ES2218800T3 - Dispositivo de dosificado bioquimico e inmunoquimico. - Google Patents
Dispositivo de dosificado bioquimico e inmunoquimico.Info
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Abstract
Un dispositivo de dosificación que comprende: (a) un sustrato que comprende: (i) un material poroso capaz de transportar un líquido cromatográficamente y (ii) uno o más reactivos de ensayo para una dosificación que tiene lugar sobre el material poroso; y (b) un polímero de revestimiento transparente impermeable al agua unido al material poroso de manera que define un compartimiento absorbente continuo.
Description
Dispositivo de dosificado bioquímico e
inmunoquímico.
La presente invención se refiere a un nuevo
dispositivo para realizar ensayos.
Hay una necesidad continua de dispositivos
autónomos simples para realizar ensayos bioquímicos fuera del
laboratorio. En particular, se necesita un dispositivo que se pueda
usar en casa, en una clínica o consulta del médico, que se pueda
usar para obtener un resultado analítico que es rápido y que
requiere el grado mínimo de destreza e implicación del usuario.
La presente invención pretende proporcionar un
dispositivo para realizar ensayos bioquímicos, que evita la
necesidad de procedimientos manuales complicados y que por lo tanto
puede ser manejado por un usuario no cualificado.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un dispositivo de ensayo incluyendo:
- (a)
- un sustrato incluyendo:
- (i)
- un material poroso capaz de transportar cromatográficamente un líquido; y
- (ii)
- uno o varios reactivos de prueba para un ensayo dispuestos sobre el material poroso; y
- (b)
- un polímero de recubrimiento transparente impermeable al agua unido al material poroso para definir un compartimiento bíbulo secante.
Típicamente, el material poroso es un material
celulósico, un material plásticoporoso o una fibra de material de
vidrio. Preferiblemente, el material poroso es un material
celulósico tal como papel o nitrocelulosa. El material poroso puede
estar modificado química o físicamente para darle propiedades
físicoquímicas específicas. Por ejemplo, puede llevar una carga
iónica, en particular cuando es papel. Ejemplos de material poroso
cargado adecuado incluyen papel de intercambio iónico Whatman®.
Preferiblemente, se incorpora un polímero dopante
impermeable al líquido que el material poroso es capaz de
transportar, a una parte del material poroso para definir un canal
en el material poroso, disponiéndose el o cada reactivo de análisis
sobre el material poroso en el canal allí definido. Típicamente, el
polímero dopante es un polímero acrílico, un copolímero acrílico tal
como un copolímero de acrilato de etilo y metacrilato de metilo tal
como Primal B-60A, un copolímero acrílico de vinilo
tal como una tinta de serigrafía tal como Polyvin Gloss o un
heteropolisacárido. Los heteropolisacáridos adecuados incluyen
polímeros de carrageenina tal como carrageenina tipo II. Se puede
usar un silano junto con el polímero dopante para delimitar el
canal en el material poroso.
La forma del compartimiento bíbulo se puede
determinar por la forma del material poroso, pero se determina
preferiblemente por el canal definido en el material poroso por el
polímero dopante.
El polímero (b) recubre el sustrato. Está unido
típicamente al sustrato (a) y no se puede quitar mecánicamente.
Preferiblemente, el polímero de recubrimiento (b) está unido al
sustrato por penetración parcial del polímero de recubrimiento en
el sustrato. Así, el polímero de recubrimiento (b) es
preferiblemente contiguo, o integral, con el dispositivo de ensayo.
El polímero de recubrimiento penetra en el sustrato solamente en
una extensión limitada y no penetra en un grado tal que evite que
el material poroso transporte cromatográficamente el líquido. En
general, el polímero de recubrimiento penetra de 30 a 70%,
preferiblemente aproximadamente 50%, del espesor del sustrato.
El polímero de recubrimiento (b) es típicamente
un heteropolisacárido y es preferiblemente un polímero de
carrageenina tal como carrageenina tipo I o agarosa. También puede
ser un polímero sintético tal como un polímero acrílico o un
copolímero acrílico tal como Primal B-60.
El polímero de recubrimiento (b) no tiene que
recubrir todo el sustrato (a). Una parte del material poroso puede
estar así sin recubrir. Preferiblemente, sin embargo, solamente hay
una entrada al compartimiento bíbulo. Se puede disponer uno o
varios (pero no todos) reactivos de prueba sobre la porción no
recubierta del material poroso de tal forma que sea transportado
cromatográficamente al compartimiento bíbulo cuando se aplique una
muestra líquida al dispositivo de ensayo. Así, el recubrimiento (b)
recubre típicamente al menos una parte del material poroso para
definir un compartimiento bíbulo secante conteniendo al menos un
reactivo de análisis.
Preferiblemente, el dispositivo de ensayo de la
presente invención incluye otra capa (c) dispuesta sobre el
polímero de recubrimiento (b) para mejorar las propiedades visuales
y/o de textura del dispositivo de ensayo. La capa (c) puede ser
transparente, brillante, rígida o impermeable al agua según sea
preciso. Preferiblemente, es una capa brillante transparente. La
capa (c) también puede ser ventajosamente imprimible, es decir,
capaz de tener información impresa directamente sobre ella. Los
ejemplos de información que se puede imprimir sobre la capa (c)
incluyen logos, nombres de marca, instrucciones de uso del
dispositivo de ensayo, indicadores para mostrar un resultado
positivo y/o negativo, estándares de calibración y códigos de
barras.
Típicamente, la capa (c) incluye uno o varios
compuesto(s) seleccionado(s) a partir de polímeros
acrílicos tal como ácido polimetacrílico, copolímeros acrílicos tal
como Acrylsol WS-24, Primal B-85 y
copolímeros de acrilato de etilo y metacrilato de metilo (por
ejemplo Primal B-60A), ácidos poliurónicos tal como
ácido algínico, y alcoholes poliméricos. Los alcoholes poliméricos
preferidos son los que tienen un peso molecular de 6000 a 146000,
preferiblemente de aproximadamente 9000. Los alcoholes poliméricos
adecuados incluyen alcohol polivinílico.
Donde el polímero (b) no recubre todo el sustrato
(a), la capa (c) no recubre típicamente la parte del material poroso
que no está recubierta con el polímero (b).
Los dispositivos de ensayo de la invención pueden
ser uutilizados al someter a ensayo una amplia gama de muestras
líquidas para una amplia gama de analitos. Así, se pueden usar en
atención sanitaria humana o animal, por ejemplo para analizar en
muestras, tal como suero humano o animal, plasma, orina, saliva o
líquido cerebroespinal, analitos tal como glucosa en sangre, drogas
de abuso, drogas terapéuticas, y antígenos de significado para el
diagnóstico y anticuerpos para los mismos. También se pueden
utilizar en higiene alimenticia, por ejemplo, para analizar en
productos alimenticios patógenos tal como E. Coli o
Salmonella, o para analizar agua potable en busca de
patógenos tal como los que producen cólera, enfermedades tifoideas
o amébicas. Además, se pueden utilizar en análisis medioambiental,
por ejemplo para analizar en agua de río la presencia de
contaminantes tal como fosfatos, nitratos, nitritos o un rango de
compuestos xenobióticos tal como hidrocarbonos poliaromáticos,
hidrocarbonos de petróleo totales y bifenilos policlorados. Dado que
los dispositivos son simples y autónomos, se pueden usar en muchas
situaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar para aplicación in
situ en lugares contaminados y en entornos domésticos, por
ejemplo para analizar en el agua de un acuario la presencia de
nitritos o nitratos.
Hablando en términos generales, la muestra a
analizar será una muestra acuosa y, por lo tanto, el líquido que el
material poroso es capaz de transportar, es en general un líquido
acuoso.
Los reactivos de prueba dispuestos sobre el
material poroso del dispositivo de ensayo incluyen en general al
menos un reactivo de detección que es capaz de reaccionar con un
analito predeterminado cuya presencia se sospecha en una muestra a
analizar para generar un efecto detectable, por ejemplo formando un
complejo con el analito predeterminado. El efecto detectable puede
ser evidente a simple vista (por ejemplo, un cambio de color).
Alternativamente, puede ser detectable solamente por un
espectrómetro u otros medios técnicos (por ejemplo, un cambio de
absorción ultravioleta).
Típicamente, el reactivo de detección tiene una
mayor afinidad para el analito predeterminado que para otros
ingredientes de la muestra a analizar.
El reactivo de detección puede ser una sustancia
química tal como iones férricos, que experimentan un cambio de
color cuando se ponen en contacto con ácido salicílico, ácido
pícrico, que forma un complejo coloreado con creatinina en
condiciones alcalinas, y molibdato de amonio, que forma un complejo
con iones fosfato en condiciones ácidas.
El reactivo de detección también puede ser una
enzima, por ejemplo alcohol dehidrogenasa que, junto con
nicotinamida adenina dinucleótido, puede convertir etanol a
acetaldehído, conversión que es detectable usando luz
ultravioleta.
Se puede usar, si es preciso, más de un reactivo
de detección. Así, se puede usar una enzima y una coenzima como
reactivos de detección. Los ejemplos de casos en los que se puede
usar más de un reactivo de detección incluyen el uso de
sulfanilamida y naftiletilendiamina, que forman un complejo rosa con
iones nitrito bajo condiciones ácidas, y el uso de glucosa oxidasa,
fenol, 4-aminoantipireno y peroxidasa para detectar
glucosa. Donde está presente más de un reactivo de detección, cada
reactivo de detección se puede disponer sobre partes adyacentes del
material poroso, o se puede disponer uno o varios reactivos de
detección sobre la misma parte del material poroso. Donde se
utiliza más de un reactivo de detección, el efecto detectable se
produce en general solamente después de poner cada reactivo de
detección en contacto con la muestra líquida en la que se sospecha
la presencia del analito.
En general, al menos un reactivo está
inmovilizado en el material poroso. Puede ser inmovilizado por
adsorción pasiva al material poroso. Alternativamente, los
reactivos de prueba pueden incluir un compuesto de anclaje de
detección que es capaz de inmovilizar un reactivo de detección en
el material poroso. El compuesto de anclaje de detección puede ser
un compuesto que permite una unión adecuada covalente entre el
material poroso y el reactivo de detección.
El reactivo de detección también puede ser
inmovilizado en el material poroso por medios iónicos. Por ejemplo,
se puede usar papel de intercambio iónico de carga negativa como el
material poroso para inmovilizar un reactivo de detección cargado
(o viceversa). Ejemplos de reactivos de detección cargados incluyen
mezclas de sulfanilamida y
N-1-naftiletilendiamina
dihidrocloruro, mezclas que se pueden usar para detectar nitrito,
como se ha explicado anteriormente. Los reactivos de prueba pueden
incluir, además del reactivo de detección, un reactivo para mejorar
el efecto detectable producido por la reacción del analito
predeterminado con el reactivo de detección. Por ejemplo, puede
estar presente carboxi metil celulosa cuando el material poroso es
papel, para garantizar la distribución de un producto de reacción
coloreado a través del papel.
El o cada reactivo de detección puede disponerse,
por ejemplo, para dar, como efecto detectable, una banda de color o
se puede disponer para dar, como efecto detectable, un bloque de
color. Esta última disposición puede ser útil para ensayos
cuantitativos o semicuantitativos que implican una comparación de la
intensidad del color obtenido con un estándar.
Los dispositivos de ensayo de la invención pueden
ser usados para realizar ensayos químicos multirreactivo o ensayos
secuenciales. Así, se puede disponer un primer reactivo de
detección y al menos otro reactivo de detección sobre el material
poroso, siendo tal la colocación relativa de los reactivos que una
muestra líquida aplicada al compartimiento bíbulo será transportada
cromatográficamente para contactar primero el primer reactivo y
después para contactar los demás reactivos.
Típicamente, en dispositivos de ensayo adecuados
para ensayos químicos multirreactivo, cada reactivo de detección, a
excepción del último reactivo de detección a ser contactado por la
muestra líquida, se puede mover libremente cuando se aplica un
líquido al material poroso, inmovilizándose dicho último reactivo
de detección a ser contactado en el material poroso de la manera
explicada anteriormente. Típicamente, en dispositivos de ensayo
adecuados para ensayos secuenciales, cada reactivo de detección se
inmoviliza en el soporte sólido de la manera explicada
anteriormente.
Por ejemplo, cuando se utiliza un dispositivo de
ensayo multirreactivo que tiene dos reactivos de detección, una
muestra líquida en cuya presencia se sospecha el analito, será
transportada cromatográficamente al primer reactivo donde el
analito, si está presente, experimentará una primera reacción. El
producto del primer reacción será transportado cromatográficamente
al segundo (y último) reactivo de detección, que está inmovilizado
típicamente en el material poroso. Allí experimentará una segunda
reacción para generar un efecto detectable. Cuando el primer
reactivo es sulfanilamida y el segundo reactivo es
naftiletilendiamina, el dispositivo de ensayo es adecuado para
analizar en una muestra líquida la presencia de nitrito.
Otro ejemplo: cuando se utiliza un dispositivo de
ensayo secuencial, cada reactivo de detección está inmovilizado
típicamente en el material poroso y la muestra líquida es
transportada cromatográficamente a través de cada reactivo de
detección. Cada reactivo de detección puede ser capaz de reaccionar
con un analito diferente para producir un efecto detectable (en
cuyo caso el dispositivo de ensayo secuencial será adecuado para
analizar en una muestra líquida una pluralidad de analitos).
Alternativamente, cada reactivo de detección puede ser sensible
solamente a una concentración predeterminada de un analito (en cuyo
caso el dispositivo de ensayo secuencial será adecuado para ensayos
cuantitativos o semicuantitativos).
En los dispositivos de ensayo de la invención, el
compartimiento bíbulo puede incluir un cuerpo central que tiene una
pluralidad de canales conectados al mismo. Tal disposición se
representa en las figuras 2 y 3. Se puede disponer reactivos de
detección en cada canal. Como con respecto al dispositivo de ensayo
secuencial, cada reactivo de detección puede ser capaz de reaccionar
con un analito diferente para producir un efecto detectable (en
cuyo caso el dispositivo será adecuado para analizar en una muestra
líquida una pluralidad de analitos). Alternativamente, cada
reactivo de detección puede ser sensible a una concentración
diferente del mismo analito (en cuyo caso el dispositivo será
adecuado para ensayos cuantitativos o semicuantitativos).
Típicamente, en tales dispositivos de ensayo, hay de dos a seis o
más, preferiblemente cuatro, canales conectados al cuerpo
central.
Los reactivos de prueba pueden incluir además un
agente bloqueante tal como albúmina sérica bovina, polivinil
pirrolidina, globulina y peptonas tal como caesina ácido- y
enzima-hidrolizada o carboximetil celulosa. También
pueden incluir una solución tampón portadora tal como 10mM Tris
hidrocloruro o Tris carbonato. Se prefiere en particular que los
reactivos de prueba incluyan tal agente bloqueante o solución
tampón portadora cuando el reactivo de detección reacciona con el
analito predeterminado en una reacción enzimática o
inmunológica.
El dispositivo de ensayo de la presente invención
es especialmente adecuado para realizar inmunoensayos. En
dispositivos de ensayo adecuados para realizar inmunoensayos, el
reactivo de detección es típicamente un reactivo de unión
específica tal como un antígeno o un anticuerpo. Típicamente, el
reactivo de unión específica es un antígeno de significado para el
diagnóstico, un anticuerpo para un antígeno de significado para el
diagnóstico, o un anticuerpo que reconoce un anticuerpo para un
antígeno de significado para el diagnóstico.
Un antígeno de significado para el diagnóstico
puede ser un patógeno. Además, un antígeno de significado para el
diagnóstico puede ser un antígeno, cuya cantidad en una muestra se
considera que está relacionada con la probabilidad de inicio de una
enfermedad. Además, un antígeno de significado para el diagnóstico
puede ser un antígeno cuya presencia en una muestra indica un
estado clínico tal como embarazo.
Los ejemplos de antígenos de significado para el
diagnóstico incluyen gonadotropina coriónica humana, hormona
luteinizante, antígenos de virus de hepatitis A, B y C,
microorganismos responsables de Clamidia o enfermedad de Lyme, el
virus VIH o patógenos responsables de otras enfermedades de
transmisión sexual, antígenos tal como colesterol que están
asociados con enfermedad cardiaca, antígenos que son indicativos de
ataque cardiaco u otras patologías fisiológicas, antígenos
asociados con el Síndrome de Down, antígenos asociados con leucemia
felina y antígenos asociados con respuestas alérgicas. típicamente,
cuando el reactivo de unión específica es un anticuerpo, es un
anticuerpo para un patógeno tal como un virus, una bacteria, u otro
microorganismo o un anticuerpo que reconoce un anticuerpo para
dicho patógeno.
Más preferiblemente, en dispositivos de ensayo
adecuados para realizar inmunoensayos, los reactivos de prueba
incluyen:
(a) un analito marcado o análogo de analito o un
reactivo de unión específica marcado para un analito, pudiendo
moverse libremente el reactivo de unión específica marcado o
analito marcado o análogo de analito cuando se aplica al material
poroso una muestra líquida en cuya presencia se sospecha el analito;
y dicho reactivo de unión específica no marcado para el mismo
analito, inmovilizado en el material poroso en una zona de
detección, siendo tal la colocación relativa del reactivo marcado
(a) y la zona de detección que cuando la muestra líquida se aplica
al compartimiento bíbulo, el reactivo marcado (a) se filtra a la
zona de detección.
El reactivo no marcado (b) se inmoviliza
generalmente en el material poroso por adsorción pasiva o por medio
de dicho compuesto de anclaje de detección. Un dispositivo de
ensayo en el que los reactivos de prueba se disponen sobre el
material poroso de esta forma se representa en la figura 1.
Típicamente, el reactivo (b) se dispone dentro
del compartimiento bíbulo y el reactivo (a) se dispone sobre una
parte del material poroso que no está recubierta con el polímero
(b), de tal forma que sea transportado cromatográficamente al
compartimiento bíbulo cuando se aplique una muestra líquida al
dispositivo de ensayo.
Los dispositivos de ensayo de la invención en los
que los reactivos de prueba son los antes definidos, se pueden usar
para efectuar tanto ensayos intercalados (cuando el reactivo
marcado (a) es un reactivo de unión específica para un analito)
como ensayos de competición (cuando el reactivo marcado (a) es un
analito o análogo de analito). El analito analizado en la muestra
líquida puede ser un antígeno o un anticuerpo.
Cuando el dispositivo está destinado a uso en un
ensayo intercalado, y el analito que se analiza en la muestra
líquida es un antígeno, el reactivo marcado (a) y el reactivo de
unión específica no marcado (b) son en general anticuerpos que
reconocen el antígeno. Claramente, el reactivo no marcado (b) no se
une al epítopo al que se une el reactivo marcado (a), pero es
específico para un epítopo diferente. Un ejemplo de tal dispositivo
de ensayo se representa en la figura 4.
Cuando el analito que se analiza en la muestra
líquida es un anticuerpo, el reactivo marcado (a) puede ser un
antígeno reconocido por el anticuerpo de analito, en cuyo caso el
reactivo no marcado (b) es generalmente un anticuerpo que reconoce
el anticuerpo de analito. Un ejemplo de tal dispositivo de ensayo
se representa en la figura 5. Alternativamente, el reactivo marcado
(a) puede ser un anticuerpo que reconoce el anticuerpo de analito,
en cuyo caso el reactivo no marcado (b) es generalmente un antígeno
reconocido por el anticuerpo de analito. Un ejemplo de tal
dispositivo de ensayo se representa en la figura 6.
Se prefieren en particular los dispositivos de
ensayo en los que los reactivos (a) y (b) son reactivos de unión
específica para un anticuerpo que reconoce VIH o patógenos de
leucemia felina.
Cuando el analito es un anticuerpo humano, los
ejemplos de anticuerpos que reconocen el anticuerpo de analito
incluyen IgG antihumana e IgM antihumana.
Cuando el dispositivo está destinado a uso en un
ensayo de competición, el reactivo no marcado (b) es generalmente
un anticuerpo cuando el analito que se analiza en la muestra
líquida es un antígeno. Cuando el analito que se analiza en la
muestra líquida es un anticuerpo, el reactivo (b) es generalmente un
antígeno reconocido por el anticuerpo de analito o un anticuerpo
que reconoce el anticuerpo de analito.
Otros reactivos de prueba pueden estar presentes
en una zona de control, para garantizar que el reactivo marcado (a)
se filtre a la zona de detección. Estos reactivos de prueba
adicionales incluyen típicamente un reactivo de unión específica
para el reactivo marcado (a). Cuando el ensayo es un ensayo
intercalado, el analito o su análogo está inmovilizado típicamente
en la zona de control. Cuando el ensayo es un ensayo de
competición, un reactivo capaz de unirse al marcador soportado por
el reactivo marcado (a) puede ser inmovilizado en la zona de
control. La colocación de la zona de control es generalmente tal
que cuando la muestra líquida se aplica al compartimiento bíbulo, el
reactivo marcado (a) se filtre de la zona de detección a la zona de
control.
En el sentido en que se usa aquí, un análogo de
un analito es un compuesto capaz de formar un complejo con un
reactivo de unión específica para el analito.
Preferiblemente, el reactivo marcado (a) y el
reactivo no marcado (b) son anticuerpos, preferiblemente anticuerpos
que reconocen un patógeno tal como un virus, una bacteria u otro
microorganismo. En otra realización preferida, el reactivo no
marcado (b) es dicho patógeno y el reactivo marcado (a) es un
anticuerpo que reconoce un anticuerpo para dicho patógeno.
Los dispositivos de ensayo de la invención
adecuados para realizar inmunoensayos también se pueden utilizar en
un ensayo cuantitativo o semicuantitativo o en un ensayo de una
muestra líquida para una pluralidad de analitos predeterminados. En
dispositivos adecuados para ser utilizados en tales ensayos, el
compartimiento bíbulo incluye típicamente un cuerpo central y una
pluralidad de canales conectados al mismo (figuras 2 y 3).
En dispositivos adecuados para un inmunoensayo de
una muestra líquida para una pluralidad de analitos
predeterminados:
- dicho reactivo de unión específica marcado para
cada analito predeterminado o un analito marcado o análogo de
analito correspondiente a cada analito predeterminado está presente
típicamente en el cuerpo central, pudiendo moverse libremente el
reactivo de unión específica marcado o analito marcado o análogo de
analito cuando se aplica al material poroso una muestra líquida en
cuya presencia se sospechan los analitos; y
- cada canal conectado al cuerpo central contiene
típicamente una zona de detección en la que está inmovilizado dicho
reactivo de unión específica no marcado para uno de los analitos
predeterminados, siendo tal la colocación relativa de los reactivos
marcados y las zonas de detección que cuando la muestra líquida se
aplica al compartimiento bíbulo, los reactivos marcados se filtran
a cada zona de detección.
En dispositivos de ensayo adecuados para un
ensayo cuantitativo o semicuantitativo:
- un analito marcado o análogo de analito o dicho
reactivo de unión específica marcado para un analito está presente
típicamente en el cuerpo central, pudiendo moverse libremente el
reactivo de unión específica marcado o analito marcado o análogo de
analito cuando se aplica al material poroso una muestra líquida en
cuya presencia se sospecha el analito; y
- cada canal conectado al cuerpo central contiene
típicamente una zona de detección en la que está inmovilizado dicho
reactivo de unión específica no marcado para el analito, donde la
colocación relativa del reactivo marcado y las zonas de detección
es tal que cuando la muestra líquida se aplica al compartimiento
bíbulo, el reactivo marcado se filtra a cada zona de detección, y
donde
(a) cada zona de detección contiene una
concentración diferente de reactivo de unión específica no marcado,
o
(b) uno o varios, pero no todos (y
preferiblemente todos a excepción de uno), canales conectados al
cuerpo central son canales de calibración que contienen una zona
(i), en la que está inmovilizado un reactivo de unión específica
para el analito en una cantidad suficiente para unir
sustancialmente todo el analito que pasa a través de la zona, y una
zona (ii) conteniendo una cantidad definida de analito
opcionalmente marcado o análogo de analito que se puede mover
libremente cuando la muestra líquida se aplica al material poroso,
siendo tal la colocación relativa de la(s) zona(s)
(i), la(s) zona(s) (ii) y la(s) zona(s)
de detección en el (los) canal(es) de calibración que cuando
la muestra líquida se aplica al compartimiento bíbulo, la muestra
líquida se filtra del cuerpo central primero a la(s)
zona(s) (i), después a
\hbox{la(s)}
zona(s) (ii) y después a la(s) zona(s) de
detección.
Típicamente, el analito o análogo de analito
presente en cada zona (ii) se marca cuando la muestra líquida a
analizar contiene una concentración alta de analito. En estas
circunstancias, una gran cantidad del reactivo marcado presente en
el cuerpo central se unirá en cada zona (i) (mediante el analito),
y una cantidad suficiente del reactivo marcado del cuerpo central
puede no filtrase a la(s) zona(s) de detección en el
(los) canal(es) de calibración.
Hay típicamente de 2 a 6, preferiblemente 4,
canales conectados al cuerpo central.
Se puede usar dispositivos adecuados para un
ensayo de una muestra líquida para una pluralidad de analitos
predeterminados o adecuados para un ensayo cuantitativo o
semicuantitativo para efectuar tanto ensayos intercalados como
ensayos de competición para anticuerpos o antígenos, como se ha
descrito anteriormente. Otros reactivos de prueba pueden estar
presentes en una o varias zonas de control como se ha descrito
anteriormente. Las figuras 2 y 3 muestran dispositivos de ensayo de
la invención que se pueden usar en un ensayo de una muestra líquida
para una pluralidad de analitos predeterminados o en un ensayo
cuantitativo o semicuantitativo.
Un dispositivo de ensayo especialmente preferido,
adecuado para realizar un ensayo semicuantitativo para un
anticuerpo, se representa en la figura 7. En este dispositivo, un
anticuerpo marcado que reconoce el anticuerpo de analito está
presente en el cuerpo central. Todos, a excepción de uno, los
canales conectados al cuerpo central contienen dicha zona (i), en
la que se inmoviliza un antígeno reconocido por el anticuerpo de
analito, y dicha zona (ii), conteniendo cada zona (ii) una cantidad
predeterminada diferente del anticuerpo de analito. Cada canal
conectado al cuerpo central también contiene una zona de detección
en la que se inmoviliza un antígeno que es reconocido por el
anticuerpo de analito.
La comparación de las señales generadas en las
zonas de detección después de terminar el ensayo, da una indicación
de la concentración del anticuerpo de analito en la muestra
líquida.
Los reactivos de prueba marcados se pueden marcar
con cualquier marcador convencional. Preferiblemente, el marcador
es un marcador enzimático, un marcador radiactivo, un marcador
fluorescente, microesferas de látex teñidas, un marcador de oro o
un marcador polisacárido funcionalizado. Más preferiblemente, el
marcador es capaz de generar una señal visual. El marcador se puede
unir por medios convencionales.
Para algunos ensayos, puede ser ventajoso dirigir
específicamente o controlar la velocidad del flujo de la muestra
líquida sobre la(s) zona(s) de detección, promoviendo
por lo tanto un mayor contacto entre el analito en el líquido y los
reactivos inmovilizados en la(s) zona(s) de detección
para efectuar una intensificación de la señal generada por el
marcador. La forma del compartimiento bíbulo puede estar adaptada
para lograrlo. Por ejemplo, el compartimiento bíbulo puede ser más
estrecho en la(s) zona(s) de detección que en la
región del material poroso donde se añade la muestra líquida. Tal
disposición se representa en la figura 1.
La forma del compartimiento bíbulo también puede
ser tal que cree una zona de atrapamiento en la que se concentrará
el reactivo marcado. Tal zona de atrapamiento se puede usar para
indicar que ha tenido lugar cromatografía exitosa. Por lo tanto,
puede actuar como un control independiente disponiendo un indicador
"preparado para leer". Una zona de atrapamiento puede constar,
por ejemplo, de una barrera parcial a través del compartimiento
bíbulo. Tal barrera puede estar formada por el polímero dopante,
como se representa en la figura 1.
El dispositivo de ensayo de la invención puede
incluir además un filtro para quitar de la muestra líquida a
analizar materia particulada indeseada. En general, el filtro se
dispone a través de la entrada al compartimiento bíbulo de manera
que la muestra líquida se pueda aplicar al dispositivo de ensayo a
través del filtro.
Por ejemplo, el filtro puede incluir un polímero
con tamaños de poro definidos dispuesto a través de la entrada al
compartimiento bíbulo. Tal filtro integral puede actuar como una
barrera semipermeable para quitar material indeseado particulado,
tal como detritus, de muestras de agua. Alternativamente, el
filtro puede incluir dicho material poroso dispuesto a través de la
entrada al compartimiento bíbulo, del que una parte se recubre
opcionalmente con el polímero de recubrimiento (b). Tal filtro
podría quitar materia, tal como glóbulos rojos, de la muestra
líquida a analizar. Dicho polímero dopante se puede incorporar a
una parte de tal filtro para definir un canal en el filtro. Tal
canal puede ser útil para dirigir la muestra líquida a la entrada
del compartimiento bíbulo.
Preferiblemente, el dispositivo de ensayo de la
invención es una tira sustancialmente plana tal como una varilla de
inmersión, que transporta cromatográficamente la muestra líquida a
lo largo de la tira (un "dispositivo de flujo lateral"). Sin
embargo, el dispositivo de ensayo también puede transportar
cromatográficamente la muestra líquida a través del espesor del
material poroso ("dispositivo de flujo tangencial").
En un dispositivo de flujo tangencial, dicho
polímero dopante se incorpora en una parte del material poroso como
se ha descrito anteriormente, extendiéndose el canal definido por
el polímero dopante a través del cuerpo del material poroso. El
canal está encerrado así por el material poroso en todos los lados.
El polímero de recubrimiento (b) no es esencial en un dispositivo de
flujo tangencial.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un dispositivo de ensayo incluyendo:
- (a)
- un sustrato incluyendo:
- (i)
- un material poroso capaz de transportar cromatográficamente un líquido; y
- (ii)
- uno o varios reactivos de prueba para un ensayo dispuestos en el material poroso; y
- (b)
- un polímero dopante impermeable al líquido que el material poroso es capaz de transportar, incorporado en una parte del material poroso para definir un canal que se extiende a través del cuerpo del material poroso, disponiéndose el o cada reactivo de análisis sobre el material poroso en el canal allí definido.
Los polímeros dopantes preferidos son los antes
definidos.
Tal dispositivo de flujo tangencial puede
incluir, en la entrada al canal en el material poroso, un polímero
que tiene tamaños de poro definidos. Tal polímero puede actuar como
una membrana semipermeable como se ha explicado anteriormente.
Además, tal dispositivo de flujo tangencial puede incluir, a través
de la salida del canal en el material poroso, una capa o
recubrimiento impermeable al líquido que el material poroso es
capaz de transportar. La capa o recubrimiento impermeable puede
incluir, por ejemplo, dicho polímero de recubrimiento (b) o una
capa de silano unida al material poroso.
Muchos de tales dispositivos de flujo tangencial
se pueden disponer sobre una única hoja de material poroso tal como
una única hoja de papel. Los dispositivos de flujo tangencial así
dispuestos se pueden usar para realizar ensayos de forma parecida a
una placa de microvaloración convencional.
También se facilita un método de analizar en una
muestra líquida la presencia o ausencia de un analito
predeterminado, incluyendo dicho método:
(a) contactar la muestra líquida con el
compartimiento bíbulo de un dispositivo según la invención;
(b) dejar que el material poroso transporte
cromatográficamente la muestra líquida; y
(c) determinar la presencia del analito
predeterminado en la muestra líquida.
La presente invención también proporciona el uso
de un dispositivo de ensayo de la invención para analizar en una
muestra líquida un analito predeterminado. También se facilita un
kit de prueba conteniendo un dispositivo de ensayo de la
invención.
Además, la presente invención proporciona un
proceso para preparar un dispositivo de ensayo de la invención,
proceso que incluye:
(a) disponer un material poroso capaz de
transportar cromatográficamente un líquido;
(b) disponer uno o varios reactivos de prueba
para un ensayo en el material poroso; y
(c) unir un polímero de recubrimiento
transparente impermeable al agua al material así obtenido
contactando el material con una solución o suspensión del polímero
de recubrimiento.
En el paso (c) el material poroso se recubre con
el polímero de recubrimiento transparente impermeable al agua.
Cuando el polímero de recubrimiento es un polímero biológico tal
como un heteropolisacárido, el material se pone típicamente en
contacto primero con un agente acelerador de gel y después se pone
en contacto con la solución o suspensión del polímero de
recubrimiento.
En algunos casos el polímero de recubrimiento se
puede aplicar en el paso (c) poniendo el material en contacto con el
polímero de recubrimiento en forma líquida.
El polímero de recubrimiento se puede aplicar con
métodos de recubrimiento por rodillo conocidos por los expertos en
la materia, en particular cuando es un polímero sintético.
Preferiblemente, el proceso de la invención
incluye el paso adicional, entre los pasos (a) y (b), de aplicar a
parte del material poroso un polímero dopante impermeable al
líquido que el material poroso es capaz de transportar, para
definir un canal en el material poroso, disponiéndose el o cada
reactivo de análisis sobre el soporte poroso en el paso (b) en el
canal allí definido.
El polímero dopante se puede aplicar por medio de
un pulverizador de aire controlado por ordenador o, preferiblemente,
aplicando el polímero dopante al material poroso después de unir
una plantilla a ambos lados del material poroso. Esto se puede
hacer, por ejemplo, mediante técnicas de impresión serigráfica
estándar.
El agente acelerador de gel es un compuesto capaz
de promover el entrecruzamiento del polímero de recubrimiento.
También se puede describir como un agente de entrecruzamiento. No
se requiere un agente acelerador de gel cuando el polímero es un
polímero sintético tal como un polímero de acrilato. Los agentes
aceleradores de gel adecuados incluyen sales inorgánicas tal como
cloruro cálcico, polímeros conteniendo nitrógeno tal como
polietilenimina, sales orgánicas de amonio tal como bromuro de
hexadecilamonio, proteínas tal como celulasas y resinas catiónicas
tal como sustancias químicas de poli(aminoamida) de curado
neutras (por ejemplo Kymene® SLX).
Preferiblemente, el proceso de la invención
incluye además:
(d) poner el dispositivo así obtenido en contacto
con uno o varios compuesto(s) seleccionado(s) a partir
de polímeros acrílicos, polisacáridos gelificantes y polivinil
alcoholes para formar sobre el dispositivo otra capa, que es
preferiblemente una capa brillante transparente.
Preferiblemente la capa adicional se obtiene
sumergiendo el dispositivo de ensayo en una solución seleccionada a
partir de soluciones incluyendo de 0,5% a 1,5% p/v ácido algínico,
soluciones incluyendo de 7,5% a 12,5% p/v alcohol polivinílico,
soluciones incluyendo 100% p/v Primal B-60A,
soluciones incluyendo de 25% a 100% p/v Acrysol
WS-24, y soluciones incluyendo de 40 a 60% p/v,
preferiblemente de aproximadamente 47% p/v, Primal
B-60A que tienen una relación de Primal
B-60A: ácido polimetacrílico de 90:10 a 70:30 o una
relación de Primal B-60A: Primal B85 de 95:5 a
90:10. Típicamente, todas las soluciones anteriores son soluciones
acuosas.
Típicamente, cuando el polímero de recubrimiento
impermeable al agua es dicho polímero biológico, el proceso de la
invención incluye además un paso de lavado antes del paso (a), en
el que el material poroso se pone en contacto con una solución
acuosa de iones metal mono-, di- o trivalentes, tal como iones
potasio, calcio o aluminio. El paso de lavado se efectúa en general
pasando el material poroso a través de un depósito de inmersión que
contiene la solución de iones metal, y secando después el material
poroso en una caja de aire.
Dicho dispositivo de ensayo de flujo tangencial
se puede preparar disponiendo uno o varios reactivos de prueba
sobre dicho material poroso y aplicándole dicho polímero dopante
como se ha descrito anteriormente.
En su aspecto más amplio la invención proporciona
el uso de un polímero impermeable a un líquido, para controlar el
flujo del líquido a través de un material poroso que es capaz de
transportar cromatográficamente el líquido.
Los Ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Ejemplos 1-5
Se pasaron trozos de 80 mm de papel
cromatográfico no modificado (Whatman 31 ET o 3MM) compuesto de
fibras de celulosa pura con un tamaño de poro de matriz medio de
4-6 \mum a través de un depósito de inmersión que
contiene una solución acuosa de 200mM cloruro cálcico. Después se
secaron en un depósito de aire y cortaron a una dimensión final de
8 x 80 mm.
Los poros en parte de las tiras así obtenidas se
bloquearon mediante la incorporación del polímero acrílico Primal
B-60A aplicado a temperatura ambiente (RT). Se
formó un canal en la tira fijando plantillas de policarbonato a
ambos lados del papel y aplicando el polímero. El polímero se dejó
secar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas.
Después se calentó carrageenina Tipo I (1,5%
pv^{-1}) en agua destilada a 80ºC hasta que estuvo completamente
en suspensión. Una vez en suspensión el polímero se enfrió y
mantuvo a 45ºC.
El polímero se aplicó al papel de tal forma que
se lograse polimerización superficial con mínima permeación de gel
de la matriz de celulosa. Para lograrlo se utilizaron varios
agentes aceleradores de gel como se expone en la Tabla 1.
Las tiras de prueba se sumergieron inicialmente
en una solución acuosa del agente acelerador de gel seguido de una
inmersión inmediata en la suspensión de carrageenina caliente. Este
proceso se repitió tres veces para acumular un recubrimiento
superficial continuo, terminando con una inmersión final en la
solución aceleradora de gel. Las tiras recubiertas se dejaron secar
durante la noche a temperatura ambiente o 37ºC.
Después se aplicó otra capa de recubrimiento a
los papeles recubiertos así obtenidos usando varias mezclas de
polímeros y copolímeros como se expone en la Tabla 1.
Los papeles recubiertos se sumergieron dos veces
en el polímero de recubrimiento adicional y dejaron secar a
temperatura ambiente durante 2 horas.
| Ejemplo | Agente acelerador de gel | Polímero de recubrimiento adicional |
| 1 | 200mM Cloruro cálcico | Mezcla de Primal B-60A (100% p/v) y Orotan |
| 165* (21% p/v) | ||
| 2 | polietilenimina (2% p/v) | como antes |
| 3 | Celluclast (5,0% p/v) | como antes |
| 4 | Kymene SLX (1,0% p/v) | como antes |
| 5 | bromuro de hexadeciltrimetril amonio | como antes |
| * Orotan 165 es una sal amónica de ácido polimetacrílico |
Ejemplos 6 a 10
Se repitió el proceso de los Ejemplos 1 a 5, a
excepción de que se utilizó carrageenina Tipo II como el polímero
dopante en lugar de Primal B-60A.
Se calentó carrageenina Tipo II (1% p/v) en agua
destilada a 90ºC con agitación constante hasta que todo el polímero
estaba en suspensión. Una vez en suspensión, el polímero se mantuvo
a 70ºC, y aplicó a ambos lados del papel, al que se había unido una
plantilla de policarbonato. Después se dejó secar el papel durante
aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente.
Las tiras se recubrieron con carrageenina Tipo I
y otra capa de recubrimiento como se expone en los Ejemplos 1 a 5.
Las soluciones aceleradoras de gel y otros polímeros de
recubrimiento usados se exponen en la Tabla 2.
| Ejemplo | Agente acelerador de gel | Polímero de recubrimiento adicional |
| 6 | 200mM Cloruro cálcico | Mezcla de Primal B-60A (100% p/v) y Orotan |
| 165* (21% p/v) | ||
| 7 | polietilenimina (2% p/v) | como antes |
| 8 | Celluclast (5,0% p/v) | como antes |
| 9 | Kymene SLX (1,0% p/v) | como antes |
| 10 | bromuro de hexadeciltrimetril amonio | como antes |
| * Orotan 165 es una sal amónica de ácido polimetacrílico |
Se aplicó Polyvin Gloss a hojas de papel
cromatográfico no modificado (200 x 280 mm) (Whatman 31 ET, 3MM o
Schleicher & Schuell 2/2, 3324, 2668) usando técnicas de
impresión serigráfica convencionales. El polímero se aplicó como
una plantilla de serigrafía a ambos lados del papel. La impresión
definió formatos de flujo lateral individuales teniendo cada uno un
canal de papel no dopado. Las dimensiones de los formatos de flujo
lateral eran 15 x 85 mm. Después de la aplicación del polímero
dopante, las hojas se cortaron en los formatos de flujo lateral
individuales.
Utilizando una pipeta Gilson, se aplicó 5 \mul
de solución tampón bloqueante al formato de flujo lateral en una
franja continua a lo ancho del canal 15 mm desde el extremo
inferior de la tira. Esta franja se definió como el
"origen".
La tira se secó después en un horno (60ºC)
durante 5 minutos y después se dejó a temperatura ambiente durante
30 minutos.
Se aplicaron anticuerpos marcados con oro
específicos para gonadotropina coriónica humana como una franja
continua a lo ancho del canal en el origen.
Después se aplicó anticuerpo no marcado
específico para el anticuerpo marcado con oro como una franja
continua a lo ancho del canal 28 mm desde el extremo inferior de la
tira. Esto se definió como la "zona de detección". La tira se
dejó después secar al aire a temperatura ambiente durante una hora
al menos.
Las tiras de flujo lateral individuales sobre las
que se habían aplicado reactivos de prueba, se sumergieron en una
solución caliente (38 \pm 1ºC) de polímero de recubrimiento (b)
(1,5% pv^{-1} agarosa) dos veces, hasta una profundidad de 65 mm
de la parte superior de la tira, dejando el origen sin recubrir.
Después se secaron durante la noche a temperatura ambiente.
Las tiras recubiertas primarias se sumergieron
dos veces en una mezcla de 90:10 Primal B-60A;
Orotan 165 (el polímero (c) hasta una profundidad de 65 mm de la
parte superior de la tira, dejando el origen sin recubrir. Después
se dejaron secar al aire durante la noche a temperatura
ambiente.
Las pruebas se desarrollaron extendiendo las
tiras en una muestra de solución tampón de orina sintética a la que
se añadió gonadotropina coriónica humana a varias concentraciones.
Una franja rosa clara en la zona de detección mostró que la tira se
había desarrollado con éxito y que se había detectado el analito
(gonadotropina coriónica humana).
Se repitió el proceso del Ejemplo 11 a excepción
de que, después de la aplicación de los reactivos de prueba, se
aplicó un polímero de recubrimiento de Primal B60 usando una
recubridora manual K (RK Print-Coat Instruments
Ltd). Las tiras se secaron después al aire a temperatura ambiente
durante 30 minutos.
Barriercoat DC1708, una emulsión polimérica de
acrilato de estireno modificado (Dussek Campbell) se recubrió por
rodillo de forma similar sobre las tiras recubiertas, hasta una
profundidad de 65 mm de la parte superior de la tira, dejando el
origen sin recubrir. Las tiras se secaron después al aire a
temperatura ambiente durante 30 minutos.
El procedimiento siguiente describe la producción
de un dispositivo de flujo tangencial de ensayo para la detección de
glucosa.
El principio que subyace a la detección de
glucosa por esta reacción es el siguiente:
Glucosa + O_{2} + H_{2}O
\xrightarrow{\textstyle{Glucosa \ oxidasa}} Gluconato +
H_{2}O_{2}
H_{2}O_{2} + fenol +
4-aminoantipireno \xrightarrow{\textstyle
peroxidasa} cromógeno
rosa/rojo
Los reactivos de ensayo de glucosa se prepararon
como sigue:
Se pesó 1,2 \pm 0,1 g fenol en una botella con
tapón roscado de 100 ml y se añadió 100 \pm 1 ml de 0,1 M
solución tampón fosfato pH 7,0. La mezcla se agitó bien hasta que
se disolvió completamente. La botella se envolvió en lámina de
aluminio para que no llegase luz a la solución.
Se pesó 0,4 \pm 0,1 g de
4-aminoantipireno en una botella con tapón roscado
de 100 ml y se añadió 100 \pm 1 ml de 0,1 M solución tampón
fosfato pH 7,0. La mezcla se agitó bien hasta que se disolvió
completamente. La botella se envolvió en lámina de aluminio para
que no llegase luz a la solución.
Se preparó una muestra de solución de peroxidasa
conteniendo 800 IU/ml tomando una muestra de peroxidasa con una
actividad de X IU/mg, pesando 800/X \pm 0,1 mg en un tubo
Eppendorf de 1,5 ml y añadiendo 1,0 \pm 0,1 ml 0,1 M solución
tampón fosfato, pH 7,0. Este reactivo se debe preparar fresco cada
vez.
Se preparó una solución de glucosa oxidasa
conteniendo 250 IU/ml tomando una muestra de glucosa oxidasa con una
actividad de X IU/mg e Y mg/ml, pipetando 250/XY \pm 0,01 ml a un
tubo Eppendorf de 1,5 ml y añadiendo 1 \pm 0,1 ml 0,1 M solución
tampón fosfato, pH 7,0. Este reactivo se debe preparar fresco cada
vez.
Se pesó 20 \pm 1 mg de carboxi metil celulosa
(CMC) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se añadieron los reactivos
siguientes:
200 \pm 1 \mul reactivo fenol
200 \pm 1 \mul
4-aminoantipireno
200 \pm 1 \mul reactivo de peroxidasa
200 \pm 1 \mul reactivo de glucosa
oxidasa
200 \pm 1 \mul 0,1 M solución tampón fosfato,
pH 7,0.
Los reactivos se mezclaron bien y mantuvieron en
hielo lo necesario.
Se serigrafiaron hojas de papel cromatográfico no
modificado (200 x 280 mm; papeles Whatmans 31 ET, 3MM o SS) con
Polyvin Gloss, usando técnicas de impresión serigráfica
convencionales, aplicándose como una plantilla de serigrafía que
define formatos de flujo tangencial a ambos lados del papel. La
impresión define cavidades de prueba de flujo tangencial
individuales.
La hoja impresa era de formato similar a una
placa de microvaloración.
Después de la aplicación del polímero dopante,
las hojas se cortaron en formatos de flujo tangencial individuales
con 5 cavidades por tira (10 x 85 mm). Cada cavidad podría contener
alrededor de 5 \mul de muestra líquida.
Se añadió reactivo de ensayo de glucosa (10 \pm
1 \mul) como se definió anteriormente a cada una de las cavidades
impresas sobre la tira de prueba y dejó secar al aire a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
Las tiras se almacenaron en lámina de aluminio
para evitar la luz a temperatura ambiente.
Se preparó una tira estándar de calibración al
mismo tiempo que las tiras de muestra de manera que se pudiese
hacer una comparación en tiempo real cuando se desarrollaron las
tiras de muestra.
Los estándares de calibración de glucosa (10
\pm 1 \mul) se prepararon pesando 1,802 \pm 0,002 g
D-glucosa en un matraz volumétrico de 100 ml y
añadiendo 80 ml agua destilada con agitación hasta que la glucosa se
había disuelto completamente. La solución se aumentó después a 100
ml con agua destilada. Esto proporcionó una solución madre de 100
mM D-glucosa, que se utilizó para hacer estándares
de 2-10 mM por dilución en serie. Los estándares se
almacenaron a -20ºC hasta que se usaron.
Después se cargó 10 \mul \pm 1 de estándar de
calibración en las cavidades cargadas con reactivos. Después de 1
minuto a temperatura ambiente, se desarrolló coloración dentro de
las cavidades (rosa a roja). La intensidad de color se refiere a la
concentración de glucosa en el estándar.
La escala de colores producida usando la tira de
calibración se utilizó para comparar el color producido por la
muestra, para dar una indicación de la concentración de glucosa en
la muestra.
Se cargó 10 \pm 1 \mul de muestra en cada una
de las cavidades cargadas con reactivo. Después de 1 minuto a
temperatura ambiente, se desarrolló coloración dentro de las
cavidades (rosa a roja).
El desarrollo de color de esta tira se comparó
con la tira estándar de calibración descrita para dar una
indicación de la concentración de glucosa de cada muestra.
Se repitió el proceso del Ejemplo 12, a excepción
de que se utilizó reactivos de ensayo de nitrito en lugar de
reactivos de ensayo de glucosa. Los reactivos de ensayo de nitrito
se prepararon como sigue:
Se pesaron 40 \pm 0,5 mg sulfanilamida y 2,0
\pm 0,1 mg
N-1-naftiletilendiamina
dihidrocloruro en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Se añadió 1 \pm
0,1 ml de ácido o-fosfórico (10%/O vv^{-1}) y la
mezcla se agitó hasta que se disolvió.
Se pesó 48,2 \pm 0,1 mg de nitrito en una
probeta de 500 ml y se añadió 400 ml agua desionizada. La mezcla se
agitó hasta que se disolvió. El contenido de la probeta se
transfirió después con lavados usando agua desionizada a un matraz
volumétrico de 1 l. La solución se aumentó a 1 L con agua
desionizada y mezcló bien. Por lo tanto, se obtuvo una solución
madre de 10 mgl^{-1} (10 ppm) nitrito (NO^{2-}) que se utilizó
para preparar soluciones estándar de 1 a 8 ppm nitrito. Los
estándares se almacenaron a -20ºC hasta que se usaron.
La utilización de papel Whatman 31 ET como
material poroso en dicho dispositivo de ensayo de flujo lateral dio
lugar a transporte cromatográfico del cromóforo utilizado en la
prueba de nitrito durante el transcurso de la prueba. Esto tuvo el
efecto de separar el color en el papel en vez de producir un cambio
definitivo de color en la región de prueba del dispositivo. Por lo
tanto, se utilizó material poroso cargado para fijar la molécula de
color.
Así, se utilizó papel de intercambio iónico
Whatman P81, conteniendo la celulosa de intercambio iónico
modificada, fosfato de celulosa, como el soporte poroso en lugar de
31 ET y el polímero enmascarante se aplicó como en el Ejemplo 11. Se
aplicaron reactivos de nitrito de prueba preparados como en el
Ejemplo 14 a una zona de detección del dispositivo. El cromóforo de
prueba de nitrito, una especie de carga positiva, se fijó en
posición por la carga negativa del fosfato de celulosa. Después,
cuando se realizó la prueba, los otros reactivos se movieron con la
muestra conteniendo el nitrito y reaccionaron con el cromóforo
fijado dando lugar a una banda pronunciada de color que podría estar
relacionada con la concentración de nitrito en la muestra.
Claims (17)
1. Un dispositivo de ensayo incluyendo:
- (a)
- un sustrato incluyendo:
- (i)
- un material poroso capaz de transportar cromatográficamente un líquido; y
- (ii)
- uno o varios reactivos de prueba para un ensayo dispuestos sobre el material poroso; y
- (b)
- un polímero de recubrimiento transparente impermeable al agua unido al sustrato por penetración parcial del polímero de recubrimiento al material poroso para definir un compartimiento bíbulo secante.
2. Un dispositivo según la reivindicación 1,
donde el material poroso es papel.
3. Un dispositivo según la reivindicación 1 ó 2,
donde un polímero dopante impermeable al líquido que el material
poroso es capaz de transportar, se incorpora en una parte del
material poroso para definir un canal en el material poroso,
disponiéndose el o cada reactivo de análisis sobre el material
poroso en el canal allí definido.
4. Un dispositivo según la reivindicación 3,
donde el polímero dopante es un polímero acrílico, un polímero
acrílico de vinilo o un heteropolisacárido.
5. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el polímero de recubrimiento (b)
es un heteropolisacárido, un polímero acrílico o un copolímero
acrílico.
6. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, incluyendo además (c) una capa
brillante transparente dispuesta sobre (b).
7. Un dispositivo según la reivindicación 6,
donde la capa brillante (c) incluye uno o más compuestos
seleccionados a partir de polímeros acrílicos, copolímeros
acrílicos, ácidos poliurónicos, heteropolisacáridos, y alcoholes
poliméricos que tienen un peso molecular de 9000 a 146000.
8. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los reactivos de prueba incluyen
al menos un reactivo de detección que es capaz de reaccionar con un
analito predeterminado para proporcionar un efecto detectable.
9. Un dispositivo según la reivindicación 8, que
es adecuado para realizar inmunoensayos y en el que el reactivo de
detección es un antígeno de significado para el diagnóstico o un
anticuerpo para el mismo.
10. Un dispositivo según la reivindicación 9, en
el que los reactivos de prueba incluyen:
(a) un analito marcado o análogo de analito o un
reactivo de unión específica marcado para un analito, pudiendo
moverse libremente el reactivo de unión específica marcado o
analito marcado o análogo de analito cuando se aplica al material
poroso una muestra líquida en la que se sospecha la presencia del
analito; y
(b) un reactivo de unión específica no marcado
para el mismo analito inmovilizado en el material poroso en una
zona de detección, siendo la colocación relativa del reactivo
marcado (a) y la zona de detección tal que cuando la muestra
líquida se aplica al compartimiento bíbulo, el reactivo marcado (a)
se filtra a la zona de detección.
11. Un dispositivo según la reivindicación 10, en
el que el reactivo (a) está dispuesto sobre una parte del material
poroso que no está recubierta con el polímero (b), de tal forma que
sea transportado cromatográficamente al compartimiento bíbulo
cuando se aplica una muestra líquida al dispositivo de ensayo.
12. Un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores adecuado para ser utilizado en un
ensayo cuantitativo o semicuantitativo o para uso en un ensayo de
una muestra líquida para una pluralidad de analitos predeterminados,
en el que el compartimiento bíbulo incluye un cuerpo central y una
pluralidad de canales conectados al mismo.
13. Un método de analizar en una muestra líquida
la presencia o ausencia de un analito predeterminado, método que
incluye:
(a) poner la muestra líquida en contacto con el
compartimiento bíbulo de un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores;
(b) dejar que el material poroso transporte
cromatográficamente la muestra líquida; y
(c) determinar la presencia del analito
predeterminado en la muestra líquida.
14. Un kit de prueba conteniendo un dispositivo
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Un proceso para preparar un dispositivo según
la reivindicación 1, proceso que incluye:
(a) proporcionar un material poroso capaz de
transportar cromatográficamente un líquido;
(b) disponer uno o varios reactivos de prueba
para un ensayo sobre el material poroso; y
(c) unir un polímero de recubrimiento
transparente impermeable al agua al material así obtenido poniendo
el material en contacto con una solución o suspensión del polímero
de recubrimiento.
16. Un proceso según la reivindicación 15
incluyendo además el paso adicional, entre los pasos (a) y (b), de
aplicar a parte del material poroso un polímero dopante impermeable
al líquido que el material poroso es capaz de transportar, para
definir un canal en el material poroso, disponiéndose el o cada
reactivo de análisis sobre el soporte poroso en el paso (b) en el
canal allí definido.
17. Un proceso según las reivindicaciones 15 ó
16, incluyendo además:
(d) contactar el dispositivo así obtenido con uno
o varios compuestos seleccionados a partir de polímeros acrílicos,
gelificar polisacáridos y polivinil alcoholes para formar una capa
brillante transparente sobre el dispositivo.
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