ES2235640A1 - Medio de cultivo de celulas progenitoras humanas y uso para la proliferacion de dichas celulas para su posterior transplante autologo. - Google Patents
Medio de cultivo de celulas progenitoras humanas y uso para la proliferacion de dichas celulas para su posterior transplante autologo.Info
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Abstract
Medio de cultivo de células progenitoras humanas y uso para la proliferación de dichas células para su posterior transplante autólogo. La presente invención trata de un medio de cultivo de células progenitoras humanas y el uso para la proliferación de dichas células para su posterior transplante autólogo.
Description
Medio de cultivo de células progenitoras humanas
y uso para la proliferación de dichas células para su posterior
transplante autólogo.
La invención se refiere al ámbito de la
biomedicina regenerativa, más específicamente a un medio de cultivo
de células progenitoras que evita los problemas asociados a la
utilización de sueros heterólogos y componentes de origen animal no
humano en el cultivo de células para el autotransplante.
Las células germinales son en la actualidad
objeto de mucha atención en el ámbito de la medicina regenerativa
debido a su utilidad para la regeneración de tejidos dañados por
causas externas o deficiencias genéticas.
En estudios recientes se ha mostrado la utilidad
del transplante de células progenitoras autólogas para mejorar la
función del miocardio dañado por isquemia (Regenerating functional
myocardium: improved performance after skeletal myoblast
transplantation. Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, Jones TR,
Reedy MC, Hutcheson KA, Glower DD, Kraus WE. Nat Med. 1998 8:
929-33.) (Cellular cardiomyoplasty: myocardial
regeneration with satellite cell implantation. Chiu RC, Zibaitis A,
Kao RL. Ann Thorac Surg. 1995 60: 12-8.) Más
específicamente, se han realizado ya ensayos clínicos de fase 1
utilizando células progenitoras de músculo esquelético autólogo en
los que se muestra la utilidad de dichas células para mejorar la
función del miocardio infartado (Autologous skeletal myoblast
transplantation for severe postinfarction left ventricular
dysfunction. Menasche P, Hagege AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel
E, Pouzet B, Bel A, Sarateanu S, Scorsin M, Schwartz K, Bruneval P,
Benbunan M, Marolleau JP, Duboc D. J Am Coll Cardiol. 2003 41:
1078-83).
La estrategia utilizada está basada en la
utilización de células germinales de origen autólogo, lo que evita
los problemas relacionados con los aspectos éticos derivados de la
utilización de células embrionarias, el rechazo, por parte del
sistema inmune del huésped de las células heterólogas injertadas y
la posible introducción de patógenos externos, tales como virus,
priones etc.
El injerto de células progenitoras para regenerar
la pérdida de función de un tejido, como es el caso del miocardio
infartado, requiere el aporte de un número elevado de células, por
ejemplo entre 100 y 300 millones de células. Es muy difícil obtener
dicho número de células directamente de los tejidos del paciente,
por lo cual es necesario disponer de procedimientos adecuados para
extraer y purificar las células germinales a partir de pequeñas
cantidades de tejido autólogo y a continuación cultivar dichas
células germinales hasta obtener el número adecuado para el
transplante.
Existen en la actualidad múltiples procedimientos
para la extracción y cultivo de células precursoras de músculo
esquelético (US 5.324.656 Media for normal human muscle satellite
cells), (US 5.833.978 Method of in vitro preconditioning
healthy donor's myoblasts before transplantation thereof in
compatible patients suffering of recessive myopathies like muscular
dystrophy, for improving transplantation success) (WO 03/012076
Culture médium to improve the purity of myoblast cultures and
method using same). Los medios de cultivo están compuestos de un
medio basal definido y un componente indefinido consistente en
suero bovino fetal y en algunos casos un suplemento consistente en
factores de crecimiento.
La utilización de sueros heterólogos y en
particular no humanos, puede tener importantes consecuencias
negativas debidas al rechazo inmunológico y a la introducción de
patógenos resultante de la imposibilidad de eliminar con absoluta
certeza la presencia de virus y priones. Es decir, para el
transplante de células progenitoras con fines regenerativos es
necesario:
- a)
- disponer de un número de células eficaz para el transplante,
- b)
- evitar el rechazo por parte del sistema inmune del huésped de los componentes transplantados, y
- c)
- evitar la introducción de agentes patógenos exógenos al huésped.
En el caso particular de la regeneración del
miocardio infartado, se ha logrado una mejora parcial de la función
cardíaca mediante la implantación en el perímetro de la zona del
miocardio infartado de células progenitoras de músculo esquelético
autólogo (Autologous skeletal myoblast transplantation for severe
postinfarction left ventricular dysfunction. Menasche P, Hagege AA,
Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, Bel A, Sarateanu S,
Scorsin M, Schwartz K, Bruneval P, Benbunan M, Marolleau JP, Duboc
D. J Am Coll Cardiol. 2003 41: 1078-83).
A partir de una porción de músculo esquelético
del paciente se separan y purifican las células progenitoras que a
continuación se cultivan para alcanzar el número de células
efectivo para el transplante. Las células progenitoras cultivadas
se implantan en el miocardio del paciente, por ejemplo, utilizando
una aguja hipodérmica o un catéter.
Aunque la utilización de células progenitoras
autólogas permite generar un número suficiente de células eficaz
para el transplante evitando a la vez los problemas de rechazo
inmunológico e infecciones por patógenos derivados del donante, la
utilización de medios de cultivo que incluyen componentes de origen
animal sigue siendo un problema que preocupa debido a la posibilidad
de introducción de patógenos de origen animal presentes en el
suero. Debido a la potencial existencia de patógenos todavía
desconocidos en los materiales de origen biológico, la exclusión de
tales agentes solo se puede garantizar utilizando materiales
sintéticos o recombinantes y excluyendo todo material de origen
animal. Incluso materiales tales como la albúmina de suero bovino,
garantizada por no contener patógenos específicos, podría ser un
vehículo para la introducción de patógenos cuya presencia habría
sido imposible de detectar por no ser todavía conocidos.
Por consiguiente, un medio para el cultivo de
células destinadas a la regeneración de tejidos debe, además de
proporcionar los nutrientes y factores de crecimiento adecuados,
estar exento de materiales de origen animal. Una estrategia para
alcanzar tal objetivo consiste en utilizar exclusivamente
materiales sintéticos y materiales autólogos, derivados del propio
huésped.
La presente invención se refiere a un medio de
cultivo de células progenitoras humanas y al uso para la
proliferación de dichas células para su posterior transplante
autólogo. Dicho medio de cultivo consiste en un medio definido
suplementado con factores de crecimiento, más un componente
indefinido consistente en suero del propio paciente, que permite un
crecimiento rápido de dichas células, frecuentemente superior al
obtenido utilizando procedimientos basados en el uso de suero
bovino fetal. Con este medio de cultivo se eliminan posibles
fuentes de patógenos externos derivados de la utilización en el
medio de cultivo de componentes de origen animal que suplementan
los medios de cultivo sintéticos y los problemas de rechazo
inmunológico.
La presente invención también se refiere al uso
de dicho medio de cultivo capaz de promover la proliferación de
células progenitoras de músculo esquelético para su posterior
transplante autólogo en pacientes humanos y en particular para
implante en pacientes afectos de patología cardiovascular.
La presente invención se enfrenta con el problema
de proporcionar nuevos medios de cultivo capaces de promover la
proliferación de células progenitoras para su posterior transplante
autólogo en pacientes humanos.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que un medio para el cultivo de células
progenitoras de músculo esquelético consistente en un medio
definido suplementado con factores de crecimiento, más un
componente indefinido consistente en suero del propio paciente,
permite un crecimiento rápido de dichas células, no inferior y
frecuentemente superior al obtenido utilizando los procedimientos
anteriores basados en el uso de suero bovino fetal.
Así, un objeto de la presente invención es un
medio de cultivo completo semidefinido adecuado para el crecimiento
de células progenitoras de músculo esquelético humanas, en adelante
medio de cultivo de la presente invención, para su posterior
transplante a seres humanos, preferentemente para el transplante
autólogo, constituido por:
- a)
- suero autólogo del propio paciente receptor del injerto entre el 1 y el 20% (v/v);
- b)
- un suplemento consistente entre 1 y 20 ng/ml de Epidermal Growth Factor (EGF), 1 y 20 ng/ml de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), entre 0,05 y 2 \mug/ml dexametasona, y entre 1 y 20 \mug/ml insulina; y
- c)
- un medio de cultivo definido para células animales entre 80 y 99%.
Los márgenes aquí descritos son biológicamente
razonables. Hay referencias, para los casos en que se utilizaron
estos factores de crecimiento individualmente, estos oscilan
alrededor de 10 ng/ml, por ejemplo bFGF se utiliza entre 3 y 10
ng/ml (US 5.324 656), EGF 10 ng/ml y Dexamentasona a 3 \mug/ml
(Autologous skeletal myoblast transplanted to isquemia damaged
myocardium in humans Francis D. Pagani et al. J. American
College of Cardiology, 2003, 41:879-888).
Tal como se refiere en la presente patente el
término "medio de cultivo definido" se refiere a un medio
artificial que aporta los mínimos requerimientos de aminoácidos
esenciales, minerales, vitaminas, hormonas, etc, y que pertenece, a
título ilustrativo y sin limitar el alcance de la presente
invención, al siguiente grupo: Ham's F12, MCDB 120, MCDB 131.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye un medio de cultivo de la presente invención constituido
por:
- a)
- suero autólogo del paciente receptor del injerto al 10%,
- b)
- un suplemento consistente en 10 ng/ml de EGF recombinante, 10 ng/ml de bFGF recombinante, 0.4 \mug/ml de dexametasona y 10 \mug/ml de insulina recombinante, y
- c)
- un medio de cultivo definido Ham's F12 al 90%.
Con el medio de cultivo de la presente invención
se eliminan posibles fuentes de patógenos externos derivados de la
utilización en el medio de cultivo de componentes de origen animal
que suplementan los medios de cultivo sintéticos y los problemas de
rechazo inmunológico. Además, el crecimiento de las células
progenitoras de músculo esquelético autólogo es comparable o
superior al crecimiento de dichas células en los medios sintéticos
suplementados con suero bovino fetal.
Un objeto adicional de la presente invención lo
constituye el uso de un medio de cultivo definido para células
animales al que se le ha añadido un suplemento de factores de
crecimiento, para producir un medio de cultivo capaz de promover la
proliferación de células progenitoras de músculo esquelético para
su posterior transplante autólogo en pacientes humanos.
Finalmente, otro objeto de la invención lo
constituye el uso del medio de la presente invención para la
proliferación de células progenitoras de músculo esquelético para
su posterior implante en pacientes afectos de patología
cardiovascular.
Figura 1.- La figura muestra una gráfica de Side
scatter contra Fluorescencia de un cultivo de mioblastos humanos
teñido con una IgG control isotópico, panel izquierdo o con un
anticuerpo IgG antidesmina, panel derecho. Aproximadamente el 52%
de la población celular muestra reactividad con el anticuerpo
antidesmina.
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la
invención y no debe ser considerado en sentido limitativo del
alcance de la misma.
El siguiente procedimiento se realizó en una
cámara de cultivo de flujo laminar vertical, en una sala para
cultivos celulares.
A partir de una muestra de músculo esquelético
del paciente se obtuvo material biológico para los siguientes
experimentos. Se obtuvieron muestras de aproximadamente 5 g de un
músculo esquelético adecuado, en condiciones de esterilidad, a
partir de donantes anestesiados y a través de una incisión de
aproximadamente 5 cm. Las muestras se depositaron en un tubo de
plástico estéril, convenientemente identificado, conteniendo medio
de cultivo celular Ham's F12 y penicilina/estreptomicina a una
concentración de 100 unidades/ml y 100 \mug/ml, respectivamente.
El traslado de la muestra a la sala de cultivo se realizó
empleando un tiempo máximo de una hora.
Posteriormente, se lavó dicha muestra tres veces
con 20 ml de medio de cultivo Ham's F12 conteniendo
penicilina/estreptomicina a una concentración de 100 unidades/ml y
100 \mug/ml, respectivamente y se disgregó finamente utilizando
pinzas y bisturí quirúrgico estériles. El material disgregado se
suspendió en 5 ml de medio de cultivo Ham's F12 sin suero
conteniendo 2 mg/mi de colagenasa (Sigma C-2674)
previamente esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,2
\mum (Millipore) y se incubó durante 1 hora a 37°C con
agitación. A continuación se realizó un segundo tratamiento
añadiendo tripsina recombinante (rProtease, Invitrogen) a 37°C con
agitación durante 20 minutos. Una vez transcurrida la incubación se
centrifugó a 2000 x g durante 30 minutos a 4°C, se descartó el
sobrenadante y se suspendieron las células en 3 ml de suero del
paciente para detener la acción de las proteasas. Se diluyó la
suspensión añadiendo 7 ml de medio de cultivo Ham's F12 y se filtró
a través de un filtro con un tamaño de poro de 100 \mum
(Millipore), para eliminar los detritus y restos del tratamiento
con proteasas. La fracción filtrada se depositó en un frasco de
cultivo de 75 cm^{2} y se cultivó en medio Ham's
F-12, suplementado con suero bovino fetal al 20% y
5 ng/ml de bFG F recombinante, en un incubador a 37°C, 5%
CO_{2}.
Los cultivos de células progenitoras se
mantuvieron en Ham's F12 hasta alcanzar el 70% de confluencia. Al
alcanzar este punto los cultivos se tripsinizaron y se expandieron
trasladándolos a un frasco de cultivo de 175 cm^{2} en el que se
mantuvieron en las mismas condiciones, hasta alcanzar de nuevo el
70% de confluencia y así sucesivamente hasta alcanzar el número de
células deseado.
El número total de células y el porcentaje de
células progenitoras de músculo esquelético así obtenidas se
valoraron mediante citometría de flujo de los cultivos. Para ello,
se descartó el medio de cultivo de las células progenitoras,
generadas tal como se describió previamente, y se incubaron las
células adheridas al plástico del frasco con 3 ml de tripsina
recombinante durante 5 minutos a temperatura ambiente. La acción de
las proteasas se detuvo añadiendo un volumen igual de medio de
cultivo. Se contaron las células utilizando un hemocitómetro y la
suspensión de células se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos a
temperatura ambiente. A continuación se resuspendió el precipitado
de células a una concentración de 10^{6} células/ml en Ham's
F12, se transfirió 1 ml de la suspensión a un tubo cónico de 1,5 ml
(Eppendorf) y se centrifugó en una microcentrífuga a 10.000 rpm
durante 0,5 minutos a temperatura ambiente. El precipitado de
células se suspendió en 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,1% azida sódica
(PBA) y se repitió la centrifugación en las mismas condiciones. El
precipitado de células se suspendió en 100 \mul de 70% etanol:agua
durante 30 minutos a 4ºC con agitación ocasional. A continuación se
centrifugaron las células en una microcentrífuga como en el caso
anterior, se descartó el sobrenadante y se lavaron las células 2
veces con 1 ml de PBA. El precipitado de células se resuspendió en
100 \mul de PBA conteniendo 2 \mul de un anticuerpo monoclonal
antidesmina (Dako M 0760) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C.
Una cantidad igual de células control se incubó con la misma
cantidad de la correspondiente IgG isotípica (Sigma M 9269) en las
mismas condiciones [Factors affecting functional outcome alter
autologous skeletal myoblast transplantation. B. Pouzet et
al., Ann. Thorac. Surg. 2001, 71:844-851].
Una vez concluidas las incubaciones se lavaron
las células 2 veces con 1 ml de PBA, como en el caso anterior y el
precipitado de células resultante se suspendió en 100 \mul PBA
conteniendo 2 \mul de un anticuerpo anti IgG murino conjugado a
FITC (Dako F 0479) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Las
células marcadas se lavaron 2 veces con PBA, como en el caso
anterior.
La proporción de células progenitoras en la
población de células cultivadas se determinó utilizando un
citómetro de flujo analizador Coulter X-L. En la
Figura 1 se muestran los resultados de tal análisis. Se observa que
aproximadamente la mitad de la población son mioblastos.
Se comparó la capacidad proliferativa de las
células progenitoras humanas en diferentes medios de cultivo con y
sin componentes heterólogos de origen humano o animal.
Se utilizaron muestras de tejido muscular para
producir suspensiones de células tal como se describió en el
Ejemplo 1. Una vez disgregada se dividió la muestra en 3 alícuotas
con el mismo número de células y se cultivó cada una de estas
alícuotas tal como se describe en el Ejemplo 1, excepto que una
alícuota se cultivo en el medio (a), otra en el medio (b) y la
tercera en el medio (c). Estos medios se describen a
continuación.
- (a)
- Medio de cultivo Ham's F12 suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 20% (control referencia de crecimiento).
- (b)
- Medio de cultivo Ham's F12 suplementado con suero del paciente al 10%.
- (c)
- Medio de cultivo Ham's F12 suplementado con suero del paciente al 10%, 10 ng/ml de EGF recombinante (Sigma), 5 ng/ml de bFGF recombinante (PrepoTech EC Ltd), 0.4 \mug/ml de dexametasona (Sigma) y 10 \mug/ml de insulina recombinante (Sigma).
El suero se preparó a partir de sangre. Se
permite la coagulación espontánea de la sangre a 37°C y a
continuación se centrifuga a 3000 rpm y se separa el sobrenadante,
consistente en el suero.
Se efectuaron determinaciones semanales del
número de células y análisis citométricos para determinar la
proporción de células progenitoras en el cultivo. El experimento se
repitió por cuadriplicado utilizando muestras de diferentes
individuos.
Las Tablas I y II muestran los resultados
experimentales. En comparación con el medio de cultivo control (a)
y el suplementado con suero del paciente (b), se puede observar que
sólo con el medio suplementado con suero del paciente más factores
de crecimiento (c) se ha obtenido de todos los pacientes un número
de células superior a 200.000.000 a los 21 días. Se observa
también, que este medio de cultivo optimizado favorece el
crecimiento de células progenitoras frente a otros tipos celulares
presentes en el cultivo (fibroblastos principalmente).
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Medio de cultivo para la proliferación de
células progenitoras y posterior transplante a seres humanos
caracterizado porque está constituido por:
- a)
- el suero autólogo del paciente receptor del transplante
- b)
- un suplemento de factores de crecimiento
- c)
- un medio de cultivo definido para células animales
2. Medio de cultivo según la reivindicación 1
caracterizado porque está constituido por:
- a)
- el suero autólogo del paciente receptor del transplante en una proporción entre el 1 y el 20% (v/v)
- b)
- un suplemento de factores de crecimiento consistente entre otros en
- -
- factor de crecimiento epidérmico entre 1 y 20 ng/ml
- -
- factor de crecimiento fibroblástico entre 1 y 20 ng/ml
- -
- dexametasona entre 0.05 y 2 microgramos/ml
- -
- insulina entre 1 y 20 microgramos/ml
- c)
- un medio de cultivo definido para células animales entre 80 y 99%
3. Medio de cultivo según las reivindicaciones 1
y 2 caracterizado porque está constituido preferentemente
por:
- a)
- el suero autólogo del paciente receptor del transplante al 10% (v/v)
- b)
- un suplemento de factores de crecimiento consistente entre otros en
- -
- factor de crecimiento epidérmico recombinante entre 10 ng/ml
- -
- factor de crecimiento fibroblástico recombinante entre 10 ng/ml
- -
- dexametasona entre 0.4 microgramos/ml
- -
- insulina recombinante entre 10 microgramos/ml
- c)
- un medio de cultivo definido Ham's F12 al 90%
4. Uso de un medio de cultivo según las
reivindicaciones de la 1 a la 3 para promover la proliferación de
células progenitoras de músculo esquelético.
5. Uso de un medio de cultivo según la
reivindicación 4 para la realización de transplantes autólogos en
pacientes humanos.
6. Uso de un medio de cultivo según la
reivindicación 5 para la realización de transplantes autólogos en
pacientes humanos afectos de patología cardiovascular.
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|---|---|---|---|
| ES200302985A ES2235640B1 (es) | 2003-12-17 | 2003-12-17 | Medio de cultivo de celulas progenitoras humanas y uso para la proliferacion de dichas celulas para su posterior transplante autologo. |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19651992A1 (de) * | 1996-12-13 | 1998-06-25 | Toloczyki Christian Dr | Serum als Zusatz von Kulturmedium bei der Züchtung von stratifizierten Hautäquivalenten aus Stammzellen |
| WO2001007568A2 (en) * | 1999-07-23 | 2001-02-01 | Diacrin, Inc. | Muscle cells and their use in cardiac repair |
| WO2003012076A2 (en) * | 2001-08-02 | 2003-02-13 | Universite Laval | Culture medium to improve the purity of myoblast cultures and method using same |
| CA2470853A1 (en) * | 2001-12-13 | 2003-06-19 | Japan Science And Technology Agency | Human cell culture medium and culture method |
-
2003
- 2003-12-17 ES ES200302985A patent/ES2235640B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-12-07 WO PCT/ES2004/070106 patent/WO2005059089A1/es active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WO2005059089A1 (es) | 2005-06-30 |
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