ES2229221T3 - Procedimiento de identificacion de un inhibidor de pde iv. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA SELECCIONAR INHIBIDORES DE PDE IV QUE TIENEN UN INDICE TERAPEUTICO SALUDABLE, Y A LOS COMPUESTOS QUE TIENEN ESTAS PROPIEDADES.

Description

Procedimiento de identificación de un inhibidor de PDE IV.

Ámbito de la invención

La presente invención cubre un procedimiento de identificación de compuestos que inhiben, o unen, preferentemente una forma de la isoenzima fosfodiesterasa denominada IV (PDE IV a partir de ahora) a la vez que muestra igual, o mejor aún menos, unión o inhibición para una segunda forma de la enzima. Estas formas, y se cree que son diferentes formas de conformaciones no interconvertibles de la misma enzima aunque esto no se ha probado, se distinguen por su afinidad de unión a rolipram, un inhibidor de PDE IV arquetípico. El rolipram se une con una alta afinidad al sitio catalítico de una de las formas pero con baja afinidad al sitio catalítico de la otra. Por esto una forma se denomina sitio de unión de alta afinidad del rolipram y la otra forma se identifica como sitio de unión de baja afinidad del rolipram.

Campo de la invención

Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (PDEs) representan una familia de enzimas que hidrolizan los segundos mensajeros intracelulares ubícuos, 3',5'-monofosfato de adenosina (AMPc) y 3',5'-monofosfato de guanosina (GMPc), a sus correspondientes metabolitos inactivos 5'-monofosfato. Se cree que existen al menos cinco clases distintas de PDE isoenzimas, de las cuales cada una posee características físicas y cinéticas únicas y cada una representanta un producto de familia genética diferente. Estas se han distinguido usando los números romanos I al V.

La enzima objeto de la presente invención es la isoenzima PDE IV en todas sus formas y en el ámbito completo de su distribución por todas las células. Es una enzima AMPc-selectiva de bajo K_{m} (AMPc K_{m} = 1-5 \muM) que tiene poca actividad contra GMPc (K_{m} > 100 \muM). Los miembros de esta clase de isoenzima poseen la interesante característica de existir en dos o más formas no-inconvertibles o lentamente inconvertibles que unen el rolipram y otros inhibidores de PDE IV con potencias de orden de rango características. Así el mismo producto genético puede existir en más de un estado conformacional catalíticamente activo. Más importante, las proporciones relativas de las diferentes formas de unión pueden variar dependiendo del tipo de célula de tejido. Por ejemplo, las células inflamatorias pueden contener una proporción relativamente alta de la forma que une con una baja afinidad el rolipram mientras que las células cerebrales y parietales pueden contener una proporción relativamente alta de la forma que une con una alta afinidad el rolipram.

Es particularmente interesante en la presente invención el papel que esta clase de isoenzimas juega en la inflamación y en el músculo liso de las vías respiratorias. Existen estudios donde se muestra que juega un papel importante en la regularización del AMPc en una amplia variedad de células inflamatorias (es decir, células cebadas, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y monocitos) y en el músculo liso de las vías respiratorias. El trabajo de la presente invención es particularmente aplicable a células inflamatorias y del músculo liso de las vías respiratorias; es de particular interés el tipo de isoenzima expresado en monocitos humanos. Esto es porque el AMP cíclico sirve de segundo mensajero para inhibir la quimiotaxia y para activar células inflamatorias. Además, el AMPc media en la relajación del músculo liso de las vías respiratorias. Esto, junto con el papel del PDE IV en la metabolización del AMPc ha suministrado las bases para investigar los inhibidores del PDE IV: en función de su capacidad para elevar el contenido de AMPc en los leucocitos y en el músculo liso de las vías respiratorias, los inhibidores de PDE IV pueden poseer actividades antiinflamatorias y broncodilatadoras.

Los inhibidores PDE usados en la actualidad en el tratamiento de inflamaciones y como broncodilatores, medicamentos como la teofilina y la pentoxifilina, inhiben las isoenzimas PDE en todos los tejidos de forma indiscriminada. Éstos compuestos muestran efectos secundarios, aparentemente porque no inhiben de forma selectiva las cinco clases de isoenzimas PDE en todos los tejidos. Esto es una consideración a tener en cuenta al evaluar el perfil terapéutico de estos compuestos. El estado de la enfermedad objeto puede ser tratado de manera efectiva por dichos compuestos, pero pueden aparecer efectos secundarios no deseados que, si se pueden evitar o minimizar, incrementarían el efecto terapéutico global de este enfoque al tratamiento de ciertos estados de la enfermedad. Si se toma de forma colectiva, esta información sugiere que los efectos secundarios asociados con el uso de inhibidores convencionales de PDE no selectivos podrían ser reducidos dirigiendo nuevos inhibidores selectivos de isoenzima a los PDE predominantes en el tejido o célula de interés. Aunque en teoría los inhibidores selectivos de enzima de PDE deben representar una mejora sobre inhibidores no selectivos, los inhibidores selectivos probados hasta la fecha no están exentos de efectos secundarios producidos como extensión de inhibir el isoenzima de interés en un tejido inapropiado o que no es el objetivo. Por ejemplo, los estudios clínicos con rolipram inhibidor de PDE IV selectivo, que se estaba desarrollando como un antidepresivo, indican que tiene actividad psicotrópica y produce efectos gastrointestinales, por ejemplo pirosis, náuseas y emesis. Hay indicios de que los efectos secundarios de denbufilina, otro inhibidor de PDE IV señalado para el tratamiento de la demencia multiinfarto, también pueden incluir pirosis, náuseas y emesis. Se piensa que estos efectos secundarios se dan como resultado de inhibir PDE IV en áreas específicas de la CNS y del sistema gastrointestinal.

En 1986, Schneider y colaboradores describieron la presencia y características de los sitios de unión de [^{3}H]-rolipram estereoselectivo y de alta afinidad en homogeneizados cerebrales de rata. Aunque se asumió que estos sitios de unión representaban el sitio catalítico del cerebro de rata "fosfodiesterasa AMPc no dependiente de la calmodulina" (es decir PDE IV), se detectó una notable anomalía en los datos. Bajo similares, aunque no idénticas condiciones experimentales, los datos mostraron que el rolipram tenía una K_{d} = 1 nM, mientras que inhibía la actividad de PDE IV de cerebro de rata con una K_{i} = 1 \muM. Así, se observaba una diferencia de 1000 unidades en la afinidad de rolipram por el sitio de unión en contraste con su efecto en la actividad catalítica. Aunque no se alcanzó una comprensión sobre el establecimiento de las relaciones estructura actividad (REA) para la inhibición de PDE y la competición para la unión de [^{3}H]-rolipram, la diferencia sustancial en la potencia del rolipram como inhibidor de PDE IV comparado con su potencia en el sitio de unión parece cuestionar la validez de la suposición de que ambas actividades se contengan dentro del mismo locus molecular.

Debido a este dilema, se iniciaron varios estudios. Uno de ellos trato de averiguar si el sitio de unión de alta afinidad del rolipram existía en la misma proteína que el sitio catalítico del AMPc. Otro estudio buscó determinar si la REA para la inhibición de PDE IV es la misma que la REA para la competición con el sitio de unión de rolipram de alta afinidad. Un tercer estudio se encargó de intentar elucidar qué significado biológico, si lo hay, podría haber en estos hallazgos, particularmente porque se podría relacionar con el desarrollo de nuevas terapias de medicación.

Según se fueron recopilando datos de varios ensayos, se hizo aparente que hay al menos dos formas en PDE IV recombinante de monocitos humanos (hPDE IV) donde se unen los inhibidores. Una explicación para éstas observaciones es que hPDE IV existe en dos formas distintas. Una une los semejantes al rolipram y la denbufilina con una alta afinidad mientras la otra une estos compuestos con una baja afinidad. Por esto distinguimos estas formas refiriéndonos a ellas como la forma de unión de rolipram de alta afinidad (HPDE IV) y la forma de unión de rolipram de baja afinidad (LPDE IV).

La importancia de este hallazgo se basa en el descubrimiento de que los compuestos que compiten con más potencia por la forma de unión de rolipram de alta afinidad (HPDE IV) tienen más efectos secundarios o efectos secundarios más intensos que aquellos que compiten con más potencia con la LPDE IV (forma de unión de rolipram de baja afinidad). Otros datos indican que los compuestos pueden ser dirigidos hacia la forma de unión de baja afinidad de PDE IV y que esta forma es distinta de la forma de unión por la cual rolipram es una unión de alta afinidad. Se halló que existían distintos REAs para inhibidores que actuaban en la forma de unión de rolipram de alta afinidad contra la forma de unión de rolipram de baja afinidad. Además, éstas dos formas parece que tienen distintos papeles funcionales. Así, compuestos que interactuaban con la forma de unión de rolipram de baja afinidad parecen tener actividad antiinflamatoria, mientras que aquellos que interactúan con la forma de unión de rolipram de alta afinidad producen efectos secundarios o muestran con más intensidad esos efectos secundarios.

No hay una clara explicación para estos hallazgos. Sin embargo, se ha propuesto que PDE IV puede existir en dos diferentes estados terciario y cuaternario. Ambas formas se cree que son catalíticamente activas. El rolipram se une a un sitio catalítico de una forma con alta afinidad, definida aquí por tener una K_{i} menor que 10 nanomolar, y a la otra forma con una baja afinidad, definida aquí por tener una K_{i} superior a 100 nanomolar.

Una consecuencia útil de éstos hallazgos es que ahora es posible identificar compuestos que inhiben preferentemente la actividad catalítica de AMPc donde la enzima está en la forma que une rolipram con baja afinidad, de esta manera se reducen los efectos secundarios que parece ser están unidos a la inhibición de la forma que une rolipram con una alta afinidad. Esto aporta un índice terapéutico superior respecto a actividades antiinflamatorias y/o broncodilatoras versus efectos secundarios.

Sumario de la invención

El objeto de la invención se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Para los propósitos de ésta invención, el sitio catalítico AMPc que une rolipram con una baja afinidad se denomina el sitio de unión de "baja afinidad" (LPDE IV) y la otra forma de éste sitio catalítico que une rolipram con una alta afinidad se denomina el sitio de unión de "alta afinidad" (HPDE IV).

Se llevaron a cabo unos experimentos iniciales para establecer y validar una prueba de unión de [^{3}H]-rolipram. Se dan detalles de este trabajo más adelante en el Ejemplo 1.

Para determinar si tanto la actividad de unión de alta afinidad como la actividad de unión de baja finalidad residían en el mismo producto genético, se transforma levadura por procedimientos conocidos y se estudia la muestra de PDE IV recombinante durante un periodo de fermentación de 6 horas. El análisis de Western Blot usando un anticuerpo dirigido contra PDE IV indicó que la cantidad de PDE IV expresada aumentó con el tiempo, alcanzando un máximo tras 3 horas de crecimiento. Además, más del 90% del producto inmunoreactivo estaba en el sobrenadante de alta velocidad (100,000 x g) de los lisados de levadura. La unión [^{3}H]R-(-)-Rolipram y la actividad PDE fueron monitorizadas junto con la expresión proteínica. La actividad PDE IV fue expresada junto con la actividad de unión de rolipram, indicando que ambas funciones existen en el mismo producto genético. De forma similar a los resultados con el análisis Western Blot, se halló más de 85% de la actividad PDE inhibidora de rolipram y de la actividad de unión de [^{3}H]-rolipram en la fracción sobrenadante de levadura.

En conjunto, la mayor parte de los PDE IV recombinantes mostrados en este sistema existen como LPDE IV y sólo una pequeña fracción como HPDE IV. En consecuencia, la inhibición de actividad catalítica de PDE IV recombinante refleja principalmente las acciones de compuestos en LPDE IV. La inhibición de la actividad catalítica de PDE IV puede así ser usada como un índice de la potencia de compuestos en LPDE IV. La potencia de compuestos en HPDE IV puede ser evaluada examinando su capacidad para competir por [^{3}H]-rolipram. Para desarrollar REAs tanto para los sitios de unión de rolipram de baja afinidad como de alta afinidad, las potencias de compuestos seleccionados se determinaron en dos sistemas de ensayo. Se tabularon los resultados de experimentos usando compuestos estándar. Tal y como se esperaba, ciertos compuestos fueron de forma clara más potentes compitiendo con [^{3}H]-rolipram por el sitio en donde rolipram demostró una unión de alta afinidad comparado con el otro sitio, aquel en que rolipram es un ligante de baja afinidad. La correlación de REA entre unión de alta afinidad y unión de baja afinidad fue pobre y se concluyó que el REA para la inhibición de unión de [^{3}H]-rolipram de alta afinidad era distinto del REA para unir el sitio de unión de rolipram de baja afinidad. Tabla I muestra los resultados de este trabajo de REA.

TABLA I

1

2

La denbufilina es 7-acetonil,1,3-dibutilxantina preparada por SmithKline Beecham. La papaverina es 1-[(3,4-dimetoxifenil)metil]-6,7-dimetoxiisoquinolina. La trequinsina es 2,3,6,7-tetrahidro-2-(mesitilimino)-9,10-dimetoxi-3-metil-4H-primido[6,1-a]isoquinolina-4-ona. Dipirimadol es el nombre genérico para 2,2',2'',2'''-[(4,8-dipiperidinopirimida[5,4-d]pirimidina-2-6-diil)dinitrilo]tetraetanol.

Estos resultados muestran que algunos compuestos pueden de forma selectiva inhibir la llamada forma de baja afinidad en comparación con la forma de alta afinidad, y viceversa. El significado de este hallazgo es que es factible minimizar efectos secundarios diseñando o eligiendo compuestos que de manera selectiva (preferentemente) inhiben un sitio afectando, de esta forma la respuesta deseada hasta la exclusión de otra, indeseada, respuesta, o al menos minimizar la respuesta no buscada hasta un grado donde no esté interfiriendo con la terapia intencionada hasta un grado inaceptable.

A pesar de este trabajo, no hemos definido las bases para los REA dispares para la unión de rolipram de alta afinidad y unión de rolipram de baja afinidad en el isoenzima PDE IV. Sin embargo, se ha descubierto que si un compuesto presenta una proporción de IC_{50} de cerca de 0,1 o superior, calculado como una proporción del IC_{50} de la forma de unión de rolipram de alta afinidad dividida por el IC_{50} para la forma que une rolipram con una baja afinidad, tendrá un índice terapéutico aceptable. Es decir, se puede ahora tratar con éxito una diversidad de enfermedades inmunológicas e inflamatorias sin afectar para nada otros fenómenos psicológicos o en un grado inaceptable. Por ello la representación más preferible es inhibir el sitio de unión de rolipram de baja afinidad como un medio para tratar enfermedades inflamatorias y alérgicas.

Compuestos

Esta invención abarca un procedimiento para identificar esos compuestos que tienen una proporción de IC_{50} (alta/baja afinidad) de cerca de 0,1 o superior. Esto incluye cualquiera y todos los compuestos que son inhibidores de PDE IV según el ensayo descrito, y que demuestra en éstos, o ensayos similares, una relación dentro del ámbito definido; de particular interés son aquellos compuestos que no son del dominio público y/o no han sido probados como o no son conocidos como inhibidores PDE IV con antelación a la fecha de clasificación de esta aplicación.

Se dan ejemplos de compuestos que alcanzan la relación de IC_{50} estándar dadas en la Tabla I, anteriormente mostrada, así como las solicitudes de patentes de EE.UU. en trámite USSN 862.083 presentada el 30 octubre 1992; USSN 862.111 presentada el 30 octubre 1992; USSN 862.030 presentada el 30 octubre 1992; y USSN 862.114 presentada el 30 octubre 1992.

Los compuestos preferidos son aquellos que tienen una relación de IC_{50} superior a 0,5, y de forma particular aquellos compuestos que tienen una relación superior a 1,0. Los compuestos preferidos son trequinsina, dipiridamol y papaverina. Compuestos como cis-[ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxipenil)ciclohexan-1-carboxilato], 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona y cis-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol] son ejemplos de estructuras que se unen preferentemente al sitio de unión de baja afinidad y que tienen una relación de IC_{50} de 0,1 o superior.

Los siguientes ejemplos tienen como objeto mostrar cómo hacer y usar la invención. Su intención de ninguna manera es limitar el alcance de la invención en modo alguno o en grado alguno. Remítase a las reivindicaciones situadas más adelante para ver lo que está reservado a los inventores.

Ejemplos

Se usaron ocho ensayos diferentes distribuidos entre cinco especies para obtener datos que apoyasen la selección de una relación de IC_{50} cerca de 0,1 o superior. Los ensayos fueron: estimulación de la producción de ácido de la glándula parietal aislada de conejos, inhibición de la desgranulación (liberación de mileoperoxidasa) inducida con FMLP en neutrófilos humanos; inhibición de la formación de O_{2} incluida con FMLP en eosinófilos de conejos de indias; inhibición de la producción de TNF_{\alpha} inducida con LPS en monocitos humanos; producción de emesis en perros; inhibición de broncoconstricción inducida con antígeno en conejos de indias; inversión de hipotermia inducida con reserpina en ratones; e inhibición de producción de TNF_{\alpha} inducida con LPS de monocitos humanos transferidos en ratones. Abajo se presentan estos ensayos y datos.

Análisis estadístico

Para examinar la hipótesis de que la inhibición del sitio de baja afinidad PDE IV está asociada con las acciones antiinflamatorias de esta clase de compuestos, mientras que la inhibición del sitio de alta afinidad está asociada con la producción de ciertos efectos secundarios, se determina la capacidad de varios inhibidores PDE IV para bloquear la función de las células inflamatorias tanto in vitro como in vivo y la capacidad de estos compuestos para producir efectos secundarios en modelos in vitro e in vivo. Para comparar la capacidad de los inhibidores PDE IV para obtener un efecto terapéutico o efecto secundario dado con su capacidad para inhibir el sitio de unión de baja afinidad contra su capacidad para inhibir el sitio de alta afinidad de PDE IV, nosotros comparamos la potencia de estos compuestos en los ensayos in vitro e in vivo con su potencia contra la actividad catalítica de enzimas aislados o el sitio de alta afinidad por una correlación lineal de (r^{2}) o una correlación de orden de rango (Rho de Spearman). La correlación lineal pregunta si la potencia de un compuesto en inhibir tanto el sitio de baja afinidad como el sitio de alta afinidad se puede usar para predecir la capacidad de sacar un efecto antiinflamatorio o secundario dado. La correlación de orden de rango prueba si la potencia del orden de rango en producir un efecto antiinflamtorio o secundario dado es similar a la potencia de orden de rango en inhibir el sitio de baja afinidad o alta afinidad. Ambos r^{2} y el Rho de Spearman fueron calculados usando el programa de ordenador STAT View II para Macintosh.

PDE IV contra unión de alta afinidad de rolipram Ejemplo 1 Ensayos de fosfodiesterasa y unión de rolipram

Se determinó que PDE IV y HPDE IV de monocitos humanos aislados existían principalmente en la forma de baja afinidad. Así, se puede valorar la actividad de compuestos de prueba contra la forma de baja afinidad del PDE IV usando ensayos estándar para la actividad catalítica de PDE IV empleando [^{3}H] AMPc 1 \muM como sustrato (Torphy et al., 1992).

Se usarán como fuente de proteína sobrenadantes de alta velocidad del cerebro de rata y se prepararon ambos enantiomeros de [^{3}H]-rolipram para una actividad específica de 25,6 Ci/mmol. Se modificaron las condiciones de ensayo estándar del procedimiento publicado para ser idénticas a las condiciones del ensayo de PDE, excepto para la última del AMPc: Tris HCl 50 mM (pH 7.5), MgCl_{2} 5 mM, 5'-AMP 50 \muM y de [3H]-rolipram 1 nM (Torphy et al., 1992). El ensayo duro 1 hora a 30ºC. Una vez concluida la reacción, se separó el ligando unido del ligando libre usando un recolector de células Brandel. Se valoró la competitividad por el sitio de unión de alta afinidad bajo condiciones que fueron idénticas a aquellas usadas para medir la actividad de PDE de baja afinidad, excepto que [^{3}H]-AMPc no estaba presente.

Ejemplo 2 Acumulación de aminopirina

Ciertos metilxantinas y otros inhibidores PDE no selectivos incrementan la secreción de ácido en varias especies. Ciertos inhibidores PDE IV selectivos, por ejemplo, rolipram y Ro 20-1724, aumentan la secreción de ácido en ratas, en particular cuando se dan en combinación con un activador de adenilato ciclasa como histamina. Este incremento en la secreción de ácido está acompañado por una elevación en la acumulación de AMPc inducida por la histamina. Se probó esta información para determinar si el fenómeno existía. La capacidad de los compuestos para inducir la secreción de ácido fue correlacionada con su capacidad contra el sitio de baja afinidad o el sitio de alta afinidad. El ensayo usado en este trabajo fue la acumulación de una base débil, aminopirina radiomarcada que se ha comunicado que sirve como un marcador bioquímico para la secreción incrementada de ácido. El ensayo es el siguiente:

Preparación de la glándula gástrica

Se sacrificaron conejos de ambos sexos mediante dislocación cervical y se les extirparon los estómagos. Se diseccionó la mucosa del corpus; se descartaron las porciones craneal y antral del estómago. Se aislaron las glándulas gástricas mediante una modificación de los procedimientos descritos por Berglindh y Obrink (1976) y Sack y Spenney (1982). Entonces, se desmenuzó la mucosa y se digirió con collagenasa para aislar las glándulas gástricas. Se filtraron las glándulas digeridas, se lavaron, y se suspendieron en un medio de incubación de 1:15 (vol:vol) de las siguientes composiciones: NaCl, 132,4 mM; KCl, 5,4 mM: Na_{2}HPO_{4}, 5,0 mM; NaH_{2}PO_{4}, 1,0 mM; MgSO_{4}, 1,2 mM; CaCl_{2}, 1,0 mM; NaHCO_{3}, 12,0 mM; albúmina sérica de rata, 2 mg/ml; dextrosa, 2 mg/ml; con un pH 7,4.

Acumulación de aminopirina

Para determinar la secreción de ácido, se incubaron las glándulas gástricas en combinación con [^{14}C]-aminopirina, varias concentraciones de inhibidores de PDE IV selectivos, y una concentración mínima de histamina (0,3-1,0 \muM), a 37ºC en un agitador horizontal (110 ciclos/minutos) durante 20 minutos de acuerdo con los procedimientos de Sack y Spenney (1982). Se centrifugaron las muestras y se determinó la radioactividad en alícuotas de la fracción de sobrenadante y de granulo. Se calcularon las porciones de aminopirina como se describió por Sack y Spenney (1982). Los datos fueron expresados como el porcentaje de una respuesta producida por una concentración máxima de histamina (100 \muM). Se determinaron los valores de EC_{50} por interpolación lineal usando la respuesta máxima obtenida para cada compuesto.

Ejemplo 3 Evaluación del potencial emético de inhibidores de PDE selectivos en perros

Se obtuvieron perros mestizos (n = 5, para cada estudio) de ambos sexos de la colonia animal. Después de ayunar un día, se les alimentó con ½ lata de comida para perros (Big Bet) al menos 30 minutos antes del estudio. Se les colocó una cánula en la vena cefálica de cada pata delantera para administrar medicamentos. La cánula se llenó con 1 ml de salina isotónica (0,09%) antes de administrar el compuesto experimental. Los compuestos fueron disueltos tanto en una mezcla de polietilenglicol y solución salina como polietilen glicol al 100% y se dio a un volumen de 1,0-2,0 ml/ 10 kg. Para asegurar que la dosis entera entra en la circulación, se llenó la cánula con una cantidad adicional 0,5-1,0 ml de solución salina. Después se devolvió el animal a una jaula para un periodo de observación de 1 hora. Se observó a cada perro en busca de señales de náuseas o vómitos y se anotó el tiempo tras la administración del compuesto para que se diese este comportamiento. Al final del periodo de observación, el animal fue devuelto a su jaula madre. Cada día de estudio fue seguido de 7 días sin estudio. Se administró cada compuesto en dosis cada vez mayores a cada perro en días de estudio sucesivos hasta que se observó un efecto emético. En este tiempo, se apartó al perro del estudio y se evaluaron dosis más altas en aquellos perros que aún no habían respondido.

Los datos se expresaron como el porcentaje acumulativo de perros que respondieron a cada dosis como se describió en la literatura para curvas de respuesta de dosis cuantal. Un valor ED_{50} se calculó usando análisis probit.

Ejemplo 4 Ensayo de eosinofilos en conejos de indias Aislamiento y purificación de eosinofilos

Se inyectó a los conejos de indias machos (Hartley, Hazelton Labs) 1 ml desuero equino semanalmente durante 4-6 semanas antes de uso. Se anestesió a los animales con una mezcla de ketamina/xilazina (88 mg; 12 mg/ml); 0,4 ml/kg al menos 24 horas después de una inyección de suero equino. Después de la inducción de anestesia se lavó la cavidad peritoneal con 50 ml de solución salina estéril (0,9%) caliente. Se recolectó el fluido de lavado usando un catéter de 14 G dentro de tubos de plástico de centrifugado cónico de 50 ml. A los conejos de indias se les permitió recuperarse de la anestesia y se podían usar de nuevo después de un periodo de descanso de dos semanas.

Se aislaron las células del fluido de lavado mediante centrifugación (400 x g, 10 minutos) y se suspendieron en 35 ml de salina regulada por fosfato (PBS) reforzada con 10 ml de Percoll isotónico (1,075 g/ml). Se centrifugó esta suspensión durante 30 min a 300 x g. Se lavó el gránulo que contenía eosinofilos y eritrocitos en PBS y los eritrocitos lisados. Éstas células se suspendieron en un medio RPMI 1640 con 20% de FBS y se incubaron durante la noche a 37ºC en un incubador de 5% CO_{2} humidificado. Las células del día siguiente se lavaron y suspendieron en PBS para determinar la viabilidad (exclusión de azul de tripano) y la pureza celular.

Producción de superóxido anion (O_{2}^{-})

Se suspendieron eosinofilos purificados (viabilidad > 95% y pureza > 90%) en PBS con 20 mM de Regulador Hepes (pH 7,4) y 0,1% de gelatina en una concentración de 1-2 x 10^{6} célula/ml. Se añadieron eosinofilos (1 x 10^{5}) a una placa de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 1 hora a 37ºC. Se añadieron los inhibidores de PDE IV durante 10 minutos antes del comienzo de la reacción. Se inicio la reacción por la adición del citocromo C (169 \muM) y formil Met-Leu-Phe (fMLP) (30 nM) en ausencia o presencia de 60 unidades de superoxido dismutasa (SOD). La reducción del citocromo C se monitorizó en un lector de placas Dynatech MR 7000 a 550 nm con una referencia de 630 nm en varios periodos de tiempo. Se determinó el índice de producción de O_{2}^{-} mediante un análisis de regresión lineal usando la absorción neta de pocillos en ausencia o presencia de SOD en varios puntos de tiempo. Los resultados se expresaron como un porcentaje de la producción de control de O_{2}^{-} corregida para la liberación básica. Ya que la inhibición máxima observada era del 60%, se calcularon los log IC_{30} usando una interpolación lineal de la concentración y agrupación del 30%.

Ejemplo 5 Broncoconstricción en conejos de indias

Se sensibilizaron los conejos de indias Hartley macho (200-250 g/4 semanas, Hartley Investigación, Denver, PA) con inyecciones I.M. de 0,35 ml de una solución salina del 5% (w/v) de ovoalbúmina en cada muslo (0,7 ml total) en los días 1 y 4. Los conejos de indias estuvieron disponibles para su uso después del día 25.

Procedimiento experimental

Se anestesiaron los conejos de indias Hartley machos (600-800 g Hazelton), sensibilizados de forma activa a la ovoalbúmina, fueron anestesiados con sodio pentobarbital (40 mg/kg I.P.) aproximadamente 10-15 minutos antes de la cirugía. Se canalizó la vena yugular, la arteria carótida, y la tráquea (Desret Intracath® Vialon® catéteres radioopacos de polímeros de resina (Deseret Medical, Inc., Sandy, UT), 22 GA y 19 GA, y tubo de PE 260, respectivamente) para la administración de medicamentos, monitorización de la presión sanguínea y ventilación. Se realizó la vagotomía bilateral para minimizar la interferencia colinérgica. Se paralizaron los animales (bromuro de pancuronium, 0,1 mg/kg i.v.) y se ventilaron (45 respiraciones/minutos) por vía de Respirador Harvard para Roedores (modelo 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Se midieron los cambios en la presión del aire mediante un brazo lateral de la cánula traqueal con un transductor Elcomatic (Buxco Electronics, Sharon, CT). El volumen del golpe de ventilación fue dispuesto para producir una presión lateral de 8 cm de H_{2}O (aproximadamente 5cc de aire ambiente). Se midió la presión sanguínea con un transductor de presión física Statham P23XL (Viggo-Spectramed, Oxnard, CA). Las presiones se grabaron en un polígrafo Grass Model 7D (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Los animales se mantuvieron calientes en una mesa de calentamiento a lo largo del experimento para mantener la temperatura corporal.

Se administraron los compuestos o excipientes de ensayo por vía i.v. 10 minutos antes del estímulo con antígeno. En el punto de tiempo 0, se administraron 0,1 mg/kg de ovoalbumina por vía i.v. En la cima de la respuesta con antígeno, se administró una dosis adicional de antígeno, 0,2 mg/kg de ovoalbumina, i.v.. Después de alcanzar el punto álgido de la respuesta con antígeno al 0,3 mg/kg de ovoalbúmina acumulativo, se administró una solución saturada de KCl, 1 cc/kg, i.v., lo que produjo máxima broncoconstricción,

Ejemplo 6 Inhibición de TNF_{\alpha} inducido con LPS en monocitos humanos Estudios in vitro

Para determinar si la inhibición de TNF_{\alpha} está relacionada con la inhibición de LPDE IV o HPDE IV, se seleccionaron una serie de inhibidores de PDE IV poseedores de una gama de potencias para los LPDE IV y HPDE IV por su capacidad para inhibir la producción de TNF_{\alpha} en monocitos humanos estimulado con lipopolisacáridos (LPS) in vitro. El uso de células humanas primarias para ésta selección fue de extrema importancia dado que diferentes especies parecen diferir de forma dramática en la contribución relativa de LPDE IV y HPDE IV a la hidrólisis de AMPc en células inflamatorias.

Procedimientos

Se valoró la inhibición de TNF_{\alpha} en monocitos de sangre periférica humanos que se purificaron (Collata) a partir de capas neutralizadoras o residuos de sangre de plasmaforesis de donantes humanos normales. Los monocitos se colocaron en placas a una densidad de 1 x 10^{6} células/ml medio/pozo en multidiscos de 24 pocillos. A las células se les permitió adherirse durante 1 hora, después de la cual el sobrenadante fue aspirado y se añadió 1 ml de médio fresco (RPMI-1640 conteniendo 1% de suero de feto de ternero y penicilina/estreptomicina a 10 U/ml). Las células se incubaron durante 45 minutos en presencia o ausencia de compuestos de ensayo en concentraciones que iban desde 1 nM a 1 mM antes de la adición de LPS (E. coli. 055:B5 Sigma Chemicals) para dar una concentración final de 100 ng/ml. Los compuestos de ensayo se solubilizaron y se diluyeron en una concentración 50:50 de dimetilsulfoxido/etanol, tal que la concentración de disolvente final en el médio de cultivo de monocitos fue 0,5% dimetilsulfoxido y 0,5% etanol. Se retiraron los sobrenadantes de los monocitos después de una incubación de 14-16 horas a 37ºC/5% CO_{2}, y se centrifugaron a 100 x G para retirar los restos celulares. Los ensayos de citoquina se realizaron bien de modo inmediato y si no los sobrenadantes de cultivo se guardaron a -70ºC hasta ser utilizados en ensayos.

Los niveles de TNF_{\alpha} se midieron usando una ELISA (Winston) empleando un anticuerpo de TNF_{\alpha} antihumano murino monoclonal (ver debajo) como el anticuerpo de captura y un TNF_{\alpha} antihumano policlonal de conejo como el segundo anticuerpo. Para detectar, se añadió un preoxidasa-conjugado de cabra anticonejo (Boehringer Mannheim, Cat. #605222) seguido de un sustrato para preoxidasa (1 mg/ml ortofenilenediamina con un 0,1% de peróxido de urea). Se calculan los niveles de TNF_{\alpha} en muestras a partir de una curva patrón generada con TNF_{\alpha} recombinante humano producido en E. coli. Se preparan anticuerpos monoclonales a TNF_{\alpha} de bazos de ratones BALB/c inmunizados con TNF_{\alpha} recombinante humano por una modificación del procedimiento de Kohler y Millstein (Nature, vol. 256, pg495-497, 1975). Los anticuerpos TNF_{\alpha} antihumanos de conejo policlonales se prepararon por inmunización repetida de conejos blancos neocelandeses con r TNF_{\alpha} ecombinante humano emulsionados por el adyuvante completo de Freund.

Supresión in vivo de la producción de TNF_{\alpha} humano en un modelo de peritonitis adoptivo Procedimientos

Una unidad media de sangre venosa entera heparinizada se sacó de empleados sanos que no estaban tomando ningún tipo de medicación. Se separaron los leucocitos polimorfonucleares poniendo en capas la sangre en Histopaque-1077 mediante centrifugación a 800 x g durante 30 minutos a 25º C. La porción limfocito/monocito fue cosechada y lavada dos veces con DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) sin Ca^{2+} y Mag^{2+} a 1000 rpm durante 10 minutos a 25ºC. El gránulo se resuspendió en 5 ml de DPBS sin Ca^{2+} y Mag^{2+}, se colocó en capas en 5 ml de solución Percoll preparada en el médio RPMI 1640 que estaba desprovisto de suero a 25ºC, y se centrifugó a 550 x g durante 30 minutos a 25ºC. La capa flotante de monocitos se retiró y lavó dos veces con DPBS sin Ca^{2+} y Mag^{2+} a 1000 rpm durante 10 minutos a 25ºC. El lavado y aislado de monocitos final se suspendió a 6-10 x 106 células/ml en DPBS sin Ca^{2+} y Mag^{2+} a 25ºC. Los monocitos también se aislaron mediante el mismo procedimiento de los paquetes de Leucocitos Fuente. Las preparaciones del monocito abarcaron del 65 al 90% de monocitos y la viabilidad de las células fue de > 97% (exclusión de azul de tripano).

Se mantuvieron los machos BALB/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) en grupos de 4 ó 5 en un lugar con barreras. A los ratones que pesaban entre 18-25 g y que eran de la misma edad se les inyectaron 0,5 ml de 6-10 x 10^{6} de monocitos/ml dentro del peritoneo usando presión ligera en una jeringuilla con una aguja de 23 ga para que así los monocitos fueran expuestos a mínimas fuerzas de intercambio y estrés. A los 2 minutos de recibir los monocitos, se trataron los ratones con excipientes o compuestos mediante dosis orales durante 15 minutos Entonces se inyectó a los animales intraperitonealmente (i.p.) 0,2 ml de 125 mg/ml de endoxina (E. coli. tipo W, Difco) disuelto en DPBS sin Ca^{2+} y Mag^{2+}. Dos horas más tarde, se practicó la eutanasia en los animales mediante asfixia por dióxido de carbono y se inyectaron 1,5 ml de DPBS sin Ca^{2+} y Mag^{2+} (4ºC) i.p. Se masajeo suavemente el peritoneo y se retiró el lavado y se colocó en tubos de poliproileno en una bañera con hielo. Las muestras se aclararon por centrifugación (12,500 x g durante 5 minutos a 4ºC). Se decantaron los sobrenadantes en tubos nuevos (pueden ser guardados a -20ºC) y ensayados para TNF_{\alpha} humano y de ratón mediante ELISA. Se calcularon los valores ED_{50} mediante procedimientos estándar.

Ejemplo 7 Procedimientos de neutrofilos humanos Aislamiento y purificación

Los neutrofilos (PMNs) se aislaron de la sangre heparinizada mediante una centrifugación gradual usando Ficoll (Histopaque 1077) seguida de una sedimentación en dextrano para retirar los eritrocitos. Cualquier eritrocito restante se lisó con agua durante 30 seg y se restauró la isotonicidad usando 10X DB-PBS (agua/aceite Ca2+ o Mag2+). Se aislaron los PMNs mediante centrifugación y se lavaron una vez más con 1X DB-PBS antes de determinar el número de células y la viabilidad (exclusión de azul de tripano). El número de células se ajustó a 0,75-1,5 x 10^{6} células/ml dependiendo del donante individual.

Degranulación (liberación de mieloperoxidasa)

Una alícuota (0,1 ml) de la suspensión de células anterior se incubó en la Solución Salina Equilibrada de Earles conteniendo tampón HEPES 20 mM (pH = 7,4) y un 0,1% de gelatina en presencia de 5 \mug/ml de citocalasina B durante 5 minutos a 37ºC en un baño agitado. Las células se pretrataron durante 5 minutos adicionales con varias concentraciones de inhibidores de PDE IV selectivos y PGE_{2} (3-10 nM) con anterioridad a la adición de fMLP (30 nM). Se añadió el fMLP y continuó la incubación durante 30 minutos más. La reacción se terminó mediante la colocación de las muestras en hielo seguido de una centrifugación. La fracción sobrenadante se retiró y se guardó congelada (-30ºC) hasta el ensayo para estudiar la actividad de mieloperoxidasa.

Determinación de actividad de mieloperoxidasa

La actividad mieloperoxidasa se determinó usando o-dianisidina como sustrato y peroxidasa de rábano como patrón. Se incubó una alícuota (50\mul) de sobrenadante con 100\mul de sustrato (o-dianisidina, 0,53 mM; H2O2, 0,147 mM; concentración final) en 50 mM de tampón fosfato de Na (pH 6.0). La reacción terminó con la adición de 50 \muL de 4 M H_{2}SO_{4}. La formación de producto se determinó midiendo la absorción a 410 nm y la actividad se determinó comparándola con la curva patrón usando peroxidasa de rábano. Los datos se expresaron como porcentaje de control (cantidad de mieloperoxidasa liberado en la presencia de PGE_{2} solo). Puesto que la inhibición máxima observada para la mayoría de compuestos fue del 30%, se calcularon los valores de log (IC_{15}) usando interpolación lineal de las concentraciones que comprendían un 15%.

Ejemplo 8 Inversión de hipotermia inducida con reserpina en ratones

Se aislaron individualmente los ratones CF-1 0 BALB/c machos en jaulas de alambre. Se grabó la temperatura rectal de cada ratón antes del pretratamiento con reserpina (10 mg/kg, i.p.). Cuatro horas después del reserpina se registraron las temperaturas rectales y a los animales individuales se les dieron varias dosis de forma oral tanto de compuestos de prueba como de excipientes o rolipram (10 mg/kg). Entonces se registraron las temperaturas rectales cada 30 minutos durante 2 horas. Los datos se expresaron como el cambio en temperatura observado cuatro horas post reserpina (las temperaturas cayeron aproximadamente 10-15ºC por debajo de los niveles básicos). Las curvas de respuesta a dosis se construyeron usando cambios de temperatura registrados 90 ó 120 minutos después del tratamiento. Los valores de ED_{50} se determinaron mediante un análisis probit o de regresión lineal de una media de 6-9 animales. Para comparar la capacidad de los compuestos para invertir la hipotermia inducida con reserpina con su capacidad para inhibir la unión de baja afinidad o unión de alta afinidad, los valores ED_{50} e IC_{50} fueron expresados como el -log (valor).

Ejemplo 9 Relación entre la función biológica y la inhibición de PDE IV

Para determinar si ciertos efectos biológicos de la inhibición de PDE IV estaban asociados con la inhibición o de LPDE IV o de HPDE IV, se determinó una comparación entre la capacidad de los compuestos para producir un efecto y la capacidad de los compuestos para inhibir LPDE IV o HPDE IV usando una correlación lineal y de orden de rango. Varios factores pueden influenciar estas correlaciones por: 1) la estabilidad de los compuestos; 2) capacidad de los compuestos para entrar en células; 3) en estudios in vivo, la biodisponibilidad de los compuestos; 4) los valores de correlación, de forma especial la correlación lineal son sensibles a la diferencia en potencias, cuanto mayor el alcance de los valores de potencia más fácil es medir una correlación lineal significativa. Estas advertencias se tomaron en consideración cuando se analizaba y resumía la correlación entre la inhibición de LPDE IV o HPDE IV y la función biológica en los sistemas de ensayo.

Usando células inflamatorias aisladas, se correlacionó mejor la supresión de producción de TNF_{\alpha} de monocitos y la inhibición de producción de superóxido en los eosinofilos de conejo de indias con la inhibición de LPDE IV y no de HPDE IV. Además, la prevención in vivo de la broncoconstricción inducida con antígeno se correlacionó mejor con la inhibición de LPDE IV que con HPDE IV. En este modelo in vivo, los inhibidores de PDE IV parece que actúan previniendo la desgranulación de la célula mástil (Underwood et al., in press). Sin embargo, la inhibición de la función de la célula inflamatoria no siempre estuvo asociada con la inhibición de LPDE IV porque se halló que la inhibición de desgranulación neutrófila estaba mejor correlacionada con la inhibición de HPDE IV que de LPDE IV. Así parece que algunas pero no todas las supresiones de actividad de la célula inflamatoria estaban asociadas con la inhibición de LPDE IV. En contraste, el aumento de la secreción de ácido, la producción de la emesis y la inversión de hipotermia inducida por resperpina (una medida del potencial psicotrópico de los inhibidores PDE IV) estaban mejor correlacionados con la inhibición de HPDE IV y no LPDE IV. De tal manera que la mayor parte de los efectos secundarios potenciales de esta clase de compuestos se asociaron con la inhibición de HPDE IV.

Así éstos hallazgos sugieren que los compuestos que de forma preferente inhiben LPDE IV producirán efectos antiinflamatorios beneficiosos con reducido potencial para dar efectos secundarios indeseados. Así seleccionando compuestos con una proporción de IC_{50} cerca de 0.1 o superior respecto al IC_{50} para forma catalítica de PDE IV que une rolipram con una alta afinidad dividida por el IC_{50} para la forma catalítica de PDE IV que une rolipram con una baja afinidad (HPDE IV/LPDE IV) debería resultar en un incremento en su índice terapéutico, es decir, el efecto beneficioso es maximizado y el efecto perjudicial es minimizado.

Para determinar si esta pauta de selección identificaría de verdad los compuestos con un índice terapéutico mejorado, se evaluaron tres modelos que comparan un efecto terapéutico con un efecto secundario. Esto incluyó una comparación in vitro entre la capacidad de los compuestos para suprimir la producción de TNF_{\alpha} de monocitos humanos aislados con su capacidad para estimular la secreción de ácido en glándulas parietales de conejo aisladas y dos comparaciones in vivo para examinar la capacidad de los compuestos para prevenir la broncoconstricción inducida por un antígeno en conejos de indias y la capacidad para sacar emesis en perros y la capacidad de los compuestos para suprimir la producción de TNF_{\alpha} en un modelo de transferencia adoptiva en ratones y su capacidad para invertir la hipotermia inducida por reserpina en ratones.

Los inhibidores PDE IV con una proporción selectiva (HPDE IV/LPDE IV) igual o superior a 0,1 mostraron una marcada mejora en su índice terapéutico. Por ejemplo, cis-[4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1-carboxilato], 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona, y cis-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol] todos con una proporción selectiva \geq 0,1 demuestran una mejoría 100x veces en su índice terapéutico en comparación con el arquetípico inhibidor PDE IV, R-rolipram. Así, esto demuestra que usando la pauta de selección de HPDE IV IC_{50}/ LPDE IV IC_{50} \geq 0,1 se identifican los compuestos con una comparación in vitro de índice terapéutico incrementado.

Claims (7)

1. Un procedimiento para identificar un inhibidor de PDE IV, procedimiento que comprende determinar para dicho inhibidor el valor IC_{50} para su unión con la forma PDE IV que une rolipram con alta afinidad y su valor IC_{50} para su unión con la forma PDE IV que une rolipram con baja afinidad, y determinar si la relación del valor de IC_{50} para unión de alta afinidad al valor de IC_{50} para unión de baja afinidad es aproximadamente 0,1 o superior.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el procedimiento identifica un inhibidor que tiene una relación de IC_{50} de aproximadamente 0,1 o superior como se determina mediante el uso de PDE IV de cerebro de rata como la forma que une rolipram con alta afinidad y PDE IV humana como la forma que une rolipram con baja afinidad.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la relación de IC_{50} es de aproximadamente 0,5 o superior.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la relación de IC_{50} es de aproximadamente 1,0 o superior.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la forma de unión de baja afinidad de PDE IV se obtiene de monocitos humanos.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que la PDE IV usada como forma de unión de alta afinidad de PDE IV es el sobrenadante de alta velocidad de un homogeneizado de células de cerebro de rata.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la reivindicación 8, en el que el procedimiento comprende determinar para dicho inhibidor de valor IC_{50} para competir con la unión de 1nM de [^{3}H]R-rolipram a una forma de PDE IV que une rolipram con una alta afinidad, determinando el valor de IC_{50} para la inhibición de actividad catalítica de PDE IV de una forma que une rolipram con una baja afinidad usando 1 uM [^{3}H]-AMPc como sustrato, y determinar si la relación del valor de IC_{50} para la unión de alta afinidad al valor IC_{50} de la forma para la unión de baja afinidad es de aproximadamente 0,1 o superior.