo y el primer polímero hidrófobo en
presencia de un disolvente orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un
segundo polímero, y
una tercera capa que comprende un tercer
polímero.
La presente invención proporciona también un
método para determinar la concentración de urea en una solución,
por medición de la concentración de amoniaco que comprende: medir
la fluorescencia de un material sensor de la invención; exponer el
material sensor a una solución que comprende urea; medición de la
fluorescencia del material sensor después de la etapa de
exposición; determinación de la carga de fluorescencia; y
determinación de la concentración de urea en la solución.
La presente invención proporciona también un
procedimiento de preparación de un material sensor de urea que
comprende;
combinación de un fluoróforo sensible al pH y un
primer polímero hidrófobo para formar una primera mezcla, en
presencia de un disolvente orgánico, donde el fluoróforo está
protonado dentro del primer polímero hidrófobo en ausencia de
amoníaco, y tiene una fracción transductora que queda neutra en
cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoníaco;
formación de una primera capa de la primera
muestra sobre un substrato;
combinación de ureasa y un segundo polímero para
formar una segunda mezcla;
formación de una segunda capa de la segunda
mezcla sobre la primera capa; y
formación de una tercera capa de un tercer
polímero sobre la segunda capa.
La presente invención proporciona también un
dispositivo de sensor óptico para determinar la concentración de
urea en una solución que comprende urea por medición de la
concentración de amoníaco, que comprende:
un componente óptico que es transparente para las
ondas electromagnéticas incidente y emisivas,
una primera capa depositada sobre una superficie
de los componentes ópticos, comprendiendo la primera capa un
fluoróforo sensible al pH inmovilizado en un primer polímero
hidrófobo, fluoróforo que puede reaccionar cuantitativamente con
amoníaco, y forma una fracción transductora que queda neutra en
cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoníaco y
donde la primera capa se prepara por combinación del fluoróforo y
el primer polímero hidrófobo en presencia de un disolvente
orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un
segundo polímero, depositada sobre la primera capa, y
una tercera capa que comprende un tercer
polímero, depositada sobre la segunda capa; donde el componente
óptico está conectado ópticamente a medios que recogen la emisión
radiante para medir la fluorescencia indicativa de la concentración
de amoníaco.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar además
ciertos aspectos de la presente invención. La invención se
comprenderá mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en
combinación con la descripción detallada de los modos de realización
específicos aquí presentados.
La figura 1 muestra una configuración de sensor
de urea.
La figura 2 representa la curva de respuestas de
tres sensores de urea en unidades de intensidad de fluorescencia en
función de la concentración (mM) de urea.
La presente invención se refiere a un sensor para
la detección de urea. El sensor de la presente invención comprende
un fluoróforo inmovilizado en un polímero hidrófobo, donde el
fluoróforo puede reaccionar cuantitativamente con amoníaco y la
fracción transductora del fluoróforo queda neutra en cuanto a carga
cuando se desprotona.
La fracción transductora es el anillo o grupo de
anillos en la estructura molecular del fluoróforo sensible al pH,
que produce la fluorescencia cuando se radia con la particular
energía de excitación requerida para la excitación. Este mismo
segmento de la molécula sufre una carga de resonancia debido a la
protonación y desprotonación, y esta carga da lugar a un cambio en
la fluorescencia que permite calibrar la fluorescencia como una
función de la alteración del pH. Un anillo sustituyente que no está
implicado en el cambio de resonancia basado en el pH se puede
cargar negativamente cuando se desprotona: véase, por ejemplo, el
radical de ácido benzoico sobre rodamina.
En la presente invención, la detección de urea en
una solución depende de la presencia de la enzima ureasa, que
cataliza la hidrólisis de urea a NH_{3} y CO_{2}. Los sensores
de la presente invención detectan el amoníaco que se produce. La
detección de amoníaco se basa en cambios en el espectro de
fluorescencia del fluoróforo en la desprotonación, como se muestra
en la siguiente reacción:
INDH^{+} +
NH_{3} \rightarrow IND +
NH_{4}{}^{+}
El material sensor comprende tres capas: una capa
de transductor, una capa de enzima, y una capa protectora. La capa
de transductor está formada por el fluoróforo inmovilizado en un
polímero hidrófobo. La capa de enzima está formada por la enzima
ureasa inmovilizada en un polímero. La tercera es la capa
protectora, que es otro polímero.
Fluoróforos adecuados en los sensores de esta
invención son indicadores del pH fluorescente que quedan neutros en
cuanto a carga cuando se desprotonan, y que existen en el estado
protonado en el microentorno del polímero. Estos fluoróforos
incluyen naranja de acridina:
y tintes de
rodamina:
donde R^{1} y R^{2} son,
independientemente, un alquilo que tiene entre aproximadamente 2 y
20 átomos de carbono y R^{3} es hidrógeno o un alquilo que tiene
entre aproximadamente 2 y 20 átomos de carbono. El naranja de
acridina y los tintes de rodamina son los fluoróforos preferidos.
La modulación de la fluorescencia de acridina se mide por lo
general con una excitación a 489 nm y una emisión a 540 nm, pero se
puede excitar a otras longitudes de onda. Se puede conseguir una
lectura radiométrica por excitación a dos longitudes de onda y
generar una relación de las dos emisiones como una función del
amoníaco. La modulación de fluorescencia de un derivado de
rodamina, donde R^{1} y R^{2} son, ambos C_{18}H_{37}, se
mide por lo general con una excitación a 530 nm y emisión a 590
nm.
Los polímeros hidrófobos útiles en la presente
invención son, preferiblemente, polímeros en los que el fluoróforo
es al menos parcialmente soluble. Estos polímeros incluyen, sin que
quede limitado solo a ellos, poliestireno, poliuretano,
poli(etil celulosa), polidienos tales como
poli(1,3-butadieno), copolímero de
butadieno-acrilonitrilo,
poli(dimetilbutadieno) y poliisopreno, polialquenos tales
como polietileno, copolímero de isobuteno-isopreno,
poli(4-metilpenteno), polipropileno, poli
metacrilato de etilo, politetrafluoroetileno, poli(alcohol
vinílico), poli(cloruro de vinilo), y polioximetileno,
celulosa y derivados de celulosa, tales como hidrato de celulosa,
acetato de celulosa, nitrato de celulosa, etil celulosa, etil
metacrilato de celulosa, polimetacrilatos tales como
poli(metacrilato de metilo) y poli(metacrilato de
etilo) así como polisiloxanos, poliésteres y policarbonatos. Un
polímero preferido es etil celulosa. Estos polímeros hidrófobos se
pueden utilizar tanto en la capa transductora como en la capa
protectora del modo de realización preferido.
El fluoróforo y polímero hidrófobo se combinan
para formar un polímero fluorescente. Las intensidades de señal del
polímero fluorescente son altas ya que el tinte es muy soluble en
el medio orgánico del polímero y no hay apagado de la fluorescencia
(como en la Patente estadounidense número 5.506.148) debido a la
ausencia de cargas negativas sobre la molécula del tinte. En la
exposición a amoniaco, la fluorescencia del polímero fluorescente
decrece, lo cual es consistente con la desprotonación que tiene
lugar en el tinte al formarse el ión amonio en el polímero
fluorescente. Esta respuesta del sensor es reversible cuando la
fuente de amoniaco se retira y el amoniaco del sensor se difunde
hacia fuera de la membrana.
Se puede añadir opcionalmente un compuesto onio
al polímero fluorescente. El compuesto onio ajusta el pH del
microentorno del polímero fluorescente para potenciar la
sensibilidad a amoníaco. Los compuestos onio incluyen compuestos de
amonio, fosfonio y piridinio. Entre los ejemplos de compuestos onio
adecuados se incluyen hidróxido de tetrabutilamonio, cloruro de
tetrabutilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, hidrogeno sulfato
de tetrabutilamonio trifluorometano, acetato de tetrabutilamonio,
bromuro de tetraetilamonio, p-toluensulfonato de
tetraetilamonio, cloruro de feniltrimetilamonio, bromuro de
benciltrimetilamonio, bromuro de
tetra-n-propilamonio,
tetrafluoroborato de benciltrietilamonio, bromuro de
n-dodeciltrimetilamonio, cloruro de
tetrafenilfosfonio, bromuro de n-hexadecilpiridinio,
cloruro de trifenilfosfonio, bromuro de tetrabutilfosfonio e
hidróxido de hexadeciltrimetilamonio. Los compuestos onio
preferidos son compuestos de amonio cuaternario, tal como hidróxido
de tetrabutilamonio.
El material sensor se puede preparar por
disolución del fluoróforo y polímero en un disolvente adecuado, tal
como un alcohol, tolueno, tetrahidrofrano u otro disolvente
orgánico conocido en la técnica para disolver el polímero hidrófobo.
En general, la cantidad de fluoróforo utilizada estará entre
aproximadamente 0,05% y 0,5% de la masa total. El fluoróforo se
distribuye, preferiblemente, de manera uniforme a través del
polímero fluorescente resultante.
Se puede formar entonces una membrana o película
del polímero fluorescente disuelto por cualquier método conocido en
la técnica, tal como recubrimiento por movimiento de rotación o
brocha sobre un substrato no reactivo, tal como vidrio, plástico o
cerámica. Alternativamente, el fluoróforo se puede unir
covalentemente al polímero, como se describe en la Patente
estadounidense número 5.005.572.
La capa de enzima está formada por la enzima
ureasa disuelta en un polímero hidrófilo o hidrófobo, que se
deposita entonces sobre la capa de transductor. La capa de enzima
se puede depositar sobre la capa de transductor de manera similar
al depósito de la capa de transductor sobre el substrato. El
polímero puede estar reticulado y la enzima se puede modificar
químicamente para su unión al polímero. Los polímeros útiles para
la capa de enzima incluyen polialcohol vinílico, poliacrilato de
hidroxibutilo, hidroxi-propilcelulosa, derivados de
acrilamida, y otros polímeros hidrófilos o hidrófobos conocidos por
los especialistas en la técnica.
La capa protectora está formada por un polímero
que es permeable al analito al mismo tiempo que no es rápidamente
soluble en la matriz de la muestra. El polímero se puede disolver
en un disolvente y depositarse entonces sobre la capa de enzima de
una manera similar. Los polímeros adecuados para uso en la capa
protectora son por lo general los polímeros antes descritos,
preferiblemente poli metacrilato de hidroxietilo (poliHEMA). Este
polímero se aplica como recubrimiento protector para evitar la
disolución inmediata de la muestra.
Los polímeros fluorescentes se pueden utilizar
como recubrimientos de transductores para sensores ópticos. Los
sensores ópticos tradicionales para CO_{2}, NH_{3} y otras
especies detectadas por vía de un transductor modulado para el pH
se basan en el modelo de Severinghaus (Severinghaus, J.W.; Bradley,
A.F. J. Appl. Physiol., 13:515 (1958) donde este tiene una
capa de transductor que contiene fluoróforo o cromóforo sensibles a
pH, recubierta con un material de membrana de cubierta, tal como un
polímero basado en siloxano (Munkholm, C., Walt, D. R. Milanovich,
F.P., Talanta, 35: 109-112 (1988). Una
dificultad inherente a los sensores Severighaus es su potencial de
fallos debido a que los poros de la membrana de cubierta gotean.
Los sensores preparados por la presente invención proporcionarán
medidas cuantitativas de niveles de amoniaco a través de la
modulación del microentorno del fluoroforo. Dado que los
microentornos del sensor se dispersan a través del polímero, la
preparación de un sensor tal requiere únicamente de una sola
aplicación del material de membrana, y esta configuración de
membrana única hace irrelevante el problema de la pérdida por los
poros. Los sensores no responden a los cambios en pH global, lo que
indica que los microdominios del transductor están secuestrados por
la muestra. Este sensor se puede utilizar en un sistema que mide la
fluorescencia de superficie reflejada así como en un sistema de
medida de una señal de onda evanescente.
Una ventaja de los sensores ópticos es su
capacidad para resolver información de diferentes analitos a través
de sus bandas de ondas discretas. De esta forma se pueden acoplar
juntos un sensor de amoníaco con un sensor para un analito
diferente en la misma membrana, pero recogiendo la información de
lectura a longitudes de onda separadas. Los microdominios del
sensor estarán poblados por múltiples transductores, pero la
química y el procesado de las señales se llevaría a cabo como si
los sensores estuvieran en capas separadas. En este sensor de
analito múltiple, el transductor para el analito
no-amoniaco puede ser un tinte polianiónico, tal
como los descritos en la Patente estadounidense número
5.506.148.
El material sensor se puede utilizar como un
recubrimiento sobre cualquier superficie y utilizarse para medir
urea en cualquier solución, tal como en la sangre, saliva u orina.
Podría tomar parte en los productos y sistemas utilizados en la
medición de analitos críticos de la sangre, en aplicaciones
utilizadas para seguimiento de la diálisis, y en todos los casos
clínicos de seguimiento de urea en tratamientos. Es concebible que
este material sensor se pueda emplear en proyectos de investigación
académica, ya que podrá ser adaptado a una diversidad de sistemas
de medida, tales como fibras ópticas.
Utilizando los métodos de esta invención se puede
preparar películas de sensor extremadamente delgadas, de
aproximadamente 0,5 a 5 \mum de grueso, que tienen un nivel de
fluorescencia detectable. Estas finas películas pueden proporcionar
un tiempo de respuesta inusualmente rápido y resultan ideales para
recubrir los sensores planos utilizados en métodos de detección de
ondas evanescentes donde se desea un recubrimiento fluorescente que
esté dentro de las mismas dimensiones que la onda de propagación.
Los sensores preparados con este método no se verán afectados por
las pérdidas de los poros ya que el material sensor es continuo en
el recubrimiento. Estas películas pueden tener además una vida en
depósito más larga debido a la ausencia de una capa acuosa, que
sería susceptible de deshidratación.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar los modos de realización preferidos de la invención. Un
especialista se dará cuenta que las técnicas descritas en los
ejemplos que se dan a continuación representan técnicas
descubiertas por el autor de la invención para un buen
funcionamiento de la práctica de la invención, y así se puede
considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.
Se añadió tinte naranja de acridina a una
solución al 10% de etil celulosa para que fuera 5 x 10^{-4} M. Se
añadió hidróxido de tetrabutilamonio para dar una solución final
0,0045 M. La solución se sometió a ultrasonidos hasta que la mezcla
era completa. Se recubrió entonces con movimiento de rotación sobre
un substrato de vidrio y se curó en condiciones ambiente durante 24
horas. Se preparó una solución al 5% de poli alcohol vinílico en
agua desionizada utilizando poli alcohol vinílico de peso molecular
M.W. 124.000 - 186.000. El recubrimiento de enzima se preparó por
adición de 90 mg de ureasa (Signa U 4002, Actividad: 50.000 -
100.000 unidades/gramo) a 1,5 ml de polialcohol vinílico, y se
aplicó entonces a una capa de etil celulosa con movimiento de
rotación. Se aplicó un tercer recubrimiento de poliHEMA (10% en
metanol) a la capa de enzima por recubrimiento de rotación. Se curó
el sensor en condiciones ambiente durante 24 horas. Se ensayó
entonces con un fluorímetro comercial, equipado con montaje para el
sensor, empleando solución recién preparada de urea en tampón
fosfato (0,05 M, pH 7,8). La Figura 1 muestra la configuración del
sensor. La Figura 2 muestra la curva de respuestas de tres sensores
de urea en unidades de intensidad de fluorescencia en función de la
concentración de urea (mM). La señal decrece a medida que aumenta
la concentración de urea, lo que está de acuerdo con la
desprotonación del fluoróforo, naranja de acridina, por la
producción de amoníaco por hidrólisis de urea catalizada por
enzima.
Se preparó un sensor como en el Ejemplo 1,
excepto en que no se añadió capa protectora de poliHEMA como tercer
recubrimiento. El sensor mostraba respuesta a urea, pero se perdía
continuamente la respuesta a urea debido a la pérdida de la capa de
enzima.
Se preparó una solución de enzima por adición de
10 mg de ureasa (lo mismo que antes) a 200 \mul de acrilato de
polihidroxibutilo (27% en isopropanol). La solución se aplicó
mediante movimiento de rotación sobre la capa de transductor
preparada con etil celulosa, naranja de acridina, e hidróxido de
tetrabutilamonio (lo mismo que antes). El sensor se curó en
condiciones ambiente durante 24 horas y después se ensayó en cuanto
a la respuesta de urea. Respondía a concentraciones de 5, 10, 20,
50 y 100 mM, preparadas en tampón Tris 0,05 M, pH 8,0.
Se disolvió poli metacrilato de hidroxietilo
(poliHEMA) en metanol para dar una solución al 10%. Se disolvió
ureasa en agente tampón, 100 mg en 1 ml de tampón Tris 0,05 M, pH
8,0. Se prepararon tres concentraciones de ureasa en poliHEMA y
cada una se aplicó con movimiento de rotación sobre un transductor
preparado con etil celulosa, naranja de acridina, e hidróxido de
tetrabutilamonio. El sensor se curó en condiciones ambiente durante
24 horas y después se ensayó en cuanto a respuesta a urea, como
antes. El sensor mostró respuesta a urea, pero la respuesta era
lenta y sujeta a desplazamiento.
Se preparó hidroxipropilcelulosa como solución al
25% en tampón acuoso, pH 8. Se añadieron 10 mg de ureasa de alta
actividad (Sigma, U 0251, Actividad: 600.000 - 1.200.000
unidades/g) a 250 \mul de solución de polímero y se aplicó con
movimiento de rotación sobre un transductor preparado con etil
celulosa, naranja de acridina e hidróxido de tetrabutilamonio.
Sobre la capa de enzima de aplicó con movimiento de rotación una
capa de cierre de acrilamida al 5% en metanol. El sensor mostró una
respuesta reversible a urea 100 mM, y no se ensayó con
concentraciones más bajas.
Se copuló covalentemente ureasa con poli alcohol
vinílico porel método de Narinesingh y col. (Anal. Chim.
Acta 249: 387-393 (1991). Para preparar un
sensor, se disolvieron 0,16 g del polímero de la enzima en 1 ml de
NaHCO_{3} 0,05 M, pH 8,0 y se aplicó con movimiento de rotación
sobre un transductor preparado por etil celulosa, naranja de
acridina, e hidróxido de tetrabutilamonio. El sensor mostraba una
respuesta a urea 100 mM que era reversible y presentaba una
recuperación superior a la de los sensores preparados sin la unión
covalente de la enzima.
Se disolvió en metanol (100 ml) un derivado de
acrilamida (15 g) sintetizado por Joseph Berger,
Ciba-Geigy, Basilea, Suiza (JB 2701155). Se disolvió
ureasa en tampón Tris, (100 mg en 1 ml). La solución de enzima se
disolvió en la solución de polímero, a diferentes concentraciones.
Se prepararon sensores por aplicación con movimiento de rotación de
las soluciones de polímero sobre transductores preparados con etil
celulosa, naranja de acridina e hidróxido de tetrabutilamonio. La
mitad de los sensores se cubrieron también con poliHEMA. Todos los
sensores se ensayaron con soluciones de urea de un intervalo de
concentraciones de 2-5 mM. Los sensores respondieron
a todos los niveles de urea, con y sin recubrimiento de
poliHEMA.
Se repitió la misma preparación del Ejemplo 1 con
la sustitución de la enzima de actividad normal (Sigma U 4002) por
la ureasa de alta actividad (U0251), y esta preparación daba por
resultado un sensor con una fuerte respuesta a urea, tanto en el
tiempo de respuesta hasta el equilibrio como en la magnitud de la
reacción a urea.
Ejemplo comparativo
1
Se repitió la misma preparación del Ejemplo 5
excepto en que no se utilizó capa de cierre. El sensor no daba
respuesta a urea.
Ejemplo comparativo
2
Se repitió la misma preparación del Ejemplo 1 con
sustitución de poli alcohol vinílico de peso molecular M.W. 11.000.
Después de un inicio nítido decrece la señal a la exposición a la
muestra, presentando entonces el sensor muy poca respuesta a urea.
Esto se confirmó en varias preparaciones. Por reemplazamiento del
poli alcohol vinílico de bajo peso molecular (M.W.) por el polímero
de M.W. 124.000 se cubrió la respuesta a urea.
Todas las composiciones y métodos aquí descritos
y reivindicados se pueden hacer y llevar a cabo sin experimentación
indebida a la luz de la presente invención. Aunque las
composiciones y métodos de esta invención se han descrito en
términos de modos de realización preferidos, quedará claro para los
especialistas en esta área que se pueden aplicar variaciones a las
composiciones y métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas
del método aquí descrito, de acuerdo con la invención reivindicada.
Más específicamente quedará claro que ciertos agentes que
químicamente relacionados pueden sustituir a los agentes específicos
aquí descritos y podría alcanzarse el mismo o similar resultado
según la invención definida en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (31)
1. Un material sensor de urea que comprende:
una primera capa formada por un fluoróforo
sensible al pH inmovilizado dentro de un primer polímero hidrófobo,
donde el fluoróforo que está protonado dentro del primer polímero
hidrófobo en ausencia de amoniaco, puede reaccionar
cuantitativamente con amoniaco, y tiene una fracción transductora
que es neutra en cuanto a carga cuando se desprotona en presencia
de amoniaco, donde la concentración de amoniaco presente está
indicada por un cambio en la florescencia directamente resultante
de la desprotonación del fluoróforo y donde la primera capa se
prepara por combinación del fluoróforo y el primer polímero
hidrófobo en presencia de un disolvente orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un
segundo polímero, y una tercera capa que comprende un tercer
polímero.
2. Un material sensor según la reivindicación 1,
donde la primera capa comprende además un compuesto onio.
3. Un material sensor según la reivindicación 2,
donde el compuesto onio es un compuesto de amonio cuaternario.
4. Un material sensor según la reivindicación 3,
donde el compuesto onio es hidróxido de tetrabutilamonio.
5. Un material sensor según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el fluoróforo es naranja de
acridina.
6. Un material sensor según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde el fluoróforo es un tinte de
rodamina.
7. Un material sensor según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el primer polímero hidrófobo es
etil celulosa.
8. Un material sensor según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el polímero de la segunda capa
es poli alcohol vinílico.
9. Un material sensor según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el tercer polímero es poli
metacrilato de hidroxietilo.
10. Un procedimiento para preparación de un
material sensor de urea, que comprende:
combinar un fluoróforo sensible al pH y un primer
polímero hidrófobo para formar una primera mezcla en presencia de
un disolvente orgánico, donde el fluoróforo está protonado dentro
del primer polímero hidrófobo en ausencia de amoniaco, y tiene una
fracción transductora neutra en cuanto carga cuando se desprotona en
presencia de amoníaco;
- formación de una primera capa de la primera mezcla sobre el substrato;
- combinación de ureasa y un segundo polímero para formar una segunda mezcla;
- formación de una segunda capa de la segunda mezcla sobre la primera capa; y
- formación de una tercera capa de un tercer polímero sobre la segunda capa;
11. Un procedimiento según la reivindicación 10
donde el fluoróforo es naranja de acridina.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10
donde el fluoróforo es un tinte de rodamina.
13. Un procedimiento según la reivindicación 10,
11 ó 12 donde el primer polímero hidrófobo es etil celulosa.
14. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 donde el polímero de la segunda capa es
poli alcohol vinílico.
15. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14 donde el tercer polímero de la tercera
capa es poli metacrilato de hidroxietilo.
16. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15 donde la substancia es vidrio, plástico o
cerámica.
17. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 16 donde la primera mezcla comprende un
compuesto onio.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17
donde el compuesto onio es un compuesto amonio cuaternario.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18
donde el compuesto onio es hidróxido de tetrabutilamonio.
20. Un método para determinar la concentración de
urea en una solución, por medida de la concentración de amoniaco,
que comprende:
medir la fluorescencia del material sensor de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
exponer el material sensor a la solución que
comprende urea,
medir la fluorescencia del material sensor
después de la etapa de exposición,
determinar el cambio de fluorescencia, y
determinar la concentración de la urea en la
solución.
21. Un dispositivo de sensor óptico para
determinar la concentración de urea en una solución que comprende
urea por medición de la concentración de amoniaco, que
comprende:
un componente óptico que es transparente a las
ondas electromagnéticas incidentes y emisivas,
una primera capa depositada sobre una superficie
de los componentes ópticos, comprendiendo la primera capa un
fluoróforo sensible al pH inmovilizado en un primer polímero
hidrófobo, el cual fluoróforo puede reaccionar cuantitativamente
con amoníaco, y forma una fracción transductora que es neutra en
cuanto a carga cuando se desprotona en presencia de amoniaco y
donde la primera capa se prepara por combinación del fluoróforo y
el primer polímero hidrófobo en presencia de un disolvente
orgánico;
una segunda capa que comprende ureasa y un
segundo polímero, depositado sobre la primera capa; y
una tercera capa que comprende un tercer
polímero, depositado sobre la segunda capa, donde el componente
óptico está conectado ópticamente a medios para recoger la emisión
radiante para medir la fluorescencia indicativa de la concentración
de amoníaco.
22. Un dispositivo según la reivindicación 21,
donde el fluoróforo es naranja de acridina.
23. Un dispositivo según la reivindicación 21,
donde el fluoróforo es un tinte de rodamina.
24. Un dispositivo según las reivindicaciones 21,
22 ó 23, donde el primer polímero hidrófobo es etil celulosa.
25. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, donde el polímero de la segunda capa es
poli alcohol vinílico.
26. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, donde el tercer polímero es poli
metacrilato de hidroxietilo.
27. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, donde el componente óptico es una fibra
óptica.
28. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, donde el componente óptico es una guía de
ondas plana.
29. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, donde el componente óptico es un sensor
de ondas evanescente.
30. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 29, que comprende además uno o más sensores
capaces de detectar analitos distintos a amoníaco.
31. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 30, donde la primera capa comprende además un
compuesto onio.
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---|---|---|---|---|
US6254830B1 (en) * | 1999-11-05 | 2001-07-03 | The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations | Magnetic focusing immunosensor for the detection of pathogens |
US6291200B1 (en) | 1999-11-17 | 2001-09-18 | Agentase, Llc | Enzyme-containing polymeric sensors |
US6750033B2 (en) | 2001-05-07 | 2004-06-15 | Agentase, Llc | Positive response biosensors and other sensors |
DE10143517A1 (de) * | 2001-09-05 | 2003-03-27 | Hte Ag The High Throughput Exp | Verfahren und Vorrichtung zur Analyse eines fluiden Mediums |
EP1809733B1 (en) | 2004-10-06 | 2015-01-07 | Agentase, LLC | Enzyme-based device for environmental monitoring |
US7422892B2 (en) | 2004-10-06 | 2008-09-09 | Agentase, Llc | Enzyme-based device for environmental monitoring |
US20060134716A1 (en) * | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Pelagia-Irene Gouma | Electrospun enzyme-nanocomposite biosensing material |
US8617366B2 (en) * | 2005-12-12 | 2013-12-31 | Nova Biomedical Corporation | Disposable urea sensor and system for determining creatinine and urea nitrogen-to-creatinine ratio in a single device |
US8409864B2 (en) * | 2006-01-06 | 2013-04-02 | Renal Solutions, Inc. | Ammonia sensor and system for use |
US7449579B1 (en) | 2006-05-02 | 2008-11-11 | Sandia Corporation | Detection of electrophilic and nucleophilic chemical agents |
US8240636B2 (en) | 2009-01-12 | 2012-08-14 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Valve system |
US8105487B2 (en) | 2007-09-25 | 2012-01-31 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Manifolds for use in conducting dialysis |
US8040493B2 (en) | 2007-10-11 | 2011-10-18 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Thermal flow meter |
US9358331B2 (en) | 2007-09-13 | 2016-06-07 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Portable dialysis machine with improved reservoir heating system |
US8597505B2 (en) | 2007-09-13 | 2013-12-03 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Portable dialysis machine |
US8535522B2 (en) | 2009-02-12 | 2013-09-17 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | System and method for detection of disconnection in an extracorporeal blood circuit |
US9308307B2 (en) | 2007-09-13 | 2016-04-12 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Manifold diaphragms |
CA3057806C (en) | 2007-11-29 | 2021-11-23 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | System and method for conducting hemodialysis and hemofiltration |
US20100084558A1 (en) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Wang Su-Chee S | Systems and methods for determining a concentration of urea in an aqueous solution |
CN102307650B (zh) | 2008-10-07 | 2015-09-16 | 弗雷塞尼斯医疗保健控股公司 | 用于透析系统的充灌系统和方法 |
EA201690595A1 (ru) | 2008-10-30 | 2016-11-30 | Фрезениус Медикал Кеа Холдингс, Инк. | Модульная система диализа (варианты) |
WO2010114932A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | Xcorporeal, Inc. | Modular reservoir assembly for a hemodialysis and hemofiltration system |
GB0915775D0 (en) | 2009-09-09 | 2009-10-07 | Univ Gent | Implantable sensor |
US10105081B2 (en) | 2009-09-09 | 2018-10-23 | Indigo Diabetes Nv | Implantable sensor |
DE102012021933B4 (de) * | 2012-11-09 | 2015-12-31 | Airbus Defence and Space GmbH | Optischer pH-Wert-Sensor |
US9201036B2 (en) | 2012-12-21 | 2015-12-01 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Method and system of monitoring electrolyte levels and composition using capacitance or induction |
US9157786B2 (en) | 2012-12-24 | 2015-10-13 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Load suspension and weighing system for a dialysis machine reservoir |
US9354640B2 (en) | 2013-11-11 | 2016-05-31 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Smart actuator for valve |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1054034A (en) * | 1975-06-20 | 1979-05-08 | Barbara J. Bruschi | Multilayer analytical element |
DE2821469A1 (de) * | 1978-05-17 | 1979-11-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostisches mittel zur bestimmung von harnstoff |
JPS5877661A (ja) * | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Fuji Photo Film Co Ltd | アンモニアまたはアンモニア生成基質分析用一体型多層分析材料および検出法 |
US5198335A (en) * | 1985-06-04 | 1993-03-30 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Integral multilayer analytical element for analysis of ammonia-forming substrate |
JPH0664056B2 (ja) * | 1987-04-16 | 1994-08-22 | 富士写真フイルム株式会社 | アンモニア生成物質定量用一体型多層分析要素 |
US5005572A (en) * | 1988-02-26 | 1991-04-09 | Brigham & Women's Hospital | CO2 indicator and the use thereof to evaluate placement of tracheal tubes |
US5372784A (en) * | 1988-08-31 | 1994-12-13 | Baxter Diagnostics Inc. | Measurement of bacterial CO2 production in an isolated fluorophore by monitoring an absorbance regulated change of fluorescence |
US5173434A (en) * | 1990-11-05 | 1992-12-22 | Baxter Diagnostics Inc. | Measurement of color reactions by monitoring a change of fluorescence |
JP2552199B2 (ja) * | 1990-10-19 | 1996-11-06 | 富士写真フイルム株式会社 | アンモニア又はアンモニア生成物質定量用一体型多層分析要素 |
US5176980A (en) * | 1991-08-08 | 1993-01-05 | Eastman Kodak Company | Electrographic liquid developer and method of making same |
AT399229B (de) * | 1992-04-23 | 1995-04-25 | Avl Verbrennungskraft Messtech | Sensoranordnung zur direkten oder indirekten optischen bestimmung physikalischer oder chemischer parameter |
US5387525A (en) * | 1993-09-03 | 1995-02-07 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for activation of polyanionic fluorescent dyes in low dielectric media with quaternary onium compounds |
JP3406089B2 (ja) * | 1994-10-19 | 2003-05-12 | 富士写真フイルム株式会社 | 両性電解質を含む乾式分析素子 |
US5577137A (en) * | 1995-02-22 | 1996-11-19 | American Research Corporation Of Virginia | Optical chemical sensor and method using same employing a multiplicity of fluorophores contained in the free volume of a polymeric optical waveguide or in pores of a ceramic waveguide |
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