ES2220983T3

ES2220983T3 - Procedimiento de tratamiento de adenomas de colon.

Info

Publication number: ES2220983T3
Application number: ES96924537T
Authority: ES
Inventors: Stacia Kargman; Jilly Evans; Thomas J. Simon
Original assignee: Merck Frosst Canada and Co; Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Frosst Canada and Co; Merck and Co Inc
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-15
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2016-07-15
Also published as: DE69632632D1; ATE268176T1; IL122960A0; IL122960A; KR19990029066A; CA2227238C; EA199800139A1; AU6496096A; EP0839034A4; CN1196679A; CZ15698A3; WO1997003667A1; EP0839034B1; EA005073B1; HU225506B1; NZ312997A; HUP9901711A2; CA2227238A1; AU706089B2; MX9800568A

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA RETRASAR O IMPEDIR LA TRANSFORMACION DE UN ADENOMA COLONICO EN UN ADENOCARCINOMA COLONICO Y CONSISTE EN LA ADMINISTRACION A UN PACIENTE CON PAF O CON UNO O VARIOS ADENOMAS DE ESTAS CARACTERISTICAS DE UNA CANTIDAD EFECTIVA TERAPEUTICAMENTE NO TOXICA DE FARMACOS AINE, DE MODO QUE DICHA CANTIDAD SEA EFECTIVA PARA INHIBIR LA PGHS 2 DE DICHO ADENOMA. EL METODO PREFERENTE CONSISTE EN LA ADMINISTRACION DE UN AGENTE INHIBIDOR ESPECIFICO DE PGHS - 2 SEGUN LO DEFINIDO ANTERIORMENTE.

Description

Procedimiento de tratamiento de adenomas de colon.

Esta solicitud se dirige a un procedimiento para tratar adenomas de colon mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz y atóxica de un inhibidor específico de PGHS-2. En particular, esta solicitud se dirige a un procedimiento para prevenir o retardar la transformación de los adenomas de colon en adenocarcinomas de colon mediante la administración de un inhibidor específico de PGHS-2 terapéuticamente eficaz y atóxico.

La enzima prostaglandina G/H sintasa (PGHS) es una enzima clave en la ruta biosintética que conduce a la formación de las prostaglandinas (Watkins, W.D., Peterson, M.B., y Fletcher, J.R. ed. Prostaglandins in Clinical Practice. New York: Raven, 1989 y Dewitt, D.L. Prostaglandin endoperoxide synthase: regulation and enzyme expression. Biochim. Biophys. Acta, 1083; 121-134, 1991). Estos prostanoides son potentes mediadores biológicos con diversos efectos fisiológicos normales y también están implicados en una diversidad de dolencias patológicas que incluyen la inflamación y la transformación neoplásica (Watkins, W.D., Peterson, M.B., y Fletcher, J.R. ed. Prostaglandins in Clinical Practice. New York: Raven, 1989, Dewitt, D.L. Prostaglandin endoperoxide synthase: regulation and enzyme expression. Biochim. Biophys. Acta, 1083; 121-134, 1991 y Xie, W., Robertson, D.L. y Simmons, D.L. Mitogen-
inducible prostaglandin G/H synthase. A new target for nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Drug Dev. Res., 25; 249-265, 1992). Se han identificado dos y isoformas de PGHS (Loll, P.J. y Garavito, R.M. The isoforms of cyclooxygenase: structure and function. Expert Opin. Invest. Drugs, 3; 1171-1180,1994). La PGHS-1 se expresa constitutivamente en la mayoría de los tejidos y se ha propuesto que genera prostaglandinas para las funciones fisiológicas normales. La segunda isoforma, PGHS-2, se caracteriza por una rápida inducción por una diversidad de estímulos, incluyendo mitógenos, hormonas, citoquinas y factores de crecimiento (Loll, P.J. y Garavito, R.M. The isoforms of cyclooxygenase: structure and function. Expert Opin. Invest. Drugs, 3; 1171-1180,1994 y Battistini, B., Botting, R. y Bakhle, Y.S.
COX-1 and COX-2: Toward the Development of more selective NSAIDS. Drug News Perspectives, 7; 501-512, 1994). En dolencias tales como la inflamación, las prostaglandinas derivadas de PGHS-2 pueden ser los efectores predominantes (Masferrer, J.L., Zweifel, B.S., Manning, P.T., Hauser, S.D., Leahy, K.M., Smith, W.G., Isakson, P.C., y Seibert, K. Selective inhibition of inducible cyclooxigenase 2 in vivo is anti-inflammatory and non-ulcerogenic. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91; 3228-3232,1994). Se ha mostrado que tanto la PGHS-1 como la PGHS-2 son dianas de los fármacos antinflamatorios no esteroideos (NSAID) (Battistini, B., Botting, R., y Bakhle, Y.S. COX-1 and COX-2. Toward the Development of more selective NSAIDS. Drug News Perspectivas, 7; 501-512,1994 y O'Neill, G.P., Manzini, J.A., Kargman, S., Yergey, J., Kwan, M.Y., Falgueyret, J.P., Abramovitz, M., Kennedy, B.P. Ouellet, M., Cromlish, W., Culp, S., Evans, J.F., Ford-Hutchinson, A.W. y Vickers, P.J. Overexpression of human prostaglandin G/H Synthase-1 and -2 by recombinant vaccinia virus: inhibition by nonsteroidal anti-inflammatory drugs and biosynthesis of 15-hydroxyeicosatetraenoic acid. Mol. Pharmacol., 45; 245-254, 1994 y DeWitt, D.L., Meade, E.A., y Smith, W.L. PGH synthase isoenzyme selectivity: the potential for safer nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Am.J. Med. (suplemento), 95; 40S-44S, 1993). Véase también el documento WO 94/14977, publicado el 7 de julio de 1994, que describe un procedimiento para evaluar la potencia de los agentes inhibidores de PGHS-2 así como la selectividad por PGHS- 2 sobre PGHS-1.

Se han mostrado niveles elevados de prostaglandinas en diversos cánceres incluyendo los carcinomas de pulmón y colon (McLemore, T.L., Hubbard, W.C., Litterst, C.L., Liu, M.C., Miller, S., McMahon, N.A., Eggleston, J.C., y Boyd, M.R. Profiles of prostaglandin biosynthesis in normal lung and tumor tissue from lung cancer patients. Cancer Res., 48: 3140-3147, 1988 y Rigas, B., Goldman, I.S., y Levine, L. Altered eicosanoid levels in human colon cancer. J. Lab. Clin. Med., 122; 518-523, 1993). En particular, se ha mostrado que los niveles de prostaglandinas son elevados en los pólipos adenomatosos benignos y aumentan adicionalmente en el tejido de colon canceroso, en comparación con la mucosa histológicamente normal. Puesto que se ha mostrado que los prostanoides son inmunodepresivos, pueden jugar un papel en el desarrollo de los tumores (Earnest, D.L., Hixson, L.J., y Alberts, D.S. Piroxicam and other cyclooxygenase inhibitors: potential for cancer chemoprevention. J. Cell. Biochem., 161 (suplemento); 156-166, 1992).

Desde el final de la década de los años setenta, los investigadores han considerado la posibilidad de que la aspirina y los fármacos antinflamatorios no esteroideos relacionados (NSAID) podrían ser beneficiosos para el tratamiento de determinados cánceres, incluyendo el cáncer de colon.

El primer estudio epidemiológico que sugería que la aspirina podría reducir el riesgo del cáncer colorrectal se llevó a cabo en 1988 en un análisis retrospectivo y exploratorio en Melbourne, Australia (Cancer Res., 48: 4399-4404, 1988). El estudio encontró un riesgo un 40% inferior de incidencia de cáncer de colon entre las personas que usaban regularmente aspirina en comparación con aquellas que no usaban aspirina. Más recientemente, los datos de Heath y col., sugieren el posible beneficio de los NSAID en la prevención de las neoplasias colorrectales (Heath, C.W., Jr., Thun, M.J., Greenberg, E.R., Levin, B., y Marnett, L.J. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and human cancer. Cancer, 74; 2885-2888, 1994). Sin embargo, a pesar de este estudio y de los estudios subsecuentes, no hay una prueba fuerte que una el uso de la aspirina con la prevención del cáncer de colon, ni hay una prueba fuerte que demuestre una unión patológica entre el cáncer colorrectal y la PGHS o el valor terapéutico de la inhibición de PGHS mediante la administración de aspirina. Por ejemplo, los pacientes con artritis (muchos de los cuales toman aspirina) pueden ser, sencillamente, menos propensos al cáncer de colon.

En esta solicitud, se describen estudios en los que se ha analizado la expresión de las proteínas humanas PGHS-1 y PGHS-2 en 25 tumores de colon autógenos y normales relacionados, 4 pólipos premalignos de colon, 5 tejidos control de colon (de pacientes sin cáncer) y 3 tejidos de mama humanos cancerosos y normales relacionados. Entre las observaciones de este estudio está el que la proteína PGHS-1 está reducida en el tejido tumoral de colon en comparación con la mucosa colónica histológicamente normal y el que PGHS-2 se detecta en la mayoría de las muestras tumorales de colon mientras que es prácticamente indetectable en los tejidos normales, pólipos y muestras cancerosas de mama. Los niveles aumentados de prostaglandinas en el tejido tumoral del colon derivan de la isoforma PGHS-2 inducible. Estos estudios apoyan la creencia de que la transformación de un adenoma de colon en un adenocarcinoma de colon está mediada por la superproducción dramática y sorprendente de PGHS-2 en el adenoma. De acuerdo con esto, se ha encontrado, sorprendentemente, un procedimiento para retardar o prevenir la transformación de un adenoma de colon en un adenocarcinoma de colon que comprende la administración a un paciente con antecedentes de FAP (poliposis adenomatosa familiar) o a un paciente con uno o más adenomas de colon de una cantidad terapéuticamente eficaz y atóxica de NSAID; siendo, dicha cantidad, eficaz para inhibir a la PGHS-2 en dicho adenoma.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Análisis de inmunotransferencia representativo de la expresión de las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 en la mucosa colónica humana normal y en el tejido tumoral autógeno.

Figura 2. Cuantificación del cambio en la expresión de las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 en el tumor relacionado en comparación con la mucosa normal autógena.

Figura 3. Análisis de inmunotransferencia mostrando la expresión de PGHS-1 y PGHS-2 en los pólipos en los ratones knockout Apc\Delta716 que varían en tamaño de 0,3 a 5 milímetros de diámetro.

Resumen de la invención

Esta invención se dirige a un procedimiento para retardar o prevenir la transformación de un adenoma de colon un adenocarcinoma de colon que comprende la administración a un paciente con FAP o a un paciente con uno o más de dichos adenomas de una cantidad terapéuticamente eficaz y atóxica de NSAID, siendo, dicha cantidad, eficaz para inhibir la PGHS-2 en dicho adenoma. El procedimiento preferido comprende la administración de un agente específico de inhibición de la PGHS-2 tal como se define en el presente documento.

Descripción detallada de las figuras

Figura 1. Análisis de inmunotransferencia representativo de la expresión de las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 en la mucosa colónica humana normal y en el tejido tumoral autógeno. Análisis de inmunotransferencia usando un antisuero anti-PGHS-1 (panel A) y análisis de inmunotransferencia de las mismas muestras mostradas en el panel A usando un antisuero anti-PGHS-2 (panel B). Se separaron mediante SDS-PAGE patrones de PGHS purificados y muestras de proteínas microsómicas (50 \mul por línea), se transfirieron a nitrocelulosa, y se hicieron reaccionar inmunológicamente con antisueros anti-PGHS detectándolos mediante quimioluminiscencia aumentada. Los números 1-4 indican muestras de 4 pacientes representativos de los 25 pacientes examinados. Los valores de densitometría de los pacientes 1-4 en esta figura se corresponden con los de los pacientes 17-20 mostrados en la figura 2. N y T representan los tejidos de la mucosa colónica normal y tumoral relacionados de cada paciente, respectivamente. Los patrones de PGHS-1 y PGHS-2 purificados se muestran en la izquierda. Se indican las posiciones de los marcadores de peso molecular.

Figura 2. Cuantificación del cambio en la expresión de las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 en el tejido tumoral relacionado en comparación con la mucosa normal autógena. Se separaron mediante SDS-PAGE partes alícuotas de patrones de PGHS y de proteínas microsómicas de 25 pacientes (50 \mug por línea), se transfirieron a nitrocelulosa, y se hicieron reaccionar inmunológicamente con antisueros anti-PGHS-1 o anti-PGHS-2, detectándolos mediante quimioluminiscencia aumentada. Las cantidades de la proteína PGHS se determinaron mediante densitometría. La densidad óptica leída a partir de la autorradiografía digitalizada de las cantidades conocidas de los patrones de PGHS-1 y PGHS-2 purificados se usaron para cuantificar las cantidades aproximadas de las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 en las muestras microsómicas de las muestras de la mucosa normal y tumoral. Los valores representan el cambio en la expresión en nanogramos de la mucosa normal respecto al tejido tumoral de cada paciente.

Figura 3. Un análisis de inmunotransferencia mostrando la expresión de PGHS-1 y PGHS-2 en los pólipos que varían en tamaño de 0,3 a 5 milímetros de diámetro (las líneas 1-5 corresponden a las muestras derivadas a partir de pólipos de, aproximadamente, 1-5 mm de diámetro, respectivamente). Se mostró la proteína PGHS-1 en todas las muestras control intestinales y colónicas y en los pólipos. No se detectó inmunorreactividad frente a PGHS-2 en las muestras control intestinales o colónicas. Aunque se detectaron pequeños niveles de la proteína PGHS-2 en los pólipos intestinales mayores (3-5 mm de diámetro) (líneas 3, 4 y 5), se detectaron mayores niveles de especies de PGHS-2 inmunorreactivas en todas las muestras de pólipos de colon que varían en tamaño de 1 a 5 mm de diámetro (líneas 1-5), mostrándose niveles muy altos de proteína PGHS-2 en pólipos de 2-3 mm de diámetro (líneas 2 y 3). Las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 purificadas de oveja (5 ng, 10 ng y 20 ng) se sometieron a electroforesis como patrones y están marcadas de acuerdo con esto.

Descripción detallada de la invención

En una realización, esta invención está dirigida a un procedimiento para retardar o prevenir la transformación de un adenoma de colon en un adenocarcinoma de colon que comprende la administración a un paciente con antecedentes de FAP o a pacientes con uno o más adenomas de una cantidad terapéuticamente eficaz y atóxica de 3-fenil-4-(4-metilsulfonilfenil)-2-(5H)-furanona, siendo, dicha cantidad, eficaz para inhibir la PGHS-2 en dicho adenoma.

Como se apreciará por los expertos en la técnica, un acontecimiento importante en la transformación de un adenoma de colon en un adenocarcinoma de colon es la adquisición de la capacidad de las células del adenoma de invadir la membrana basal del tejido de la submucosa del colon.

De acuerdo con esto, dentro de esta realización está un tipo de invención dirigida a un procedimiento para retardar o prevenir la aparición de la capacidad de un adenoma o una porción celular del mismo de invadir la membrana basal del tejido de la submucosa del colon que comprende la administración a un paciente con antecedentes de FAP o a pacientes con uno o más adenomas de una cantidad terapéuticamente eficaz y atóxica del compuesto anterior, siendo, dicha cantidad, eficaz para inhibir la PGHS-2 en dicho adenoma.

El compuesto anterior se describe en el documento WO 95/00501, publicado el 5 de enero de 1995.

Esta invención se dirige a un procedimiento para retardar o prevenir la transformación de un adenoma en un adenocarcinoma que comprende la administración a un paciente con uno o más adenomas de una cantidad terapéuticamente eficaz y atóxica del compuesto anterior, siendo, dicha cantidad, eficaz para inhibir la producción de PGHS-2 en dicho adenoma. El procedimiento preferido comprende la administración de un agente específico de inhibición de PGHS-2 tal como se define en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención comprenden el compuesto anterior en forma de un ingrediente activo y también pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.

Para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades mediadas por la ciclooxigenasa, el compuesto anterior puede administrarse oralmente, tópicamente, parenteralmente, por inhalación de pulverizados o rectalmente en formulaciones farmacéuticas unitarias que contienen cargas, aditivos y vehículos farmacéuticamente aceptables y atóxicos ordinarios. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye las inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares e intraesternales o las técnicas de infusión intravenosa. Además del tratamiento de animales de sangre caliente tales como ratones, ratas, caballos, ganado bovino, perros, gatos, etc., el compuesto de la invención es eficaz en el tratamiento de los seres humanos.

Tal como se indica anteriormente, las composiciones farmacéuticas para tratar las enfermedades medianas por la ciclooxigenasa-2 tal como se definen, pueden incluir, opcionalmente, uno o más ingredientes de los enumerados anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden estar en una forma adecuada para el uso oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas al uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados entre el grupo constituido por edulcorantes, saborizantes, colorantes y conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente refinadas y sabrosas. Los comprimidos contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables y atóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y desintegrantes, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido algínico; aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga, y lubricantes, por ejemplo, estearato magnésico, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin revestir o pueden estar revestidos mediante técnicas conocidas para retardar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y, de este modo, proporcionar una acción sostenida a lo largo de un periodo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retraso tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También pueden revestirse mediante la técnica descrita en las patentes de Estados Unidos Nº 4.256.108; 4.166.452; y 4.265.874 para conformar comprimidos osmóticos y terapéuticos de liberación controlada.

Las formulaciones para el uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que los ingredientes activos están mezclados con agua o un medio aceitoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen la sustancia activa mezclada con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma adragante y goma arábiga; los agentes de dispersión o humectantes pueden ser un fosfátido que se presenta de un modo natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetamol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados a partir de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol polioxietilenado, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados a partir de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitano polioxietilenado. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más colorantes, uno o más saborizantes, y uno o más edulcorantes, tal como sacarosa, sacarina o aspartamo.

Las suspensiones aceitosas pueden formularse suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones aceitosas pueden contener un espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Los edulcorantes tales como los indicados anteriormente, y los saborizantes pueden añadirse para proporcionar una preparación oral sabrosa. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los ejemplos de los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados son los mencionados anteriormente. Los excipientes adicionales, por ejemplo, edulcorantes, saborizantes y colorantes también pueden estar presentes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida o mezclas de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser fosfátidos que se presentan de una manera natural, por ejemplo, de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados a partir de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitano, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitano polioxietilenado. Las emulsiones también pueden contener edulcorantes y saborizantes.

Los jarabes y elixires pueden formularse con edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa, tales formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante y saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados que han sido mencionados anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable y atóxico, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butandiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y una solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean ordinariamente en forma de un medio disolvente o de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo ligero incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Los compuestos de fórmula I también pueden administrarse en la forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritable adecuado que es sólido a temperatura corriente pero líquido a la temperatura rectal y, por tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.

Para el uso tópico, se emplean cremas, pomadas, gelatinas, soluciones o suspensiones, etc., que contienen el compuesto de fórmula I (para el fin de esta solicitud, la aplicación tópica incluirá enjuagues bucales y colutorios).

Son útiles los niveles de dosificación del orden de, aproximadamente, 0,01 mg a, aproximadamente, 140 mg/kg de peso corporal por día en el tratamiento de las dolencias que se indican anteriormente, o, alternativamente, aproximadamente, 0,5 mg a, aproximadamente, 7 g por paciente por día. Por ejemplo, la inflamación puede ser tratada eficazmente mediante la administración de, aproximadamente, 0,01 a 50 mg del compuesto por kg de peso corporal por día, o, alternativamente, aproximadamente, 0,5 mg a, aproximadamente, 3,5 g por paciente por día.

La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con los vehículos para producir una forma farmacéutica única variará dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administración. Por ejemplo, una formulación destinada para la administración oral en los seres humanos puede contener de 0,5 mg a 5 g de agente activo compuesto con una cantidad apropiada y cómoda de vehículo que puede variar del, aproximadamente, 5 al, aproximadamente, 95% de la composición total. Las formas farmacéuticas unitarias contendrán, generalmente, de, aproximadamente, 1 mg a, aproximadamente, 500 mg de un ingrediente activo, típicamente, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg y 500 mg. Se prevé una dosis una vez al día.

Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores que incluyen la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la ruta de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular en terapia.

Los ejemplos de más adelante tienen la intención de ilustrar, pero no limitar la invención tal como se describe en el presente documento.

Ejemplos Muestras de pacientes

Se examinaron tejidos del colon cancerosos y de la mucosa normal relacionada, pólipos adenomatosos, mucosa colónica normal de pacientes sin cáncer y tejidos de mama cancerosos y normales relacionados. La media de edad y el intervalo de las muestras normales relacionadas y cancerosas de colon fueron 63,3 y 41-93 años, respectivamente. Los especímenes del tejido del colon se obtuvieron a partir de un área sin necrotizar del tumor y a partir de la mucosa normal autógena del mismo paciente en un margen de extirpación localizado a más de 5 cm del tumor. Histológicamente, todos los tumores de colon fueron adenocarcinomas y todos los pacientes tenían cáncer de colon esporádico. Un paciente tenía un foco de adenocarcinoma dentro de un pólipo adenomatoso. Los adenomas de colon provenían de pacientes con poliposis adenomatosa familiar (FAP).

Preparación de las membranas microsómicas a partir de los tejidos del colon

Los tejidos congelados se descongelaron en tampón de homogeneización enfriado en hielo [fosfato potásico 50 mM, pH 7,1, que contiene NaCl 0,1 M, EDTA 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,4 mM, inhibidor de tripsina de soja 60 \mug/ml, leupeptina 2 \mug/ml, aprotinina 2 \mug/ml y pepstatina 2 \mug/ml; todos ellos de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Los tejidos se rompieron en hielo dos veces usando un aparato para romper tejidos (Biospec Products, Bartlesville, OK) y se homogeneizaron mediante sonicación a 4ºC usando un homogeneizador por ultrasonidos de Cole Parmer serie 4710 (Cole Parmer Instruments Co., Chicago, IL). Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 1000 x g durante 15 minutos a 4ºC y los sobrenadantes resultantes se sometieron a centrifugación a 100.000 x g durante 60 minutos a 4ºC. Las fracciones de las membranas se resuspendieron en tampón de homogeneización y se sometieron a sonicación para obtener una suspensión homogénea de membranas. Se determinaron las concentraciones de proteína de cada muestra usando un kit de análisis de proteínas (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá).

Antisueros

Las proteínas purificadas de longitud completa PGHS-1 de la vesícula seminal de oveja y PGHS-2 de la placenta se compraron a Cayman (Ann Arbor, MI) y se usaron para generar anticuerpos policlonales de conejo. Se inyectó 1 ml de adyuvante completo de Freund que contenía 200 \mug de PGHS-1 o PGHS-2 a conejos blancos hembras de Nueva Zelanda. Dos semanas después de la inyección primaria, se inyectó una dosis de recuerdo a los conejos con 100 \mug de PGHS- 1 o PGHS-2 purificada en 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund. El antisuero anti-PGHS reconoce las isoformas humanas de PGHS homólogas con, aproximadamente, una selectividad de 1000 veces por la isoforma apropiada. En las condiciones usadas en este estudio, los anticuerpos anti-PGHS no muestran una reactividad cruzada significativa con la isoforma de PGHS alternativa. Para cada experimento, se cargaron en cada gel dos concentraciones de tanto la proteína PGHS-1 como la PGHS-2 para valorar la selectividad de los anticuerpos.

Electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) y análisis de inmunotransferencia

Las fracciones de las membranas, se mezclaron con tampón de muestra de dodecilsulfato sódico (SDS) (Tris-HCl 20 mM, pH 6,8, que contenía SDS 0,4% (peso/vol.), glicerol 4%, \beta-mercaptoetanol 0,24 M, y azul de bromofenol 0,5%), se hirvieron durante 5 minutos y se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de acuerdo con el procedimiento de Laemmli (Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the Assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685,1970). Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa como se describe previamente (Towbin, H., Staehelin, T., y Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide ges to nitrocellulose sheets: procedure and some Applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75; 4350-4354, 1979). Los anticuerpos primarios frente a PGHS-1 y PGHS-2 se usaron a una dilución final de 1:5000 y 1:7500, respectivamente. El anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo unido a la peroxidasa de rábano (Amersham Life Sciences, Oakville, Ontario, Canadá) se usó a una dilución de 1:3000. La inmunodetección se realizó usando quimioluminiscencia aumentada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham). Las autorradiografías se digitalizaron usando un densitómetro computerizado (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) y se usó el volumen de densidad óptica correspondiente a la isoforma de PGHS purificada para calcular la cantidad (ng) de proteína PGHS en el tejido histológicamente normal del colon y en el tumoral.

Análisis estadístico

Los resultados de este estudio se analizaron mediante una prueba no paramétrica de los signos de Wilcoxon para determinar las diferencias significativas entre los niveles normales y tumorales de PGHS-1 y PGHS-2 (Freund, J.E., Mathematical Statistics. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1992).

Resultados Expresión de PGHS-1 en el colon humano: tejido normal y tumoral

La figura 1 es una inmunotransferencia representativa que muestra la expresión de PGHS en 4 de los 25 pacientes examinados en este estudio. La banda de 72 kDa, que corresponde al peso molecular publicado para PGHS-1 (Otto, J.C., DeWitt, D.L.S., y Smith, W.L. N-glycosylation of prostaglandin endoperoxide synthases-1 and -2 and their orientations in the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 268; 18.234-18.242, 1993), emigra junto al patrón de PGHS-1 purificado de la vesícula seminal bovina (figura 1A) y con la PGHS-1 humana recombinante expresada en células COS-7 (datos sin mostrar; 7). Los resultados de la inmunotransferencia de todos los 25 pacientes se cuantificaron mediante análisis de densitometría y se muestran en un gráfico de barras en la figura 2. En 21 de los 25 pacientes, los niveles de PGHS-1 estaban reducidos en el tejido tumoral en comparación con el del colon normal. La media de la disminución de PGHS-1 en los tumores en comparación con el tejido normal de todos los 25 pacientes examinados fue de 170 ng por mg de proteína microsómica. En comparación con el patrón de PGHS-1 purificado, el intervalo de concentraciones de la PGHS-1 en el tejido normal y tumoral fue de 0-760 ng (mediana: 199,8) y de 4-540 ng (mediana: 51,1) por mg de proteína microsómica, respectivamente. La diferencia en la expresión de PGHS-1 en el tejido normal frente al tejido tumoral fue muy estadísticamente significativa tal como se determinó mediante los análisis no paramétricos (prueba de los signos de Wilcoxon, p<0,0001).

Expresión de PGHS-2 en el colon humano: tejido normal y tumoral

Se muestra en la figura 1B un análisis de inmunotransferencia representativo de 4 de las 25 muestras de colon relacionadas usando un anticuerpo específico anti-PGHS-2. Se realizaron inmunotransferencias por duplicado para valorar la expresión de PGHS-1 (figura 1A) y de PGHS-2 (figura 1B) en las muestras que derivan del mismo paciente. No se detectó inmunorreactividad frente a PGHS-2 en ninguna de las cuatro muestras de tejido de colon normal. Por el contrario, se detectaron bandas inmunorreactivas de 70-72 kDa, que emigraban junto con la PGHS-2 de la placenta de oveja (figura 1B) y con la PGHS-2 recombinante humana expresada en células COS-7 (datos sin mostrar; 7) en el tejido tumoral de 3 de los 4 pacientes mostrados en el presente documento. En total, la proteína PGHS-2 inmunorreactiva se detectó en el tejido tumoral de 19 de los 25 pacientes examinados (figura 2). De un modo global, la media del aumento de PGHS-2 en los tumores de colon de todos los 25 pacientes examinados fue, aproximadamente, 73 ng por mg de proteína microsómica. En comparación con el patrón de PGHS-2, el intervalo de concentraciones de la proteína PGHS-2 inmunorreactiva en el tejido normal y tumoral fue de 0-49 ng (mediana: 3,8 ng) y 1,6-580 ng (mediana: 37,7 ng) por mg de proteína microsómica, respectivamente. La diferencia de la expresión de PGHS- 2 en el tejido normal frente al tejido tumoral fue muy estadísticamente significativa tal como se determinó mediante el análisis no paramétrico (prueba de los signos de Wilcoxon, p<0,0001).

Los tumores de colon se clasificaron en 4 estadios de Duke: A, tumor dentro de la mucosa intestinal; B, tumor hacia la mucosa muscular; C, metástasis en los nódulos linfáticos y D, metástasis en otros tejidos. En este estudio, los tumores de colon provenían de pacientes con todos los estadios de la clasificación de Duke (tabla 1).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

NA = datos no disponibles
ND = no detectable

Estadios de Duke:
\hskip20mm A = tumor dentro de la mucosa
\hskip20mm B = tumor hacia la mucosa muscular
\hskip20mm C = metástasis en los nódulos linfáticos
\hskip20mm D = metástasis en otros tejidos

Tabla 1

Datos de los pacientes. Se muestra la información de cada paciente examinado en este estudio. Cuando está disponible, se indican las medicaciones tomadas por los pacientes. El estadio de Duke de la enfermedad es como sigue: A = tumor dentro de la mucosa; B = tumor hacia la mucosa muscular; C = metástasis en los nódulos linfáticos y D = metástasis en otros tejidos. La cantidad de proteína PGHS inmunorreactiva se expresa en relación al cambio en la expresión en el tejido de la mucosa colónica normal respecto al tejido tumoral. NA: datos no disponibles y ND: inmunorreactividad no detectable.

No hubo asociación entre el estadio y el cambio en la expresión de la proteína PGHS-1 o de la PGHS-2. Esta falta de asociación es coherente con la observación de que los niveles de PGE_{2} en los tumores de colon humanos no parecen estar relacionados con los estadios de Duke (Rigas, B., Goldman, I.S., y Levine, L. Altered eicosanoid levels in human colon cancer, J. Lab. Clin. Med., 122; 518-523, 1993). De un modo interesante, la expresión de PGHS-2 fue baja o bien indetectable en 5 de los 6 pacientes que usaban normalmente medicación antinflamatoria (tabla 1).

Expresión de las proteínas PGHS-1 y -2 en el colon normal, en los pólipos premalignos y en el tejido de mama canceroso y normal relacionados

Se analizó la expresión de las proteínas PGHS-1 y -2 en una diversidad de otros tejidos humanos incluyendo 5tejidos de colon de pacientes sin cáncer, 4 pólipos premalignos y 3 tejidos de mama cancerosos y normales relacionados. Aunque se observó la proteína PGHS-1 en los tejidos normales y cancerosos, la proteína PGHS-2 no se detectó en ninguna de estas muestras.

Discusión

En este estudio, 19 de los 25 tumores de colon examinados expresaban la proteína PGHS-2 mientras que sólo 2 de las 25 muestras de tejido de colon normal expresaban esta proteína. En concomitancia con la expresión inducida de PGHS-2, la expresión de PGHS-1 estaba reducida en 21 de las 25 muestras tumorales en comparación con la mucosa colónica normal adyacente; sin embargo, las concentraciones de la proteína PGHS-1 fueron similares en las muestras control del colon y los pólipos.

A nuestro entender, éste es el primer estudio que examina la expresión de las proteínas PGHS-1 y -2 en el cáncer de colon humano. La investigación previa había mostrado niveles aumentados de eicosanoides, en particular, PGE_{2}, en el cáncer de colon humano (Rigas, B., Goldman, I.S., y Levine, L. Altered eicosanoid levels in human colon cancer. J. Lab. Clin. Med., 122; 518-523, 1993; Bennett, A., Del Tacca, M., Stamford, I.F, y Zebro, T. Prostaglandins from tumours of human large bowel. Br. J. Cancer, 35; 881-884, 1977; Bennett, A., Civier, A., Hensby, C.N., Melhuish, P.B., y Stamford, I.F. Measurement of arachidonate and its metabolites extracted from human normal and malignant gastrointestinal tissues. Gut., 28; 315-318, 1987). Se concluye que el aumento en la enzima PGHS-2 que se observa en el tejido tumoral de colon da como resultado una elevación de los niveles de prostaglandina en estos tumores. Además, se concluye que, puesto que las prostaglandinas pueden tener múltiples efectos en la biología del cáncer, incluyendo la activación del crecimiento y la modulación de la supervivencia inmunitaria, los niveles elevados de prostanoides dentro de los tumores ayudarán al crecimiento y desarrollo tumoral (Earnest, D.L., Hixson, L.J., y Alberts, D.S. Piroxicam and other cyclooxygenase inhibitors. Potential for cancer chemoprevention. J. Cell. Biochem., 161 (suplemento); 156-166, 1992). De modo interesante, no se observó proteína PGHS-2 en el examen de las muestras de cáncer de mama. De este modo, la expresión de la proteína PGHS-2 es una característica típica de la transformación del tejido promaligno a las fases malignas.

Eberhart y sus colaboradores mostraron una regulación por incremento del ARNm de PGHS-2 en adenomas y adenocarcinomas colorrectales humanos (Eberhart, C.E., Coffey, R.J., Radica, A., Giardiello, F.M., Ferrenbach, S., Dubois, R.N. Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology, 107; 1183-1188, 1994). Aunque es un hallazgo interesante, puede no ser indicativo de la expresión real de la enzima debido a la compleja regulación postranscripcional y traduccional del ARNm de PGHS-2. Por ejemplo, Hoff y col. (Hoff, T., DeWitt, D., Kaever, V., Resch, K., y Goppelt-Struebe, M. Differentiation-associated expression of prostaglandin G/H synthase in monocytic cells. FEBS Lett., 320; 38-42, 1993), Lee y col. (Lee, S.H., Soyoola, E., Chanmugam, P., Hart, S., Sun, W., Zhong, H., Liou, S., Simmons, D., y Hwang, D. Selective expression of mitogen-inducible cyclooxygenase in macrophages stimulated with lipopolysaccharide. J. Biol. Chem., 267; 25.934-25.938, 1992) y los laboratorios de los autores de la presente invención han mostrado una expresión sustancial del ARNm de PGHS-2 sin una expresión concomitante de proteína PGHS-2. Por lo tanto, el examen de la expresión de la proteína PGHS es crítico para estimar la concentración de la enzima PGHS-2.

Nada en la técnica sugería la ausencia de proteína PGHS-2 en los pólipos de 4 pacientes con poliposis adenomatosa familiar, especialmente, en vistas del indicio, en diversos grupos, de que el sulindac (que inhibe tanto la PGHS-1 como la PGHS-2) daba como resultado una regresión del pólipo en los pacientes con poliposis familiar. Las muestras de pólipos humanos fueron mezclas de pequeños pólipos de colon que variaban en tamaño de 0,4 a < 5 mm de diámetro. Según nuestra opinión, la proteína PGHS-2 se expresa en el estadio tardío en la secuencia pólipo-cáncer, cuando los pólipos son mayores en diámetro, quizás mayores o iguales a 5 mm de tamaño. Un reciente estudio de Ladenheim y col. publica que el sulindac no da como resultado una regresión de los pólipos de colon esporádicos; sin embargo, ponen énfasis en que su estudio se llevó a cabo en pólipos esporádicos tempranos (67% de los pólipos eran \leq 5 mm) y sugieren que la respuesta a los NSAID puede ser más favorable en los pólipos en un "estadio particular a lo largo de la secuencia adenoma-carcinoma (Ladenheim, J., García, G., Titzer, D., Herzenberg, H., Lavori, P., Edson, R., y Omary, B. Effect of sulindac on sporadic colonic polyps. Gastroenterology, 108; 1083-1087,1995)".

El uso prolongado de NSAID está asociado con efectos secundarios que incluyen toxicidad renal, ulceración gastrointestinal y aumento de la hemorragia. Los NSAID actuales tales como la aspirina, sulindac e indometacina, tienen poca selectividad en la inhibición de PGHS-1 o bien PGHS-2 (Battistini, B., Botting, R., y Bakhle, Y.S. COX-1 and COX-2: Toward the Development of more selective NSAIDS. Drug News Prespectives, 7; 501-512, 1994; O'Neill, G.P., Manzini, J.A., Kargman, S., Yergey, J., Kwan, M.Y., Falgueyret, J.P., Abramovitz, M., Kennedy, B.P., Ouellet, M., Cromlish, W., Culp, S., Evans, J.F., Ford-Hutchinson, A.W., y Vickers, P.J. Overexpression of human prostaglandin G/H synthase-1 and -2 by recombinant vaccinia virus: inhibition by nonsteroidal anti-inflammatory drugs and biosynthesis of 15-hydroxyeicosatetraenoic acid. Mol. Pharmacol., 45; 245-254, 1994; DeWitt, D.L., Meade, E.A., y Smith, W.L. PGH synthase isoenzyme selectivity: the potential for safer nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Am. J. Med. (suplemento), 95; 40S-44S, 1993). Se ha sugerido que los inhibidores selectivos de PGHS-2 tendrían efectos terapéuticos útiles junto con una capacidad disminuida de inducir efectos secundarios en base a sus mecanismos. Recientemente, se ha mostrado que un inhibidor selectivo de PGHS-2, NS-398, tiene efectos antinflamatorios, antipiréticos y analgésicos en la rata sin ser ulcerogénico (Futaki, N., Yoshikawa, K., Hamasaka, Y., Arai, I., Higuchi, S., Iizuka, H., y Otomo, S. NS-398, a novel non-steroidal anti-inflammatory drug with potent analgesic and antipyretic effects, which causes minimal stomach lesions. Gen. Pharmacol., 24; 105-110, 1993; Futaki, N., Takahashi, S., Yokohama, M., Arai, I., Higuchi, S., y Otomo, S. NS-398, a new anti-inflammatory agent, selectively inhibits prostaglandin G/H synthase/cyclooxygenase (COX-2) activity in vitro. Prostaglandins, 47; 55-59, 1994). El presente estudio, que examina la expresión de PGHS-1 y PGHS-2 en el colon, muestra que ambas isoformas PGHS están presentes en los tumores del colon.

Pólipos de ratón

Los ratones knockout Apc\Delta716 (desarrollados por el Dr. Taketo en Banyo Merck, ref: Oxima, M., Ounshima, H., Kitagawa, K., Kobayashi, M., Itakura, C. y Taketo, M. Loss of Apc heteroxygosity and abnormal tissue building in nascent intestinal polyps in mice carrying a truncated Apc genetruncation mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4482-4486, 1995) desarrollan múltiples pólipos a lo largo de su tracto intestinal. Se recogieron de seis ratones (machos y hembras) de generaciones de ratones N1, N2 y N4 de retrocruzamiento muestras de pequeños pólipos intestinales y de colon que variaban en tamaño de 0,3 a 5,6 mm a partir de ratones knockout Apc\Delta716 y se congelaron inmediatamente.

Resultados Expresión de PGHS-1 y PGHS-2 en pólipos de ratón Apc\Delta716

Se examinó la expresión de las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 en pólipos de tamaño aumentado de ratones Apc\Delta716. La figura 3 es un análisis de inmunotransferencia que muestra la expresión de PGHS-1 y PGHS-2 en pólipos que varían en tamaño de 0,3 a 5 mm de diámetro (las líneas 1-5 corresponden a muestras que derivan de pólipos de, aproximadamente, 1-5 mm de diámetro, respectivamente). Se mostró la proteína PGHS-1 en todas las muestras control intestinales y colónicas y en los pólipos. No se detectó inmunorreactividad frente a PGHS-2 en las muestras control intestinales o colónicas. Aunque se detectaron niveles bajos de proteína PGHS-2 en los pólipos intestinales mayores (3-5 mm de diámetro) (líneas 3, 4 y 5), se detectaron niveles mayores de especies inmunorreactivas de PGHS-2 en todas las muestras de pólipos de colon que variaban en tamaño de 1 a 5 mm de diámetro (líneas 1-5) mostrándose niveles muy altos de proteína PGHS-2 en pólipos de 2-3 mm de diámetro (líneas 2 y 3). Las proteínas PGHS-1 y PGHS-2 purificadas de oveja (5 ng, 10 ng y 20 ng) se sometieron a electroforesis como patrones y se marcaron de acuerdo con esto. Se cree que la inducción dramática de COX-2 durante el crecimiento del pólipo refleja un papel crítico de COX-2 en la iniciación de la transformación de adenoma en adenocarcinoma.

Claims

1. Uso de 3-fenil-4-(4-metilsulfonilfenil)-2-(5H)-furanona para la fabricación de un medicamento para tratar los adenomas de colon en un paciente con antecedentes de FAP o en un paciente con uno o más adenomas.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tratamiento es retardar o prevenir la transformación de un adenoma de colon en un adenocarcinoma de colon.

3. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tratamiento es retardar o prevenir la aparición de la capacidad de un adenoma de invadir la membrana basal del tejido de la submucosa del colon.