ES2219764T3 - Ratones transgenicos que pueden expresar el factor inhibidor de leucemia. - Google Patents
Ratones transgenicos que pueden expresar el factor inhibidor de leucemia.Info
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Abstract
DE ACUERDO CON AL PRESENTE INVENCION, SE PROPORCIONAN MAMIFEROS TRANSGENICOS QUE SON CAPACES DE EXPRESAR ESPECIFICAMENTE EL FACTOR INHIBIDOR DE LA LEUCEMIA EN LA HIPOFISIS. LOS MAMIFEROS TRANSGENICOS DE LA INVENCION SON UTILES COMO MODELOS ANIMALES DE TRASTORNOS HIPOFISARIOS. LOS MAMIFEROS TRANSGENICOS DE LA INVENCION SON TAMBIEN UTILES PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE ESTIMULAN LA PRODUCCION DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO, COMPUESTOS UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS FISIOLOGICOS ASOCIADOS AL CRANEOFARINGIOMA, COMPUESTOS UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS FISIOLOGICOS ASOCIADOS CON QUISTES HIPOFISARIOS, Y SIMILARES.
Description
Ratones transgénicos que pueden expresar el
factor inhibidor de leucemia.
La presente invención se refiere a animales
transgénicos y usos para los mismos. En un aspecto particular, la
presente invención se refiere a animales transgénicos que
sobreexpresan el factor inhibidor de leucemia en la hipófisis. En
otro aspecto, la presente invención se refiere a modelos animales
para trastornos hipofisarios.
El factor inhibidor de leucemia (LIF), una
citocina pleiotrópica, es un determinante del desarrollo y la
función neuronal, hematopoyética y metabólica. El LIF detiene la
diferenciación de hemocitoblastos embrionarios in vitro y la
arteriogénesis de vasos pequeños. La sobreexpresión in vivo
del LIF específico de tejido conduce al cambio de la inervación
simpática noradrenérgica a la colinérgica en el páncreas o a
epitelio tímico alterado e interconversión de las morfologías tímica
y de los ganglios linfáticos. La inyección de células
hematopoyéticas que producen LIF produce caquexia y mortalidad en
los ratones.
El LIF hipofisario y sus sitios de unión se
expresan predominantemente en los corticotrofos y somatotrofos de
feto humano tan pronto como a las 14 semanas de gestación. El LIF
actúa potentemente en sinergia con la hormona liberadora de
corticotropina (CRH) para potenciar la transcripción de la
proopiomelanocortina (POMC) y la secreción de adrenocorticotropina
(ACTH) in vitro. A la inversa, el LIF antagoniza la
proliferación de pituicitos inducida por CRH, atenuando el ciclo
celular en la fase S. Además, la inyección de lipopolisacárido
endotóxico induce tanto la expresión de LIF como del receptor de LIF
en el hipotálamo e hipófisis murinos, concomitantemente con la
inducción de ACTH. El LIF infundido como tratamiento prolongado en
dosis múltiples a ratones que portan un gen LIF alterado (con
déficit de LIF) estimula la secreción de ACTH mientras que atenúa la
secreción de hormona de crecimiento (GH) en un 39%.
Bamber et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 91, 7839-7843 (1994) prepararon ratones
transgénicos, que expresan LIF en islotes pancreáticos bajo el
control del promotor de insulina para probar si el LIF puede influir
en la diferenciación neuronal in vivo y se evaluó el fenotipo
del neurotransmisor de la inervación pancreática simpática.
Shen et al., The EMBO Journal,
13(6), 1375-1385 (1994) generaron una línea
de ratones transgénicos que expresa la proteína LIF difusible
específicamente en las células T, para investigar los efectos de LIF
sobre el sistema linfático.
La patente de los EE.UU. número 5.223.610
describe un método de ingeniería genética fisiológica mediante la
alteración genética de niveles de segundo mensajero en las células
para la hiperactivación o inhibición de la función celular en el
interior de las células, tejidos y animales introduciendo un gen
extraño que altere un sistema de segundo mensajero. En particular,
en la columna 16, líneas 64 y sig., se describen animales que
expresan un gen modulador no letal en las células que liberan la
hormona de crecimiento hipofisaria.
Los hallazgos descritos anteriormente implican
que el LIF actúa para regular tanto el desarrollo hipofisario fetal
como las respuestas funcionales hipofisarias de los adultos al
estrés. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de determinar
los efectos de la sobreexpresión de LIF dirigida por la
hipófisis.
Según la presente invención, se prevén mamíferos
transgénicos que pueden expresar específicamente el factor inhibidor
de leucemia en la hipófisis. Se ha descubierto que los mamíferos
transgénicos de la invención son útiles como modelos animales de
trastornos hipofisarios. Los mamíferos transgénicos de la invención
son útiles también para identificar compuestos que estimulen la
producción de hormona de crecimiento, compuestos útiles para el
tratamiento de trastornos fisiológicos asociados con el
craneofaringioma, compuestos útiles para el tratamiento de
trastornos fisiológicos asociados con los quistes hipofisarios y
similares.
La figura 1 muestra el constructo de LIF murino
recombinante utilizado como el transgén para la producción de un
mamífero transgénico de la invención.
Las figuras 2a, 2b, 2c y 2d muestran los pesos
corporales (PC) relativos de 3 ratones transgénicos fundadores
(F-0_{1}, F-0_{2},
F-0_{3}) y un ratón de primera generación
F-1_{1}, respectivamente. Se pesaron los ratones
WT ("wild type", de tipo natural), crías de la misma camada
(círculos cerrados) y transgénicos (círculos abiertos) a las 10:00
a.m. en los días indicados. Cada punto de dato representa la media
\pm intervalo de 2, 1, 3 y 3 animales WT y un ratón transgénico en
los paneles a, b, c y d, respectivamente.
La figura 3 muestra los niveles de GH en los
ratones WT, F-0_{1} y F-0_{2}.
Se obtuvo sangre retro-orbital de cada animal bajo
anestesia ligera (metoxiflurano, 10 segundos) a las 10:00 a.m. en 3
días consecutivos. Cada punto de dato representa la media \pm
intervalo de determinaciones por duplicado en cada animal.
Según la presente invención, se prevén ratones
transgénicos que contienen un ácido nucleico exógeno que codifica
para el factor inhibidor de leucemia (LIF), en los que dicho LIF
puede expresarse específicamente en la hipófisis.
Tal como se utiliza en el presente documento,
"ratón transgénico" se refiere a un ratón que contiene un
transgén recombinante heredable. Tales ratones transgénicos pueden
prepararse mediante métodos bien conocidos, tales como los descritos
en, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. 4.736.866; 5.175.383;
5.175.384; 5.175.385; 5.347.075 y similares (cada una de las cuales
se incorpora mediante referencia, en su totalidad, en el presente
documento).
Tal como se utiliza en el presente documento,
"Factor inhibidor de leucemia" (LIF) se refiere a una proteína
que: (1) tiene la capacidad de suprimir la proliferación de células
de leucemia mieloide tales como las células M1, con la
diferenciación asociada de las células leucémicas; (2) competirá con
una proteína que tiene la secuencia definida del LIF murino o LIF
humano para unirse a receptores celulares específicos sobre las
células M1 o macrófagos murinos o humanos (véase la patente de los
EE.UU. 5.427.925). Proteínas LIF adecuadas y ácidos nucleicos que
codifican para las mismas, contemplados para su uso en la práctica
de la presente invención, por ejemplo, los descritos en las patentes
de los EE.UU. 5.187.077; 5.427.925; 5.443.825, y similares (cada una
de las cuales se incorpora mediante referencia, en su totalidad, en
el presente documento). Una proteína LIF preferida actualmente y el
ácido nucleico que codifica para la misma es el LIF murino (véase la
patente de los EE.UU. 5.187.077).
Tal como se emplea en el presente documento, la
frase "ácido nucleico exógeno" se refiere a la secuencia de
ácido nucleico que no es nativa para el huésped, o que está presente
en el huésped en otro entorno distinto al nativo (por ejemplo, como
parte de un constructo de ADN modificado mediante ingeniería
genética). El ácido nucleico que codifica para LIF contemplado para
su uso en el presente documento puede obtenerse a partir de fuentes
naturales o puede prepararse de manera sintética. La secuencia
preferida actualmente para su uso en el presente documento es ADNc
que codifica para el LIF murino o humano, siendo especialmente
preferido para LIF murino. Cuando un constructo de expresión
contiene un gen endógeno que codifica para una proteína LIF que se
produce naturalmente, el ADNc para tal gen endógeno está unido
operativamente a un promotor diferente de su promotor nativo, de tal
manera que el gen puede sobreexpresarse con respecto a los niveles
de expresión que se producen naturalmente en el mamífero de tipo
natural correspondiente, es decir, el mamífero transgénico puede
producir niveles superiores de la proteína codificada que los que se
producen naturalmente.
Tal como se utiliza en el presente documento, una
proteína LIF "sobreexpresada" se refiere a una proteína que se
produce en cantidades mayores que las que se producen de manera
endógena. La sobreexpresión puede conseguirse, por ejemplo, uniendo
un transgén a un promotor constitutivo apropiado, de tal manera que
el transgén se exprese continuamente. Alternativamente, el transgén
puede unirse a un promotor fuerte, inducible de modo que la
sobreexpresión pueda producirse libremente.
Niveles adecuados de sobreexpresión de LIF
incluyen la expresión del transgén en aproximadamente 1,5 veces
hasta aproximadamente 1000 veces o más el nivel de expresión que se
produce naturalmente del gen endógeno. Niveles preferidos de
sobreexpresión son al menos aproximadamente 5 veces, prefiriéndose
especialmente al menos aproximadamente 10 veces el nivel de
expresión que se produce naturalmente del gen endógeno.
Los transgenes que codifican para proteínas LIF
adecuadas están contenidos normalmente en constructos de expresión.
La frase "constructo de expresión" se refiere a una molécula de
ADN que puede dirigir la transcripción y la traducción de un gen
estructural (es decir, ADNc) de modo que se sintetice una proteína
deseada. El constructo de expresión comprende al menos un promotor
unido operativamente a al menos un transgén que codifica para una
proteína deseada, y una secuencia de terminación de la
transcripción. Por tanto, el segmento que codifica para la proteína
se transcribe bajo la regulación de la región promotora en un
transcrito que puede proporcionar, tras la traducción, la proteína
deseada. La orientación y el posicionamiento adecuados del marco de
lectura de los diversos segmentos del constructo de expresión están
dentro de los conocimientos de las personas expertas habituales en
la técnica; se facilitan detalles adicionales en los ejemplos.
La región promotora se refiere a la parte de un
gen que controla la transcripción del ADN al que se une
operativamente. La región promotora incluye secuencias específicas
de ADN que son suficientes para el reconocimiento por la ARN
polimerasa, la unión y el inicio de la transcripción. El promotor
particular seleccionado debe poder producir suficiente expresión
para dar como resultado la producción de una cantidad eficaz de
proteína LIF.
Los mamíferos transgénicos preferidos actualmente
según la invención son aquellos que pueden sobreproducir LIF,
específicamente en la hipófisis. Esta sobreexpresión selectiva puede
conseguirse de una variedad de maneras, por ejemplo, manteniendo el
LIF bajo el control de la expresión de un promotor específico de la
hipófisis. Promotores específicos de la hipófisis adecuados pueden
ser promotores regulados temporalmente (por ejemplo, inducibles) o
promotores constitutivos.
Ejemplos de promotores inducibles, regulados
temporalmente y específicos de la hipófisis adecuados incluyen
promotores de la hormona de crecimiento (GH) y similares. Un
promotor inducible, regulado temporalmente preferido es el promotor
de la hormona del crecimiento de rata (rGH). Debe entenderse que
este promotor puede no ser el óptimo para todas las realizaciones de
la presente invención. Pueden modificarse los promotores utilizados
en los constructos de ADN de la presente invención, si se desea, sin
afectar a sus características de control.
Promotores "constitutivos" específicos de la
hipófisis adecuados son aquellos que son activos en la hipófisis en
todas las condiciones del entorno y en todas las fases de desarrollo
o diferenciación celular. Promotores constitutivos específicos de la
hipófisis adecuados para su uso en la práctica de la presente
invención están ampliamente disponibles y son bien conocidos en la
técnica. Promotores constitutivos específicos de la hipófisis
adecuados a modo de ejemplo incluyen el promotor de la subunidad
alfa, el promotor de la POMC, el promotor de Pit-1 y
similares.
Según otra realización de la presente invención,
se prevén constructo(s) de ácido nucleico que comprenden el /
los constructo(s) de expresión descrito(s)
anteriormente. La expresión "constructo de ácido nucleico", o
la forma abreviada "constructo", tal como se utilizan en el
presente documento, y en toda la memoria descriptiva y las
reivindicaciones, se refiere a una molécula de ácido nucleico
recombinante que puede incluir constructos de expresión, orígenes de
la replicación del ADN, genes procarióticos y eucarióticos de
diversas fuentes (tales como genes marcadores seleccionables), genes
represores, así como cualquier otra secuencia de nucleótidos. El
constructo puede ser lineal o estar en la forma circular de un
vector de plásmido. Un constructo de ácido nucleico de la invención
particularmente preferido es el constructo de expresión
rGH-mLIF descrito en el ejemplo 1 y expuesto en la
figura 1.
Los constructos de ácido nucleico de la presente
invención se dice que están "asociados operativamente" entre
sí, de tal manera que dichos transgenes pueden expresarse mediante
traducción para producir la proteína codificada en condiciones
adecuadas bien conocidas por los expertos en la técnica.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "plásmido" o "vector" se refiere a bucles de ADN
circular, bicatenario, que no están unidos a los cromosomas. Los
expertos en la técnica reconocerán que los términos plásmido y
vector pueden utilizarse de manera intercambiable. Un plásmido
contiene ADN que puede producir la expresión de secuencias de ADN
contenidas en el mismo, en las que tales secuencias están en
asociación operativa con otras secuencias que pueden producir su
expresión, tales como secuencias promotoras y similares. El tipo y
número de vectores empleados no es crítico, siempre que los
transgenes contenidos en los mismos sean heredables, por ejemplo,
que puedan expresarse por cada generación de mamíferos. Vectores
adecuados para su uso en la expresión de transgenes LIF descritos en
el presente documento incluyen: pBluescript SK +/- (Stratagene, La
Jolla, CA), pcDNA3 (Invitrogen, La Jolla, CA) y similares.
Los mamíferos transgénicos de la invención,
además de poder sobreproducir LIF, normalmente se caracterizan
además por tener niveles sustancialmente reducidos de GH con
respecto a un mamífero de tipo natural correspondiente. Tales
niveles reducidos de GH son normalmente inferiores a aproximadamente
el 50%, preferiblemente el 25%, con respecto a los niveles de GH en
un mamífero de tipo natural correspondiente, prefiriéndose
especialmente menos de aproximadamente el 10%. Por tanto, mientras
que los niveles de GH pueden variar dentro de amplios intervalos,
los mamíferos transgénicos de la invención muestran normalmente
niveles fisiológicos anómalamente reducidos de la hormona de
crecimiento. En consecuencia, los mamíferos transgénicos de la
invención son útiles como un modelo animal para una variedad de
trastornos hipofisarios y trastornos por déficit de la hormona de
crecimiento.
Por ejemplo, el desarrollo de quistes
hipofisarios es común en una amplia variedad de especies, incluido
el hombre. En los ratones, la bolsa de Rathke es evidente en el día
gestacional 8,5; en el día 14 su lumen se comprime por el desarrollo
de la adenohipófisis y el tallo hipofisario. A los 16 días, los 3
componentes funcionales de la hipófisis, incluyendo los lóbulos
anterior, intermedio y posterior, son evidentes. La expresión de la
hormona trópica de la hipófisis se produce desde el día 11,5,
comenzando con la subunidad \alpha, que está restringida a la
bolsa de Rathke definitiva. La expresión de GH es evidente sólo en
el día 17,5 de manera embrionaria, antes de la obliteración final de
la bolsa de Rathke en el día 18. La restricción de la expresión
hormonal a los tipos de células trópicas específicas de la hipófisis
anterior se produce cuando se oblitera la bolsa.
La expresión de LIF en la hipófisis embrionaria
de un ratón transgénico según la presente invención dio como
resultado la detención del desarrollo de la hipófisis murina. En
este ratón transgénico, los quistes hipofisarios podrían representar
el fracaso de la cavidad hipofisaria en cerrarse. Alternativamente,
los quistes pueden ser invaginaciones de la pared anterior del
epitelio de la hendidura de Rathke, que ha fracasado en formar
células de secreción hormonal diferenciadas. Los quistes parecen de
origen embrionario ya que están flanqueados por células epiteliales
primitivas, inmunopositivas frente a citoqueratina y
S-100 e inmunonegativas frente a hormonas trópicas.
Esto está de acuerdo con otros estudios que han demostrado que LIF
es un potente inhibidor de la diferenciación de células
ectodérmicas. En un ratón transgénico según la presente invención,
la expresión de LIF en la hipófisis embrionaria también dio como
resultado la desregulación de los somatotrofos con una disminución
del 49% en las células secretoras de GH y de GH no detectable en el
suero.
Puesto que la expresión del transgén de LIF en
los ratones transgénicos de la invención está controlada por el
promotor de GH de rata, se esperaría la expresión del transgén de
LIF en el mismo momento (día embrionario 17,5) y en el mismo tipo de
células que la GH endógena. Por tanto, la desregulación de los
somatotrofos puede deberse a la sobreproducción de un producto de
transgén y una alteración generalizada de la maquinaria celular;
alternativamente, podría deberse a efectos autocrinos del LIF sobre
la célula somatotrofa. Sin embargo, la alteración de la maquinaria
celular por el transgén es improbable ya que se han expresado otros
transgenes utilizando este promotor y la función somatotrofa
endógena no se alteró. Los niveles bajos de ARNm para GH y GH
circulante no detectable implican una biosíntesis de GH defectuosa.
Además, puesto que las 3 líneas fundadoras separadas descritas en el
ejemplo 2, expresaron todas un fenotipo con déficit de GH similar,
es improbable que la alteración del gen de la GH estructural
endógeno por el transgén haya producido un déficit de GH. Además, no
se observó ningún cambio en la estructura del gen de la GH en los
ratones transgénicos cuando se analizaron los segmentos de
restricción para el gen de la GH.
Puesto que se espera que el promotor de GH
transactive la expresión génica sólo en el hemocitoblasto precursor
acidófilo común tanto a GH como a PRL (prolactina), está claro que a
pesar de la presencia de Pit-1, se atenúa la
expresión hipofisaria de GH en los ratones transgénicos de la
presente invención. De manera interesante, la expresión de
fosfo-CREB (proteína de unión al elemento de
respuesta al AMP cíclico), que está asociado con la transactivación
de la transcripción de GH, fue inferior en el animal transgénico, lo
que apoya la conclusión de que, además de fracasar la maduración
quística, también se manifiesta una inhibición directa de la
transcripción de GH en el modelo de animal transgénico de la
invención. El grado de retardo del crecimiento observado en los
animales transgénicos de la invención es superior al observado en
otros modelos en los que se extirpó el linaje de somatotrofos
utilizando o bien timidina cinasa o bien la toxina diftérica, o en
los que se inactivó funcionalmente el gen de la GH utilizando CREB
mutada. De manera interesante, los corticotrofos fetales humanos
expresan abundantes receptores de LIF y, en el modelo animal
descrito en el presente documento, la sobreexpresión de LIF
hipofisario dio como resultado una hiperplasia corticotrofa. La
abundancia relativa de células corticotrofas y la inducción del ARNm
para POMC pueden reflejar la estimulación paracrina de POMC, tal
como se ha mostrado in vitro, donde el LIF es un potente
inductor de la transcripción de POMC. In vivo, la forma
difusible, alternativamente de corte y empalme del transcrito de
ARNm para LIF, se expresa en la hipófisis sometida a tensión,
dándole un crédito adicional a un papel paracrino para el LIF en la
inducción de POMC.
La capacidad para suprimir el desarrollo del
linaje somatotrofo y para inducir los corticotrofos sugiere una
función intrahipofisaria novedosa para el LIF. Por tanto, el LIF es
un potente regulador del desarrollo hipofisario después del día
embrionario 16, cuando se inicia la expresión de GH.
Alternativamente, los hallazgos descritos en el presente documento
podrían indicar la desdiferenciación de los somatotrofos
comprometidos para dar células indiferenciadas más primitivas en
respuesta al LIF. La expresión del transgén de LIF se encontró que
era letal en el útero en al menos el 12,5% de los fetos
seleccionados en el día embrionario 18,5. Los supervivientes
transgénicos posnatales pueden haber tenido una expresión inferior
de LIF intrahipofisario y estos ratones viables pueden reflejar un
sitio de integración del transgén menos favorable. Por tanto, la
sobreexpresión de LIF hipofisario durante el desarrollo inhibe y
estimula las células adenohipofisarias. La expresión de LIF
específica de la hipófisis también inhibe el cierre de la bolsa de
Rathke, así como también inhibe el desarrollo normal de los
somatotrofos y la producción de GH. Por el contrario, se estimulan
las células que producen ACTH en los ratones transgénicos de la
invención. Esto está de acuerdo con la función del LIF como un
inhibidor de la diferenciación celular, así como con su capacidad
para cambiar notablemente el transcurso de los patrones de
diferenciación celular.
En los ratones transgénicos de LIF dirigido a la
hipófisis de la invención, la persistencia de quistes
neuroectodérmicos asociados con la hipoexpresión de GH y PRL
proporciona un modelo animal para los quistes hipofisarios humanos o
quistes paraselares (que pueden estar asociados con el déficit de
hormona de crecimiento). La sobreexpresión de LIF hipofisario puede
estar implicado también en la patogénesis de quistes hipofisarios en
la infancia, incluyendo el craneofaringioma, el tumor selar más
frecuente en la infancia. Estas lesiones quísticas se considera que
se derivan de restos celulares de origen neuroectodérmico de la
bolsa de Rathke y que se extienden hasta el diencéfalo durante el
desarrollo fetal. Los niños con craneofaringioma muestran
característicamente una corta estatura, debido al déficit de GH, que
es la anomalía hormonal más frecuente encontrada. El modelo animal
descrito en el presente documento manifiesta un trastorno
embrionario asociado con la detención de los quistes hipofisarios,
proporcionando así un sistema de modelo útil para los trastornos
quísticos hipofisarios humanos y los trastornos por déficit de
GH.
Según otra realización de la presente invención,
se prevén métodos para identificar compuestos útiles para tratar
trastornos fisiológicos asociados con el craneofaringioma,
comprendiendo dichos métodos:
(a) administrar los compuestos de prueba a un
mamífero transgénico de la invención, y
(b) identificar como útiles aquellos compuestos
que provocan una respuesta terapéutica de la lesión hipofisaria.
Tal como se utiliza en el presente documento, la
frase "trastornos fisiológicos asociados con el
craneofaringioma" se refiere a las características mostradas por
los pacientes, tales como crecimientos tumorales y la aparición de
quistes hipofisarios. Véase, por ejemplo, Yasargil et al.,
1990, J. Neurosurg., 73:3-11; Barloon
et al., AJNR:9, marzo / abril de 1988, págs.
406-407; y Fischer et al., 1990, J.
Neurosurg., 73:534-540.
Tal como se utiliza en el presente documento, la
frase "provocan una respuesta terapéutica de la lesión
hipofisaria" se refiere a compuestos de prueba que producen
involución, contracción o desaparición de la lesión hipofisaria. Tal
respuesta puede monitorizarse fácilmente por los expertos en la
técnica utilizando la investigación anatomopatológica bien conocida
de muestras de autopsia. Se pueden comparar fácilmente los tamaños
de las lesiones hipofisarias para los mamíferos transgénicos
tratados y los control.
Según todavía otra realización de la presente
invención, se prevén métodos para identificar compuestos útiles para
tratar un trastorno fisiológico asociado con los quistes
hipofisarios, comprendiendo dicho método:
(a) administrar los compuestos de prueba a un
mamífero transgénico de la invención, y
(b) identificar como útiles aquellos compuestos
que estimulan una disminución del tamaño de las cavidades quísticas
en la hipófisis anterior.
Los trastornos fisiológicos asociados con los
quistes hipofisarios (que se muestran por los animales transgénicos
de la invención) incluyen, por ejemplo, detención del crecimiento o
enanismo, fracaso en la reproducción, corta vida, congestión
pulmonar y similares.
Asimismo, tal disminución del tamaño de la
cavidad quística puede monitorizarse fácilmente por lo expertos en
la técnica utilizando la investigación anatomopatológica bien
conocida de muestras de autopsia. Se pueden comparar fácilmente los
tamaños de las cavidades quísticas para los mamíferos transgénicos
tratados y los control.
Los animales transgénicos de la invención también
pueden utilizarse como fuentes de células para el cultivo celular,
en las que las células transgénicas se obtienen preferiblemente a
partir de la hipófisis. Las células de los animales pueden mostrar
ventajosamente propiedades deseables tanto de las células cultivadas
transformadas como de las normales; es decir, serán normales o casi
normales morfológica y fisiológicamente, pero pueden cultivarse,
como las células tales como las células NIH3T3, durante periodos
prolongados, y quizá indefinidos, de tiempo. Además, cuando la
secuencia promotora que controla la transcripción de la secuencia
del transgén recombinante está regulada temporalmente y es
inducible, pueden controlarse la velocidad de crecimiento celular y
otras características del cultivo añadiendo o eliminando el factor
inductor.
Todas las patentes de los EE.UU. y las
publicaciones mencionadas en el presente documento se incorporan
mediante referencia, en su totalidad, en el mismo. Ahora se
describirá la invención con mayor detalle haciendo referencia a los
siguientes ejemplos no limitantes.
A menos que se establezca lo contrario, la
presente invención se realizó utilizando procedimientos habituales,
tal como se describe por ejemplo, en Maniatis et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU. (1982);
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU. (1989); Davis et al.,
Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science
Publishing, Inc., Nueva York, EE.UU. (1986); o Methods in
Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, S.
L. Berger y A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego,
EE.UU. (1987).
Se clonó la región promotora de rGH (320 pb,
KpnI-XhoI) en un poliligador ("polylinker")
Pbluescript SK (Stratagene). Se clonó un fragmento
EcoRI-BamHI de 670 pb, que contiene la región
codificante del ADNc para mLIF en 3' a la región promotora. El
fragmento híbrido de ADNc para rGH-mLIF se escindió
del Bluescript utilizando enzimas de restricción de KpnI y BamHI y
se clonó en el vector pcDNA 3 en 5' a los sitios de poliadenilación
de GH bovina. Para la microinyección del constructo de 1,6 kb
(figura 1) que contenía la región promotora de rGH, se escindió el
ADNc para mLIF y el sitio de poliadenilación de bGH de las
secuencias del vector con KpnI y DraIII y se purificaron mediante
electroforesis en gel.
Se construyó un plásmido que contenía el gen de
fusión GH-LIF mediante el aislamiento de un
fragmento de 320 pb (KpnI - XhoI) del promotor
de GH de rata y un fragmento de 670 pb (EcoRI -
BamHI)que contenía el ADNc para LIF murino de longitud
completa, seguido por los ligados secuenciales en la región del
poliligador de pBluescript SK (Stratagene). Los sitos de
KpnI - BamHI que engloban el gen de fusión
GH-LIF se ligaron en el vector pcDNA3 (Invitrogen),
que contiene los sitios de poliadenilación de GH bovina. Se preparó
el gen de fusión GH-LIF para microinyección mediante
electroforesis en gel de agarosa de un fragmento de 1,6 kb
(KpnI - DraIII) y se purificó adicionalmente con
Elutip (Schleicher & Schuell). Este fragmentó se microinyectó en
los pronúcleos de óvulos fecundados de ratón y los óvulos inyectados
se transplantaron a madres portadoras pseudopreñadas siguiendo un
procedimiento habitual. Todos los ratones se mantuvieron en un
entorno libre de patógenos y se les suministró alimentos y agua a
voluntad, histología, inmunohistología e hibridación in
situ.
Se seleccionaron los fundadores potenciales
mediante análisis de inmunotransferencia por el método Southern de
ADN terminal utilizando un fragmento de 670 pb marcado de cebador
aleatorio que contiene el ADNc de longitud completa para LIF de
ratón. Tras la microinyección del gen de fusión
rGH-mLIF (figura 1) en óvulos fecundados de ratón,
se seleccionó la progenie resultante de las gestaciones en las
madres receptoras para determinar la integración del transgén. El
ADN terminal de las crías se digirió con BstYI y se corrió sobre un
gel de agarosa al 1%. El ADN se transfirió a nitrocelulosa
utilizando un aparato para electrotransferencia
("electroblotter"). La mancha se hibridó con un fragmento
radiomarcado BamHI-BstYI de 679 pb de ADNc para mLIF
que contenía los exones 1,2 y parte del exón 3. Esta sonda se
hibrida a un fragmento BstYI de 3,0 kb del gen LIF endógeno y un
fragmento puente BstYI de 0,85 kb. El gen endógeno sirvió como un
control del número de copias.
Se seleccionaron 250 crías utilizando una sonda
de ADNc para LIF representada en la figura 1 y la integración del
transgén de poli A rGH-mLIF-bGH se
confirmó en 3 ratones fundadores mediante el análisis de
inmunotransferencia por el método Southern. La sonda de LIF se
hibridó con un fragmento puente BstYI de 0,85 kb único para el
transgén (figura 1). De 1 a 3 copias del transgén se integraron en
los ratones fundadores. Los 3 ratones fundadores pesaron menos que
las crías WT de una misma camada (figuras 2a, 2b, 2c y 2d). Puesto
que uno de estos fundadores transgénicos (F-O_{3})
murió a las 4 semanas, se utilizaron dos para la cría. Puesto que no
se consiguieron gestaciones a las 22 semanas, sus ovarios se
transplantaron a ratones hembra B6D2F_{1} receptores sustitutos
para la posterior creación de la progenie transgénica. Los ratones
transgénicos tuvieron una vida más corta que las crías WT de una
misma camada (hasta 5 meses) y la autopsia mostró una hipoplasia
diafragmática con congestión pulmonar y hepática crónicas.
Para determinar si la GH circulante no detectable
era debido a una alteración estructural del gen de la GH por el
transgén, se determinó la integridad del gen de la GH murino
mediante la digestión por restricción y análisis mediante el método
Southern utilizando una sonda de ADNc para GH de rata. La digestión
del ADN del ADN del ratón transgénico de la invención con ThaI dio
lugar a un mapa de restricción de GH que permaneció inalterado en
comparación con el ADN de tipo natural (no transgénico).
Se realizaron los radioinmunoensayos utilizando
la metodología habitual. La GH de ratón y los kit de RIA
(radioinmunoensayo) con PRL se suministraron por Dr. A. F. Parlow,
Harbor-UCLA (AFP 10783B, AFP 1077D,
respectivamente). La sensibilidad de la GH y los RIA con PRL fue de
0,78 y 0,4 ng/ml, respectivamente.
Los niveles de GH en suero medidos en tres días
consecutivos no fueron detectables (< 0,78 ng/ml) en dos ratones
transgénicos (figura 3). Los niveles hormonales en suero para
IGF-I (factor de crecimiento I similar a la
insulina), PRL y T_{4} se facilitan en la tabla 1. Se extrajo
sangre por vía retro-orbital de los ratones WT y
transgénicos a las 10:00 a.m. en 3 días consecutivos para determinar
los marcadores indicados.
A partir de la tabla 1, es evidente que los
niveles de IGF-I también fueron inferiores en los
animales transgénicos (53 - 94 mg/ml frente a 215 - 321 ng/ml, p
< 0,001) y los niveles de prolactina en suero disminuyeron (5,4
\pm 0,43 frente a 14,4 \pm 2,19, p < 0,05). Los niveles de
T_{4} no se alteraron en los animales transgénicos (tabla 1).
Se utilizó el método bien conocido del complejo
de estreptavidina - biotina peroxidasa. Los anticuerpos primarios
incluyeron los anti-PRL de ratón, anti- GH de rata,
anti-\beta-FSH de rata y
anti-ACTH humana (todos donados amablemente por el
National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
(Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y
Renales), Bethesda, Maryland, EE.UU.).
Se contaron las células hipofisarias
inmunorreactivas frente a GH, PRL, ACTH y LH con una lente objetivo
de 40X dentro de una rejilla ocular de 0,01 mm. Se expresó el número
total de células positivas como un porcentaje del número total de
células dentro de la misma zona. El recuento cubrió la sección
horizontal de una hipófisis en cada caso.
Los resultados indicaron que la
inmunorreactividad con LIF era difusa en el lóbulo de la hipófisis
anterior y en algunas células del lóbulo intermedio tanto de los
animales WT como de los transgénicos. Sin embargo, en las secciones
de la hipófisis anterior de los animales transgénicos, se observaron
agrupaciones intensas dispersas de células inmunoteñidas con LIF y
varias cavidades quísticas. Estas estaban flanqueadas por células
epiteliales ciliadas, cuboidales, inmunorreactivas focalmente frente
a citoqueratina y S-100 e inmunonegativas frente a
hormonas trópicas de la hipófisis. Por tanto, es probable que estos
quistes sean de origen neuroectodérmico primitivo. La inmunotinción
con GH y PRL fue menos intensa en los ratones transgénicos mientras
que aumentó la inmunopositividad frente a ACTH.
Los resultados también indicaron que el número de
células somatotrofas en los animales transgénicos disminuyó en un
47% y se atenuaron los niveles de expresión de ARNm para GH,
evaluados mediante la hibridación in situ. Por el contrario,
las células corticotrofas aumentaron en un 79% comparado con los
animales de tipo natural.
Se utilizaron secciones desparafinadas de cinco
\mum para la técnica de hibridación in situ. Se fijaron las
hipófisis en formalina tamponada al 10% y se incorporaron a
parafina. Se tiñeron cinco secciones de 5 \mum con hematoxilina -
eosina (HE) y ácido peryódico de Schiff (PAS). Se demostraron los
ARNm para GH, PRL y POMC aplicando sondas de oligodesoxinucleótido
correspondientes a los aminoácidos 145-151 de GH de
ratón, 64-70 de PRL de ratón y
99-108 de POMC de rata. Las sondas se marcaron
mediante el método del extremo 3' con ^{35}S-dATP,
utilizando un kit disponible comercialmente (NEP\cdot100, DuPont,
Canadá, Mississauga, Ontario).
Los ARNm para LIF y Pit-1 se
identificaron utilizando sondas de ARN. Las sondas de ARN sentido o
antisentido para Pit-1 se sintetizaron a partir de
una plantilla de ADNc de 672 pb subclonado en pBluescript KS. Tras
su linealización con BamHI e HindIII, se realizó la
transcripción utilizando polimerasa T3 y polimerasa T7 para las
sondas antisentido, respectivamente. Las oligosondas y las sondas de
ARN se purificaron con cartuchos NENSORB-TM (DuPont,
Canadá). Los detalles de las condiciones de hibridación,
autorradiografías y controles se contaron con un objetivo de
inmersión en aceite 100X en unas 50-80 células
adenohipofisarias. Se obtuvo el número medio de granos de plata que
representaba la hibridación no específica a partir del número de
granos de plata en los lóbulos intermedio y posterior, y se restó
del número medio de granos de plata en las células del lóbulo
anterior.
En las secciones teñidas con hematoxilina -
eosina, se conservó la arquitectura normal de la hipófisis. Los
lóbulos posterior e intermedio no mostraron cambios morfológicos. La
hendidura de Rathke separaba el lóbulo anterior del lóbulo
intermedio. Al contrario que en las hipófisis de los controles, en
los ratones transgénicos, el epitelio de revestimiento de la pared
anterior de la hendidura de Rathke era ciliado. En algunas
secciones, se observó que el epitelio de revestimiento de la
hendidura de Rathke formaba invaginaciones profundas en el lóbulo
anterior, y también formaba cavidades quísticas llenas de coloide.
Los lóbulos anteriores de los tres animales transgénicos contenían
un número disminuido de células acidófilas y un número variable de
cavidades quísticas llenas de coloide positivo frente a PAS, restos
celulares ocasionales y/o cuerpos de psamoma. Los quistes estaban
flanqueados por células epiteliales ciliadas, más a menudo
cuboidales.
En los lóbulos anteriores de las hipófisis de los
animales transgénicos, la inmunorreactividad frente a LIF mostró un
patrón difuso con intensidad moderada en la mayoría de las células e
inmunotinción con LIF intensa en células dispersas. En las hipófisis
de los animales control, la inmunorreactividad frente a LIF fue
difusa. Estaban presentes células definidas teñidas por LIF en los
lóbulos intermedios de las hipófisis de los animales transgénicos y
no transgénicos. Mediante la hibridación in situ, la señal del ARNm
para LIF fue débil y se distribuyó de manera difusa por las células
del lóbulo anterior e intermedio tanto en las hipófisis de los
animales transgénicos como control.
Se evaluaron los quistes para determinar la
presencia de inmunomarcadores epiteliales, endoteliales y
neuronales, incluyendo el antígeno epitelial de membrana,
citoqueratina, antígeno relacionado con el factor VIII, proteína
ácida fibrilar glial, proteína S-100 y proteína de
neurofilamento anti-humana. Sólo la citoqueratina y
la proteína S-100 estaban presentes en
sustancialmente todas las células epiteliales que revisten los
quistes. Algunos quistes fueron inmunonegativos frente a todos los
marcadores. En algunos quistes, se hallaron células que contienen
1-2 hormonas atrapadas, entre las células
epiteliales.
La inmunocitoquímica para las hormonas
adenohipofisarias reveló la presencia de los cinco tipos de células
que contienen hormonas. Los recuentos celulares demostraron una
disminución del 49% de las células inmunorreactivas frente a GH y
una disminución del 38% de las células inmunorreactivas frente a
PRL, comparado con las hormonas adenohipofisarias de los ratones no
transgénicos. Muchas células inmunoteñidas con GH fueron más
pequeñas, con un contorno ovoide o angular a diferencia de las
hipófisis de los animales control, en las que estas células tenían
una forma redonda o poliédrica. La cuantificación de los granos de
plata que señalan los ARNm para GH y PRL mostró una reducción de
aproximadamente el 50% cada una. Las células inmunorreactivas frente
a ACTH aumentaron en un 80%. No se observó cambio en la intensidad
de la señal de hibridación del ARNm para POMC comparado con las
hipófisis de los animales control. Los porcentajes de células
inmunorreactivas frente a TSH y LH fueron similares a los hallados
en las glándulas de los animales control.
La inmunocitoquímica para CREB y CREB fosforilado
reveló una disminución notable en el número de núcleos
inmunorreactivos frente a CREB fosforilado en los lóbulos anteriores
de las hipófisis de los animales transgénicos. No se observó cambio
en la intensidad de la señal de hibridación del ARNm para
Pit-1 en las adenohipófisis de los animales
transgénicos en comparación con los controles.
Puesto que la velocidad de integración del
transgén era baja (3,250), se postuló que el transgén podría ser
letal en el útero. Por tanto, tras la microinyección, se puso
término a las gestaciones oportunas y se evaluó la viabilidad fetal.
Se puso término a las gestaciones en el día embrionario 18,5 y se
determinó la viabilidad de los fetos. Entonces, se extrajo ADN del
hígado fetal y se sometió a análisis de inmunotranferencia mediante
el método Southern. Tras la terminación en el día embrionario 18,5,
se encontró muerto uno de los 8 fetos en el útero y su ADN demostró
la integración del transgén. Once fetos vivos observados en 3
gestaciones separadas no mostraron integración del transgén.
Aunque la invención se ha descrito en detalle con
referencia a ciertas realizaciones preferidas de la misma, se
entenderá que sus modificaciones y variaciones están dentro del
espíritu y el alcance de los que se describe y reivindica.
Claims (11)
1. Ratón transgénico para hacer un modelo, in
vivo, de quistes hipofisarios, cavidades quísticas hipofisarias,
quistes paraselares y/o craneofaringiomas, comprendiendo el ratón
transgénico en sus células germinativas e hipofisarias ácidos
nucleicos que comprenden un gen que codifica para el factor
inhibidor de leucemia (LIF) de ratón regulado por un promotor
específico de la hipófisis de la hormona de crecimiento de rata
asociado operativamente al mismo; en el que con respecto al ratón de
tipo natural correspondiente:
la hipófisis expresa LIF a un nivel que es de al
menos aproximadamente 1,5 veces;
los niveles circulantes de hormona de crecimiento
(GH) y factor de crecimiento I similar a la insulina
(IGF-I) son de al menos aproximadamente un 10%
inferiores; y
el peso corporal del ratón es inferior; y
el ratón transgénico comprende además una lesión
hipofisaria seleccionada del grupo que consiste en un quiste
hipofisario, una cavidad quística hipofisaria, un quiste paraselar
y/o un craneofaringioma.
2. Ratón transgénico según la reivindicación 1,
en el que el LIF se expresa a un nivel de hasta aproximadamente
1.000 veces más que el nivel de LIF endógeno.
3. Ratón transgénico según la reivindicación 1,
en el que el LIF se expresa a un nivel de al menos aproximadamente 5
veces más que el nivel de LIF endógeno.
4. Ratón transgénico según la reivindicación 3,
en el que el LIF se expresa a un nivel de al menos aproximadamente
10 a aproximadamente 1.000 veces más que el nivel de LIF
endógeno.
5. Ratón transgénico según la reivindicación 1,
que tiene un nivel sanguíneo de GH y/o IGF-I un 25%
inferior al del correspondiente ratón de tipo natural.
6. Ratón transgénico según la reivindicación 5,
que tiene un nivel sanguíneo de GH y/o IGF-I
aproximadamente un 50% inferior al del correspondiente ratón de tipo
natural.
7. Método de identificación de compuestos
eficaces en reducir una lesión hipofisaria seleccionada del grupo
que consiste en quistes hipofisarios, cavidades quísticas
hipofisarias, quistes paraselares y craneofaringiomas, que
comprende
administrar un compuesto de prueba al ratón
transgénico según la reivindicación 1;
determinar el tamaño de la(s) lesión /
lesiones hipofisaria(s) presente(s) en el ratón antes
de, y tras, la administración del compuesto; e
identificar compuestos que disminuyan el tamaño
de la(s) lesión / lesiones hipofisaria(s) del
ratón.
8. Método según la reivindicación 7, en el que la
lesión hipofisaria es un quiste hipofisario.
9. Método según la reivindicación 7, en el que la
lesión hipofisaria es una cavidad quística hipofisaria.
10. Método según la reivindicación 7, en el que
la lesión hipofisaria es un craneofaringioma.
11. Método según la reivindicación 7, en el que
la lesión hipofisaria es un quiste paraselar.
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