ES2219679T3

ES2219679T3 - Vacuna de combinacion contra la enfermedad de newcastle.

Info

Publication number: ES2219679T3
Application number: ES96202866T
Authority: ES
Inventors: Carla Christina Schrier; Heinrich Dieter Lutticken
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-15
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: JPH09169663A; DK0770397T3; BR9605153B1; ATE264691T1; DE69632235T2; DE69632235D1; CA2187974C; EP0770397A1; PT770397E; US5733556A; JP3947254B2; BR9605153A; MX9604907A; CA2187974A1; EP0770397B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA VACUNA DE COMBINACION PARA UTILIZAR EN LA PROTECCION DE LOS POLLOS CONTRA ND QUE TIENE UN SISTEMA DE EXPRESION, COMO UN VECTOR DEL VIRUS, QUE EXPRESA UNA PROTEINA INMUNOGENICA NDV, Y UNA VARIEDAD DE VACUNA NDV EN VIVO. SE DEMUESTRA QUE DICHA VACUNA DE COMBINACION PERMITE UNA BUENA PROTECCION LOCAL Y SISTEMICA.

Description

Vacuna de combinación contra la enfermedad Newcastle.

La presente invención se relaciona con una vacuna de combinación para uso en la protección de las aves de corral frente a la enfermedad de Newcastle ("ND"), consistente en una subunidad inmunogénica del NDV o un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV, y con un kit consistente en los componentes para dicha vacuna de combinación.

La enfermedad de Newcastle es una infección vírica de las aves de corral con una amplia distribución geográfica que causa grandes pérdidas económicas en la industria avícola. El virus de la enfermedad de Newcastle ("NDV") es el agente etiológico de esta enfermedad y representa el virus prototipo del género Paramyxovirus. La enfermedad de Newcastle es complicada, en el sentido de que diferentes aislados y cepas del virus pueden inducir una enorme variación en la gravedad de la enfermedad. En general, cuanto más joven es el pollo más aguda y grave es la enfermedad. La infección puede tener lugar por inhalación o por ingestión y la forma infecciosa del virus se propaga de un ave a otra.

Como se ha indicado antes, se han identificado varios patotipos del NDV, es decir, velogénico, mesogénico y lentogénico. Aunque estos términos resultan de una prueba de laboratorio, los términos son ahora generalmente utilizados para describir virus de virulencia alta, moderada o baja para los pollos. La forma velogénica neurotrópica de la enfermedad está causada por cepas altamente patógenas del NDV y se caracteriza por una rápida aparición de graves signos respiratorios, seguida de signos neurológicos. En la mayoría de los casos, los animales infectados no sobreviven. Las cepas velogénicas viscerotrópicas del NDV son altamente patógenas y causan una elevada mortalidad y lesiones graves en el tracto gastrointestinal. Las cepas mesogénicas del NDV causan normalmente enfermedad respiratoria grave en aves totalmente susceptibles y, en aves adultas, causan una marcada caída en la producción de huevos. Las cepas lentogénicas del NDV causan una enfermedad leve caracterizada por signos respiratorios, especialmente en aves jóvenes totalmente susceptibles.

Con objeto de reducir las pérdidas económicas debidas a la ND en la industria avícola comercial se ha vacunado a los pollos frente a la ND. Se han aplicado vacunas vivas derivadas de cepas lentogénicas y mesogénicas rutinariamente, siendo adecuada la vacuna mesogénica solamente para la vacunación secundaria. Sin embargo, también en el grupo lentogénico hay una variedad considerable en la virulencia. Las cepas del NDV usadas como vacunas vivas incluyen V4, Hitchner B1, F, La Sota (lentogénica) y la cepa H, Mukteswar, Komarov y Roakin (mesogénica). La principal ventaja de las vacunas vivas de la ND es que éstas pueden ser administradas por técnicas baratas de aplicación en masa, tales como la aplicación por aerosol y en el agua de bebida. Sin embargo, las vacunas vivas pueden producir graves reacciones vacunales, en particular en el tracto respiratorio después de la vacunación por aerosol. Debido a esto, es importante usar virus extremadamente débiles para la vacunación, en particular para la vacunación primaria; sin embargo, como resultado, se necesitan habitualmente múltiples aplicaciones de vacunas.

Las vacunas inactivadas son administradas por inyección, generalmente a pájaros de más edad. En su mayor parte, estas vacunas contienen el virus muerto mezclado con un vehículo adyuvante, tal como hidróxido de aluminio o una emulsión de agua-en-aceite. Los virus usados para la preparación de vacunas en emulsión oleosa incluyen Ulster 2C, Hitchner B1, La Sota, Roakin y diversos virus virulentos (D.J. Alexander, En Diseases of Poultry, 9ª edición 1991, eds., Calnek y col., Iowa State University Press, Ames, Iowa, 496-519).

Las cepas vivas usadas comúnmente del NDV Hitchner B1 y La Sota causan aún reacciones vacunales respiratorias moderadas. Como resultado de esto, se han desarrollado vacunas de NDV basadas en cepas vivas más débiles, aunque se acepta, en general, que la inmunogenicidad de las cepas vacunales, particularmente en aves positivas a MDA, disminuye con su virulencia. Se han descrito varias de dichas cepas débiles en la técnica anterior. La Patente EE.UU. Nº 5.250.298 (Universidad de Delaware) describe un mutante vivo sensible a la temperatura y adaptado al frío de la cepa parental Hitchner B1, denominado CaTs. La Patente EE.UU. Nº 5.149.530 (Duphar Int. Res. B.V.) describe la cepa NDW derivada de la cepa Ulster 2C. Más aún, en la Patente EE.UU. Nº 5.188.502 (University of Georgia Research Foundation, Inc.) se describe una cepa de NDV atenuada de forma natural aislada del tracto intestinal de un pavo que no mostraba signos de enfermedad respiratoria. Se describe otra cepa débil de NDV, denominada C2, en la Patente EE.UU. Nº 5.750.111 (AKZO Nobel N.V.).

Los recientes desarrollos en la tecnología de la ingeniería genética han posibilitado el uso de una nueva generación de vacunas basadas en la expresión de componentes inmunogénicos del virus, las así llamadas subunidades. La principal ventaja de este tipo de vacunas sobre las vacunas vivas convencionales de NDV basadas en cepas lentogénicas de NDV es que no causan las reacciones vacunales respiratorias que normalmente se producen después de la vacunación convencional. Más aún, ya no es necesaria la producción de NDV y se reduce la posibilidad de reversión a la virulencia del virus vacunal.

En la técnica anterior, se han descrito vacunas basadas en una proteína de NDV de una subunidad inmunogénica o en un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV. Concretamente, se han descrito recientemente vacunas basadas en la expresión de la fusión del NDV (F) o de la proteína hemaglutinina-neuraminidasa por vectores víricos vivos tales como el herpes virus de los pavos ("HVT") y el virus de la viruela de las aves de corral ("FPV"), o por el sistema de expresión de baculovirus (Morgan, R.W. y col., Avian Diseases 36, 858-870, 1992; Boursnell, M.E.G. y col., Virology 178, 297-300, 1990, y J. Gen. Virol. 71, 621-628, 1990; Mori, H. y col., Avian Diseases 38, 772-777, 1994; Nagy, E. y col., Avian Diseases 35, 585-590, 1991).

La protección del tracto respiratorio local es importante en la prevención de la infección inicial por NDV y la posterior enfermedad y para limitar la propagación del virus a pollos susceptibles por inhalación o por ingestión de alimentos o del agua de bebida contaminados. En general, las vacunas vivas convencionales del NDV inducen una protección respiratoria local adecuada. La mayoría de los estudios que utilizan vacunas FPV-NDV sólo estudiaban la inmunidad sistémica frente a signos neurológicos, pero no evaluaban la inmunidad respiratoria. Más aún, la vacuna FPV-NDV/F o FPV-NDV/HN administrada por vía ocular inducía sólo una pobre protección sistémica y no se pudo detectar ningún efecto añadido de la inmunización con ambas FPV-NDV/F y FPV-NDV/HN recombinantes (Edbauer, C. y col., Virology 179, 901-904, 1990). Además, en Morgan y col., Avian Diseases 36, antes citado, y Avian Diseases 37, 1032-1040, 1993, se demostró que la administración de una vacuna viva de NDV basada en vectores víricos da lugar a niveles relativamente bajos de protección respiratoria local, en particular en presencia de anticuerpos maternos ("MDA") para el NDV y de una inoculación posterior.

La presente invención proporciona una vacuna de combinación para el NDV que induce una mayor protección frente a la ND a un nivel de protección tanto local como sistémico.

En particular, la presente invención se relaciona con una vacuna de combinación para uso en la protección de las aves de corral frente a la ND, consistente, por una parte, en un primer componente activo que es una subunidad inmunogénica del NDV o un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV y, por la otra, en un segundo componente activo que es una cepa vacunal viva de NDV. El beneficio de dicho primer componente si se administra como único componente reside principalmente en la generación de una protección sistémica (frente a la mortalidad y los signos nerviosos, tales como espasmos clónicos, temblores musculares, tortícolis, opistótonos y parálisis) en aves inoculadas, mientras que dicho segundo componente induce principalmente en ese caso una protección local en el tracto respiratorio (frente a la multiplicación del virus de inoculación NDV en la tráquea). Sorprendentemente, se ha visto en la presente invención que la vacuna de combinación aquí definida evoca una respuesta inmune protectora sinérgica, tanto sistémica como localmente. Como resultado, la vacuna reivindicada induce una alta protección frente a la infección por NDV por cepas de NDV mesógenicas y cepas de NDV velogénicas neurotrópicas, incluso en presencia de anticuerpos maternos.

Preferiblemente, la vacuna de combinación contiene un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV. Dicho vector es un microorganismo, por ejemplo una bacteria o un virus, o un polinucleótido que alberga el gen codificante de la proteína inmunogénica del NDV. El vector es capaz de expresar dicha proteína o de replicarse en aves inoculadas, expresando así dicha proteína, como resultado de lo cual el animal inmunizado desarrolla una respuesta inmune frente a la proteína. El término "heterólogo" indica que en la naturaleza el vector no alberga el gen del NDV.

Los vectores víricos vivos son los más preferidos. Se han descrito ya en la técnica muchos vectores víricos vivos que albergan genes codificantes de proteínas de patógenos aviares, en particular vectores víricos codificantes de proteínas del NDV. Los vectores víricos adecuados para uso en la presente invención son conocidos para los expertos en la técnica e incluyen poxvirus, virus herpes y retrovirus aviares.

Un ejemplo de un poxvirus adecuado es el de la vaccinia; sin embargo, son más preferidos los Avipoxvirus, porque su espectro de hospedadores es más restringido. En particular, los poxvirus de las palomas ("PPV") y los poxvirus de las aves de corral (FPV) se consideran como adecuados.

Se describen ejemplos de tales vectores PPV y FPV adecuados que albergan un gen inmunogénico del NDV en Letellier, C. y col., Archives of Virology 118, 43-56, 1991; Edbauer, C.E. y col., Virology 179, 901-904, 1990; Taylor, J. y col., J. Virology 64, 1441-1450, 1990; Ogawa, R. y col., Vaccine 8, 486-490, 1990; Bournsell, M.E.G. y col., Virology 178, 297-300, 1990, y J. Gen. Virology 71, 621-628, 1990, y Boyle, D.B. y col., virus Research 10, 343-356, 1988.

Se describe un ejemplo de un vector retrovírico aviar (virus de la leucosis aviar) que alberga el gen HN del NDV en Morrison, T. y col., Microbial Pathogenesis 9, 387-396, 1990.

Un vector vírico incluso más preferido para uso en la presente invención es el HVT (virus herpes de los pavos; véase Sondermeyer, P.J.A. y col., Vaccine 11, 349-358, 1993). El HVT tiene varias ventajas, incluyendo su probada seguridad y eficacia frente a la enfermedad de Marek. Más aún, el HVT puede ser rutinariamente administrado a pollos de un día de edad. La construcción de un vector HVT-NDV que albergue el gen HN o F y su eficacia como único componente activo en una vacuna está descrito en Morgan R.W. y col., Avian Diseases 36, 858-870, 1992, y 37, 1032-1040, 1993.

Se puede preparar un vector vírico tal como se ha descrito antes por técnicas convencionales del ADN recombinante, después de lo cual se pueden cultivar las células huésped infectadas con el virus vector para producir cantidades suficientes del virus vector. A continuación, se pueden recoger las células que contienen virus y/o los virus vectores en forma purificada del cultivo, seguido de su incorporación en una vacuna según métodos estándar.

Los vectores bacterianos adecuados para uso aquí incluyen E. coli y varias especies de Salmonella.

Alternativamente, el vector es un polinucleótido que alberga el gen NDV operablemente unido a un promotor, potenciador u otras secuencias que permitan al gen expresarse en células aviares. En general, el polinucleótido puede ser una molécula de ADN lineal. Normalmente, el gen NDV es situado dentro de un plásmido bacteriano. Dicho vector puede ser usado para la inmunización basada en ADN, donde el polinucleótido es directamente transferido a las células aviares por transfección in vivo por métodos conocidos para este fin (Donnelly, J.J. y col., The Immunologist 2, 20-26, 1994).

Como alternativa para el vector heterólogo antes definido, se puede incorporar una subunidad inmunogénica del NDV en la vacuna según la invención. En el caso de una vacuna subunitaria, se produce una proteína inmunogénica del NDV in vitro en cantidades suficientes, de tal forma que pueda ser administrada al animal a inmunizar como componente activo de la vacuna. El término subunidad inmunogénica del NDV se refiere a un compuesto o composición que contiene una proteína inmunogénica del NDV esencialmente libre del material del NDV (proteináceo) con el que normalmente se asocia en la naturaleza.

En principio, la subunidad inmunogénica del NDV puede ser purificada de viriones de NDV por técnicas estándar de purificación bioquímicas, aunque se prefiere la expresión de la subunidad por un sistema de expresión de ADN recombinante.

En el último caso, la subunidad inmunogénica del NDV es expresada por una célula huésped. Una célula huésped adecuada es una célula que puede ser transformada por un fragmento de ADN codificante de la subunidad y que es capaz de expresar dicha subunidad.

"Transformación", tal como se usa aquí, se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo en una célula huésped independientemente del método empleado, por ejemplo captación directa o transducción. La secuencia de ácido nucleico heterólogo puede integrarse en el genoma del hospedador. Para la expresión, se dota al fragmento de ADN heterólogo de secuencias de control de la expresión apropiadas que son compatibles con el hospedador designado y que pueden regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico insertada.

La célula huésped puede ser de origen procariótico, por ejemplo sistema de expresión bacterianos derivados de E. coli, Bacillus subtilis o especies de Pseudomonas.

La célula huésped es preferiblemente de origen eucariótico, tal como una levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, o una célula eucariótica superior, tal como una célula de insecto, de planta o de mamífero, incluyendo células HeLa y células de ovario de hámster Chino ("CHO"). Las células de insecto incluyen la línea celular Sf9 de Spodoptera frugiperda (Luckow y col., Biotechnology 6, 47-55, 1988). Se puede encontrar información con respecto a la clonación y la expresión de la subunidad inmunogénica del NDV en sistemas de clonación eucarióticos en Esser, K. y col. (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986).

Alternativamente, una célula huésped adecuada es una célula que es susceptible de infección por un virus recombinante que alberga un fragmento de ADN codificante de la subunidad inmunogénica del NDV. En el virus, el fragmento de ADN heterólogo se inserta en una región no esencial del virus, es decir, una región que puede ser usada para la incorporación de dicho fragmento de ADN sin alterar las funciones esenciales del virus, tales como las necesarias para la infección o la replicación del virus.

Para obtener grandes cantidades de subunidad inmunogénica del NDV, el sistema preferido de expresión es el sistema de expresión en baculovirus ("BVES"). En este sistema, se mantienen células de insecto como Spodoptera frugiperda (Sf, IPLB-Sf21) en cultivo celular como huésped para un baculovirus, como un virus de la polihidrosis nuclear de Autographa californica ("AcNPV"). Algunos de los genes de AcNPV se expresan en altos niveles, pero no son esenciales para el ciclo infectivo del virus. Estos genes son el blanco de la recombinación homóloga en células transfectadas entre un plásmido de transferencia del báculo, como pAcAS3, y el ADN de AcNPV de tipo salvaje ("wt"). En pAcAS3 (J. Vlak y col., Virology 179, 312-320, 1990), se insertan los genes heterólogos secuencia abajo del promotor p10 en lugar del gen p10 no esencial, rodeados por secuencias de AcNPV wt que son el blanco del proceso de recombinación. Para facilitar el estudio de recombinantes, pAcAS3 contiene también el gen LacZ, haciendo que las placas recombinantes se vuelvan azules al añadir X-gal al medio.

La construcción de baculovirus recombinantes que albergan el gen F o NH de NDV y su expresión en células de insecto han sido descritas en la técnica anterior, por ejemplo por Kamiya, N. y col., Virus Research 32, 373-379, 1994; Murakami, Y. y col., Virus Research 33, 123-137, 1994; Niikura, M. y col., Virus Research 20, 31-43, 1991; Mori, H. y col., Avian Diseases 38, 772-777, 1994; Nagy, E. y col., Virology 176, 426-438, 1990, y Avian Diseases 35, 585-590, 1991.

Coset, F.-L. y col., Virology 185, 862-866, 1991, describen la preparación de una vacuna subunitaria de NDV basada en una línea celular que expresa de manera constitutiva la proteína NH.

En la presente invención, las células huésped definidas anteriormente pueden ser cultivadas en condiciones favorables a la expresión de las subunidades inmunogénicas del NDV. Las vacunas pueden ser preparadas usando muestras del cultivo bruto, lisados de células huésped, extractos de células huésped o sobrenadantes de cultivo, aunque en otra realización se pueden preparar subunidades más purificadas dependiendo del uso pretendido. Para purificar las proteínas producidas, se cultivan células huésped que expresan las subunidades en un volumen adecuado y se aíslan las proteínas producidas de dichas células o del medio si las proteínas son excretadas. Las proteínas excretadas al medio pueden ser aisladas y purificadas por técnicas estándar, por ejemplo fraccionamiento salino, centrifugación, ultrafiltración, cromatografía, inmunoprecipitación de filtración por gel o cromatografía de inmunoafinidad, mientras que las proteínas intracelulares pueden ser aisladas recogiendo primeramente dichas células, rompiendo las células, por ejemplo, por sonicación o por otros medios de disrupción mecánica, tales como la prensa Francesa, seguido de separación, si se desea, de la proteína y de los otros componentes intracelulares. La disrupción celular podría también ser conseguida por medios químicos (por ejemplo, tratamiento con EDTA) o enzimáticos, tales como la digestión con lisozima.

Como segundo componente activo de la presente invención, se puede usar cualquiera de las cepas lentogénicas vivas de NDV conocidas. Dichas cepas incluyen las cepas vacunales Hitchner B1 y La Sota.

Se describe información detallada en cuanto a cepas vacunales vivas de NDV, producción de vacunas y administración de vacunas, por ejemplo, en Allan y col., FAO Animal Production and Health Series Nº 10, FAO, Roma, 1978, y D.J. Alexander, En: Diseases of Poultry, 9ª edición, 1991, eds. Calneck y col., Iowa State University Press, Amer., Iowa, 496-519.

Un problema asociado al uso de vacunas vivas de ND es la presencia de anticuerpos NDV maternos en pollos comerciales, que interfieren con el establecimiento de protección tras la vacunación. Se puede resolver este problema usando cepas vacunales de NDV relativamente virulentas. Un inconveniente de dichas vacunas de NDV vivas más virulentas es, sin embargo, que producen o contribuyen al desarrollo de enfermedad respiratoria, lo que da lugar a un menor rendimiento de los pollos o incluso a mortalidad en pollos jóvenes.

En consecuencia, una realización particularmente preferida de la presente invención es una vacuna de combinación donde la cepa vacunal viva del NDV es una cepa de NDV lentogénica débil. Dicha vacuna de combinación no induce o induce sólo reacciones vacunales respiratorias menores y al mismo tiempo evoca una respuesta inmune protectora mayor. Con cepas vacunales lentogénicas débiles se quiere decir cepas vacunales con un Índice de Reacción Vacunal ("VRI" 1 y "VRI" 2) menor de 2. Los VRI se basan, entre otros, en la pérdida de peso debida a la vacunación y varían entre 0 y 10 (van Eck, J.H.H. y col., Avian Pathology 20, 497-507, 1991). Son ejemplos de dichas cepas vacunales débiles las cepas de NDV C2 (depósito CNCM Nº I-1614; depositada por Intervet International BV, Win de Korverstraat 35, 5831 AN Boxmeer, Países Bajos), CaTs (Patente EE.UU. Nº 5.250.298), la cepa de pavo atenuada de forma natural descrita en la Patente EE.UU. Nº 5.188.502 y NDW (Patente EE.UU. Nº 5.149.530), siendo la cepa C2 la más preferida.

La subunidad o proteína inmunogénica del NDV para uso aquí es un componente proteico del virus NDV que es capaz de inducir una respuesta inmune protectora en las aves de corral e incluye las proteínas F, HN y de la matriz (M) y la nucleoproteína (NP).

En particular, la subunidad o proteína inmunogénica del NDV preferida es la proteína F o HN. En varios de los documentos antes citados se describen ejemplos de estos componentes víricos y de los genes que codifican para dichos componentes.

Una vacuna de combinación muy ventajosa según la presente invención consiste en la cepa viva C2 del NDV y el vector HVT-NDV/F.

Aunque la vacuna según la presente invención puede ser usada de forma efectiva en pollos, también se pueden vacunar con éxito otras aves de corral, tales como pavos, gallinas de Guinea y perdices, con la vacuna. Los pollos incluyen los pollos de engorde acelerado, los reproductores y las ponedoras.

Aunque se prefiere, no es necesario administrar los dos componentes activos de la vacuna de combinación en una forma mixta. La forma de administración para cada componente puede depender de las propiedades específicas de cada uno de los componentes. Por ejemplo, las cepas vacunales vivas del NDV son preferiblemente administradas por las técnicas baratas de aplicación en masa comúnmente utilizadas para la vacunación contra la ND, tal como mediante aerosolización o a través del agua de bebida. Sin embargo, también se contempla la administración por inyección para dichas vacunas. La subunidad inmunogénica del NDV expresada por, por ejemplo, un baculovirus o un vector heterólogo definido anteriormente, por ejemplo derivado de HVT o de FPV, es administrada habitualmente por vía parenteral. Sin embargo, también se contemplan otras vías de vacunación, tales como in ovo, siempre que el componente activo específico sea capaz de evocar una respuesta inmune protectora tras la administración. Las ventajas de la presente invención pueden ser también conseguidas si los componentes de la vacuna combinada son administrados a las aves separados en un pequeño intervalo de tiempo, por ejemplo en un intervalo de aproximadamente 24 horas, preferiblemente 8 horas. Por ejemplo, se puede obtener también el efecto ventajoso de la vacuna de combinación si uno de los componentes, por ejemplo el vector HVT antes descrito, es administrado in ovo justo antes de la eclosión y la cepa vacunal viva del NDV es administrada inmediatamente después de la eclosión, por ejemplo al día de edad.

La vacuna según la invención consiste en una dosificación efectiva de los componentes activos, es decir, una cantidad de componente activo inmunizante que inducirá inmunidad en las aves vacunadas frente a la inoculación por un virus ND virulento. Se define aquí la inmunidad como la inducción de un nivel significativo de protección mayor en una población de aves tras la vacunación en comparación con un grupo no vacunado.

Típicamente, la cepa vacunal viva del NDV puede ser administrada en una dosis de 10^{3,0}-10^{8,0} dosis infecciosas de embriones_{50} (DIE_{50}) por animal, preferiblemente en una dosis de 10^{5,0}-10^{7,0} DIE_{50}. Los vectores basados en HVT pueden ser administrados en una cantidad de 10-10.000 pfu (unidades formadoras de placas), preferiblemente de 100-1.500 pfu, mientras que los vectores FPV son normalmente efectivos si se administran en una cantidad de 10^{2,0}-10^{5,0} DICT_{50} (dosis infectivas de cultivo de tejidos_{50}). Las vacunas subunitarias efectivas expresadas en baculovirus derivan normalmente de 10^{5,0}-10^{8,0} células.

La vacuna de combinación según la invención puede ser administrada a las aves directamente después de la eclosión, es decir, a partir de un día de edad. La vacuna puede ser usada como vacunación primaria, si se desea seguido de una o más vacunaciones secundarias. La vacuna combinada es también adecuada para incorporación en programas de vacunación que también implican el uso de una vacuna NDV monovalente en forma viva o inactivada.

Como ejemplo, se pueden vacunar pollos de engorde de un día de edad, seguido de una inmunización secundaria a los 10-21 días de edad. Se puede vacunar a las ponedoras o a los reproductores a los 1-10 días, seguido de vacunaciones de refuerzo los días 26-38 y a las 16-20 semanas.

La invención incluye también vacunas multivalentes consistentes, además de en los dos componentes activos antes definidos, en una vacuna que contiene uno o más inmunógenos derivados de otros patógenos infecciosos para las aves de corral.

Preferiblemente, la vacuna de combinación contiene adicionalmente una o más cepas vacunales del virus de la bronquitis infecciosa ("IBV"), del virus de la enfermedad bursal infecciosa ("IBDV"), del agente de la anemia de los pollos ("CAA") o de reovirus.

La vacuna según la invención puede ser preparada y comercializada en forma de suspensión o en forma liofilizada y adicionalmente contiene un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable habitualmente usado para dichos componentes activos. Como vehículos se incluyen estabilizantes, conservantes y tampones. Son estabilizantes adecuados, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como suero de leche desecada, albúmina o caseína) o sus productos de degradación. Son tampones adecuados, por ejemplo, fosfatos de metales alcalinos. Son conservantes adecuados timerosal, mertiolato y gentamicina. Como diluyentes se incluyen agua, tampón acuoso (tal como solución salina), alcoholes y polioles (tales como glicerol).

Si se desea, la vacuna según la invención puede contener un adyuvante. Como compuestos o composiciones adecuadas para este fin se incluyen hidróxido, fosfato u óxido de aluminio; emulsiones de aceite-en-agua o de agua-en-aceite basadas, por ejemplo, en un aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52®, o un aceite vegetal, tal como acetato de vitamina E, y saponinas.

La presente invención también contempla un formato de kit que consiste en una unidad de múltiples recipientes empaquetada que tiene recipientes para cada componente activo según se ha definido antes. El kit puede tener también un recipiente con un vehículo o diluyente para uno o ambos de los componentes activos.

Ejemplo 1 Eficacia de la administración combinada del vector HVT-NDV/F y de una cepa vacunal viva de NDV

Se preparó el vector HVT-NDV/F como describen Morgan, R.W. y col. en Avian Diseases 36, 858-870, 1992, y Sondermeyer, P.J.A. y col., en Vaccine 11, 349-358, 1993. Se propagó HVT-NDV/F en fibroblastos de embrión de pollo ("CEF") primarios preparados a partir de huevos embrionados libres de patógenos específicos de 10 días de edad. Se mantuvieron las células en una combinación de medio esencial mínimo modificado de Glasgow y de Eagle suplementado con un 5% de suero fetal de ternera y un cóctel de antibióticos.

Se sembraron los CEF en botellas rodantes a una densidad de aproximadamente 6x10^{5} células/cm^{2}, se infectaron con HVT-NDV-F a una "moi" (multiplicidad de infección) de \leq0,01 pfu/célula y se incubaron a 37ºC durante 48-72 h. Cuando los cultivos alcanzaron un efecto citopático de aproximadamente el 80%, se recogieron las células infectadas usando tripsina, se centrifugaron y se volvieron a suspender en medio de congelación. Se guardaron alícuotas de las células infectadas en ampollas de vidrio selladas en la fase gaseosa de nitrógeno líquido.

Se preparó la vacuna viva de NDV a partir de la cepa vacunal débil del NDV C2 (depositada en la CNCM del Institute Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, París, Francia, bajo el Nº de acceso I-1614).

Se diluyó NDV C2 X+4 para que contuviera aproximadamente 3-4 logs de virus por 0,1 ml y se inoculó en 200 embriones SPF de 10-12 días de edad. Se pusieron los embriones a 37ºC. A los cuatro días de la inoculación, miraron los embriones al trasluz y se pusieron todos los embriones vivos a 4ºC durante 2 horas. Se recogió entonces el fluido alantoideo. Se mezcló un total de 1.340 ml de fluido alantoideo con 660 ml de estabilizante y 20 ml de Gentocina. Se mezcló todo ello durante 15 minutos y se introdujo después en viales de vidrio de 10 ml, a 2 ml por vial. Se liofilizaron entonces los viales.

Se inocularon dos grupos de pollos de engorde comerciales de 30 días de edad con la cepa NDV-C2 por vía oculonasal.

Se inocularon dos grupos de pollos de engorde comerciales de 30 días de edad con la cepa HVT-NDV/F por vía intramuscular.

Se inocularon cuatro grupos de pollos de engorde comerciales de 30 días de edad con la cepa HVT-NDV/F por vía intramuscular y con la cepa NDV-C2 por vía oculonasal.

A las dos y cinco semanas de edad, se añadieron 2 pollos SPF de control de la misma edad a cada grupo de inoculación.

Se inóculo un grupo de pollos por inóculo con la cepa de NDV Herts 33/56 por vía intramuscular. Estos pollos fueron monitorizados a lo largo de un período de doce días por si aparecían signos clínicos de la Enfermedad de Newcastle y/o mortalidad.

Los otros grupos fueron inoculados con la cepa Beaudette del NDV por vía oculonasal. A los seis días de la inoculación, estos pollos fueron sacrificados y se extrajeron las tráqueas para reaislar el virus.

Se recogieron muestras de sangre al día de edad para la determinación de anticuerpos para el NDV en la prueba de IH (inhibición de la hemaglutinación) (el título IH medio era de 10^{6,4}). En los sueros de los pollos SPF de cinco semanas de edad, no se pudieron detectar anticuerpos para el NDV.

Se vacunó a los pollos con:

NDV-C2:	0,1 ml por pollo (7,6 log_{10} DIE_{50} por dosis).
HVT-NDV/F:	0,2 ml por pollo (\pm 1.200 PFU por dosis).

Se inoculó a los pollos con:

NDV Beaudette:	0,2 ml por pollo (7,6 log_{10} DLE_{50} por dosis).
NDV Herts 33/56:	0,2 ml por pollo (7,6 log_{10} DLE_{50} por dosis).

Determinación de la protección sistémica

Durante un período de doce días después de la inoculación con la cepa Herts de NDV, todos los pollos fueron observados diariamente en cuanto a la aparición de mortalidad o de evidencia clínica de la Enfermedad de Newcastle. Se registraron los datos diariamente. El sistema de puntuación era el siguiente:

0:	no aparece evidencia clínica de Enfermedad de Newcastle
1:	aparición de evidencia clínica de Enfermedad de Newcastle
	signos nerviosos centrales como:
	- espasmo clónico
	- temblores musculares
	- tortícolis
	- opistótonos
	- parálisis de las patas, ocasionalmente de las alas
2:	mortalidad debida a la inoculación del NDV.

Determinación de la protección local

Todos los pollos inoculados con la cepa Beaudette del NDV fueron sacrificados a los seis días de la inoculación y se les extirpó la tráquea. Se guardaron todas las tráqueas congeladas en caldo de triptosa al 2,5% a -70ºC hasta llevar a cabo el reaislamiento del virus.

Por muestra de tráquea, se inocularon 8-10 huevos a través de la cavidad alantoidea. Se incubaron los huevos durante ocho días a +37ºC en una incubadora de huevos con balanceo. Se consideró que la mortalidad de embriones que se producía 24 horas después de la inoculación era debida a la replicación del NDV.

En la Tabla 1 se muestran los resultados de la protección local y sistémica obtenidos a las dos y cinco semanas de la vacunación.

TABLA 1

1

NR = No realizado.

La vacuna NDV C2 viva inducía sólo una protección parcial, tanto local como sistémicamente, en presencia de altos niveles de MDA. También la vacuna monovalente HVT-NDV/F indujo una protección local (y sistémica) pobre en estas circunstancias.

Fue inesperado el hecho de que, tras la administración de la combinación de NDV-C2 y HVT-NDV/F, al comparar con las administraciones simples, tanto la protección local como la sistémica mejoraron excepcionalmente.

Este efecto sinérgico seguramente hace de la combinación una buena candidata para vacunación, en particular de pollos comerciales de engorde acelerado de un día de edad, frente al NDV.

Ejemplo 2 Eficacia de la administración combinada de HVT-NDV/HN o FPV-NDV/F y la cepa vacunal viva de NDV C2 o VG/GA

Se prepararon las dos vacunas consistentes en las cepas lentogénicas débiles de NDV C2 o VG/GA de forma similar a la vacuna basada en NDV C2 descrita en el Ejemplo 1. La cepa de NDV VG/GA está descrita en la Patente EE.UU. Nº 5.118.502 (ATCC Nº VR 2239). La vacuna del vector HVT-NDV/HN fue preparada como describen Morgan y col. y Sondermeyer y col. (Ejemplo 1).

Se insertó el gen NDV F descrito en el Ejemplo 1 en la región no esencial del fragmento Bam-HI J del genoma del FPV (virus de la viruela de las aves de corral) como se describe en la Solicitud Internacional WO 90/02191. Se recombinó una cassette de expresión que contenía el gen F bajo el control de un promotor de vaccinia y un gen marcador lacZ in vivo por transfección del ADN en células de pollo infectadas con FPV. Los recombinantes fueron identificados por tinción bluo-gal y purificados a homogeneidad siguiendo ciclos sucesivos de purificación por placas. La expresión del gen F fue confirmada por tinción fluorescente e inmunoprecipitación con antisueros específicos para NDV.

Se asignaron aleatoriamente 140 pollos de engorde comerciales a siete grupos de tal forma que cada grupo contuviera 20 pollos. Se sangraron otros 20 compañeros de eclosión de un día de edad y se examinaron los sueros en cuanto a la presencia de anticuerpos para NDV. Con un día de edad, se inoculó a los pollos del grupo 1 con la cepa VG/GA del NDV, se inoculó a los pollos del grupo 2 con la cepa HVT-NDV/HN, se inoculó a los pollos del grupo 3 tanto con la cepa FG/GA del NDV como con la cepa HVT-NDV/HN, se inoculó a los pollos del grupo 4 con la cepa NDV-C2, se inoculó a los pollos del grupo 5 con la cepa FPV-NDV/F, se inoculó a los pollos del grupo 6 tanto con la cepa NDV-C2 como con la cepa FPV-NDV/F y se dejó a los pollos del grupo 7 sin inocular y éstos sirvieron como controles. A los 14 y 31 días de edad se recogieron muestras de sangre de todos los pollos individualmente y se examinaron los sueros en cuanto a la ausencia/presencia de anticuerpos para NDV. A los 31 días de edad, todos los pollos fueron sometidos a una inoculación con la cepa Herts del NDV. Durante un período de 10 días después de la inoculación, se observó a los pollos diariamente en cuanto a la aparición de mortalidad.

Tratamiento

Se inoculó a 20 pollos de un día de edad del grupo 1 y del grupo 3 con 0,1 ml a cada uno de NDV VG/GA-GA que contenían 5,2 log_{10} DIE_{50} de partículas infecciosas de NDV por vía ocular.

Se inoculó a 20 pollos de un día de edad del grupo 4 y del grupo 6 con 0,1 ml a cada uno de NDV C2 que contenían 7,2 log_{10} DIE_{50} de partículas infecciosas de NDV por vía ocular.

Se inoculó a 20 pollos de un día de edad del grupo 2 y del grupo 3 con 0,2 ml a cada uno de HVT-NDV-HN que contenían 838 PFU de partículas infecciosas de HVT por vía intramuscular.

Se inoculó a 20 pollos de un día de edad del grupo 5 y del grupo 6 con 0,2 ml a cada uno de FPV-NDV/F que contenían 45.000 PFU de partículas infecciosas de FPV por vía subcutánea.

A los 31 días de edad, se inoculó a los pollos con 0,2 ml de la cepa Herts del NDV que contenían 7,4 log_{10} DIE_{50} de partículas infecciosas de NDV por vía intramuscular.

Observación de signos clínicos de la enfermedad

Después de la inoculación con la cepa Herts del NDV se observó a los pollos diariamente en cuanto a la aparición de mortalidad durante un período de 10 días.

Serología

A los 14 y a los 35 días de edad, se recogieron muestras de sangre de todos los pollos individualmente de la vena del ala.

Se examinaron las muestras de sangre en cuanto a anticuerpos para NDV en la prueba de IH del NDV según procedimientos estándar.

En las Tablas 2A y 2B se muestra la eficacia tanto de las vacunas monovalentes como de la de combinación.

TABLA 2A Resultados de la serología

Vacuna	log_{2} del título medio de anticuerpos para NDV a los 31 días
	post-inoculación
NDV cepa VG/GA	2,1 \pm 1,8
HVT-NDV/HN	2,1 \pm 1,8
NDV cepa VG/GA + HVT-NDV/HN	6,7 \pm 1,1
Controles	0,1 \pm 0,2

TABLA 2B Porcentaje de protección frente a la inoculación intramuscular con NDV Herts a los 31 días de edad

Vacuna	Porcentaje de protección basado en el número de pollos muertos
NDV cepa C2	53%
FPV-NDV/F	15%
NDV cepa C2 + FPV-NDV/F	75%
Controles	0%

La Tabla 2A muestra que tanto la cepa lentogénica débil VG/GA del NDV como la cepa vacunal HVT-NDV/HN inducían sólo una respuesta moderada de anticuerpos IH, mientras que la vacuna de combinación inducía una elevada respuesta inmune sinérgica. De forma similar, la protección aportada por la vacuna de combinación consistente tanto en la cepa lentogénica débil C2 del NDV como en el vector FPV-NDV/F era mayor que la suma de la protección inducida por las vacunas monovalentes.

Claims

1. Una vacuna de combinación para uso en la protección de las aves de corral frente a la Enfermedad de Newcastle (ND), consistente en una subunidad inmunogénica del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) o un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV, caracterizada por el hecho de que la vacuna contiene además una cepa vacunal viva de NDV.

2. Una vacuna de combinación según la reivindicación 1, caracterizada por ser el vector heterólogo un vector vírico vivo.

3. Una vacuna de combinación según la reivindicación 1, caracterizada por ser la subunidad inmunogénica del NDV el producto de expresión de un sistema de expresión en células bacterianas o de insectos.

4. Una vacuna de combinación según la reivindicación 3, caracterizada por ser la subunidad inmunogénica el producto de expresión de un baculovirus recombinante.

5. Una vacuna de combinación según la reivindicación 2, caracterizada por ser el virus vector vivo el virus herpes de los pavos (HVT) o el virus de la viruela de las aves de corral (FPV).

6. Una vacuna de combinación según las reivindicaciones 1-5, caracterizada por ser la subunidad o proteína inmunogénica del NDV la proteína de fusión (F) o hemaglutinina-neuraminidasa (HN).

7. Una vacuna de combinación según las reivindicaciones 1-6, caracterizada por ser la cepa vacunal viva del NDV una cepa de NDV lentogénica débil.

8. Una vacuna de combinación según la reivindicación 7, caracterizada por ser la cepa lentogénica débil del NDV la cepa C2, depositada en la CNCM del Institute Pasteur, París, Francia, bajo el Nº de acceso I-1614.

9. Un kit de vacunación para inmunizar aves de corral frente a la ND, cuyo kit consiste en los siguientes componentes:

a.: una subunidad inmunogénica del NDV o un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV y

b.: una cepa vacunal viva del NDV y

c.: eventualmente un vehículo o diluyente para los componentes a y/o b.

10. Un kit según la reivindicación 9, caracterizado por ser el vehículo o diluyente un adyuvante.

11. Uso de una subunidad inmunogénica del NDV o de un vector heterólogo capaz de expresar una proteína inmunogénica del NDV como primer componente y de una cepa vacunal viva del NDV como segundo componente para la fabricación de una vacuna para la administración combinada de los componentes para la protección de las aves de corral frente a la enfermedad de Newcastle.

12. Uso según la reivindicación 11, caracterizado por administrar el primer componente parenteralmente o in ovo y administrar el segundo componente por una vía de aplicación en masa.

13. Uso según la reivindicación 12, caracterizado por administrar el primer componente in ovo antes de la eclosión y administrar el segundo componente a las aves cuando tienen un día de edad.