DE60106905T2

DE60106905T2 - Formulierungen und verfahren zur verwendung von stickstoffmonoxid mimetika gegen einen malignen zellphänotyp

Info

Publication number: DE60106905T2
Application number: DE60106905T
Authority: DE
Inventors: A. Michael ADAMS; H. Charles GRAHAM; Jeremy P. W. Heaton; Lynne-Marie Postovit
Original assignee: Cellegy Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Queens University at Kingston
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: US20020040059A1; HK1052468B; US6946484B2; ATE281177T1; CA2407466A1; CA2407466C; MXPA02010551A; ES2232613T3; DE60106905D1; EP1278547B1; IL152428A; AU5022101A; EP1278547A2; WO2001080890A3; WO2001080890A2; JP2003531179A; HK1052468A1; AU2001250221B2; IL152428A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer niedrigen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums in der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung und Verhinderung eines malignen Zellphänotyps. Wir haben nun festgestellt, dass der Mechanismus durch den Hypoxie bzw. Sauerstoffnot und Hyponitroxie einen Einfluss auf den Zellphänotyp ausüben, nicht notwendigerweise lediglich durch den Mangel an Sauerstoff vermittelt wird, sondern vielmehr auch von einer Defizienz in der Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität. Folglich, wie hierin aufgezeigt, ist die Verabreichung niedriger Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika ausreichend, um die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen so zu erhöhen, wiederherzustellen oder beizubehalten, dass maligne Zellphänotypen inhibiert oder verhindert werden. Daher werden hierin Formulierungen vorgesehen, um niedrige Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika an Zellen bei Konzentrationen zuzuführen, welche einen malignen Zellphänotyp inhibieren und/oder die Entwicklung eines malignen Zellphänotyps verhindern, welche aber die Entwicklung ungewollter Effekte der NO-Mimetika vermindern oder vermeiden. Diese Formulierungen sind besonders nützlich bei der Behandlung und Verhinderung von Krebs in Tieren.
Hintergrund der Erfindung
Hypoxie oder Sauerstoffspannung unterhalb des normalen physiologischen Werts in Zellen führen zu physiologischen sowie pathologischen Änderungen in den Zellen, wobei die Änderungen mit einer differenziellen Genexpression in Zusammenhang gebracht worden sind. Beispielsweise beeinflusst Hypoxie die Endothelzellen-Physiologie in vivo und in vitro in verschiedenen Weisen, einschließlich der Modulierung der transkriptionell regulierten Expression von gefäßaktiven Substanzen und Matrixproteinen, welche bei der Modulierung des Gefäßtonus oder der Remodulie rung des Gefäßsystems und des umgebenden Gewebes beteiligt sind (Faller, D. V., Clin. Exp. Pharmacol. and Physiol. 1999, 26:74 – 84). Hypoxie in festen Tumoren schützt Krebszellen gezeigtermaßen vor einer Abtötung durch Röntgenstrahlen und führt zu Resistenz gegenüber bestimmten Krebsarzneimitteln. Hypoxie scheint des weiteren die maligne Progression zu beschleunigen und Metastasierung zu erhöhen (Brown, J. M. Cancer Res. 1999, 59: 5863 – 5870).
Stickstoffmonoxid ist mit verschiedenen biologischen Vorgängen in Verbindung gebracht worden. Beispielsweise ist Stickstoffmonoxid ein biologisches Botschaftermolekül, verantwortlich für die Endothel-abgeleitete Gefäßrelaxation und die Neurotransmission. Bei Spiegeln, welche von diesen Wissenschaftlern als hohe Spiegel bezeichnet werden, ist Stickstoffmonoxid auch als ein Mediator für Anti-Tumor- und Anti-Bakterien-Aktionen von Makrophagen bekannt. Es wurde ebenfalls aufgezeigt, dass Stickstoffmonoxid eine modulatorische Rolle auf die Cytokin-induzierte Expression von Matrix-Metalloproteinase-9 und Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen ausübt (Eberhardt et al., Kidney International 2000 57:59 – 69).
Eine große Menge an klinischen und experimentellen Daten zeigt, dass Stickstoffmonoxid auch eine Rolle bei der Förderung des Wachstums und der Progression von festen Tumoren spielt. Beispielsweise ist die Stickstoffmonoxid-Erzeugung durch induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) mit der Entwicklung von Prostatakrebs (Klotz et al., Cancer; National Library of Medicine, MDX Health Digest 1998 82(10):1897 – 903) sowie mit Kolon-Adenokarzinomen und Brust-Adenokarzinomen (Lala, P. K, and Orucevic, A., Cancer and Metastasis Reviews 1998, 17:91 – 106) in Zusammenhang gebracht worden. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass Stickstoffmonoxid eine wichtige Rolle im Metabolismus und Verhalten von Lungenkrebs-Arten und insbesondere Adenokarzinomen spielt (Fujimoto et al. Jpn. J. Cancer Res. 1997, 88:1190 – 1198). Tatsächlich wurde vorgeschlagen, dass Tumorzellen, welche Spiegel an Stickstoffmonoxid herstellen oder daran ausgesetzt sind, welche diese Forscher als niedrige Spiegel bezeichnen, oder Tumorzellen, die zum Überdauern einer Stickstoffmonoxid-vermittelten Verletzung in der Lage sind, wegen ihres Über lebensvorteils eine klonale Selektion durchlaufen (Lala, P. K. und Orucevic, A., Cancer and Metastasis Reviews 1998 17:91 – 106).
Diese Autoren schlagen vor, dass diese Tumorzellen bestimmte Stickstoffmonoxidvermittelte Mechanismen zur Förderung von Wachstum, Invasion und Metastase verwenden, und schlagen vor, dass Stickstoffmonoxid-blockierende Arzneistoffe nützlich zur Behandlung bestimmter menschlicher Krebsarten sind. Es gibt auch Beweise, welche darauf hinweisen, dass Tumor-abgeleitetes Stickstoffmonoxid die Tumor-Angiogenese sowie die Invasionsfähigkeit bestimmter Tumoren bei Tieren einschließlich Menschen fördert (Lala, P. K. und Orucevic, A., Cancer and Metastasis Reviews, 1998 17:1 – 6).
Allerdings wurde offenbart, dass Stickstoffmonoxid die Erzeugung von durch Hypoxie induzierten Vasokonstriktoren umkehrt (Faller, D. G., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 1999, 26:74 – 84). Darüber hinaus wurde von den Stickstoffmonoxid-Spendern Natriumnitroprussid, S-Nitroso-L-glutathion und 3-Morpholinosydnonimin im mikromolaren Bereich (IC₅₀ = 7,8, 211 bzw. 490 μM) gezeigt, die adaptive Zellantwort, gesteuert durch den Transkriptionsfaktor "Hypoxieinduzierbarer Faktor-1" in hypoxisch kultivierten Hep3B-Zellen, einer humanen Hepatom-Zelllinie, zu unterdrücken (Sogawa et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 1998, 95:7368 – 7373). Von dem Stickstoffmonoxid-Donor Natriumnitroprussid (SNP; 150 μM) ist auch gezeigt worden, die Hypoxie-induzierte Expression von vaskulärem Endothel-Wachstumsfaktor zu verringern, einem Endothelzell-Mitogen, das für die normale Gefäßentwicklung und pathologische angiogenische Krankheiten, wie Krebs- und Iris- und Retina-Neovaskularisierung erfordert wird (Ghiso et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 1999, 40 (6):1033 – 1039). In diesen Experimenten wurde gezeigt, dass 150 μM SNP die Hypoxie-induzierten VEGF-mRNA-Spiegel in immortalisierten humanen Retina-Epitelzellen mindestens 24 Stunden lang vollständig unterdrücken.
Hohe Spiegel an Stickstoffmonoxid, falls in bestimmten Zellen induziert, können Cytostase und Apoptose verursachen. Beispielsweise haben Xie et al. gezeigt, dass eine Exponierung an hohe Spiegel an Stickstoffmonoxid (unter Erzeugung von ungefähr 75 μM Nitrat; siehe 5A von Xie et al.) ein nutzbares Phänomen ist, um den Tod (siehe 6A und 6B von Xie et al.) bei murinen K-1735-Melanom-Zellen zu beschleunigen (J. Exp. Med. 1995, 181:1333 – 1343). Darüber hinaus offenbart die WO 93/20806 ein Verfahren zum Induzieren von Zellcytostase oder Cytotoxizität durch Exponierung von Zellen an eine Verbindung, wie Spermin-bis(stickstoffmonoxid)-Addukt-Monohydrat bei 500 μM, welches fähig zum Freisetzen von Stickstoffmonoxid in einer wässrigen Lösung ist. Es wird gelehrt, dass die Verbindungen bei der Behandlung von Tumorzellen sowie in antiparasitischen, Anti-Pilz- und antibakteriellen Behandlungen nützlich sind. Die Anwendung eines Mega-Dosierungs-Schemas wird vorgeschlagen, worin eine große Dosis der Stickstoffmonoxid-freisetzenden Verbindung verabreicht wird, Zeit für die Wirkung der aktiven Verbindung zugestanden wird, und dann ein geeignetes Reagenz, wie ein Stickstoffmonoxid-Abfangmittel, an das Individuum verabreicht wird, um die aktive Verbindung unwirksam zu machen und nicht-spezifische Schädigung aufzuhalten. Auf der Seite 14, Zeile 25–30 von WO 93/20806 wird gelehrt, dass 3-(n-Propylamino)propylamin-bis(stickstoffmonoxid)-Addukt, Diethylamin-bis(stickstoffmonoxid)-Addukt-Natriumsalz, Isopropylaminbis(stickstoffmonoxid)-Addukt-Natriumsalz, Natriumtrioxodinitrat(II)-Monohydrat und N-Nitrosohydroxylamin-N-sulfonat die Zelllebensfähigkeit bei Konzentrationen bis zu 500 μM nicht signifikant beeinflussen.
Das U. S.-Patent 5 840 759, U. S.-Patent 5 837 736 und U. S.-Patent 5 814 667 offenbaren Verfahren zur Anwendung von mg/kg-Mengen an Stickstoffmonoxidfreisetzenden Verbindungen, um hypoxische Zellen in einem Tumor gegen Strahlung zu sensitivieren. Diese Patente offenbaren ebenfalls Verfahren zur Verwendung der gleichen Stickstoffmonoxid-freisetzenden Verbindungen bei mg/kg-Spiegeln, um Nicht-Krebs-Zellen oder -Gewebe vor Strahlung zu schützen, Krebszellen gegen chemotherapeutische Mittel empfindlich zu machen und Nicht-Krebs-Zellen oder - Gewebe vor chemotherapeutischen Mitteln zu schützen. In diesen Verfahren verwen dete Verbindungen geben spontan Stickstoffmonoxid unter physiologischen Bedingungen ohne Erfordernis von Sauerstoff ab. Diese Patente lehren die Verabreichung der Stickstoffmonoxid-abgebenden Verbindung, etwa 15 bis etwa 60 Minuten vor der Therapie. Typische verabreichte Dosen der Stickstoffmonoxid-freisetzenden Verbindung belaufen sich vorgeschlagenerweise auf etwa 0,1 bis etwa 100 mg an einer oder mehreren Stickstoffmonoxid-freisetzenden Verbindungen pro kg Körpergewicht. Konzentrationen der Stickstoffmonoxid-freisetzenden Verbindungen DEA/NO und PAPA/NO, welche gezeigtermaßen die Empfindlichkeit von MCF7-Brustkrebszellen und V79-Fibroblasten gegen Melphalan, Thiotepa, Mitomycin C, SR4233 und Cisplatin in vitro erhöhten, lagen im Millimolar-Bereich, während von 70 mg/kg DEA/NO gezeigt wurde, das Überleben von Mäusen zu erhöhen, welche eine Verabreichung des chemotherapeutischen Mittels Melphalan im in vivo-KHT-Tumor-Modell erhielten.
Das U. S.-Patent 5 700 830 und die WO 96/15781 offenbaren Verfahren zur Inhibition des Aneinanderhaftens zwischen Krebszellen und Nicht-Krebszellen in einem Tier durch Verabreichen einer Stickstoffmonoxid-freisetzenden Verbindung, enthaltend eine Stickstoffmonoxid-freisetzende funktionelle N₂O₂-Gruppe, an das Tier. Jüngere Untersuchungen zeigen jedoch, dass die Krebszell-Adhäsion an und die Ausbreitung entlang der Gefäßwand, welche zu einer Extravasation führt, kein obligatorisches Ereignis in der Metastasierung ist (Morris et al., Exp. Cell. Res. 1995, 219: 571 -578).
Die WO 98/58633 offenbart eine Mikrodosis-Stickstoffmonoxid-Therapie zur Linderung von vaskulären Befunden, die mit einer Verringerung in der Stickstoffmonoxid-Herstellung oder einer Attenuierung des Stickstoffmonoxid-Effekts assoziiert sind.
Sumitani et al., Anticancer Research, 17(2A), 197, 865 – 871, lehren, dass Natriumnitroprussid (SNP) eine Apoptose von NA-Zellen induziert. Wie in der Offenbarung gelehrt wird, können hohe Spiegel an Stickstoffmonoxid, wenn sie in gewissen Zellen induziert werden, eine Apoptose herbeiführen. Sumitani et al. lehren, dass hohe Spiegel an NO₂ eine Apoptose von NA-Zellen und eine Niederregulierung der Protoonkogene c-myc und c-myb verursachen.
Umansky et al., International Journal of Oncology, 16(1), 2000, 109 – 117, lehrt, dass NO-induzierte Apoptose in verschiedenen humanen neoplastischen Lymphoidzellen Änderungen in den mitochondrialen Funktionen erfordert und unabhängig von CD95 ist.
Umansky et al., International Journal of Oncology, 10(3), 1997, 465 – 471, lehrt, dass die Aktivierung von Rinder-Endothelzellen mit Tumornekrosefaktor-a in vitro zur Stimulation der NO-Synthese führt, was zu einer Apoptose der behandelten Zellen führt.
Dookeran, Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, 41, 2000, 280, lehrt, dass eine Präparation von Nitroprussid in Ethiodol mit verzögerter Freisetzung zu keinem Zellüberleben in vitro führt, und schlägt vor, dass sowohl Antitumor-Mechanismen von NO als auch CN-Produktion zu diesem Effekt beitragen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine niedrige Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums in der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren und Verhindern eines malignen Zellphänotyps zu verwenden, wobei die niedrige Dosis 3- bis 10 000-fach niedriger als eine Dosis an Stickstoffmonoxid-Mimetikum ist, welche eine Gefäßerweiterung hervorruft.
Diese Medikamente sind besonders nützlich bei der Bekämpfung von Krebs durch Verringern seines Wachstums und Verbessern der Antwort auf eine Therapie. Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Medikamente Metastase, Invasionsfähigkeit und Progression von Zellen, die einen malignen Phäno typ aufzeigen, inhibieren. Darüber hinaus können die Medikamente einen schlafenden Zustand von Zellen, welche einen malignen Phänotyp aufweisen, sowohl an primären als auch sekundären Stellen von Tumoren herbeiführen oder erhalten.
Ferner können diese Medikamente die Entwicklung von Resistenz von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufweisen, gegen antimaligne therapeutische Modalitäten verhindern oder vermindern sowie die Wirksamkeit von antimalignen therapeutischen Modalitäten erhöhen.
Die Medikamente, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, sind auch sehr nützlich bei der Verhinderung eines malignen Zellphänotyps, welcher sich in Zellen nach Exponierung der Zellen an Bedingungen und/oder therapeutische Mittel, welche zu einer Defizienz in der Stickstoffmonoxid-Mimetikumaktivität in den Zellen führen, entwickeln kann.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Medikamente sind auch nützlich bei der Inhibierung der Entwicklung eines aggressiveren malignen Zellphänotyps in Krebszellen, welche nach Exposition an Faktoren stattfinden kann, welche eine derartige Entwicklung induzieren.
Darüber hinaus sind diese Medikamente nützlich zur Diagnose und Überwachung eines malignen Zellphänotyps in einem Tier durch Detektion von Spiegeln von einem oder mehreren, für einen malignen Zellphänotyp kennzeichnenden Markern, im Anschluss an die Verabreichung einer geringen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums. Keine Veränderung, eine Verringerung oder eine Verlangsamung im Anstieg des Spiegels von einem oder mehreren dieser Marker in einem Tier im Anschluss an die Verabreichung einer niedrigen Dosis an Stickstoffmonoxid-Mimetikum im Vergleich zum Spiegel des Markers im Tier vor der Verabreichung des Niedrigdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikums weist auf einen malignen Zellphänotyp in dem Tier hin.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung neue therapeutische und diagnostische Medikamente für die Behandlung und Verhinderung von Krebs in Tieren vor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist ein Histogramm, welches den Effekt von GTN und SNP auf die in vitro-Invasion von invasiven MDA-MB-231-Brustkrebszellen bei hypoxischen Bedingungen (1% O₂) im Vergleich zu normalen Bedingungen (20% O₂) zeigt. Die Zellen wurden auf MATRIGEL-beschichtete Membranen aufgeschichtet und unter hypoxischen oder normalen Bedingungen, allein oder in Gegenwart von Stickstoffmonoxid-Mimetika inkubiert.
Der Invasionsindex (% der Kontrolle), welcher als ein Maß der Invasionsfähigkeit der Zellen für jede Behandlung herangezogen wird, wurde durch Färbung der Zellen, welche durch die Membran eindrangen, und Auszählen derselben bestimmt. Der erste Balken zeigt den Invasionsindex von unter normalen Bedingungen (20% O₂) kultivierten Zellen. Der zweite Balken zeigt den Invasionsindex von unter hypoxischen Bedingungen (1% O₂) kultivierten Zellen. Der dritte Balken zeigt den Invasionsindex von Zellen, welche unter hypoxischen Bedingungen (1% O₂) kultiviert wurden und eine Verabreichung mit 10^–10 M SNP erhielten. Der vierte Balken zeigt den Invasionsindex von Zellen, die unter hypoxischen Bedingungen (1% O₂) kultiviert wurden und eine Verabreichung von 10^–11 M GTN erhielten. Die mit "*" gekennzeichneten Werte waren unter Anwendung des Post-hoc-Tests nach Student-Newman-Keuls für paarweise Mehrfachvergleichs-Vorgehen signifikant unterschiedlich (p < 0,05, n = 6).
Die 2 ist ein Histogramm, welches das Lungen-Besiedlungsvermögen von B16F10-Maus-Melanomzellen zeigt, welche 12 Stunden lang in 1% oder 20% O₂ in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 × 10^–11 M GTN inkubiert und i.v. (Schwanzvene) in weibliche C57B16-Mäuse injiziert worden sind. Vierzehn Tage später wurden die Mäuse getötet, und die Lungen wurden entfernt und in Bouin's Fixativ fixiert. Es wurden sowohl melanotische als auch amelanotische Metastasenkolonien unter ei nem Präpariermikroskop gezählt. Der erste Balken gibt die Anzahl von Knoten an, beobachtet in Lungen von Mäusen, welche mit Zellen injiziert wurden, die bei normalen Bedingungen (20% O₂) kultiviert worden waren. Der zweite Balken gibt die Anzahl von Knoten an, beobachtet in Lungen von Mäusen, welche mit Zellen injiziert wurden, die bei normalen Bedingungen (20% O₂) kultiviert worden waren und die eine Verabreichung von 2 × 10^–11 M GTN erhalten hatten. Der dritte Balken zeigt die Anzahl von Knoten, beobachtet in Lungen von Mäusen, welche eine Injektion von unter hypoxischen Bedingungen (1% O₂) kultivierten Zellen erhielten. Der vierte Balken zeigt die Anzahl von Knoten, beobachtet in Lungen von Mäusen, welche mit Zellen injiziert wurden, die bei hypoxischen Bedingungen (1% O₂) kultiviert worden waren und eine Verabreichung von 2 × 10^–11 M GTN erhalten hatten.
Die 3 zeigt im Kreislauf befindliche Spiegel von Prostata-spezifischem-Antigen (PSA) in zwei Patienten, Patient A (3A) und Patient B (3B), welche einer radikalen Prostatektomie unterzogen worden waren. Ein scharfer Abfall in den Plasma-PSA-Spiegeln wurde in beiden Patienten innerhalb von zwei Monaten der Verabreichung der Niedrigdosis-NO-Mimetikum-Therapie beobachtet. Die Plasma-PSA-Spiegel wurden unter Verwendung eines Radioimmunassays gemessen, welcher eine Genauigkeit von ± 0,1 ng/ml aufweist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wir haben jetzt gezeigt, dass der Mechanismus, durch welchen Hypoxie und Hyponitroxie einen Einfluss auf Zellphänotypen besitzen, nicht lediglich wegen eines Sauerstoffmangels sondern vielmehr auch von einer Defizienz in der Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität vermittelt wird. Ferner haben wir nun gezeigt, dass die Verabreichung einer geringen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums ausreichend ist, um Spiegel an Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen so zu erhöhen, wiederherzustellen oder beizubehalten, dass ein maligner Zellphänotyp inhibiert oder verhindert wird. Diese Inhibition und Verhinderung findet sogar dann, wenn die Zellen in einer hypoxischen Umgebung vorliegen und/oder bei Kombination mit Inhibition der endogenen Stickstoffmonoxid-Herstellung statt. Die Verabreichung sehr geringer Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika war, sogar unter Bedingungen von ausgesprochen verringerten Sauerstoffspiegeln (1% O₂), in der Lage, die Erzeugung eines malignen Zellphänotyps zu verhindern und einen malignen Zellphänotyp von Zellen zu inhibieren.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung die Anwendung von Niedrigdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie in der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung und Verhinderung eines malignen Zellphänotyps von Zellen. Die Medikamente sehen neue therapeutische Vorgehensweisen für die Behandlung und Verhinderung von Krebs in Tieren vor. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird mit "Behandlung" oder "Behandeln" gemeint, alle Mittel zur Bekämpfung von Krebs durch Verringern des Wachstums von Zellen, die einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, und Verbessern der Antwort gegenüber antimalignen therapeutischen Modalitäten einzuschließen. Somit wird mit "Behandlung" oder "Behandeln" gemeint, das Überleben und/oder Wachsen von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu inhibieren, das Überleben und/oder Wachstum von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu verhindern, die Invasivität von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu verringern, die Progression von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu vermindern, die Metastasierung von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu verringern, die Regression von Zellen, welche einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu erhöhen und/oder die Tötung von Zellen, welchen einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, zu erleichtern. "Behandlung" oder "Behandeln" überspannt beabsichtigerweise ebenfalls das Beibehalten von Zellen, die einen malignen Zellphänotyp aufzeigen, in einem schlafenden Zustand an ihrer primären Stelle sowie an sekundären Stellen. Ferner wird mit "Behandeln" oder "Behandlung" gemeint, die Wirksamkeit von anti-malignen therapeutischen Modalitäten zu erhöhen sowie die Resistenz dagegen zu verhindern oder zu senken. Mit "anti-maligne therapeutische Modalitäten" wird beabsichtigt, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Strahlungstherapien, Wärmetherapien, Immuntherapien, Chemotherapien und andere Therapien einzuschließen, welche vom Fachmann auf dem Gebiet bei der Behandlung von Krebs und anderen Malignitäten angewandt werden. Mit "Erhöhen der Wirksamkeit" wird gemeint, eine Erhöhung der Wirksamkeit und/oder Aktivität der anti-malignen therapeutischen Modalität und/oder eine Verringerung der Entwicklung von Resistenz gegen die anti-maligne therapeutische Modalität einzuschließen. Verfahren zur Überwachung und/oder Diagnostizierung von malignen Zell-Phänotypen in einem Tier durch Messung von tumorselektiven Markern in einem Tier können in Gegenwart von Niedrigdosis-NO-Mimetikum-Therapie durchgeführt werden. Beispielhafte Tumormarker, nützlich zur Überwachung und Diagnostizierung von Tumor-Progression und -Metastasen, schließen, ohne Einschränkung darauf, Prostata-spezifisches Antigen (PSA) für Prostatakrebs, karzinoembryonisches Antigen (CEA) für Magen-Darm-Krebs, α-Fetoprotein und βHCG für Hodenkrebs, CA19-9 und CA72-4 für Magenkrebs, CA15-3 für Brustkrebs und die Zelloberflächen-Rezeptoren für Östrogen und Her-2 für Brustkrebs ein. Weitere Marker, welche für diagnostische Absichten überwacht werden können, schließen, ohne Einschränkung darauf, Protein, reguliert durch OXYgen-1 (PROXY-1), ebenfalls bekannt als NDRG-1, Plasminogenaktivator-Inhibitor (PAI-1), Plasminogenaktivator-Rezeptor vom Urokinase-Typ (uPAR) und vaskulären Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) ein. Wie vom Fachmann auf dem Gebiet bei Lektüre dieser Beschreibung verstanden werden wird, können ferner zusätzliche Tumormarker zu denjenigen, welche hierin beispielhaft aufgeführt wurden, ebenfalls überwacht werden. Der Tumormarker kann in einer biologischen Flüssigkeit, wie einem Serum, Plasma oder Urin, nachweisbar sein. Keine Veränderung, eine Abnahme oder Verlangsamung der Zunahme des Levels von einem oder mehreren dieser Marker in einem Tier im Anschluss an die Verabreichung einer geringen Dosis des Stickstoffmonoxid-Mimetikums im Vergleich zum Level des Markers in dem Tier vor der Verabreichung der geringen Dosis des Stickstoffmonoxid-Mimetikums ist hinweisend für einen malignen Zellphänotyp in dem Tier.
Für die Absichten der vorliegenden Erfindung wird mit dem Begriff "geringe Dosis" eine Menge, welche 3- bis 10 000-fach geringer als eine Dosis von Stickstoffmonoxid, welche eine Blutgefäßerweiterung hervorruft, gemeint. Eine solche Menge ist in der Lage, einen Level der Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität in Zellen zu erhöhen, wiederherzustellen oder aufrecht zu erhalten, der maligne Zellphänotypen inhibiert oder verhindert und/oder die Wirksamkeit einer anti-malignen therapeutischen Modalität erhöht, welche gemeinsam mit der geringen Dosis an NO-Mimetikum verabreicht wurde. Bei dieser niedrigen Dosis treten die bekannten nachteiligen Effekte von NO-Mimetika in Tieren ohne einen malignen Zellphänotyp nicht auf. Wie vom Fachmann bei der Lektüre dieser Beschreibung verstanden wird, erhöht, restauriert oder behält das Stickstoffmonoxid-Mimetikum Aktivität sowohl in als auch um die Zelle herum (d. h. in der zellulären Mikroumgebung).
Verfahren zur Bestimmung der Level an Stickstoffmonoxid von Zellen, basierend auf Nitrit-, Nitrat- und S-Nitrosothiol-Leveln in Zellkultur sowie Plasma und Serum, sind beschrieben worden. Serum- oder Plasma-Nitratspiegel in gesunden normalen Freiwilligen zeigen berichtetermaßen einen mittleren Stickstoffmonoxid-Level von 33,4 ± 8,9 μM mit einem Bereich von 14 bis 60 μM (Marzinzig et al., Nitric Oxide: Biology and Chemistry 1987 1(2):177 – 189). Diese Spiegel basieren jedoch auf NO-Synthase-Endprodukten, welche sich akkumulieren und repräsentieren daher wahrscheinlich eine Überschätzung der normalen physiologischen Stickstoffmonoxid-Spiegel. Berichtete gemessene Spiegel variieren auch in Abhängigkeit von dem für die Messung gewählten Verfahren. Ferner sind die Spiegel an Nitrit und Nitrat im Plasma oder Serum nicht allein repräsentativ für die NO-Produktion eines Patienten. Basierend auf unseren Experimenten nehmen wir an, dass abhängig von der Zelle normale physiologische Spiegel an Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen geringer, beispielsweise wenigstens 5-fach und vorzugsweise 10- bis 10 000-fach geringer sein können als diejenigen, welche im Fachgebiet berichtet werden.
Eine Kurzzeit-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie wird im allgemeinen bei Spiegeln verabreicht, welche die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen über die normalen physiologischen Spiegel hinaus erhöht. Wo allerdings eine längerfristige Therapie allgemein erwünscht ist, werden die Induktion von Toleranz gegen das NO-Mimetikum und Nebeneffekte zu ernsten Bedenken. Daher ist die Menge an Stickstoffmonoxid-Mimetikum, verwendet in der Herstellung des Medikaments, in der vor liegenden Erfindung so niedrig, dass die Entwicklung von Toleranz gegen das NO-Mimetikum und/oder ungewollte Nebeneffekte verzögert und/oder verringert werden, wenn das Medikament verabreicht wird. Es ist beispielsweise bekannt, dass die Verabreichung von Stickstoffmonoxid oder Verbindungen, welche Stickstoffmonoxid an Menschen bei Dosierungen zuführen, welche herkömmlich verwendet werden, um kardiovaskuläre Befunde (d. h. GTN bei 0,2 mg/h oder größer) durch Blutgefäßerweiterung zu behandeln, wirkungsvolle Gefäßerweiterungs-Antworten sowie die Entwicklung von Arzneimitteltoleranz gegen GTN bei wiederholter Verabreichung provozieren können. Eine solche Verabreichung wird häufig von einer Reihe ungewollter Nebenwirkungen begleitet, einschließlich Kopfweh, Erröten und Hypotonie. Im Gegensatz dazu ist in der vorliegenden Erfindung die Dosis von Stickstoffmonoxid-Mimetikum, verwendet in der Herstellung des Medikaments zum Inhibieren und Verhindern eines malignen Zellphänotyps, 3- bis 10 000-fach geringer, vorzugsweise mindestens 100- bis mindestens 10 000-fach geringer, als jene, welche typischerweise in anderen therapeutischen Anwendungen, wie Blutgefäßerweiterung, verwendet werden, und induziert daher weder so schnell Toleranz gegen das NO-Mimetikum noch ungewollte Nebenwirkungen. Unter Verwendung der Stickstoffmonoxid-Mimetika Natriumnitroprussid (SNP) und Glyceryltrinitrat (GTN), haben wir beispielsweise jetzt aufgezeigt, dass Mengen im Bereich zwischen 10^–12 und 10^–10 M in der zellulären Umgebung verwendet werden können, um einen malignen Zellphänotyp zu verhindern und zu inhibieren. Basierend auf Ergebnissen aus diesen Experimenten nehmen wir ferner an, dass so niedrige Dosen an SNP wie 10^–14 M zur Verhinderung und Inhibierung eines malignen Zellphänotyps in weniger hypoxischen oder hyponitroxischen Umgebungen effektiv sind. Die Tabelle 1 gibt weitere Beispiele verschiedener bevorzugter geringerer Dosierungen für in der vorliegenden Erfindung nützliche Stickstoffmonoxid-Mimetika sowie zum Vergleich die bei der Blutgefäßerweiterungs-Therapie verwendeten höheren Dosierungen an.
Tabelle 1 Typische gefäßerweiternde und Mikrodosierungen von Organonitrat
Wie der Fachmann auf dem Gebiet bei Lektüre dieser Beschreibung verstehen wird, können auch niedrigere oder höhere Mengen an Stickstoffmonoxid-Mimetika, als die hierin beispielhaft veranschaulichten, verabreicht werden, basierend auf der Wirksamkeit des Stickstoffmonoxid-Mimetikums zur Erzielung des letztendlichen Ziels der Erhöhung, Wiederherstellung oder Beibehaltung der Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen, so dass ein maligner Phänotyp verhindert oder inhibiert wird, ohne Entwicklung einer substanziellen Arzneimitteltoleranz gegen das NO-Mimetikum und ohne ungewollte Nebenwirkungen. Die Festlegung von Mengen an Stickstoffmonoxid-Mimetikum, welche in die Niederdosis-Formulierungen der vorliegenden Erfindung eingebracht werden sollen, kann vom Fachmann auf dem Gebiet basierend auf den hierin angegebenen Belehrungen routinemäßig vorgenommen werden.
Mit dem Ausdruck "Inhibieren und Verhindern", wie hierin verwendet, wird gemeint, einen biologischen Befund zu verringern, umzukehren oder zu lindern, abzumildern, zu normalisieren, zu bekämpfen oder damit umzugehen. Somit bezieht sich das Inhibieren und Verhindern eines malignen Zellphänotyps gemäß der vorliegenden Erfin dung auf die Verhinderung der Entwicklung, die Umkehrung oder Linderung der Entwicklung und/oder die Normalisierung, Bekämpfung oder Handhabung der Entwicklung eines malignen Zellphänotyps. Folglich kann die Verabreichung einer geringen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums (1) sowohl prophylaktisch, um die Entwicklung eines malignen Zellphänotyps in Tieren, welche ein hohes Risiko zur Entwicklung von Krebs aufweisen oder an einen Faktor exponiert sind, der bekanntermaßen die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen verringert, zu inhibieren und zu verhindern, als auch (2) zur Behandlung von Krebs in Tieren durch Inhibieren von Metastasen und Entwicklung von Resistenz gegen antimaligne therapeutische Modalitäten und durch Erhöhen der Effektivität von antimalignen therapeutischen Modalitäten, angewandt werden.
Gemäß Stedman's Medical Dictionary wird Malignität definiert als 1. resistent gegen Behandlung; auftretend in schwerer Form und häufig tödlich; Neigung zur Verschlimmerung und zu einem sich verschlimmernden Verlauf führend; 2. in Bezug auf ein Neoplasma, aufweisend die Eigenschaft zum örtlichen invasiven und destruktiven Wachstum und zur Metastase. Gemäß dieser Definition wird für die Absichten der vorliegenden Erfindung mit "maligner Zellphänotyp" gemeint, Erhöhungen der Metastasierung, Resistenz gegen antimaligne therapeutische Modalitäten und Angiogenese einzuschließen. Mit "maligner Zellphänotyp" wird für die Absichten der vorliegenden Erfindung auch gemeint, einschließlich der Zustände im Spektrum zu sein, welche zu einem malignen Verhalten und einer abnormen Invasivität führen, wie Hyperplasie, Hypertrophie und Dysplasie, sowie diejenigen Zellen und Gewebe, welche den malignen Prozess erleichtern. Beispiele von Zuständen in diesem Spektrum schließen, ohne Einschränkung darauf, gutartige prostatische Hyperplasia und Molenschwangerschaft ein.
Wie durch die hierin präsentierten Daten bewiesen, kann die Inhibition und Verhinderung eines malignen Zellphänotyps in Zellen routinemäßig durch Untersuchung der Expression von Genen, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, uPAR, PSA, PAI-1, PROXY-1 und VEGF, durch Untersuchen der Zell-Invasivität in in-vitro- oder in- vivo-Assays und/oder durch Untersuchen der Resistenz der Zellen gegen antimaligne therapeutische Modalitäten bestimmt werden. Es wird angenommen, dass eine erhöhte Phosphodiesterase-Expression und/oder -Aktivität in Zellen mit einem malignen Zellphänotyp beobachtet werden kann. Verfahren zum Messen der Expression dieser Gene sind zum Beispiel in der WO 99/57306 beschrieben worden. Wie der Fachmann auf dem Gebiet bei der Lektüre dieser Beschreibung verstehen wird, können jedoch auch andere Verfahren zur Bestimmung der Genexpression durch Messen von exprimiertem Protein oder proteolytischen Fragmenten davon angewandt werden.
Für die Absichten der vorliegenden Erfindung wird mit dem Begriff "Stickstoffmonoxid-Mimetikum" Stickstoffmonoxid oder ein funktionelles Äquivalent davon; jede Verbindung, welche die Effekte von Stickstoffmonoxid nachahmt, durch Biotransformation Stickstoffmonoxid erzeugt oder freisetzt, Stickstoffmonoxid spontan erzeugt oder Stickstoffmonoxid spontan freisetzt; jede Verbindung, welche in irgendeiner anderen Weise Stickstoffmonoxid oder eine Stickstoffmonoxid-artige Einheit erzeugt oder andere Stufen des NO-Weges aktiviert, oder jedwede Verbindung, welche die NO-Verwendung durch die Zelle ermöglicht oder erleichtert, wenn sie an das Tier verabreicht wird, gemeint. Derartige Verbindungen können auch als "NO-Donoren", "NO-Proarzneimittel", "NO-erzeugende Mittel", "NO-abgebende Verbindungen", "NO-erzeugende Mittel" und "NO-Versorger" bezeichnet werden. Beispiele solcher Verbindungen schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, folgendes ein: Organonitrate, wie Nitroglycerin (GTN), Isosorbid-5-mononitrat (ISMN), Isosorbiddinitrat (ISDN), Pentaerythritol-Tetranitrat (PETN), Erythrityl-Tetranitrat (ETN); Aminosäurederivate, wie N-Hydroxyl-L-arginin (NOHA), N⁶-(1-Iminoethyl)lysin (L-NIL), L-N⁵-(1-Iminoethyl)ornithin (LN-NIO), N^W-Methyl-L-arginin (L-NMMA), und S-Nitrosoglutathion (SNOG); und andere Verbindungen, welche NO unter physiologischen Bedingungen erzeugen oder freisetzen, wie S,S-Dinitrosodithiol (SSDD), [N-[2-(Nitroxyethyl)]-3-pyridincarboxamid (Nicorandil), Natriumnitroprussid (SNP), S-Nitroso-N-acetylpenicilamin (SNAP), 3-Morpholino-Sydnonimin (SIN-1), Molsidomin, DEA-NONOat (2(N,N-Diethylamino)-diazenolat-2-oxid) und Spermin-NONOat (N-[4- [1-(3-Aminopropyl)-2-hydroxy-2-nitrosohydrazino]butyl-1,3-propandiamin). Die organischen Nitrate GTN, ISMN, ISDN, ETN und PETN sowie Nicorandil (üblicherweise bekannt als ein Kaliumkanal-Öffner) sind in pharmazeutischen Dosierungsformen kommerziell erhältlich. SIN-1, SNAP, S-Thioglutathion, L-NMMA, L-NIL, L-NIO, Spermin-NONOat und DEA-NONOat sind kommerziell von Biotium, Inc. Richmond, CA., erhältlich. Wie hierin verwendet, wird mit dem Begriff "Stickstoffmonoxid-Mimetikum" ebenfalls beabsichtigt, jegliche Verbindung zu bedeuten, welche als ein Stickstoffmonoxid-Weg-Mimetikum wirkt, welches Stickstoffmonoxid-artige Aktivität aufweist oder welches den Effekt von Stickstoffmonoxid nachahmt. Derartige Verbindungen müssen nicht notwendigerweise Stickstoffmonoxid freisetzen, erzeugen oder vorsehen, aber sie besitzen einen zu Stickstoffmonoxid ähnlichen Effekt auf einen Weg, der von Stickstoffmonoxid beeinflusst wird. Zum Beispiel besitzt Stickstoffmonoxid sowohl von cyclischem GMP abhängige als auch von cyclischem GMP unabhängige Effekte. Stickstoffmonoxid aktiviert bekanntermaßen die lösliche Form von Guanylylcyclase, wodurch es die intrazellulären Level des "Second-Messengers" Cyclo-GMP und andere Wechselwirkungen mit weiteren intrazellulären "Second-Messengers", wie cyclischem AMP, erhöht. Als solches sind Verbindungen, welche entweder teilchenförmige oder lösliche Guanylylcyclase direkt aktivieren, wie natriuretische Peptide (ANP, BNP und CNP), 3-(5'-Hydroxymethyl-2'furyl)-1-benzylindazol (YC-cGMP oder YC-1) und 8-(4-Chlorphenylthio)guanosin-3',5'-cyclomonophosphat (8-PCPT-cGMP), ebenfalls Beispiele für NO-Mimetika. In manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird es jedoch bevorzugt, dass das NO-Mimetikum keine Verbindung einschließt, welche entweder teilchenförmige oder lösliche Guanylylcyclase direkt aktiviert. Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität beinhaltet diejenigen Signaltransduktions-Prozesse oder -Wege, welche mindestens ein NO-Mimetikum-bindendes Effektormolekül umfassen, wie beispielsweise Guanylylcyclase oder andere Häm-enthaltende Proteine. Beispiele von Mitteln, welche als NO-Mimetika durch Ermöglichen oder Erleichtern der NO-Verwendung durch die Zelle wirken, sind Verbindungen, welche Phosphodiesterase-Aktivität und/oder -Expression inhibieren, wie Phosphordiesterase-Inhibitoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mehr als ein NO-Mimetikum verabreicht. In dieser Ausführungsform wird es bevorzugt, dass das NO-Mimetikum auf andere Teile des NO-Wegs der Zelle zielt oder einwirkt. Beispielsweise kann ein NO-Donor mit einer Verbindung, welche den Abbau von cyclischem Nukleotid (z. B. cAMP oder cGMP) inhibiert, wie einem Phosphodiesterase-Inhibitor, co-verabreicht werden. Bevorzugte als NO-Mimetika nützliche Phosphordiesterase(PDE)-Inhibitoren sind diejenigen, welche PDE-1 bis PDE-5 inhibieren.
Mit dem Begriff "Hyponitroxie" sind in der vorliegenden Erfindung Zustände gemeint, bei welchen die Spiegel der Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität niedriger als normale physiologische Spiegel für diesen Zelltyp sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird mit dem Begriff "Tier" beabsichtigt, alle Säugetiere und insbesondere Menschen einzuschließen. Vorzugsweise werden NO-Mimetika an ein Tier verabreicht, welches in der Gefahr für einen malignen Zellphänotyp steht oder darunter leidet. Derartige Tiere werden hierin auch als Subjekte oder Patienten, welche einer Behandlung bedürfen, bezeichnet.
Niedrige Sauerstoffspiegel sind mit einem erhöhten Level an zellulärer Invasion und Invasivität in Zusammenhang gebracht worden. Hypoxischer Stress verursacht eine Vielfalt von zellulären Anpassungen, welche sich häufig in der Aufwärts-Regulation bestimmter Gene manifestieren.
Es ist beispielsweise gezeigt worden, dass uPAR-mRNA und Zelloberflächen-uPAR-Proteinspiegel unter hypoxischen Bedingungen ansteigen. uPAR ist ein Hochaffinitäts-Zelloberflächenrezeptor für Pro-Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (pro-uPA). Bei der Bindung von pro-uPA an uPAR wird der inaktive Einzelketten-pro-uPA zu seiner aktiven Zwei-Ketten-Form gespalten. Das aktivierte Enzym, noch gebunden an den Rezeptor, wirkt dann zur Umwandlung von Plasminogen in Plasmin, welches letztendlich mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) zersetzt. Aktives uPA dient auch zur Aktivierung sowohl von latenten Metalloproteinasen als auch Wachstumsfaktoren. uPAR dient auch als ein Rezeptor für das ECM-Molekül Vitronectin. In Kombination erhöhen diese Funktionen die Zell-Invasion und das Potenzial für die Invasivität. Eine positive Korrelation zwischen der Hypoxie-induzierten uPAR-Aufwärtsregulierung und der Karzinom-Zellinvasivität ist vorgeschlagen worden (Graham et al. Int. J. Cancer 1999 80:617 – 623). Darüber hinaus haben wir nun gezeigt, dass eine Hyponitroxie, induziert durch Verabreichung des Stickstoffmonoxid-Synthase-Antagonisten L-NMMA (0,5 mM) bei hypoxischen (1% O₂) und nicht-hypoxischen (5% und 20% O₂) Bedingungen, die uPAR-mRNA-Spiegel in 24 Stunden lang bei 37° inkubierten humanen MDA-MD-231-Zellen erhöht.
Auch von PAI-1 ist gezeigt worden, unter hypoxischen Bedingungen stimuliert zu werden; siehe WO 99/57306. Ferner wurde diese Stimulation von einer Verringerung der Zelladhäsion begleitet. PAI-1 ist ein 52 kDa großes ECM-Glycoprotein, welches von einer Vielzahl normaler und maligner Zellen hergestellt wird. Dieses Glycoprotein ist ein Regulator der Plasminogenaktivator-Aktivität. Es fungiert, um sowohl freies als auch gebundenes uPA durch die Bildung von irreversiblen kovalenten Komplexen zu inhibieren. Von PAI-1 wurde auch gezeigt, mit dem uPAR um die Bindung an die gleiche Domäne von Vitronectin zu kompetieren. Als solches ist PAI-1 in der Lage, an Vitronectin-beschichtete Platten gebundene Zellen freizusetzen. Untersuchungen haben gezeigt, dass PAI-1 für die optimale in vitro-Invasivität von Lungenkarzinomzellen erforderlich ist.
Hypoxie erhöht gezeigtermaßen auch die Resistenz von Zellen gegen zytotoxische Mittel. Das Gen für PROXY-1 wurde identifiziert unter Verwendung eines RT-PCR-basierenden Differenzial-Displays im Anschluss an die Kultivierung einer Vielzahl von Zelltypen unter niedrigen Sauerstoff-Spiegeln; siehe WO 99/57306. Man nimmt an, dass das 43-kDa große PROXY-1-Protein eine Rolle beim Schützen der Zellen vor Verletzungen, einschließlich Hypoxie, DNA-schädigenden Mitteln, zytotoxischen Mitteln und Glucose-Auszehrung, spielt, da eine erhöhte PROXY-1-Expression in Antwort auf jeden dieser schädigenden Stimuli beobachtet wird. Zusammen mit der Tatsache, dass dieses Gen von einer Vielzahl von nicht-verwandten Zelltypen exprimiert wird, weist dieser Typ von Genexpression PROXY-1 als einen universellen "Schalter" aus, welcher an den Anfangsereignissen beteiligt ist, welche zu zellulären Adaptationen an Hypoxie führen.
Wir haben nun festgestellt, dass Stickstoffmonoxid ein primärer Mediator von zellulären adaptiven Antworten auf Änderungen in den Sauerstoffspiegeln in und um die Zelle ist. Durch Verabreichung einer geringen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums haben wir gezeigt, dass die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität erhöht, wiederhergestellt oder bei einem Level gehalten werden kann, der einen malignen Zellphänotyp inhibiert oder verhindert. Im Gegensatz dazu war der Effekt der Beibehaltung geringer Sauerstoffspiegel auf Zellen auf das Inhibieren basaler Spiegel der endogenen Stickstoffmonoxid-Produktion beschränkt.
Unter hypoxischen Bedingungen, bei welchen die Sauerstoffspiegel limitierend sind, haben wir jetzt gezeigt, dass Krebszelllinien eine oder mehrere der folgenden malignen Zell-phänotypischen Eigenschaften erwerben: Sie steigern ihre Lungen-Kolonisierungs-Fähigkeit im Anschluss an eine i.v. Inokulation in syngeneische Mäuse (experimentelle Metastase); sie erhöhen ihre Invasivität durch die extrazelluläre Matrix in vitro (ebenfalls relevant für Metastase); und sie werden resistenter gegen das chemotherapeutische Arzneimittel Doxorubicin. In diesen Experimenten wurden Krebszellen an 1% O₂ (10 – 15 mmHg pO₂) exponiert, um Hypoxie zu induzieren, und mit nicht-hypoxischen Krebszellen verglichen, welche an 5 – 20% O₂ (30 – 160 mmHg) exponiert worden waren. Durch Verabreichen niedriger Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika (während Perioden, als die Sauerstoffspiegel limitierend waren und/oder als die endogene Stickstoffmonoxid-Produktion inhibiert war) wird der Erwerb dieser malignen phänotypischen Änderungen verhindert. Diese Verhinderung findet sogar dann statt, wenn die Zellen in einer extrem hypoxischen Umgebung vorliegen.
Wir haben nun aufgezeigt, dass niedrige Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika SNP und/oder Glyceryltrinitrat (GTN) die hypoxische Aufwärtsregulation von uPAR und PAI-1 sowie PROXY-1 inhibieren. Von einer ähnlichen Niedrigdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie wird erwartet, ebenfalls bei der Inhibierung der hyponitroxischen Aufwärtsregulierung dieser Gene, wie derjenigen, beobachtet in Zellen, behandelt mit L-NMMA (0,5 mM), d. h. zur Inhibierung und Verhinderung eines malignen Zellphänotyps wirksam zu sein.
Experimente, durchgeführt in humanen Brustkrebszellen, kultiviert unter hypoxischen Bedingungen (1% O₂), zeigten, dass die Behandlung der hypoxischen Zellen mit 10-¹²M SNP die Spiegel an uPRA-mRNA signifikant im Vergleich zu unbehandelten hypoxischen Kontroll-Zellen und mit 10^–8 M SNP behandelten hypoxischen Zellen verringerte. In ähnlicher Weise reduzierte die Behandlung von Brustkrebszellen, kultiviert unter hypoxischen Bedingungen mit dem Stickstoffmonoxid-Mimetikum GTN bei niedrigen Dosen bei 10^–11 M und 10^–10 M, signifikant uPAR-mRNA-Spiegel in den hypoxischen Zellen im Vergleich zu unbehandelten hypoxischen Zellen und zu hypoxischen Zellen, behandelt mit GTN bei 10^–9 M, 10^–8 M, 10^–7 M, 10^–6 M und 10^–5 M. In der Tat waren die Spiegel von uPAR-mRNA in hypoxischen Brustkrebszellen, behandelt mit 10^–11 M GTN und 10^–10 M GTN, ähnlich zu den Spiegeln von uPAR-mRNA, welche in Zellen gemessen wurden, die unter nicht-hypoxischen Bedingungen (20% O₂) kultiviert worden waren. Die Spiegel von uPAR-mRNA in mit GTN bei 10^–6 M und 10^–5 M behandelten hypoxischen Zellen waren ähnlich zu den Spiegeln von unbehandelten hypoxischen Zellen, was eine Toleranz gegenüber dem NO-Mimetikum nahe legt. Eine Verringerung der uPAR-Proteinspiegel wurde in diesen Zellen 24 Stunden nach der Inkubation mit diesen Stickstoffmonoxid-Mimetika auch beobachtet.
Ferner bestätigten Experimente mit humanen invasiven Trophoblastenzellen (HTR-8/SVneo) die Fähigkeit von geringen Dosen dieser Stickstoffmonoxid-Mimetika, die Expression von uPAR in hypoxischen Zellen zu senken.
Die Auswirkungen der Behandlung von invasiven HTR-8/SVneo-Trophoblastenzellen mit dem Stickstoffmonoxid-Mimetikum GTN auf mRNA-Spiegel von PROXY-1 wurden ebenfalls untersucht. Die PROXY-1-mRNA-Spiegel waren in Zellen, kultiviert in 20% O₂, sehr niedrig. Allerdings wurden die Spiegel an PROXY-1-mRNA in Zellen, kultiviert in 1% O₂, welche unbehandelt oder mit 10^–7 M GTN behandelt waren, erhöht. Im Vergleich dazu waren die Spiegel an PROXY-1 in hypoxischen Zellen, behandelt mit einer niedrigen Dosis, 10^–11 M GTN, viel niedriger.
Darüber hinaus wurden die Auswirkungen der Stickstoffmonoxid-Mimetika SNP und GTN auf die PAI-1-mRNA-Spiegel in Brustkrebszellen untersucht. Wiederum verringerte die Behandlung hypoxischer Zellen mit niedrigen Dosierungen der Stickstoff monoxid-Mimetika SNP (10^–12 M) und GTN (10^–11 M) signifikant die Spiegel von PAI-1-mRNA im Vergleich zu unbehandelten hypoxischen Zellen.
Es wurden auch Experimente durchgeführt, um die Effekte von geringen Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika auf die Spiegel von Metalloproteinase zu bestätigen. Brustkrebszellen wurden unter hypoxischen oder Kontroll-Bedingungen in Gegenwart variierender Konzentrationen von SNP oder GTN inkubiert. Die Behandlung hypoxischer Zellen mit geringen Dosen, 10^–11 M GTN und 10^–12 M SNP, eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums führten zu einer Verringerung der von den Zellen sezernierten Metalloproteinasen im Vergleich zu unbehandelten hypoxischen Zellen.
Dann wurde funktionell gezeigt, dass eine Inhibition der hypoxischen Aufwärtsregulierung dieser Gene zu einer Verringerung der zellulären Invasivität und Arzneistoffresistenz führt. Das Invasionsvermögen von Zellen unter hypoxischen Bedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit von Stickstoffmonoxid-Mimetika wurde auch unter Verwendung von MATRIGEL-Invasionskammern (modifizierte Boyden-Kammern) überprüft. In diesen in vitro-Invasionsassays wurden entweder Brustkrebszellen (siehe 1) oder invasive HTR-8/SVneo-Trophoblasten auf MATRIGEL-beschichtete Membranen ausplattiert. Die Zellen wurden dann unter hypoxischen oder normalen Bedingungen, allein oder in Gegenwart von Stickstoffmonoxid-Mimetika, inkubiert. Der Invasionsindex für jede Behandlung wurde durch Färbung der Zellen, welche durch die Membran durchgedrungen waren, und Zählen derselben bestimmt. In beiden Zelllinien reduzierte die Behandlung mit niedrigen Dosierungen an Stickstoffmo noxid-Mimetika signifikant die hypoxische Zell-Invasivität im Vergleich zu unbehandelten hypoxischen Zellen. Die Invasions-Indizes von hypoxischen Brustkrebszellen, behandelt mit 10^–10 M SNP und 10^–11 M GTN, waren ähnlich zu oder sogar geringer als bei Zellen, welche unter nicht-hypoxischen Bedingungen kultiviert worden waren. Bei den HTR-8/SVneo-Trophoblasten-Zellen inhibierte 10^–7 M GTN die Invasivität hypoxischer Zellen um 56,2%, während 10^–8 M SNP die Invasivität um 63,4% inhibierte.
Das Vermögen niedriger Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika, Metastasen von Tumorzellen in Tieren zu inhibieren, wurde dann bestätigt. In einem ersten Satz von Experimenten wurde die Fähigkeit von hypoxischen Bedingungen, die Anzahl von Metastasen zu erhöhen, aufgezeigt. In diesen Experimenten erhielten Mäuse über die Schwanzvene eine Injektionsverabreichung eines Bolus von metastatischen Melanomzellen. Unmittelbar nach der Injektion wurden die Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt. Die erste Gruppe wurde in eine Kammer mit einem kontinuierlichen Fluss einer Gasmischung, umfassend 21% O₂ (Raumluft), eingebracht. Die zweite Gruppe wurde in eine hypoxische Umgebung mit nur 10% O₂ eingebracht. Nach 24 Stunden wurden beide Gruppen entnommen und in bei Raumluft gehaltene reguläre Käfige eingebracht. Nach 14 Tagen wurden die Tiere getötet, und Metastasen-Knötchen in den Lungen der Tiere wurden gezählt. Die Tiere in der hypoxischen Umgebung wiesen eine 2-fach statistisch höhere Anzahl an Lungenknoten im Vergleich zu den Tieren in der nicht-hypoxischen Umgebung auf.
In einem zweiten Satz von Experimenten erhielten Mäuse eine Injektion mit Maus-Melanomzellen, welche 12 Stunden lang in 1% oder 20% O₂ in Gegenwart oder Abwesenheit einer niedrigen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums (GTN; 2 × 10^–11 M) präinkubiert worden waren. Nach vierzehn Tagen wurden die Mäuse getötet, und die Lungen wurden hinsichtlich Metastasenknoten visuell untersucht. Darüber hinaus wurde die Anzahl an Lungenknötchen in diesen Mäusen verglichen. Die Lungen von Tieren, welchen hypoxische und nicht-hypoxische Melanomzellen, behandelt mit dem Stickstoffmonoxid-Mimetikum vor der Injektion, verabreicht worden waren, zeigten statistisch weniger Metastasenknoten im Vergleich zu Tieren, denen jeweils unbehandelte hypoxische und nicht-hypoxische Melanomzellen verabreicht worden waren (siehe 2). Spezifisch die in vitro-Vorbehandlung mit 2 × 10^–11 M GTN verringerte die Hypoxie-stimulierte Lungenknotenbildung um 85%, und sogar bei 20% Sauerstoff verringerte die GTN-Vorbehandlung das Ausmaß der Metastase um mehr als 60%. Tatsächlich wurde von der Unterdrückung der Lungenknotenbildung durch die GTN-Vorbehandlung festgestellt, ungeachtet der in vitro-Oxygenierungsspiegel äquivalent zu sein. Ferner führte eine Behandlung der Zellen mit L-NMMA vor der Inokulation in Mäuse zu einer 63%igen Gesamtzunahme der Anzahl von Lungenknoten (p < 0,01; post hoc Fisher-Test). Die einhergehende Behandlung unter Verwendung von GTN (10^–10 M) und L-NMMA attenuierte diese metastatische Antwort um 60% (p < 0,0005). Die Häufigkeitsverteilung von Lungenknoten über die drei experimentellen Gruppen hinweg lag im Bereich von 0 bis 111. In zwei der Kontrollmäuse und vier der GTN-behandelten Mäuse wurden keine Lungenknoten gefunden. Die Charakterisierung der Lungenknoten-Frequenz durch Tertile zeigte ein konsistentes Muster der Unterdrückung über die gesamte NO-Mimetikum-behandelte Gruppe hinweg, verglichen mit der L-NMMA-behandelten Gruppe. Darüber hinaus lag die Metastasierung bei der GTN-behandelten Gruppe signifikant unterhalb sogar der Kontrollspiegel im höchsten Tertil. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Spiegel von NO, und nicht Sauerstoff selbst, die Schwere des Metastasen-Phänotyps bestimmen. Ferner beruhte der Effekt der Niederkonzentration-GTN-Behandlung auf die Lungenknotenbildung nicht auf einem nicht-spezifischen zytotoxischen oder wachstumsinhibierenden Effekt auf die Zellen, da sie ein ähnliches Koloniebildungsvermögen in vitro wie unbehandelte Zellen aufwiesen.
Wie vom Fachmann auf dem Gebiet bei Lektüre dieser Beschreibung verstanden werden wird, können Ergebnisse aus den Untersuchungen in diesem Mausmodell verwendet werden, um die Arzneimittel-Disposition in anderen Spezies, einschließlich Menschen, vorherzusagen, um pharmakokinetische Äquivalenz in verschiedenen Spezies, einschließlich des Menschen, zu definieren und Dosierungsschemata für andere experimentelle Tiermodelle und für humane klinische Untersuchungen zu entwerfen.
Ein derartiges pharmakokinetisches Scaling wird routinemäßig auf der Grundlage von Daten durchgeführt, wie sie hierin bereitgestellt werden, wie durch Bezugsstellen, wie Mordenti, J. J. Pharm. Sci. 1986 75 (11):1028 – 1040, bewiesen wird.
Ferner wurde die Fähigkeit eines NO-Mimetikums, den Krankheitsfortschritt in Menschen zu verringern, aufgezeigt. In dieser Untersuchung wurden kontinuierliche transdermale Pflaster verwendet, um sehr geringe Dosen an GTN (0,033 mg/Stunde) an Patienten mit wiederkehrendem prostatischen Adenokarzinom zuzuführen. Patienten mit prostatischem Adenokarzinom wurden für diese Untersuchung gewählt, weil der Fortschritt dieses Krebstyps gut mit den Plasmaspiegeln von Prostataspezifischem Antigen (PSA) korreliert. Somit kann das Ergebnis der Niedegdosis-NO-Mimetikum-Therapie leicht durch Messen der PSA-Spiegel überprüft werden. Einer Analyse von Daten aus zwei Patienten in dieser Untersuchung enthüllte einen scharfen Abfall der Plasma-PSA-Spiegel innerhalb von zwei Monaten der GTN-Behandlung, wodurch gezeigt wird, dass die Niederdosis-NO-Mimetikum-Therapie ein effektives Vorgehen im Umgang mit Krebs, insbesondere Prostata-Krebs, in Menschen ist (siehe 3A und 3B). Die Plasma-PSA-Spiegel wurden durch ein kommerziell erhältliches Immunoassay-Kit, wie Immuno 1 (Bayer Corporation), gemessen.
Die Fähigkeit geringer Dosen an Stickstoffmonoxid-Mimetika, die Resistenz von Brustkrebszellen gegen Doxorubicin zu verringern, wurde ebenfalls untersucht. In diesen Experimenten wurde zuerst die Fähigkeit hypoxischer Bedingungen, eine Resistenz gegen Doxorubicin zu erhöhen, bestätigt. Zellen, welche an 1% O₂ exponiert worden waren, hatten bei Konzentrationen von 25 und 50 μM Doxorubicin höhere Überlebensraten im Vergleich zu Zellen, welche an 20% O₂ exponiert worden waren. Der Effekt niedriger Dosen des Stickstoffmonoxid-Mimetikums GTN auf die Doxorubicin-Resistenz von hypoxischen und nicht-hypoxischen Zellen wurde dann untersucht. Es wurde festgestellt, dass hypoxische Krebszellen, behandelt mit 10^–6 M und 10^–10 M GTN, geringere Doxorubicin-Überlebensraten im Vergleich zu unbehandelten hypoxischen Zellen aufwiesen. Die Überlebensraten der mit Stickstoffmonoxid-Mimetikum behandelten hypoxischen Zellen waren vergleichbar zu denjenigen, beobachtet in unbehandelten nicht-hypoxischen Zellen und nicht-hypoxischen Zellen, behandelt mit dem Stickstoffmonoxid-Mimetikum. Diese Ergebnisse sind in mehreren menschlichen Krebsarten sowie Maus-Krebsarten und mit anderen antimalignen therapeutischen Modalitäten bestätigt worden.
Somit zeigen diese Untersuchungen, dass ein maligner Zellphänotyp, wie derjenige, induziert durch Hypoxie, inhibiert und verhindert werden kann durch Erhöhen (Wiederherstellen) des Spiegels der Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität. Andere Faktoren, welche bekanntermaßen die zelluläre Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität senken, so dass ein maligner Zellphänotyp induziert wird, schließen, ohne Einschränkung darauf, Verringerung der Arginin-Spiegel, Exposition an endogene Stickstoffmonoxid-Synthase-Antagonisten, wie L-NMMA und ADMA, Exposition an endogene Stickstoffmonoxid-Abfangmittel, wie Superoxid, Änderungen der Expression von Stickstoffmonoxid-Synthase, Änderungen in Kofaktoren, wie GSH und NADPH, Glukose-Auszehrung, chirurgische Vorgehensweisen, Verabreichung von Betäubungsmitteln, Verabreichung von pharmakologischen Mitteln, welche den Kreislauf verändern, wie, ohne Einschränkung darauf, antihypertensive Mittel, und traumatische Verletzungen, einschließlich, ohne Einschränkung darauf, diejenigen, assoziiert mit Blutverlust, verringertem Blutvolumen und Blutung, ein. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Inhibieren und Verhindern eines malignen Zellphänotyps, welcher aus diesen und anderen Faktoren resultiert, durch Verabreichen geringer Dosen eines oder mehrerer Stickstoffmonoxid-Mimetika.
Die Niedrigdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Medikamente, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, werden auch den malignen Zellphänotyp von Gefäßendothelzellen verhindern, welcher letztendlich aus der Rekrutierung derartiger Zellen durch einen Tumor und die Entwicklung einer Blutversorgung zum Tumor resultiert, was auch als Angiogenese bekannt ist. Versuche zum Abschneiden der Tumorblutversorgung durch Blockieren von VEGF in Gefäßendothelzellen sind als Krebs-Behandlungen relativ erfolglos geblieben. Das Vorhandensein von VEGF in Tumoren hat gezeigtermaßen die Tumorinvasivität unterdrückt. Somit wird angenommen, dass Mittel, welche die Wirkungen von VEGF entfernen oder blockieren, wie Anti-VEGF-Antikörper, eigentlich aggressivere Krebszell-Phänotypen erzeugen. Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung kann jedoch die Erzeugung eines aggressiveren malignen Zellphänotyps verhindert werden, wodurch die Verwendung von Anti-VEGF-Therapien zur Verhinderung von Angiogenese ohne Erzeugung von aggressiveren Krebszellen gestattet wird.
Diese Untersuchungen zeigen auch die Fähigkeit der Niederdosis-NO-Mimetikum-Therapie, Spiegel eines Tumormarkers in einem Patienten zu senken. Die Tumormarker-Spiegel werden vom Fachmann routinemäßig als Indikatoren des Fortschreitens eines Krebses verwendet. Folglich ist die Fähigkeit der Niederdosis-NO-Mimetikum-Therapie, die Spiegel dieser Marker zu verringern, kennzeichnend für ihre Fähigkeit, Krebsarten zu behandeln. Ferner kann die Progression eines Tumors in einem Patienten diagnostiziert und/oder überwacht werden durch Messen der Spiegel eines Tumormarkers in dem Patienten in Gegenwart einer niedrigen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums.
Niedegdosis-Formulierungen der Stickstoffmonoxid-Mimetika, welche letztendlich zu einer Erhöhung, Wiederherstellung oder Beibehaltung von Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen führen, ausreichend zur Verhinderung oder Inhibierung eines malignen Zellphänotyps, können gemäß im Fachgebiet bekannten Formulierungsverfahren hergestellt werden. Medikamente der vorliegenden Erfindung zur Verabreichung von Stickstoffmonoxid-Mimetika können die Form von Salben, transdermalen Pflastern, transbuccalen Pflastern, injizierbaren Formen, Nasen-Inhalationsformen, Spray-Formen für Tieflungen-Zuführung durch den Mund, oral verabreichten essbaren Tabletten und Kapseln und Tabletten oder Pastillen oder "Lollipop"-Formulierungen zur Verabreichung durch das Mundschleimhautgewebe einnehmen. Die letztgenannten Formulierungen schließen Tabletten, Pastillen und dergleichen ein, welche aufgelöst werden, während sie auf oder unter der Zunge oder in der Backentasche gehalten werden. Die pharmazeutischen Präparationen oder Medikamente sehen eine geringe Dosis des Stickstoffmonoxid-Mimetikums vor, welche 3- bis 10 000-fach geringer ist als eine Dosis von Stickstoffmonoxid-Mimetikum, die zur Blutgefäßerweiterung führt, und welche ausreichend ist, um die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität auf einen Spiegel zu erhöhen, wiederherzustellen oder beizubehalten, welcher einen malignen Zellphänotyp inhibiert oder verhindert, was hierin auch als eine therapeutisch wirksame Menge bezeichnet wird, während der Periode, in welcher die zelluläre Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität von Zellen vermindert ist. Formulierungen oder Medikamente können vorzugsweise mehr als ein NO-Mimetikum umfassen. In dieser Ausführungsform wird es bevorzugt, dass das NO-Mimetikum auf verschiedene Teile des NO-Weges zielt oder einwirkt. Zum Beispiel kann ein NO-Donor mit einer Verbindung gemeinsam verabreicht wird, welche den Abbau von zyklischen Nukleotiden (z. B. cAMP oder cGMP) inhibiert, wie einem Phosphodiesterase-Inhibitor. Bevorzugte Phospodiesterase(PDE)-Inhibitoren, nützlich als NO-Mimetika, sind diejenigen, welche PDE-1 bis PDE-5 inhibieren.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Stickstoffmonoxid-Mimetikums, gemeinsam formuliert mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger" ein nicht-toxisches, inertes festes, halbfestes oder flüssiges Füllmaterial, Verdünnungsmittel, einkapselndes Material oder einen Formulierungshilfsstoff von jedwedem Typ. Einige Beispiele von Materialien, welche als pharmazeutisch annehmbare Träger dienen können, sind Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; Zellulose und ihre Derivate, wie Natriumcarboxymethylzellulose, Ethylzellulose und Zelluloseacetat; pulverförmiger Tragant; Malz; Gelatine; Talkum; Exzipienten, wie Kakaobutter und Suppositorien-Wachse; Öle, wie Erdnussöl, Baumwollöl; Saffloröl; Sesamöl; Olivenöl; Maisöl und Sojabohnenöl; Glycole, wie ein Propylenglycol; Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; Pyrogen-freies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Ringer-Lösung; Ethylalkohol und Phosphatpufferlösungen, sowie andere nichttoxische kompatible Gleitmittel, wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat. Färbemittel, Trennmittel, Beschichtungsmittel, Süßstoffe, Geschmackmittel und Duftstof fe, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel können ebenfalls in der Formulierung gemäß der Beurteilung des Formulators vorhanden sein. Die Formulierungen dieser Erfindung können an Menschen und andere Tiere oral, rektal, parenteral, intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (wie durch Pulver, Salben oder Tropfen), supralingual (auf der Zunge), sublingual (unter der Zunge), buccal (in der Backentasche gehalten) oder als ein orales oder nasales Spray verabreicht werden. Das orale Spray kann in der Form eines Pulvers oder Nebels vorliegen, welcher durch orale Inhalation in die tiefen Lungen zugeführt wird.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung schließen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere ein. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, welche üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, enthalten, wie zum Beispiel Wasser oder andere Lösungsmittel, solubilisierende Mittel und Emulgatoren, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Baumwoll-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Kastor- und Sesamöle), Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Mischungen hiervon. Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Formulierungen auch Hilfsstoffe einschließen, wie Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, Süßmacher, Geschmacksstoffe und Duftstoffe. Injizierbare Präparationen, beispielsweise sterile injizierbare wässrige oder ölartige Suspensionen können gemäß dem bekannten Fachgebiet unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Präparation kann auch eine sterile injizierbare Lösung, Suspension oder Emulsion in einem nicht-toxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, wie zum Beispiel eine Lösung in 1,3-Butandiol. Zu den annehmbaren Vehikeln und Lösungsmitteln, welche verwendet werden können, zählen Wasser, Ringer-Lösung, U. S. P. und isotonische Natriumchloridlösung. Darüber hinaus werden herkömmlicherweise sterile fixierte Öle als ein Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Für diesen Zweck kann jegliches milde fixierte Öl verwendet werden, einschließlich synthetischen Mono- oder Diglyceriden. Weiterhin werden Fettsäuren, wie Ölsäure, in der Herstellung von injizierbaren Formen verwendet.
Die injizierbaren Formulierungen können sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien-zurückhaltenden Filter, oder durch Einbinden von sterilisierenden Mitteln in der Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilen Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium vor der Verwendung gelöst oder dispergiert werden können.
In Fällen, wo es wünschenswert ist, die Wirkung des Stickstoffmonoxid-Mimetikums zu verlängern, kann die Absorption des Stickstoffmonoxid-Mimetikums aus einer subkutanen oder intramuskulären Injektion verlangsamt werden. Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension von kristallinem oder amorphem Material mit geringer Wasserlöslichkeit bewerkstelligt werden. Die Absorptionsrate des Stickstoffmonoxid-Mimetikums hängt dann von seiner Auflösungsrate ab, welche ihrerseits von der Kristallgröße und der kristallinen Form abhängen kann. Alternativ dazu wird eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Formulierung durch Lösen oder Suspendieren des Stickstoffmonoxid-Mimetikums in einem Öl-Vehikel bewerkstelligt. Injizierbare Depot-Formen werden durch Bilden von mikroeingekapselten Matrizes des Arzneistoffs in biologisch abbaubaren Polymeren, wie Polylactid-Polyglycolid, hergestellt. Abhängig von dem Verhältnis von Arzneistoff zu Polymer und der Natur des jeweiligen verwendeten Polymers kann die Rate der Arzneistofffreisetzung gesteuert werden. Beispiele von anderen biologisch abbaubaren Polymeren schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride) ein. Als Depot injizierbare Formulierungen können auch durch Einfangen des Stickstoffmonoxid-Mimetikums in Liposomen oder Mikroemulsionen hergestellt werden, welche mit Körpergeweben kompatibel sind.
Formulierungen für rektale oder vaginale Verabreichung sind vorzugsweise Suppositorien, welche durch Mischen der Stickstoffmonoxid-Mimetika mit geeigneten nicht-reizenden Exzipienten oder Trägern, wie Kakaobutter, Polyethylenglycol oder einem Suppositorienwachs, welche bei Umgebungstemperatur fest aber bei Körpertemperatur flüssig sind und deshalb im Rektum oder der Vaginalhöhlung schmelzen, wodurch das Stickstoffmonoxid-Mimetikum freigesetzt wird, hergestellt werden können.
Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate ein. In solchen festen Dosierungsformen wird das Stickstoffmonoxid-Mimetikum mit mindestens einem inerten pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder Füllstoffen oder Streckmitteln, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Manitol und Kieselsäure; Bindemitteln, wie Carboxymethylzellulose, Alginaten, Gelatine, PoIyvinylpyrolidon, Saccharose und Akazin; Feuchthaltemitteln wie Glycerol; Auflösungsmitteln, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiocastärke, Alginsäure, bestimmten Silikaten und Natriumcarbonat; Lösungsverzögerungsmitteln, wie Paraffin; Absorptionsbeschleunigern, wie quarternären Ammoniumverbindungen; Benetzungsmitteln, wie Cetylalkohol und Glycerolmonosterarat; Absorptionsmitteln wie Kaolin- und Bentonit-Ton; und Gleitmitteln, wie Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglycolen, Natriumlaurylsulfat und Mischungen hiervon gemischt. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosierungsform auch Puffermittel umfassen.
Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in weichen und hart-gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden, wobei solche Exzipienten wie Lactose oder Milchzucker sowie hochmolekulargewichtige Polyethylenglycole und dergleichen verwendet werden. Die feste Dosierungsform von Tabletten, Kapseln, Pillen und Granulaten kann mit Beschichtungen und Hüllen hergestellt werden, wie darmlöslichen Beschichtungen und anderen Beschichtungen, welche auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannt sind. Sie können gegebenenfalls Trübungsmittel enthalten und können des weiteren von einer solchen Zusammensetzung sein, dass sie das Stickstoffmonoxid-Mimetikum nur, oder bevorzugt, in einem gewissen Teil des Darmtrakts, gegebenenfalls in einer verzögerten Weise, freisetzen.
Beispiele von Einbettungs-Zusammensetzungen, welche verwendet werden können, schließen polymere Substanzen und Wachse ein.
Pulver und Sprays können, zusätzlich zu dem Stickstoffmonoxid-Mimetikum, Exzipienten wie Lactose, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamid-Pulver oder Mischungen dieser Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich gebräuchliche Treibmittel, wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe oder alternative Nicht-CFC-Treibmittel, wie DIMEL, auch bezeichnet als 1,3,4-A, enthalten.
Dosierungsformen für die topische oder transdermale Verabreichung von Stickstoffmonoxid-Mimetika schließen Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Pulver, Lösungen, Sprays, Inhalationsmittel oder Pflaster ein. Das Stickstoffmonoxid-Mimetikum wird unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und jeglichen Konservierungsmitteln und/oder Puffern, wie sie erforderlich sein können, vermischt. Ophthalmische Formulierungen, Ohrentropfen, Augensalben, Pulver und Lösungen werden ebenfalls als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung angesehen. Transdermale Pflaster besitzen den zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung einer gesteuerten Zuführung des Stickstoffmonoxid-Mimetikums an den Körper. Derartige Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums im geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptions-Verstärkungsmittel können ebenfalls verwendet werden, um den Fluss des Stickstoffmonoxid-Mimetikums durch die Haut zu erhöhen. Die Rate kann entweder durch Vorsehen einer geschwindigkeitsregulierenden Membran oder durch Dispergieren des Stickstoffmonoxid-Mimetikums in einer Polymermatrix oder einem Gel gesteuert werden.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einem Stickstoffmonoxid-Mimetikum Exzipienten enthalten, wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Zellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Betonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Mischungen hiervon.
Eine bevorzugte Art der Zuführung ist eine solche, welche eine bei einem angemessenen Fließgleichgewicht erfolgende Zuführung des Stickstoffmonoxid-Mimetikums vorsieht, so dass "Steady-State"-Plasmakonzentrationen aufrechterhalten werden. Eine solche Zuführung vermeidet jedweden wesentlichen Anfangs-Spike in der Plasmakonzentration des Mittels, wie es wünschenswert wäre, um Plasmakonzentrationen zu vermeiden, welche negative Nebenwirkungen hervorrufen. Transdermale Pflaster und gepulste Zuführungssysteme sind bevorzugte Zuführungsarten.
Für diejenigen Formulierungen, die ein Stickstoffmonoxid-Mimetikum enthalten, welches kommerziell erhältlich ist, werden die Niedrigdosis-Formulierungen zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vorzugsweise gemäß der gleichen Verfahren wie die kommerziell erhältlichen Höherdosis-Formulierungen formuliert, jedoch mit geringeren Mengen, ausreichend, um die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität bei Zellen auf einen Level zu erhöhen, wiederherzustellen oder aufrechtzuerhalten, welcher maligne Zellphänotypen inhibiert oder verhindert und/oder die Wirksamkeit einer antimalignen therapeutischen Modalität erhöht. Verfahren zur Formulierung liegen innerhalb der Fähigkeiten von pharmazeutischen Formulierungschemikern und werden vollständig in solchen Arbeiten wie Remington's Pharmaceutical Science, 18. Auflage, Hrsg.: Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA, 1990, beschrieben.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Medikamente sind besonders nützlich bei der Inhibierung von Metastasen und der Entwicklung von Resistenz von Tumorzellen gegen antimaligne therapeutische Modalitäten, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, chemotherapeutische Mittel, Strahlungstherapien, Immuntherapien und Wärmetherapien. Beispiele von Klassen von chemotherapeutischen Mitteln, nützlich in Kombination mit Niedrigdosis-NO-Mimetika, schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, folgende ein: Anti-Gefäßbildungs-Mittel einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Anti-VEGF-Mittel, alkylierende Mittel, wie Stickstoff-Mostriche, Alkylsulfonate, Nitrosoharnstoffe, Ethylenimine und Triazene; Antimetabolite, wie Folat-Antagonisten, Purinanaloge und Pyrimidinanaloge; Antibiotika, wie Antracycline, Bleomycine, Dauxorubicin, Mitomycin, Dactinomycin und Plicamycin; Endothelin-aktivierende Mittel; Enzyme, wie L-Asparaginase; Farnesyl-Proteintransferase-Inhibitoren; 5α-Reduktase-Inhibitoren; Inhibitoren von 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase-Typ 3; hormonale Mittel wie Glucocortioide, Östrogen oder Antiöstrogene, Androgene oder Antiandrogene, Progestine und luteinisierendes-Hormon-freisetzendes-Hormon-Antagonist; Octreotidacetat; Microtubuli-Disruptionsmittel, wie Ecteinascidine und Analoge und Derivate davon; Microtubuli-Stabilisierungs-Wirkstoff, wie Taxane, beispielsweise TAXOL (Paclitaxel), TAXOTERE (Docetaxel) und Analoge davon, und Epothilone oder Analoge davon; Vinca-Alkaloide; Epipodophyllotoxine, Topoisomerase-Inhibitoren; Prenyl-Proteintransferase-Inhibitoren; und andere Mittel wie Hydroxyharnstoff, Procarbazin, Mitotan, Hexamethylmelamin, Platin-Koordinationskomplexe, wie Cisplatin und Carboplatin, Biologische-Antwort-Modifikatoren, Wachstumsfaktoren und Immunmodulatoren oder monoklonale Antikörper. Repräsentative Beispiele von in diesen Klassen in der vorliegenden Erfindung nützlichen chemotherapeutischen Mitteln schließen, ohne Einschränkung darauf, Actinomycin D, Aflacon, Bleomycinsulfat, Buserelin, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cladribin, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Daunorubicin, Discodermolide, Doxorubicin-hydrochlorid, Estramustin, Estramustinphosphat-Natrium, Etoposid, Etoposidphosphat, Fludarabin, Fluorouracil, Flutamid, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon, Interleukine, Leuprolid, Levamisol, Lomustin, Mechlorethamin-Hydrochlorid, Melphalan, Mercaptopurin, Methotrexat, Mitomycin C, Paclitaxel, Pentastatin, Pteridin, Chinocarcine, Rituximab, Safracine, Saframycine, Semustin, Streptozocin, Tamoxifen, Teniposid, Thioguanin, Thiotepa, Topotecan, Vinblastin, Vincristin, Vinorelbin-Tartrat und jedwede Analoge oder Derivate hiervon ein.
Tieren, welche unter Krebs leiden, kann eine niedrige Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums verabreicht werden, um das metastatische Potenzial der Tumorzellen zu inhibieren sowie die Wirksamkeit einer gleichzeitig verabreichten antimalignen therapeutischen Modalität zu erhöhen, welche auf die Tötung der Krebszellen zielt. Stickstoffmonoxid-Mimetikum kann Tieren in Kombination mit anderen antimalignen therapeutischen Modalitäten im Anschluss an, vor oder während der chirurgischen Entfernung eines Tumors und/oder im Anschluss an, während oder vor einer Bestrahlungs- oder Wärmetherapie verabreicht werden. Man nimmt an, dass diese Therapie auch die Wirksamkeit von Anti-VEGF-Mitteln erhöhen wird, welche auf die Inhibierung der Angiogenese von vaskulären Endothelzellen zu Tumoren hin abzielen. Eine Niederdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie kann an ein Tier vor, mit oder im Anschluss an eine Verabreichung eines Anti-VEGF-Mittels, wie einem Anti-VEGF-Antikörper, verabreicht werden. In diesem Fall wird es bevorzugt, dass die Stickstoffmonoxid-Therapie wenigstens über die bekannte aktive Zeitdauer des Anti-VEGF-Mittels hinweg aufrechterhalten wird. Eine Niederdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie kann auch als prophylaktische Therapie an Tiere verabreicht werden, welche in hoher Gefahr zur Entwicklung von Krebs stehen, um die Entwicklung von Zellen mit einem malignen Zellphänotyp zu verhindern. Eine geringe Dosis des Stickstoffmonoxid-Mimetikums kann täglich an das Tier während seines gesamten Lebens verabreicht werden. Folglich kann eine Verabreichung von langfristigen Dosierungsformulierungen mit verzögerter Freisetzung in diesen Tieren bevorzugt werden. Darüber hinaus kann eine Niederdosis-Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie an Tiere verabreicht werden, welche im Verdacht stehen, oder bekanntermaßen, einem Faktor exponiert sind/zu sein, der die zelluläre Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität verringert, so dass Zellen mit einem malignen Zellphänotyp induziert werden. Die Verabreichung dieser Niederdosis-Stickstoffmonoxid-Therapie inhibiert erwartetermaßen die Entwicklung eines malignen Zellphänotyps in diesen Tieren. Die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Therapie kann wenigstens so lange verabreicht werden, wie das Tier an den Faktor exponiert ist. Zum Beispiel nimmt man an, dass sowohl chirurgische Eingriffe als auch Betäubung Faktoren sind, welche die zelluläre Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Aktivität verringern, so dass ein maligner Zellphänotyp induziert wird. Folglich kann, vor oder während eines chirurgischen Eingriffs und/oder der Verabreichung eines Betäubungsmittels in einem Tier, dem Tier auch eine geringe Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums verabreicht werden, um einen malignen Zellphänotyp zu verhindern und zu inhibieren. In diesem Fall wird es bevorzugt, dass das Stickstoffmonoxid-Mimetikum mindestens während der Zeit verabreicht wird, während der das Tier dem chirurgischen Vorgehen unterliegt und/oder unter den Effekten der Betäubung steht. In ähnlicher Weise kann einem Tier, das einer physischen Verletzung, speziell einer physischen Verletzung, assoziiert mit Blutverlust, einer Verringerung des Blutvolumens oder einer Blutung, unterliegt, eine geringe Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums verabreicht werden, um einen malignen Zellphänotyp zu verhindern und zu inhibieren. Man nimmt an, dass die gemeinsame Verabreichung einer geringen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums auch angewandt werden kann, um einen malignen Zellphänotyp zu inhibieren oder zu verhindern, welcher nach der Verabreichung von pharmakologischen Mitteln auftreten kann, die den Kreislauf verändern, z. B. antihypertensiven Mitteln. In diesem Fall wird das Stickstoffmonoxid-Mimetikum vorzugsweise auf einer täglichen Basis mit den anderen Mitteln oder in einer langfristigen Formulierung mit verzögerter Freisetzung, welche sich über den Zeitraum erstreckt, in welchem das andere Mittel verabreicht wird, verabreicht.
Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele sind zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung angegeben.
Beispiele
Beispiel 1: Materialien
Gewebekulturmedium (RPMI 1640) und fötales Rinderserum (FBS) wurde von Gibco BRL (Grand Island, NY) erworben. Hypoxische Bedingungen wurden unter Verwendung von luftdichten Kammern von BellCo Biotechnology (Vineland, NJ) erzeugt. GTN wurde als Lösung (TRIDIL, 5 mg ml^–1 oder 2,22 M) in Ethanol, Propylenglycol und Wasser (1 : 1 : 1,33) von DuPont Pharmaceuticals (Scarborough, ON) erhalten. Natriumnitroprussid (SNP) wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben. RNA-Extraktionen wurden durchgeführt unter Verwendung eines PURESCRIPT-RNA-Isolations-Kits von Gentra Systems (Minneapolis, MN). Für die die Northern-Blot-Analysen wurden die für die RNA-Transfers verwendeten Nylonmembranen von Micron Separations, Inc. (Westboro, MA) bezogen; Die uPAR- und PAI-1-cDNA-Sonden wurden in einem Bluescript-Plasmid-Vektor kloniert; das [³²P]-dCTP und Reflection-NEF-Film wurden von Dupont/New England Nuclear (Mississauga, ON) erworben; und das Oligo-Markierungs-Kit wurde von Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) erhalten. Für die in vitro-Invasions-Assays wurde das serumfreie EX-CELL 300-Kulturmedium von JRH Biosciences (Lenexa, KS) bezogen, die Costar TRANSWELL-Inserts (6,5-mm-Durchmesser-Polycarbonat, Membran, Poren von 8 μm) wurden von Corning Costar (Cambridge, MA) erworben, und die rekonstituierte Basalmembran (MATRIGEL) wurde von Collaborative Biomedical Products (Bedford, MA) erworben. Das Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay(ELISA)-Kit für Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) wurde von American Diagnostica (Greenwich, CT) erhalten. Für die Western-Blot-Analyse von uPAR wurden die aufgelösten Proteine auf Immobilon-P-Membranen von Millipore (Bedford, MA), überführt, Anti-uPAR-Antikörper (monoklonaler Antikörper [MoAb] 3937) wurde von American Diagnostica (Greenwich, CT) erworben, das affinitätsgereinigte Ziege-Anti-Maus-IgG(H+L)-Meerettichperoxidase-Konjugat von Blotting-Güteklasse wurde von BIO-RAD (Hercules, CA) erhalten, und das Antigen wurde durch verstärkte Chemolumineszenz (ECL) unter Verwendung von Reagenzien von Amersham Canada (Mississauga, ON) nachgewiesen. Für die zymographischen Analysen wurde die Gelatine von BDH (Toronto, ON) erworben, das Casein wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) gekauft, und das Plasminogen stammte von American Diagnostica (Greenwich, CT).
Beispiel 2: Zellen
Die invasive Trophoblasten-Zelllinie HTR-8/SVneo und die metastatische Brustkarzinom-Zelllinie MDA-MB-231 wurden in diesen Experimenten verwendet. Sowohl die HTR-8/SVneo- als auch die MDA-MB-231-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 5% FBS, kultiviert.
Die Zelllinie HTR-8/SVneo wurde aus Explantat-Kulturen aus einer menschlichen Plazenta des ersten Trimesters erhalten und durch Transfektion mit einem cDNA-Konstrukt, codierend das große T-Antigen von SVneo, immortalisiert. Diese Zellen sind früher charakterisiert worden und sind während über 130 Passagen in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 5% FBS, gehalten worden. Sie zeigen einen hohen Proliferationsindex auf und haben verschiedene phänotypische Ähnlichkeiten mit den nicht-transfizierten HTR-8-Elternzellen gemeinsam, wie Invasionsfähigkeit in vitro und Fehlen von Tumorigenität in Nacktmäusen.
Die MDA-MB-231-Zelllinie wurde ursprünglich 1973 aus der Pleuraleffusion eines 51 Jahre alten Patienten mit Brustkrebs isoliert (Callieau et al., J. Nat. Cancer Inst., 1974, 53:661 – 674).
Beispiel 3: Hypoxische Zellkulturbedingungen
Zellen wurden in eine luftdichte Kammer eingebracht und wurden mit einer Gasmischung, enthaltend 5% CO₂ : 95% N₂, umspült, bis die Sauerstoffkonzentration 0% war, wie abgelesen durch einen Minioxl Oxygen Analyzer (Catalyst Research Corp., Owing Mills, MD). Die Zellen wurden dann bei 37°C inkubiert. Innerhalb der ersten 2 Stunden der Inkubation hatte sich der Sauerstoffspiegel in den Kammern auf ungefähr 1% äquilibriert und blieb während des Rests der Inkubationsdauer auf diesem Spiegel.
Alternativ dazu wurden die Zellen in eine Kammer gebracht, in der atmosphärische O₂-Spiegel durch einen PRO-OX O₂-Regulator (Reming Bioinstruments, Redfield, NY) aufrechterhalten wurden.
Beispiel 4: Behandlung von Zellen mit Glyceryltrinitrat (GTN) und Natriumnitroprussid (SNP)
In diesen Beispielen wurden die Zellen mit variierenden Konzentrationen an GTN und SNP behandelt. Die Stammlösung von GTN wurde zuerst in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 10^–4 M verdünnt. Im Anschluss an eine Filtration wurde die GTN-Lösung in dem Kulturmedium auf Konzentrationen im Bereich von 10^–4 M bis 10^–11 M verdünnt. Das SNP (ursprünglich in Kristallform) wurde in destilliertem Wasser gelöst und zu einer Konzentration zu 10^–5 M verdünnt. Im Anschluss an die Filtration wurde das SNP im Kulturmedium auf Konzentrationen im Bereich von 10^–6 M bis 10^–12 M verdünnt.
Beispiel 5: Northern-Blot-Analysen
Zellen wurden mit variierenden Konzentrationen von GTN und SNP unter hypoxischen (1% O₂) oder Kontrollbedingungen (20% O₂) bei 37°C kultiviert. In einem anderen Satz von Experimenten wurden MDA-MB-231-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von LMMA (0,5 mM) 24 Stunden lang unter verschiedenen Sauerstoffspiegeln (1%, 5% oder 20% O₂) bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde die zelluläre Gesamt-RNA aus den Zellen unter Anwendung des RNA-Isolations-Kits Gentra PURESCRIPT isoliert. Die isolierte RNA wurde anschließend durch Elektrophorese aufgetrennt und auf geladene Nylonmembranen überführt. Die Membranen wurden ungefähr 2 Stunden lang bei 42°C in einer Lösung, enthaltend 50% Formamid, 5X Denhardt's-Lösung, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), 6X SSC (1X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, vorhybridisiert. Sie wurden dann mit einer [³²P]-dCTP-markierten cDNA-Sonde (uPAR oder PAI-1) ungefähr 24 Stunden lang bei 42°C in einer Lösung hybridisiert, bestehend aus 6X SSC, 0,5% SDS, 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 50% Formamid, und enthaltend eine cDNA-Sonde (uPAR oder PAI-1), welche mit [³²P]-dCTP unter Verwendung eines Pharmacia-Oligolabelling-Kits markiert worden war. Im Anschluss an eine Reihe von Waschungen wurde die Membran verwendet, um Dupont-Reflection-NEF-Film zu belichten. Nach 1 – 4 Tagen wurde der Film entwickelt und analysiert. Um Unterschiede in der Menge an RNA, welche in jeder Probe aufgetragen wurde, zu korrigieren, wurde 28S-rRNA verwendet.
Beispiel 6: Western-Blot-Analyse von uPAR-Proteinspiegeln
Um den Spiegel an uPAR-Protein zu untersuchen, wurden die Zellen zuerst mit 20% O₂ oder 1% O₂ in Gegenwart variierender Konzentrationen von SNP oder GTN kultiviert. Im Anschluss an die Inkubationen wurden die Zellen unter Verwendung eines Puffers lysiert, enthaltend 40 mM HEPES pH 7,2, 100 mM NaCl, 20% Glycerin, 0,1 mM EDTA pH 8,0, 0,2% Triton X-100, 1 mM DTT und 2 mM PMSF. Die Lysate wurden dann einer Homogenisierung, DNA-Scherung (10mal mit einer Nadel von 25
Gauge), Kochen (5 Minuten) und Zentrifugation (15 Minuten, 14 000 g) unterzogen. Der Überstand wurde abgesammelt und bei –80°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Proben wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unterzogen, und die aufgetrennten Proteine wurden auf eine Immobilon-P-Membran unter Verwendung einer Naßtransfer-Vorrichtung (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON) überführt. Die Membranen wurden über Nacht bei 4°C in einer Lösung geblockt, welche 1% PBS und 0,01% Tween20 (PBS-T) sowie 5% Casein enthielt. Die Blots wurden anschließend 1,5 Stunden lang mit dem monoklonalen Anti-uPAR-Antikörper [MoAb 3937] inkubiert, worauf sechs 5-minütige Waschungen mit PBS-T folgten. Die Membranen wurden dann mit einem sekundären, Meerettichperoxidase-markierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper 1,5 Stunden lang inkubiert. Im Anschluss an sechs weitere 5-minütige Waschungen mit PBS-T wurde das Antigen durch verstärkte Chemolumineszenz detektiert, und die Blots wurden auf Relection-NEF-Film von Dupont exponiert.
Beispiel 7: Messung von Metalloproteinase- und Plasminogenaktivator-Aktivität durch Zymographie
Um die Spiegel an Metalloproteinase- und Plasminogenaktivator-Aktivität zu messen, wurden die Zellen unter hypoxischen oder Kontrollbedingungen in Gegenwart von variierenden Konzentrationen an SNP oder GTN inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines serumfreien Mediums (EX-CELL 300) kultiviert. Im Anschluss an die Inkubation wurde das Medium extrahiert und bei 5000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend abgesammelt und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. SDS-Polyacrylamidgele wurden gemäß gut bekannten Verfahrensweisen hergestellt. Für die Analyse der Metalloproteinase-Sekretion enthielt das Gel 0,1% w/v Gelatine, und für die Analyse der Plasminogenaktivatorsekretion wurde das Gel 0,1% w/v Casein sowie Plasminogen (50 μg/ml) supplementiert. Das serumfreie konditionierte Medium wurde dann mit einem nicht-reduzierenden Probenauftragspuffer (0,5 M Tris, 10% SDS, 1% Bromphenolblau in 2 ml Glycerol) in einem Verhältnis von 4 : 1 vereinigt und wurde nicht gekocht. Im Anschluss an die Elektrophorese durchliefen die Gele zwei 15-minütige Waschungen mit 2,5% Triton X-100. Dieser Schritt entfernte das SDS. Nach den Waschungen mit H₂O wurden die Gele über Nacht bei 37°C in einer Lösung inkubiert, welche Tris-HCl (pH 7,0) und CaCl₂ (5 mM) enthielt. Die Gele wurden mit 0,4% Coomassie-Brilliant-Blue R-250 in 40% Methanol/10% Eisessig/50% destilliertem Wasser ungefähr 1 Stunde lang gefärbt und danach etwa 2 Stunden lang in 30% Methanol/10% Eisessig/60% destilliertem Wasser entfärbt. Molekulargewichtsstandards zeigten sich als dunkle Banden gegen den helleren blauen Hintergrund, und farblose Zonen erschienen, wo eine Lysis stattgefunden hatte. In den gelatinehaltigen Gelen entsprachen diese Bereiche der Aktivität von Metalloproteinase (Gelatinase), und in den Casein-Gelen entsprachen diese Banden der Plasminogenaktivator-Aktivität. Die Gele wurden unter Verwendung einer Konservierungslösung (10% Eisessig/10% Glycerin/80% destilliertes Wasser) 1 Stunde lang aufbewahrt, und wurden 1 Stunde lang bei 60°C auf Cellophan getrocknet.
Beispiel 8: In vitro-Invasions-Assays
MATRIGEL-Invasionskammern (modifizierte Boyden-Kammern) wurden eingesetzt, um das Invasionsvermögen der Zellen unter hypoxischen und Standardbedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an GTN oder SNP zu überprüfen. Die Kammern bestanden aus Zellkultur-Inserts von 6,5 mm Durchmesser und mit einer Membran von 8 μm Porengröße. Jede Membran wurde mit 100 μl einer 1 mg/ml-Lösung von MATRIGEL, gelöst in kaltem serumfreien Kulturmedium (EX-CELL 300) beschichtet, und in einem Laminarströmungs-Abzug ungefähr 12 Stunden lang trocknen gelassen. Das MATRIGEL wurde dann durch Inkubieren desselben mit 100 μl serumfreien Medium während ungefähr 1 Stunde rehydratisiert. Nach der Rehydratisierung wurden Zellsuspensionen, enthaltend 5,0 × 10⁴ oder 1,0 × 10⁵ Zellen in 100 μl Medium, das sowohl Serum als auch die Stickstoffmonoxid-Behandlungen enthielt, in jede Vertiefung zugesetzt. Kulturmedium, enthaltend Serum und die jeweilige Stickstoffmonoxid-Behandlung, wurde dann zu jedem Insert zugesetzt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang entweder unter hypoxischen (1% O₂) oder Kontrollbedingungen (20% O₂) inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die nicht-eindringenden Zellen von der oberen Oberfläche der Membran durch Abwischen mit einem Baumwoll-Wischer entfernt. Die Zellen auf der unteren Oberfläche der Membran wurden 10 Minuten lang mit Carnoy's-Fixativ (25% Essigsäure, 75% Methanol) fixiert und danach ungefähr 3 Stunden lang mit 1% Toluidin-blau, 1% Natriumboratlösung gefärbt. Im Anschluss an eine Spülung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurde die Membran aus dem Insertgehäuse mit einer kleinen Skalpellklinge entfernt, auf einen Mikroskop-Objektträger montiert und mit einem Deckgläschen belegt. Invadierende Zellen wurden dann unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung betrachtet und gezählt. Der Invasionsindex für jede Behandlung wurde berechnet durch Dividieren der Anzahl eindringender Zellen durch die Anzahl von Zellen, welche unter Standardbedingungen eine Invasion vollführten. Dieser Wert wurde dann mit 100 multipliziert, um einen Prozentsatz zu erhalten. Der Standard wurde als ein Wert von 100% angegeben, und die Behandlungswerte wurden in einen Prozentanteil des Standards umgewandelt. Die Ergebnisse wurden hinsicht lich der statistischen Signifikanz entweder unter Anwendung des Tukey-Tests für paarweise Mehrfachvergleichs-Vorgehen oder der Student-Newman-Keuls-Methode für paarweise Mehrfachvergleichs-Vorgehen getestet; siehe 1.
Beispiel 9: In vivo-Metastase-Modell
C57BL6-Mäuse erhielten eine i.v.-Injektion (Schwanzvene) mit einem Bolus von 5 × 10⁴ – 10⁵ B16F10-Metastasen-Melanomzellen. Unmittelbar nach der Schwanzveneninjektion wurden die Mäuse statistisch in Gruppen zu 15 unterteilt, und die Mäuse in jeder Gruppe wurden in Plexiglaskammern (ungefähr 3 Liter) eingebracht, welche kontinuierlich mit Gasmischungen von 20% O₂: Rest N₂ bzw. 10% O₂: Rest N₂ durchspült wurden. Die Gasflüsse wurden auf einen Spiegel eingestellt, welcher keine CO₂-Anhäufung innerhalb der Kammern zuließ. Nach einer 24 Stunden langen Exponierung an eine Atmosphäre von entweder 20% O₂ oder 10% O₂ wurden die Mäuse aus den Kammern entnommen und in reguläre Käfige eingebracht, welche bei Raumluft gehalten wurden. Dreizehn Tage später wurden die Mäuse durch Cervixdislokation getötet und die Lungen wurden entfernt und in Bouin-Fixativ (Sigma) fixiert. Metastatische Knötchen (von denen viele aufgrund der Gegenwart von Melanin schwarz aussahen) auf der Oberfläche der Lunge wurden visuell unter einem Präpariermikroskop gezählt. Die Daten wurden als die Anzahl von Lungenknoten pro 10⁴ injizierten Zellen ausgedrückt und wurden unter Anwendung statistischer Tests für nicht-parametrische Werte analysiert.
In einem zweiten Satz von Experimenten wurde dasselbe Protokoll befolgt, außer dass die B16F10-Maus-Melanomzellen 12 Stunden lang in 1% oder 20% Sauerstoff in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 × 10^–11 M GTN inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann von den Platten mit Trypsin entfernt, und 5 × 10⁴ Zellen wurden i.v. (Schwanzvene) in weibliche C57BL6-Mäuse injiziert; siehe 2. Einige der in vitro behandelten Zellen wurden auf Gewebekulturschalen ausplattiert, um das Koloniebildungsvermögen zu bestimmen, wobei das in Beispiel 10 beschriebene Protokoll verwendet wurde.
Beispiel 10: Koloniebildungs-Assay hinsichtlich Doxorubicin-Resistenz
Die Resistenz von MDA-MB-231-Brustkrebszellen gegen Doxorubicin wurde im Anschluss an die Kultur in 20% oder 1% Sauerstoff durch Zählen der gebildeten Zahl von Kolonien bestimmt. MDA-MB-231-Zellen wurden in 1% O₂ oder 20% O₂ 24 Stunden lang inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellen an Verdünnungsmittel (Kontrolle), 25 μM Doxorubicin, 25 μM Doxorubicin plus 10^–6 M GTN oder 25 μM Doxorubicin plus 10^–10 M GTN 1 Stunde lang exponiert. Die Zellen wurden gewaschen und dann bei unterschiedlichen Verdünnungen auf 35-mm-Platten ausplattiert. Die Zellen wurden weitere 1 – 2 Wochen inkubiert, um das Wachstum von Zellkolonien zu gestatten. Am Ende der Inkubationsdauer wurden die Zellen mit Carnoy-Fixativ fixiert, mit Kristallviolett gefärbt, gespült und an der Luft trocknen gelassen. Die Kolonien wurden visuell gezählt. Die unter jeder Bedingung überlebenden Zellen wurden durch Zählen der Anzahl von Kolonien bestimmt und wurden als ein Bruchteil der Anzahl von Kolonien ausgedrückt, welche ohne Exposition an Doxorubicin überlebten.
Obgleich diese Erfindung im Besonderen aufgezeigt und unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird es der Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass verschiedene andere Veränderungen an der Form und den Einzelheiten vorgenommen werden können, ohne vom Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verwendung einer geringen Dosis eines Stickstoffmonoxid-Mimetikums bei der Herstellung eines Medikaments zur Kontrolle, Behandlung und/oder Prävention von Krebs, malignen Erkrankungen, Blastom, Hyperplasia, Hyperthrophia, Dysplasia und/oder Tumor-Angiogenese, worin die niedrige Dosis 3 bis 10 000-fach geringer ist als eine Dosis von Stickstoffmonoxid-Mimetikum, die zur Blutgefäßerweiterung führt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Medikament in einer Menge verabreicht wird, welche die Entwicklung von Toleranz gegenüber dem Stickstoffmonoxid-Mimetikum und/oder ungewollte Nebenwirkungen, Kopfschmerzen, Erröten und Hypotonie einschlossen, verzögert oder reduziert.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Medikament allein oder in Kombination mit einem antimalignen therapeutischen Wirkstoff verabreicht wird.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin das Medikament: (1) das Metastasen-Potential eines Tumors oder eines malignen Zellphänotypus inhibiert, vorzugsweise durch Herabsetzung der Invasionsfähigkeit, der Progression, des Wachstums und/oder der Metastasen von einen malignen Phänotyp-aufweisenden Zellen; wobei das Überleben und/oder das Wachstum von einen malignen Phänotyp-aufweisenden Zellen inhibiert werden; und wobei die Progression und/oder die Metastasen von einen malignen Phänotyp-aufweisenden Zellen herabgesetzt werden; und wobei die Regression von einen malignen Phänotypaufweisenden Zellen verstärkt wird; und/oder wobei das Töten von einen malignen Phänotyp-aufweisenden Zellen erleichtert wird; (2) einen malignen Tumor in einem schlafenden Zustand an seiner primären und/oder sekundären Stelle erhält; (3) die Wirkung davon verstärkt und/oder die Resistenz gegen eine antimaligne therapeutische Modalität verhindert oder herabsetzt; oder (4) die Tumor-Angiogenese bei Tieren mit hohem Risiko für Krebsentwicklung und/oder mit Exponierung gegenüber Faktoren, die bekanntermaßen die Stickstoffmonoxid-Aktivität in einem Tier reduzieren, inhibiert oder verhindert, worin die Faktoren optional herabgesetzte Argininlevels, Aussetzung gegenüber Stickstoffmonoxid-Synthase-Antagonisten, Aussetzung gegenüber Stickstoffmonoxid-Fängern, Änderungen bei Stickstoffmonoxid-Synthase-Expression, Änderung bei Cofaktoren, Glukose-Deprivation, chirurgische Eingriffe, Verabreichung von Anästhesiemitteln, Verabreichung von pharmakologischen Wirkstoffen, welche den Kreislauf verändern und traumatische Verletzungen wie z.B. körperliches Trauma, Blutverlust, herabgesetztes Blutvolumen oder Blutsturz einschließen.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin die Zellen, die maligne Erkrankungen aufweisen, gewählt sind aus malignen Zellen, invasiven Zellen und Zellen und Gewebe(n), welche den malignen Prozess erleichtern; optional, worin der maligne Zell-Phänotyp durch Verbesserung der Antwort auf eine anti-maligne therapeutische Modalität kontrolliert, behandelt und verbessert wird.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin Krebs durch Messung eines im Tier vorhandenen Tumor-selektiven Markers diagnostiziert oder überwacht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 6, worin das Medikament die Zunahmen des Levels des Tumormarkers herabsetzt oder abbremst.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin der Krebs Magenkrebs, Darmkrebs, Hodenkrebs, Prostatakrebs, prostatisches Adenokarzinom, Brustkrebs, metastatisches Melanom, oder Kombinationen davon umfasst; optional, worin der Krebs oder andere maligne Erkrankungen, Blastom, Hyperplasia, Hypertrophia, Dysplasie und/oder Tumor-Angiogenese in einem Tier gutartige prostatische Hyperplasia oder Molenschwangerschaft umfasst.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin das Stickstoffmonoxid Mimetikum Stickstoffmonoxid, einen Stickstoffmonoxid-Donor, eine Verbindung, welche durch Biotransformation Stickstoffmonoxid erzeugt oder freisetzt, eine Verbindung, welche spontan Stickstoffmonoxid erzeugt oder spontan Stickstoffmonoxid freisetzt, oder eine Verbindung, die Stickstoffmonoxid erzeugt, umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das Stickstoffmonoxid-Mimetikum ist: (1) ein Stickstoffmonoxid-Donor, gewählt aus Nitroglycerin (GTN), Isosorbid-5-mononitrat (ISMN), Isosorbiddinitrat (ISDN), Pentaerythritoltetranitrat (PETN), Erythrityltetranitrat (ETN), N-Hydroxyl-L-Arginin (NOHA), N⁶-(1-Iminoethyl)lysin) (L-NIL), L-N⁵-(1-Iminoethyl)ornithin (LN-NIO), N^W-Methyl-L-Arginin (L-NMMA), S-Nitrosogluthathion (SNOG), S, S-Dinitrosodithiol (SSDD), [N-[2(Nitroxyethyl)]-3-pyridincarboxamid (nicorandil), Natriumnitroprussid (SNP), S-Nitroso-N-acetylpenicilamin (SNAP), 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1), Molsidomin, DEA-NONOat (2(N,N-Diethylamino)-diazenolat-2-oxid), und Spermin-NONOat (N-[4-[1-(3-Aminopropyl)-2-hydroxy-2-nitrosohydrazino]butyl-1,3-propandiamin; (2) eine Verbindung, die Stadien des NO-Wegs aktiviert, eine Verbindung, welche die NO-Verwendung durch eine Zelle ermöglicht oder erleichtert, eine Verbindung, welche direkt Guanylyl-Cyclase, Phosphodiesterase-Inhibitor aktiviert; (3) ein Typ I, II, III, IV oder V Phosphodiesterase-Inhibitor oder (4) ein Proteinkinase-G-Aktivator.
Verwendung gemäß eines beliebigen der Ansprüche 3–10, worin die antimaligne therapeutische Modalität Strahlungstherapie, Wärmetherapie, Immuntherapie oder Chemotherapie einschließt, optional, worin die antimaligne therapeutische Modalität Strahlentherapie umfasst und das Stickstoffmonoxid-Mimetikum ein Stickstoffmonoxid, ein Stickstoffmonoxid-Donor, eine Verbindung, welche Stickstoffmonoxid durch Biotransformation erzeugt oder spontan nur in Gegenwart von Sauerstoff freisetzt, ist, worin das Stickstoffmonoxid-Mimetikum während der Strahlentherapie verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 11, worin die Chemotherapie die Verabreichung eines chemotherapeutischen Wirkstoffes umfasst, der ein anti-Angiogenese-Wirkstoff, ein anti-Metabolit, ein Antibiotikum, ein Endothelin-aktivierendes Mittel, ein Enzym, ein hormoneller Wirkstoff, Ocreotidacetat, ein Mikrotubulusdisruptionsmittel, ein Mikrotubulus-Stabilisierungswirkstoff, ein Vinca-Alkaloid, ein Epipodophyllotoxin, ein Topoisomerase-Inhibitor, ein Prenylproteintransferase-Inhibitor, Hydroxyharnstoff, Procarbazin, Mitotane, Hexamethylmelamin, ein Platinkoordinationskom plex, ein Bio-Antwort-Modifikator, ein Wachstumsfaktor, ein Immunmodulator oder ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung gemäß Anspruch 12, worin der chemotherapeutische Wirkstoff ein Enzym ist, gewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Asparaginase, Farnesylproteintransferase-Inhibitoren, 5a Reduktase-Inhibitoren, und Inhibitoren von 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 3.
Verwendung gemäß Anspruch 12, worin der chemotherapeutische Wirkstoff ein aus der Gruppe von Glucocorticoiden, Östrogenen oder Anti-Östrogenen, Androgenen oder Anti-Androgenen, Gestagenen, luteinisierendes Hormon-freisetzender Hormon-Antagonist und Octreotidacetat gewählter hormoneller Wirkstoff ist.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Dosis 100- bis 10 000-fach niedriger ist als eine Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Dosis, welche zur Blutgefäßerweiterung führt.
Verwendung gemäß eines beliebigen der voranstehenden Ansprüche, worin das Stickstoffmonoxid-Mimetikum als vasodilatorische Verbindung bekannt ist und das Mimetikum in einer Dosierung verabreicht wird, die wenigstens 3- bis 10 000-fach geringer, vorzugsweise 100- bis 10 000-fach geringer als die Stickstoffmonoxid-Mimetikum-Dosis, die bekanntermaßen zu Blutgefäßerweiterung führt, ist.