ES2223894T3 - Metodo para la produccion de beta-caroteno. - Google Patents
Metodo para la produccion de beta-caroteno.Info
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Abstract
Procedimiento de obtención de beta-caroteno. La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la producción de beta-caroteno a partir de cultivos sumergidos de hongos mucorales como Blakeslea, Choanephora o Phycomyces mediante la adición al medio de cultivo de lecitina conjuntamente con un control de pH una vez comenzada la fermentación, procedimiento que incluye un paso de recuperación de beta-caroteno que permite obtener una simplificación en el proceso, una optimización en el rendimiento, junto con un incremento en la purificación del producto.
Description
Método para la producción de
\beta-caroteno.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para la producción de carotenoides, especialmente
\beta-caroteno, a partir de cultivos sumergidos de
hongos mucorales del género Blakeslea. Se describe un método
de fermentación que permite obtener un incremento en la producción
de \beta-caroteno y en la concentración relativa
de este con respecto a otros carotenoides, basado en la
incorporación en el medio de cultivo de lecitina de soja así como
en una estrategia definida de control del pH durante la
fermentación.
Asimismo, la presente invención describe un
procedimiento optimizado para la purificación y aislamiento de
\beta-caroteno cristalino de elevada pureza, a
partir del caldo de fermentación obtenido anteriormente, mediante
una simplificación del procedimiento de purificación e incremento
del rendimiento de recuperación utilizando disolventes considerados
como "naturales" y/o aquellos incluidos en la clase III de la
ICH (International Conference of Harmonization).
Los carotenoides son compuestos abundantes en los
vegetales, la fuente principal de la que se obtuvieron. Han sido
objeto de numerosos estudios debido a sus propiedades como
antioxidantes y como precursores de vitamina A. Representan el más
extendido grupo de pigmentos naturales existente en la naturaleza.
Se utilizan en la industria como suplemento y colorante alimenticio
en margarinas, aceites, salsas, sopas, etc. (Ninet L. y Renaut J.
1979. En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2ª
edn., vol. 1. Academic Press, NY, pp. 529-544).
Los carotenoides son isoprenoides que contienen
una cadena poliénica de dobles enlaces conjugados característica,
procedente de una condensación de dos precursores geranilgeranil
(Pfander (1992). Meth. Enzimol.). Existen dos grupos de pigmentos:
los carotenos y sus derivados oxigenados, las xantofilas.
La fórmula empírica molecular del
\beta-caroteno es C_{40}H_{56}, con un peso
molecular de 536,85 y la siguiente fórmula desarrollada:
La producción de \beta-caroteno
como compuesto de alta pureza ha estado ligada a la reacción de
síntesis química clásica, en procedimientos que hoy en día son
objeto de polémica al considerarse que son más ventajosas vías
alternativas partiendo de fuentes de origen natural por
fermentación o productos naturales unidos a procedimientos de
extracción empleando disolventes y condiciones de reacción menos
drásticas.
Los carotenoides y demás componentes terpénicos
derivados en general y el \beta-caroteno en
particular pueden obtenerse a partir de fuentes naturales, bien sea
productos vegetales tales como tomate y zanahoria, en los que se
encuentra en porcentajes muy pequeños o partiendo de cultivos de
algas, hongos, etc., seleccionados, en los que la proporción de
estos componentes puede aumentar.
Procedimientos de obtención de oleorresinas ricas
en carotenoides y en \beta-caroteno a partir de
vegetales, aceites o algas se describen en diversas patentes.
En la mayoría de los casos, los procedimientos de
extracción descritos requieren una etapa de molienda/extrusión del
fruto para facilitar la extracción del disolvente y liberar el
contenido intracelular rico en \beta-caroteno.
El procedimiento de extracción de estos
componentes debería hacer frente a la relativamente baja
concentración y a la particular disposición de los mismos en
agrupaciones almacenadas intracelularmente. En consecuencia, la
extracción del \beta-caroteno requiere métodos
adecuados que permitan solubilizar el producto, bien mediante
penetración de las paredes celulares o mediante ruptura previa de
las paredes celulares, liberando el contenido intracelular.
Los procedimientos descritos en US 3268606, US
2959522 utilizan disolventes halogenados tales como diclorometano,
cloroformo, etc., o hidrocarburos aromáticos: benceno, tolueno,
etc., que tienen problemas de toxicidad inherente que se traducen
en su inclusión dentro de los grupos I y II de la Guía para
disolventes residuales de uso en aplicaciones farmacéuticas o
alimentarias y según la cual es recomendable utilizar aquellos que
pertenezcan al grupo de la Clase III.
La mayoría de los métodos de extracción de
\beta-caroteno a partir de algas emplean aceites.
Estos métodos no son adecuados para obtener
\beta-caroteno en forma cristalina, sino más bien
para obtener extractos oleosos, tales como los descritos en las
patentes de EE.UU. US 4680314; US 4713398; US 5019668; US 5378369 en
los que se solubiliza el \beta-caroteno y se
comercializa como tal.
El uso de CO_{2} supercrítico se ve limitado
por la baja solubilidad del \beta-caroteno. Se ha
considerado el empleo de otros disolventes a presión en condiciones
supercríticas o como gases licuados. Los ejemplos incluyen propano o
etileno en los cuales la solubilidad es mayor. No obstante, el uso
de estos disolventes hidrocarbonados haría más difícil el uso del
\beta-caroteno en la industria alimentaria.
El \beta-caroteno puede ser
obtenido de forma alternativa a partir de caldos de fermentación de
determinados hongos mucorales tales como Phycomyces,
Blakeslea, etc., los cuales presentan como ventaja frente a las
fuentes naturales anteriormente mencionadas de la elevada
concentración de este compuesto en relación a la cantidad de
biomasa seca así como el posible incremento de producción utilizando
estirpes superproductoras obtenidas por técnicas de mutagénesis
clásica o biología molecular o bien mediante la optimización del
procedimiento de fermentación utilizando materias primas complejas,
determinados inductores de la producción o inhibidores de la
producción de otros carotenoides estructuralmente relacionados que
eviten la producción de los mismos.
En cualquiera de los métodos de producción de
\beta-caroteno con el hongo B. trispora se
utilizan cultivos mixtos, debido a que se obtienen rendimientos de
\beta-caroteno muy superiores a los de las
estirpes (+) y (-) cuando se emplean cultivos por separado
(Ciegler, A. 1965). Advan. Appl. Microbiol. 7:19) y US 5422247.
Las harinas de cítricos han sido añadidas al
medio de fermentación de \beta-caroteno como
sustituto de la \beta-ionona, un estimulante
químico de la ruta biosintética [Ciegler, A. 1965. Adv. Appl.
Microbiol. 7, 1-34]. La adición de derivados de
cítricos, previamente tratados con álcali, permitió incrementar el
contenido de \beta-caroteno hasta 1,7 g/l [Upjohn
Co., 1965. Patente holandesa 65/00,788].
Un estudio analítico encaminado a identificar el
o los factores estimulantes de la producción de
\beta-caroteno, contenido(s) en harinas de
cítricos, reveló que el ácido cítrico es el principal componente
además de una pequeña cantidad de ácido málico, así como un tercer
ácido no identificado, cuyo Rf es similar al del ácido glucónico o
el ácido 2-cetoglucónico. Este estudio concluyó que
la función del ácido cítrico en el incremento de la producción es
no específica y podría actuar como un precursor de metabolitos
tempranos de la ruta biosintética. Adicionalmente se encontró un 42%
de carbohidratos, de ellos el 50% era sacarosa y el resto azúcares
reductores (glucosa y fructosa) [Pazola, Z., Ciegler, A., Hall,
H.H. 1966. Nature 5043: 1367-1368].
Las lecitinas son compuestos con una estructura
de glicerofosfatidilcolina, y están presentes en todos los
organismos vivos (plantas y animales), y son constituyentes
significativos del tejido de los nervios y el cerebro. Son
sustancias incoloras, oleosas al tacto, que funden a alrededor de
60ºC y se descomponen al calentar poco después de sobrepasar 100ºC.
La molécula de lecitina consiste en una mezcla de diglicéridos de
ácido esteárico, ácido palmítico y ácido oleico, unidos al éster de
colina del ácido fosfórico. Como la molécula tiene naturaleza
dipolar, se usa extensamente como agente tensioactivo y agente
emulsionante comestible, de origen natural, con aplicación en la
industria alimentaria general (chocolate, margarina), la dietética,
la industria farmacéutica y la industria cosmética [Furia, T.E.
(ed). CRC Handbook of Food Additives. 2ª Ed. Cleveland: The
Chemical Rubber Co., 1972. 879]. La lecitina comercialmente
disponible procede principalmente de habas de soja, obtenida como un
subproducto de la fabricación de aceite de soja aunque también se
puede obtener del maíz dulce y otras semillas vegetales [Hawley,
G.G. The Condensed Chemical Dictionary. 9ª edición. Nueva York: Van
Nostrand Reinhold Co., 1977. 509]. La lecitina de soja contiene
11,7% de ácido palmítico, 4% de ácido esteárico, 8,6% de ácido
palmitoleico, 9,8% de ácido oleico, 55% de ácido linoleico, 4% de
ácido linolénico, 5,5% de ácidos de
C_{20}-C_{22} (incluyendo el ácido araquidónico)
[The Merck Index. 9ª Ed. Rahway, Nueva Jersey: Merck & Co.,
Inc., 1976. 712].
El efecto de la lecitina de soja sobre la
fermentación se ha estudiado principalmente en relación con su uso
en pienso como suplemento de fosfolípidos y el efecto sobre la
fermentación del rumen, con efecto sobre la disgestibilidad de
grasas y los niveles en suero de triglicéridos y colesterol en
terneros y ovejas (Jenkins TC, Jiménez T y Cross DI (1989)
"Influence of phospholipids on ruminal fermentation in
vitro and on nutrient digestion and serum lipids in sheep" J.
Anim. Sci. 67(2): 529-537; Jenkins TC y
Fotouhi N (1990) "Effects of lecithin and corn oil on site of
digestion, ruminal fermentation and microbial protein synthesis in
sheep" J. Anim. Sci. 68(2): 460-466;
Jenkins TC (1990) "Nutrient digestion, ruminal fermentation and
plasma lipids in steers fed combinations of hydrogenated fat and
lecithin" J. Dairy Sci. 73(10):
2934-2939), así como sobre la producción de leche en
vacas (Abel-Caines SF, Grant RJ y Morrison M (1998)
"Effect of soybean hulls, soy lecithin and soapstock mixtures on
ruminal fermentation and milk composition in dairy cows" J. Dairy
Sci. 81(2): 462-470).
En la producción de mildiomicina mediante la
fermentación de Actinomycetes, se encontró en algunos casos
un importante incremento en la producción tras la incorporación al
medio de cultivo de componentes con naturaleza de
N-metilo (especialmente grupos trimetilamonio), en
otros colina, betaína, lecitina, tetrametilamonio, etc., o
sustancias naturales ricas en estos compuestos, o incluso una
combinación de ambos para evitar una posible sobredosis de otros
componentes de la sustancia natural en cuestión [US 4.334.022].
Otras patentes desarrolladas en los años 80 se
refieren a la incorporación de lecitina para favorecer el
procedimiento de fermentación en vainas de soja libres de grasa con
el propósito de mejorar su facilidad de procesamiento y digestión
[JP 58116648] así como su efecto activador sobre el cultivo de
microorganismos utilizados en el procesamiento de alimentos [DE
3546511; EP 0223161]. Por otro lado, el carácter emulsionante de
este compuesto se ha tenido en cuenta en aplicaciones de
eliminación de aceites por microbios [DE 149056] o en el tratamiento
enzimático de efluentes orgánicos residuales [EP 0421223] y en la
formación de compost a partir de residuos con un alto contenido en
grasas [JP 7033570].
En una solicitud reciente, se ha utilizado la
lecitina también para mejorar el medio de cultivo del hongo
Lagenidium giganteum, permitiendo un mayor crecimiento y
también una mayor efectividad como agente de biocontrol frente a
mosquitos del hongo incubado en tales condiciones [WO
98/58049].
En US 2959521 se prepara
\beta-caroteno cultivando B. trispora en un
medio nutritivo que contiene lecitina como antioxidante estimulando
así la producción de \beta-caroteno.
En la producción de
\beta-caroteno mediante la fermentación de
Blakeslea trispora, se ha descrito el uso de algunos agentes
tensioactivos (tales como Span 20, monolaureato de sorbitán, SIGMA)
para incrementar la producción al permitir un crecimiento disperso
del micelio (Seon-Won Kim, Weon-Taek
Seo y Young-Hoon Park (1997) "Enhanced production
of \beta-carotene from Blakeslea trispora
with Span 20" Biotechnology Letters 19(6):
561-562). Sin embargo, no se ha descrito ningún
efecto sobre la proporción del contenido de
\beta-caroteno producido con respecto a los otros
carotenoides presentes también en los cultivos de Blakeslea
trispora (\gamma-caroteno,
\beta-zea-caroteno, etc.).
Los procedimientos para obtener el
\beta-caroteno a partir de caldos de
fermentación, descritos hasta el momento, implican generalmente una
etapa de extracción y sucesivas cristalizaciones y
recristalizaciones e incluso etapas de purificación cromatográfica,
lo que, debido a la naturaleza de estas sustancias, exige un consumo
elevado de disolventes debido a la baja solubilidad de estas
sustancias (US 5310554; EP 0242148; US 3369974, Biochemistry and
Molecular Biology International, 39, 1077-1084
(1996)) y a menudo las purezas del producto obtenido son
excesivamente bajas.
Además, los disolventes habitualmente empleados,
diclorometano, cloroformo, hexano, benceno o tolueno, dificultan el
uso del \beta-caroteno obtenido en la industria
alimentaria por su toxicidad. Sin embargo, recientemente en US
5714658 se logró la extracción de \beta-caroteno
mediante un agente orgánico líquido de extracción que comprendía un
éster del ácido acético de alcoholes de
C_{1}-C_{4}.
Cuando los cristales de
\beta-caroteno son obtenidos directamente por
cristalización del extracto orgánico a partir de un caldo de
fermentación mediante evaporación directa del disolvente, los
cristales obtenidos no poseen la pureza necesaria comparados con el
\beta-caroteno sintético, siendo necesarias varias
etapas de recristalización y/o purificación con el consiguiente
consumo de disolvente, complejidad del procedimiento y pérdidas de
producto que originan unos bajos rendimientos de recuperación.
Recientemente, se ha descrito la preparación de
cristales de \beta-caroteno en la patente PCT WO
98/03480 mediante sucesivos lavados con agua o alcoholes de bajo
peso molecular, partiendo de un extracto de acetato de etilo
obtenido por extracción de la biomasa procedente de un caldo de
fermentación, que aun dando lugar a cristales de
\beta-caroteno altamente puros, exige un consumo
elevado de disolventes tales como acetato de etilo y etanol,
sucesivas etapas de lavado y cristalización que dan lugar a que los
rendimientos de recuperación del producto sean bajos. En WO98/50574
se describe una etapa de separación de lípidos con un alcohol
inferior, a partir de biomasa de B. trispora utilizada para
producir \beta-caroteno con una pureza de
93,9%.
El objeto de la presente invención es el
incremento de la producción de \beta-caroteno, en
un procedimiento de fermentación con hongos mucorales
(Blakeslea, Phycomyces, etc.), más específicamente
Blakeslea trispora, mediante el cultivo del hongo en un
medio de fermentación que contiene cantidades variables de lecitina,
especialmente lecitina de soja, aplicando una estrategia definida
para el control del pH durante la fermentación.
Asimismo, en esta invención, se describe la
producción de \beta-caroteno cristalino de
elevada pureza a partir de un caldo de fermentación, empleando
disolventes considerados como naturales. Disolventes naturales son
aquellos que, por una parte, son toxicológicamente inocuos y/o
aquellos que están incluidos en la clase III de las directrices de
la ICH (International Conference of Harmonization).
En su consideración general, el procedimiento
comprende las siguientes etapas:
- 0)
- Fermentación en un medio de cultivo con lecitina y en condiciones predeterminadas de control del pH
- 1)
- Separación de la biomasa húmeda de la fuente natural de biosíntesis (el caldo de fermentación por ejemplo)
- 2)
- Purificación de la biomasa húmeda por tratamiento con alcohol
- 3)
- Separación de la biomasa purificada del alcohol
- 4)
- Acondicionamiento de la biomasa purificada mediante secado y disgregación o ruptura de la misma
- 5)
- Extracción sólido-líquido de \beta-carotenoides con un disolvente orgánico
- 6)
- Concentración del extracto enriquecido
- 7)
- Precipitación/cristalización por adición de alcohol
- 8)
- Filtración
- 9)
- Secado.
El método aquí descrito nos permite recuperar
\beta-caroteno cristalino con una pureza superior
al 90%, preferiblemente superior al 95% y más preferiblemente
superior al 98%.
La presente invención describe un procedimiento
para incrementar la producción de \beta-caroteno,
en un procedimiento de fermentación con hongos mucorales
(Blakeslea, Choanephora o Phycomyces, más
específicamente Blakeslea trispora. La invención consiste en
cultivar el hongo B. trispora en un medio de fermentación que
contiene subproductos derivados de la manipulación de cítricos, en
particular harinas de cítricos, los cuales han sido obtenidos
mediante un procedimiento de eliminación de pectinas por
tratamiento con hidróxido cálcico y sucesivos tratamientos de cambio
de pH y lavados para concentrar determinados componentes que
inducen la producción de \beta-caroteno. Dentro
de las harinas de cítricos, pueden ser utilizadas harinas
procedentes de, por ejemplo, naranja, pomelo, mandarina, etc. y
dentro de cada una de ellas, las diferentes variedades de cada uno
de ellos como, por ejemplo, Navel, Navelina, Clementina, Washington,
Valencia-late etc.
Por una parte, la invención consiste en que el
medio de cultivo contiene también lecitina de soja y, por otra
parte, en aplicar una estrategia definida para controlar el pH
durante la fermentación. El efecto combinado de estas variables
permite un incremento en la producción de
\beta-caroteno y en la concentración relativa de
este con respecto a otros carotenoides minoritarios.
Los organismos utilizados para la fermentación
pueden ser estirpes aisladas (+) o (-) o una mezcla de las estirpes
(+) y (-) de hongos mucorales, más específicamente B.
trispora o bien mutantes de B. trispora superproductores
de \beta-caroteno. Varias mezclas de las estirpes
(+) y (-) del hongo pueden ser utilizadas en el procedimiento de
fermentación de esta invención.
El procedimiento de fermentación puede realizarse
en cualquier medio de cultivo que contenga una o más fuentes de
carbono, una o más fuentes de nitrógeno, sales minerales, tiamina y
proporciones variables de harinas de cítricos procedentes de un
único cítrico y una única variedad o mezclas de harinas de
diferentes frutos cítricos y/o variedades y lecitina de soja, en
proporciones variables que van desde un 0,1% al 10% y
preferiblemente del 0,5% al 5% y más preferiblemente del 1% al
2%.
Las fuentes de carbono que se pueden utilizar
como nutrientes sencillos o complejos incluyen hidratos de carbono o
grasas tales como por ejemplo dextrinas, almidones, glucosa,
sacarosa, fructosa, aceites animales y vegetales. Dentro de las
fuentes de nitrógeno pueden utilizarse fuentes orgánicas e
inorgánicas tales como por ejemplo vainas de soja, harina de maíz,
destilados solubles, extracto de levadura, harina de algodón,
peptonas, caseína o sulfato amónico. Las sales minerales que pueden
adicionarse al medio de cultivo incluyen fosfatos, sulfatos,
cloruros de cationes monovalentes tales como sodio, potasio o
amonio o cationes divalentes tales como calcio o magnesio. Las
proporciones de los nutrientes se determinan en función de las
necesidades de crecimiento del microorganismo y los niveles de
producción.
La fermentación se lleva a cabo en condiciones
aerobias y en cultivo sumergido. La temperatura de fermentación
oscila entre 20ºC y 32ºC aunque se prefiere el intervalo entre 25ºC
y 28ºC.
El pH del cultivo evoluciona libremente en las
primeras horas, en las que hay un crecimiento inicial del hongo en
el fermentador. El pH se controla luego mediante la adición de
ácido y/o álcali dentro del intervalo de 6,5-7,2,
aunque preferiblemente 6,7-6,9. El comienzo del
control del pH depende de la evolución del crecimiento, pero en
general tiene lugar después de entre 12 y 50 horas de fermentación,
preferiblemente entre 24 y 36 horas.
La incorporación de lecitina al medio, debido al
carácter anfipático de esta molécula, favorece la emulsión de los
aceites en el medio de cultivo en el que se encuentren estos en
alta concentración, como es el caso a menudo en medios de
fermentación de \beta-caroteno. Esta acción por
una parte favorece el uso del aceite por el microorganismo y por la
otra se ha encontrado, sorprendentemente, que activa la ruta de
carotenogénesis favoreciendo la transformación del
gamma-caroteno en beta-caroteno,
incrementando la producción de esta última sustancia y su
concentración relativa con respecto a otros carotenoides,
especialmente el gamma-caroteno, y conduce así a
una importante reducción en la presencia de esta sustancia en el
producto final, incrementando la pureza del
todo-trans beta-caroteno.
Además, este efecto se intensifica cuando se
lleva a cabo un control adecuado del pH durante la fermentación, de
tal forma que ajustar el pH después de 24-36 horas
de fermentación favorece la reducción del
gamma-caroteno de una manera incluso más marcada,
incrementando la concentración relativa de la forma beta.
La presencia de gamma-caroteno en
los caldos de fermentación de hongos mucorales de cultivos en fase
estacionaria ha sido descrita anteriormente (Murillo FJ,
Torres-Martínez S, Aragón CM y
Carda-Olmedo E (1981) "Substrate transfer in
carotene biosynthesis in Phycomyces" Eur. J. Biochem.
119(3): 511-516; Candau R., Bejarano ER,
Carda-Olmedo E (1991) "In vivo channelling
of substrates in an enzyme aggregate for
beta-carotene biosynthesis" Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88(11): 4936-4940; Fraser PD,
Ruiz-Hidalgo MJ, López-Matas MA,
Álvarez MI, Eslava AP y Bramley PM (1996) "Carotenoid biosynthesis
in wild type and mutant strains of Mucor circinelloides" Biochim
Biophys Acta 1289(2): 203-208).
Esta presencia se ha descrito también en
Blakeslea trispora (Mehta BJ y Carda-Olmedo
E (1999) "Lycopene cyclization in Blakelea trispora"
Mycoscience 40(3) 307-310). En ambos casos,
estos efectos inhibitorios se describen para el caso de algunas
sustancias tales como nicotina,
2-(4-clorofeniltio)-trietilamina,
alfa-picolina e imidazol sobre la producción de
beta-caroteno, favoreciendo sin embargo la
acumulación de
licopeno-gamma-caroteno debido al
bloqueo de la licopeno-ciclasa. Sin embargo, no se
han descrito previamente procedimientos encaminados a reducir el
contenido de gamma-caroteno en la fermentación de
B. trispora incrementando la producción de
beta-caroteno y con ello la pureza del producto
final obtenido.
Este efecto de reducción del contenido de
gamma-caroteno en los caldos de fermentación de
Blakeslea trispora resultado de la presente invención es de
importancia en el sentido de que permite cumplir las
especificaciones establecidas tanto a nivel de la farmacopea como
para la industria alimentaria de que el producto final se requiere
con una pureza de beta-caroteno de al menos 96% en
el producto final.
Dadas las características del componente
carotenoide biosintetizado en la fermentación, de ser intracelular,
el procedimiento de recuperación a partir del caldo de cultivo,
preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica la
separación de la biomasa del caldo, con el propósito de eliminar o
reducir las pérdidas en el caldo sin biomasa.
Esta separación puede hacerse por los
procedimientos establecidos de A) Filtración, empleando las
tecnologías al uso de filtros, bien sean de bandas, rotatorios,
prensas, etc., en los que una barrera constituida por el material
filtrante separa la biomasa y permite pasar la fase líquida sin la
biomasa, o B) Centrifugación, en la que, haciendo uso de la
diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa (normalmente
mayor) se emplea una máquina tal como una centrífuga, un decantador
o similar, en el que la fase pesada se concentra y se separa de la
fase líquida con la menor cantidad posible de biomasa. Reducir
pérdidas y optimizar el rendimiento de cada fase respectiva
consiguiendo así la mayor cantidad de biomasa con el mayor contenido
de residuo seco y eliminando la mayor cantidad de caldo de
fermentación es uno de los objetivos de esta invención.
El micelio húmedo resultante contiene más del 95%
de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente
más del 97% y más preferiblemente más del 99%. El contenido en
carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior al 5%,
preferiblemente inferior al 3% y más preferiblemente inferior al
1%.
Este sólido húmedo de micelio estaría en
disposición de permitir, mediante las etapas ulteriores, la
separación de beta-caroteno, pero el hallazgo de
que, relacionado con la fermentación, mantiene un porcentaje
relativamente elevado de componentes lipófilos, entre 15 y 20%
(ácidos grasos y aceites) y que en etapas ulteriores surgen
problemas de purificación, conduce a la introducción, debido a este
punto, de una etapa de purificación de la biomasa.
Esta etapa de purificación implica una
resuspensión de la biomasa con una cantidad de alcohol, metanol,
etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en el que
la solubilidad del \beta-caroteno sea muy baja, o
mezclas de los mismos, en proporción adecuada para conseguir la
máxima purificación de los componentes lipídicos, en otras
palabras, el micelio húmedo se resuspende con una cantidad de
alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio húmedo. La
temperatura de resuspensión oscila entre la temperatura ambiente y
el punto de ebullición del alcohol. El tiempo de contacto oscila
entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensión alcohólica así preparada
se filtra o centrifuga, de modo que el contenido en sólidos en el
filtrado o sobrenadante sea prácticamente nulo. El micelio húmedo
resultante, que contendrá alcohol y agua en diferentes
proporciones, contiene más del 93% de los carotenoides producidos en
la fermentación, preferiblemente más del 95% y más preferiblemente
más del 97%.
En la mezcla resultante de restos de caldo con
alcohol, el contenido en carotenoides es inferior al 2%,
preferiblemente inferior al 1%. Mediante este tratamiento con
alcohol es posible eliminar una serie de sustancias lipófilas
solubles en alcohol que varían en función de las características
del caldo utilizado, efectuando una purificación previa
extremadamente importante y que nos permitirá obtener un producto
final cristalino de elevada pureza. Además, la eliminación de una
proporción variable de agua del micelio húmedo inicial facilita
considerablemente el procedimiento de secado.
Alternativamente al conjunto de estas dos etapas
de separación de la biomasa y de purificación por resuspensión, se
plantea la posibilidad de que mezclando directamente el caldo
recogido con alcohol en proporciones de volumen entre 1:0,5 y 1:5
(caldo/alcohol) y a temperaturas entre la temperatura ambiente y la
del punto de ebullición de la mezcla, preferiblemente entre la
temperatura ambiente y 50ºC, manteniendo el tiempo mínimo de
contacto se consigue un efecto de purificación equivalente al
descrito, con lo que se simplifica el procedimiento mediante la
eliminación de la operación de separación sólido/líquido.
El hecho de que el producto carotenoide sea
intracelular implica que la biomasa purificada requiere un
acondicionamiento mediante secado y molienda, secado y disgregación
o sólo disgregación de la biomasa, que favorezca la mezcla con
disolventes y facilite la extracción.
El micelio deshidratado purificado se seca. El
secado puede llevarse a cabo utilizando procedimientos normales en
lotes de sólido o en continuo. La temperatura de secado oscila
entre la temperatura ambiente y 150ºC, preferiblemente no debería
sobrepasar los 60ºC y más preferiblemente debería estar por debajo
de 50ºC. El tiempo de secado depende de la temperatura empleada,
oscilando entre 1 hora y 72 horas. Debido a la posible
descomposición de estos carotenoides por oxidación con el oxígeno
atmosférico, es conveniente efectuar este procedimiento de secado en
ausencia de oxígeno, bien en atmósfera de nitrógeno o al menos a
vacío.
Con el fin de permitirle al disolvente un buen
acceso al carotenoide a extraer, es necesario llevar a cabo una
operación de ruptura previa del micelio, de modo que el área
superficial de contacto sea máxima. El tamaño de partícula óptimo
del micelio seco y roto debería ser inferior a 3 mm,
preferiblemente inferior de 1 mm y más preferiblemente inferior a
0,5 mm.
La disgregación de la biomasa puede realizarse
sobre el producto seco por medios convencionales, por ejemplo
utilizando medios mecánicos de molienda con partes giratorias o
fijas: mazas, tamices, etc., por el paso a través de cilindros
giratorios que presionan uno contra el otro o mediante el sistema de
secado tipo instantáneo (flash) en el equipo de molino de
chorro (jet mill) donde el producto húmedo se alimenta a una
corriente de un gas circulante a temperatura elevada, de manera que
el tiempo de residencia sea el mínimo para conseguir la vaporización
del contenido de componentes líquidos, y se transporta, debido a
diferencias en las densidades del producto, hasta un ciclón donde
se recupera.
Durante el tiempo de secado y en el trayecto
tiene lugar un efecto de homogeneización al chocar las partículas
con las paredes.
Para la extracción del
\beta-caroteno a partir de un micelio
acondicionado tal y como se ha descrito aquí, se pueden emplear
disolventes orgánicos diferentes. Esta invención se refiere al uso
de disolventes de grado alimentario considerados como naturales,
tales como los ésteres de acilo, preferiblemente ésteres de etilo,
propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, o mezclas de los mismos,
que combinan la solubilidad razonablemente elevada de los
componentes carotenoides con su compatibilidad como disolventes
incluidos en el Grupo de la Clase III de la ICH. Estos disolventes
son admisibles tanto en España como dentro de la Comunidad Europea,
para aplicaciones tanto farmacéuticas como alimentarias (RDL
12/04/96 y RDL 16/10/96).
La temperatura de extracción oscila entre la
temperatura ambiente y la del punto de ebullición del disolvente,
preferiblemente entre 50ºC y 80ºC. El tiempo de extracción será el
mínimo necesario para conseguir la solubilización, entre 1 segundo
y 1 hora, preferiblemente entre 1 minuto y 15 minutos. La cantidad
de disolvente empleada depende de la temperatura y de la riqueza
del micelio en carotenoides, oscilando entre 5 ml/g y 20 ml/g. El
número de extracciones varía desde 1 hasta 3. La cantidad de
carotenoides extraídos es superior al 85%, preferiblemente superior
al 90% y más preferiblemente superior al 95%.
Una vez obtenido el extracto rico en carotenoides
es necesario concentrarlo hasta un determinado volumen. La
concentración final de carotenoides en el disolvente tras
concentrar oscila preferiblemente entre 10 y 40 g/l. La temperatura
de concentración debería ser inferior a 80ºC, preferiblemente
inferior a 70ºC y más preferiblemente inferior a 50ºC. El tiempo de
concentración debería ser inferior a 1 hora, preferiblemente
inferior a 30 minutos, y más preferiblemente inferior a 15
minutos.
Una vez concentrado el extracto al volumen
requerido, es necesario adicionar un insolubilizante de los
carotenoides, concretamente un alcohol y más concretamente metanol,
etanol, isopropanol, anhidros, o cualquier otro alcohol en el que la
solubilidad del \beta-caroteno sea baja, en
proporciones entre 1/1 y 6/1 respecto al volumen del disolvente
tras la concentración, con lo cual el rendimiento en
\beta-caroteno cristalino aumenta
considerablemente. La adición del alcohol tiene también un efecto
purificador, recuperándose un producto más puro que cuando no se
adiciona. El tiempo de cristalización oscila entre 15 minutos y 24
horas, preferiblemente entre 1 hora y 12 horas y más
preferiblemente entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalización
debería ser inferior a 25ºC, preferiblemente inferior a 5ºC.
La separación de los cristales de las aguas de
cristalización se puede efectuar por filtración o centrifugación,
desplazando las aguas de cristalización que bañan los cristales
lavándolos con el mismo alcohol empleado para insolubilizarlos.
Los cristales obtenidos se secan a vacío a
temperatura ambiente durante al menos 1 hora hasta obtener un
contenido residual de disolvente acorde con las especificaciones de
concentración máxima establecidas por la legislación, y en el caso
del \beta-caroteno, se establece una pérdida por
secado < 0,2%.
La pureza en beta-caroteno de los
cristales obtenidos, corresponde a un título determinado por
espectrofotometría mediante la lectura de la absorción a 455 nm
disuelto en ciclohexano (E1% 1cm = 2500) según el método
espectrofotométrico de la USP, EP, BP, superior al 90%,
preferiblemente superior al 95% y más preferiblemente superior al
98% con un contenido en otros carotenoides inferior al 4%,
preferiblemente inferior al 2%.
Asimismo el producto cristalino obtenido puede
manejarse y comercializarse como tal o formando parte de
formulaciones en las que la proporción de
\beta-caroteno varíe entre el 1 y el 85%, mezclado
con excipientes o compuestos diferentes, tales como aceite de soja,
aceite de maíz, aceite de oliva, etc., con diferentes grados de
pureza y acompañado de un antioxidante del tipo del tocoferol. Un
objeto de la presente invención es proporcionar una formulación de
carotenoides dispersable en agua, que contenga aproximadamente de 1
a 25 partes en peso de polvo seco de carotenoides encapsulados en
una matriz de almidón de calidad alimentaria que proporcione
\beta-caroteno incluido en el polvo encapsulado
en condiciones estables. Se pueden emplear diferentes tipos de
almidón.
El producto de la presente invención son
formulaciones sólidas de \beta-caroteno,
dispersables en agua.
Los almidones preferidos empleados son almidones
de maíz modificados de calidad alimentaria con un elevado peso
molecular, lo que permite un emulsión sencilla de la fase orgánica
en agua. Después de separar el disolvente, la dispersión satisface
el intervalo de colores del \beta-caroteno. Este
almidón alimentario modificado no produce suficiente
redispersibilidad del polvo seco. Así, se añade también otro
almidón. La segunda variedad es una mezcla de almidones de calidad
alimentaria de pesos moleculares diferentes en un intervalo de
1.000-700.000; este segundo tipo de almidón
proporciona una buena dispersabilidad del producto final.
Como el \beta-caroteno es
sensible a la oxidación, pueden disolverse antioxidantes en el
disolvente que contiene el \beta-caroteno para
intensificar la estabilidad frente al deterioro. En la presente
invención, se puede utilizar cualquier antioxidante autorizado para
alimentos, incluyendo entre otros,
\alpha-tocoferol de origen natural o sintético.
El nivel de antioxidante será suficiente para proteger el
\beta-caroteno. Éste debe ser de 0,1 a 0,3 la
cantidad de \beta-caroteno. También se puede
añadir a la formulación palmitato de ascorbilo debido al efecto
sinérgico antioxidante de la asociación de los dos
antioxidantes.
El método de esta invención es especialmente
aplicable para la recuperación de \beta-caroteno
cristalino de una fuente microbiana, preferiblemente algas, hongos
o levaduras, más preferiblemente de hongos del orden de los
Mucorales, y más preferiblemente de B. trispora.
La extrema pureza conseguida en los cristales
obtenidos por la presente metodología y el empleo de disolventes
considerados como naturales hace que estos cristales sean
aplicables en la industria alimentaria, la industria farmacéutica o
la industria de cosméticos.
La adición de lecitina de suya al medio de
cultivo reduce el contenido de gamma-caroteno
cuando se fermenta en un matraz.
Se prepara un medio de inóculo que contiene por
litro: vainas de soja, 23 g; harina de maíz, 47 g; fosfato
monopotásico 0,5 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g. Su pH inicial
es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 500 ml a
razón de 67 ó 100 ml. Después de esterilizar, se siembran con
suspensiones de esporas de la estirpe (+) de B. trispora y
la estirpe (-) de B. trispora en matraces separados y se
incuban a 25ºC durante 48 horas.
Se prepara un medio base de fermentación que
contiene por litro: vainas de soja, 44 g; harina de maíz, 19 g;
harina de naranja, 10 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g; aceite
vegetal 100 g.. El medio de cultivo que contiene lecitina de soja se
prepara según la descripción anterior y se suplementa con un 1% de
lecitina. El pH se ajusta a 6,3. El medio se reparte en matraces
Erlenmeyer de 250 ml en porciones de 20 ml.
Para la fermentación de
\beta-caroteno, se inoculan matraces que
contienen medio de fermentación con un 10% de un cultivo mixto de
estirpes de B. trispora (+) y B. trispora (-). Todos
los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm. A
las 48 horas de fermentación, se adiciona
\beta-ionona a los matraces a razón de 1 ml por
litro de medio de cultivo y se recoge el micelio al 6º día de
fermentación.
La extracción de \beta-caroteno
se realiza utilizando cualquier método descrito de ruptura celular
que permita liberar el contenido intracelular. Se solubiliza en
cualquier disolvente en el que sea soluble tal como por ejemplo
acetona. Su concentración se puede determinar mediante
espectrofotometría pero se prefiere el uso de cromatografía líquida
(HPLC), utilizando cualquiera de los métodos descritos en la
bibliografía.
La adición de lecitina de soja incrementa la
producción de \beta-caroteno en un 5% y reduce la
producción de \gamma-caroteno en un 60% (véase la
Figura 1). Este experimento muestra que la lecitina permite
incrementar la producción de \beta-caroteno y
también ayuda a la producción de un producto más puro.
La incorporación de lecitina al medio de cultivo
incrementa la producción de beta-caroteno y reduce
el nivel relativo de gamma-caroteno en un
fermentador piloto. Cuando se combina con el control del pH, el
efecto sobre la producción de gamma-caroteno es
incluso mayor.
Se prepara un medio de inóculo que contiene por
litro: vainas de soja, 23 g; harina de maíz, 47 g; fosfato
monopotásico, 0,5 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g. Su pH
inicial es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de
2000 ml, con 500 ml en cada matraz. Después de esterilizar, se
siembran con suspensiones de esporas de la estirpe (+) de B.
trispora y la estirpe (-) de B. trispora en matraces
separados y se incuban a 25ºC durante 48 horas, con agitación
orbital a 250 rpm y 5 cm de excentricidad.
Se transfiere cada una de las estirpes en
condiciones estériles a un tanque intermedio de crecimiento con un
medio de cultivo con la siguiente composición por litro:
Pharmamedia, 29 g; harina de maíz, 47 g; fosfato monopotásico 0,5 g;
hidrocloruro de tiamina, 0,002 g; agente antiespumante, 1 g. Su pH
inicial es de 6,0.
Después de incubar durante 36-48
h, se realiza la mezcla de las estirpes (+) y (-) y se utiliza un
10% de la mezcla para sembrar el medio base de fermentación, cuya
composición por litro es la siguiente: vainas de soja, 50 g; harina
de maíz, 25 g; harina de naranja, 15 g; fosfato dibásico
monopotásico 0,5 g; isoniazida, 0,28 g; hidrocloruro de tiamina,
0,002 g; aceite vegetal 80 g; agente antiespumante, 0,175 g. Este
medio de cultivo se suplementa con un 1% de lecitina de soja.
La fermentación se verifica a una temperatura de
25-28ºC con agitación variable entre 150 y 250 rpm y
una aireación de 1-1,5 v/v/m. El control del pH se
realiza con amoniaco o ácido sulfúrico, manteniéndose dos
condiciones diferentes dependiendo del ensayo: sin control del pH
con un intervalo entre 6,5 y 7,5 o con control a 6,8 \pm 0,1 tras
36 horas de fermentación. Entre las 40 y 50 horas de fermentación se
adicionan 10 g/l de una solución de \beta-ionona
al 10% en aceite vegetal. Entre las 50 y 60 horas se adicionan 10
g/l de una solución de etoxiquina al 2,5% en aceite vegetal.
La fermentación se prolonga durante
100-140 horas, al cabo de las cuales se valora la
producción de \beta-caroteno: la extracción de
\beta-caroteno se realiza mediante cualquier
método descrito con ruptura celular que permita liberar el contenido
intracelular. Se solubiliza en cualquier disolvente en el que sea
soluble, por ejemplo, acetona. Su concentración se puede determinar
por medios espectrofotométricos, pero se prefiere el uso de
cromatografía líquida (HPLC), utilizando cualquiera de los métodos
descritos en la bibliografía.
Los resultados de estos ensayos realizados con el
medio de cultivo con y sin lecitina y las dos condiciones de
control del pH mencionadas anteriormente se presentan en la
siguiente tabla:
Estos datos indican claramente que la
incorporación de lecitina al medio de cultivo incrementa la
producción de beta-caroteno (5% de incremento) y el
nivel relativo de gamma-caroteno (en un 43%).
Cuando se combina con el control del pH, el efecto sobre la
producción de gamma-caroteno es incluso mayor
(63%).
Se recogen tres litros de caldo de fermentación.
El título del caldo es de 6 g de \beta-caroteno
por litro. La biomasa de este caldo se recupera mediante filtración
por Buchner, obteniendo 1000 g de biomasa húmeda. La biomasa húmeda
se resuspende en 3 l de isopropanol azeótropo 85/15 y se agita
durante 30 minutos. La biomasa purificada se vuelve a recuperar
mediante filtración por Buchner.
Esta biomasa se seca en estufa a vacío a una
temperatura inferior a 45ºC y durante 18 horas, hasta que el
contenido en disolventes residuales es del orden de
1-2%. Se obtiene un total de 270 g de biomasa seca y
purificada con un contenido de \beta-caroteno
equivalente a una pureza del 6,5%.
La biomasa seca se muele en un molino de
martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la misma pureza
específica y acondicionado para permitir la extracción con el
disolvente.
La extracción se efectúa mezclando los 270 g de
biomasa molida con 4500 ml de acetato de isobutilo a 70ºC,
manteniéndose en agitación durante 5 minutos. Se separa la biomasa
agotada del disolvente rico filtrando por placa filtrante. La
biomasa agotada se lava con 500 ml de acetato de isobutilo templado
sobre el propio filtro, mezclando los dos disolventes. El total de
acetato de isobutilo rico se concentra a vacío y manteniendo la
temperatura por debajo de 45ºC hasta reducir el volumen a 700 ml,
momento en el cual ha cristalizado parte del
\beta-caroteno. Para completar la cristalización
y obtener un \beta-caroteno más puro, se añaden
2100 ml de isopropanol. La mezcla se mantiene en agitación entre 0
y 5ºC y en atmósfera de nitrógeno durante 3 horas. Se filtra por un
embudo Buchner, lavando los cristales con 25 ml de isopropanol sobre
el embudo Buchner. Se recogen los cristales y se secan, obteniéndose
14 g de cristales de \beta-caroteno con una
pureza del 96% medida por espectrofotometría.
Se recogen aproximadamente 500 l de caldo de
fermentación, con un título en \beta-caroteno de
aproximadamente 5,5 g/l. Este se mezcla directamente con 1500 l de
isopropanol azeótropo con agua 85-15 y se calienta
la mezcla a 40ºC. Después de mantener en agitación durante 30
minutos, se separa la biomasa del líquido por centrifugación con un
decantador. Se recogen alrededor de 180 kg de biomasa húmeda
purificada.
Esta biomasa se seca en secadero rotativo a vacío
hasta conseguir un contenido en disolventes residuales del orden de
1-2%. La temperatura ha de ser inferior a 45ºC y el
tiempo del orden de 12-24 h. Se obtienen 45 kg de
biomasa seca con un contenido de \beta-caroteno
equivalente a una riqueza específica del 5,9%, una pureza
ligeramente inferior.
La biomasa seca se muele en un molino de
martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la misma pureza
específica y acondicionado para permitir la extracción con el
disolvente.
Como alternativa, la biomasa húmeda se seca en un
turbosecador instantáneo (tipo molino de chorro) en cuyo caso no es
necesaria la etapa de molienda.
La extracción se efectúa mezclando los 45 kg de
sólido molido con 800 l de acetato de isobutilo a 70ºC,
manteniéndose en agitación durante 15 minutos. Se separa la biomasa
agotada del disolvente rico por centrifugación con decantador. El
total de acetato de isobutilo se concentra a vacío y manteniendo la
temperatura por debajo de 45ºC hasta reducir el volumen a 110 l,
momento en el cual ha cristalizado parte del
\beta-caroteno. Para completar la cristalización
del \beta-caroteno se añaden 330 l de
isopropanol. Se mantiene la mezcla en agitación mientras se enfría,
durante 3 h a 0-5ºC. Se filtra por un embudo
Buchner recogiendo los cristales de beta-caroteno
que se secan. Se obtienen 2,1 kg de producto con una pureza del 96%
medida por espectrofotometría.
A: Porcentaje de producción de
\beta-caroteno con lecitina (columna derecha) o
sin lecitina (columna izquierda).
B: Porcentaje de producción de
\gamma-caroteno con lecitina (columna derecha) o
sin lecitina (columna izquierda).
Claims (18)
1. Procedimiento de producción de carotenoides
que comprende las etapas de:
- (1)
- Fermentación de una biomasa a base de hongos mucorales en cultivo sumergido
- (2)
- Separación de la biomasa
- (3)
- Purificación de la biomasa por separación de los componentes lipófilos que no sean carotenoides mediante una extracción con alcohol
- (4)
- Secado de la biomasa y disgregación de la misma
- (5)
- Extracción sólido/líquido de los carotenoides contenidos en la biomasa, con disolventes orgánicos de grado alimentario
- (6)
- Concentración de un extracto rico en carotenoides
- (7)
- Precipitación-cristalización de los carotenoides mediante la adición de alcohol
- (8)
- Filtración y secado final,
caracterizado por la adición
al medio de cultivo en la etapa (1) de lecitina combinada con
control del pH después de comenzar la fermentación, en el que dicho
control del pH consiste
en:
- (a)
- ajustar el pH dentro del intervalo de 6,5-7,2;
- (b)
- ajustar el pH después de 24-36 horas de fermentación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el cultivo sumergido se lleva a cabo en
condiciones aerobias, el hongo mucoral pertenece al género
Blakeslea, particularmente B. trispora y el
carotenoide obtenido es el \beta-caroteno.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizado porque la lecitina de soja se añade en un
porcentaje de 0,1-10, preferiblemente de
0,5-5% y más preferiblemente de
0,5-1,5%.
4. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque se cultivan las estirpes (+) y/o (-), o
bien mutantes seleccionados de B. trispora, superproductores
de \beta-caroteno.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la temperatura
durante la fermentación oscila entre 20 y 32ºC.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa (3) de
purificación de la biomasa para la separación de componentes
lipófilos que no sean carotenoides consiste en la suspensión de la
biomasa en un alcohol en el que la solubilidad de los carotenoides
es baja, preferiblemente en metanol, etanol, propanol o
isopropanol.
7. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la purificación de la biomasa (3) se
lleva a cabo en el propio medio de cultivo, directamente después de
la etapa (1) o, alternativamente, una vez separada de dicho medio,
después de la etapa (2).
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 6 y 7, caracterizado porque la cantidad
de alcohol a añadir se encuentra entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio
húmedo, la temperatura durante la suspensión oscila entre la
temperatura ambiente y el punto de ebullición del alcohol añadido,
siendo el tiempo de contacto de 5 minutos a 24 horas.
9. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque cuando la purificación de la biomasa se
produce directamente sobre el caldo de cultivo, las proporciones
caldo: alcohol oscilan entre 1:0,5 y 1:5.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa
de secado-disgregación (4) de la biomasa se puede
llevar a cabo en lotes o como un procedimiento en continuo, en
ausencia de oxígeno, a una temperatura que oscila entre la
temperatura ambiente y 150ºC y durante un tiempo que oscila entre 1
hora y 72 horas.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la disgregación de la biomasa se
produce por medios convencionales hasta alcanzar un tamaño de
partícula inferior a 3 mm.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el alcohol
empleado en la purificación de la biomasa se selecciona entre
metanol, etanol, propanol o isopropanol, o mezclas de los
mismos.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa
de extracción (5) se repite entre 1 y 3 veces y consiste en el
lavado de la biomasa seca y disgregada con disolventes orgánicos de
grado alimentario, a una temperatura comprendida entre la
temperatura ambiente y el punto de ebullición del disolvente,
durante un tiempo que oscila entre 1 segundo y 1 hora, en una
cantidad que oscila entre los 5 ml/g y 20 ml/g, obteniéndose un
extracto rico en carotenoides con un contenido de estas sustancias
superior al 85%, preferiblemente superior al 90% y más
preferiblemente superior al 95%.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
disolvente empleado en la etapa de extracción (5) consiste en un
éster de acilo, preferiblemente un acetato de etilo, propilo,
isopropilo, butilo o isobutilo, o mezclas de los mismos.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
extracto rico en carotenoides se somete a una etapa de concentración
(6) por medios convencionales, a una temperatura inferior a 80ºC,
durante un tiempo inferior a 1 hora, hasta alcanzar una
concentración de carotenoides en el intervalo entre 10 y 40
g/l.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
extracto enriquecido en carotenoides se somete a una etapa (7) de
precipitación-cristalización mediante la adición de
un alcohol, en proporción 1/1 a 1/6 respecto al volumen del
disolvente tras la concentración (6), a una temperatura de
cristalización inferior a 25ºC y durante un tiempo de cristalización
que oscila entre 15 minutos y 24 horas.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el control
del pH se lleva a cabo entre 12 - 50 horas después de comenzar la
fermentación.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque el pH se controla entre 24 - 36 horas
después de comenzar la fermentación y se ajusta en un intervalo de
6,7 - 6,9.
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