ES2227611T3 - Uso de heparinas para disminuir repuestas inflamatorias. - Google Patents
Uso de heparinas para disminuir repuestas inflamatorias.Info
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Abstract
LAS ENZIMAS HEPARINASAS PUEDEN UTILIZARSE COMO TRATAMIENTO MEDICO PARA REDUCIR LAS RESPUESTAS INFLAMATORIAS LOCALIZADAS. EL TRATAMIENTO CON HEPARINASA DEL ENDOTELIO ACTIVADO INHIBE EL MOVIMIENTO, LA ADHESION Y LA EXTRAVASACION DE LEUCITOS. LA MAYOR PARTE DE LA HEPARINA Y DEL SULFATO DE HEPARANO SOBRE LAS SUPERFICIES CELULARES DEL ENDOTELIO Y EN MEMBRANAS BASALES SE DEGRADA POR LA EXPOSICION A LA HEPARINASA. ADEMAS, LAS QUIMOCINAS INMOVILIZADAS, QUE ESTAN UNIDAS A LA HEPARINA/SULFATO DE HEPARANO SOBRE EL ENDOTELIO ACTIVADO, SON SOLUBILIZADAS POR LA DIGESTION CON HEPARINASA. LA HEPARINASA PUEDE INFUSIONARSE HACIA EL SISTEMA VASCULAR PARA INHIBIR LA ACUMULACION DE LEUCOCITOS EN UN TEJIDO INFLAMADO Y DISMINUIR LAS LESIONES PROVOCADAS POR INFLAMACIONES LOCALIZADAS. PUEDE LOGRARSE LA ADMINISTRACION DIRIGIDA DE HEPARINASA AL ENDOTELIO ACTIVADO MEDIANTE LA ADMINISTRACION LOCALIZADA Y/O EL USO DE HEPARINASA FORMADA MEDIANTE INGENIERIA GENETICA QUE CONTIENE DOMINIOS DE UNION A LIGANDOS DEL ENDOTELIO.
Description
Uso de heparinasas para disminuir respuestas
inflamatorias.
Esta invención se refiere al uso de un enzima
heparinasa en la preparación de un medicamento para administración
intravascular para disminuir las respuestas inflamatorias de una
lesión por isquemia/reperfusión en un tejido de un paciente.
Una respuesta inflamatoria es una respuesta local
a una lesión celular que está marcada por dilatación de capilares,
infiltración de leucocitos, enrojecimiento, calor y dolor y sirve
como mecanismo para iniciar la eliminación de agentes nocivos y del
tejido dañado.
Una respuesta inflamatoria generalizada dentro de
un tejido se produce por el reclutamiento de leucocitos en el
tejido. La destrucción de bacterias, materiales extraños y/o células
dañadas se produce por medio de fagocitosis y/o desgranulación
extracelular (secreción de enzimas de degradación, proteínas
antimicrobianas y mieloperoxidasa, que forma superóxidos a partir de
H_{2}O_{2} secretado). Aunque la mayoría de las respuestas
inflamatorias localizadas son beneficiosas, pueden producirse
respuestas inflamatorias perjudiciales. La mayoría de las respuestas
inflamatorias perjudiciales también implican la acumulación de
leucocitos dentro de un tejido. Esta acumulación ocasiona la
destrucción de células y tejidos viables. Además de dañar a los
tejidos, estas respuestas son perjudiciales o debilitantes para el
individuo que las padece. Los ejemplos de respuestas inflamatorias
perjudiciales pueden incluir los siguientes: lesión por
isquemia/reperfusión después de infarto de miocardio, choque,
apoplejía, trasplante de órganos, cirugía de bypass cardiopulmonar,
rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide, asma inducida por
antígenos, rinitis alérgica y glomerulonefritis (véase la revisión
en Harlan, et al., Immunol. Rev.,
114:5-12, 1990; Carlos y Harlan, Blood
84:2068-2101, 1994).
El reclutamiento de leucocitos implica una
cascada de sucesos celulares, que comienzan con la activación del
endotelio vascular por el tejido lesionado o infectado adyacente al
endotelio. La activación del endotelio tiene como resultado una
mayor adhesión de los leucocitos a las células endoteliales y una
migración transendotelial (extravasación) por los leucocitos unidos
al interior del tejido lesionado. La activación endotelial se
manifiesta por una estimulación a corto plazo, rápida y/o a largo
plazo de las células endoteliales.
Ciertos activadores tales como trombina,
leucotrienos quimioatrayentes, B_{4}, C_{4} y D_{4}
(LTB_{4}, LTC_{4} y LTD_{4}) y la histamina provocan una
activación rápida y transitoria (<30 minutos) de las células
endoteliales, independiente de la síntesis de proteínas, y pueden
aumentar los niveles en la superficie de las células endoteliales de
quimioatrayentes tales como el factor activador de plaquetas (PAF;
un glicerofosfolípido) y LTB_{4} (mostrado para histamina), y
moléculas de adhesión; ICAM-1 (mostrada para
trombina) y P-selectina (Zimmerman, et al.,
J. Cell Biol., 110:529-540, 1990; Sugama,
et al., J. Cell Biol. 119:935-944,
1992; McIntyre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 83:2204-2208, 1986, Lorant, et
al., J. Cell Biol., 115:223-234, 1991).
Las consecuencias de la rápida activación de las células
endoteliales aumenta la adhesión de los leucocitos al endotelio
(Hoover et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos,
81:2191-2194, 1984; Zimmerman, et al., J.
Cell Biol., 110:529-540, 1990; Hanahan, et
al. Ann. Rev. Biochem., 55:483-509,
1986). Sin embargo, no se ha demostrado que el aumento de los
niveles de LTB_{4} en la superficie aumente directamente la
migración transendotelial de neutrófilos (Hughes, et al.,
Prost. Leuk. Essent. F. A., 45:113-119, 1992)
y, en ciertas situaciones, no se necesita PAF para la adhesión de
leucocitos al endotelio activado (Kuijpers, et al., J.
Cell Biol., 117:565-574, 1992).
La activación de células endoteliales a largo
plazo (horas de duración) dependiente de la síntesis de proteínas se
produce por citoquinas, tales como IL-1b y
TNF-a, y por lipopolisacáridos (LPS) y tiene como
resultado el mantenimiento de mayores niveles de moléculas de
adhesión en la superficie: E-selectina,
P-selectina, ICAM-1 y
VCAM-1 (revisado por Carlos y Harlan, Blood,
84:2068-2101, 1994). La IL-1b y el
TNF-a también aumentan la síntesis de PAF por las
células endoteliales (Kuijpers, et al., J. Cell Biol.,
117:565-574, 1992). Además, se ha demostrado que la
activación de células endoteliales por IL-1b,
TNF-a, LPS e histamina aumenta la síntesis y
secreción de la quimioquina IL-8 (Strieter, et
al., Science, 243:1467-1469, 1989;
Jeannin, et al., Blood, 84:2229-2233,
1994).
Se ha demostrado que las quimioquinas
IL-8 y MCP-1 se producen por las
células endoteliales para que estén presentes en la superficie de
dichas células (Huber, et al., Science,
254:99-102, 1991, Springer, Nature,
346:425-434, 1990). Se ha demostrado que la
quimioquina MIP-1b está presente en el endotelio de
ganglios linfáticos in vivo (Taub, et al.,
Science, 260:355-359, 1993; Tanaka, et
al., Nature, 361:79-82, 1993). Las
quimioquinas RANTES, MIP-a, MIP-b,
MCP-1 e IL-8 son, todas ellas,
proteínas de unión a heparina que, después de secretarse, se unen a
la superficie celular y a proteoglicanos de la matriz extracelular
que poseen restos de heparina y de heparán sulfato (revisado por
Miller, et al., Crit. Rev. Immunol.,
12:17-46, 1992).
La heparina y el heparán sulfato son restos de
glicosaminoglicanos similares encontrados entremezclados en la
mismas cadenas de carbohidrato no ramificadas. Se unen
covalentemente a los esqueletos proteicos de proteoglicanos. A pesar
de lo que implican estos dos nombres, la heparina está más sulfatada
que el heparán sulfato. Los proteoglicanos están presentes en las
superficies celulares y en matrices extracelulares (por ejemplo, en
la membrana basal del endotelio). Debido a la dificultad para
distinguir las zonas de heparina y de heparán sulfato en la misma
cadena de carbohidrato, existen pocos datos sobre la preferencia de
unión de las quimioquinas a los restos de heparina o de heparán
sulfato. Hay alguna indicación de que las quimioquinas
IL-8 y GRO se unen con mayor afinidad al heparán
sulfato que a la heparina, y de que PFA y NAP-2 se
unen con mayor afinidad a restos de heparina (Witt, y Lander,
Curr. Biol., 4:394-400, 1994). En general,
las quimioquinas se denominan proteínas de unión a heparina. Se ha
demostrado que las regiones C-terminales de las
quimioquinas IL-8, PF4, MCP-1 y
NAP-2 forman una hélice-a, y que se
unen a heparina/heparán sulfato (Webb, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos, 90:7158-7162, 1993;
Zucker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos,
86:7571-7574, 1989; Matsushima, et al., en
Interleukins, Molec. Biol. Immunol., ed. Kistimoto, Karger,
Basilea, 236-265, 1992). Probablemente, ésta sea una
estructura común para todas las quimioquinas.
Todas las moléculas mencionadas anteriormente,
que se expresan por células endoteliales activadas (PAF, LTB_{4},
selectinas, CAM y quimioquinas) están presentes en la superficie de
las células endoteliales y se localizan en el endotelio vascular
adyacente a los sitios de tejido lesionado. Los leucocitos
transportados por la sangre que interaccionan con estas moléculas
también se localizarán en su unión en zona del tejido lesionado. El
resultado de la activación a largo plazo del endotelio es una mayor
adhesión y extravasación de leucocitos y una acumulación localizada
significativa de leucocitos en el tejido adyacente, que no puede
producirse durante la activación a corto plazo (Ebisawa, et
al., J. Immunol., 149:4021-4028, 1992;
Huber, y Weiss, J. Clin. Invest.,
83:1122-1129, 1989;
Oppenheimer-Marks, et al., J.
Immunol., 145:140-148, 1990).
Se cree que la adhesión de leucocitos al
endotelio es un proceso de dos etapas (revisado por Carlos, y
Harlan, Blood, 84:2068-2101, 1994).
Inicialmente, los leucocitos ruedan a lo largo de la superficie de
los vasos sanguíneos. El aumento del rodamiento inicialmente está
mediado en el endotelio vascular (en los primeros 30 minutos) por
interacciones entre estructuras Sialyl Lewisx sobre la superficie de
los leucocitos y P-selectina y
E-selectina, que están aumentadas en las células
endoteliales activadas (Ley, et al., Blood,
85:3727-3735, 1995). El aumento del rodamiento
también está mediado (después de 40 minutos) por interacciones entre
la L-selectina presente en las membranas celulares
de leucocitos y en moléculas parecidas a la heparina presentes en el
endotelio vascular, que son inducibles por citoquinas (Karin et
al., Science 261:480-483, 1993), o entre
la L-selectina presente en linfocitos y las
adresinas vasculares GlyCAM-1, CD34 y
MAdCAM-1 en vénulas de endotelio alto (HEV) de
tejido linfoide. La segunda etapa, la adhesión firme de los
leucocitos a las células endoteliales, se basa en interacciones
entre integrinas de leucocitos (por ejemplo LFA-1,
Mac-1, VLA-4) y moléculas de
adhesión de las células endoteliales (CAM, por ejemplo
ICAM-1, ICAM-2,
VCAM-1, MAdCAM-1). Los leucocitos se
aplanan sobre la superficie endotelial y retiran la
L-selectina, simultáneamente con la firme adhesión
(Kishimoto, et al., Science,
245:1238-1242, 1989; Jutila, et al., J.
Immunol., 143:3318-3324, 1989; Smith, et
al., Clin. Invest., 87:609-618,
1991).
Los niveles de selectina y CAM aumentan en la
superficie del endotelio en respuesta a muchas citoquinas y
quimioatrayentes. Estos aumentos dependen de la síntesis y/o
secreción de moléculas de selectina y CAM adicionales sobre la
superficie celular. Por el contrario, se ha demostrado que la
activación de los leucocitos para una adhesión firme tiene lugar en
segundos (Bargatze, et al., J. Exp. Med.,
178:367-373, 1993), por medio de un aumento de la
secreción de integrinas y, lo que es más importante, por medio de la
inducción de cambios conformacionales en las integrinas de la
superficie celular (activación de integrinas), que permite la unión
fuerte de las integrinas a CAM (revisado en Zimmerman, Immunol.
Today, 13:93-99, 1992).
El PAF y la E-selectina pueden
activar integrinas para la adhesión de células endoteliales (Lorant
et al., J. Biol. Chem. 115:223-234,
1991; Lo, J. Exp. Med., 173:1493-1500, 1991).
Se ha demostrado que para la unión de células T CD8+ a moléculas
VCAM-1 inmovilizadas se requiere la presencia de
MIP-1b, inmovilizado por unión a CD44 (que posee
restos heparina/heparán sulfato), o un conjugado de
heparina-BSA. Se demostró que esta unión estaba
bloqueada por un anticuerpo contra VLA-4, lo que
indica que MIP-1b activa VLA-4 sobre
la superficie de las células T (Tanaka, et al.,
Nature, 361:79-82, 1993). Se ha demostrado
que se produce un aumento en el nivel de la integrina CD18 (parte de
Mac-1) en la superficie de neutrófilos cuando los
neutrófilos entran en contacto con el endotelio que se ha estimulado
con IL-1b. Un anticuerpo contra IL-8
inhibía la regulación positiva de CD18 y también inhibía la adhesión
de los neutrófilos (Huber, Science,
254:99-102, 1991). Por lo tanto, las quimioquinas
pueden actuar como activadores directos de la adhesión de
leucocitos. Por el contrario, Luscinaskas et al. (J.
Immunol., 149:2163-2171, 1992) han demostrado
que el pretratamiento de neutrófilos con IL-8 inhibe
la unión de los neutrófilos, y que la adición de
IL-8 exógeno separaba los neutrófilos que se
adherían a las células endoteliales activadas. Rot (Immunol.
Today, 13:291-294, 1992) ha reconciliado estos
resultados contradictorios proponiendo que la IL-8
unida a la superficie de las células endoteliales promueve la
adhesión, mientras que la IL-8 soluble puede
inhibirla.
Las diferentes quimioquinas activan diferentes
leucocitos. La IL-8 activa neutrófilos, eosinófilos
y células T. RANTES activa monocitos, eosinófilos y células T.
MCP-1 activa monocitos. MIP-1a
activa células T CD4+, monocitos y células B, mientras que
MIP-1b activa monocitos y células T CD8+ (revisado
en Lasky, Current Biol., 3:366-378, 1993). Se
está considerando que las diferentes combinaciones de selectinas,
integrinas, CAM y quimioquinas seleccionan la adhesión y migración
de los subtipos de leucocitos observados en los diferentes tejidos
inflamados (Butcher, Cell, 67:1033-1039,
1991).
La importancia de las interacciones de
integrinas, CD11/CD18 (Mac-1) e ICAM en la adhesión
y extravasación de leucocitos se ha demostrado en numerosos sistemas
usando anticuerpos contra estas moléculas. Los anticuerpos
interfieren con la función de las moléculas de adhesión y bloquean o
reducen el reclutamiento de leucocitos. El síndrome de deficiencia
de adhesión leucocitaria (LAD) de tipo I produce una ausencia
parcial o total de la integrina CD18 en los leucocitos de los
pacientes afectados. El reclutamiento de neutrófilos en los sitios
de inflamación es insignificante. Sin embargo, el reclutamiento de
monocitos y eosinófilos es normal, lo que indica que un conjunto
alternativo de moléculas de adhesión pueden funcionar para reclutar
estas células, quizás VLA-4 y VCAM-1
(Harlan, Clin. Immunol. Immunopath.,
67:S16-S24, 1993). Los neutrófilos no expresan
VLA-4 (Winn y Harlan, J. Clin. Invest.,
92:1168-1174, 1993). Como se ha mencionado
anteriormente, las quimioquinas son importantes para la activación y
para el aumento de los niveles en superficie de integrinas
VLA-1 y CD18 en leucocitos. Se ha demostrado que la
IL-8 inmovilizada sobre un filtro de policarbonato
es adecuada para dirigir la migración de neutrófilos a través del
filtro (Rot, Immunol. Today, 13:291-294).
Huber, et al. (Science, 254:99-102,
1991) han demostrado que se necesita un gradiente transendotelial de
IL-8 unida, producido por monocapas de células
endoteliales estimuladas por IL-1b, para la
extravasación de neutrófilos. Estos neutrófilos se
pre-activaron con IL-8 y se unieron
a las células endoteliales, pero no migraron hasta que estuvo
presente el gradiente de IL-8. Este gradiente se
extendió desde la superficie luminal de las células endoteliales a
través de la membrana basal subyacente a la monocapa de células
endoteliales. El lavado de la IL-8 unida de la
membrana basal subyacente a las células endoteliales activadas
previno la migración a través de la monocapa. Además, un anticuerpo
contra la IL-8 inhibió el 70-80% de
la migración de los neutrófilos. Kuijpers et al. (J. Cell
Biol., 117:565-572, 1992) usaron un anticuerpo
anti-IL-8 para producir una
reducción del 60% en la migración de neutrófilos a través de
endotelio activado por IL-1b y
TNF-a, y la adición de un antagonista del receptor
de PAF produjo una reducción del 85-90% en la
migración. Estos resultados están en contraste con los experimentos
que demostraron que los neutrófilos pretratados con
IL-8 tenían inhibida su capacidad para migrar a
través de una monocapa de células endoteliales activadas
(Luscinaskas et al., J. Immunol.,
149:2163-1271, 1992). De esta manera, es probable
que las quimioquinas no sólo activen los leucocitos para la
adhesión, sino que en la extravasación de leucocitos es importante
un gradiente de quimioquinas unidas. La presencia de quimioquina
soluble puede interferir con la adhesión y la migración a lo largo
de un gradiente de quimioquinas unidas. Como se analiza a
continuación, los aumentos de concentración localizados in
vivo en quimioquinas solubles se minimizarían por el flujo
sanguíneo.
Una vez que los leucocitos activados han empezado
a acumularse en el interior de un tejido lesionado, pueden aumentar
la acumulación de más leucocitos por síntesis y secreción de
citoquinas, quimioquinas y LTB_{4}. Se ha demostrado que los LPS
aumentan directamente la expresión de IL-1b de
monocitos (Porat, et al., FASEB J.,
6:2482-2489, 1992). La IL-8, la
IL-1b y el TNF-a se producen por
neutrófilos activados con GM-CSF, otra citoquina
producida por macrófagos activados, endotelio y células T (McCain,
et al., Am. J. Respir. Cell Molec. Biol.,
8:28-34, 1993; Lindemann, et al., J.
Immunol. 140:837-839, 1988; Lindemann, et
al., J. Clin. Invest., 83:1308-1312,
1989). Se ha demostrado que la IL-1b y el
TNF-a estimulan los monocitos, aumentando de esta
manera la expresión de las quimioquinas, IL-8 y
MIP-1a (Lukacs, et al., Blood,
82:3668-3674, 1993). Se ha demostrado que los
neutrófilos activados y los monocitos son una fuente principal de
producción de LTB_{4} (Samuelsson, et al., Science,
237:1171-1176, 1987; Brach, et al., Eur.
J. Immunol, 22:2705-2711, 1992). Como se ha
analizado anteriormente, el LTB_{4} no está implicado directamente
en el reclutamiento adicional de leucocitos, pero como los
neutrófilos estimulados con LTB_{4} producen IL-8,
los neutrófilos estimulados con LTB_{4} pueden promover el
reclutamiento adicional de neutrófilos, indirectamente, por medio de
la formación de un gradiente de IL-8 (McCain, et
al., Am. J. Respir. Cell Molec Biol.,
10:651-657, 1994). El reclutamiento continuado de
leucocitos por estos activadores derivados de leucocitos requeriría
el uso del endotelio vascular como intermedio. Las células
endoteliales y las membranas basales se unirían y presentarían
quimioquinas derivadas de neutrófilos, formando un gradiente, o las
citoquinas derivadas de leucocitos activarían el endotelio, lo que
también originaría la creación de un gradiente de quimioquinas.
El flujo sanguíneo del sistema vascular
prevendría el aumento de concentración localizado de factores de
activación solubles (citoquinas, quimioquinas y quimioatrayentes),
producido por una respuesta inflamatoria localiza en el tejido. Si
una inflamación local está produciendo altas concentraciones en
sangre de activadores, podría tener lugar una activación sistémica
de leucocitos (Finn, et al., J. Thorac. J. Surg.,
105:234-241, 1993). Los leucocitos activados después
podrían unirse transitoriamente al endotelio inactivado y/o
desgranulado, produciendo sepsis (Sawyer, et al., Rev.
Infect. Dis., 11:S1532-1544, 1989). En las
situaciones en las que algunos de los leucocitos transportados por
la sangre se activan por una inflamación localizada (no todos los
leucocitos activados se extravasan), los leucocitos activados
producirían y secretarían citoquinas, quimioquinas y LTB_{4}
adicionales a la sangre. Este aumento de la concentración de
activador podría regular positivamente las células inactivadas y
amplificar la respuesta sistémica.
Aunque se ha proporcionado el mecanismo de las
respuestas inflamatorias con algún detalle, sigue existiendo la
necesidad de medios eficaces para reducir o prevenir las respuestas
inflamatorias localizadas que surgen de una lesión de
isquemia/reperfusión en el tejido de un paciente.
Esta invención se refiere al descubrimiento de
que pueden usarse enzimas que degradan heparinasa, por separado o en
combinación, para reducir la respuesta inflamatoria localizada. De
esta manera, la presente invención proporciona el uso de un enzima
heparinasa en la preparación de un medicamento para administración
intravascular para disminuir respuestas inflamatorias localizadas
debidas a una lesión por isquemia/reperfusión en el tejido de un
paciente.
Las heparinasas útiles en esta invención pueden
proceder de diversas fuentes: heparinasas I, II y III de la bacteria
Gram negativa Flavobacterium heparinum, heparinasa de cepas
de Bacteroides, heparinasa de Flavobacterium Hp206,
heparinasa de especies de Cytophagia, y heparinasas de
células de mamífero. Estos enzimas, en solitario o en combinación,
se denominan en este documento heparinasa o enzima heparinasa. La
heparinasa puede sobreexpresarse a partir de una secuencia de
nucleótidos recombinante en Flavobacterium heparinum o
Escherichia coli. La heparinasa puede ser heparinasa III. La
lesión por isquemia/reperfusión puede ser infarto de miocardio,
apoplejía, trasplante de órganos, choque o cirugía de bypass
cardiopulmonar.
Por medio de la administración de heparinasa se
degradan restos de heparina y heparán sulfato sobre la superficie de
células endoteliales y de las membranas basales. La eliminación de
restos de heparina y de heparán sulfato de proteoglicanos regulados
positivamente en células endoteliales activadas previene la
interacción de la L-selectina, encontrada en
leucocitos, con los proteoglicanos. Al reducirse las interacciones
L-selectina-proteoglicano puede
inhibirse el rodamiento de los leucocitos sobre el endotelio
activado.
Además, cuando se retiran restos de heparina y de
heparán sulfato de la superficie de células endoteliales activadas y
de su membrana basal, se liberan quimioquinas, que están unidas a la
heparina y al heparán sulfato, de las superficies celulares y de la
membrana basal. La pérdida de quimioquinas unidas disminuye la
concentración localizada de quimioquinas y altera el gradiente de
quimioquinas producido por el endotelio activado, inhibiendo de esta
manera la activación por quimioquinas de los leucocitos rodantes,
que es necesaria para una adhesión firme, e impidiendo la
extravasación de leucocitos a lo largo del gradiente de
quimioquinas. Mediante esta invención, la disminución del rodamiento
de los leucocitos, la activación y la extravasación pueden inhibir
las respuestas inflamatorias en tejidos localizadas interfiriendo
con los mecanismos fundamentales de reclutamiento de leucocitos.
El enzima heparinasa puede dirigirse a tipos
celulares, tejidos u órganos específicos por el método de
administración seleccionado, que suministra altas concentraciones
localizadas de los enzimas o limita físicamente la dispersión de los
enzimas. Adicionalmente, de acuerdo con esta invención, la
heparinasa puede dirigirse por fusión de los enzimas a dominios de
unión de anticuerpos; factores de crecimiento o moléculas de
adhesión. Las proteínas de fusión se producen por construcción y
expresión de fusiones génicas en organismos recombinantes. Como
ejemplos, los dominios de unión pueden reconocer moléculas de la
superficie celular en el endotelio activado (por ejemplo,
ICAM-1, VCAM-1,
P-selectina y E-selectina), o en
subtipos de células endoteliales (por ejemplo,
GlyCAM-1). Los enzimas de fusión dirigidos pueden
aumentar el número y especificidad de indicaciones, mientras se
reducen las cantidades de enzima necesarias en relación con la
eficacia y los posibles efectos secundarios resultantes de los
tratamientos.
La figura 1 es un gráfico del recuento de
35S-heparina/heparán sulfato liberado de la
superficie de células endoteliales por 1,0 IU/ml de heparinasa III,
que se separaron de acuerdo con el tamaño en una columna de
exclusión molecular. Los rombos indican el recuento liberado por una
digestión de 5 minutos, los cuadrados indican el recuento liberado
por una digestión de 30 minutos y los triángulos indican el recuento
liberado por una digestión de 60 minutos. De las fracciones
derivadas de la digestión de la heparinasa III se ha restado el
recuento de fondo de la fraccionación de las digestiones
simuladas.
Las figuras 2A y 2B son gráficos del porcentaje
de heparina/heparán sulfato presente en la línea de células
endoteliales humana no activada (2A) y activada por
IL-1b (2B) en los tiempos indicados después del
tratamiento con 0,1 IU/ml de heparinasa I, II o III durante 1 hora.
Se usó la unión de 125I-bFGF a la heparina de la
superficie celular para determinar la cantidad de heparina/heparán
sulfato presente. Los resultados para las células tratadas con
heparinasa I, II o III se indican por rombos, cuadrados o
triángulos, respectivamente. Las líneas verticales indican el error
típico de las medias.
Las figuras 3A y 3B son gráficos del porcentaje
de heparina/heparán sulfato presente en la línea de células
endoteliales humana no activada (3A) y activada por
IL-1b (3B) en los tiempos indicados después del
tratamiento con 1,0 IU/ml de heparinasa I. Se usó la unión de
125I-bFGF a la heparina de la superficie celular
para determinar la cantidad de heparina/heparán sulfato presente.
Los resultados para células tratadas durante 1, 3 o 5 horas se
indican mediante rombos, cuadrados o triángulos, respectivamente.
Las líneas verticales indican el error típico de las medias.
Las figuras 4A y 4B son gráficos del porcentaje
de heparina/heparán sulfato presente en la línea de células
endoteliales humana no activada (4A) y activada por
IL-1b (4B) en los tiempos indicados después del
tratamiento con 1,0 IU/ml de heparinasa III. Se usó la unión de
125I-bFGF a heparina de la superficie celular para
determinar la cantidad de heparina/heparán sulfato presente. Los
resultados para las células tratadas durante 1, 3 o 5 horas se
indican mediante rombos, cuadrados o triángulos, respectivamente.
Las líneas verticales indican el error típico de las medias.
La figura 5 contiene gráficos que representan los
niveles de IL-8 liberada de capas de células
endoteliales humanas activadas por IL-1b por
tratamiento con 1,0 IU/ml de heparinasas; I (5A), II (5B), I+III
(barras que contienen líneas diagonales; 5B), y III (5C). Las barras
representan el porcentaje de diferencia en la concentración de
IL-8 encontrada en los sobrenadantes de capas
endoteliales activadas tratadas con heparinasas, frente a los
sobrenadantes no tratados de capas endoteliales activadas (que sólo
contienen la IL-8 secretada). Los errores típicos
para estas diferencias de porcentajes se indican por líneas
verticales. Las líneas superpuestas en las barras indican la
concentración de IL-8 en los sobrenadantes de capas
de células tratadas con heparinasa. Los errores típicos de estas
medidas también se indican por líneas verticales (no siempre
visibles).
La figura 6 es un gráfico del nivel de adhesión
de neutrófilos a células endoteliales, que estaban inactivadas,
activadas por IL-1b, o tratadas con 0,1 IU/ml de
heparinasas I, II o III después de activación por
IL-1b. El nivel de adhesión se expresa como el
porcentaje de neutrófilos añadidos, que se están adhiriendo.
Las figuras 7A, 7B y 7C son gráficos del
porcentaje de inhibición de la extravasación de neutrófilos a través
de capas de células endoteliales activadas por
IL-1b, que se trataron con heparinasas I, II o III,
respectivamente. Las barras que contienen líneas diagonales
representan los resultados de tratamientos de una hora con 1,0 IU/ml
de heparinasa. Las barras blancas representan los resultados de
tratamientos de una hora con 0,1 IU/ml de heparinasa. Las barras
negras representan los resultados de tratamientos de 15 minutos con
0,1 IU/ml de heparinasa I o III, y la barra que contiene líneas
verticales representa los resultados de tratamientos de 15 minutos
con 1,0 IU/ml de heparinasa II. Las desviaciones típicas para los
porcentajes de inhibición se indican por líneas verticales. Los
pequeños asteriscos indican resultados de tratamientos de una hora
que fueron significativamente diferentes de los resultados de los
tratamientos de 15 minutos con la misma heparinasa (P<0,05). Los
asteriscos grandes indican los resultados de los tratamientos de una
hora con 1,0 IU/ml de heparinasa que fueron significativamente
diferentes de los resultados de los tratamientos de una hora con 0,1
IU/ml de la misma heparinasa. Los números entre paréntesis debajo de
las barras indican el número de experimentos incluidos en cada
conjunto de datos.
La figura 8 es un gráfico que muestra la
actividad de heparinasa humana (b-tromboglobulina)
sobre la ECM (matriz extracelular) a pH 5,8 y 7. Las barras sólidas
representan el porcentaje de diferencia de ^{35}SO_{4} liberado
a partir de ECM tratada con 1 \mug de heparinasa humana frente al
liberado de ECM sin tratar. Las barras que contienen líneas
diagonales representan la diferencia en porcentaje de
^{35}SO_{4} liberado a partir de ECM tratada con 5 \mug de
heparinasa humana frente al liberado de ECM sin tratar. La
desviación típica de las medias se indica mediante líneas
verticales.
La figura 9 es un gráfico que representa el
cambio en el nivel de extravasación de neutrófilos sobre la
activación de capas de HUVEC con IL-1b, y después
del tratamiento de capas de HUVEC activadas con heparinasa humana
(hhep). La desviación típica de las medias se indica por líneas
verticales.
La figura 10 es un gráfico de concentraciones de
heparinasa III en plasma de rata durante un periodo de infusión de
cinco horas. Los puntos de tiempo en el protocolo se indican por las
flechas, con descripciones encima de las flechas. Las líneas
verticales indican el error típico de las medias.
La figura 11 es un gráfico del nivel de
rodamiento de leucocitos en la microvasculatura de la rata después
de tres horas de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos
indican los niveles en ratas sin tratamiento previo, los cuadrados
indican los niveles en ratas con tratamiento simulado que
experimentaron isquemia y los triángulos indican los niveles en
ratas tratadas con heparinasa que experimentaron isquemia. Las
líneas verticales indican el error típico de las medias.
La figura 12 es un gráfico del nivel de adhesión
de leucocitos en la microvasculatura de la rata después de 3 horas
de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos indican los
niveles en ratas sin tratamiento previo, los cuadrados indican los
niveles en ratas con tratamiento simulado que experimentaron
isquemia, y los triángulos indican los niveles en ratas tratadas con
heparinasa que experimentaron isquemia. Las líneas verticales
indican el error típico de las medias.
La figura 13 es un gráfico del nivel de
extravasación de leucocitos en la microvasculatura de la rata
después de 3 horas de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos
indican los niveles en ratas tratadas con heparinasa que
experimentaron isquemia. Las líneas verticales indican el error
típico de las medias.
La figura 14 es un gráfico del nivel de
extravasación de leucocitos en la microvasculatura de la rata
después de 2 horas de isquemia, durante la reperfusión. Las barras
blancas son la diferencia en porcentaje en los niveles en ratas con
tratamiento simulado frente a los niveles en ratas sin tratamiento
previo. Las barras que contienen líneas diagonales son la diferencia
en porcentaje en los niveles en ratas tratadas con heparinasa frente
a los niveles en ratas sin tratamiento previo. Las líneas verticales
indican el error típico de las medias.
La figura 15 es un gráfico del nivel de perfusión
en vénulas postcapilares de ratas después de 3 horas de isquemia,
durante la reperfusión. Los círculos indican los niveles en ratas
sin tratamiento previo, los cuadrados indican los niveles en ratas
con tratamiento simulado que experimentaron isquemia y los
triángulos indican los niveles en ratas tratadas con heparinasa que
padecieron isquemia. Las líneas verticales indican el error típico
de las medias.
La figura 16 es un gráfico del producto de ritmo
cardíaco-presión sanguínea para conejos durante la
isquemia y reperfusión con o sin tratamiento con heparinasa. Los
círculos y cuadrados blancos son datos para ratas pretratadas con
solución salina y ratas tratadas por reperfusión, respectivamente.
Las pirámides blancas y los círculos negros son datos para conejos
pretratados con heparinasa y tratados por reperfusión,
respectivamente (niveles en plasma diana para heparinasa III 25
\mug/ml). Los cuadrados, pirámides y rombos negros son datos para
conejos tratados por reperfusión con heparinasa con niveles diana en
plasma de heparinasa III de 5, 1,25 y 0,25 \mug/ml,
respectivamente. BASE indica los niveles iniciales. 30I indica el
nivel a los 30 minutos de isquemia, 30R, 60R, 120R y 180R indica los
niveles a los 30, 60, 120 y 180 minutos de reperfusión. Las líneas
verticales indican la desviación típica de las medias.
La figura 17 es un gráfico del porcentaje del
tamaño de infarto frente a la zona de riesgo después de isquemia y
reperfusión en corazones de conejos, que se sometieron a diferentes
tratamientos con heparinasa. Los círculos negros indican los niveles
medios para cada grupo de tratamiento. Las formas blancas indican
los niveles para conejos individuales. CPT y CRT indican conejos
pretratados con solución salina y tratados por reperfusión,
respectivamente. DPT y DRT indican conejos pretratados con
heparinasa y tratados por reperfusión, respectivamente. Los números
debajo de DPT y DRT indican el nivel diana de heparinasa III en el
plasma (en \mug/ml). Las líneas verticales indican la desviación
típica de las medias.
La figura 18 es un gráfico de la concentración de
heparinasa III que se infundió a los conejos tratados con heparinasa
(en IU/ml). DPT y DRT indican conejos pretratados con heparinasa y
tratados por reperfusión, respectivamente. Los números debajo de DPT
y DRT indican el nivel diana de heparinasa III en el plasma (en
\mug/ml). Con indica conejos de control en los que se ha infundido
solución salina. Las líneas verticales indican la desviación típica
de las medias.
La figura 19 es un gráfico de las concentraciones
de heparinasa III medidas en el plasma de conejo durante el
pretratamiento y reperfusión. Los círculos indican las
concentraciones reales medidas en conejos pretratados con heparinasa
en los que se pretendían conseguir concentraciones diana en plasma
de 25 \mug/ml de heparinasa III. Los cuadrados, pirámides,
triángulos y rombos indican las concentraciones reales medidas en
conejos tratados por reperfusión con heparinasa en los que se
pretendían conseguir concentraciones diana en plasma de 25, 5, 1,25
y 0,25 \mug/ml de heparinasa III, respectivamente. BASE indica
concentraciones iniciales. 30P y 60P indican concentraciones a los
30 y 60 minutos de pretratamiento. 15R, 30R, 60R, 120R y 180R
indican concentraciones a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos de
reperfusión, respectivamente. Las líneas verticales indican la
desviación típica de las medias.
Las interacciones entre leucocitos y endotelio
son críticas para el progreso de respuestas inflamatorias
localizadas. Estas interacciones críticas incluyen contactos
funcionales entre quimioquinas unidas al endotelio y receptores de
quimioquinas de leucocitos, y entre la L-selectina
de leucocitos y proteoglicanos de heparina/heparán sulfato en el
endotelio. Esta invención se basa en el descubrimiento y se refiere
al uso del enzima heparinasa y la proteína de fusión de heparinasa
para disminuir las interacciones
leucocito-quimioquina y
leucocito-proteoglicano de células endoteliales y,
por lo tanto, inhibir la inflamación localizada.
La heparina y el heparán sulfato son restos de
glicosaminoglicano de proteoglicanos localizados en la superficie de
muchos tipos de células diferentes y también encontrados en las
matrices extracelulares producidas por muchas células. Las células
endoteliales producen matrices extracelulares, principalmente en su
lado abluminal, denominadas membrana basal. Las células endoteliales
activadas por ciertas citoquinas o por otros estimuladores de
respuesta inflamatoria, aumentan sus niveles en superficie de
proteoglicanos de heparina y heparán sulfato (excluyendo las vénulas
de alto endotelio), que actúan como moléculas de adhesión
inflamatoria, e interaccionan con L-selectina en los
leucocitos rodantes. Esta interacción aumenta los contactos de
leucocitos con el endotelio (aumento del rodamiento de leucocitos),
que son necesarios para etapas posteriores del reclutamiento de
leucocitos. El endotelio activado también aumenta su síntesis y
secreción de quimioquinas. La secreción de quimioquinas a su vez
aumenta la concentración localizada de las mismas quimioquinas,
porque las quimioquinas se unen a los restos de heparina y heparán
sulfato de proteoglicanos en las superficies de las células
endoteliales y en las membranas basales. Este gradiente de
concentración localizada es necesario para la activación de
leucocitos para la adhesión firme y la extravasación y tiene como
resultado el reclutamiento de leucocitos en sitios
inflamatorios.
Se han descubierto enzimas heparinasas en
microorganismos incluyendo Flavobacterium heparinum (Lohse y
Linhardt, J. Biol. Chem. 267:2437-24355,
1992), cepas de Bacteroides (Saylers, et al., Appl.
Environ. Microbiol, 33:319-322, 1977; Nakamura,
et al., J. Clin. Microbiol.
26:1070-1071, 1988), Flavobacterium Hp206
(Yoshida, et al., 10º Annual Symposium of Glycoconjugates,
Jerusalen 1989) y especies de Cytophagia (Bohn, et
al., Drug Res. 41(I), Nr.
4:456-460, 1991). También se han descrito
heparinasas procedentes de células de mamíferos (Fuks, et
al., Patente de Estados Unidos número 5.362.641, 1994; Hoogewerf
et al., J. Biol. Chem. 270:3268-3277,
1995). Las heparinasas de Flavobacterium heparinum,
heparinasa I (EC 4.2.2.7), y heparinasa II degradan la heparina,
mientras que la heparinasa II también degrada el heparán sulfato,
así como la heparinasa III (EC 4.2.2.8). Los productos de la
digestión completa por estos enzimas principalmente son disacáridos,
aunque pueden persistir pequeñas cantidades de tetrasacáridos y
oligosacáridos. Estos enzimas pueden usarse para retirar
glicosaminoglicanos, heparina y heparán sulfato de la superficie
celular y de la membrana basal.
La eliminación de heparina y heparán sulfato de
las células endoteliales interfiere con las interacciones de la
L-selectina con el endotelio, evitando el aumento
del rodamiento de los leucocitos. La eliminación de
glicosaminoglicanos de las células endoteliales y de las membranas
basales también retira las quimioquinas unidas a
glicosaminoglicanos, que son críticas para el reclutamiento de los
leucocitos. La pérdida de quimioquinas unidas a células endoteliales
disminuye la activación de integrinas de leucocitos e inhibe la
adhesión firme por los leucocitos. También inhibe la extravasación
de leucocitos, porque los leucocitos requieren la presencia de un
gradiente unido de quimioquina para la transmigración. Se cree, sin
que esta creencia suponga una limitación, que la concentración de
quimioatrayentes no unidos se reduce de la capa de endotelio por el
flujo sanguíneo, evitando la formación de un gradiente
quimioatrayentes solubles significativo.
Generalmente, después de una hora de tratamiento
con heparinasa, el 50% de la heparina y el heparán sulfato de la
superficie celular digerida y membrana basal digeridas se reemplaza
en 2 a 4 horas, y se reemplazan completamente en 12 a 16 horas. Los
tiempos de tratamiento mayores (3 y 5 horas) aumentan en gran medida
el tiempo necesario para reemplazar la misma cantidad de
heparina/heparán sulfato. Las respuestas inflamatorias se
disminuirían significativamente por una velocidad lenta de reemplazo
de la heparina/heparán sulfato de la superficie celular. La
administración apropiada de heparinasa podría aumentar la duración
de la respuesta inflamatoria disminuida.
Las heparinasas individuales o una combinación de
las mismas, que pueden usarse en esta invención, pueden prepararse a
partir de diversas fuentes. La heparinasa puede prepararse por
aislamiento a partir de células bacterianas o de mamífero, ya sean
células que producen el enzima de manera natural o que se han
modificado por ingeniería genética para producir el enzima como se
describe por métodos conocidos. Además, pueden aislarse heparinasas
de mamífero de células humanas de acuerdo con los procedimientos de
purificación descritos por Fuks, et al. (documento U.S.
5.362.641, 1994).
Los enzimas heparinasas pueden purificarse a
partir de cultivos de Flavobacterium heparinum de la
siguiente manera. Se cultiva F. heparinum en fermentadores de
15 l controlados por ordenador, en una variación de medio nutriente
definido descrito por Galliher et al., Appl. Environ.
Microbiol 41(2): 360-365, 1981. Para las
fermentaciones diseñadas para producir heparin liasas, se incluye
heparina semi-purificada (Celsus Laboratories) en el
medio a una concentración de 1,0 g/l como inductor de la síntesis de
heparinasa. Las células se recogen por centrifugación y los enzimas
deseados se liberan del espacio periplásmico por una variación del
procedimiento de choque osmótico descrito por la Patente de Estados
Unidos Nº 5.169.772 de Zimmermann, et al. (1992).
Las proteínas del osmolato bruto se adsorben en
una resina de intercambio catiónico (CBX, J.T. Baker) a una
conductividad entre uno y siete mhos. Las proteínas no unidas del
extracto se desechan y la resina se introduce en una columna
cromatográfica (50 cm de diámetro interno x 100 cm). Las proteínas
unidas eluyen a un caudal lineal de 3,75
cm\cdotmin-1 con gradientes de etapas de fosfato
0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,1 M, fosfato 0,01 M/cloruro
sódico 0,25 M y fosfato 0,01 M/cloruro sódico 1,0 M, todos a pH 7,0
\pm 0,1. La heparinasa II eluye en la fracción de NaCl 0,1 M,
mientras que las heparinasas I y III eluyen en la fracción de 0,25
M. Como alternativa, la etapa de cloruro sódico 0,1 M se elimina y
las tres heparinasas co-eluyen con el cloruro sódico
0,25 M. Las fracciones de heparinasa se cargan directamente en una
columna que contiene cellufine sulfato (5,0 cm de diámetro interno x
30 cm, Amicon) y se eluyen con un caudal lineal de 2,50
cm\cdotmin-1 con gradientes por etapas de fosfato
0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,2 M, fosfato 0,01 M/cloruro
sódico 0,4 M y fosfato 0,01 M/cloruro sódico 1,0 M, todos a pH 7,0
\pm 0,1. Las heparinasas II y III eluyen en la fracción de cloruro
sódico 0,2 M, mientras que la heparinasa I eluye en la fracción 0,4
M. La fracción de cloruro sódico 0,2 M de la columna de cellufine
sulfato se diluye con fosfato sódico 0,01 M para dar una
conductancia menor que 5 mhos. La solución se purifica
adicionalmente cargando el material en una columna de
hidroxilapatita (2,6 cm de diámetro interno x 20 cm) y eluyendo la
proteína unida a un caudal lineal de 1,0
cm\cdotmin-1 con gradientes por etapas de fosfato
0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,35 M, fosfato 0,01 M/cloruro
sódico 0,45 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,65 M y fosfato 0,01
M/cloruro sódico 1,0 M, todos a pH 7,0 \pm 0,1. La heparinasa II
eluye como un solo pico de proteína en la fracción de cloruro sódico
0,45 M, mientras que la heparinasa III eluye en un solo pico de
proteína en la fracción de cloruro sódico 0,65 M. La heparinasa I se
purifica adicionalmente cargando el material de la columna de
cellufine sulfato, diluido a una conductividad menor que 5 mhos, en
una columna de hidroxilapatita (2,6 cm de diámetro interno x 20 cm)
y eluyendo la proteína unida a un caudal lineal de 1,0
cm\cdotmin-1 con un gradiente lineal de fosfato
(de 0,01 a 0,25 M) y cloruro sódico (de 0,0 a 0,5 M). La heparinasa
I eluye en un sólo pico de proteína aproximadamente a la mitad del
gradiente.
Los enzimas heparinasas obtenidos por este método
tienen una pureza mayor del 98,5% según se estima por análisis de
HPLC de fase inversa (BioCad, POROS II). Los resultados de
purificación para los enzimas heparinasas se muestran en la tabla
A.
| muestra | actividad (IU) | actividad específica (IU/mg) | rendimiento (%) |
| Fermentación | |||
| Degradación de heparina | 94.500 | 100 | |
| Degradación de heparán sulfato | |||
| 75.400 | ND | 100 | |
| Osmolato | |||
| Degradación de heparina | 52.100 | 55 | |
| Degradación de heparán sulfato | |||
| 42.000 | ND | 56 | |
| Intercambio catiónico | |||
| Degradación de heparina | 22.600 | 24 | |
| Degradación de heparán sulfato | 27.540 | ND | 37 |
| Cellufine sulfato | |||
| Degradación de heparina | 19.200 | 20 | |
| Degradación de heparán sulfato | |||
| 9.328 | 30,8 | 12 | |
| Hidroxilapatita | |||
| Heparinasa 1 | 16.300 | 115,3 | 17 |
| Heparinasa 2 | 2.049 | 28,4 | 3 |
| Heparinasa 3 | 5.150 | 44,5 | 7 |
También pueden aislarse enzimas de degradación de
glicosaminoglicanos a partir de sistemas de expresión recombinantes
tales como el sistema de expresión de heparinasa I descrito por
Sasisekharan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 90:8660-8664, 1993; y los sistemas de
expresión de heparinasa II y III descritos en el documento WO
95/34635. En estos sistemas de expresión, los genes de F.
heparinum se aislan y clonan en plásmidos cadena abajo de un
promotor inducible. Los plásmidos se introducen en E. coli y
la expresión del enzima deseado se dirige por un método de inducción
adecuado tal como un cambio de temperatura o la adición de IPTG al
medio.
Los enzimas pueden recuperarse en una forma
purificada por una modificación de los métodos descritos en este
documento. La ruptura celular se consigue mediante homogeneización,
sonicación o tratamiento enzimático para romper la pared celular y
liberar los componentes citoplásmicos. Si la síntesis enzimática da
como resultado una agregación, el agregado después puede disolverse
por un agente de desnaturalización, guanidina HCl de 3 a 6 M o urea
de 4 a 8 M, y la proteína puede replegarse retirando el agente
desnaturalizante por diálisis o dilución. El enzima replegado puede
purificarse adicionalmente usando los métodos de cromatografía
líquida descritos anteriormente.
Pueden crearse proteínas de fusión que incorporan
el enzima heparinasa fusionado a proteínas con propiedades de unión
específicas por medio de técnicas de biología molecular
recombinante. Eligiendo una proteína de unión apropiada, la
actividad heparinasa puede dirigirse a sitios específicos, in
vivo. Se ha demostrado que ICAM-1 se expresa
preferentemente en la superficie de células endoteliales activadas
(Dustin, et al., J. Immunol., 137:245-254,
1986). Como ejemplos de proteínas de fusión, un anticuerpo,
fragmento Fab o región variable, específico para
ICAM-1, VCAM-1 o
P-selectina, cuando se fusiona con el enzima
heparinasa o una parte activa del mismo, localiza la actividad
heparinasa cerca de las superficies luminal y abluminal del
endotelio activado. En esta área se retiran restos de heparina y
heparán sulfato provocando la ruptura del gradiente de quimioquinas
producido por el endotelio. Como otros ejemplos, la fusión de enzima
heparinasa, o una parte activa del mismo, al dominio I de
LFA-1 o Mac-1 (ambos se unen a
ICAM-1) dirige el endotelio activado para la
eliminación de heparina y heparán sulfato, inhibiendo el rodamiento
de leucocito y la formación del gradiente de quimioquinas. Ciertos
receptores para citoquinas tales como IL-1b, están
regulados positivamente en el endotelio activado y proporcionan otra
diana para la unión de proteínas de fusión. También puede
conseguirse por fusión de IL-1b, o el dominio de
unión al receptor de IL-1b a la heparinasa de
dirección. Las proteínas de fusión pueden reducir las respuestas
inflamatorias a menores concentraciones en sangre de la necesaria
para conseguir reducciones comparables usando heparina no fusionada.
Además, otras células del sistema vascular se verán menos afectadas
por esta actividad enzimática de la proteína de fusión, reduciendo
los posibles efectos secundarios de los tratamientos.
Las proteínas de fusión de heparinasa creadas por
ingeniería genética retienen la unión y las propiedades catalíticas
de la heparinasa y de la proteína a la que se fusionan. Se han
purificado tres heparinasas hasta la homogeneidad a partir de
Flavobacterium heparinum, y se han producido de una forma
recombinante en Escherichia coli. Pueden producirse proteínas
de fusión que constan de enzima heparinasa combinado con dominios de
unión de anticuerpos o moléculas de adhesión con una fusión genética
en un hospedador recombinante, reteniendo al mismo tiempo las
funcionalidades de unión y la actividad enzimática de las distintas
proteínas. Estas moléculas también pueden purificarse hasta la
homogeneidad por procedimientos usados normalmente para la
purificación de las partes individuales de la proteína de fusión
(por ejemplo, cromatografía de afinidad, y protocolos de
purificación de heparinasa). A diferencia de la heparinasa natural
purificada a partir de Flavobacterium heparinum, el enzima
recombinante puede no contener restos de carbohidrato o de
piroglutamato amino-terminales. Todas las
heparinasas recombinantes pueden contener deleciones, aminoácidos
adicionales y/o alterados, que modifican la actividad enzimática del
enzima natural o el funcionamiento de los dominios de unión. La
heparinasa y la heparinasa de fusión pueden estabilizarse para uso
in vivo, complejándolas con polietilenglicol, agentes de
entrecruzamiento y por microencapsulación.
Por ejemplo, el gen para la heparinasa I se aisló
a partir de F. heparinum como se describe en Sasisekharan
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
90:3660-3664, 1993, y se insertó un sitio de
restricción EcoR I en posición 5' con respecto al codón que
codifica el resto glutamina-21 por reacción en
cadena de la polimerasa. Se preparó un fragmento que contenía el gen
de heparinasa I por digestión con endonucleasas de restricción
EcoR I y BamH1, y se unió al plásmido pMALc2
(Biolaboratorios New England) escindido con EcoR
I/BamH I. El plásmido resultante contenía un gen híbrido que
codificaba una proteína de 82.000 - 85.000 Dalton que incorporaba la
proteína de unión a maltosa (MalB) fusionada en posición 5' con
respecto al gen de heparinasa I. Este plásmido se insertó en células
de Escherichia coli HB101 usando el método mediado por
cloruro cálcico descrito por Cohen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 69:2110-211. Estas células
presentaron actividad heparinasa bajo el control del promotor tac,
permitiendo la síntesis de la proteína de fusión por la adición de
una concentración 0,1 mM del agente inductor IPTG al medio de
cultivo.
Las células HB101
(pMALc2-HEP1Q21) se cultivaron hasta una densidad
celular de 1,0 g/l de peso seco de células en 500 ml de medio M9 que
contenía IPTG 0,1 mM a 37ºC, y se concentraron por centrifugación a
10.000 g durante 10 minutos. El sedimento celular se suspendió en 10
ml de Tris 0,025 M a pH, 7,7 y las células se rompieron por
sonicación usando un Heat Systems modelo XL2020, durante 4,5
minutos, a un nivel de potencia de 3, en ciclos de 30 segundos de
activación y 30 segundos de desactivación. Los desechos celulares se
retiraron por centrifugación, a 10.000 g durante 10 minutos, y el
sobrenadante se aplicó a una columna de resina de afinidad de
amilosa (1,0 diámetro interno x 2 cm, New England Biolabs). La
proteína unida se eluyó con un gradiente por etapas de Tris 0,025 M
que contenía maltosa 0,01 M a pH 7,5. La proteína de fusión se eluyó
en un pico de proteína que mostró una actividad específica de
heparinasa de 23,77 IU/mg.
La proteína de fusión de unión
heparinasa-maltosa también puede purificarse por
técnicas de separación de proteínas convencionales basadas en las
propiedades de la heparinasa. Se fraccionaron sonicados celulares
por precipitación con sulfato amónico. Las proteínas no específicas
se retiraron con una etapa de precipitación en sulfato amónico 1,7 M
y el sobrenadante precipitó elevando la concentración de sulfato
amónico a 3,2 M. El material precipitado contenía la proteína de
fusión y se resuspendió en fosfato sódico 0,025 M, pH 6,5. El
material se aplicó a una columna de intercambio catiónico débil (1,6
diámetro interno x 10 cm, CBX, J.T. Baker) y se eluyó con gradientes
por etapas secuenciales de cloruro sódico 0,0 M, cloruro sódico 0,01
M, cloruro sódico 0,25 M y cloruro sódico 1,0 M, todos en fosfato
sódico 0,025 M. La proteína de fusión eluía en la fracción de
elución de cloruro sódico 0,25 M y mostraba una actividad específica
de heparinasa de 29,95 IU/ml. Estos dos procedimientos de
purificación demuestran que pueden obtenerse proteínas de fusión de
heparinasa funcionales uniendo genéticamente una proteína con
propiedades de unión deseadas al extremo N-terminal
de heparinasa, reteniendo la proteína de fusión resultante tanto la
funcionalidad de la heparinasa como la funcionalidad de la proteína
con la que se fusiona.
Como otro ejemplo de una proteína de fusión, un
fragmento de restricción BamH I/Sal I de pGBH3, que
contiene el gen de heparinasa III de Flavobacterium
heparinum, se insertó en pMALc2 para formar un gen para la
fusión de una proteína de unión a maltosa con la heparinasa III. Se
produjeron extractos de la cepa de E. coli DH5a que contenían
el plásmido del gen de fusión como se ha descrito en el último
ejemplo, y estos extractos contenían 18,7 IU/ml/O.D. de actividad
heparinasa III. El extracto también se combinó con resina de
afinidad de amilosa y la resina después se separó del extracto por
centrifugación. La resina se lavó una vez con solución de Tris 0,025
M (pH 7,5) y las proteínas unidas a la resina se resuspendieron en
tampón de muestra SDS-PAGE y se separaron de acuerdo
con su tamaño en un gel de SDS-poliacrilamida al
7,5%. El análisis de transferencia de Western del gel con anticuerpo
específico anti-heparinasa III identificó una
proteína de 116.000 Da, que corresponde al tamaño esperado de la
proteína de fusión. Este análisis indica que la proteína de fusión
tiene un dominio de unión a maltosa funcional. Este ejemplo
demuestra que la proteína heparinasa III también puede fusionarse a
un dominio de unión para producir un enzima de fusión
bifuncional.
Los métodos para aumentar la vida media in
vivo son conocidos y se usan rutinariamente, especialmente en el
caso de los enzimas. Un ejemplo de un método adecuado es la unión de
restos de polietilenglicol a la proteína, que inhibe la captación
por el sistema reticuloendotelial. La preparación y caracterización
de tales proteínas no inmunogénicas se describe en Lu, et al.
(Pept. Res. 6(3), 140-146, 1993),
Delgado, et al. (Critical Rev. Ther. Drug Carrier
Syst. 9(3-4), 249-304,
1992) y Davis et al. (Patente de Estados Unidos Número
4.179.337, 1979), cuyas enseñanzas se incorporan en este documento.
Otro ejemplo de un método adecuado es el uso de agentes de
entrecruzamiento bifuncionales para estabilizar el enzima contra la
degradación proteolítica. El glutaraldehído es un tipo de agente de
entrecruzamiento bifuncional. El documento PCT WO95/00171 de Novo
Nordisk A/S contiene un listado de otros agentes de entrecruzamiento
bifuncionales útiles, y enseña el uso de los mismos, que se
incorpora en este documento.
El enzima heparinasa se administra localmente. La
administración local proporciona un mejor control. La heparinasa se
mezcla con un vehículo farmacéutico o veterinario apropiado, y
después se administra en una cantidad eficaz para producir el efecto
deseado en las células tratadas usando métodos conocidos por los
especialistas en la técnica, por ejemplo, para aplicación local, el
uso de perfusión, inyección o un catéter.
Pueden conseguirse dosificaciones de dirección y
de concentración eficaz mediante la preparación de enzimas dirigidos
como se ha descrito anteriormente, o mediante el uso de vehículos de
dirección, tales como un catéter o inyección localizada, para
conseguir una liberación controlada del enzima con especificidad de
sitio.
El enzima heparinasa puede formularse en un
vehículo para administración por inyección, por ejemplo, en solución
salina o un tampón acuoso, usando la metodología convencional, o
puede encapsularse en una matriz polimérica. La encapsulación de
heparinasa en formulaciones de liberación controlada es bien
conocida; los materiales incluyen, pero sin limitación, liposomas,
lipoesferas, matrices poliméricas biodegradables y vesículas. Estos
encapsulantes típicamente son micropartículas que tienen un diámetro
de 60 nm a 100 micrómetros, pero preferiblemente menor que diez
micrómetros, y más preferiblemente un diámetro de un micrómetro o
menos.
Los proteosomas se preparan a partir de proteínas
de la membrana externa de bacterias meningocócicas y Lowell, et
al., Science, 240:800 (1988) ha informado que se unen a
proteínas que contienen anclajes hidrófobos. Las proteínas de los
proteosomas son muy hidrófobas, reflejando su papel como proteínas
transmembrana y porinas. Cuando se aislan, sus interacciones
proteína-proteína hidrófobas hacen que formen
vesículas multimoleculares naturales membranosas de 60 a 1000 nm o
fragmentos de vesículas de membrana, dependiendo de la concentración
del detergente usado en su aislamiento. La heparinasa también puede
encapsularse dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller
et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744
(1992) y como se ha descrito anteriormente en relación con los
proteosomas. Como alternativa, la heparinasa se puede encapsular en
vesículas lipídicas tales como vesículas de lípidos NovasomeTM
(Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH). Se describe otro
vehículo en el documento WO 91/07760 de Nova Pharmaceuticals, cuyas
enseñanzas se incorporan en este documento, que hace referencia a
una lipoesfera que tienen un núcleo sólido y una capa de envuelta
externa formada por fosfolípidos.
El vehículo también puede ser un sistema de
liberación retardada polimérico. Los polímeros sintéticos
biodegradables son particularmente útiles para realizar la
liberación controlada de la heparinasa. La microencapsulación se ha
aplicado a la inyección de productos farmacéuticos microencapsulados
para proporcionar una liberación controlada. Numerosos factores
contribuyen a la selección de un polímero particular para la
microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis del polímero
y el proceso de microencapsulación, el coste de los materiales y del
proceso de microencapsulación, el perfil toxicológico, las
necesidades de una cinética de liberación variable y la
compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos son, todos
ellos, factores que deben considerarse. Son ejemplos de polímeros
útiles policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres y
políamidas, particularmente las que son biodegradables.
Una elección frecuente de un vehículo para
productos farmacéuticos es
poli(d,l-lactida-co-glicolida)
(PLGA). Es un poliéster biodegradable que tiene una larga historia
de uso médico en suturas erosionables, placas de huesos y otras
prótesis temporales, en las que no ha presentado ninguna toxicidad.
Se ha formulado una amplia diversidad de productos farmacéuticos
incluyendo péptidos y antígenos en microcápsulas de PLGA. El proceso
de microencapsulación con PLGA usa una separación de fases de una
emulsión de agua en aceite. La heparinasa se prepara como una
solución acuosa y la PLGA se disuelve en disolventes orgánicos
adecuados tales como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas
dos soluciones inmiscibles se co-emulsionan mediante
agitación a alta velocidad. Después se añade un no disolvente para
el polímero, causando la precipitación del polímero alrededor de las
gotas acuosas para formar microcápsulas embrionarias. Las
microcápsulas se recogen y se estabilizan con uno de una colección
de agentes (alcohol polivinílico (PVA), gelatina, alginatos,
polivinilpirrolidona (PVP), metil celulosa) y el disolvente se
retira por secado al vacío o extracción con disolvente. Otros medios
para la encapsulación incluyen secado por pulverización,
co-precipitación y extracción con disolvente.
El enzima heparinasa puede administrarse por
inyección, infusión o perfusión. Típicamente, la inyección se
realiza usando una jeringa un catéter. Puede usarse una jeringa o un
catéter para aplicar la heparinasa de manera local a zonas de vasos
sanguíneos, tejidos u órganos. Los pacientes a los que se les han
diagnosticado inflamaciones localizadas pueden tratarse por medio de
la introducción de heparinasa en su sistema vascular de esta manera.
La heparinasa también puede administrarse antes o simultáneamente
con una cirugía, para reducir las respuestas inflamatorias
resultantes. Además, antes de una cirugía de trasplante, el donante
de órganos puede someterse a perfusión con una preparación de
heparinasa para reducir la inflamación tras la reperfusión después
del trasplante.
La heparinasa altera la superficie celular y la
membrana basal escindiendo los restos de heparina y de heparán
sulfato de la superficie celular y de los proteoglicanos de la
matriz extracelular. La retirada de estos glicosaminoglicanos
reducirá las interacciones leucocito-endotelio
(rodamiento de leucocitos) disminuyendo la unión de la
L-selectina presente en los leucocitos a los
proteoglicanos del endotelio. Además, la retirada de heparina y de
heparán sulfato disminuirá la unión de quimioquinas al endotelio, lo
cual reducirá la activación, la adherencia y la extravasación de
leucocitos. La producción de células endoteliales de córnea bovina
con proteoglicanos de heparina/heparán sulfato y la posterior
digestión de estos proteoglicanos radiomarcados con heparinasa III
de Flavobacterium proporciona una evaluación cualitativa del
efecto del enzima sobre la superficie celular. La digestión de los
proteoglicanos de la superficie celular con heparinasa III liberará
tanto los restos heparina como los de heparán sulfato, porque estos
restos están intercalados en las mismas cadenas de carbohidrato no
ramificadas. Por el tratamiento con heparinasa III se solubilizaron
cantidades significativas de
^{35}S-heparina/heparán sulfato.
Se produjeron capas de células endoteliales que
contenían ^{35}S-sulfato sembrando placas de 24
pocillos con células endoteliales de córnea bovina primarias. Estas
células se dejaron crecer hasta 1 día antes de la confluencia en
DMEM con un 10% de suero de ternero fetal y un 5% de suero de
ternero. Un día antes de la confluencia, las células se diluyeron 10
veces en medio de Fisher suplementado con un 10% de suero de ternera
fetal, un 5% de suero de ternera, un 4% de dextrano y 25 mCi/ml de
Na_{2}35SO_{4}, y se cultivaron durante 3 días con la adición de
0,5 ng/ml por día de bFGF. La incorporación de un marcador por
células cercanas a la confluencia localiza el marcador en y sobre
las células y minimiza el marcador de ^{35}S incorporado en la
membrana basal.
Las capas de células endoteliales que contenían
^{35}S-sulfato se trataron con 600 \mul de
solución salina tamponada con fosfato o heparinasa III, en solución
salina tamponada con fosfato, a una concentración de 1,0 IU/ml, en
pocillos por duplicado. Las digestiones se dejaron transcurrir
durante 5, 30 o 60 minutos a 37ºC. Después del tiempo de digestión
indicado, se retiraron 400 \mul de solución de digestión de cada
pocillo y se fraccionaron en una columna de exclusión molecular
Bio-sil SEC 125-5 controlada por un
sistema Beckman Gold HPLC, equipado con un tomador de muestras
automático. El caudal fue de 1 ml/minuto y se recogieron fracciones
de 1 ml. La cantidad de 35S-sulfato presente en cada
fracción se determinó midiendo una alícuota de cada fracción en un
contador de centelleo de líquidos Packard 1600 TR. Las soluciones de
control marcadas no tratadas se fraccionaron y se midieron de la
misma manera, y la cantidad de material radiactivo en cada fracción
(fondo) se restó de la cantidad presente en las fracciones de las
muestras digeridas con heparinasa. La cantidad de heparina/heparán
sulfato marcado con ^{35}S en la superficie celular en cada
fracción liberada por tratamiento con heparinasa III se muestra en
la figura 1.
El factor de crecimiento factor de crecimiento de
fibroblastos básico (bFGF) es una proteína de unión a heparina bien
caracterizada que, como se sabe, se une a los restos de heparina de
proteoglicanos presentes en la superficie celular y en la matriz
extracelular (Maccarana, et al., J. Biol. Chem.,
268:23898-23905, 1993). La unión de bFGF marcado con
^{125}I a los proteoglicanos de la superficie celular y de la
membrana basal se usó para conocer la cantidad de heparina/heparán
sulfato retirada de capas de células endoteliales no activadas y
activadas por IL-1b y sus membranas basales por las
heparinasas I, II o III. La digestión de la superficie celular y la
membrana basal con heparinasa retirará tanto los restos de heparina
como los de heparán sulfato, porque estos restos están intercalados
en las mismas cadenas de carbohidrato no ramificadas. La unión de
bFGF marcado con ^{125}I también se usó en este experimento para
determinar la velocidad a la que los restos de heparina/heparán
sulfato se reemplazaron en la superficie celular y en la membrana
basal de endotelio tratado con heparinasas I, II o III.
La mayor parte de la heparina/heparán sulfato
puede retirarse usando heparinasa (del 70 al 90%; figuras 2, 3 y 4).
Esto demuestra que en el endotelio pueden desaparecer casi
completamente los restos de heparina/heparán sulfato usando
heparinasa. Con un tratamiento con heparinasa de 1 hora, la
velocidad de reemplazo de la heparina/heparán sulfato generalmente
tiene una naturaleza bifásica. El reemplazo del 40 al 50% de la
heparina/heparán sulfato digerido se produce en unas pocas horas. El
reemplazo adicional de la heparina/heparán sulfato agotado se
produce a una velocidad más lenta durante el resto del experimento,
produciéndose el reemplazo completo a las 12 a 16 horas. Los
tratamientos de 3 y 5 horas con heparinasas redujeron las
velocidades de reemplazo de heparina/heparán sulfato en la
superficie celular (figuras 3 y 4). Esto fue lo más evidente para el
endotelio no activado. En cuanto a los resultados experimentales
representados en las figuras 3 y 4 para el endotelio activado por
IL-1, los tres tiempos de tratamiento (1, 3 y 5
horas) dieron menores velocidades de reemplazo que las observadas en
los resultados experimentales representados en la figura 2.
Estos datos indican que el tratamiento con
heparinasa tiene como resultado una inhibición significativa de la
unión de L-selectina y la formación de un gradiente
de quimioquinas inmovilizado, y esto tendría como resultado una
inhibición significativa de las respuestas inflamatorias
localizadas. Además, un periodo de tratamiento de 3 a 5 horas puede
prolongar en gran medida el periodo de respuesta inflamatoria
reducida disminuyendo la velocidad de reemplazo de heparina/heparán
sulfato.
Se cultivó una línea de células endoteliales
humanas hasta la confluencia en placas de 48 pocillos en 0,25
ml/pocillo de medio RPMI, que contenía un 1% de
penicilina/estreptomicina y un 20% de suero fetal. Las células en la
mitad de los pocillos se activaron durante 4 horas con 10 \mul de
50 ng/ml de IL-1b. Después de la activación, todos
los pocillos se lavaron tres veces con HBSS y se trataron con medio
de incubación (medio RPMI, Tris HCl 25 mM pH 8, HEPES 25 mM pH 7,4 y
BSA al 0,1%) o 0,1 IU/ml de heparinasa I, II o III diluida en medio
de incubación a 37ºC, en CO_{2} al 5%, durante 60 minutos para los
resultados experimentales representados en la figura 2 o, para los
resultados representados en las figuras 3 y 4, 1,0 IU/ml de
heparinasa I o III diluida en medio de incubación a 37ºC en CO_{2}
al 5% durante 60 minutos con ninguna, 3 o 5 reemplazos de los
enzimas cada hora. Después de los tratamientos enzimáticos, los
pocillos se lavaron 3 veces con HBSS y se incubaron con medio RPMI
que contenía un 1% de penicilina/estreptomicina y un 20% de suero
fetal \pm IL-1b, a 37ºC en CO_{2} al 5%, durante
los tiempos indicados en la figura 2. Los pocillos se lavaron de
nuevo tres veces con HBSS y se añadieron 0,1 ml de medio de
incubación a cada pocillo, y las placas se enfriaron en hielo
durante 5 minutos. A todos los pocillos se les añadieron 20 \mul
de 125 ng/ml de ^{125}I-bFGF, y 20 \mul de bFGF
sin marcar a una concentración de 20 \mug/ml. A algunos de los
pocillos de control también se les añadieron 15 \mul de heparina a
una concentración de 10 mg/ml, para determinar la unión no
específica de fondo. Las placas se incubaron en hielo durante 40
minutos y se lavaron 2 veces con HBSS frío. Se añadieron 0,25 ml de
LAB (HEPES 25 mM pH 7,4 y NaCl 2 M) a cada pocillo para solubilizar
el bFGF y después se recogió en tubos. Esta etapa se repitió y los
contenidos de los tubos se contaron en un contador gamma. La
cantidad de unión de fondo no específica se restó de cada muestra de
control no tratada y tratada. Los recuentos de muestras se
dividieron por los recuentos de control para terminar el porcentaje
de unión que se produjo. Los resultados \pm los errores típicos
(SE) se muestran en las figuras 2, 3 y 4.
La eliminación del gradiente de quimioquinas
unidas formado por el endotelio activado adyacente al tejido
inflamado inhibirá la acumulación de neutrófilos dentro de este
tejido, y disminuirá la respuesta inflamatoria. La quimioquina
IL-8 se produce por el endotelio activado por
IL-1b y otras citoquinas y quimioatrayentes, que se
secretan por tejidos inflamados. Si la IL-8 unida al
endotelio puede solubilizarse por tratamiento con heparinasa, se
retiraría de la zona de inflamación por el flujo sanguíneo y se
inhibiría la respuesta inflamatoria localizada. La eliminación y
solubilización in vitro de 0,5 a 3 veces más
IL-8 inmovilizada endógena (frente a la
IL-8 secretada) del endotelio activado por las
heparinasas I, II o III o por las heparinasas I y III demuestra que
el gradiente de quimioquina unida puede destruirse por tratamiento
con heparinasa.
Se usó un ml de una solución de 3 mg/ml de
colágeno humano para recubrir los pocillos de una placa de 12
pocillos. Toda la solución de colágeno restante se retiró por
aspiración. Se tripsinizaron células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC; usadas en los pasos 1 a 8) de una placa confluente de
10 ml y se diluyeron 1 a 7 en medio RPMI que contenía un 20% de
suero fetal, un 1% de penicilina/estreptomicina, 100 \mug/ml de
heparina, 10 \mug/ml de factor de crecimiento epidérmico y 200
\mug/ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales. Se
añadió 1 ml de células diluidas a cada pocillo de las placas de 12
pocillos recubiertas con colágeno. Las células se dejaron crecer
hasta la confluencia a 37ºC en CO_{2} al 5%. El medio de cultivo
se cambio un día sí y otro no durante el periodo de crecimiento. El
día antes del ensayo de quimioquinas el medio se cambió por 1 ml de
medio RPMI sin heparina.
Para activar la capa de endotelio, se añadieron
50 ng/ml de IL-1b recombinante humana, diluida en
medio RPMI (menos suero fetal, factor de crecimiento epidérmico,
suplemento de crecimiento de células endoteliales y heparina) y un
2% de BSA a pocillos que no eran de control hasta una concentración
final de 2 ng/ml. Las placas de múltiples pocillos se incubaron a
37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se retiró el medio de todos
los pocillos y los pocillos se lavaron dos veces con solución salina
equilibrada de Hanks (HBSS). Se añadieron 0,5 ml de medio RPMI
(menos suero fetal, factor de crecimiento epidérmico, suplemento de
crecimiento de células endoteliales y heparina) y un 2% de BSA a los
pocillos durante los tiempos indicados en la figura 3. Después de
los tiempos indicados, los pocillos se vaciaron y se lavaron una vez
con 1 ml de HBSS. Se añadieron 0,5 ml de HBSS con o sin 1 IU/ml de
heparinasa I, II o III; o heparinasas I y III a los pocillos. Las
placas se incubaron a 37ºC en un bloque térmico durante 15 minutos
con agitación ocasional. Después de 15 minutos, los sobrenadantes se
recogieron y se ensayaron para IL-8. Se usó un
sistema de ensayo de inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA) de
Perseptive Diagnostics para determinar las concentraciones de
IL-8 en los sobrenadantes. Se siguió el protocolo
recomendado por el fabricante. Se usaron 90 \mul de sobrenadante y
10 \mul de cloruro sódico 5 M en cada pocillo de la placa de
ELISA. Cada etapa de lavado utilizó tres repeticiones de 150 \mul
de solución de lavado por pocillo, con 2-3 minutos
de agitación entre cada repetición. El porcentaje de diferencia en
la concentración de IL-8 de los sobrenadantes entre
endotelio inducido por IL-1b tratado con heparinasa
I, II o III frente a endotelio no tratado inducido por
IL-1b se muestran en la figura 5. Además, en la
figura 5 se muestran las concentraciones de IL-8 en
los sobrenadantes de endotelio tratado con heparinasa I, II o III
inducido por IL-1b.
Para concentrar neutrófilos en un sitio de
inflamación, las moléculas de la superficie de las células
endoteliales activan la unión fuerte de neutrófilos rodantes a las
paredes de vénulas postcapilares. Se han identificado quimioquinas
unidas a heparina/heparán sulfato como importantes moléculas señal
para la activación de neutrófilos para su unión fuerte en los
microcapilares. El sistema de ensayo de adhesión de neutrófilos
in vitro descrito a continuación se usa habitualmente para
analizar las condiciones que afectan a la adhesión de los
neutrófilos a las células endoteliales. El tratamiento de las capas
de células endoteliales humanas activadas usado en este ensayo con
heparinasa I, II o III tuvo como resultado reducciones
significativas en el nivel de adhesión de neutrófilos al endotelio.
Estos resultados demuestran que el tratamiento de la vasculatura con
heparinasa inhibiría la acumulación localizada de neutrófilos en los
microcapilares e inhibiría las respuestas inflamatorias.
Se extrajeron 25 ml de sangre venosa de un
donante sano en 1/10 volúmenes de citrato sódico 0,1 M, pH 7,4 y se
diluyó con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco que contenía cloruro cálcico y cloruro magnésico
(D-PBS). Se depositaron alícuotas de 10 ml de sangre
diluida sobre 10 ml de Ficoll-Paque en tubos de 50
ml. Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 30 minutos a 20ºC y
se dejaron parar sin frenar. Las capas superiores se retiraron y los
sedimentos se resuspendieron en 3 volúmenes de una solución de
NH_{4}Cl 155 mM, KHCO_{3} 10 mM y EDTA 0,1 mM, pH 7,4 a 4ºC,
para lisar los eritrocitos. Los tubos se invirtieron después de unos
pocos minutos y el contenido se volvió negro después de 7 a 8
minutos. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugaron de nuevo
a 400 x g durante 5 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se aspiraron y
los sedimentos se resuspendieron en la solución de NH_{4}Cl que
contenía un 0,5% de albúmina humana. Las suspensiones se agruparon y
el volumen se llevó a 50 ml. La suspensión celular se incubó en
hielo durante 15 minutos y se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos
a 4ºC. El sobrenadante se retiró y si el sedimento aún era rojo, se
lavó de nuevo con solución de NH_{4}Cl que contenía un 0,5% de
albúmina humana. Finalmente, las células se resuspendieron en
D-PBS con 5 mg/ml de albúmina humana y se
refrigeraron hasta que se necesitaron. Se diluyó una alícuota de 10
\mul de suspensión con 10 \mul de azul trípano y las células se
contaron en un hemocitómetro para determinar el número de células
viables por volumen de suspensión.
Se preparó una suspensión de 10 x 10^{6}
neutrófilos en 2 ml de PBS (sin Ca, sin Mg) con 5 mg/ml de albúmina
humana. Se añadió BCECF-AM (Molecular Probes) a la
suspensión para conseguir una concentración final de 46 \muM. Los
neutrófilos se incubaron en un baño de agua a una temperatura
establecida de 37ºC durante 30 minutos, después de lo cual se
centrifugaron y se aclararon dos veces con PBS (sin Ca, sin Mg) con
5 mg/ml de albúmina humana. Finalmente, se resuspendieron en 10 ml
de RPMI + 20% de suero bovino fetal a 37ºC.
Se tripsinizaron células HUVEC en el número de
paso 3 y se contaron. Las células se pusieron en una placa en RPMI +
20% de suero bovino fetal + 95 \mug/ml de heparina + ECGS + EGF a
5 x 10^{4} células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se
cultivaron a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 18 horas. En este
momento, el medio de cultivo se reemplazó por RPMI + 20% de suero
bovino fetal (2 ng/ml de IL-1b durante 4 horas). Las
células después se aclararon con HBSS y se trataron con heparinasa
I, II o III a 0,1 IU/ml en HBSS durante 1 hora a 37ºC con CO_{2}
al 5%.
Después del periodo de tratamiento, se aclararon
células HUVEC una vez con HBSS. Se añadieron 200 \mul de la
suspensión de neutrófilos (que corresponde a 200.000 neutrófilos) a
cada pocillo de células HUVEC tratadas o de control. La placa se
puso a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 30 minutos. El periodo de
adhesión se detuvo por centrifugación de la placa de arriba a abajo
a 250 x g durante 5 minutos. Se añadieron 200 \mul de PBS (sin Ca,
sin Mg) + 5 mg/ml de albúmina humana a cada pocillo y la placa se
leyó con un lector de placas de fluorescencia Fluorolite 1000 a un
voltaje de 2,5 V. El filtro de emisión era a 535 nm \pm 35 y el
filtro de excitación a 485 \pm 22.
Se generó una curva patrón poniendo cantidades
conocidas de neutrófilos teñidos con BCECF-AM,
resuspendidos en PBS (sin Ca, sin Mg) + 5 mg/ml de albúmina humana
en pocillos de otra placa de 96 pocillos que contenía capas HUVEC
confluyentes. Las unidades de fluorescencia se representaron frente
a la cantidad de neutrófilos y se calculó la pendiente. La curva
patrón se usó para determinar el número de neutrófilos unidos en los
pocillos de control y tratados con heparinasa. En la figura 6 se
muestran las diferencias en porcentaje entre las capas de HUVEC
activadas con IL-1b y las capas de HUVEC comparables
tratadas con heparinasas I, II y III.
Los leucocitos de la sangre se acumulan en
tejidos inflamados por transmigración a través del endotelio
adyacente (extravasación). La capa de células endoteliales se activa
por el tejido inflamado (mediante citoquinas y quimioatrayentes) y
el endotelio afectado dirige y localiza la acumulación de leucocitos
en el tejido inflamado. Para activar los leucocitos para la
extravasación y para dirigir la migración de los leucocitos al
interior del tejido inflamado, el endotelio activado forma un
gradiente de quimioquinas inmovilizado sobre su superficie celular y
en su membrana basal. El sistema de ensayo de transmigración de
neutrófilos in vitro descrito a continuación se usa
habitualmente para analizar las condiciones que afectan a la
extravasación de neutrófilos. El tratamiento de las capas de células
endoteliales humanas activadas usadas en este sistema con heparinasa
I, II o III dio como resultado reducciones significativas en el
nivel de migración de neutrófilos a través del endotelio. Estos
resultados demuestran que el tratamiento con heparinasa de la
vasculatura inhibiría la acumulación de neutrófilos localizada y las
respuestas inflamatorias.
Se aislaron neutrófilos como se ha descrito en el
ejemplo 4. Se disolvió fibronectina humana a 0,4 mg/ml en medio RPMI
sin suero. Se recubrieron insertos de filtro (6,25 mm) con un tamaño
de poros de 3 \mum u 8 \mum con 4 \mug/cm^{2}de fibronectina
humana durante una hora a temperatura ambiente y se aclararon con
agua destilada. Los pocillos de una placa de 24 pocillos se llenaron
con 0,3 ml de medio RPMI con 20% de suero bovino fetal, 95 \mug/ml
de heparina, 200 \mug/ml de ECGS y 10 ng/ml de EGF. Los insertos
de filtro recubiertos se asentaron en los pocillos y sobre los
insertos de filtro recubiertos se cultivaron 8 x 10^{4} células
endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC; usadas en los pasos 1
a 7) en 0,3 ml de medio RPMI completo. Las células se dejaron crecer
durante 48 a 65 horas, a 37ºC en CO_{2} al 5%. El medio de cultivo
de los insertos de filtro y los pocillos se cambió una vez durante
el periodo de crecimiento por medio RPMI que carecía de heparina.
Después del periodo de crecimiento, el medio de cultivo debajo de
todos los insertos, excepto los insertos de control negativo, se
retiró y se reemplazó por medio de cultivo fresco que carecía de
heparina y factores de crecimiento, pero que contenía 2 ng/ml de
IL-1b recombinante humana. El medio de cultivo
debajo de los insertos de control negativos se reemplazó por medio
de cultivo fresco. Las placas de múltiples pocillos se incubaron a
37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 horas. El medio se retiró de los
insertos y los pocillos y las células se aclararon una vez con
solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Los filtros y los
pocillos se llenaron con 0,3 ml de una solución de HBSS; y los
insertos tratados recibieron HBSS que contenía heparinasa I, II o
III en lugar de HBSS. Este tratamiento se realizó durante los
tiempos indicados en la figura 1, a 37ºC en CO_{2} al 5%. La
solución se retiró y las células se aclararon una vez con HBSS. Se
añadieron 0,3 ml de medio de cultivo fresco sin heparina y factores
de crecimiento a los pocillos y se añadieron 1,5 x 10^{6}
neutrófilos humanos preparados recientemente en 0,3 ml de medio de
cultivo sin heparina ni factores de crecimiento a todos los
insertos. Las placas se incubaron a 37ºC en CO_{2} a 5% durante
los tiempos indicados en la figura 3. Después de este tiempo, los
insertos se retiraron y los fondos se aclararon una vez con 0,3 ml
de D-PBS. Se retiró el contenido del pocillo y el
pocillo se lavó con 0,3 ml de D-PBS. Los aclarados
se añadieron al contenido del pocillo y los contenidos reunidos se
llevaron a un volumen de 1 ml. Estas muestras se congelaron durante
un periodo de hasta 16 horas antes del ensayo de la actividad
mieloperoxi-
dasa.
dasa.
Se produjeron patrones que contenían entre 1 x
10^{5} y 1 x 10^{6} neutrófilos en un volumen de 1 ml diluyendo
una alícuota de la suspensión de neutrófilos en
D-PBS. Se añadieron 4 ml de fosfato potásico 50 mM a
pH 6,7 que contenía un 0,5% de bromuro de hexadeciltrimetilamonio y
un 0,5% de tritón a cada patrón y muestra descongelada. Se añadieron
0,1 ml de cada muestra o patrón a una cubeta de plástico. Se
añadieron 2,9 ml de tampón fosfato 50 mM, a pH 6,0, que contenía
0,167 mg/ml de clorhidrato de o-dianisidina y
peróxido de hidrógeno al 0,0005% a las cubetas. Se controló el
cambio de absorbancia a 460 nm cada 30 segundos durante 3 minutos
usando un espectrofotó-
metro.
metro.
Las proporciones de cambios obtenidas en relación
con los patrones se usaron para producir una curva de la velocidad
de aumento de la absorbancia frente al número de neutrófilos. Esta
curva se usó para cuantificar el número de neutrófilos en cada
muestra, que habían migrado a través de una capa endotelial tratada
o no tratada. El número de neutrófilos migratorios se dividió por
1,5 x 10^{6} para determinar el porcentaje de migración de
neutrófilos.
La eficacia del tratamiento con heparinasa en
este ensayo dependía de la medida en la que las células HUVEC
estaban cubriendo la superficie de filtro. La medida de cobertura se
basó en un análisis de exclusión de colorante realizado después de
un experimento de extravasación y varió un poco de un filtro a otro
en un solo experimento. Generalmente, si el filtro estaba cubierto
densamente con una capa de HUVEC fuertemente empaquetadas, el
porcentaje de extravasación de neutrófilos era bajo (<10%) y las
diferencias entre pocillos tratados y no tratados no fueron
estadísticamente significativas (gran variabilidad de un pocillo a
otro). Si grandes zonas del filtro no quedaban cubiertas con una
capa de HUVEC (una estimación del 30-40% del
filtro), grandes cantidades de neutrófilos (del 40 al 60%) migrarían
a través del filtro, pero un tratamiento de 1 hora con heparinasa no
sería tan eficaz para inhibir la migración. Esta migración no es
comparable con la extravasación, que puede definirse funcionalmente
como neutrófilos que se aprietan entre células endoteliales vecinas.
Si del 75 al 90% del filtro estaba cubierto con HUVEC, generalmente
se extravasaban del 15 al 30% de neutrófilos, y se descubrió que el
tratamiento de 1 hora con heparinasas era el más eficaz en
estas
condiciones.
condiciones.
Usando el ensayo t de Student se analizaron los
experimentos para determinar si se había observado un efecto
significativo para los tratamientos de una hora con heparinasa
(P<0,05). Los datos de estos experimentos se combinaron y se
representan en la figura 7. Los datos para los tratamientos de 15
minutos con heparinasa mostrados en la figura 7 proceden de los
mismos experimentos que los tratamientos de 1 hora. Se usó el ensayo
Student-Newman-Keuls para determinar
el significado de las diferencias (P<0,05) entre diferentes
tratamientos con el mismo enzima. Las diferencias significativas
están indicadas por asteriscos (*) en la figura 7.
Las preparaciones comerciales de
b-tromboglobulina son una mezcla de las quimioquinas
CTAP-III y NAP-2. A un pH no
fisiológico (pH 5,8-6), estas quimioquinas tienen
actividad heparinasa, mientras que a pH 7, se unen a heparina y
actúan como citoquinas quimiotácticas para leucocitos. Se analizó la
actividad heparinasa de preparaciones comerciales de
b-tromboglobulinas a pH 5,8 y pH 7, por digestión de
ECM radiactivo marcado con 35SO_{4}. Estas preparaciones mostraron
actividad heparinasa humana significativa sólo a pH 5,8. Después se
usaron en el sistema de ensayo de extravasación in vitro
descrito en el ejemplo 5, para determinar si la actividad de
heparinasa humana podría prevenir la extravasación de neutrófilos a
través de una capa de células endoteliales. El tratamiento de capas
de células endoteliales humanas activadas con heparinasa humana
(b-tromboglobulina) dio como resultado una reducción
significativa de la extravasación de neutrófilos. Estos resultados
demuestran que el tratamiento con heparinasa de la vasculatura con
heparinasa humana inhibiría la acumulación de neutrófilos localizada
y las respuestas
inflamatorias.
inflamatorias.
Se ensayó la actividad heparinasa de
b-tromboglobulina comercial a pH 5,8 y a pH 7
mediante la liberación de heparina/heparán sulfato marcado con
35SO_{4} a partir de ECM. Se fraccionaron células endoteliales de
córnea bovina en los pasos 1 a 8 1:10 en una placa confluente y se
sembraron en placas de 4 pocillos en DMEM de bajo contenido en
glucosa con un 10% de suero bovino fetal, un 5% de suero de ternero
y un 4% de dextrano añadido. Las placas recibieron 1 ng/ml de bFGF 3
veces por semana antes de alcanzar la confluencia. Justo antes de
alcanzar la confluencia, se añadió Na_{2}35SO_{4} en H_{2}O
diluido a 1 mCi/ml con DMEM de bajo contenido en glucosa a las
células a una concentración final de 25 \muCi/ml, en medio de
Fisher con un 10% de suero bovino fetal, un 5% de suero de ternera y
un 4% de dextrano. De 3 a 4 días después, se volvió a administrar el
marcador. Las placas se dejaron en reposo de 12 a 14 días después de
la confluencia. Para recoger la matriz, el medio se retiró y se
reemplazó por una solución de Tritón al 0,5%, NH_{4}OH 0,02 M en
PBS (sin Ca, sin Mg). Esta solución se retiró y la matriz se lavó 3
veces con PBS (sin Ca, sin Mg). Las placas se almacenaron a 4ºC y se
cubrieron con PBS. Estas matrices se usaron en un
año.
año.
Se usó b-tromboglobulina de
Wellmark (producto Nº 41705) o Calbiochem (producto Nº 605165) para
la digestión de ECM marcada. Se disolvieron 100 \mug de enzima en
1 ml de agua (Wellmark) o PBS (Calbiochem). Se realizó una dilución
adicional en PBS a pH 5,8 o 7. Las matrices se cubrieron con 250
\mul de PBS solo o PBS con 1 o 5 \mug de
\beta-tromboglobulina. Las matrices se incubaron
en una incubadora de CO_{2} durante 3 horas. Se tomaron alícuotas
de 100 \mul de cada pocillo y se contaron. La cantidad de
radiactividad liberada de cada matriz tratada con enzima se comparó
con una matriz sin tratar, y los resultados se muestran en la figura
8.
Se cultivaron HUVEC en insertos de filtro y se
activaron como se ha descrito en el ejemplo 5. Se aplicaron cinco
\mug de \beta-tromboglobulina en PBS a pH 5,8 o
PBS solo a la capa de HUVEC durante una hora. Se añadieron
neutrófilos por encima de los filtros y se cuantificó el número de
neutrófilos en extravasación como se describe en el ejemplo 5. En la
figura 9 se muestra el efecto de los tratamientos con heparinasa
humana sobre la extravasación de neutró-
filos.
filos.
Este ejemplo ilustra el efecto de la heparinasa
III sobre el comportamiento de leucocitos in vivo. Se
analizaron tres mecanismos clave de la acumulación de leucocitos en
tejidos inflamados: rodamiento, adherencia y extravasación de
leucocitos en la microvasculatura de músculo esquelético de rata
después de isquemia. Se descubrió que pretratando la vasculatura con
heparinasa III antes de la isquemia, y manteniendo constante la
concentración en plasma de heparinasa III durante la reperfusión se
reducía significativamente el rodamiento, la adherencia y la
extravasación de leucocitos. Este ejemplo demuestra que el
tratamiento con heparinasa de la vasculatura inhibiría la
acumulación de neutrófilos en microcapilares y en los tejidos
circundantes. El tratamiento con heparinasa in vivo daría
como resultado la disminución de las respuestas inflamatorias. Como
también demuestra este ejemplo, el tratamiento con heparinasa
aumentó significativamente la perfusión microvascular en músculo
reperfundido después de la isquemia. Además de la disminución de la
acumulación de neutrófilos, el aumento de la perfusión microvascular
afectaría positivamente a la recuperación del tejido muscular y
posiblemente afectaría a las consecuencias de los sucesos de
isquemia/reperfusión (es decir, inflamatorios).
Para establecer un nivel en plasma de
aproximadamente 1 IU/ml, realizamos estudios piloto para ensayar el
efecto de la infusión de Heparinasa durante el periodo de tiempo de
5 horas necesario para nuestros estudios in vivo. Una
publicación anterior sobre el comportamiento de los leucocitos
después de 3 horas de isquemia (Forbes et al., 1996,
Microvascular Research 51:275-287) contiene datos
sobre ratas sin tratamiento previo y con tratamiento simulado. Como
los métodos y los tiempos fueron los mismos para este estudio previo
y el presente estudio de 3 horas de isquemia, el efecto del
tratamiento con heparinasa se comparará con los resultados sin
tratamiento previo y con tratamiento simulado obtenidos a partir de
los resultados publicados anteriormente. Para el protocolo de
isquemia de 2 horas, se analizaron ratas adicionales sin tratamiento
previo y con tratamiento simulado.
Para investigar directamente el efecto de la
heparinasa in vivo, aplicamos videomicroscopía intravital al
músculo extensor digitorum longus en la pata trasera de la
rata. Este análisis se realizó durante un periodo de 105 o 90
minutos de reperfusión, al que siguieron 2 o 3 horas,
respectivamente, sin isquemia. Dichos periodos de
isquemia/reperfusión (I-R) dieron como resultado una
respuesta inflamatoria en el músculo esquelético suficiente para
provocar el aumento de las interacciones
leucocito-célula endotelial.
Se anestesiaron ratas Wistar macho que pesaban de
225 a 250 g por inhalación de halotano (al 1% - 1,5%) y se
canularon la arteria carótida y la vena yugular para controlar la
presión sanguínea y permitir la infusión de fluidos,
respectivamente. El músculo extensor digitorum longus (EDL)
en la pata trasera de la rata se preparó para microscopía
intravital. En resumen, con la rata anestesiada tendida sobre la
plataforma del microscopio, el músculo EDL se expuso por reflexión
de la piel superyacente y separación de los músculos tibial anterior
y gastrocnemius. Se ató una sutura alrededor del tendón distal del
músculo permitiendo la reflexión del músculo en un baño salino
colocado sobre la plataforma del microscopio. Se mantuvieron las
temperaturas normales del músculo y del cuerpo (es decir, el músculo
a 32ºC y el cuerpo a 37ºC) mediante lámparas térmicas. El músculo se
cubrió con un cubreobjetos de vidrio y todo el tejido expuesto se
cubrió con vendaje Sharan para evitar la deshidratación. Después de
la preparación del músculo EDL para videomicroscopía intravital, y
un periodo de recuperación de 30 minutos para permitir al flujo
sanguíneo microvascular volver a la normalidad después de la
hiperemia inducida por los métodos preparatorios, se eligieron
1-2 campos de visión que contenían cada uno dos o
más vénulas capilares. Estos campos de visión se usaron durante todo
el experimento de manera que pudieran medirse los cambios temporales
en el comportamiento del flujo de leucocitos. Se realizaron
registros de un minuto de estos campos de visión usando pocos
aumentos para proporcionar información con respecto al flujo de RBC
en el interior de capilares individuales. Después de los registros
de pocos aumentos, se registraron vistas de las vénulas
postcapilares durante 1 minuto con más aumento. Los registros en
vídeo de dichas vistas permiten el análisis "independiente" de
los parámetros microcirculatorios. De esta manera, se midieron los
valores de control de la densidad de capilares sometidos a perfusión
y el comportamiento del flujo de leucocitos (número de adherencias,
rodamientos y extravasaciones por unidad de
área).
área).
Los niveles en plasma de heparinasa III se miden
usado un ELISA de heparinasa III. El ELISA de heparinasa III es un
ensayo cuantitativo de sándwich de dos anticuerpos. Se aplican
anticuerpos de conejo anti-heparinasa III
purificados por afinidad como recubrimientos en una placa de
microtitulación. Los pocillos se lavan e incuban durante 2 horas a
37ºC con tampón de bloqueo (TBS, BSA al 1% + Tween 20 al 1%).
Después de 3 lavados, se añaden patrones y muestras a los pocillos y
la heparinasa III presente se une con el anticuerpo inmovilizado.
Después se retira por lavado cualquier sustancia no unida y se
añaden a los pocillos anticuerpos de conejo
anti-heparinasa III marcados con biotina. Los
anticuerpos en exceso se retiran por lavado. Se añade estreptavidina
conjugada con peroxidasa y se une a cualquier complejo de biotina
presente en el pocillo. Después de retirar por lavado la
estreptavidina sin reaccionar, se añade una solución de sustrato que
contiene peróxido de hidrógeno y
3,3',5,5'-tetrametilbencidina en DMF acuosa a los
pocillos, de acuerdo con el procedimiento descrito para el kit TMB
Peroxidase EIA Substrate (Biorad, CA), y el color se revela en
proporción con la cantidad de heparinasa III en la muestra. Una
solución de H_{2}SO_{4} 1 N detiene la reacción y la absorbancia
se mide a 450 nm.
Una serie de ratas se sometió a infusión con
heparinasa III a través del catéter venoso a una velocidad de 3 ml/h
durante 5 horas para mantener un nivel de heparinasa de 1,0 IU/ml en
la sangre. Por medio de estos estudios piloto se determinó que 0,33
IU/g de peso corporal/h eran adecuados para este fin.
Se registró el flujo sanguíneo microvascular y el
comportamiento de los leucocitos cada 15 minutos durante un total de
90 a 105 minutos de reperfusión. Se tomaron muestras de sangre antes
de la administración de heparinasa y durante la reperfusión para
asegurar que se conseguían concentraciones correctas de heparinasa
en plasma.
En todos los casos, las medias se expresan con su
error típico estimado. Las comparaciones se realizaron usando un
análisis de varianza (ANOVA) seguido, cuando fue apropiado, de
ensayos de Scheffé como análisis ad hoc. Se asumió que el
resultado era significativo a p>0,05.
Se consiguió una concentración en plasma de
aproximadamente 1 IU/ml (ajustado para la actividad) durante la
infusión, y a pesar de una tendencia hacia el aumento de los niveles
en plasma durante las últimas 2 horas de infusión, la concentración
en plasma se mantuvo constante (figura 10). La infusión prolongada
de heparinasa III parecía no tener efectos secundarios negativos al
menos en términos de la presión sanguínea o ritmo respiratorio.
Inmediatamente después de 3 horas de isquemia, el
número de leucocitos rodantes (Lr) aumentó significativamente en
ratas sometidas a I-R simulada (14,77 \pm 1,33),
en comparación con ratas sin tratamiento previo (sin
I-R) (5,66 \pm 0,11). El número medio de
leucocitos rodantes permaneció constante a estos niveles durante la
reperfusión tanto en las ratas sometidas al tratamiento simulado
como en las ratas sin tratamiento previo para la duración del
periodo de reperfusión de 90 minutos (figura 3). A pesar de las 3
horas de isquemia, no se midió ningún cambio en el rodamiento de
leucocitos dentro de vénulas postcapilares de ratas tratadas con
heparinasa III. De hecho, el número medio de leucocitos rodantes
después del tratamiento con heparinasa (2,81 \pm 0,64) tendía a
ser menor que en ratas sin tratamiento previo durante el periodo de
observación de 90 minutos (figura 11).
El número de leucocitos adheridos a la pared de
vénulas postcapilares (Ls) aumentó progresivamente en ratas
sometidas a I-R simulada, alcanzando un nivel
constante (11,96 \pm 0,01) en los 45 minutos posteriores a la
liberación del torniquete (3 horas de isquemia). Sin embargo, el
número de leucocitos adheridos en ratas tratadas con heparinasa III
no mostró ningún cambio después de la isquemia, y no fue
significativamente diferente de las ratas sin tratamiento previo
(figura 12).
Como sería de esperar basándose en los bajos
números de leucocitos adherentes después del tratamiento con
heparinasa III, el número de leucocitos extravasado (Le) no cambió
durante la reperfusión después de 3 horas de isquemia (figura 13).
Los Le de ratas con tratamiento simulado y sin tratamiento previo no
están disponibles para el protocolo de isquemia de 3 horas. Para un
protocolo de isquemia de 2 horas, los Le para las ratas tratadas con
heparinasa III fueron más que para ratas sin tratamiento previo,
pero significativamente menos que los Le en los animales con
tratamiento simulado. Estos datos se representan en la figura 14,
como la diferencia en porcentaje en los Le para las ratas tratadas
con heparinasa y con tratamiento simulado frente a ratas sin
tratamiento previo.
Después de la liberación del torniquete después
de 3 horas de isquemia, tuvo lugar una disminución significativa de
la perfusión microvascular (CDper) tanto en ratas con tratamiento
simulado como en ratas tratadas con heparinasa III, en comparación
con la perfusión medida en ratas sin tratamiento previo. Sin
embargo, a diferencia de la perfusión en ratas con tratamiento
simulado, la perfusión microvascular en los músculos tratados con
heparinasa III volvió a la normalidad a los 30 minutos de la
liberación del torniquete (figura 15).
La isquemia produce un grado significativo de
lesión al nivel de los miocitos y células endoteliales dentro del
lecho vascular coronario; esto puede conducir a la extravasación del
plasma y de otros componentes sanguíneos y celulares al espacio
intersticial. Los leucocitos polimorfonucleares pueden migrar a
través de la capa de células endoteliales; esta migración de
neutrófilos a través de la barrera de tejido conectivo depende de
las acciones de los enzimas proteolíticos derivados de neutrófilos
incluso en presencia de antiproteasas plasmáticas. La restauración
del flujo sanguíneo permite un acceso rápido de las células
inflamatorias al miocardio en peligro. La adhesión de neutrófilos a
células endoteliales está estimulada por la endotoxina
IL-1b (activa el endotelio vascular para producir
moléculas de adherencia para leucocitos) o por el factor de necrosis
tumoral. Varios estudios han explorado la posibilidad de usar
diversas intervenciones farmacológicas incluyendo anticuerpos
monoclonales para prevenir la adhesión de neutrófilos a células
vasculares o miocárdicas particularmente durante la fase de
reperfusión. Se ha demostrado que la interferencia con las
interacciones neutrófilo-célula (rodamiento,
adhesión y extravasación de neutrófilos) reduce significativamente
el grado de lesión celular después de una
isquemia-reperfusión. Esto sugiere que las células
inflamatorias juegan un papel importante en la patofisiología de la
lesión celular inducida por isquemia; las células inflamatorias
también pueden jugar un papel en la extensión de la lesión de los
miocitos más allá de lo que ocurre durante el ataque isquémico (es
decir, lesión por reperfusión). Como el tratamiento con heparinasa
es eficaz para inhibir las interacciones
neutrófilo-endotelio (véanse los ejemplos
anteriores), se investigó la prevención de la lesión por reperfusión
en miocardio de conejo por tratamiento con heparinasa en los
experimentos descritos en este ejemplo. Se descubrió que la
heparinasa III atenuaba el grado de la necrosis de tejidos cuando se
administraba a una dosis diana de 25 \mug/ml antes del comienzo de
la oclusión coronaria o en el comienzo de la reperfusión.
Dosificaciones menores de heparinasa III no proporcionaron
cardioprotección en esta preparación animal de lesión por
isquemia-reperfusión; sin embargo, a una dosis diana
de 5 \mug/ml hubo una tendencia hacia la reducción del tamaño del
infarto. Se obtuvo protección sin cambios significativos en la
hemodinámica cardíaca o en la distribución del flujo
sanguíneo
transmural.
transmural.
Cuando una respuesta inflamatoria es el resultado
de un episodio isquémico como en los ejemplos no limitantes de
ataque cardíaco y apoplejía, este ejemplo demuestra que el
tratamiento con heparinasa antes o en el momento del suceso
inflamatorio puede reducir la lesión de los tejidos. Además, este
ejemplo indica que la lesión tisular resultante de la acumulación de
leucocitos durante cualquier suceso inflamatorio puede reducirse por
tratamiento o pretratamiento con heparinasa.
Para estos estudios se usaron conejos New Zealand
White macho (2,2-3,0 kg de peso corporal). Los
conejos se cuidaron de acuerdo con la Guide to the Care and Use
of Experimental Animals (vol. 1 y 2) del Canadian Council on
Animal Care. Se premedicaron con maleato de acepromazina
intramuscular (5 mg/kg; Austin Laboratories) y se anestesiaron con
pentobarbital sódico (25 mg/kg; i.v.; MTC Pharmaceuticals). Se
administró más anestésico cada hora. La tráquea se canuló y los
conejos se ventilaron mecánicamente con aire ambiente. La vena
yugular derecha se canuló para la administración de fármacos
(heparinasa III o vehículo); la vena yugular izquierda se canuló
para permitir la extracción de sangre para determinar los niveles de
heparinasa en plasma. Se puso una cánula (PE-90) en
la arteria carótida izquierda para la extracción de sangre arterial
de referencia durante la inyección de microesferas
radiomarcadas.
El corazón se expuso mediante una toracotomía
izquierda y se ató un lazo (seda 4-0) alrededor de
la primera rama anterolateral de la arteria coronaria circunfleja
izquierda a medio camino entre el canal atrioventricular y el
vértice. La sutura de seda se pasó a través de la longitud de un
tubo Tygon para proporcionar un lazo para la oclusión coronaria. La
presión de la cámara ventricular izquierda se obtuvo con un catéter
lleno de fluido colocado a través del vértice. Se dejó que la
hemodinámica cardíaca se estabilizara durante 20 minutos.
Se indujo isquemia de miocardio regional tirando
de la sutura a través del tubo de plástico y sujetándola con un
hemostato de mosquito. La isquemia se verificó visualmente por la
aparición de cianosis epicárdica regional y elevación del segmento
ST en el electrocardiograma (derivación II). En corazones que
desarrollan fibrilación ventricular, se restauró el ritmo sinusal
normal mediante un masaje suave del LV (no se usó cardioversión
eléctrica en estos experimentos); los corazones que no pudieron
cardiovertirse después de dos intentos se excluyeron del análisis de
datos. A lo largo de los experimentos se registraron el
electrocardiograma de derivación II y la presión LV con un
registrador fisiográfico de 4 canales Gould (TA240) EasyGraph
(Interfax Inc., Montreal, Quebec).
Se asignaron conejos a siete grupos de
tratamiento diferentes; a los conejos del grupo 1 se les dio
solución salina (i.v.) durante 60 minutos antes del comienzo de la
isquemia; a los conejos del grupo 2 se les dio solución salina
(i.v.) al comienzo de la reperfusión coronaria; a los conejos del
grupo 3 se les dio heparinasa III (nivel diana de 25 \mug/ml,
i.v.) durante 60 minutos antes del comienzo de la isquemia; a los
conejos del grupo 4 se les dio heparinasa III (nivel diana de 25
\mug/ml, i.v.) al comienzo de la reperfusión coronaria; a los
conejos de los grupos 5, 6 y 7 se les administraron niveles diana de
0,25, 1,25 o 5,0 (g/ml de heparinasa III, respectivamente, al
comienzo de la reperfusión coronaria. Se infundió fármaco o solución
salina por vía intravenosa (4,0 ml/h) durante 60 minutos antes del
comienzo de la isquemia de miocardio en dos grupos de tratamiento
(grupos 1 y 3) y después de manera continua durante 2 horas usando
una bomba de infusión Harvard (Ealing Scientific, Montreal, Canadá).
En los demás grupos experimentales, la infusión de vehículo o
fármaco se inició en el momento de la reperfusión y se continuó
durante 3 horas durante la reperfusión. Los conejos se asignaron a
un grupo particular rotando el tratamiento con fármaco en
experimentos sucesivos a través de los siete protocolos de
tratamiento. Todos los conejos se sometieron a 45 minutos de
oclusión coronaria regional seguida de 180 minutos de
reperfusión.
Se obtuvieron muestras de sangre de la vena
yugular derecha al comienzo de la medición, 30 y 60 minutos después
de la infusión del vehículo o de fármaco en los conejos del grupo 1
y 3; y también se obtuvo sangre a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos
de reperfusión coronaria. En los demás grupos experimentales se
obtuvieron al inicio y a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos de
reperfusión coronaria. Las muestras de sangre se centrifugaron
durante 15 minutos a 1500 rpm a 4ºC; el plasma se congeló y se
almacenó a -20ºC para análisis posterior. Los niveles de heparinasa
III en plasma se determinaron como se ha descrito en el ejemplo
7.
\newpage
Se midió el flujo sanguíneo en lechos vasculares
isquémicos y no isquémicos usando microesferas radiomarcadas (\pm
15 \mum; NEN, Boston, MA) usando la técnica de extracción de
referencia. Para cada medida del flujo sanguíneo, se inyectaron
0,4-0,6 x 10^{6} microesferas marcadas con 113Sn,
46Sc o 85Sr (agitadas mecánicamente con un mezclador vorticial
inmediatamente antes de su uso) a la aurícula izquierda en
condiciones hemodinámicas estacionarias seguido de dos lavados
abundantes con 3 ml de solución salina templada (la inyección de
microesferas en la aurícula izquierda asegura la mezcla adecuada en
la cámara LV y evita los artefactos de flujo que se producen con las
inyecciones directas de microesferas en la circulación coronaria).
Se recogieron muestras de sangre arterial de referencia de la
arteria carótida empezando 10 segundos antes de la inyección de las
microesferas y continuando durante 2 minutos posteriormente a una
velocidad de 2,6 ml/minuto. La distribución del flujo sanguíneo
miocárdico se evaluó a: 1- al principio, 2- 30 minutos después del
comienzo de la reperfusión coronaria y 3- a los 180 minutos de la
reperfusión coronaria. Se mide la radiactividad del tejido y de la
sangre de referencia usando un analizador multicanal de altura de
pulsos (Cobra II, Canberra Packard) con corrección para el
solapamiento de los espectros de
isótopos.
isótopos.
Al final del protocolo experimental, los
corazones se detuvieron en diástole mediante inyección intravenosa
de 10 ml de cloruro potásico saturado, se extirparon rápidamente, se
aclararon con solución salina y se canularon a través de la aorta en
un aparato de perfusión Langendorff. Los corazones se perfundieron
ex vivo a través de la aorta a 75 mm Hg con cloruro de
2,3,5-trifeniltetrazolio a 37ºC durante 20 minutos.
Posteriormente se volvió a atar la sutura arterial y se inyectó
Monastral Blue de manera retrógrada a través de la cánula aórtica
para permitir la delineación de la zona anatómica de riesgo.
Después, los corazones se retiraron del aparto de perfusión, se
quitaron las aurículas y el ventrículo derecho y el ventrículo
izquierdo se pesó y se fijó por inmersión en formalina al 10%
tamponada.
tamponada.
El principal criterio de valoración de este
estudio fue el efecto del tratamiento con el fármaco sobre el tamaño
del infarto (normalizado con respecto a la zona de riesgo
anatómica), evaluado usando tinción con tetrazolio. Los corazones se
seccionaron en cortes de 2 mm y se trazaron el perfil de los cortes
LV y las zonas negativas a tetrazolio (es decir, infartadas) en
láminas transparentes de acetato. La zona anatómica de riesgo se
delineó por la ausencia de colorante azul de Monastral y se trazó
sobre láminas transparentes de acetato. Los infartos se normalizaron
con respecto al tamaño de la zona de riesgo anatómica para cada
corazón. Se determinó el área transversal de LV, el área de riesgo y
el área de infarto a partir de trazos ampliados (1,5X) por
planimetría computerizada (Sigma Scan; Jandel Scientific Inc.,
Calif.) usando un Summagraphics Summasketch Plus Bitpad conectado a
un ordenador IBM PS/2. El volumen de riesgo, el volumen de infarto y
el volumen de LV para cada corte se calculó como la suma del área
obtenida por planimetría computerizada y el espesor de cada corte de
ventrículo. Los valores de los cortes secuenciales se sumaron para
proporcionar el volumen total del LV, zona de riesgo y zona de
infarto.
Se examinaron las diferencias en los datos
hemodinámicas antes y después de la oclusión coronaria usando ANOVA
de una vía. Se usó el producto de ritmo
cardíaco-presión sanguínea como índice para la
demanda metabólica cardíaca. Se compararon el volumen de infarto, el
volumen de riesgo, el tamaño del infarto y el volumen de LV mediante
un ANOVA de una vía. Cuando se detectaron diferencias generales en
el grupo, se usó un ensayo de comparación múltiple de Dunnett para
comparación con los controles. Todas las comparaciones estadísticas
se realizaron con programas de sistemas de análisis estadísticos
(SAS Institute, Cary, NC) para el ordenador personal. Un nivel de
probabilidad (p) de menos de 0,05 se consideró
estadísticamente significativo. Para establecer el tamaño de muestra
para este estudio, se calcularon los valores "n/grupo" para
proporcionar una potencia de 0,90 para detectar una reducción mínima
del 15 por ciento (desviación típica esperada del 8%) del tamaño
del
infarto.
infarto.
En los estudios de la presente invención se
utilizaron ciento treinta conejos; cinco conejos murieron debido a
insuficiencia respiratoria (n = 1), error quirúrgico (n = 1) o
fibrilación ventricular no convertible (n = 3). Se incluyeron
treinta y seis conejos en los estudios de
dosis-respuesta y otros 28 se asignaron a las
evaluaciones biomédicas (se incluyeron hemodinámica cardíaca y
niveles de heparinasa III en plasma en el análisis estadístico
global). Por consiguiente, se incluyeron sesenta y un conejos en los
análisis de datos del tamaño del infarto.
Las variables hemodinámicas cardíacas se resumen
en la tabla 1. El ritmo cardíaco, las presiones sistólica y
diastólica del ventrículo izquierdo y el producto de ritmo
cardíaco-presión sanguínea (indicador de la demanda
de oxígeno del miocardio) antes del comienzo de la oclusión
coronaria fueron comparables para todos los grupos de tratamiento.
El producto ritmo cardíaco-presión sanguínea (figura
16) parecía ser mayor a los 60 minutos de reperfusión en conejos
tratados con heparinasa III (nivel diana de 25 \mug/ml) en el
momento de la reperfusión (grupo 4); sin embargo, la hemodinámica
cardíaca fue similar para todos los animales al final del
estudio.
En la tabla 3 se resumen los datos de peso del
ventrículo izquierdo, volumen de infarto y de riesgo, tamaño del
infarto y área anatómica de riesgo como un porcentaje del volumen de
LV. El tamaño del infarto (figura 17), normalizado con respecto al
tamaño de la zona de riesgo, fue del 42,3 \pm 4,8 (media \pm 1
SD) y del 40,0 \pm 5,3 por ciento (p = NS) en los controles
con/sin pre-tratamiento con vehículo,
respectivamente. El pretratamiento con heparinasa III y la
heparinasa III administrada en el momento de la reperfusión al nivel
diana de 25 \mug/ml dieron como resultado una reducción
significativa (p = 0,01 frente a los controles tratados con
vehículo) en la necrosis de miocitos de 26,1 \pm 5,2 y de 24,7
\pm 5,1 por ciento, respectivamente; no hubo diferencias
detectables entre los grupos tratados antes de la isquemia o en el
momento de la reperfusión coronaria. El tratamiento con heparinasa
III a niveles diana de 0,25, 1,25 o 5,0 \mug/ml no limitó el
tamaño del infarto; fueron del 42,8 \pm 6,5, 39,1 \pm 5,4 y 37,9
\pm 4,6 por ciento, respectivamente. Hubo una ligera tendencia
hacia infartos más pequeños en el grupo de tratamiento con 5,0
\mug/ml con un valor de p de 0,066.
En la figura 18 se muestran los niveles
inyectables de heparinasa III que se administraron a los grupos de
tratamiento respectivos. Se investigó la dosis diana de heparinasa
III inicial (es decir, la dosis terapéutica) de 25 \mug/ml seguido
de las diluciones del fármaco respectivas de 1:5, 1:20 y 1:100; las
diluciones se realizaron con solución salina. En la figura 19 se
muestra el transcurso a lo largo del tiempo de las concentraciones
reales de heparinasa III en plasma; el
pre-tratamiento con heparinasa III y el tratamiento
en el momento de la reperfusión proporcionaron concentraciones
similares del fármaco en plasma en los grupos 3 y 4. Las
concentraciones de heparinasa III en plasma fueron considerablemente
menores después de 3 horas de reperfusión coronaria en conejos que
inicialmente se habían pre-tratado (sólo con fármaco
administrado durante las 3 primeras horas del protocolo
experimental); lo que es más importante, el fármaco estaba presente
en el momento de la reperfusión coronaria. Esto puede responder de
los resultados similares obtenidos en los grupos 3 y 4 con respecto
al tamaño del infarto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores son medias \pm 1 SD. HR = ritmo
cardíaco; LVPsis = presión sistólica en la cámara ventricular
izquierda; LVPdias = presión diastólica en la cámara ventricular
izquierda; RPP = producto ritmo cardíaco-presión
sanguínea.
Los valores son medidas \pm 1 SD. 1p (0,05
frente al grupo 6). BASE = medida de flujo inicial (es decir, antes
de la isquemia); RP = reperfusión coronaria. Los datos se expresan
en ml/min/g de peso húmedo.
Los valores son medidas \pm 1 SD. ^{1}p (0,05
frente a los controles). Htwt = peso ventricular; AN = área de
necrosis; AR = área de riesgo; ANAR = área de necrosis normalizada
con respeto al área anatómica de riesgo; ARLV = zona de riesgo
normalizada con respeto al área de LV total.
Estos datos indican la utilidad de las
composiciones que contienen heparinasa para disminuir las respuestas
inflamatorias localizadas.
Claims (4)
1. El uso de un enzima heparinasa en la
preparación de un medicamento para administración intravascular para
reducir las respuestas inflamatorias localizadas debidas a una
lesión por isquemia/reperfusión en el tejido de un paciente.
2. El uso de la reivindicación 1, donde dicho
enzima heparinasa se sobreexpresa a partir de una secuencia de
nucleótidos recombinante, en Flavobacterium heparinum o
Escherichia coli.
3. El uso de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, donde dicho enzima heparinasa es heparinasa
III.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la lesión por isquemia/reperfusión es
infarto de miocardio, apoplejía, trasplante de órganos, choque o
cirugía de bypass cardiopulmonar.
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