ES2234293T3

ES2234293T3 - Agentes y metodos para modificar el metabolismo de la glutamina en las plantas, en particular en la remolacha.

Info

Publication number: ES2234293T3
Application number: ES99946125T
Authority: ES
Inventors: Rudolf Tischner; Guido Hoffmann
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-04
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: US6727095B1; ATE286134T1; EP1112367A2; DE19840964C1; DE59911379D1; WO2000014247A2; US20040143873A1; WO2000014247B1; WO2000014247A3; EP1112367B8; EP1112367B1

Abstract

Secuencia de nucleótidos para la modulación de la expresión de una proteína con la actividad de una glutamina sintasa, seleccionada del grupo compuesto por a) la secuencia de ADN de la serie SEQ ID Nº 1 y 3 b) una secuencia de nucleótido, que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº2 c) una secuencia de nucleótido complementaria a las secuencias de nucleótido de a) ó b), y d) una secuencia de nucleótido, que presenta un grado de homología de cómo mínimo un 80% respecto a las secuencias que se muestran en la SEQ ID Nº 1 ó 3, donde la secuencia de nucleótido es de la remolacha.

Description

Agentes y métodos para modificar el metabolismo de la glutamina en las plantas, en particular en la remolacha.

La presente invención hace referencia a la secuencia de nucleótidos de una glutamina sintetasa (sintasa) de la remolacha, a un vector que contiene esta secuencia de nucleótidos, a las células, que se transforman con este vector, a las proteínas codificadas con esta secuencia de nucleótido, a las plantas, que con esta secuencia de nucleótido se han transformado así como a los métodos para la modificación genética de las plantas, en particular de la remolacha.

La acumulación de glutamina como el componente \alpha-amino-N que existe principalmente en la remolacha, es decir en el órgano almacén de la remolacha, que se califica como nitrógeno nocivo o perjudicial, trae consigo unos problemas considerables a la producción de azúcar. La compensación que generalmente se realiza mediante la alcalinización de la acidificación del zumo de remolacha ocasionada por estos componentes es cara, conduce a la corrosión rápida de las instalaciones de producción y finalmente da lugar a unas cargas ambientales considerables, que asimismo únicamente pueden evitarse con unas medidas muy costosas desde el punto de vista económico. La síntesis de esta glutamina tiene lugar en las plantas mediante una amidación del ácido glutámico, de manera que el NH_{4}^{+} se enlaza por el consumo de ATP en el C-4 del Glutamato. Esta fase es catalizada por la enzima glutamina sintetasa (llamada de forma abreviada GS). Esta enzima se encuentra tanto en los cloroplastos como también en el citoplasma de las células vegetales. En los cloroplastos la enzima se presenta como un tetrámero de hasta cinco subunidades codificado por un gen (GS-2). En el citoplasma la enzima se presenta habitualmente según los conocimientos actuales como un héterooligómero (GS-1) codificado por varios genes. Los diferentes isoenzimas GS-1 conocidos son en general los heterooctámeros. Por el momento se han hallado seis formas iso distintas del GS-1. La glutamina sintetasa localizada en los cloroplastos, es decir la GS-2, tiene predominantemente la función de enlazar el NH_{4}^{+} precipitado durante la fotorrespiración y de transformar el NH_{4}^{+} procedente de la reducción del nitrato en compuestos orgánicos. Por el contrario la función del GS-1 reside predominantemente en las vías de desintegración catabólicas, en cuyo recorrido se fija el NH_{4}^{+} precipitado de la degradación proteínica. Este tipo de vías de desintegración tienen un papel importante especialmente durante el cambio de la hoja, es decir durante el envejecimiento, donde la glutamina formada es exportada de la hoja al órgano almacén o depósito.

Contrariamente al GS-2 en los cloroplastos, se sabe relativamente poco sobre el GS-1 en el citoplasma. Esto hace referencia sobre todo a su función en la célula pero también a su regulación. Contrariamente al GS-2 se parte del supuesto de que el GS-1 es codificado por varios genes, cuyo número es variable. Los genes muestran entre ellos homologías, pero se distinguen claramente unos de otros (Brears y cols., Plant J. 1(1991), 235 hasta 244; Edwards y cols., Plant Cell 1 (1989), 241 hasta 248). Adicionalmente los genes GS-1, que codifican respectivamente una subunidad del holoenzima octámero, pueden ser regulados de forma distinta (Petermann y Goodman MGG 230(1991), 145 hasta 154). Esto dificulta una influencia externa controlada del metabolismo de la glutamina a través de una modificación del GS-1.

La localización del GS-1 en las plantas es bastante incierta. De Edwards y cols. (a.a.O.) se sabe que una forma iso puede manifestarse exclusivamente en la floema, donde probablemente tiene un papel en el transporte intercelular. Sakurai y otros (Planta 200 (1996), 306 hasta 311) informan que en el arroz se presenta una forma iso del GS-1 en los haces conductores y probablemente tiene un papel en la exportación de la glutamina de las hojas. Se sabe también que las plantas del tabaco y de la alfalfa, que se han transformado con un gen GS-1 de Lotus corniculatus, se manifiestan en las flores (Carrayol y cols., Plant Sci 125 (1997), 75 hasta 85). Además se sabe que la composición y la localización de holoenzimas GS-1 en las raíces tuberosas del Lotus corniculatus pueden variar considerablemente. Maeck y otros (Planta 181(1990), 10 hasta 17) publican diferentes formas iso GS en la remolacha y ciertamente en diferentes fases de desarrollo y órganos.

Una reducción intencionada, llevada a cabo con métodos biológicos moleculares, del contenido de glutamina en las plantas, en particular en los órganos almacén de las plantas se desconoce por el momento. Las dificultades esenciales que aparecen en la reducción intencionada de la actividad de la glutamina sintetasa en las plantas y en la reducción deseada final del contenido de nitrógeno en los órganos almacén de las plantas se basan en que la actividad de la glutamina sintetasa específica del tejido y del tiempo debe ser tan limitada que, en el órgano objetivo, por ejemplo la remolacha almacén de una remolacha azucarera, el contenido de nitrógeno se reduzca. Por tanto la remolacha no puede experimentar ninguna alteración de sus funciones y propiedades. Además debe garantizarse que la fisiología completa de la remolacha se mantiene intacta y solamente se reduce de forma específica el contenido de nitrógeno en un órgano almacén de la remolacha. Con motivo de los problemas expuestos respecto a la localización del GS-1 y a las vaguedades en cuanto a la especificidad del tiempo de su actividad no se conoce ningún experimento satisfactorio, según el cual, el contenido de nitrógeno en los órganos almacén de las remolachas azucareras pudiera haberse reducido mediante una modulación de la actividad del GS-1.

El problema técnico en el que se basa la presente invención consiste en que se busca poder disponer de unos medios y métodos que faciliten de forma intencionada, es decir específica en el tiempo y para un tejido determinado, una disminución del contenido en nitrógeno en el órgano almacén de una planta, en particular de una remolacha, sin que con ello se alteren las funciones vitales, de crecimiento y de reproducción de la remolacha y su valor productivo.

La presente invención resuelve este problema mediante la preparación de una secuencia aislada y purificada de nucleótidos según la reivindicación principal y de los vectores que contiene esta secuencia, que se codifican para una subunidad del GS-1 de la remolacha. La presente invención resuelve el problema técnico incluso mediante la preparación de la proteína codificada por esta secuencia de nucleótidos, aislada y purificada, en particular de la secuencia de aminoácidos de la subunidad GS-1 de la remolacha, así como mediante el proceso para la modificación genética de las plantas, es decir, las remolachas, donde el contenido en glutamina sintetasa en la planta, especialmente en sus hojas envejecidas, se ha modificado, se ha reducido, de manera que las células de estas plantas con los mencionados vectores se transforman y a partir de las células transformadas se regeneran unas plantas transgénicas transformadas de forma estable, capaces de desarrollarse, en cuyas hojas envejecidas ha disminuido totalmente o se ha reducido la actividad del GS-1.

La invención tiene pues grandes ventajas ya que la subunidad codificada mediante la secuencia de nucleótido conforme a la invención equivale a la única subunidad de la forma iso de los oligómeros GS-1 que aparece en las hojas envejecidas de la remolacha. Según ello, la invención muestra el sorprendente hecho de que esta forma iso del GS-1 es un homooctámero. Esto permite influir de forma sorprendente en la actividad de esta enzima por la influencia de la manifestación de un único gen, es decir del gen que codifica la subunidad GS-1, evitando o bien reduciendo su manifestación. La invención es también sorprendente en cuanto a que la forma iso homooligómera del GS-1 preparada según la invención, aparece únicamente en una fase de envejecimiento y por tanto además de la ya mencionada especificidad del tejido en cuanto a la localización en la hoja presenta también una especificidad de tiempo respecto a su aparición durante el envejecimiento. La presente invención dispone también de forma sorprendente de medios y métodos para influir en la aparición cualitativa y /o cuantitativa de una forma iso del GS-1 homooctámero que se encuentra en las hojas envejecidas de la remolacha. Las secuencias de nucleótidos conforme a la invención pueden hallar también aplicación en la clonación de genes homólogos, en particular en las regiones codificadas por ellos, en otros tejidos o bien otras plantas y organismos. Especialmente pueden identificarse y aislarse al utilizar la presente secuencia de nucleótidos como una sonda de hibridación en sistemas homólogos o heterólogos incluso con secuencias de nucleótidos no codificadas de forma regular, asociadas por vía endógena a esta secuencia, que proporcionan una manifestación específica del tiempo y del tejido.

La invención resuelve el problema técnico existente mediante la preparación de una secuencia de nucleótido que procede de una remolacha azucarera (Beta vulgaris) para la modulación de la expresión, en particular para la supresión de la expresión, de una proteína con la actividad de una glutamina sintetasa, en particular con la actividad de una GS-1, que se ha elegido del grupo compuesto por

a): la secuencia ADN de la SEQ ID 1 ó 3,

b): una secuencia de nucleótido, que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID nr. 2.

c): una secuencia de nucleótido complementaria a las secuencias de nucleótidos de a) ó b), y

d): una secuencia de nucleótido que presenta al menos una homología del 80% respecto a las secuencias de nucleótidos de a)

La secuencia de nucleótido conforme a la invención se caracteriza por que desde el punto de vista funcional, en una célula que presenta una secuencia endógena codificada con GS-1 modula la actividad de la actividad GS-1 de esta célula transformada, por ejemplo mediante una sobre expresión o bien reduce la actividad GS-1 o bien la elimina por completo, por ejemplo de tal manera que la secuencia de nucleótidos conforme a la invención se transforma en forma de una estructura antisentido o hebra complementaria que inhibe la traslación endógena del GS-1.

La secuencia de nucleótido conforme a la invención puede ser una secuencia ADN, por ejemplo una secuencia ADN o ADNc interrumpida por intrones, pero puede ser también una secuencia ARN, por ejemplo una secuencia ARNm o bien puede fabricarse de forma sintética. La presente invención hace referencia tanto a las secuencias de nucleótidos transcritas como complementarias. Las secuencias de nucleótidos conforme a la invención pueden ser secuencias llamadas de longitud completa, es decir secuencias, que codifican una proteína completa con la actividad de una glutamina sintetasa, en particular la GS-1, de la remolacha, que si se diera el caso incluye el lugar de inicio de la traslación. Sin embargo, la invención también hace referencia a secuencias parciales de dichas secuencias de nucleótidos, en particular a aquellas que sirven para la modulación de la expresión de la proteína con la actividad de una glutamina sintetasa, en particular de una GS-1 de remolacha. Según ello la secuencia de nucleótidos conforme a la invención puede formar un gen de fusión con otras secuencias de nucleótidos incluso en la unidad de transcripción o de traslación.

En relación con la presente invención por una hibridación se entiende una prehibridación, una hibridación y un lavado posterior. La prehibridación tiene lugar preferiblemente en una solución acuosa de 6 x SSPE, 0,1% SDS y 5 veces el reactivo de Denhardt así como 500 \mug/ml de esperma de Hering desnaturalizado durante 3 horas a 60ºC, preferiblemente a 65ºC. La hibridación tiene lugar preferiblemente en una solución acuosa de 3 veces SSPE, un 0,1% de SDS y 5 veces el reactivo de Denhardt y 500 \mug/ml de esperma de Hering desnaturalizado durante 16 horas a 60ºC, preferiblemente a 65ºC. El lavado tiene lugar preferiblemente en una solución acuosa de 2 veces SSPE y un 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 10 minutos, de manera que en una solución acuosa de 2 veces SSPE y un 0,1% de SDS sigue otra etapa de lavado a 60ºC, preferiblemente a 65ºC, durante 15 minutos y concluye con una última etapa de lavado con una solución acuosa de 0,4 veces de SSPE y un 0,02% de SDS a 60ºC, preferiblemente a 65ºC durante 15 minutos.

En una forma de ejecución especialmente preferida se realiza una prehibridación en una solución acuosa de 6 veces SSPE, un 0,1% de DSD y 5 veces reactivo de Denhardt así como 500 \mug/ml de esperma de Hering desnaturalizado durante 3 horas a 65ºC. La hibridación tiene lugar en una solución acuosa de 3 veces SSPE, 0,1% SDS, 5 veces reactivo de Denhardt y 500 \mug/ml de esperma de Hering desnaturalizado durante 16 horas a 68ºC. El lavado tiene lugar en una solución acuosa de 2 veces SSPE, un 0,1% de SDS a 68ºC durante 15 minutos, de manera que en una solución acuosa de 1 volumen de SSPE y un 0,1% de SDS sigue otra etapa de lavado a 68ºC durante 15 minutos y concluye con una última etapa de lavado con una solución acuosa de 0,1 veces de SSPE y un 0,1% de SDS a 68ºC durante 15
minutos.

Naturalmente la presente invención también hace referencia a las modificaciones de las secuencias mencionadas, en particular a aquellas que frente a las secuencias mostradas en SEQ ID nº 1 ó 3 presentan adiciones de nucleótidos, eliminaciones, inversiones, sustituciones o similares que incluyen derivatizaciones químicas o bien sustituciones, intercambios o adiciones de nucleótidos inusuales.

La invención se refiere también a las secuencias de nucleótidos que presentan un grado de homología de cómo mínimo un 80%, preferiblemente un 90%, respecto a las secuencias mostradas en la SEQ ID nº 1 ó 3.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención son especialmente preferidas ya que sirven para la modulación de la expresión de una proteína con la actividad de una glutamina sintetasa, en particular de la GS-1 de la remolacha azucarera. Las secuencias de nucleótidos conforme a la invención pueden emplearse para variar la cantidad de glutamina sintetasa formada, en particular de GS-1 de remolacha, y especialmente para reducirla, y muy especialmente para eliminarla por completo. De una forma especialmente preferida la invención permite eliminar, a través de la modulación de la expresión de una forma específica en cuanto a tiempo y tejido, el almacenamiento de glutamina en el órgano almacén o depósito de la remolacha, sin que precisamente tengan que emplearse para ello unos elementos de regulación específicos en cuanto a tiempo y tejido para el transgen, es decir la secuencia de nucleótidos conforme a la invención. Las secuencias de nucleótidos conforme a la invención codificar la GS-1 de la remolacha, que aparece de forma específica únicamente en las hojas envejecidas, ya que existe una especificidad del lugar en lo que se refiere a la manifestación en las hojas y una especificidad del tiempo en cuanto a la expresión durante el envejecimiento. Las secuencias de nucleótidos conforme a la invención facilitan que se inhiba esta glutamina sintetasa que aparece específicamente en el envejecimiento de la hoja por medio de una estructura exclusiva del gen, ya que la GS-1 de la remolacha es un homooctámero y conforme a ello por medio de una estructura propia del gen puede interrumpirse la formación de subunidades de GS-1. Por consiguiente, la invención prevé de un modo especialmente preferible emplear las estructuras de las hebras complementarias que impiden de forma específica la formación de proteínas, es decir de la GS-1 en las hojas envejecidas de la remolacha. Mediante el empleo de las estructuras de hebras complementarias la GS-1 de la remolacha que aparece específicamente en el envejecimiento de la hoja puede ser inhibida en su expresión, de tal manera que se evite la formación de glutamina y el almacenamiento de glutamina en la remolacha almacén. De un modo preferible, el crecimiento de la remolacha en este proceso no se ve alterado puesto que la GS-2 no se ve afectada por la manipulación técnica del gen de las células de las plantas.

En relación con la presente invención, por la actividad de una proteína con la actividad de una glutamina sintetasa se entiende una actividad que está relacionada al C-4 de una molécula de Glutamato por el empleo del ATP conforme al NH_{4}^{+} enzimático.

En relación con la presente invención, por modulación de la expresión de una proteína se entiende una modificación intencionada conseguida con un método genotécnico, es decir el incremento o la disminución de la cantidad de proteína en una célula en comparación con la cantidad de proteína existente en el momento correspondiente en la célula respectiva de forma natural.

La modulación de la expresión puede producirse por la influencia del traslado o de la transcripción de la secuencia de nucleótidos endógena que codifica la proteína, por ejemplo por la entrada de una estructura de hebra complementaria, que reduce parcial o totalmente la cantidad de ARNm trasladable. Un incremento de la cantidad de proteína puede ocurrir, por ejemplo, por la entrada de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, que se encuentra bajo el control de elementos reguladores sobreexpresados o bien por la entrada de múltiples genocopias.

Pueden lograrse otras modulaciones alternativas o adicionales en las que se empleen elementos reguladores específicos del tejido o del tiempo, que se expresen de forma inducible o constitutiva, que conduzcan a un patrón de expresión modificado frente al patrón de expresión natural en la célula correspondiente y en el momento pertinente respecto a un estadio o fase de desarrollo respectivo de la célula o de la planta.

La presente invención se refiere en otra forma de ejecución a los vectores que contienen al menos una de las secuencias de nucleótidos conforme a la invención. En una forma de ejecución especialmente preferida de la invención se emplea un vector de este tipo como plásmido o vector viral.

La presente invención hace referencia también a los vectores del tipo mencionado con anterioridad, donde al menos existe una secuencia de nucleótidos de la presente invención que está bajo el control de las secuencias de nucleótidos reguladores existentes en el vector, que por ejemplo, se disponen en las posiciones 5', 3', 5' y 3' o dentro de la secuencia. Estas secuencias de nucleótidos reguladores pueden ser heterológicas o artificiales respecto a la secuencia de nucleótidos conforme a la invención, es decir proceder de otro organismo o de otro gen, o bien ser homólogas, es decir aparecer de forma natural junto con las secuencias de nucleótidos conforme a la invención en una unidad reguladora.

La invención se refiere según ello también a vectores del tipo mencionado con anterioridad, donde en la posición 5' de la secuencia de nucleótidos conforme a la invención se localiza una secuencia de nucleótidos que gobierna la expresión de la secuencia de nucleótido, en particular un activador. En una forma de ejecución preferida de la invención el activador es el 35 S-activador de la CaMV o bien un activador de la T-DNA del Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, el activador del gen de nopalina sintasa o bien octopina sintasa.

La invención prevé en otra forma de ejecución que en la posición 3' de la secuencia de nucleótidos conforme a la invención se localice una unidad de terminación de la transcripción, en particular una señal del 3'-poliadenilo, prefiriéndose una señal de poliadenilo del gen NOS de Agrobakterium tumefaciens.

La presente invención prevé en otra forma de ejecución que las secuencias reguladoras sean inducibles, por ejemplo por factores externos.

La invención prevé en otra forma de ejecución preferida, que las secuencias reguladoras de la expresión de estas secuencias de nucleótidos conforme a la invención controladas por éstas proporcionan una especificidad de tejido y /o de tiempo, por ejemplo, provocan una expresión de una estructura de hebra complementaria específica en las hojas durante su envejecimiento.

La invención prevé también que las secuencias de nucleótidos conforme a la invención, si fuera preciso en una unidad con las secuencias de nucleótidos reguladoras, se dispongan junto con las secuencias de nucleótidos en el vector, apoyando un traslado y una integración o recombinación de las secuencias de nucleótidos conforme a la invención con o sin las secuencias de nucleótidos reguladoras dispuestas en el genoma de una célula transformada. Las secuencias de nucleótidos conforme a la invención pueden, por ejemplo, disponerse entre la región limítrofe derecha e izquierda, flanqueadas únicamente por una región limítrofe y /o interrumpidas por una o varias regiones limítrofe de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes.

La presente invención hace referencia también a células que contienen al menos uno de los vectores mencionados. De una forma especialmente preferida este tipo de células pueden ser células bacterianas, células de levadura o células vegetales, en particular células vegetales de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, especialmente la remolacha azucarera. La presente invención se refiere pues en particular a una célula, no específica del lugar, de una planta que ha sido transformada de forma transitoria o estable con una secuencia de nucleótidos conforme a la invención, especialmente aquella que presenta en su genoma esta secuencia de nucleótidos por ejemplo en forma de una estructura complementaria. Por una planta se entiende un organismo fotosintéticamente activo, que incluye algas, mohos, helechos y plantas superiores.

La invención se refiere además a grupos de células, tejidos, órganos, partes de órganos, cultivos celulares, agregados celulares diferenciados o no diferenciados, gérmenes, protoplastos etc. de un organismo, que presentan una célula transformada con las secuencias de nucleótidos conforme a la invención, integrada de forma estable en el genoma o al menos existente de forma transitoria. De una forma especialmente preferida la invención se refiere a las hojas, tallos, semillas, raíces, órganos almacén, hojas de las flores, órganos de las flores etc. de una planta, donde los órganos mencionados al menos presentan una célula transformada de forma estable o transitoria con las secuencias de nucleótidos conforme a la invención. De forma especialmente preferida las plantas o bien alguna parte de ellas se transforman de manera que la secuencia de nucleótidos transformada es heredada de forma estable de generación en generación.

La presente invención se refiere además a las células, grupos de células, órganos de plantas y naturalmente a las plantas, en particular a las plantas fértiles intactas, que se han transformado por medio de una secuencia de nucleótidos conforme a la invención y que al menos en una de sus células presentan una de estas secuencias, integradas de forma estable en su genoma. La transformación tiene lugar, como se ha mencionado, de forma no biológica, de manera que se entiende como no biológica una transferencia genética determinada por una agrobacteria. Las células obtenidas así como las células presentes en los tejidos de las plantas, órganos de las plantas o plantas no son específicas de un lugar. Además la invención es aplicable a casi todas las plantas, familias de plantas o géneros de plantas.

De una manera especialmente preferida la secuencia de nucleótido transformada es heterológica a la célula transformada, es decir no existe de forma natural en la célula transformada, no existe en el elevado número de copias artificialmente producido o bien no allí, o no expresadas en el tiempo, en el que se expresan conforme a la invención. En los casos, en los que la célula que va a ser transformada ya presenta una secuencia de nucleótido endógena idéntica o similar, la célula obtenida a través de la transformación conforme a la invención se diferencia en que la secuencia de nucleótidos introducida existe en el genoma en otra composición genética, presenta otros elementos reguladores, se dispone en una orientación complementaria a sus elementos reguladores y /o aparece en un número de copias elevado.

La invención se refiere también a los métodos para la fabricación de células transgénicas, donde la secuencia de nucleótido de la invención que va a ser transformada por medio de un método de transformación habitual, por ejemplo por el bombardeo de micro proyectiles, la transferencia genética determinada por la agrobacteria, la electroporación, la transformación realizada por la PEG o bien similares es encauzada hacia la célula que va a ser transformada.

La invención se refiere también al método para la fabricación de plantas transgénicas que presentan una secuencia de nucleótido conforme a la invención, donde se cultivan células o grupos de células transformados con las secuencias de nucleótidos conforme a la invención y se regeneran para dar plantas intactas, preferiblemente fértiles. El cultivo y la regeneración se realiza por medio de los métodos habituales.

La invención se refiere también a una proteína con la actividad de una glutamina sintetasa, en particular a la GS-1 y a la remolacha, donde ésta es codificada a través de la secuencia de nucleótido conforme a la invención, en particular la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID nº1, en particular una secuencia de aminoácidos, que se muestra en SEQ ID nº2. La invención se refiere también a proteínas con la actividad de una glutamina sintetasa, en especial la GS-1 de remolacha, donde esta secuencia presenta modificaciones, como intercambios de aminoácidos, eliminaciones, adiciones, inversiones o similares, y donde la proteína presenta la actividad de una GS-1 de remolacha. La invención hace referencia también a proteínas, que presentan un grado de homología (aminoácidos idénticos) al nivel de aminoácidos de cómo mínimo un 90%, preferiblemente un 95% respecto a la secuencia que se muestra en la SEQ ID nº2. Este tipo de proteínas pueden prepararse de tal forma que se empleen secuencias de nucleótidos conforme a la invención como sondas de clonación, o bien muestras de hibridación para identificar y clonar genes homólogos que codifiquen estas proteínas.

En otra forma de ejecución, la invención hace referencia a anticuerpos mono- o policlonales frente a una de las mencionadas proteínas, de manera que estos anticuerpos reconozcan y se enlacen a uno o varios de los epítopos de las mencionadas proteínas.

La invención se refiere, en otra configuración, a un método para modificar el metabolismo de la glutamina en una remolacha, en particular para la modulación de la expresión, muy especialmente la represión, de una proteína con la actividad de una glutamina sintasa, especialmente la GS-1 de la remolacha, donde se modifica el contenido de glutamina sintasa de la remolacha, transformándose al menos una célula de remolacha con un vector según la presente invención, en particular con un vector que presenta la secuencia de nucleótidos conforme a la invención en una orientación complementaria y de la célula transformada o de un grupo de células se regenera una remolacha. De forma preferible una remolacha producida de esta forma se caracteriza por que la glutamina sintasa GS-1 que normalmente se forma durante el envejecimiento en sus hojas no se forma, ya que debido a la estructura complementada expresada y existente en las hojas la expresión de la glutamina sintasa se ve inhibida, de tal forma que en las hojas se evita la formación de glutamina y en definitiva el almacenamiento de glutamina en la remolacha almacén.

La infección se refiere, sin embargo, también al método para cambiar el metabolismo de la glutamina en las plantas, en particular en la remolacha, según si se eleva el contenido de glutamina sintasa en determinadas células o bien órganos, en determinados momentos, de forma que se transformen las estructuras de los genes, que permiten una expresión o manifestación constitutiva y /o reforzada de las secuencias de nucleótidos conforme a la invención.

Otras configuraciones preferidas de la invención se deducen de las subreivindicaciones.

La invención se aclara con más detalle con ayuda de los ejemplos y de los dibujos correspondientes.

La SEQ ID Nº 1 muestra la región trasladada de la secuencia de ADNc de la GS-1 de remolacha.

La SEQ ID Nº 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la GS-1 de la remolacha.

La SEQ ID Nº 3 muestra la secuencia completa de ADNc de la GS-1 de la remolacha.

Las figuras muestran:

Figura 1 una inmunotransferencia de la GS-1 obtenida según la invención

Figura 2 un autorradiograma de la inmunotransferencia según la figura 1 y

Figura 3 una representación esquemática de los resultados obtenidos en las figuras 1 y 2.

Ejemplo 1 Clonación de la ADNc para la GS-1

El ARN completo se extraía de las hojas envejecidas de la remolacha. Para ello se trituraban 20 g del material de la hoja a base de hojas de remolacha envejecidas en nitrógeno líquido y se trasladaban a 100 ml de tampón (50 mM Tris-HCl pH 9,0, 100 ml NaCl, EDTA 10 Mm, 2% p/v SDS y 0,2 mg/ml de proteinasa K). Esta mezcla se trataba dos veces con fenol /cloroformo /alcohol de isoamilo (25/24/1), se precipitaba (1/10 del volumen de NaAc 3M, pH 6,5, un volumen de isopropanol, 2 horas a -20ºC) y se lavaba con etanol del 70%. Tras su incorporación a 10 ml de H_{2}O, 10 \mug/ml de proteinasa K y 2 precipitaciones con ¼ del volumen de LiCl 10M durante 16 horas a 0ºC el RNA completo se incorporaba a 2 ml de H_{2}O con 10 \mug/ml de proteinasa K. Se obtenían 5 mg de ARN completo.

A continuación, se aislaba una poli(A)^{+} m-RNA a través de una columna de oligo-dT-celulosa. Para ello se incubaban 2 ml de ARN completo con 25 ml de tampón de enlace (NaCl 400 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y 2% SDS) y oligo-dT-celulosa (200 mg de oligo-dT-celulosa) durante 30 minutos a temperatura ambiente y bajo una agitación suave. La mezcla se trasladaba a una columna de vidrio con frita de algodón y se lavaba con un tampón de lavado (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 0,2% de SDS) gota a gota hasta que la constante de OD_{260} era de 0,005. Seguidamente se eluía con 10 ml de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) a 55ºC. Se precipitaba con 1/10 de volumen de NaAc 3M, pH 6,5 y 2 volúmenes de etanol a -20ºC durante dos horas y la mezcla se incorporaba a 10 ml de tampón de enlace. Luego se repetía la limpieza de la columna, antes del precipitado se trataba el eluido con fenol y el sedimento celular de ARNm pasaba al tampón TE. Se obtenían 50 \mug de poli (A)^{+} ARN-m.

El ADNc o complementario se fabricaba por medio un estuche de síntesis de ADN complementario de Boehringer Mannheim según un protocolo estándar (se empleaban 5 \mug de RNAm). El ADNc obtenido se ligaba en vectores \lambda (NM 1149). Para ello se empleaban 4 \mug de NM 1149 (Ecor I) y 0,2 \mug de ADNc con enlaces de EcoR I. Tras el enlace, se embalaba el ADN en bacteriófagos (NM 1149). Para ello se empleaba el Gigapack® II Gold Packaging Extract de la empresa Stratagene según el protocolo estándar, de manera que si se empleaban 4 \mug de ADN se obtenía un contenido de 140000 pfu.

El banco de ADNc obtenido así como un banco de ADNc del tejido de las raíces de las remolachas (Lambda ZAP® II Library, Stratagene, cDNA insertado a través del EcoR I y Not I en el sistema de vectores Lambda ZAP® II, índice: 250000 pfu, vector pBluescript® SK(-) con inserción según el protocolo estándar aislado a través de una escisión in vivo de Lambda ZAP® II) se detectaba con una sonda heterológica del tabaco. La sonda del tabaco heterológica se ha descrito en Becker y otros (1992) Plant. Molec.Biol.. 19, 367-379. Para la detección se infectaban bacterias E.coli con los bacteriófagos \lambda y se colocaban en placas. A continuación, se trasladaban los bacteriófagos de ADN de las bacterias lisiadas a las membranas NC (Plaquelift) y el ADN unido a la membrana se hibridizaba con una sonda de tabaco.

La detección o el examen del banco de ADNc se realizaba con la sonda heterológica de tabaco del modo siguiente. Inicialmente se llevaba a cabo una prehibridación con 6 volúmenes de SSPE, 0,1% SDS, 5 volúmenes de reactivo Denhardt y 500 \mug/ml de esperma de Hering desnaturalizado a 61ºC durante dos horas. A continuación, se realizaba la hibridación a 61ºC durante 16 horas con una solución de 3 volúmenes de SSPE, 0,1% SDS, 5 volúmenes de reactivo Denhardt y 500 \mug/ml de esperma de Hering desnaturalizado. El lavado se realizaba con 2 volúmenes de SSC y 0,1% SDS a 61ºC durante 2 etapas de 15 minutos. Seguidamente, se realizaba una etapa de lavado con un volumen de SSC y 0,1% de SDS a 61ºC durante 15 minutos.

Se desarrollaba un autorradiograma del filtro de membrana, se aislaban los bacteriófagos positivos y se extraía el ADN correspondiente. El ADNc hallado se subclonaba y secuenciaba en el plásmido pbluescript SK (Stratagene). La secuencia de nucleótidos de la región del ADNc trasladada que incluye el codón de inicio de la traslación ATG se representa en la SEQ ID Nº 1 y presenta una longitud de 1.068 bp. La secuencia completa de la ADNc se representa en la SEQ ID Nº3 y presenta una longitud de 1543 bp. El codón de inicio se encuentra en la posición 199 hasta 201. La zona trasladada termina en la posición 1266. Una señal de poliadenilización se sitúa en la zona de los nucleótidos 1478 hasta 1508.

La secuencia de aminoácidos derivada de la SEQ ID nº1 presenta una longitud de 356 aminoácidos y se representa en la SEQ ID nº2. La secuencia de aminoácidos equivale a la secuencia de aminoácidos de la subunidad P del GS-1 de remolacha. La proteína es aproximadamente de 42 kDa y representa la única subunidad de la forma iso GS-1, que se presenta en forma de un homooctámero en las hojas envejecidas de la remolacha.

Ejemplo 2 Transcripción in vitro y traslación de la subunidad P

La secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID Nº1 se transcribía in vitro y se trasladaba. La secuencia GS-1-ADN clonada empleada para ello procedía de la ADNc del tejido radicular de la remolacha mencionada en el ejemplo 1. Para averiguar para que subunidad GS-1 esta secuencia ADN codificase realizaba una transcripción in vitro y una traslación con el estuche de Boehringer Mannheim "Linked in vitro SP 6/T7 Transcription/Translation kit-radioaktiv". Para ello se incubaban 0,5 \mul (0,5\mug) de plásmido-ADN (pBluescript® SK(-) con la inserción GS-1), 5 \mul de tampón de transcripción T7 y 14,5 \mul de H_{2}O durante 15 minutos a 30ºC. A continuación se incubaban 10 \mul de solución de transcripción-reacción, 1,6 \mul de ^{35}S-metionina y 38,4 \mul de mezcla de traslación durante 1 hora a 30ºC.

Además se preparaba un extracto de proteína a partir de 5 g de hojas de remolacha de diferentes estadios de vejez (para obtener todas las subunidades GS-1 para una identificación clara). Este extracto se purificaba a través de una FPLC y las fracciones se concentraban con las actividades GS-1 máximas. La determinación de proteínas se realizaba según Bradford y daba una concentración proteínica de aprox. 1 \mug/\mul. Tanto este extracto como también la mezcla de reacción de la traslación in vitro (con la proteína GS-1 marcada radioactiva) se mezclaban con el mismo volumen de tampón de carga de urea. Se reunían unos 20 \mul como muestra para un enfoque isoeléctrico (IEF) en un gel capilar de acrilamida (1ª dimensión). Un enfoque isoeléctrico tenía lugar a 190 V durante 16 h.

Junto con una muestra de las dimensiones de la proteína se trasladaba el gel capilar a un gel SDS para separar las proteínas según su tamaño (2ª dimensión). Se efectuaba una SDS-PAGE a 140 V durante 2 horas. De este gel se preparaba una inmunotransferencia (500 mA; 1h).

La membrana de nitrocelulosa se coloreaba con rojo Ponceau y las tiras de la muestra de dimensiones se marcaban con bolígrafo.

Tras un tratamiento de bloqueo (1h) se incubaba la membrana con el 1ª anticuerpo (anti-GS; anticuerpo contra Gersten-GS, Roger Wallsgrove, Rothamsted Experimental Station, Harpenden, UK), 1:3000 en la solución de bloqueo) (16h; RT). La membrana se lavaba entonces tres veces con TBS y se incubaba con el 2º anticuerpo (1:2000 en la solución de bloqueo)(3h; RT). Tras un nuevo lavado triple tenía lugar la reacción de coloración con NBT y BCIP mediante la fosfatasa alcalina (10-20 min; 37ºC; oscuro). La membrana secada con las manchas de color para las subunidades GS-1 se exponía con una película de rayos X (exposición: 16h; RT; oscuro).

La figura 1 muestra el filtro de membrana tratado con los anticuerpos GS y coloreado (inmunotransferencia). A la izquierda se aplica una muestra de las dimensiones de la proteína. El gradiente del pH transcurre aquí de izquierda, pH 6, a derecha, pH 4. A la altura de la banda de 43 kDa se reconocen las 4 manchas de las subunidades GS-1 (compárese la figura 3, aquí en general invertido). La mancha para la subunidad P está marcada (flecha).

La figura 2 muestra el autorradiograma de la membrana, donde a la izquierda se caracterizan las bandas del patrón de dimensiones y a la derecha aparece una mancha a la altura de la banda de 43 kDa. Esta mancha era producida por la proteína marcada radiactivamente trasladada y transcrita in vitro. Al cubrir el autorradiograma con la membrana, a cada mancha de la película le corresponde una mancha de la membrana. Esta mancha se identificaba como subunidad "P" (compárese la figura 3).

La figura 3 equivale a un esquema de las proteínas que se pueden marcar mediante los anticuerpos GS. A continuación se indica la dirección del gradiente del pH (1ª dimensión) de izquierda pH 4 a derecha pH 6. A la derecha se representan las bandas del patrón de dimensiones (2ª dimensión) desde arriba 43 kDa hasta abajo 30 kDa. Los puntos aquí blancos a, b, c y d indican las posiciones de las subunidades GS-2, que asimismo se reconocen por los anticuerpos, pero también pueden separarse por la FPLC de la GS-1. A la altura de la banda de 43 kDa aparecen cuatro puntos negros s, i, p y w, que debido a su tamaño podrían identificarse como aquellas subunidades, que forman el octámero GS-1. Los otros puntos negros u, v, x_{1}, x_{2}, y y z equivalen probablemente a los productos de degradación de las proteínas GS.

Ejemplo 3 Fabricación de la remolacha transgénica

Se han preparado una serie de estructuras que contenían respectivamente un activador expresable en las plantas, es decir el activador CaMV 35 S, un tramo del gen conforme a la invención de la subunidad GS-1 de la remolacha en una orientación antisentido así como el terminador NOS. Los tramos empleados del gen conforme a la invención se diferencian unos de otros. Los cajitas de gen así fabricadas se unían al vector binario (BIN19 con resistencia de canamicina) y el agrobacterium tumefaciens (con la resistencia de la rifampicina) con los vectores binarios preparados se transformaba por medio de la electroporación. Los transformadores seleccionaban la rifampicina y la canamicina. A continuación discos de las hojas de remolacha o bien los pecíolos se transformaban en una suspensión con agrobacterias transformadas y se inducían la formación de retoños y gérmenes con las hormonas de las plantas NAA y BAP. Tras la selección de un medio que contenía canamicina y la regeneración a plantas intactas según los protocolos habituales, podía detectarse por medio de mediciones de las actividades del enzima GS1, de la electroforesis del gel SDS, de la 2D-PAGE y de los análisis inmunológicos, que el conjunto de estructuras empleadas con los diferentes tramos de gen existían en las hojas de las plantas transgénicas, regeneradas y eran activos y conducían a la eliminación de la actividad de la glutamina sintasa y a la formación de glutamina sintasa en las hojas envejecidas de la remolacha.

(1) DATOS GENERALES

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Suedzucker Aktiengesellschaft

\hskip4,6cm Mannheim /Ochsenfurt

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(B): CALLE: Maximilianstrasse 10

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(C): POBLACIÓN: MANNHEIM

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(D): PAIS: REPUBLICA FEDERAL DE ALEMANIA

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(E): CÓDIGO POSTAL: 68165

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(ii): DEFINICIÓN DE LA INVENCIÓN: Remolacha genéticamente modificada

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): VERSIÓN LEGIBLE DEL ORDENADOR:

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(A): SOPORTE DE DATOS: Floppy disk

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA DE FUNCIONAMIENTO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0,version #1.30 (EPA)

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(2) DATOS RESPECTO A LA SEQ ID Nº1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1068 pares de bases

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(B): TIPO: Nucleótido

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(C): FORMA DE RAMIFICACIÓN: Ramificación única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi): ORIGEN: (A) ORGANISMO: Beta vulgaris

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº1:

1

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(2) DATOS RESPECTO A LA SEQ ID Nº2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 365 aminoácidos

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(B): TIPO: Aminoácido

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(C): FORMA DE RAMIFICACIÓN: Ramificación única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

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(vi): ORIGEN: (A) ORGANISMO: Beta vulgaris

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº2:

2

3

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(2) DATOS RESPECTO A LA SEQ ID Nº3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(E): LONGITUD: 1534 pares de bases

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(F): TIPO: Nucleótido

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(G): FORMA DE RAMIFICACIÓN: Ramificación única

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(H): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi): ORIGEN: (A) ORGANISMO: Beta vulgaris

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº3:

4

5

Claims

1. Secuencia de nucleótidos para la modulación de la expresión de una proteína con la actividad de una glutamina sintasa, seleccionada del grupo compuesto por

a) la secuencia de ADN de la serie SEQ ID Nº 1 y 3

b) una secuencia de nucleótido, que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº2

c) una secuencia de nucleótido complementaria a las secuencias de nucleótido de a) ó b), y

d) una secuencia de nucleótido, que presenta un grado de homología de cómo mínimo un 80% respecto a las secuencias que se muestran en la SEQ ID Nº 1 ó 3,

donde la secuencia de nucleótido es de la remolacha.

2. Vector que contiene una secuencia de nucleótido conforme a la reivindicación 1.

3. Vector conforme a la reivindicación 2, donde el vector es un plásmido o un vector vírico.

4. Vector conforme a una de las reivindicaciones 2 ó 3, donde la secuencia de nucleótido se atribuye a como mínimo una secuencia de nucleótido reguladora.

5. Vector conforme a una de las reivindicaciones 2 hasta 4, donde en la posición 5' de la secuencia de nucleótido se dispone la expresión del activador que regula la secuencia del nucleótido.

6. Vector conforme a una de las reivindicaciones 2 hasta 5, donde en la posición 3' de la secuencia del nucleótido se dispone una señal 3'-poliadenilización.

7. Vector conforme a una de las reivindicaciones 2 hasta 6, donde es inducible la secuencia reguladora.

8. Vector conforme a una de las reivindicaciones 2 hasta 7, donde la secuencia reguladora de la expresión de la secuencia del nucleótido aporta especificidad de tiempo y tejido.

9. Vector conforme a una de las reivindicaciones 2 hasta 8, donde la secuencia de nucleótido presenta una orientación antisentido al activador.

10. Células que contiene un vector conforme a una de las reivindicaciones 2 hasta 9.

11. Célula conforme a la reivindicación 10, que es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de planta, en particular una célula de remolacha.

12. Planta, que contiene al menos una célula conforme a una de las reivindicaciones 10 ó 11.

13. Semilla de una planta conforme a la reivindicación 12, donde esta semilla contiene una secuencia de nucleótido conforme a la reivindicación 1.

14. Método para modificar el metabolismo de la glutamina en una remolacha, de manera que la síntesis de la glutamina sintasa en la remolacha se vea reducida o bien impedida, de tal forma que al menos una célula de la planta sea transformada con un vector conforme a la reivindicación 9 y la remolacha pueda ser regenerada.

15. Método para fabricar una remolacha transgénica, que presente un metabolismo de la glutamina alterado, y que éste se base en una disminución del contenido de glutamina sintasa en la célula de la planta, de manera que al menos una célula de la planta sea transformada con un vector conforme a la reivindicación 9 y la célula de la planta sea regenerada para dar una planta intacta.