ES2226125T3 - Terapias para insuficiencia renal aguda. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a procedimientos de tratamiento y a agentes farmacéuticos a utilizar en el tratamiento de los mamíferos que padecen insuficiencia renal aguda o que están en riesgo de desarrollar tal enfermedad, o mamíferos que padecen inflamaciones, daños celulares inducidos por neutrofilos, y apóptosis resultante de daños o de enlaces tisulares, o mamíferos en riesgo de desarrollar tales trastornos. Estos procedimientos consisten en administrar ciertas proteínas de la familia de las proteínas osteogénicas o de las proteínas morfogenéticas óseas (OP/BMP) que forman parte de la superfamilia de las proteínas del factor de crecimiento transformante TGF-{be}.

Description

Terapias para insuficiencia renal aguda.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de agentes terapéuticos en la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad renal, en particular, para tratar mamíferos, incluyendo seres humanos, que padecen, o tienen riesgo de, insuficiencia renal aguda. Los agentes terapéuticos son proteínas de la familia de proteínas osetogénicas/proteínas morfogenéticas óseas (OP/BMP) dentro de la superfamilia de proteínas de TGF-\beta.

Antecedentes de la invención

El sistema renal de los mamíferos atiende papeles principales tanto en la eliminación de productos de desecho catabólicos de la corriente sanguínea como en el mantenimiento del equilibrio de líquidos y electrolitos en el cuerpo. Por lo tanto, la insuficiencia renal, es un estado que amenaza la vida, en el que la acumulación de catabolitos y otras toxinas, y/o el desarrollo de desequilibrios importantes en los electrolitos o líquidos, puede conducir a la insuficiencia de otros sistemas de órganos principales y a la muerte. De forma general, la insuficiencia renal se clasifica como "aguda" o "crónica". Como se detalla a continuación, la insuficiencia renal aguda típicamente implica una pérdida rápida y drástica que amenaza la vida de la función renal, en un periodo de unas horas a varias semanas. En contraste, la insuficiencia renal crónica, típicamente implica una pérdida lenta y progresiva de la función renal, en un periodo de meses a años, durante cuyo tiempo la vida del sujeto no está inmediatamente amenazada.

La insuficiencia renal aguda se caracteriza por un cese abrupto o reducción sustancial de la función renal, y típicamente se diagnostica por aumentos relativamente rápidos del nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) o de los niveles de creatinina en el suero en un periodo de unas horas o días. En hasta 90-95% de los casos, la insuficiencia renal aguda puede ser secundaria de un traumatismo, cirugía u otro estado médico agudo. Hablando en general, la insuficiencia renal aguda se puede deber a causas prerrenales, postrenales o renales intrínsecas. Las causas prerrenales (por ejemplo, disminución de la capacidad cardiaca, hipovolemia, resistencia vascular alterada) y causas postrenales (por ejemplo, obstrucciones o constricciones de los uréteres, vejiga o uretra) no implican daño directo a los riñones, pero afectan al flujo sanguíneo a los riñones o al flujo de orina desde los riñones, y pueden conducir a daño permanente y/o progresivo significativo de los tejidos renales. Por otra parte, la insuficiencia renal aguda se puede deber a causas renales intrínsecas que implican un ataque o lesión más directa a los riñones, y que también pueden traer consigo daño permanente y/o progresivo a las nefronas u otras estructuras del riñón. Entre las causas intrínsecas de insuficiencia renal aguda se incluyen, pero no se limitan, enfermedades infecciosas (por ejemplo diferentes infecciones bacterianas, víricas y parásitas), enfermedades inflamatorias (por ejemplo, glomerulonefritis, lupus eritematoso sistémico), isquemia (por ejemplo, oclusión de la arteria renal), síndromes tóxicos (por ejemplo, envenenamiento por metales pesados, efectos secundarios de tratamiento antimicrobianos o quimioterapia), y traumatismos directos.

En los pacientes humanos con insuficiencia renal aguda, puede haber oliguria (excreción de orina < 400 ml/día) o anuria (excreción de orina < 50 ml/día) en 50-70% de los casos, los niveles de BUN pueden subir 10-20 mg/dl/día o más rápido, los niveles de creatinina en el plasma pueden subir 0,5-1,0 mg/dl/día, y la acidosis metabólica está casi siempre presente. Si no se tratan, los desequilibrios de electrolitos y líquidos (por ejemplo, hipercalemia, acidosis, edema) asociados con insuficiencia renal aguda, pueden conducir a arritmias que amenazan la vida, insuficiencia cardiaca congestiva, o fracasos multiorgánicos. Debido a la gravedad de la insuficiencia renal aguda, los episodios raramente duran más de varias semanas sin mortalidad y se tratan en pacientes hospitalizados.

The Journal of the American Society of Nephrology (1996) vol. 7, nº 9, pg 1867, describe datos para sugerir que OP-1 puede proporcionar una base para el tratamiento de la insuficiencia renal crónica.

El documento WO 93/05751A describe tratamiento con morfógenos para aumentar la masa ósea o prevenir la pérdida ósea en un individuo que padece una enfermedad ósea.

El documento WO 93/04692 describe métodos y composiciones para aliviar los efectos destructores de tejidos asociados con la respuesta inflamatoria a la lesión de tejidos en un mamífero, que incluyen administrar un morfógeno o agente estimulante de morfógenos.

El documento WO 94/03200A describe métodos de tratamiento terapéutico, composiciones y dispositivos para mantener las rutas neurales en un mamífero.

El documento WO 97/41880A1 describe métodos de tratamiento y preparaciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de sujetos mamíferos con, o con riesgo de, insuficiencia renal crónica, o con riesgo de necesitar terapia de sustitución renal.

El documento WO 97/41881A1 describe métodos para tratar, y productos farmacéuticos para usar, en el tratamiento de sujetos mamíferos con, o con riesgo de, insuficiencia renal crónica, o con riesgo de necesitar terapia de sustitución renal.

Por lo tanto, siguen siendo necesarios tratamiento que prevendrán, inhibirán, retrasarán o aliviarán la pérdida permanente o progresiva de la función renal, que puede ser resultado de la insuficiencia renal aguda.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva. Los agentes terapéuticos descritos se pueden usar para tratar sujetos que ya tienen insuficiencia renal aguda, así como cualquier sujeto que se espera razonablemente que sufra pérdida aguda de la función renal. El que un sujeto particular tenga insuficiencia renal aguda, o tenga riesgo de insuficiencia renal aguda, es una determinación que puede hacer rutinariamente un experto en la técnica médica o veterinaria pertinente. Entre los pacientes con insuficiencia renal aguda se incluyen los que muestran (1) un aumento del nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) con una tasa de al menos 2 a 4 mmol/l/día (5 a 10 mg/dl/día), o (2) un aumento de la creatinina en el suero con una tasa de al menos 20 a 40 \mumoles/l/día (0,25 a 0,5 mg/dl/día). Más típicamente, los sujetos con insuficiencia renal aguda muestran tasas de aumento de BUN de al menos 4 a 8 mmol/l/día (10 a 20 mg/dl/día), y tasas de aumento de la creatinina en el suero de al menos 40 a 80 \mul/l/día (0,5 a 1,0 mg/dl/día). Entre los sujetos "con riesgo" de insuficiencia renal aguda se incluyen sujetos que se espera razonablemente que entren en insuficiencia renal aguda o si no que se espera que padezcan de otra forma una pérdida progresiva rápida de la función renal. El que un sujeto particular esté en riesgo, es una determinación que puede hacer rutinariamente un experto en la técnica médica o veterinaria pertinente. Entre los sujetos con riesgo de insuficiencia renal aguda se incluyen, pero no se limitan, los siguientes: (1) sujetos en los que la determinación seriada del BUN indica una tasa de aumento de al menos 1 a 2 mmol/l/día (2,5 a 5 mg/dl/día); (2) sujetos en los que la determinación seriada de creatinina en el suero indica una tasa de aumento de al menos 10 a 20 \mumoles/l/día (0,125 a 0,25 mg/dl/día); (3) sujetos a los que se ha diagnosticado una causa prerrenal de insuficiencia renal aguda; (4) sujetos a los que se ha diagnosticado una causa postrenal de insuficiencia renal aguda; y (5) sujetos a los que se ha diagnosticado una causa renal intrínseca de insuficiencia renal aguda.

Los agentes terapéuticos de esta invención aprovechan en parte el descubrimiento de que ciertas proteínas de origen eucariótico, definidas en la presente memoria como agentes terapéuticos renales OP/BMP, y que incluyen miembros de la familia de proteínas de proteínas osteogénicas/proteínas morfogenéticas óseas (OP/BMP), se pueden usar para fabricar un medicamento para tratar sujetos con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda. Entre los agentes terapéuticos útiles se incluyen polipéptidos, o variantes funcionales de polipéptidos, que comprenden al menos el dominio C-terminal de seis o siete cisteínas de una proteína de mamífero seleccionada del grupo que consiste en OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, y proteínas que presentan al menos 70% o, más preferiblemente, 75% u 80% de homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio de siete cisteínas de OP-1 humana; y que son (a) capaces de inducir condrogénesis en el ensayo óseo ectópico de Reddi-Sampath (Sampath and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603) o un ensayo sustancialmente equivalente, (b) capaces de prevenir, inhibir, retrasar o aliviar significativamente la pérdida progresiva o permanente de la función renal que puede resultar de la insuficiencia renal aguda, en un modelo animal patrón de insuficiencia renal aguda, o (c) capaces de producir una mejora clínicamente significativa en un marcador patrón de función renal cuando se administra a un mamífero que tiene, o con riesgo de tener insuficiencia renal aguda.

Los agentes terapéuticos renales de la invención son adecuados para administrar por cualquier vía que sea compatible con el agente seleccionado, y se pueden formular con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para la vía de administración. Las vías de administración preferidas son parenteral y, en particular, intravenosa, intraperitoneal, e intracapsular renal. Se espera que la administración sea continua o frecuente (por ejemplo, diaria) durante el periodo de insuficiencia renal aguda, típicamente 1-3 semanas, pero se puede continuar durante varias semanas o meses después de la fase aguda. Se espera que las dosificaciones diarias de los agentes terapéuticos renales estén en el intervalo de aproximadamente 0,01-1000 \mug/kg de peso corporal, y más preferiblemente aproximadamente 10-700 \mug/kg de peso corporal, aunque las dosificaciones exactas variarán dependiendo del agente terapéutico renal particular usado y el estado e historia médica del sujeto particular.

Los usos terapéuticos de la presente invención incluyen la reducción de la tasa y/o grado de morbosidad en mamíferos con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda. Además, dichos usos terapéuticos son útiles para prevenir, inhibir, retrasar o aliviar la pérdida permanente o progresiva de la función renal que puede resultar de la insuficiencia renal aguda. Así, la presente invención tiene un gran valor, no sólo para aumentar las tasas de supervivencia, si no para prevenir o retrasar la necesidad de diálisis crónica o terapia de sustitución renal, para prevenir o retrasar el desarrollo de la insuficiencia renal crónica y/o para reducir la frecuencia necesaria de diálisis renal crónica.

En otro aspecto, los agentes terapéuticos renales OP/BMP de la invención son útiles para inhibir la apoptosis de células en tejidos dañados o lesionados. En relación con esto, se muestra que los agentes terapéuticos OP/BMP reducen la apoptosis de tejidos epiteliales dañados o lesionados, particularmente del epitelio renal.

En otro aspecto, los agentes terapéuticos renales OP/BMP de la invención se pueden usar en la fabricación de medicamentos para tratar cualquiera de los estados antes descritos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica de barras que muestra el efecto de OP-1 en los niveles de creatinina en ratas en las que se ha inducido daño renal isquémico impidiendo temporalmente el flujo renal sanguíneo. El eje vertical de la gráfica es una escala de creatinina (\mumoles/l).

La Figura 2 es una tabla que muestra el efecto de OP-1 en los niveles de creatinina y en los parámetros hemodinámicos en ratas en las que se perjudicó la función renal por administración de norepinefrina.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Con el fin de señalar más clara y concisamente el presente problema de la invención reivindicada, se proporcionan las siguientes definiciones para términos específicos usados en la siguiente descripción escrita y reivindicaciones adjuntas.

Insuficiencia renal aguda. La insuficiencia renal aguda típicamente se define como un rápido deterioro de la función renal, suficiente para dar como resultado la acumulación de residuos nitrogenados en el cuerpo (véase, por ejemplo, Anderson and Schrier (1994), en Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York). Son típicas en la insuficiencia renal aguda tasas de aumento del BUN de al menos 4 a 8 mmol/l/día (10 a 20 mg/dl/día), y tasas de aumento de la creatinina en el suero de al menos 40 a 80 \mumoles/l/día (0,5 a 1,0 mg/dl/día). En sujetos que son catabólicos (o hipercatabólicos), las tasas de aumento de BUN pueden superar 100 mg/dl/día. Las tasas de aumento de BUN o creatinina en el suero normalmente se determinan por análisis de sangre seriados, y preferiblemente, se llevan a cabo al menos dos análisis de sangre en un periodo entre 6 y 72 horas, o más preferiblemente, 12 y 24 horas. A veces se distingue entre insuficiencia renal "aguda" (deterioro en un periodo de días) e insuficiencia renal "rápidamente progresiva" (deterioro en un periodo de semanas). Sin embargo, como se usa en la presente memoria, la frase "insuficiencia renal aguda" se pretende que abarque ambos síndromes.

Causas prerrenales de la insuficiencia renal aguda. Tal como se usa en la presente memoria, entre las causas prerrenales de la insuficiencia renal aguda se incluyen la menor capacidad cardiaca, hipovolemia, redistribución de volumen y resistencia vascular alterada.

Causas postrenales de la insuficiencia renal aguda. Tal como se usa en la presente memoria, entre las causas postrenales de insuficiencia renal aguda se incluyen obstrucciones uretral, pélvica y de la vejiga. Por ejemplo, los coágulos sanguíneos y piedras en el riñón pueden producir obstrucciones de los uréteres o vejiga. Las obstrucciones también pueden surgir de papilas desprendidas y acúmulos de hongos. Las obstrucciones extrínsecas pueden resultar, por ejemplo, de tumores malignos o hipertrofias (por ejemplo, carcinoma prostático o de vejiga), fibrosis retroperitoneal, o causas iatrogénicas (por ejemplo, ligadura involuntaria). Las constricciones uretrales o fimosis también pueden producir insuficiencia renal aguda prerrenal.

Causas renales intrínsecas de la insuficiencia renal aguda. Tal como se usa en la presente memoria, entre las causas renales intrínsecas de la insuficiencia renal aguda se incluyen:

(1) Anomalías de la vasculatura tales como enfermedad vasoconstrictora (por ejemplo, hipertensión maligna, esclerodermia, síndrome urémico hemolítico, púrpura trombocitopénica trombótica) y vasculitis (por ejemplo, poliarteritis nodosa, angeítis por hipersensibilidad, enfermedad del suero, granulomatosis de Wegner, arteritis de células gigantes, crioglobulinemia mixta, púrpura de Henoch-Schönlein, lupus eritematoso sistémico);

(2) Anomalías de los glomérulos tales como anomalías postinfección (por ejemplo post-estreptocócicas, neumocócicas, gonocócicas, estafilocócicas, enterocócicas, víricas (por ejemplo, hepatitis B y C, paperas, sarampión, Epstein-Barr], malaria, o relacionadas con la brucelosis, Legionella, Listeria, nefritis por derivación, lepra, leptospirosis, o abscesos viscerales) y anomalías no infecciosas (por ejemplo, glomerulonefritis progresiva rápida, glomerulonefritis membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, lupus eritematoso sistémico, granulomatosis de Wegner);

(3) Nefritis intersticial aguda resultante de causas relacionadas con fármacos (por ejemplo, penicilinas, sulfonamidas, carbenicilina, cefalosporina, eritromicina, nafcilina, oxacilina, agentes antiinflamatorios no esteroideos, diuréticos [furosemida, ácido etacrínico, tiazida, espironolactona, mercuriales], fenitoina, fenobarbital, probenicid, alopurinol, cimetidina), causas relacionadas con infección (por ejemplo, pielonefritis aguda, infección estreptocócica, estafilocócica, leptospirosis, malaria, salmonelosis), necrosis papilar (por ejemplo, asociada con diabetes mellitus, enfermedades drepanocíticas, abuso de analgésicos, alcoholismo), y otras causas variadas (por ejemplo, sarcoidosis, leucemia, linfoma);

(4) Obstrucción intratubular por deposición de cristales (por ejemplo, ácido úrico, oxalato, metotrexato), o mieloma múltiple y enfermedad de las cadenas ligeras; y

(5) Necrosis tubular aguda que resulta de nefrotoxinas (por ejemplo, antimicrobianos tales como aminoglicósidos, tetraciclinas, amfotericina, polimixina, cefalosporinas), metales pesados (por ejemplo, mercurio, plomo, arsénico, sales de oro, bario), y otros agentes químicos variados (por ejemplo, cisplatino, doxorrubicina, estreptomicina, metoxiflurano, halotano, etilenglicol, tetracloruro de carbono), o de isquemia (por ejemplo, hemorragia, hipotensión, sepsis, quemaduras, infarto renal, disección de la arteria renal, rabdomiolisis, traumatismo), u otras causas variadas (por ejemplo, agentes de contraste, reacciones de transfusión, mioglobinemia, ataque por calor, picaduras de serpiente y araña).

Entre otras enfermedades y estados que ponen al sujeto en riesgo de insuficiencia renal aguda, se incluyen: cirugía de transplante de riñón (como donante o receptor), oclusión arterial bilateral, trombosis venosa renal aguda bilateral, nefropatía aguda por ácido úrico, hipovolemia, colapso cardiovascular, obstrucción aguda del tracto superior bilateral, nefropatía hipercalcémica, síndrome urémico hemolítico, retención urinaria aguda, nefroesclerosis maligna, crioinmunoglobulinemia mixta esencial, nefropatía por oxalato, necrosis cortical, glomeruloesclerosis posparto, nefropatía por hipersensibilidad, esclerodermia, glomerulonefritis idiopática rápidamente progresiva, síndrome de Goodpasture, enfermedad anti-GBM no Goodpasture, endocarditis bacteriana aguda o sepsis visceral, poliarteritis nodosa microscópica, granulomatosis de Wegner, granulomatosis alérgica, nefritis aguda por radiación, glomerulonefritis postestreptocócica, glomerulonefritis postinfección no estreptocócica, nefritis proliferativa difusa debida a lupus, glomerulonefritis membranoproliferativa, trombosis venosa renal, macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, nefropatía de Berger (IgA), púrpura de Henoch-Scönlein, y glomeruloesclerosis focal.

Agente terapéutico renal OP/BMP. Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "agente terapéutico renal OP/BMP", "agente terapéutico renal de la invención", y similares, significan un polipéptido o una variante funcional de un polipéptido, que comprende al menos el dominio C-terminal de seis o siete cisteínas de una proteína de mamífero seleccionada del grupo que consiste en OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, y proteínas que presentan al menos 70%, o más preferiblemente 75% u 80% de homología de la secuencia de aminoácidos, con la secuencia de aminoácido del dominio de siete cisteínas de OP-1 humana; y que es (a) capaz de inducir condrogénesis en el ensayo óseo ectópico de Reddi-Sampath (Sampath and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603) o un ensayo sustancialmente equivalente, (b) capaz de prevenir, inhibir, retrasar o aliviar significativamente la pérdida progresiva o permanente de la función renal, que puede resultar de la insuficiencia renal aguda en un modelo animal patrón de insuficiencia renal aguda, o (c) capaz de producir una mejora clínicamente significativa en un marcador patrón de la función renal cuando se administra a un mamífero con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda.

Eficacia terapéutica. Tal como se usa en la presente memoria, se dice que un agente terapéutico renal de la invención tiene "eficacia terapéutica", y se dice que una cantidad del agente es "terapéuticamente eficaz", si la administración de esta cantidad del agente es suficiente para producir una mejora clínicamente significativa en un marcador patrón de la función renal, cuando se administra a un sujeto mamífero (por ejemplo, un paciente humano) con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda. Dichos marcadores de la función renal son conocidos en la bibliografía médica, e incluyen, sin estar limitados, tasas de aumento de los niveles de BUN, tasas de aumento de la creatinina en el suero, mediciones estáticas de BUN, mediciones estáticas de creatinina en el suero, tasas de filtración glomerular (TFG), relaciones de BUN/creatinina, concentración de sodio (Na+) en el suero, relaciones de creatinina en orina/plasma, relaciones de urea en orina/plasma, osmolalidad de la orina, excreción diaria de orina, y similares (véase, por ejemplo, Anderson and Schrier (1994), en Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York; Kumar and Stein (1994), en Internal Medicine, 4th Edition, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis).

II. Realizaciones de la invención A. General

La presente invención depende, en parte, del sorprendente descubrimiento de que el uso terapéutico de ciertos agentes terapéuticos renales basados en proteínas en sujetos con insuficiencia renal aguda, o con riesgo de insuficiencia renal aguda, puede reducir las tasas de mortalidad y/o morbosidad, y prevenir, inhibir, retrasar o aliviar la pérdida permanente y/o progresiva de la función renal asociada con la insuficiencia renal aguda. La presente invención es particularmente sorprendente a la luz del hecho de que los agentes de la presente invención son proteínas, considerando que los regímenes de tratamiento patrón para la insuficiencia renal aguda incluyen la limitación de la ingestión de proteínas para reducir la tensión en los riñones. En realizaciones preferidas, los agentes terapéuticos renales de la invención son miembros de la familia de las proteínas osteogénicas/proteínas morfogenéticas óseas (OP/BMP) dentro de la superfamilia de TGF-\beta de proteínas.

B. Agentes terapéuticos renales OP/BMP

Los agentes terapéuticos renales de la presente invención son proteínas naturales, o variantes funcionales de proteínas naturales, de la familia de las proteínas osteogénicas/proteínas morfogenéticas óseas (OP/BMP) dentro de la superfamilia de proteínas de TGF-\beta. Es decir, estas proteínas forman un subgrupo diferente, denominado en la presente memoria la "familia OP/BMP" dentro del amplio agrupamiento evolutivo de proteínas relacionadas por la secuencia conocidas como superfamilia TGF-\beta. Los miembros de esta familia de proteínas comprenden polipéptidos secretados que comparten características estructurales comunes, y que son procesados de la misma forma a partir de una proproteína para dar una proteína madura carboxi-terminal. Dentro de la proteína madura, todos los miembros comparten un patrón conservado de seis o siete restos de cisteína que definen un dominio de 97-106 aminoácidos, y la forma activa de estas proteínas es un homodímero unido por disulfuro de un solo miembro de la familia, o un heterodímero de dos miembros diferentes (véase, por ejemplo, Massague (1990), Annu. Rev. Cell. Biol. 6:597; Sampath et al. (1990), J. Biol. Chem. 265:13198). Por ejemplo, en su forma madura, nativa, la OP-1 humana de fuente natural es un dímero glicosilado que típicamente tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30-36 kDa, determinado por SDS-PAGE. Cuando se reduce, la proteína de 30 kDa da lugar a dos subunidades peptídicas glicosiladas que tienen pesos moleculares aparentes de aproximadamente 16 kDa y 18 kDa. La proteína no glicosilada tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 27 kDa. Cuando se reduce, la proteína de 27 kDa da lugar a dos cadenas polipeptídicas no glicosiladas, que tienen peso moleculares de aproximadamente 14 kDa a 16 kDa.

Típicamente, las proteínas OP/BMP naturales son traducidas en forma de un precursor que tiene una secuencia peptídica señal N-terminal, un dominio "pro" y un dominio de proteína "madura". El péptido señal típicamente tiene menos de 30 restos, y es escindido rápidamente tras la traducción, en un sitio de escisión que se puede predecir usando el método de Von Heijne (1986), Nucleic Acids Research 14:4683-4691. El dominio "pro" es variable tanto en secuencia como en longitud, estando en el intervalo de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 restos. El dominio pro se escinde para dar el dominio C-terminal maduro de aproximadamente 115-180 restos, que incluye el dominio C-terminal de seis o siete cisteínas conservado de 97-106 restos. Tal como se usa en la presente memoria, la "forma pro" de un miembro de la familia OP/BMP se refiere a una proteína que comprende un par de polipéptidos plegados, comprendiendo cada uno un dominio pro asociado covalente o no covalentemente a los dominios maduros del polipéptido OP/BMP. Típicamente, la forma pro de la proteínas es más soluble que la forma madura en condiciones fisiológicas. Parece que la forma pro es la forma principal secretada por las células de mamífero cultivadas. La "forma madura" de la proteína se refiere al dominio C-terminal maduro que no está asociado, covalente o no covalentemente, con el dominio pro. Se considera que cualquier preparación de OP-1 contiene la forma madura cuando la cantidad de dominio pro en la preparación no es mayor que 5% de la cantidad del dominio C-terminal "maduro".

Los miembros de la familia OP/BMP útiles en la presente memoria, incluyen cualquiera de las proteína nativas naturales conocidas, incluyendo equivalentes alélicos, filogenéticos y otras de sus variantes, sean de fuentes naturales o producidas por biosíntesis (por ejemplo, incluyendo "muteínas" o "proteínas mutantes"), así como nuevos miembros activos de la familia de proteínas OP/BMP.

Entre las secuencias particularmente útiles se incluyen las que comprenden los dominios de siete cisteínas C-terminales de OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP8 y BMP9 de mamíferos, preferiblemente ser humano. Entre otras proteínas útiles en la práctica de la invención se incluyen formas activas de GDF-5, GDF-6, GDF-7, DPP, Vg1, Vgr-1, 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP o NURAL y sus variantes de secuencias de aminoácidos. En una realización actualmente preferida, los agentes terapéuticos renales de la invención se seleccionan de uno cualquiera de OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, y BMP9.

Entre las publicaciones que describen estas secuencias, así como sus propiedades químicas y físicas, se incluyen: OP-1 y OP-2: patente de EE.UU. nº 5.011.691, patente de EE.UU. nº 5.266.683, y Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9:2085-2093; OP-3: WO94/10203; BMP2, BMP3, y BMP4: patente de EE.UU. nº 5.013.649. W091/18098. WO88/00205. y Wozney et al. (1988), Science 242:1528-1534; BMP5 y BMP6: WO90/11366 y Celeste et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:9843-9847; Vgr-1: Lyons et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 4554-4558: DPP: Padgett et al. (1987), Nature 325:81-84; Vgl: Weeks (1987), Cell 51:861-867; BMP-9: WO95/33830; BMP10: WO94/26893; BMP-11: WO94/26892; BMP12: WO95/16035; BMP-13: WO95/16035; GDF-1: WO92/00382 y Lee et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:4250-4254; GDF-8: WO94/21681; GDF-9: WO94/15966; GDF-10: WO95/10539; GDF-11: WO96/01845; BMP-15: WO96/36710; MP121: WO96/01316; GDF-5 (CDMP-1, MP52): WO94/15949, WO96/14335, WO93/16099 y Storm et al. (1994), Nature 368:639-643; GDF-6 (CDMP-2, BMP13): WO95/01801, WO96/14335 y WO95/10635; GDF-7 (CDMP-3, BMP12): WO95/10802 y WO95/10635; BMP-3b: Takao, et al. (1996), Biochem. Biophys. Res. Comm. 219:656-662; GDF-3: WO94/15965; 60A: Blaster et al. (1993), Cell 73:687-702, y número de acceso de GenBank L12032. En otra realización, entre las proteínas útiles se incluyen construcciones biosintéticas biológicamente activas, incluyendo proteínas biosintéticas y proteínas quiméricas diseñadas usando secuencias de dos o más proteínas de la familia OP/BMP conocidas. Véase también las construcciones biosintéticas descritas en la patente de EE.UU. nº 5.011.691, cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia (por ejemplo, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, y COP-16).

En otras realizaciones preferidas, los agentes terapéuticos renales útiles en la presente memoria incluyen proteínas terapéuticamente eficaces en las que las secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia que comparte al menos 70% de "homología" de la secuencia de aminoácidos, y preferiblemente 75% u 80% de homología con el dominio de siete cisteínas C-terminal en las formas activas de OP-1 humana (es decir, restos 330-431, como se muestra en el SEQ ID NO:2 de la patente de EE.UU. nº 5.266.683). En otras realizaciones preferidas, los agentes terapéuticos renales útiles en la presente memoria incluyen proteínas terapéuticamente eficaces en las que las secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia que comparte al menos 60% de identidad de la secuencia de aminoácidos, y preferiblemente, 65% o 70% de identidad con el dominio de siete cisteínas C-terminal presente en las formas activas de OP-1 humana. Como comprenderán los expertos en la técnica, las secuencias homólogas o funcionalmente equivalentes incluyen disposiciones funcionalmente equivalentes de los restos de cisteína en el esqueleto de cisteína conservado, incluyendo inserciones o eliminaciones de aminoácidos que alteran la disposición lineal de estas cisteínas, pero no afectan materialmente a su relación en la estructura plegada de la proteína dimérica, incluyendo su capacidad para formar dichos enlaces de disulfuro intra- o intercadenas, según sea necesario para la actividad biológica. Para determinar el grado de homología de una secuencia de aminoácidos candidata con el esqueleto de siete cisteínas C-terminal de OP-1 humana, la secuencia candidato y la secuencia de referencia, primero se alinean usando un algoritmo de alineación, tal como el algoritmo de programación dinámico descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443 (1970), o el Programa Align, un paquete de software comercial producido por DNAstar, Inc. Después de hacer la alineación inicial, se puede refinar por comparación con las secuencias de otros miembros de la familia OP/BMP de proteínas relacionadas. Una vez que se ha hecho y refinado la alineación entre las secuencias candidato y de referencia, se calcula una puntuación de porcentaje de homología. Se comparan los aminoácidos individuales de cada secuencia secuencialmente de acuerdo con las similitudes entre sí. Entre los factores similares se incluyen tamaño, forma y carga eléctrica similar. Un método particularmente preferido para determinar similitudes de aminoácidos es la matriz PAM250 descrita por Dayhoff et al., (1978), Atlas of Protein Sequence and Sructure Vol 5 (Suppl. 3), pp. 354-352, Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.C. Primero se calcula una puntuación de similitud como la suma de las puntuaciones de similitudes de aminoácidos alineados a pares. Se ignoran las inserciones y supresiones para los propósitos de porcentaje de homología e identidad. De acuerdo con esto, en este cálculo no se usan las penalizaciones por huecos. Después la puntuación bruta se normaliza dividiéndola por la media geométrica de las puntuaciones del compuesto candidato y el esqueleto de siete cisteínas de hOP-1. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de esas puntuaciones. La puntuación bruta normalizada es el porcentaje de homología.

Por lo tanto, en la presente memoria se entiende que "homología" de la secuencia de aminoácidos incluye tanto identidad como similitud de la secuencia de aminoácidos, y tal como se usa en la presente memoria, un porcentaje de "homología" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de restos de aminoácidos que son idénticos o similares entre las secuencias. Los restos "similares" son "sustituciones conservativas" que cumplen los criterios definidos por una "mutación puntual aceptada" por Dayhoff et al. (1978), véase antes. Por lo tanto, "sustituciones conservativas" son restos que son física o funcionalmente similares a los correspondientes restos de referencia, que tienen similar tamaño, forma, carga eléctrica y/o propiedades químicas tales como la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Entre los ejemplos de sustituciones conservativas se incluye la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina. La expresión "sustitución conservativa" o "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido pariente no sustituido en una cadena de polipéptido dada, con la condición de que la cadena de polipéptido sustituida resultante tenga también eficacia terapéutica en la presente invención.

Los agentes terapéuticos renales de la invención también se caracterizan por las actividades biológicas que pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica. Específicamente, un agente terapéutico renal de la presente invención es (a) capaz de inducir condrogénesis en el ensayo óseo ectópico de Reddi-Sampath (Sampath and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603) o un ensayo sustancialmente equivalente, (b) capaz de prevenir, inhibir, retrasar o aliviar significativamente la pérdida progresiva o permanente de la función renal, que puede resultar de la insuficiencia renal aguda, en un modelo animal patrón de insuficiencia renal aguda, o (c) capaz de producir una mejora clínicamente significativa en un marcador patrón de función renal cuando se administra a un mamífero con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda.

El ensayo óseo ectópico de Reddi-Sampath es conocido en la técnica como un ensayo de la actividad condrogénica. El ensayo, que se puede llevar a cabo fácilmente, es descrito y discutido, por ejemplo, por Sampath and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603; y Wozney (1989), "Bone Morphogenetic Proteins," Progress in Growth Factor Research 1:267-280. Los expertos en la técnica pueden usar o desarrollar muchos ensayos equivalentes, usando otros animales y tejidos, para evaluar la actividad biológica de los agentes terapéuticos renales de la presente invención. Véase, por ejemplo, los bioensayos descritos en la patente de EE.UU. nº 5.266.683.

Los agentes terapéuticos renales de la presente invención también se pueden ensayar en modelos animales de insuficiencia renal aguda. Los modelos de mamíferos de insuficiencia renal aguda, por ejemplo, en ratones, ratas, cobayos, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, vacas, caballos, y primates no humanos, se pueden crear produciendo una lesión o ataque directo o indirecto adecuado a los tejidos renales del animal. Los modelos animales de insuficiencia renal aguda, se pueden crear, por ejemplo, induciendo en el animal los estados o enfermedades descritos antes, poniendo a un sujeto "en riesgo" de insuficiencia renal aguda. En realizaciones particularmente preferidas, se usa un modelo animal en el que la insuficiencia renal aguda es inducida por la administración controlada de agentes nefrotóxicos (por ejemplo, cisplatino, antibióticos aminoglicósidos, metales pesados).

Finalmente, se puede evaluar la eficacia terapéutica de los agentes terapéuticos renales de la presente invención produciendo una mejora clínicamente significativa en un marcador patrón de función renal cuando se administra a un sujeto mamífero (por ejemplo, un paciente humano) con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda. Dichos marcadores de la función renal son conocidos en la bibliografía médica, e incluyen, sin estar limitados, tasas de aumento de los niveles de BUN, tasas de aumento de la creatinina en el suero, mediciones estáticas de BUN, mediciones estáticas de creatinina en el suero, tasas de filtración glomerular (TFG), relaciones de BUN/creatinina, concentración de sodio (Na+) en el suero, relaciones de creatinina en orina/plasma, relaciones de urea en orina/plasma, osmolalidad de la orina, excreción diaria de orina, y similares (véase, por ejemplo, Anderson and Schrier (1994), en Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York; Kumar and Stein (1994), en Internal Medicine, 4th Edition, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis).

Los agentes terapéuticos renales contemplados en la presente memoria pueden ser expresados a partir de DNA genómico intacto o truncado, o ADNc o a partir de ADN sintéticos en células hospedantes procariotas o eucariotas. Las proteínas dímeras se pueden aislar de los medios de cultivo y/o volver a plegar y dimerizar in vitro para formar composiciones biológicamente activas. Los heterodímeros se pueden formar in vitro combinando cadenas de polipéptidos distintas, separadas. Alternativamente, los heterodímeros se pueden formar en una sola célula coexpresando ácidos nucleicos que codifican cadenas de polipéptidos distintas, separadas. Véase, por ejemplo, el documento WO93/09229, o la patente de EE.UU. nº 5.411.941, para varios protocolos de producción de proteínas heterodímeras recombinantes de ejemplo. Entre las células hospedantes actualmente preferidas se incluyen, sin limitación, procariotas incluyendo E. coli, o eucariotas incluyendo levaduras, Saccharomyces, células de insecto, o células de mamíferos, tales como células CHO, COS o BSC. Un experto en la técnica entenderá que se pueden usar ventajosamente otras células hospedantes. Se describen descripciones detalladas de las proteínas útiles en la práctica de esta invención, incluyendo como hacerlas, usarlas y ensayar su actividad condrogénica, en numerosas publicaciones, incluyendo las patentes de EE.UU. nº 5.266.683, y 5.011.691.

C. Sujetos adecuados para tratamiento

En general, los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden usar para fabricar un medicamento para tratar a cualquier sujeto humano con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda. Dichos sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan, sujetos o pacientes humanos. Sin embargo, además, los agentes terapéuticos se pueden usar para fabricar un medicamento para tratar mamíferos domesticados que se tienen como compañeros del ser humano (por ejemplo, perros, gatos, caballos), que tienen valor comercial significativo (por ejemplo, vacas lecheras, ganado vacuno, animales deportivos), que tienen valor científico significativo (por ejemplo, ejemplares cautivos o libres de especies en peligro de extinción), o que tienen valor de otra forma. Además, en general, no es necesario que los sujetos adecuados para el tratamiento con los agentes terapéuticos de la presente invención, presenten indicaciones para el tratamiento con los agentes de la invención distintos de los asociados a la insuficiencia renal aguda o riesgo de insuficiencia renal aguda. Es decir, los sujetos para el tratamiento pueden no tener indicaciones para el tratamiento con los agentes de la invención. Sin embargo, en una serie de casos, los sujetos pueden presentar otros síntomas (por ejemplo, osteodistrofia) para los cuales estaría indicado el tratamiento con el agente terapéutico renal. En dichos casos, el tratamiento con el agente terapéutico renal se debería ajustar en concordancia para evitar la dosificación excesiva.

Un experto en la técnica médica o veterinaria está preparado para reconocer sujetos con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda, y se ha desarrollado una bibliografía científica detallada en torno al tema. Véase, por ejemplo, Anderson and Schrier (1994), en Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York; Kumar and Stein (1994), en Internal Medicine, 4th Edition, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.

Preferiblemente, un diagnóstico de que un sujeto tiene insuficiencia renal aguda, o tiene riesgo de entrar en insuficiencia renal aguda, se hace basándose en análisis de sangre seriados que miden, entre otros factores, los niveles en la circulación de creatinina en el suero y de nitrógeno ureico sanguíneo. Dichos análisis de sangre "seriados" se pueden tomar cada pocas horas inmediatamente después de ingreso de un paciente no diagnosticado que presenta síntomas de insuficiencia renal aguda. Sin embargo, más típicamente, los análisis de sangre seriados consecutivos se separan por un periodo de al menos 6 horas, no más de 72 horas, y preferiblemente 12-24 horas. Basándose en dos o más análisis de sangre en un periodo de 24 ó 72 horas, se puede calcular una tasa de aumento de creatinina en el suero o BUN.

Finalmente, hay que indicar que los sujetos que tienen un solo riñón, independientemente de la forma en que han perdido el otro riñón (por ejemplo, traumatismo físico, eliminación quirúrgica, defecto de nacimiento), se puede considerar que tienen mayor riesgo de insuficiencia renal aguda. Esto es particularmente cierto para los sujetos que han perdido un riñón debido a una enfermedad o estado que puede afectar al riñón que queda. Igualmente, los sujetos que ya son receptores de un transplante renal, o que están recibiendo diálisis crónica (por ejemplo, hemodiálisis crónica o diálisis peritoneal ambulatoria continua) se puede considerar que tienen mayor riesgo de insuficiencia renal aguda. Por lo tanto, para estos sujetos, puede ser necesario controlar más cuidadosamente las indicaciones clínicas antes discutidas, y puede ser aconsejable una intervención más temprana o más agresiva con el tratamiento del agente terapéutico renal.

En otro aspecto, los agentes terapéuticos renales OP/BMP de la invención son útiles para inhibir la apoptosis de células en tejidos dañados o lesionados. Esto también se demuestra en el siguiente Ejemplo 3, en el que se ve que la OP-1 administrada sistémicamente reduce el número de células apoptóticas en un modelo de IRA de lesión por isquemia-reperfusión en rata. Por lo tanto, se muestra que los agentes terapéuticos OP/BMP son útiles para inhibir la apoptosis de tejidos epiteliales dañados o lesionados, particularmente del epitelio renal.

D. Formulaciones y usos terapéuticos

Los agentes terapéuticos renales de la presente invención son adecuados para administrar por cualquier vía que sea compatible con el agente terapéutico renal particular usado. Por lo tanto, según sea adecuado, la administración puede ser oral o parenteral, incluyendo vías de administración intravenosa, intraperitoneal e intracapsular renal. Además, la administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo del agente terapéutico, o se puede hacer más continua por administración intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa i.v.) o interno (por ejemplo, un implante biodegradable o bomba implantada).

Los agentes terapéuticos renales de la invención son adecuados para administrar a un individuo por cualquier medio adecuado, preferiblemente directamente (por ejemplo, administración local, por inyección o tópica, a un sitio del tejido) o sistémicamente (por ejemplo, por vía parenteral u oral). Cuando el agente se va a proporcionar por vía parenteral, tal como por administración intravenosa, subcutánea, o intramuscular, el agente preferiblemente comprende parte de una solución acuosa. La solución es fisiológicamente aceptable, de modo que además de suministrar el agente deseado al sujeto, la solución no afecta adversamente al equilibrio de electrolitos y/o volumen del sujeto. Así, el medio acuoso para el agente puede comprender solución salina fisiológica normal (por ejemplo, NaCl al 9,85%, 0,15 M, pH 7-7,4).

Si se desea, un agente terapéutico renal dado u otro agente se puede hacer más soluble por asociación con una molécula adecuada. Por ejemplo, la asociación de un dímero de OP/BMP maduro con un dominio pro de OP/BMP da como resultado la forma pro del agente terapéutico renal, que típicamente es más soluble o dispersable en soluciones fisiológicas que la correspondiente forma madura. De hecho, se cree que los miembros endógenos de la familia OP/BMP son transportados (por ejemplo, secretados y circulan) en el cuerpo del mamífero de esta forma. Esta forma soluble de la proteína se puede obtener del medio de cultivo de células de mamífero que secretan OP/BMP, por ejemplo, células transfectadas con ácido nucleico que codifica y es competente para expresar la proteína. Alternativamente, se puede formular una especie soluble formando complejo del dímero maduro (o uno de sus fragmentos activos) con un dominio pro o uno de sus fragmentos que potencian la solubilidad (descrito de forma más completa a continuación). Otra molécula capaz de potenciar la solubilidad y particularmente útil para administraciones orales, es la caseína. Por ejemplo, la adición de caseína al 0,2% aumenta la solubilidad de la forma activa madura de OP-1 en 80%. También pueden ser útiles otros componentes encontrados en la leche y/o diferentes proteínas del suero.

Se pueden preparar soluciones útiles para administración parenteral por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica, descritos por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990.

Alternativamente, los agentes descritos en la presente memoria son adecuados para administrar por vía oral. La administración oral de proteínas como productos terapéuticos, en general no se practica ya que la mayoría de las proteínas son degradadas rápidamente por enzimas digestivas y ácidos en el sistema digestivo del mamífero, antes de que puedan ser absorbidas en la corriente sanguínea. Sin embargo, los agentes terapéuticos renales descritos en la presente memoria típicamente son estables frente a ácidos y resistentes a las proteasas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.968.590). Además, al menos uno de esos agentes terapéuticos renales, OP-1, se ha identificado en extracto de glándula mamaria, calostro y leche de 57 días. Además, la OP-1 purificada de extracto de glándula mamaria es terapéuticamente eficaz y también se detecta en la corriente sanguínea. Finalmente, la forma soluble de OP-1, por ejemplo, OP-1 madura asociada con el dominio pro, es terapéuticamente eficaz. Estos descubrimientos, así como los descritos en los siguientes ejemplos, indican que la administración oral y parenteral son medios viables para administrar los agentes terapéuticos renales de la invención a un individuo. Además, mientras que las formas maduras de algunos agentes terapéuticos renales descritos en la presente memoria típicamente son muy poco solubles, la forma encontrada en la leche (y extracto de glándula mamaria y calostro) es fácilmente soluble, probablemente por asociación de la forma madura terapéuticamente eficaz, con parte o todo el dominio pro de la secuencia intacta y/o por asociación con uno o más componentes de la leche. De acuerdo con esto, los compuestos proporcionados en la presente memoria, también se pueden asociar con moléculas capaces de potenciar sus solubilidad in vitro o in vivo.

Los compuestos proporcionados en la presente memoria también se pueden asociar con moléculas capaces de dirigir el agente terapéutico renal al tejido deseado. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, u otra proteína de unión que interacciona específicamente con una molécula de la superficie de las células del tejido deseado. Se pueden diseñar moléculas directoras útiles, por ejemplo, usando la tecnología de sitio de unión de la cadena sencilla descrita, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.091.513.

Como entenderán los expertos en la técnica, las composiciones formuladas contienen cantidades terapéuticamente eficaces del agente terapéutico renal. Es decir, contienen cantidades que proporcionan concentraciones adecuadas del agente a los tejidos renales durante un tiempo suficiente para prevenir, inhibir, retrasar o aliviar la pérdida permanente o progresiva de la función renal, o proporcionar eficacia terapéutica de otra forma. Como entenderán los expertos en la técnica, la concentración de los compuestos descritos en una composición terapéutica de la presente invención, variará dependiendo de una serie de factores, incluyendo la eficacia biológica del agente seleccionado, las características químicas (por ejemplo, hidrofobicidad) de los compuestos usados, la formulación de los excipientes del compuesto, la vía de administración, y del tratamiento previsto incluyendo si el ingrediente activo se va a administrar directamente en el riñón o cápsula renal, o si se va a administrar sistémicamente. La dosificación preferida que se va a administrar es probable que también dependa de variables tales como el estado de los tejidos renales, la extensión de la pérdida de función renal, y el estado de salud global del sujeto particular. Las dosificaciones se administran preferiblemente de forma continua, pero también se pueden administrar dosificaciones diarias, multisemanales, semanales o mensuales. Para sujetos que a parte de esto necesitarán sesiones de hemodiálisis, continua, bisemanal o trisemanal, no se consideran demasiado inconvenientes infusiones intravenosas o intraperitoneales continuas, bisemanales o trisemanales. Además, con el fin de facilitar las infusiones frecuentes, puede ser aconsejable la implantación de un stent semipermanente (por ejemplo, intravenoso, intraperitoneal o intramuscular).

Los agentes terapéuticos renales de la invención son adecuados para administrar solos o combinados con otras moléculas que se sabe que son beneficiosas para el tratamiento de los estados descritos en la presente memoria. Cuando se usan combinados con otros agentes, puede ser aconsejable alterar en consecuencia las dosificaciones de los agentes terapéuticos renales de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso de agentes terapéuticos renales OP/BMP de la invención en la fabricación de medicamentos para tratar cualquiera de los estados antes descrito.

La práctica de la invención, incluyendo sus aspectos y realizaciones adicionales preferidos, se entenderá todavía mejor con los siguientes ejemplos, que se presentan en la presente memoria sólo para ilustrar y no se deben considerar limitantes de la invención de ninguna forma.

Ejemplo 1

Para examinar la capacidad de OP-1 para afectar beneficiosamente el curso de la función renal después de un ataque isquémico agudo del riñón, se examinó el efecto de OP-1 en los niveles de creatinina en ratas en las que se indujo daño isquémico renal evitando temporalmente el flujo sanguíneo renal. En este sistema modelo, se presionan con pinza ambas arterias renales durante 60 minutos. Se administran 0,25 \mug/kg de OP-1 en la vena de la cola en los cuatro tiempos siguientes: 10 minutos antes de presionar con la pinza la arteria, después otra 24, 48 y 72 horas después de la lesión isquémica. Como se muestra en la Figura 1, el nivel de creatinina de las ratas tratadas con placebo aumenta rápidamente después de la lesión, llega al máximo en la medición de 24 horas, y vuelve al nivel normal 18 días después de la lesión. En contraste, el tratamiento con OP-1 está asociado con un nivel de creatinina que llega al máximo en la medición de 24 horas con un nivel sólo la mitad que el del grupo del placebo, después del cual empieza a disminuir. En cada uno de los cuatro días después de lesión en los que se hicieron mediciones, el nivel de creatinina de las ratas tratadas con placebo era al menos el doble de alto que el de los animales tratados con OP-1. Estos resultados indican que la OP-1 puede limitar el daño causado al tejido renal por un ataque isquémico, y también puede acelerar la recuperación funcional del riñón.

Ejemplo 2

Para estudiar el efecto del tratamiento de OP-1 después de lesión en la función renal en otro modelo animal de insuficiencia renal, se trataron ratas con un solo riñón con OP-1, 2 días después del daño renal inducido por norepinefrina. En el sistema modelo (descrito con más detalle por Conger et al., Kidney Intl, 40:21-28, 1991), a cada rata se le ha quitado un riñón 7 días antes de la lesión renal, que es inducida por infusión intraarterial de norepinefrina durante 90 minutos. Dos días después de la administración de norepinefrina, se administran 0,25 mg/kg de OP-1 por vía intravenosa.

La tabla superior de la Figura 2 presenta los niveles de creatinina de las ratas tratadas con vehículo y con OP-1. El cuarto día después de la lesión, los animales que se habían tratado con OP-1 el segundo día después de la lesión, tenían niveles de creatinina que eran significativamente inferiores que los niveles de los testigos tratados con vehículo. Los datos presentados en la tabla inferior de la Figura 2 muestran que el tratamiento con OP-1 también estaba asociado con mejoras en el flujo sanguíneo renal, TFG, y flujo de orina comparado con los testigos.

Ejemplo 3

Se llevaron a cabo experimentos adicionales usando una lesión por isquemia-reperfusión como modelo de insuficiencia renal aguda en ratas, como sigue:

Procedimientos quirúrgicos en los animales y protocolos experimentales

Se dejaron en ayunas ratas macho Wistar de 200-250 g (Pilva Breeding Laboratory, Zagreb, Croacia) durante 12 h antes de la cirugía. Después de administración intraperitoneal del anestésico ketamina (20 mg/kg), se ocluyeron dorsalmente ambas arterias renales durante 60 minutos con pinzas de microaneurisma (Roboz). Se administró por la vena de la cola tampón vehículo o tampón de acetato sódico 20 mM que contenía OP-1 (500 \mul). Todos los animales se sometieron a administración intraperitoneal de 1-3 ml de solución salina (NaCl al 0,9%) previamente calentada (37ºC) para compensar cualquier pérdida de líquidos durante la cirugía. Los experimentos eran ciegos, y se puso fin a las ratas en diferentes intervalos de tiempo desde 30 min a 18 días. Se obtuvieron muestras de sangre (0,5 ml) del plexo orbital 0 h, 24 h, 48 h, y 72 h, y en algunos casos, 30 min, 2 h, 8 h, y 96 h, y 18 días después de reperfusión. Para las mediciones de TFG, se recogió orina de las jaulas metabólicas durante 24 h como se ha descrito previamente (Vukicevic et al. (1989) Bone Miner. 6:125-39). La creatinina en el suero y la orina se midieron por el método de Jaffe (Whelton et al. (1994) en Clinical Chemistry, Burtis and Ashwood, eds., Amer. Assn. Clin. Chem.), el nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) se midió por el procedimiento de la glutamato-deshirogenasa UV, el fósforo se midió por un método con molibdato, y el calcio se midió por un método con o-cresolftaleína. Los electrolitos en el suero se midieron por potenciometría indirecta. Se llevaron a cabo quince experimentos independientes con un total de 456 ratas. En un modelo profiláctico, se administró OP-1, 10 minutos antes de la cirugía y después 24 h, 48 h y 72 h más tarde. En un modelo terapéutico, la primera inyección de OP-1 se administró 1 h o 16 h después de reperfusión, seguido de inyecciones a intervalos de 24 h hasta 96 h después de reperfusión.

Histomorfometría e inmunocitoquímica

Cuando se sacrificaron, cada riñón se dividió longitudinalmente y una mitad se fijó en paraformaldehído al 4%. Se tiñeron dos secciones consecutivas de bloques sumergidos en parafina, con H&E y PAS. Las mediciones morfométricas se hicieron en secciones longitudinales usando una retícula en el ocular que contenía 100 puntos en las líneas de la retícula con un microscopio Nikon (Nikon Optiphot-2; MVI, Avon, MA). La retícula se calibró con un micrómetro con escala y se midió el área de una característica específica por recuento del número de cortes (puntos o aciertos) que se superponían en el tejido de interés. Todos los recuentos se hicieron con una lente del objetivo de 1x. Cada punto o acierto representa un área de 0,61 mm^{2}. La verificación de las características se hizo con un aumento mayor, si no se podía apreciar mediante las lentas del objetivo de 1x.

Las variables morfométricas incluían área total del tejido, área tubular dilatada, área tubular taponada, área infartada, y área necrótica. Un túbulo dilatado se definió como una estructura tubular que tiene el lumen dilatado y células epiteliales identificables. Un túbulo taponado se definió como una estructura tubular que tiene el lumen lleno de residuos y células epiteliales identificables. Un área infartada se definió como una parte o una zona del riñón que muestra perfiles de tejido identificable y pierde detalles celulares, que se tiñó de rosa brillante con colorante H&S, y que se asoció con una congestión regional en la médula externa. Un área necrótica se definió como una parte o una zona del riñón localizada en el área infartada que muestra tanto pérdida de utilidad del tejido como de detalles celulares.

La inmunocitoquímica se llevó a cabo usando el sistema de detección con inmunoperoxidasa (Zymed, San Francisco, CA). Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales: PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular; Dako, Dinamarca), \alpha-actina de músculo liso (SMA) (Dako, Dinamarca), IgG de miosina de músculo liso (BTI, Stoughton, MA) y ICAM (CD 54; Dako, Dinamarca). Se contaron un mínimo de 3000 células por sección de riñón teñidas con PCNA y SMA, y el número de células positivas se expresó como un porcentaje de las células totales contadas en las subdivisiones de la corteza, y/o zona S_{3}.

Se detectaron células apoptóticas por un sistema de apoptosis in situ con TACS 2 TdT (Trevigen, Gaithersburg, MD). Se contó el número total de células apoptóticas en la corteza y médula en tres secciones por riñón, de ocho animales independientes por grupo, sacrificados los días 1, 2, 3 y 5 después de reperfusión.

Acumulación de neutrófilos y actividad

La infiltración de neutrófilos se determinó usando tinción con cloroacetato de naftol AS-D-esterasa (Sigma) en secciones histológicas. Los neutrófilos se contaron en la corteza y en la zona S_{3} (médula externa y corteza interna) usando una retícula en el ocular. Los datos se expresaron como número de neutrófilos por mm^{2}, evaluados en 100 campos de alta potencia por sección, dos secciones por animal, en 8 ratas independientes 24 h después de la lesión. Además, se determinó la actividad de neutrófilos 24 h después de la lesión por la actividad de mieloperoxidasa (MPO). Para la MPO se extrajeron los riñones en HTAB al 0,5% (Sigma) en tampón de KPO_{4} 50 mM, pH 6,0, se homogeneizaron durante 10 min, se trataron por ultrasonidos durante 5 min, y finalmente el lisato se centrifugó durante 60 min a 20.000xg. Se incubaron 10 \mul de extracto con 1 ml de tampón de KPO_{4} 50 mM que contenía 0,167 mg/ml de O-dianisidina (Sigma) y 0,0005% de H_{2}O_{2} a 25ºC. Se determinó la absorbancia a 460 nm usando un patrón de mieloperoxidasa (Oxis) y se normalizaron al peso neto del riñón.

Análisis estadístico

Se llevaron a cabo análisis de varianza de dos vías y análisis post hoc con prueba de rangos múltiples de Duncan, para determinar los efectos del tratamiento y tiempo en los parámetros bioquímicos e histológicos. Se usaron las pruebas U de Mann-Whitney y pruebas ji para determinar la significancia de las diferencias en los resultados entre los grupos seleccionados.

Efectos profilácticos y terapéuticos

En un experimento típico, 24 h después de reperfusión los niveles de creatinina en el suero (Cr) y nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) aumentaron 8 a 10 veces por encima de los valores normales en ratas con insuficiencia renal aguda que recibieron vehículo de tampón de acetato (500 \mul; pH 4,5). La inyección intravenosa de 250 \mug de OP-1/kg 10 minutos antes de presión con pinza, y después a intervalos de 24 h hasta 72 h después de reperfusión, diminuyó espectacularmente la tasa de mortalidad y contuvo claramente la elevación de Cr en el suero y BUN, y los valores de fósforo y potasio, comparados con las ratas tratadas con vehículo. Los valores de sodio y cloruro en el suero permanecieron sin cambiar en todos los animales. El vehículo solo no influyó en la función renal en ratas con IRA comparado con ratas con IRA que no recibieron nada. La dosis de OP-1 que protegió satisfactoriamente el riñón frente a la lesión isquémica varió con la edad del animal y la gravedad de la isquemia y reperfusión, y estaba dentro del intervalo de 50 - 250 \mug/kg. La TFG medida 24 h después de reperfusión, era significativamente mayor en ratas tratadas con OP-1 que en ratas tratadas con vehículo. Específicamente, las ratas fingidas tenían una TFG (ml/min) de 4,7\pm0,8; las ratas con IRA tratadas con vehículo tenían una TFG de 0,25\pm0,11; y las ratas tratadas con OP-1 tenían una TFG de 0,45 \pm0,17 (p<0,05 frente a la IRA). Para examinar el potencial terapéutico de OP-1 para el tratamiento de ARF estabilizado, se administró OP-1, 1 h o 16 h después de reperfusión. Ambos grupos de tratamiento con OP-1 mostraron menores valores de Cr en el suero y BUN. La reducción de Cr en el suero y BUN fue más drástica en ratas con OP-1 administrada 1 h después de reperfusión que las que recibieron OP-1 16 h después de reperfusión. Estos resultados indican que OP-1 protege frente a la pérdida de la función renal en la isquemia, medido por los parámetros bioquímicos del suero.

Protección frente a daño renal

Los análisis histológicos de secciones del riñón de ratas con IRA, indicaban que los cambios morfológicos se habían producido en la zona S_{3}. Dos horas después de reperfusión, los riñones tratados con vehículo mostraron señales de congestión que condujeron a grandes zonas de infarto parenquimal y necrosis cuando se examinaron 24 h, 72 h y 120 h después de reperfusión. Sin embargo, los animales a los que se les dio OP-1 antes de la isquemia, no presentaron congestión o presentaron poca y tuvieron menos infarto; 28 de 32 riñones tratados con vehículo y 16 de 32 riñones tratados con OP-1 tuvieron infarto blanco (necrosis), y 26 de 32 ratas tratadas con vehículo y 14 de 32 tratadas con OP-1 tuvieron infarto rojo. El análisis histomorfométrico mostró que 6 y 11% del área de la sección del riñón en ratas tratadas con vehículo, y 0 y 0,3% de ratas tratadas con OP-1 tenían infarto blanco o rojo, respectivamente. En la zona del riñón afectada por infarto, aproximadamente 50% de los túbulos estaban dilatados tanto en las ratas tratadas con vehículo como con OP-1, 1 a 5 días después de lesión. Sin embargo, se encontraron menos túbulos taponados con células epiteliales descamadas, residuos celulares y matriz fundida, en ratas tratadas con OP-1 comparado con animales tratados con vehículo, los días 2 y 5 después de la lesión. El análisis de las células musculares lisas derivadas de capilares peritubulares, puso de manifiesto que 24 h después de la lesión, aproximadamente 5 veces más células en la zona S_{3} de los riñones tratados con OP-1 expresaban \alpha-actina, comparado con los riñones tratados con vehículo, sugiriendo que la terapia con OP-1 ayuda al mantenimiento de un fenotipo de músculo liso vascular. La proliferación celular evaluada por tinción con PCNA indicaba un aumento del crecimiento de células tubulares proximales en la corteza y médula externa de las ratas tratadas con OP-1. En los animales tratados 1 h después de reperfusión, OP-1 tenía una acción protectora similar en la histología del riñón. En animales tratados 16 h después de reperfusión, el daño estructural era similar a los animales tratados con vehículo 24 h después de la lesión.

Supresión de la inflamación

Puesto que se ha descrito que ICAM-1 juega un papel importante durante la aparición de IRA, se determinó el efecto de OP-1 en la expresión de ICAM-1 en diferentes puntos de tiempo después de isquemia y reperfusión. El tratamiento con OP-1, 10 min antes de la isquemia atenuó la expresión de ICAM-1 determinado por análisis molecular e histoquímico de riñones obtenido 30 min, 2 h y 8 h después de reperfusión. Se observó una acumulación de neutrófilos significativa en las ratas tratadas con vehículo 24 h después de reperfusión en la zona S_{3}. En contraste, las ratas tratadas con OP-1 tenían una acumulación de neutrófilos espectacularmente menor (232\pm47 células/mm^{2} en el grupo con vehículo frente a 9\pm3 células/mm^{2} en el OP-1; n = 8, p< 0,01). La acitividad neutrófila en el riñón se siguió midiendo la actividad de la MPO tisular total. La administración de OP-1, 1 h después de reperfusión disminuyó la actividad de mieloperoxidasa (MPO) aproximadamente 3 veces, determinado 24 h después de reperfusión (MPO/\mug/riñón húmedo: 37,3\pm16,5 en riñones tratados con vehículo frente a 12,8\pm7,5 en tratados con OP-1; n = 8; p < 0,01).

Reducción de la apoptosis

Los días 1 y 2 después de la lesión, no había diferencias en el número de células apoptóticas en la médula tanto en los riñones tratados con OP-1 como tratados con vehículo. Sin embargo, se observó una reducción del número de células apoptóticas en la corteza de las ratas tratadas con OP-1. Cinco días después de la lesión, el tratamiento con OP-1 dio como resultado una reducción espectacular de las células apoptóticas unidas a la membrana basal de los túbulos tanto de la corteza como de la médula, mientras que se observaron numerosas células apoptóticas en el lumen de los túbulos renales de las ratas tratadas con vehículo.

Claims (30)

1. Uso de un agente terapéutico renal BMP (proteína morfogenética ósea) para fabricar un medicamento para mejorar la función renal en un mamífero con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, para retrasar la necesidad, o reducir la frecuencia, de tratamiento de diálisis en un mamífero con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, para inhibir la apoptosis de una célula en un tejido de mamífero que se ha dañado o lesionado, o con riesgo de dañarse o lesionarse, debido a insuficiencia renal aguda.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho agente terapéutico renal comprende un polipéptido que consiste en al menos un dominio de cisteínas C-terminal de una proteína seleccionada del grupo que consiste en una forma pro, una forma madura, y una forma soluble de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, y BMP9.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho agente terapéutico renal comprende un polipéptido que consiste en al menos un dominio de cisteínas C-terminal de una proteína seleccionada del grupo que consiste en una forma pro, una forma madura, y una forma soluble de OP-1 humana.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho agente terapéutico renal comprende un polipéptido que tiene al menos 70% de homología con una secuencia de aminoácidos de un dominio de siete cisteínas de OP-1 humana.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido tiene al menos 75% de homología con una secuencia de aminoácidos de un dominio de siete cisteínas de OP-1 humana.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido tiene al menos 80% de homología con una secuencia de aminoácidos de un dominio de siete cisteínas de OP-1 humana.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido es al menos 60% idéntico a una secuencia de aminoácidos de un dominio de siete cisteínas de OP-1 humana.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido es al menos 65% idéntico a una secuencia de aminoácidos de un dominio de siete cisteínas de OP-1 humana.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido es al menos 70% idéntico a una secuencia de aminoácidos de un dominio de siete cisteínas de OP-1 humana.

12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-11, en el que dicho agente terapéutico renal

(a) induce condrogénesis en un ensayo óseo ectópico;

(b) previene, inhibe, retrasa o alivia la pérdida de la función renal que resulta de la insuficiencia renal aguda en un modelo animal de insuficiencia renal aguda, o

(c) produce una mejora clínicamente significativa en un marcador patrón de la función renal cuando se administra a un mamífero con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda.

13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho agente terapéutico renal se selecciona del grupo que consiste en proteínas osteogénicas humanas y proteínas morfogénicas óseas humanas.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el medicamento puede reducir la tasa de aumento de BUN en el mamífero que tiene una tasa de aumento de BUN de al menos 1 a 2 mmol/l/día (2,5 a 5 mg/dl/día).

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el medicamento puede reducir la tasa de aumento de BUN en el mamífero que tiene una tasa de aumento de BUN de al menos 2 a 4 mmol/l/día (5 a 10 mg/dl/día).

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el medicamento puede reducir la tasa de aumento de BUN en el mamífero que tiene una tasa de aumento de BUN de al menos 4 a 8 mmol/l/día (10 a 20 mg/dl/día).

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho medicamento puede reducir la tasa de aumento de creatinina en el suero en el mamífero que tiene una tasa de aumento de creatinina en el suero de al menos 10 a 20 \mumol/l/día (0,125 a 0,25 mg/dl/día).

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho medicamento puede reducir la tasa de aumento de creatinina en el suero en el mamífero que tiene una tasa de aumento de creatinina en el suero de al menos 20 a 40 \mumol/l/día (0,25 a 0,5 mg/dl/día).

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho medicamento puede reducir la tasa de aumento de creatinina en el suero en el mamífero que tiene una tasa de aumento de creatinina en el suero de al menos 40 a 80 \mumol/l/día (0,5 a 1,0 mg/dl/día).

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, para tratar o aliviar causas prerrenales de insuficiencia renal aguda, causas postrenales de insuficiencia renal aguda y causas renales intrínsecas de insuficiencia renal aguda.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, para tratar o aliviar una causa prerrenal de insuficiencia renal aguda, seleccionada del grupo que consiste en menor capacidad cardiaca, hipovolemia, redistribución de volumen, y resistencia vascular alterada.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, para tratar o aliviar una causa postrenal de insuficiencia renal aguda, seleccionada del grupo que consiste en obstrucciones uretrales, pélvicas y de vejiga.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, para tratar o aliviar una causa renal intrínseca de insuficiencia renal aguda, seleccionada del grupo que consiste en anomalías de la vasculatura, anomalías de los glomérulos, nefritis intersticial aguda, obstrucción intratubular, y necrosis tubular aguda.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para tratar o aliviar un receptor de transplante de riñón.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para tratar o aliviar un mamífero que sólo tiene un riñón.

26. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho medicamento es para administración oral, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, o en la cápsula renal.

27. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho medicamento se va a administrar por vía parenteral mediante un stent implantado en el mamífero.

28. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el stent es un stent intravenoso.

29. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el stent es un stent intraperitoneal.

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el stent es un stent intracapsular renal.