ES2232613T3

ES2232613T3 - Formulaciones y metodos de utilizacion de agentes mimeticos del oxido nitrico contra un fenotipo celular maligno.

Info

Publication number: ES2232613T3
Application number: ES01923448T
Authority: ES
Inventors: Michael A. Adams; Charles H. Graham; Jeremy P. W. Heaton; Lynne-Marie Postovit
Original assignee: Cellegy Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Adamis Pharmaceuticals Corp
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: AU5022101A; EP1278547B1; CA2407466C; DE60106905D1; MXPA02010551A; WO2001080890A2; EP1278547A2; ATE281177T1; IL152428A; HK1052468B; US6946484B2; AU2001250221B2; HK1052468A1; US20020040059A1; IL152428A0; WO2001080890A3; CA2407466A1; DE60106905T2; JP2003531179A

Abstract

Uso de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico en la preparación de un medicamento destinado a controlar, tratar y/o prevenir cáncer, tumores malignos, neoplasia, hiperplasia, hipertrofia, displasia y/o angiogénesis de tumores, en el que dicha dosis baja es 3 a 10.000 veces menor que una dosis de agente mimético del óxido nítrico que produce vasodilatación.

Description

Formulaciones y métodos de utilización de agentes miméticos del óxido nítrico contra un fenotipo celular maligno.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico en la preparación de un medicamento para inhibir y prevenir un fenotipo celular canceroso. Ahora se ha encontrado que el mecanismo mediante el cual la hipoxia y la hiponitroxia tienen un impacto sobre el fenotipo celular no está mediado necesariamente sólo por la falta de oxígeno sino más bien también por una deficiencia en la actividad mimética del óxido nítrico. En consecuencia, como se demuestra en la presente memoria, la administración de dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico es suficiente para aumentar, restaurar o mantener la actividad mimética del óxido nítrico de las células, de forma que se inhiban o se prevengan los fenotipos celulares cancerosos. De este modo, se proporcionan formulaciones para suministrar dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico a las células, a concentraciones que inhiben un fenotipo celular canceroso y/o que previenen el desarrollo de un fenotipo celular canceroso, pero que reducen o evitan el desarrollo de efectos no deseados de los agentes miméticos del NO. Estas formulaciones son particularmente útiles para tratar y prevenir el cáncer en animales.

Antecedentes de la invención

La hipoxia o una tensión de oxígeno por debajo de un valor fisiológico normal, en células, da como resultado alteraciones fisiológicas así como también patológicas en las células, alteraciones las cuales se han asociado con una expresión génica diferencial. Por ejemplo, la hipoxia afecta a la fisiología celular endotelial in vivo e in vitro de diversas formas, que incluyen la modulación de la expresión regulada transcripcionalmente de sustancias vasoactivas y de proteínas de la matriz implicadas en la modulación del tono vascular o en la reestructuración de la vasculatura y del tejido circundante (Faller, D.V. Clin. Exp. Pharmacol. and Physiol. 1999 26:74-84). Se ha demostrado que la hipoxia, en tumores sólidos, protege a las células cancerosas del exterminio mediante irradiación con rayos X, y conduce a la resistencia a ciertos fármacos del cáncer. La hipoxia también parece que acelera la progresión de tumores malignos y aumenta la metástasis (Brown, J.M. Cancer Res. 1999 59:5863-5870).

Se ha implicado al óxido nítrico en diversos procesos biológicos. Por ejemplo, el óxido nítrico es una molécula mensajera biológica responsable de la relajación vascular derivada del endotelio, y de la neurotransmisión. El óxido nítrico, al que se hará referencia como niveles elevados, también es conocido como un mediador de acciones antitumorales y antibacterianas de macrófagos. También se ha demostrado que el óxido nítrico desempeña un papel modulador sobre la expresión, inducida por citoquinas, de la metaloproteinasa 9 de la matriz y de los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (Eberhardt et al. Kidney International 2000 57:59-69).

Un gran volumen de datos clínicos y experimentales indican que el óxido nítrico también desempeña un papel promoviendo el crecimiento y la progresión de tumores sólidos. Por ejemplo, se ha implicado a la generación del óxido nítrico, mediante óxido nítrico sintasa inducible (INOS), en el desarrollo de cáncer de próstata (Klotz et al. Cancer; National Library of Medicine, MDX Health Digest 1998 82(10):1897-903), así como en adenocarcinomas del colon y adenocarcinomas de mama (Lala, P.K. y Orucevic, A., Cancer and Metastasis Reviews 1998 17:91-106). Además, se ha sugerido que el óxido nítrico desempeña un papel importante en el metabolismo y en el comportamiento de cánceres de pulmón, y en particular en adenocarcinomas (Fujimoto et al. Jpn. J. Cancer Res 1997 88:1190-1198). De hecho, se ha sugerido que las células tumorales que producen o están expuestas a lo que se denomina aquí como niveles bajos de óxido nítrico, o que las células tumorales capaces de resistir el daño mediado por el óxido nítrico, sufren una selección clonal debido a su ventaja en la supervivencia (Lala, P.K. y Orucevic, A., Cancer and Metastasis Review 1998 17:91-106). Estos autores sugieren que estas células tumorales utilizan ciertos mecanismos, mediados por el óxido nítrico, para la promoción del crecimiento, invasión y metástasis, y proponen que los fármacos que bloqueen al óxido nítrico pueden ser útiles en el tratamiento de ciertos cánceres humanos. También existen indicios que señalan que el óxido nítrico derivado de tumores promueve la angiogénesis tumoral, así como la capacidad invasora de ciertos tumores en animales, incluyendo los seres humanos (Lala, P.K. Cancer and Metastasis Reviews 1998 17:1-6).

Sin embargo, se ha descrito que el óxido nítrico invierte la producción de vasoconstrictores inducida por la hipoxia (Faller, D.G. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1999 26:74-84). Además, se ha demostrado que los dadores de óxido nítrico, nitroprusiato de sodio, S-nitroso-L-glutationa y 3-morfolinosidnonimina, en el intervalo micromolar (IC_{50} = 7,8, 211 y 490 \muM, respectivamente), suprimen la respuesta celular adaptativa controlada por el factor de transcripción, el factor 1 inducible por hipoxia, en células Hep3B cultivadas hipóxicamente, una estirpe celular de hepatoma humano (Sogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 95:7368-7373). El dador de óxido nítrico nitroprusiato de sodio (SNP; 150 \muM) también ha demostrado que disminuye la expresión, inducida por hipoxia, del factor de crecimiento endotelial vascular, un mitógeno celular endotelial requerido para el desarrollo vascular normal y para enfermedades angiogénicas patológicas tales como cáncer y neovascularización del iris y de la retina (Ghiso et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 1999 40(6):1033-1039). En estos experimentos se demostró que 150 \muM de SNP suprimían completamente los niveles de ARNm del VEGF inducidos por la hipoxia, durante al menos 24 horas, en células epiteliales retinianas humanas inmortalizadas.

Niveles elevados de óxido nítrico, cuando se inducen en ciertas células, pueden provocar citostasis y apoptosis. Por ejemplo, Xie et al. han demostrado que la exposición a niveles elevados de óxido nítrico (que producen aproximadamente 75 \muM de nitrito; véase la Figura 5A de Xie et al.) es un fenómeno que se puede explotar para promover la muerte (véanse las Figuras 6A y 6B de Xie et al.) en células de melanoma K-1735 murinos (J. Exp. Med. 1995 181:1333-1343). Además, el documento WO 93/20806 describe un método para inducir la citostasis o citotoxicidad celular al exponer a las células a un compuesto tal como el aducto monohidratado de espermina-bis(óxido nítrico), a 500 \muM, que es capaz de liberar óxido nítrico en una disolución acuosa. Se enseña que los compuestos son útiles en el tratamiento de células tumorales así como también en tratamientos antiparasitarios, antifúngicos y antibacterianos. Se sugiere el uso de un régimen de megadosificación, en el que se administra una gran dosis del compuesto liberador de óxido nítrico, se da tiempo a que el compuesto activo actúe, y entonces se administra a la persona un reactivo adecuado, tal como un depurador de óxido nítrico, para hacer inactivo al compuesto activo y para detener el daño no específico. En la página 14, líneas 25 a 30, del documento WO 93/20806, se enseña que el aducto de 3-(n-propilamino)propilamina-bis(óxido nítrico), que la sal sódica del aducto de dietilamina-bis(óxido nítrico), que la sal sódica del aducto de isopropilamina-bis(óxido nítrico), que el monohidrato del trioxodinitrato (II) de sodio y que el N-sulfonato de N-nitrosohidroxilamina no afectaron significativamente a la viabilidad celular a concentraciones de hasta
500 \muM.

La patente U.S. nº 5.840.759, la patente U.S. nº 5.837.736 y la patente U.S. nº 5.814.667 describen métodos para usar cantidades de mg/kg, de compuestos liberadores de óxido nítrico, para sensibilizar células hipóxicas, en un tumor, a la radiación. Estas patentes también describen métodos para usar los mismos compuestos liberadores de óxido nítrico, en cantidades de mg/kg, para proteger a las células o al tejido no cancerosos de la radiación, para sensibilizar células cancerosas a agentes quimioterapéuticos, y para proteger a las células o al tejido no cancerosos de los agentes quimioterapéuticos. Los compuestos usados en estos métodos liberan espontáneamente óxido nítrico en condiciones fisiológicas, sin requerir oxígeno. Esta patentes enseñan la administración del compuesto liberador de óxido nítrico desde alrededor de 15 hasta alrededor de 60 minutos antes de la terapia. Se sugiere que las dosis típicas del compuesto liberador de óxido nítrico administrado sean de alrededor de 0,1 hasta alrededor de 100 mg de uno o más compuestos liberadores de óxido nítrico por kg de peso corporal. Las concentraciones de los compuestos liberadores de óxido nítrico, DEA/NO y PAPA/NO, demostraron aumentar la sensibilidad de las células de cáncer de mama MCF7 y de los fibroblastos V79 a melfalán, tiotepa, mitomicina C, SR4233 y a cisplatino in vitro, cuando se encuentran en el intervalo milimolar, mientras que se demostró que 70 mg/kg de DEA/NO aumentan la supervivencia de los ratones a los que se les administra el agente quimioterapéutico Melfalán en el modelo de tumor de KHT in vivo.

La patente U.S. nº 5.700.830 y el documento WO 96/15781 describen métodos para inhibir la adherencia entre células cancerosas y células no cancerosas, en un animal, administrando al animal un compuesto liberador de óxido nítrico que contiene un grupo funcional N_{2}O_{2} liberador de óxido nítrico. Sin embargo, estudios recientes indican que la adhesión de las células del cáncer a la pared de los vasos, y su extensión por ella, conduciendo a la extravasación, no es un suceso obligatorio en la metástasis (Morris et al. Exp. Cell. Res. 1995 219:571-578).

El documento WO 98/58633 describe una terapia de microdosis de óxido nítrico para aliviar patologías vasculares asociadas con una reducción en la producción de óxido nítrico, o con una atenuación del efecto del óxido nítrico.

Sumitani et al., Anticancer Research, 17(2A), 197, 865-871, enseña que el nitroprusiato de sodio (SNP) induce apoptosis de células NA. Como se enseña en la descripción, los niveles elevados de óxido nítrico, cuando se inducen en ciertas células, pueden provocar apoptosis. Sumitani et al. enseña que niveles elevados de NO_{2} provocan apoptosis de las células NA, y la disminución de proto-oncogenes de c-myc y c-myb.

Umansky et al., International Journal of Oncology, 16(1), 2000, 109-117, enseña que la apoptosis inducida por NO, en diferentes células linfoides neoplásicas humanas, requiere cambios en las funciones mitocondriales, y es independiente de CD95.

Umansky et al., International Journal of Oncology, 10(3), 1997, 465-471, describe que la activación de células endoteliales bovinas, con el factor de necrosis tumoral a in vitro, conduce a la estimulación de la síntesis de NO, dando como resultado la apoptosis de las células tratadas.

Dookeran, Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, 41, 2000, 280, enseña que la preparación de liberación sostenida de nitroprusiato en etiodol da como resultado la falta de supervivencia celular in vitro, y sugiere que tanto los mecanismos antitumorales del NO como la producción de CN contribuyen a este efecto.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es el uso de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico en la preparación de un medicamento para inhibir y prevenir un fenotipo celular canceroso, en el que dicha dosis baja es 3 a 10.000 veces más baja que una dosis de agente mimético del óxido nítrico que produce vasodilatación.

Estos medicamentos son particularmente útiles para controlar el cáncer mediante la reducción de su crecimiento y de la mejora de la respuesta a la terapia. Por ejemplo, los medicamentos preparados según la presente invención pueden inhibir la metástasis, la capacidad invasora y la progresión de células que muestran un fenotipo canceroso. Además, los medicamentos pueden inducir o mantener la latencia de células que muestran un fenotipo canceroso en sitios primarios así como también secundarios de tumores. Además, estos medicamentos pueden prevenir o disminuir el desarrollo de resistencia de células que muestran un fenotipo celular canceroso a modalidades terapéuticas anticancerosas, así como pueden aumentar la eficacia de modalidades terapéuticas anticancerosas.

Los medicamentos preparados según la presente invención también son muy útiles para prevenir un fenotipo celular canceroso que se puede desarrollar en células con la exposición de las células a condiciones y/o a agentes terapéuticos que conducen a una deficiencia en la actividad mimética del óxido nítrico en las células.

Los medicamentos preparados según la presente invención también son útiles inhibiendo el desarrollo de un fenotipo celular canceroso más agresivo, en células del cáncer, lo que puede ocurrir con la exposición a factores que inducen tal desarrollo.

Además, estos medicamentos son útiles en el diagnóstico y en la monitorización de un fenotipo celular canceroso, en un animal, vía la detección de niveles de uno o más marcadores indicadores de un fenotipo celular canceroso tras la administración de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico. La falta de cambio, la disminución o la desaceleración en el aumento del nivel de uno o más de estos marcadores, en un animal, tras la administración de una dosis baja de agente mimético del óxido nítrico, según se compara con el nivel del marcador en el animal antes de la administración de la dosis baja de agente mimético del óxido nítrico, es indicativo de un fenotipo celular canceroso en el animal.

En consecuencia, la presente invención proporciona nuevos medicamentos terapéuticos y de diagnóstico para el tratamiento y la prevención del cáncer en animales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un histograma que muestra el efecto de GTN y SNP sobre la invasión in vitro mediante células de cáncer de mama invasivas MDA-MB-231 en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}), según se compara con las condiciones normales (20% de O_{2}). Las células se revistieron sobre membranas revestidas con MATRIGEL, y se incubaron en condiciones hipóxicas o en condiciones normales, solas o en presencia de agentes miméticos del óxido nítrico. El índice de invasión (% de control), que se toma como una medida del potencial invasivo de las células para cada tratamiento, se determinó tiñendo a las células que invadieron a través de la membrana, y contándolas. La primera barra representa el índice de invasión de células cultivadas en condiciones normales (20% de O_{2}). La segunda barra representa el índice de invasión de células cultivadas en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}). La tercera barra representa el índice de invasión de células cultivadas en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}) y a las que se les ha administrado 10^{-10} M de SNP. La cuarta barra representa el índice de invasión de células cultivadas en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}) y a las que se les ha administrado 10^{-11} M de GTN. Los valores indicados mediante "*" fueron significativamente diferentes (p < 0,05, n = 6) usando el test post-hoc de Student-Newman-Keuls para procedimientos de comparación múltiple por parejas.

La Figura 2 es un histograma que muestra la capacidad de colonización del pulmón de las células de melanoma de ratón B16F10, incubadas durante 12 horas en 1% o 20% de O_{2}, en presencia o ausencia de 2 x 10^{-11} M de GTN, y que se han inyectado i.v. (vena de la cola) en ratones hembra C57B16. Catorce días después, los ratones se sacrificaron, y los pulmones se retiraron y se fijaron en fijador de Bouin. Ambas colonias metastásicas melanóticas y amelanóticas se contaron en un microscopio de disección. La primera barra representa el número de nódulos observados en los pulmones de ratones a los que se les han inyectado células cultivadas en condiciones normales (20% de O_{2}). La segunda barra representa el número de nódulos observados en los pulmones de ratones a los que se les han inyectado células cultivadas en condiciones normales (20% de O_{2}) y a los que se les ha administrado 2 x 10^{-11} M de GTN. La tercera barra representa el número de nódulos observados en pulmones de ratones a los que se les han inyectado células en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}). La cuarta barra representa el número de nódulos observados en pulmones de ratones a los que se les han inyectado células cultivadas en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}) y a los que se les ha administrado 2 x 10^{-11} M de GTN.

La Figura 3 muestra los niveles de antígeno específico de la próstata (PSA) circulante, en dos pacientes, el paciente A (Figura 3A) y el paciente B (Figura 3B), que han sufrido una prostatectomía radical. En ambos pacientes se observó una fuerte disminución en los niveles de PSA plasmáticos en los dos meses de administración de la terapia con agentes miméticos del NO de dosis baja. Los niveles de PSA plasmáticos se midieron usando un radioinmunoensayo que tiene una exactitud de \pm 0,1 ng/ml.

Descripción detallada de la invención

Ahora se ha demostrado que el mecanismo mediante el cual la hipoxia y la hiponitroxia tienen impacto sobre fenotipos celulares no está mediado solamente debido a la falta de oxígeno sino más bien también por una deficiencia en la actividad mimética del óxido nítrico. Además, ahora se ha demostrado que la administración de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico es suficiente para aumentar, restaurar o mantener niveles de actividad mimética del óxido nítrico de las células, de forma que se inhiba o se prevenga un fenotipo celular canceroso. Esta inhibición y prevención ocurre incluso cuando las células están en un medioambiente hipóxico, y/o cuando se combinan con la inhibición de la producción de óxido nítrico endógeno. La administración de dosis muy bajas de agentes miméticos del óxido nítrico, incluso en condiciones de niveles notablemente reducidos de oxígeno (1% de O_{2}), fue capaz de prevenir la generación de un fenotipo celular canceroso y de inhibir un fenotipo celular canceroso de células.

En consecuencia, la presente invención se refiere al uso de una terapia de agentes miméticos del óxido nítrico de dosis baja en la preparación de un medicamento para inhibir y prevenir un fenotipo celular canceroso de células. Los medicamentos proporcionan nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento y la prevención del cáncer en animales. Para los fines de la presente invención, por "tratamiento" o "tratar" se quiere englobar todos los medios para controlar el cáncer, reduciendo el crecimiento de células que muestran un fenotipo celular canceroso, y para mejorar la respuesta a modalidades terapéuticas anticancerosas. De este modo, por "tratamiento" o "tratar" se quiere decir que se inhibe la supervivencia y/o el crecimiento de células que muestran un fenotipo celular canceroso, que se previene la supervivencia y/o el crecimiento de células que muestran un fenotipo celular canceroso, que se disminuye la capacidad invasora de las células que muestran un fenotipo celular canceroso, que se disminuye la progresión de células que muestran un fenotipo celular canceroso, que se disminuyen las metástasis de células que muestran un fenotipo celular canceroso, que se aumenta la regresión de células que muestran un fenotipo celular canceroso, y/o que se facilita el exterminio de células que muestran un fenotipo celular canceroso. "Tratamiento" o "tratar" también engloba el mantenimiento, en un estado latente en sus sitios primarios así como secundarios, de células que muestran un fenotipo celular canceroso. Además, por "tratar" o "tratamiento" se quiere decir aumentar la eficacia así como prevenir o disminuir la resistencia a modalidades terapéuticas anticancerosas. Por "modalidades terapéuticas anticancerosas" se incluyen, pero no se limitan a, terapias por radiación, terapias térmicas, inmunoterapias, quimioterapias, y otras terapias usadas por los expertos en la materia en el tratamiento del cáncer y de otros tumores malignos. Por "aumentar la eficacia" se incluye un aumento de la potencia y/o de la actividad de la modalidad terapéutica anticancerosa, y/o una disminución en el desarrollo de resistencia a la modalidad terapéutica anticancerosa. Los métodos para monitorizar y/o diagnosticar fenotipos celulares cancerosos en un animal, vía la medición de marcadores selectivos de tumores en un animal, se pueden realizar en presencia de una terapia con agentes miméticos del NO de dosis baja. Los marcadores tumorales ejemplares, útiles en la monitorización y diagnóstico de la progresión tumoral y de las metástasis, incluyen, pero no se limitan a, antígeno específico de la próstata (PSA) para el cáncer de próstata, antígeno carcinoembriónico (CEA) para el cáncer gastrointestinal, \alpha-fetoproteína y \betaHCG para el cáncer testicular, CA19-9 y CA72-4 para el cáncer gástrico, CA15-3 para el cáncer de mama, y los receptores de la superficie celular para estrógenos y Her-2 para el cáncer de mama. Marcadores adicionales que se pueden monitorizar con fines de diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, Proteína Regulada por OXÍgeno-1 (PROXY-1), también conocida como NDRG-1, el inhibidor del activador de plasminógeno (PAI-1), el receptor del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR), y el factor de crecimiento endotelial vascular 1 (VEGF). Además, como se comprenderá por los expertos en la materia al leer esta descripción, también se pueden monitorizar marcadores tumorales adicionales a los ejemplificados en la presente memoria. El marcador tumoral puede ser detectable en un fluido biológico, tal como un suero, plasma u orina. La falta de cambio, una disminución o una desaceleración en el aumento del nivel de uno o más de estos marcadores, en un animal, tras la administración de un agente mimético del óxido nítrico de dosis baja, según se compara con el nivel del marcador en el animal antes de la administración del agente mimético del óxido nítrico de dosis baja, es indicativo de un fenotipo celular canceroso en el animal.

Para los fines de la presente invención, la expresión "dosis baja" significa una cantidad 3 a 10.000 veces menor que una dosis de óxido nítrico que produce vasodilatación, y tal cantidad es capaz de aumentar, restaurar o mantener un nivel de actividad mimética del óxido nítrico, a las células, que inhibe o previene fenotipos celulares cancerosos y/o que aumenta la eficacia de una modalidad terapéutica anticancerosa coadministrada con el agente mimético del NO de dosis baja. A esta dosis baja, no se producen los efectos relacionados conocidos de los agentes miméticos del NO en animales sin un fenotipo celular canceroso. Como se comprenderá por los expertos en la materia al leer esta descripción, el agente mimético del óxido nítrico aumenta, restaura o mantiene la actividad tanto en la célula como alrededor de ella (es decir, en el microentorno celular).

Se han descrito métodos para determinar los niveles de óxido nítrico de las células, basándose en los niveles de nitrito, de nitrato y de S-nitrosotiol en el cultivo celular, así como en el plasma y en el suero. Se han dado a conocer los niveles de nitrato en suero o en plasma, en voluntarios normales sanos, para mostrar un nivel medio de óxido nítrico de 33,4 \pm 8,9 \muM con un intervalo de 14 a 60 \muM (Marzinzig et al. Nitric Oxide: Biology and Chemistry 1987 1(2): 177-189). Sin embargo, estos niveles se basan en productos finales de NO sintasa que se acumulan, y de este modo es probable que representen un sobrestimado de los niveles de óxido nítrico fisiológico normales. Los niveles medidos dados a conocer también varían dependiendo del método seleccionado para su medición. Además, los niveles de nitrito y de nitrato en el plasma o en el suero no son representativos solamente de una producción de NO del paciente. Basándose en experimentos, se cree que los niveles fisiológicos normales de actividad mimética del óxido nítrico de las células pueden ser menores, por ejemplo al menos 5 veces, y preferiblemente 10 a 10.000 veces menores, que los dados a conocer en la técnica, dependiendo de la célula.

La terapia a corto plazo con agentes miméticos del óxido nítrico generalmente se administra a niveles que aumentan la actividad mimética del óxido nítrico de las células, por encima de los niveles fisiológicos normales. Sin embargo, cuando se desea generalmente una terapia a más largo plazo, se hacen preocupantes la inducción de tolerancia frente al agente mimético del NO, y los efectos secundarios. De este modo, en la presente invención, la cantidad de mimético del óxido nítrico usada en la preparación del medicamento es baja, para retrasar y/o reducir el desarrollo de tolerancia al agente mimético del NO, y/o reducir los efectos secundarios indeseados cuando se administra el medicamento. Por ejemplo, se sabe que la administración de óxido nítrico, o de compuestos que suministran óxido nítrico, a seres humanos, a las dosis empleadas convencionalmente para tratar patologías cardiovasculares (es decir, GTN a 0,2 mg/h o superior) mediante vasodilatación, puede provocar respuestas vasodilatadoras potentes, así como el desarrollo de tolerancia al fármaco frente a GTN con la administración repetida. A menudo tal administración se ve acompañada de un número de efectos secundarios indeseables que incluyen cefalea, rubefacción e hipotensión. Por el contrario, en la presente invención, la dosis de agente mimético del óxido nítrico usada en la preparación del medicamento, para inhibir y prevenir un fenotipo celular canceroso, es 3 a 10.000 veces menor, preferiblemente al menos 100 hasta al menos 10.000 veces menor, que las dosis usadas típicamente en otras aplicaciones terapéuticas tales como vasodilatación, y de este modo no induce tolerancia al agente mimético del NO tan rápidamente, ni induce efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, cuando se usan los agentes miméticos del óxido nítrico nitroprusiato de sodio (SNP) y trinitrato de glicerilo (GTN), se ha demostrado ahora que se pueden usar cantidades que oscilan entre 10^{-12} y 10^{-10} M, en el medioambiente celular, para prevenir e inhibir un fenotipo celular canceroso. Además, basándose en los resultados de estos experimentos, se cree que las dosis de SNP tan bajas como 10^{-14} M serían eficaces previniendo e inhibiendo un fenotipo celular canceroso en entornos menos hipóxicos o hiponitróxicos. La Tabla 1 proporciona ejemplos adicionales de diversas dosis menores preferidas para los agentes miméticos del óxido nítrico útiles en la presente invención, así como las dosis más elevadas comparativas usadas en terapia de vasodilatación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Como comprenderán los expertos en la materia al leer esta descripción, también se pueden administrar cantidades de agentes miméticos del óxido nítrico menores o mayores que las ejemplificadas en la presente memoria, basándose en la eficacia del agente mimético del óxido nítrico para lograr el fin último de aumentar, restaurar o mantener la actividad mimética del óxido nítrico de las células, de forma que se prevenga o se inhiba un fenotipo canceroso sin la tolerancia farmacéutica sustancial al agente mimético del NO que se desarrolla, y sin los efectos secundarios indeseados. La determinación de las cantidades de agente mimético del óxido nítrico a incorporar en las formulaciones de dosis baja de la presente invención se puede realizar de forma normal por los expertos en la materia basándose en las enseñanzas proporcionadas aquí.

Mediante la expresión "inhibir y prevenir", como se usa en este documento, se quiere decir reducir, invertir o aliviar, mejorar, normalizar, controlar o manejar un estado biológico. De este modo, inhibir y prevenir un fenotipo celular canceroso, según la presente invención, se refiere a prevenir el desarrollo, invertir o mejorar el desarrollo, y/o normalizar, controlar o manejar el desarrollo de un fenotipo celular canceroso. En consecuencia, la administración de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico se puede usar tanto (1) profilácticamente para inhibir y prevenir que se desarrolle un fenotipo celular canceroso en animales con riesgo elevado de desarrollar cáncer, o expuestos a un factor que se sabe disminuye la actividad mimética del óxido nítrico de las células, como (2) para tratar el cáncer en animales, inhibiendo las metástasis y el desarrollo de resistencia a modalidades terapéuticas anticancerosas, y aumentando la eficacia de las modalidades terapéuticas anticancerosas.

Según el Diccionario Médico de Stedman, canceroso se define como: 1. Resistente al tratamiento; que aparece en forma grave, y frecuentemente mortal; que tiende a empeorar y que conduce a una evolución de gravedad creciente; 2. Con referencia a una neoplasia, se define por tener la propiedad de crecimiento localmente invasivo y destructivo, y metástasis. Según esta definición, para los fines de la presente invención, por "fenotipo celular canceroso" se engloban los aumentos en la metástasis, la resistencia a modalidades terapéuticas anticancerosas, y la angiogénesis. Por "fenotipo celular canceroso", para los fines de la presente invención, también se quiere decir que se incluyen estados en el espectro que conducen a un comportamiento canceroso y a la capacidad invasora anormal tal como hiperplasia, hipertrofia y displasia, así como a aquellas células y tejidos que facilitan el proceso canceroso. Los ejemplos de estados en este espectro incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia prostática benigna y embarazo molar.

Como se evidencia mediante los datos presentados en este documento, la inhibición y la prevención de un fenotipo celular canceroso en células se pueden determinar de forma normal examinando la expresión de genes que incluyen, pero no se limitan a, uPAR, PSA, PAI-1, PROXY-1 y VEGF, examinando la capacidad invasora de las células en ensayos in vitro o in vivo, y/o examinando la resistencia de las células a modalidades terapéuticas anticancerosas. Se cree que se puede observar una expresión y/o una actividad elevada de fosfodiesterasa en células con un fenotipo celular canceroso. Los métodos para medir la expresión de estos genes se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 99/57306. Como entenderán los expertos en la materia al leer esta descripción, sin embargo, también se pueden usar otros métodos para determinar la expresión génica, vía la medición de una proteína expresada, o fragmentos proteolíticos de la misma.

Para los fines de la presente invención, la expresión "agente mimético del óxido nítrico" pretende significar óxido nítrico, o un equivalente funcional del mismo; cualquier compuesto que imita los efectos del óxido nítrico, genera o libera óxido nítrico a través de biotransformación, genera óxido nítrico espontáneamente, o libera espontáneamente óxido nítrico; cualquier compuesto que de cualquier otra manera genera óxido nítrico o un resto de tipo óxido nítrico, o activa otras etapas de la ruta del NO; o cualquier compuesto que permite o facilita la utilización del NO por la célula, cuando se administra a un animal. Tales compuestos también se pueden denominar como "dadores de NO", "profármacos de NO", "agentes productores de NO", "compuestos que suministran NO", "agentes generadores de NO" y "suministradores de NO". Los ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a: organonitratos tales como nitroglicerina (GTN), 5-mononitrato de isosorbida (ISMN), dinitrato de isosorbida (ISDN), tetranitrato de pentaeritritol (PETN), tetranitrato de eritritilo (ETN); derivados de aminoácidos tales como N-hidroxil-L-arginina (NOHA), N^{6}-(2-iminoetil)lisina (L-NIL), L-N^{5}-(1-iminoetil)ornitina (LN-NIO), N^{\omega}-metil-L-arginina (L-NMMA), y S-nitrosoglutationa (SNOG); y otros compuestos que generan o liberan NO en condiciones fisiológicas, tales como S,S-dinitrosoditiol (SSDD), [N-[2-(nitroxietil)]-3-piridincarboxamida (Nicorandil), nitroprusiato de sodio (SNP), S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), 3-morfolino-sidnonimina (SIN-1), molsidomina, NONOato(2-óxido de 2-(N,N-dietilamino)-diazenolato) de DEA, y NONOato (N-[4-[1-(3-aminopropil)-2-hidroxi-2-nitrosihidrazino)butil-1,3-propanodiamina) de espermina. Los nitratos orgánicos GTN, ISMN, ISDN, ETN, y PETN, así como Nicorandil (conocido habitualmente como un abridor de los canales de potasio), están comercialmente disponibles en formas de dosificación farmacéuticas. Los compuestos SIN-1, SNAP, S-tioglutationa, L-NMMA, L-NIL, L-NIO, NONOato de espermina y NONOato de DEA están comercialmente disponibles de Biotium, Inc. Richmond, CA. Como se usa en este documento, la expresión "agente mimético del óxido nítrico" también pretende significar cualquier compuesto que actúa como un agente mimético de la ruta del óxido nítrico, que tiene actividad parecida al óxido nítrico, o que imita el efecto del óxido nítrico. Tales compuestos pueden no liberar, generar o proporcionar necesariamente óxido nítrico, pero tienen un efecto similar al óxido nítrico en una ruta que se ve afectada por el óxido nítrico. Por ejemplo, el óxido nítrico tiene efectos tanto dependientes de GMP cíclico como independientes de GMP cíclico. Se sabe que el óxido nítrico activa la forma soluble de guanilil ciclasa, aumentando de ese modo los niveles intracelulares del segundo mensajero GMP cíclico y otras interacciones con otros segundos mensajeros intracelulares tales como AMP cíclico. Como tales, los compuestos que activan directamente a la guanilil ciclasa en partículas o a la guanilil ciclasa soluble, tales como los péptidos natriuréticos (ANP, BNP y CNP), 3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-bencilindazol (YC-cGMP o YC-1) y 3',5'-monofosfato de 8-(4-clorofeniltio)guanosina cíclico (8-PCPT-cGMP), también son ejemplos de agentes miméticos del NO. Sin embargo, en algunas realizaciones de la presente invención, se prefiere que el agente mimético del NO no abarque un compuesto que activa directamente guanilil ciclasa en partículas o soluble. La actividad mimética del óxido nítrico engloba aquellos procesos o rutas de transducción de señales que comprenden al menos una molécula efectora que se une al agente mimético del NO, tal como, por ejemplo, guanilil ciclasa y otras proteínas que contienen el grupo hemo. Los ejemplos de agentes que funcionan como agentes miméticos del NO, permitiendo o facilitando la utilización del NO por la célula, son compuestos que inhiben la actividad y/o expresión de la fosfodiesterasa, tales como los inhibidores de la fosfodiesterasa.

En una realización preferida de la presente invención, se administran más de un agente mimético del NO. En esta realización se prefiere que los agentes miméticos del NO se dirijan contra o actúen sobre diferentes partes de la ruta del NO de la célula. Por ejemplo, se puede coadministrar un dador de NO con un compuesto que inhiba la degradación de nucleótidos cíclicos (por ejemplo, cAMP o cGMP), tal como un inhibidor de fosfodiesterasa. Los inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) preferidos, útiles como agentes miméticos del NO, son aquellos que inhiben PDE-1 a PDE-5.

El término "hiponitroxia" pretende significar, en la presente invención, condiciones en las que los niveles de actividad mimética del óxido nítrico son menores que los niveles fisiológicos normales para este tipo de célula.

Para los fines de la presente invención, el término "animal" incluye a todos los mamíferos, y en particular a los seres humanos. Preferiblemente, los agentes miméticos del NO se administran a un animal con riesgo o que sufre un fenotipo celular canceroso. Tales animales también se denominan en este documento como sujetos o pacientes que necesitan de tratamiento.

Se ha correlacionado a los niveles bajos de oxígeno con un aumento del nivel de invasión celular y de capacidad invasora. El esfuerzo hipóxico provoca una variedad de adaptaciones celulares, que a menudo se manifiestan en el aumento de ciertos genes.

Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles de ARNm de uPAR y de proteína del uPAR de la superficie celular aumentan en condiciones hipóxicas. El uPAR es un receptor de la superficie celular de elevada afinidad para el activador de plasminógeno de tipo pro-uroquinasa (pro-uPA). Al unir el pro-uPA a uPAR, el pro-uPA inactivo, de cadena sencilla, se rompe en su forma activa, de dos cadenas. La enzima activada, aún unida al receptor, actúa entonces para convertir el plasminógeno a plasmina, que finalmente degrada varios componentes de la matriz extracelular (ECM). El uPA activo también sirve para activar tanto a metaloproteinasas latentes como a factores de crecimiento. El uPAR también sirve como receptor para la molécula de ECM, la vitronectina. Estas funciones, juntas, aumentan la invasión celular y el potencial invasor. Se ha sugerido una correlación positiva entre el aumento de uPAR inducido por hipoxia y la capacidad invasora de células carcinómicas (Graham et al. Int. J. Cancer 1999 80:617-623). Además, ahora se ha mostrado que la hiponitroxia inducida por la administración del antagonista de óxido nítrico sintasa L-NMMA (0,5 mM), en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}) y no hipóxicas (5% y 20% de O_{2}), aumenta los niveles de ARNm de uPAR en células MDA-MD-231 humanas incubadas durante 24 horas a 37ºC.

También se ha demostrado que el PAI-1 se ve estimulado en condiciones hipóxicas. Véase el documento WO 99/57306. Además, esta estimulación estuvo acompañada de una disminución de la adherencia celular. El PAI-1 es una glicoproteína de ECM de 52 kDa que se produce por una variedad de células normales y cancerosas. Esta glicoproteína es un regulador de la actividad del activador del plasminógeno. Funciona inhibiendo uPA, tanto libre como enlazado, a través de la formación de complejos covalentes irreversibles. También se ha mostrado que el PAI-1 compite con el uPAR por unirse al mismo dominio de la vitronectina. Como tal, el PAI-1 es capaz de liberar células unidas a placas revestidas con vitronectina. Los estudios han mostrado que se requiere el PAI-1 para la capacidad invasora óptima in vitro de células carcinómicas pulmonares.

Se ha demostrado también que la hipoxia aumenta la resistencia de las células a agentes citotóxicos. Se identificó el gen para PROXY-1 usando una presentación diferencial, basada en RT-PCR, tras el cultivo de una variedad de tipos celulares sometidos a cantidades bajas de oxígeno. Véase el documento WO 99/57306. Se cree que la proteína de PROXY-1 de 43 kDa desempeña un papel en la protección de las células frente a los ataques, incluyendo la hipoxia, agentes que dañan el ADN, agentes citotóxicos y falta de glucosa, puesto que se observa un aumento de la expresión de PROXY-1 como respuesta a cada uno de estos estímulos dañinos. Junto con el hecho de que este gen es expresado por una variedad de tipos celulares no relacionados, este tipo de expresión génica es indicativo de que la PROXY-1 es un "interruptor" universal implicado en los sucesos iniciales que conducen a adaptaciones celulares a la hipoxia.

Ahora se ha encontrado que el óxido nítrico es un mediador principal de respuestas adaptativas celulares a cambios en los niveles de oxígeno en la célula y alrededor de ella. Mediante la administración de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico, se ha demostrado que se puede aumentar, restaurar o mantener la actividad mimética del óxido nítrico a un nivel que inhibe o previene un fenotipo celular canceroso. Por el contrario, el efecto del mantenimiento de niveles bajos de oxígeno en las células se limitó a la inhibición de los niveles basales de la producción de óxido nítrico endógena.

En condiciones hipóxicas en las que los niveles de oxígeno son limitados, ahora se ha demostrado que las estirpes celulares cancerosas adquieren una o más de las siguientes propiedades fenotípicas celulares cancerosas: aumentan su capacidad de colonización del pulmón tras su inoculación i.v. en ratones genéticamente idénticos (metástasis experimental); aumentan su capacidad invasora a través de la matriz extracelular in vitro (también pertinente a la metástasis); y se hacen más resistentes al fármaco quimioterapéutico doxorrubicina. En estos experimentos, las células cancerosas se expusieron a 1% de O_{2} (pO_{2} de 10-15 mmHg) para inducir hipoxia, y se compararon con células cancerosas no hipóxicas expuestas a 5-20% de O_{2} (30-160 mmHg). Al administrar dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico (durante períodos en los que los niveles de oxígeno están limitados, y/o cuando se inhibe la producción endógena de óxido nítrico), se previene la adquisición de estos cambios fenotípicos cancerosos. Esta prevención ocurre incluso cuando las células están en un medioambiente extremadamente hipóxico.

Ahora se ha demostrado que dosis bajas de los agentes miméticos del óxido nítrico SNP y/o trinitrato de glicerilo (GTN) inhiben el aumento, debido a la hipoxia, de uPAR y de PAI-1, así como de PROXY-1. También es de esperar que una terapia similar con agentes miméticos del óxido nítrico de dosis baja sea eficaz inhibiendo el aumento hiponitróxico de estos genes, tal como el observado en células tratadas con L-NMMA (0,5 mM), es decir, inhibiendo y previniendo un fenotipo celular canceroso.

Los experimentos realizados en células de cáncer de mama humano, cultivadas en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}), mostraron que el tratamiento de las células hipóxicas con 10^{-12} M de SNP redujo significativamente los niveles de ARNm de uPAR, comparados con células hipóxicas de control no tratadas y con células hipóxicas tratadas con 10^{-8} M de SNP. De forma similar, el tratamiento de células de cáncer de mama, cultivadas en condiciones hipóxicas, con el agente mimético del óxido nítrico GTN a dosis bajas de 10^{-11} M y 10^{-10} M redujo significativamente los niveles de ARNm de uPAR en las células hipóxicas, comparados con células hipóxicas no tratadas y con células hipóxicas tratadas con GTN a 10^{-9} M, 10^{-8} M, 10^{-7} M, 10^{-6} M y 10^{-5} M. De hecho, los niveles de ARNm de uPAR, en células de cáncer de mama hipóxicas tratadas con 10^{-11} M de GTN y con 10^{-10} M de GTN, fueron similares a los niveles de ARNm de uPAR medidos en células cultivadas en condiciones no hipóxicas (20% de O_{2}). Los niveles de ARNm de uPAR, en células hipóxicas tratadas con GTN a 10^{-6} M y 10^{-5} M, fueron similares a los niveles de células hipóxicas no tratadas, sugiriendo una tolerancia al agente mimético del NO. También se observó una reducción en los niveles de la proteína de uPAR en estas células, 24 horas después de la incubación con estos agentes miméticos del óxido nítrico.

Experimentos adicionales con células de trofoblastos invasivas humanas (HTR-8/SVneo) confirmaron la capacidad de las dosis bajas de estos agentes miméticos del óxido nítrico para disminuir la expresión de uPAR en células hipóxicas.

También se examinaron los efectos del tratamiento de células de trofoblastos invasivas HTR-8/SVneo con el agente mimético del óxido nítrico GTN sobre los niveles de ARNm de PROXY-1. Los niveles de ARNm de PROXY-1 fueron muy bajos en células cultivadas en 20% de O_{2}. Sin embargo, los niveles de ARNm de PROXY-1 aumentaron en células cultivadas en 1% de O_{2} que no se trataron, o que se trataron con 10^{-7} M de GTN. Por comparación, los niveles de PROXY-1 fueron mucho menores en células hipóxicas tratadas con una dosis baja, 10^{-11} M de GTN.

Además, se examinaron los efectos de los agentes miméticos del óxido nítrico SNP y GTN sobre los niveles de ARNm de PAI-1 en células de cáncer de mama. Nuevamente, el tratamiento de las células hipóxicas con dosis bajas de los agentes miméticos del óxido nítrico SNP (10^{-12} M) y GTN (10^{-11} M) disminuyó significativamente los niveles de ARNm de PAI-1 comparados con las células hipóxicas no tratadas.

También se realizaron experimentos para averiguar los efectos de dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico sobre los niveles de metaloproteinasa. Se incubaron células de cáncer de mama en condiciones hipóxicas o de control, en presencia de concentraciones variables de SNP o GTN. El tratamiento de las células hipóxicas con dosis bajas, 10^{-11} M de GTN y 10^{-12} M de SNP, de un agente mimético del óxido nítrico dio como resultado una disminución de las metaloproteinasas segregadas de las células, según se compara con células hipóxicas no tratadas.

Funcionalmente, se mostró entonces que la inhibición del aumento hipóxico de estos genes daba como resultado una disminución en la capacidad invasora celular y en la resistencia al fármaco. También se analizó la capacidad invasora de células en condiciones hipóxicas, en presencia o en ausencia de agentes miméticos del óxido nítrico, usando cámaras de invasión MATRIGEL (cámaras Boyden modificadas). En estos ensayos de invasión in vitro, las células de cáncer de mama (véase la Figura 1) o los trofoblastos invasivos HTR-8/SVneo se colocaron en placas sobre membranas revestidas con MATRIGEL. Las células se incubaron entonces en condiciones hipóxicas o en condiciones normales, solas o en presencia de agentes miméticos del óxido nítrico. El índice de invasión para cada tratamiento se determinó tiñendo las células que invadieron a través de la membrana, y contándolas. En ambas estirpes celulares, el tratamiento con dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico redujo significativamente la capacidad invasora de células hipóxicas, según se compara con células hipóxicas no tratadas. Los índices invasivos de células de cáncer de mama hipóxicas, tratadas con 10^{-10} M de SNP y 10^{-11} M de GTN, fueron similares o incluso menores que los de las células cultivadas en condiciones no hipóxicas. En células de trofoblastos HTR-8/SVneo, la concentración de 10^{-7} M de GTN inhibió la capacidad invasora de células hipóxicas en un 56,2%, mientras que la concentración de 10^{-8} M de SNP inhibió la capacidad invasora en un 63,4%.

Después se confirmó la capacidad de dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico para inhibir las metástasis de células tumorales en animales. En un primer conjunto de experimentos, se demostró la capacidad de las condiciones hipóxicas para aumentar el número de las metástasis. En estos experimentos, se administró a los ratones, vía una inyección en la vena de la cola, un bolo de células melanómicas metastásicas. Inmediatamente después de la inyección, los ratones se dividieron en dos grupos. El primer grupo se colocó en una cámara con un flujo continuo de una mezcla de gases que comprende 21% de O_{2} (aire ambiente). El segundo grupo se colocó en un medioambiente hipóxico, con sólo 10% de O_{2}. Después de 24 horas, los dos grupos se retiraron y se colocaron en jaulas normales mantenidas a aire ambiental. Después de 14 días, los animales se sacrificaron, y se contaron los nódulos metastásicos en los pulmones de los animales. Los animales en el medioambiente hipóxico tuvieron un número estadísticamente mayor, de 2 veces, de nódulos pulmonares, según se compara con animales en el medioambiente no hipóxico.

En un segundo conjunto de experimentos, se inyectó a los ratones con células melanómicas de ratón que se preincubaron durante 12 horas en 1% o 20% de O_{2}, en presencia o en ausencia de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico (GTN; 2 x 10^{-11} M). Después de catorce días, los ratones se sacrificaron, y los pulmones se observaron visualmente en busca de nódulos metastásicos. Además, se comparó el número de nódulos pulmonares en estos ratones. Los pulmones de los animales a los que se les habían administrado células melanómicas hipóxicas y células melanómicas no hipóxicas, tratadas con el agente mimético del óxido nítrico antes de la inyección, mostraron nódulos metastásicos estadísticamente menores en número, según se compara con animales a los que se les han administrado células melanómicas hipóxicas y no hipóxicas no tratadas (véase la Figura 2). Específicamente, el pretratamiento in vitro con 2 x 10^{-11} M de GTN disminuyó, en un 85%, la formación de nódulos pulmonares estimulada por hipoxia, e, incluso en 20% de oxígeno, el pretratamiento con GTN redujo el grado de la metástasis en más de 60%. De hecho, se encontró que la supresión de la formación de nódulos pulmonares mediante el pretratamiento con GTN es equivalente independientemente de los niveles de oxigenación in vitro. Además, el tratamiento de las células con L-NMMA, antes de la inoculación en los ratones, dio como resultado un aumento global del 63% en el número de nódulos pulmonares (p < 0,01; prueba de Fisher post hoc). El tratamiento concomitante, que usa GTN (10^{-10} M) y L-NMMA, atenuó esta respuesta metastásica en un 60% (p < 0,0005). La distribución de frecuencias de nódulos pulmonares en estos tres grupos experimentales osciló de 0 a 111. No se encontraron nódulos pulmonares en dos de los ratones del control, y en cuatro de los ratones tratados con GTN. La caracterización de la frecuencia de los nódulos pulmonares, mediante tertiles, reveló un patrón consistente de supresión en todo el grupo tratado con el agente mimético del NO, comparado con el grupo tratado con L-NMMA. Además, la metástasis en el grupo tratado con GTN fue significativamente menor, incluso de los niveles del control en el tertil más alto. Tomados en conjunto, estos datos indican que los niveles de NO, y no del propio oxígeno, determinan la gravedad del fenotipo metastásico. Además, el efecto del tratamiento con GTN de baja concentración, sobre la formación de nódulos pulmonares, no fue debido a un efecto no específico citotóxico o inhibidor del crecimiento sobre las células, puesto que tuvieron una capacidad formadora de colonias in vitro similar a la de las células no tratadas.

Como comprenderán los expertos en la materia al leer esta descripción, los resultados de estos estudios en este modelo murino se pueden usar para predecir los procesos de distribución, metabolismo y eliminación de un fármaco en otras especies, incluyendo los seres humanos, para definir la equivalencia farmacocinética en diversas especies, incluyendo los seres humanos, y diseñar los regímenes de dosificación para otros modelos animales experimentales y para estudios clínicos con seres humanos. Tal gradación farmacocinética se realiza de forma normal basándose en los datos tales como los proporcionados en este documento, según se pone en evidencia mediante las referencias tales como Mordenti, J. J. Pharm. Sci. 1986 75 (11):1028-1040.

Además, se demostró la capacidad de un agente mimético del NO para reducir la progresión de la enfermedad en seres humanos. En este estudio, se usaron parches transdérmicos continuos para suministrar dosis muy bajas de GTN (0,033 mg/hora) a pacientes con adenocarcinoma prostático recidivante. Para este estudio se seleccionaron pacientes con adenocarcinoma prostático, debido a que la progresión de este tipo de cáncer se correlaciona bien con los niveles plasmáticos del antígeno específico de la próstata (PSA). De este modo, el resultado de la terapia con agentes miméticos del NO de dosis bajas se puede evaluar fácilmente midiendo los niveles de PSA. El análisis de los datos procedentes de dos pacientes en este estudio reveló una disminución pronunciada de los niveles plasmáticos de PSA en dos meses de tratamiento con GTN, indicando de este modo que una terapia con agentes miméticos del NO de dosis bajas es un enfoque eficaz para el manejo del cáncer, particularmente el cáncer de próstata, en seres humanos (véanse las Figuras 3A y 3B). Los niveles plasmáticos de PSA se midieron mediante un kit de inmunoensayo comercialmente disponible, tal como Immuno 1 (Bayer Corporation).

También se examinó la capacidad de las dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico para reducir la resistencia de las células del cáncer de mama a doxorrubicina. En estos experimentos, primero se confirmó la capacidad de las condiciones hipóxicas para aumentar la resistencia a doxorrubicina. Las células expuestas a 1% de O_{2} tuvieron unas tasas de supervivencia, a concentraciones de 25 y 50 \muM de doxorrubicina, mayores que cuando se comparan con células expuestas a 20% de O_{2}. Seguidamente se examinó el efecto de dosis bajas del agente mimético del óxido nítrico GTN sobre la resistencia a doxorrubicina de células hipóxicas y no hipóxicas. Se encontró que las células cancerosas hipóxicas, tratadas con 10^{-6} M y 10^{-10} M de GTN, tuvieron tasas de supervivencia a doxorrubicina menores que cuando se comparan con células hipóxicas no tratadas. Las tasas de supervivencia de las células hipóxicas tratadas con agentes miméticos del óxido nítrico fueron comparables a las observadas en células no hipóxicas no tratadas y en células no hipóxicas tratadas con el agente mimético del óxido nítrico. Estos resultados se han confirmado en múltiples cánceres humanos así como en cánceres de ratón, y con otras modalidades terapéuticas anticancerosas.

De este modo, estos estudios demuestran que un fenotipo celular canceroso, tal como el inducido por hipoxia, puede ser inhibido y prevenido aumentando (restaurando) el nivel de actividad mimética del óxido nítrico. Otros factores conocidos que disminuyen la actividad mimética del óxido nítrico celular, de forma que se induce un fenotipo celular canceroso, incluyen, pero no se limitan a, disminuciones de los niveles de arginina, exposición a antagonistas endógenos de óxido nítrico sintasa, tales como L-NMMA y ADMA, la exposición a depuradores endógenos del óxido nítrico, tales como superóxido, los cambios en la expresión de la óxido nítrico sintasa, los cambios en cofactores tales como GSH y NADPH, la falta de glucosa, los procedimientos quirúrgicos, la administración de agentes anestésicos, la administración de agentes farmacológicos que alteran la circulación tales como, pero no limitados a, agentes antihipertensivos, y lesiones traumáticas que incluyen, pero no se limitan a, las asociadas con pérdida de sangre, disminución del volumen de sangre, y hemorragia. La presente invención se refiere a métodos para inhibir y prevenir un fenotipo celular canceroso que resulta de estos y de otros factores, mediante la administración de dosis bajas de uno o más agentes miméticos del óxido nítrico.

Los medicamentos de agentes miméticos del óxido nítrico de dosis bajas, preparados según la presente invención, también prevendrán el fenotipo celular canceroso de células endoteliales vasculares, lo que a la larga dará como resultado el "reclutamiento" de tales células por un tumor, y el desarrollo de un suministro de sangre al tumor, también conocido como angiogénesis. Los intentos de cortar el suministro de sangre al tumor, bloqueando el VEGF en células endoteliales vasculares, han sido relativamente infructuosos como tratamientos contra el cáncer. Se ha demostrado que la presencia de VEGF en tumores suprime la capacidad invasora del tumor. De este modo, se cree que los agentes que eliminan o bloquean las acciones de VEGF, tales como un anticuerpo anti-VEGF, generan realmente fenotipos celulares cancerosos más agresivos. Sin embargo, utilizando la presente invención se puede prevenir la generación de un fenotipo celular canceroso más agresivo, permitiendo de ese modo el uso de terapias anti-VEGF para prevenir la angiogénesis sin producir células cancerosas más agresivas.

Estos estudios también demuestran la capacidad de la terapia de agentes miméticos del NO de dosis bajas para disminuir los niveles de un marcador de tumores en un paciente. Los niveles de los marcadores de tumores se usan normalmente por los expertos en la materia como indicadores de la progresión de un cáncer. En consecuencia, la capacidad de la terapia de agentes miméticos del NO de dosis bajas, para disminuir los niveles de estos marcadores, es indicadora de su capacidad para tratar los cánceres. Además, la progresión de un tumor se puede diagnosticar y/o monitorizar en un paciente midiendo los niveles de un marcador de tumores en el paciente, en presencia de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico.

Las formulaciones de dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico que finalmente dan como resultado un aumento, una restauración o un mantenimiento de la actividad mimética del óxido nítrico de células, suficiente para prevenir o inhibir un fenotipo celular canceroso, se pueden producir según los métodos de formulación conocidos en la técnica. Los medicamentos de la presente invención para la administración de agentes miméticos del óxido nítrico pueden tomar la forma de ungüentos, parches transdérmicos, parches transbucales, formas inyectables, formas inhalables nasales, formas pulverizadas para el suministro pulmonar profundo a través de la boca, comprimidos y cápsulas comestibles administrados oralmente, y formulaciones en comprimidos o en pastillas o "para chupar", para la administración a través del tejido de la mucosa oral. Estas últimas formulaciones incluyen comprimidos, pastillas y similares que se disuelven mientras que se mantienen en o debajo de la lengua, o entre las encías y la mejilla. Las preparaciones farmacéuticas o medicamentos proporcionan una dosis baja del agente mimético del óxido nítrico, que es 3 a 10.000 veces menor que una dosis de agente mimético del óxido nítrico que produce vasodilatación, y que es suficiente para aumentar, restaurar o mantener la actividad mimética del óxido nítrico en un nivel que inhibe o previene un fenotipo celular canceroso, también denominada en este documento como una cantidad terapéuticamente eficaz, durante el período en el que se reduce la actividad mimética del óxido nítrico celular de las células. Las formulaciones o medicamentos pueden comprender preferiblemente más de un agente mimético del NO. En esta realización, se prefiere que los agentes miméticos del NO se dirijan contra o actúen sobre partes diferentes de la ruta del NO. Por ejemplo, se puede coadministrar un dador de NO con un compuesto que inhiba la degradación de nucleótidos cíclicos (por ejemplo, CAMP o cGMP), tal como un inhibidor de fosfodiesterasa. Los inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) preferidos, útiles como agentes miméticos del NO, son aquellos que inhiben PDE-1 a PDE-5.

Las formulaciones de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del agente mimético del óxido nítrico formulado junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa una carga, un diluyente, un material encapsulante o un auxiliar de la formulación de cualquier tipo, no tóxicos, inertes, en estado sólido, semisólido o líquido. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de alazor; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de haba de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico; y disoluciones de tampón de fosfato; así como también otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio. También pueden estar presentes en la formulación, según el juicio del formulador, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes. Las formulaciones de esta invención se pueden administrar a seres humanos y a otros animales, oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (mediante polvos, ungüentos o gotas), supralingualmente (sobre la lengua), sublingualmente (bajo la lengua), bucalmente (mantenidas entre las encías y la mejilla), o como una pulverización oral o nasal. La pulverización oral puede estar en forma de un polvo o neblina que se suministra a los pulmones mediante inhalación
oral.

Las formas de dosificación líquidas, para administración oral, incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular aceites de semilla de algodón, de nuez molida, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerina, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las formulaciones orales también pueden incluir coadyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes. Las preparaciones inyectables, por ejemplo suspensiones oleosas o acuosas inyectables estériles, se pueden formular según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes adecuados así como agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución inyectable estéril, una suspensión o una emulsión, en un diluyente o disolvente no tóxicos parenteralmente aceptables, por ejemplo como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la disolución de Ringer, y la disolución de cloruro de sodio U.S.P. y la isotónica. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles, como un medio disolvente o de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier agente fijo blando, incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se usan ácidos grasos, tales como ácido oleico.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene a las bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril o en cualquier otro medio inyectable estéril, antes del uso.

En los casos en los que sea deseable prolongar el efecto del agente mimético del óxido nítrico, se puede ralentizar la absorción del agente mimético del óxido nítrico a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una mala solubilidad en agua. La velocidad de absorción del agente mimético del óxido nítrico depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retrasada de una formulación administrada parenteralmente se logra disolviendo o suspendiendo el agente mimético del óxido nítrico en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se obtienen formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de fármaco a polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se pueden preparar atrapando al agente mimético del óxido nítrico en liposomas o en microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las formulaciones para la administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar mezclando los agentes miméticos del óxido nítrico con excipientes o vehículos adecuados no irritantes, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o cera para supositorios, y que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por lo tanto funden en la cavidad del recto o de la vagina, liberando de este modo el agente mimético del óxido nítrico.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el agente mimético del óxido nítrico se mezcla con al menos un excipiente o vehículo inerte, farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o: cargas o agentes de extensión tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico; aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa, y goma arábiga; agentes humectantes tales como glicerina; agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio; agentes que retrasan la disolución tales como parafina; aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerina; agentes absorbentes tales como caolín y arcilla bentonítica; y lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponantes.

También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar, como cargas, en cápsulas de gelatina blandas y duras, usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche, así como también polietilenglicoles de peso molecular elevado y similares. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con revestimientos y protecciones tales como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes, y también pueden ser de una composición tal que liberen el agente mimético del óxido nítrico sólo, o preferentemente, en cierta parte del aparato gastrointestinal, opcionalmente de manera retrasada. Los ejemplos de composiciones imbibidoras que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Los polvos y pulverizaciones pueden contener, además del agente mimético del óxido nítrico, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener adicionalmente agentes propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos, o propelentes no CFC alternativos, tales como DIMEL, también denominado como 1,3,4-A.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de agentes miméticos del óxido nítrico incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, pulverizaciones, inhaladores o parches. El agente mimético del óxido nítrico se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualesquiera conservantes y/o tampones que se requieran. También se contemplan las formulaciones oftálmicas, las gotas óticas, los ungüentos oculares, los polvos y las disoluciones, dentro del alcance de esta invención. Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado del agente mimético del óxido nítrico al cuerpo. Tales formas de dosificación se pueden obtener disolviendo o dispersando un agente mimético del óxido nítrico en el medio apropiado. También se pueden usar potenciadores de la absorción para aumentar el paso del agente mimético del óxido nítrico a través de la piel. La velocidad se puede controlar proporcionando una membrana que controle la velocidad, o dispersando el agente mimético del óxido nítrico en una matriz polímera o gel.

Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además del agente mimético del óxido nítrico, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.

Un modo preferido de suministro es aquel que proporciona un suministro razonablemente constante del agente mimético del óxido nítrico, a fin de mantener concentraciones plasmáticas constantes. Tal suministro evita cualquier pico inicial sustancial en la concentración plasmática del agente, puesto que sería deseable evitar concentraciones plasmáticas que produjeran efectos secundarios negativos. Los modos preferidos de suministro son los parches transdérmicos y los sistemas de suministro por pulsos.

Para las formulaciones que contienen un agente mimético del óxido nítrico que está comercialmente disponible, las formulaciones de dosis baja para uso en el método de la presente invención se formulan preferiblemente según los mismos métodos que las formulaciones de mayores dosis comercialmente disponibles, pero con menores cantidades, suficientes para aumentar, restaurar o mantener la actividad mimética del óxido nítrico a las células a un nivel que inhiba o prevenga los fenotipos celulares cancerosos y/o aumente la eficacia de una modalidad terapéutica anticancerosa. Los métodos de formulación están dentro de la pericia de los químicos de la formulación farmacéutica, y se describen completamente en trabajos tales como Remington's Pharmaceutical Science, 18ª Edición, Alfonso R, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA, 1990.

Los medicamentos preparados según la presente invención son particularmente útiles inhibiendo las metástasis y el desarrollo de resistencia de las células tumorales a modalidades terapéuticas anticancerosas que incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, terapia de radiación, inmunoterapias, y terapias térmicas. Los ejemplos de clases de agentes quimioterapéuticos útiles en combinación con agentes miméticos del NO de dosis bajas incluyen, pero no se limitan a, agentes antiangiogénicos que incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-VEGF, agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno, alquilsulfonatos, nitrosoureas, etileniminas, y triazenos; antimetabolitos tales como antagonistas de folato, análogos de purina, y análogos de pirimidina; antibióticos tales como antraciclinas, bleomicinas, doxorrubicina, mitomicina, dactinomicina, y plicamicina; agentes activadores de endotelina; enzimas tales como L-asparaginasa; inhibidores de farnesil-proteintransferasa; inhibidores de 5\alpha reductasa; inhibidores de 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 3; agentes hormonales tales como glucocorticoides, estrógenos o antiestrógenos, andrógenos o antiandrógenos, progestinas, y antagonista de la hormona liberadora de hormona luteinizante; acetato de ocreotida; agentes disruptores de los microtúbulos, tales como ecteinascidinas y análogos y derivados de los mismos; agentes estabilizadores de los microtúbulos, tales como taxanos, por ejemplo TAXOL (paclitaxel), TAXOTERE (docetaxel), y análogos de los mismos, y epotilonas o análogos de las mismas; alcaloides de la vinca; epipodofilotoxinas; inhibidores de topoisomerasa; inhibidores de prenil-proteintransferasa; y otros agentes tales como hidroxiurea, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, complejos de coordinación del platino tales como cisplatino y carboplatino, modificadores de la respuesta biológica, factores de crecimiento, y moduladores inmunitarios o anticuerpos monoclonales. Los ejemplos representativos de agentes quimioterapéuticos en estas clases útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, actinomicina D, aflacón, sulfato de bleomicina, buserelina, busulfano, carmustina, clorambucilo, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorrubicina, discodermolidas, hidrocloruro de doxorrubicina, estramustina, fosfato sódico de estramustina, etopósido, fosfato de etopósido, fludarabina, fluorouracilo, flutamida, idarrubicina, ifosfamida, interferón, interleuquinas, leuprolida, levamisol, lomustina, hidrocloruro de mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina C, paclitaxel, pentastatina, pteridina, quinocarcinas, rituximab, safracinas, saframicinas, semustina, estreptocina, tamoxifeno, tenipósido, tioguanina, tiotepa, topotecán, vinblastina, vincristina, tartrato de vinorrelbina, y cualquiera de los análogos o derivados de los mismos.

A los animales que sufren cáncer se les puede administrar una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico para inhibir el potencial metastásico de las células tumorales así como también para aumentar la eficacia de una modalidad terapéutica anticancerosa coadministrada, dirigida a exterminar las células cancerosas. El agente mimético del óxido nítrico se puede administrar a animales en combinación con otras modalidades terapéuticas anticancerosas, después, antes o durante la eliminación quirúrgica de un tumor, y/o después, durante o antes de la terapia de radiación o terapia térmica. Se cree que esta terapia también aumentará la eficacia de los agentes anti-VEGF dirigidos a inhibir la angiogénesis de células endoteliales vasculares de tumores. La terapia de dosis bajas de agentes miméticos del óxido nítrico se puede administrar a un animal antes, junto con, o después de la administración de un agente anti-VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. En este caso, se prefiere que la terapia de óxido nítrico se mantenga al menos durante el período activo conocido del agente anti-VEGF. La terapia de dosis bajas del agente mimético del óxido nítrico también se puede administrar como terapia profiláctica a animales que tienen un riesgo elevado de desarrollar cáncer, para prevenir el desarrollo de células con un fenotipo celular canceroso. Se puede administrar diariamente una dosis baja del agente mimético del óxido nítrico al animal durante su vida. En consecuencia, en estos animales puede ser preferible la administración de formulaciones de dosificación de liberación sostenida a largo plazo. Además, la terapia de dosis bajas de óxido nítrico se puede administrar a animales que se sospecha o que se sabe que están expuestos a un factor que reduce la actividad mimética del óxido nítrico celular, de forma que se induzcan células con un fenotipo celular canceroso. Es de esperar que la administración de esta terapia de dosis baja de óxido nítrico inhiba el desarrollo de un fenotipo celular canceroso en estos animales. La terapia con agentes miméticos del óxido nítrico se puede administrar durante al menos todo el tiempo que el animal esté expuesto al factor. Por ejemplo, se cree que la cirugía y la anestesia son factores que reducen la actividad mimética del óxido nítrico celular de forma que se induce un fenotipo celular canceroso. En consecuencia, antes o durante un procedimiento quirúrgico y/o la administración de un agente anestésico a un animal, se le puede administrar al animal una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico para prevenir e inhibir un fenotipo celular canceroso. En este caso, se prefiere administrar el agente mimético del óxido nítrico durante al menos el tiempo en el que el animal está bajo el procedimiento quirúrgico y/o está bajo los efectos de la anestesia. De forma similar, se le puede administrar a un animal sometido a trauma físico, especialmente un trauma físico asociado con pérdida de sangre, con una disminución del volumen de sangre o con hemorragia, una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico para prevenir e inhibir un fenotipo celular canceroso. Se cree que la coadministración de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico también se puede usar para inhibir o prevenir un fenotipo celular canceroso que puede aparecer con la administración de agentes farmacológicos que alteran la circulación, por ejemplo antihipertensivos. En este caso, el agente mimético del óxido nítrico se administra preferiblemente en una base diaria con los otros agentes, o en una formulación de liberación sostenida a largo plazo que se prolonga durante el período en el que se administra el otro agente.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales

El medio de cultivo tisular (RPMI 1640) y el suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Gibco BRL (Grand Island, NY). Las condiciones hipóxicas se generaron usando cámaras estancas al aire, procedentes de BellCo Biotechnology (Vineland, NJ). El GTN se obtuvo como una disolución (TRIDIL, 5 mg ml^{-1} o 2,22 M) en etanol, propilenglicol y agua (1:1:1,33), de DuPont Pharmaceuticals (Scarborough, ON). El nitroprusiato de sodio (SNP) se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Las extracciones de ARN se realizaron usando un kit de aislamiento de ARN PURESCRIPT, de Gentra Systems (Minneapolis, MN). Para los análisis de transferencia Northern, las membranas de nailon usadas para las transferencias de ARN se adquirieron de Micron Separations, Inc. (Westboro, MA); las sondas de ADNc de uPAR y PAI-1 se clonaron en un vector plásmido de Bluescript; el [^{32}P]-dCTP y la película de Reflection NEF se adquirieron de Dupont/New England Nuclear (Mississauga, ON); y el kit de oligomarcado se obtuvo de Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Para los ensayos de invasión in vitro, el medio de cultivo EX-CELL 300 libre de suero se adquirió de JRH Biosciences (Lenexa, KS), los insertos Costar TRANSWELL (membrana de policarbonato de 6,5 mm de diámetro, poro de 8 \mum) se adquirieron de Corning Costar (Cambridge, MA), y la membrana base reconstituida (MATRIGEL) se adquirió de Collaborative Biomedical Products (Bedford, MA). El kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) del inhibidor 1 del activador de plasminógeno (PAI-1) se obtuvo de American Diagnostica (Greenwich, CT). Para el análisis de transferencia Western de uPAR, las proteínas resueltas se transfirieron a membranas Immobilon-P de Millipore (Bedford, MA), el anticuerpo anti-uPAR (anticuerpo monoclonal [MoAb] 3937) se adquirió de American Diagnostica (Greenwich, CT), el conjugado de peroxidasa de rábano picante con IgG anti-ratón de cabra purificada por afinidad y de grado de transferencia (H+L) se obtuvo de BIO-RAD (Hercules, CA), y el antígeno se detectó mediante quimioluminiscencia aumentada (ECL) usando reactivos de Amersham Canada (Mississauga ON). Para los análisis cimográficos, la gelatina se adquirió de BDH (Toronto, ON), la caseína se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), y el plasminógeno se obtuvo de American Diagnostica (Greenwich, CT).

Ejemplo 2 Células

En estos experimentos se usaron la estirpe celular de trofoblastos invasiva HTR-8/SVneo y la estirpe celular de carcinoma de mama metastásico MDA-MB-231. Tanto las células HTR-8/SVneo como MDA-MB-231 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 5% de FBS.

La estirpe celular HTR-8/SVneo se obtuvo de cultivos de explantación de placenta humana del primer trimestre, y se inmortalizó mediante transfección con un constructo de ADNc que codifica el antígeno T grande de SVneo. Estas células se habían caracterizado previamente y se habían mantenido en cultivo durante 130 pasos en medio RPMI 1640 suplementado con 5% de FBS. Muestran un elevado índice de proliferación, y comparten diversas similitudes fenotípicas con las células HTR-8 progenitoras no transfectadas, tales como la capacidad invasora in vitro y la falta de tumorigenicidad en ratones atímicos.

La estirpe celular MDA-MB-231 se aisló inicialmente en 1973 a partir de la efusión pleural de un paciente con cáncer de mama, de 51 años de edad (Callieau et al. J. Nat. Cancer Inst. 1974 53:661-674).

Ejemplo 3 Condiciones de cultivo de células hipóxicas

Las células se colocaron en una cámara estanca al aire, y se inundaron con una mezcla gaseosa que contiene 5% de CO_{2}:95% de N_{2} hasta que la concentración de oxígeno fue de 0%, según se lee en un analizador de oxígeno Miniox1 (Catalist Research Corp., Owing Mills, MD). Las células se incubaron entonces a 37ºC. En las primeras 2 horas de incubación, el nivel de oxígeno en las cámaras se había equilibrado hasta aproximadamente 1%, y permaneció en este porcentaje durante el resto del período de incubación.

Como alternativa, las células se colocaron en una cámara en la que los niveles de O_{2} atmosférico se mantuvieron mediante un regulador de O_{2} PRO-OX (Reming Bioinstruments, Redfield, NY).

Ejemplo 4 Tratamiento de células con trinitrato de glicerilo (GTN) y con nitroprusiato de sodio (SNP)

En estos experimentos, las células se trataron con concentraciones variables de GTN y SNP. La disolución madre de GTN se diluyó primeramente en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), hasta una concentración de 10^{-4} M. Tras la filtración, la disolución de GTN se diluyó en el medio de cultivo hasta concentraciones que oscilan de 10^{-4} M a 10^{-11} M. El SNP (originalmente en forma cristalina) se disolvió en agua destilada y se diluyó hasta una concentración de 10^{-5} M. Después de la filtración, el SNP se diluyó en el medio de cultivo hasta concentraciones que oscilan de 10^{-6} M a 10^{-12} M.

Ejemplo 5 Análisis de transferencia Northern

Las células se cultivaron con concentraciones variables de GTN y de SNP en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}) o en condiciones de control (20% de O_{2}), a 37ºC. En otro conjunto de experimentos, las células MDA-MB-231 se incubaron en presencia o en ausencia de LMMA (0,5 mM) durante 24 horas en cantidades variables de oxígeno (1%, 5% ó 20% de O_{2}), a 37ºC. Después de la incubación, el ARN celular total procedente de las células se aisló usando el kit de aislamiento de ARN Gentra PURESCRIPT. El ARN aislado se separó subsiguientemente mediante electroforesis, y se transfirió a membranas de nailon cargadas. Las membranas se prehibridaron a 42ºC durante aproximadamente 2 horas en una disolución que contiene 50% de formamida, 5X de disolución de Denhardt, 0,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 6X SSC (1X SSC = 0,15 M de NaCl, 15 mM de citrato de sodio, pH 7,0), y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Después, las membranas se hibridaron con una sonda de ADNc (uPAR o PAI-1) marcada con [^{32}P]-dCTP, durante aproximadamente 24 horas a 42ºC, en una disolución compuesta de 6X SSC, 0,5% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 50% de formamida, y que contiene una sonda de ADNc (uPAR o PAI-1) que estaba marcada con [^{32}P]-dCTP mediante el uso de un kit de oligomarcado de Pharmacia. Tras los lavados en serie, la membrana se usó para exponer la película Reflection NEF de Dupont. Después de 1-4 días, la película se desarrolló y se analizó. Para corregir las diferencias en la cantidad de ARN cargado en cada muestra, se usó ARNr 28S.

Ejemplo 6 Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína de uPAR

Para examinar el nivel de proteína de uPAR, las células se cultivaron primeramente con 20% de O_{2} o 1% de O_{2} en presencia de concentraciones variables de SNP o de GTN. Después de las incubaciones, las células se lisaron usando un tampón que contiene 40 mM de HEPES de pH 7,2, 100 mM de NaCl, 20% de glicerina, 0,1 mM de EDTA de pH 8,0, 0,2% de Triton X-100, 1 mM de DTT y 2 mM de PMSF. Los lisados se sometieron entonces a homogeneización, a cizallamiento del ADN (10 veces con una aguja de calibre 25 ^{5}/_{8}), a ebullición (5 minutos) y a centrifugación (15 minutos, 14000 g). El sobrenadante se recogió y se almacenó a -80ºC hasta su uso. Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con SDS, y las proteínas resueltas se transfirieron a una membrana Immobilon-P usando un aparato de transferencia en húmedo (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON). Las membranas se bloquearon toda la noche a 4ºC en una disolución que contiene 1% de PBS y 0,01% de Tween 20 (PBS-T) así como 5% de caseína. Las manchas se incubaron subsiguientemente durante 1,5 horas con el anticuerpo anti-uPAR monoclonal [MoAb 3937], seguido de seis lavados de 5 minutos con PBS-T. Las membranas se incubaron entonces con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón de cabra, durante 1,5 horas. Después de seis lavados adicionales de 5 minutos con PBS-T, el antígeno se detectó mediante quimioluminiscencia aumentada, y las manchas se expusieron en película Reflection NEF de Dupont.

Ejemplo 7 Medición de la actividad de metaloproteinasa y del activador de plasminógeno mediante cimografía

Para medir los niveles de actividad de metaloproteinasa y del activador de plasminógeno, las células se incubaron en condiciones hipóxicas y de control en presencia de concentraciones variables de SNP o GTN. Las células se cultivaron usando un medio libre de suero (EX-CELL 300). Después de la incubación, el medio se extrajo y se centrifugó a 5.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió subsiguientemente y se almacenó a -80ºC hasta un uso posterior. Se prepararon geles de poliacrilamida con SDS según procedimientos bien conocidos. Para el análisis de secreción de metaloproteinasa, el gel contenía 0,1% p/v de gelatina; y para el análisis de la secreción del activador de plasminógeno, el gel estaba suplementado con 0,1% p/v de caseína así como también con plasminógeno (50 \mug/ml). El medio acondicionado libre de suero se combinó entonces con un tampón de carga de muestra no reductor (0,5 M de Tris, 10% de SDS, 1% de azul de bromofenol en 2 ml de glicerina) en una relación de 4:1, y no se hirvió. Después de la electroforesis, se sometió a los geles a dos lavados de 15 minutos con 2,5% de Triton X-100. Esta etapa eliminó el SDS. Después de los lavados con H_{2}O, los geles se incubaron toda la noche a 37ºC en una disolución que contiene Tris-HCl (pH 7,0) y CaCl_{2} (5 mM). Los geles se tiñeron con 0,4% de azul brillante de Coomassie R-250 en 40% de metanol/10% de ácido acético glacial/50% de agua destilada, durante aproximadamente 1 hora, y después se eliminó la tinción durante alrededor de 2 horas en 30% de metanol/10% de ácido acético glacial/60% de agua destilada. Los patrones de pesos moleculares se mostraron como bandas oscuras frente al fondo azul más claro y a las zonas incoloras que aparecieron cuando se produjo la lisis. En los geles que contienen gelatina, estas áreas correspondieron a actividad de metaloproteinasa (gelatinasa), y, en los geles de caseína, estas bandas correspondieron a actividad del activador de plasminógeno. Los geles se conservaron usando una disolución conservante (10% de ácido acético glacial/10% de glicerina/80% de agua destilada) durante 1 hora, y se secaron en celofán durante 1 hora a 60ºC.

Ejemplo 8 Ensayos de invasión in vitro

Se usaron cámaras de invasión MATRIGEL (cámaras de Boyden modificadas) para evaluar la capacidad invasora de las células en condiciones hipóxicas y estándares, en presencia o en ausencia de diversas concentraciones de GTN o de SNP. Las cámaras constan de insertos de cultivo celular, de 6,5 mm de diámetro, y con una membrana de tamaño de poros de 8 \mum. Cada membrana estaba revestida con 100 \mul de una disolución 1 mg/ml de MATRIGEL diluida en medio de cultivo libre de suero frío (EX-CELL 300), y se dejó secar en una vitrina con flujo laminar, durante aproximadamente 12 horas. La disolución de MATRIGEL se rehidrató entonces incubándola con 100 \mul de medio libre de suero, durante aproximadamente 1 hora. Después de la rehidratación, se añadieron a cada pocillo suspensiones celulares que contienen 5,0 x 10^{4} ó 1,0 x 10^{5} células en 100 \mul de medio, que contienen tanto el suero como los tratamientos del óxido nítrico. Entonces se añadieron a cada inserto el medio de cultivo que contiene suero y el respectivo tratamiento de óxido nítrico. Las células se incubaron durante 24 horas en condiciones hipóxicas (1% de O_{2}) o de control (20% de O_{2}). Tras la incubación, las células que no invadieron se retiraron de la superficie superior de la membrana limpiando con un tarugo de algodón. Las células de la superficie inferior de la membrana se fijaron durante 10 minutos con fijador de Carnoy (25% de ácido acético, 75% de metanol), y entonces se tiñeron durante aproximadamente 3 horas con una disolución de 1% de azul de toluidina y 1% de borato de sodio. Después de un aclarado en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), la membrana se retiró del alojamiento del inserto con una pequeña cuchilla de escalpelo, se montó en un portaobjetos y se cubrió. Entonces las células que invaden se visualizaron en el microscopio a un aumento de 40X, y se contaron. El índice de invasión para cada tratamiento se calculó dividiendo el número de células que invaden entre el número de células que invadieron en condiciones estándares. Este valor se multiplicó entonces por 100 para obtener el porcentaje. Al patrón se le dio un valor de 100%, y los valores del tratamiento se convirtieron a un porcentaje del patrón. Los resultados se ensayaron en busca de la significancia estadística usando el test de Tukey para procedimientos de comparación múltiple por parejas, o el método de Student-Newman-Keuls para procedimientos de comparación múltiple por parejas. Véase la Figura 1.

Ejemplo 9 Modelo de metástasis in vivo

Se inyectó i.v. (vena de la cola) a los ratones C57BL6 con un bolo de 5 x 10^{4} - 10^{5} células melanómicas metastásicas B16F10. Inmediatamente después de la inyección en la vena de la cola, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de 15, y los ratones de cada grupo se colocaron en cámaras de plexiglas (aproximadamente 3 l), que se inundaron continuamente con mezclas gaseosas de 20% de O_{2} y el resto de N_{2}, y 10% de O_{2} y el resto de N_{2}, respectivamente. Los caudales de gas se ajustaron hasta una cantidad que no permitió la formación de CO_{2} en las cámaras. Después de una exposición de 24 horas a una atmósfera de 20% de O_{2} o de 10% de O_{2}, los ratones se retiraron de las cámaras y se colocaron en jaulas normales mantenidas en aire ambiente. Trece días después, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical, y los pulmones se retiraron y se fijaron en fijador de Bouin (Sigma). Los nódulos metastásicos (muchos de los cuales aparecieron negros debido a la presencia de melanina), sobre la superficie de los pulmones, se contaron visualmente en un microscopio de disección. Los datos se expresaron como el número de nódulos pulmonares por 10^{4} células inyectadas, y se analizaron usando ensayos estadísticos para valores no paramétricos.

En un segundo conjunto de experimentos, se siguió el mismo protocolo excepto que las células de melanoma de ratón B16F10 se incubaron durante 12 horas en 1% o 20% de oxígeno en presencia o en ausencia de 2 x 10^{-11} M de GTN. Entonces se retiraron las células de las placas con tripsina, y se inyectaron i.v. (vena de la cola) 5 x 10^{4} células en ratones hembra C57BL6. Véase la Figura 2. Algunas de las células tratadas in vitro se colocaron en placas sobre cápsulas de cultivo de tejidos para determinar la capacidad formadora de colonias usando el protocolo descrito en el Ejemplo 10.

Ejemplo 10 Ensayo de formación de colonias para determinar la resistencia a doxorrubicina

La resistencia de células de cáncer de mama MDA-MB-231 a doxorrubicina se determinó tras el cultivo en 20% o 1% de oxígeno contando el número de colonias formadas. Las células MDA-MB-231 se incubaron en 1% de O_{2} o 20% de O_{2}, durante 24 horas. Después de la incubación, las células se expusieron a diluyente (control), a 25 \muM de doxorrubicina, a 25 \muM de doxorrubicina más 10^{-6} M de GTN, o 25 \muM de doxorrubicina más 10^{-10} M de GTN, durante 1 hora. Las células se lavaron y entonces se colocaron en placas de 35 mm, a diferentes diluciones. Las células se incubaron durante 1-2 semanas adicionales a fin de permitir que las colonias celulares crezcan. Al final del período de incubación, las células se fijaron con fijador de Carnoy, se tiñeron con violeta de Crystal, se aclararon y se dejaron secar al aire. Las colonias se contaron visualmente. Las células supervivientes en cada condición se determinaron contando el número de colonias, y se expresó como una fracción del número de colonias que sobrevivió sin exposición a doxorrubicina.

Aunque la presente invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a ciertas realizaciones, los expertos en la materia apreciarán que se pueden realizar otros cambios en la forma y en los detalles, sin apartarse por ello del espíritu ni del alcance de la invención.

Claims

1. Uso de una dosis baja de un agente mimético del óxido nítrico en la preparación de un medicamento destinado a controlar, tratar y/o prevenir cáncer, tumores malignos, neoplasia, hiperplasia, hipertrofia, displasia y/o angiogénesis de tumores, en el que dicha dosis baja es 3 a 10.000 veces menor que una dosis de agente mimético del óxido nítrico que produce vasodilatación.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento se administra en una cantidad que retrasa y/o reduce el desarrollo de tolerancia al agente mimético del óxido nítrico, y/o el desarrollo de efectos secundarios indeseados, incluyendo cefalea, rubefacción e hipertensión.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho medicamento se administra solo o en combinación con un agente terapéutico anticanceroso.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho medicamento

(1) inhibe el potencial metastásico de un tumor o de un fenotipo celular canceroso, preferiblemente disminuyendo la capacidad invasora, la progresión, el crecimiento y/o las metástasis de células que muestran un fenotipo canceroso; inhibiendo la supervivencia y/o el crecimiento de células que muestran un fenotipo canceroso; disminuyendo la progresión y/o las metástasis de células que muestran un fenotipo canceroso; aumentando la regresión de células que muestran un fenotipo canceroso; y/o facilitando el exterminio de células que muestran un fenotipo cance-
roso;

(2) mantiene un tumor maligno en estado latente en su sitio primario y/o secundario;

(3) mejora la eficacia de, y/o previene o disminuye la resistencia a, una modalidad terapéutica anticancerosa; o

(4) inhibe o previene la angiogénesis de tumores en animales con riesgo elevado de desarrollar cáncer y/o expuestos a factores que se sabe disminuyen la actividad del óxido nítrico en un animal, opcionalmente en el que dichos factores incluyen reducción de los niveles de arginina, exposición a antagonistas de óxido nítrico sintasa, exposición a depuradores del óxido nítrico, cambios en la expresión de óxido nítrico sintasa, cambio en cofactores, falta de glucosa, procedimientos quirúrgicos, administración de agentes anestésicos, administración de agentes farmacológicos que alteran la circulación, y lesiones traumáticas tales como trauma físico, pérdida de sangre, reducción del volumen sanguíneo, o hemorragia.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células que muestran los tumores malignos se seleccionan de entre células cancerosas, células invasivas y células y tejido(s) que facilitan el proceso canceroso; opcionalmente en el que el fenotipo celular canceroso se controla, se trata o se previene mejorando la respuesta a una modalidad terapéutica anticancerosa.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer se diagnostica o se monitoriza midiendo un marcador selectivo de tumores presente en un animal.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho medicamento disminuye o decelera los aumentos del nivel de dicho marcador de tumores.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer comprende cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer testicular, cáncer de próstata, adenocarcinoma prostático, cáncer de mama, melanoma metastásico, o combinaciones de los mismos; opcionalmente en el que el cáncer u otros tumores malignos, neoplasia, hiperplasia, hipertrofia, displasia y/o angiogénesis de tumores, en un animal, comprenden hiperplasia prostática benigna o embarazo molar.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente mimético del óxido nítrico comprende óxido nítrico, un dador de óxido nítrico, un compuesto que genera o libera óxido nítrico mediante biotransformación, un compuesto que genera óxido nítrico espontáneamente, o que libera espontáneamente óxido nítrico, o un compuesto que genera óxido nítrico.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el agente mimético del óxido nítrico es:

(1) un dador de óxido nítrico seleccionado de entre nitroglicerina (GTN), 5-mononitrato de isosorbida (ISMN), dinitrato de isosorbida (ISDN), tetranitrato de pentaeritritol (PETN), tetranitrato de eritritilo (ETN), N-hidroxil-L-arginina (NOHA), N^{6}-(1-iminoetil)lisina (L-NIL), L-N^{5}-(1-iminoetil)ornitina (LN-NIO), N^{\omega}-metil-L-arginina (L-NMMA), S-nitrosoglutationa (SNOG), S,S-dinitrosoditiol (SSDD), [N-[2-(nitroxietil)]-3-piridincarboxamida (Nicorandil), nitroprusiato de sodio (SNP), S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), 3-morfolino-sidnonimina (SIN-1), molsidomina, NONOato (2-óxido de 2-(N,N-dietilamino)-diazenolato) de DEA, y NONOato (N-[4-[1-(3-aminopropil)-2-hidroxi-2-nitrosihidrazino)butil-1,3-propanodiamina) de espermina;

(2) un compuesto que activa las etapas de la ruta del NO, un compuesto que permite o facilita la utilización del NO por una célula, un compuesto que activa directamente guanililciclasa, un inhibidor de fosfodiesterasa;

(3) un inhibidor de fosfodiesterasa de tipo I, II, III, IV ó V; ó

(4) un activador de proteína quinasa G.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que la modalidad terapéutica anticancerosa incluye terapia de radiación, terapia térmica, inmunoterapia, o quimioterapia, opcionalmente en el que la modalidad terapéutica anticancerosa comprende terapia de radiación, y el agente mimético del óxido nítrico es un óxido nítrico, un dador de óxido nítrico, un compuesto que genera o libera óxido nítrico mediante biotransformación, o un compuesto que genera espontáneamente óxido nítrico o que libera espontáneamente óxido nítrico sólo en presencia de oxígeno, en el que el agente mimético del óxido nítrico se administra durante la terapia de radiación.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la quimioterapia comprende la administración de un agente quimioterapéutico que es un agente antiangiogénico, un antimetabolito, un antibiótico, un agente activador de endotelina, una enzima, un agente hormonal, acetato de ocreotida, un agente disruptor de microtúbulos, un agente estabilizador de microtúbulos, un alcaloide de la vinca, una epipodofilotoxina, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor de prenil-protein transferasa, hidroxiurea, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, un complejo de coordinación del platino, un modificador de la respuesta biológica, un factor de crecimiento, un modulador inmunitario, o un anticuerpo monoclonal.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que el agente quimioterapéutico es una enzima seleccionada de entre el grupo que consta de L-asparaginasa, inhibidores de farnesil-proteintransferasa, inhibidores de 5\alpha reductasa, e inhibidores de 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 3.

14. Uso según la reivindicación 12, en el que el agente quimioterapéutico es un agente hormonal seleccionado de entre el grupo que consta de glucocorticoides, estrógenos o antiestrógenos, andrógenos o antiandrógenos, progestinas, antagonista de la hormona liberadora de hormona luteinizante, y acetato de ocreotida.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la dosis de agente mimético del óxido nítrico es 100 a 10.000 veces menor que una dosis de agente mimético del óxido nítrico que produce vasodilatación.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente mimético del óxido nítrico es un compuesto vasodilatador conocido, y dicho agente mimético se administra a una dosis de al menos 3 a 10.000 veces menor, preferiblemente 100 a 10.000 veces menor que la dosis de agente mimético del óxido nítrico que se sabe que produce vasodilatación.