ES2218535T3 - Metodo para el enriquecimiento de celulas modificadas mediante. - Google Patents

Abstract

LA TRANSFERENCIA BALISTICA, ES DECIR LA INTRODUCCION DE SUSTANCIAS BIOLOGICAS EN CELULAS POR MEDIO DE INYECCION A TRAVES DE LAS CELULAS DE FORMA ACELERADA Y CON UN MICROPROYECTIL DE INTRODUCCION TIENE EXITO SOLAMENTE EN UNA PARTE DE LAS CELULAS OBJETIVO. LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO, DONDE LAS CELULAS ENCONTRADAS SE SEPARAN DE LAS CELULAS NO ENCONTRADAS, DE FORMA QUE SE APLICA UNA SUSTANCIA DE INTRODUCCION CON PARTICULAS MAGNETICAS EN LAS CELULAS Y LAS CELULAS ELABORADAS CON RESPALDO MAGNETICO SE SEPARAN DESPUES DE LA TRANSFERENCIA BALISTICA POR MEDIO DE MANTENIMIENTO EN UN CAMPO MAGNETICO A PARTIR DE LAS CELULAS NO ENCONTRADAS. SE OBTIENEN ENRIQUECIMIENTOS DE HASTA POR ENCIMA DEL 90 % EN CELULAS ENCONTRADAS.

Description

Método para el enriquecimiento de células modificadas mediante transferencia balística.

Exposición del problema

Muchas cuestiones y aplicaciones de los métodos modernos de biología molecular requieren la introducción de material en las células. Especial significado tiene, sobre todo, la introducción de constructos de ácidos nucleicos que pueden cambiar el genoma de las células o modificar su expresión. Los procedimientos disponibles actualmente consisten, entre otros, en el transporte realizado por virus ó liposomas, la permeabilización de las células, por ejemplo mediante electroporación y posterior difusión de la sustancia contenida en el medio al interior de la célula, o por transporte mecánico directo de la sustancia. En Methods in Enzymology, Tomo 217 (Academic Press, San Diego, CA, 1993), págs. 461-655 se ofrece una descripción detallada del estado actual de la técnica.

En el método de transporte mecánico directo a la célula se puede inyectar en la misma una disolución que contenga la sustancia a transportar (DE PS 3718066), o trasladar hacia la célula dicha sustancia en forma sólida adsorbida en un soporte o en disolución, de tal manera que perfore la membrana y se interne en la célula (la denominada "transferencia balística"), y sin que la célula perezca debido a la introducción de este microproyectil (J. Immunol. Methods 165, 1993, págs. 149-156).

Excluyendo la microinyección, estos procedimientos poseen una eficacia de transporte a la célula muy reducida. En el caso de microinyección, la eficacia, expresada como porción de células tratadas con éxito respecto al número total de células tratadas, es bastante elevada, sin embargo el método requiere mucho tiempo y es muy laborioso, por lo que la cantidad de células que pueden ser manipuladas es muy reducida.

En principio, la transferencia balística hace posible el transporte de sustancias a las células de forma sencilla. Hasta ahora el método ha sido utilizado sobre todo en células vegetales (veáse Current Opinion in Biotechnology, Tomo 4, págs. 135-141, 1993), ya que muchas veces no estaban disponibles otras alternativas más adecuadas, si bien también fue empleado con éxito en células de mamíferos (Fitzpatrick-McElligott, Biotechnology (New York), Tomo 10, págs. 1036-1040 (1992); WO 9107487) y en procariotas (Smith y col., Journal of General Microbiology, Tomo 138, pág.138 y siguientes). En un solo paso es posible tratar desde varios miles hasta millones de células. Para ello, la sustancia a transportar se adsorbe sobre los microproyectiles y estos se aceleran hacia las células diana mediante detonación de una carga explosiva (EP 0 331 885; EP 0 397 413), bien mediante una onda de choque de gas provocada por una diferencia de presiones (WO 91/18991), o bien mediante una onda de presión provocada por una descarga eléctrica (WO 91/00359). Igualmente, se conoce un método que permite la inyección mediante chorro de aerosol (WO 91/00915). Véanse también al respecto: EP 0397413, GB 9018892.1; US 5066587; WO 91/02071; WO 91/11526.

En la transferencia balística sólo una parte de las células diana serán alcanzadas. Si compactamos los paquetes de microproyectiles a acelerar de tal manera que prácticamente todas las células diana sean alcanzadas, habrá que contar con una tasa de pérdida muy grande, ya que un elevado número de aciertos sobre una misma célula conducirá a su muerte. El compromiso entre elevada tasa de acierto y cuota de supervivencia alta provocará siempre que una parte de las células diana permanezca sin tratar.

Sin embargo, en la mayoría de los casos sólo se desea aislar aquellas células tratadas con éxito. Si la sustancia introducida es, por ejemplo, un ácido nucleico que altera temporal ó permanentemente el genoma de la célula o que interfiere en su expresión, entonces siguiendo los métodos tradicionales las células alteradas deberán separarse de las no alteradas mediante cultivo o selección celular, lo que en muchas aplicaciones limita la utilidad de estos métodos. Para el tratamiento ex vivo de células tumorales es indispensable reintroducir de nuevo en el paciente sólo las células manipuladas con éxito.

Sería una gran ventaja para la aplicación de la transferencia balística en biotecnología y medicina encontrar un método que permita una buena y rápida separación de las células acertadas de las no que no lo han sido.

Desde hace algún tiempo existen métodos de trabajo bioquímicos conocidos que permiten la separación de grupos concretos de mezclas celulares o de partículas, esto se consigue enlazando el componente a separar con partículas ferromagnéticas presentes en la mezcla, mediante interacciones específicas o inespecíficas. Mediante la aplicación de un campo magnético, aquellas partículas magnéticas que estén enlazadas con los componentes a separar quedarán retenidas en dicho campo magnético, mientras que el resto de la mezcla puede ser retirado. Tras el cese del campo magnético, y si es el caso una vez separadas las partículas magnéticas, la sustancia a separar podrá manipularse posteriormente. La unión entre las células y las partículas magnéticas se puede conseguir mediante el enlace covalente de las moléculas biológicas a las partículas magnéticas, para éstas, a su vez, formar enlaces fuertes específicos con las moléculas de la superficie celular. De esta manera por ejemplo se pueden aislar varias líneas de leucocitos según sus diferentes variantes con marcadores superficiales CD.

Los sistemas empleados para la separación se diferencian principalmente en el tamaño de las partículas utilizadas y en la intensidad del campo magnético aplicado. Las partículas ferromagnéticas más grandes (>0,5 \mum) son atraídas y retenidas desde varios milímetros de distancia por un campo magnético relativamente débil creado por unos sencillos imanes permanentes. Sin embargo, estos tamaños de partícula presentan la desventaja asociada de que las partículas, una vez desaparecido el campo magnético, conservan una cierta magnetización residual ya que son mayores que las zonas de Weiss, responsables del comportamiento ferromagnético de las partículas y que, orientadas en el mismo sentido que las zonas de Weiss en ellas contenidas, hacen que se comporten como pequeños imanes permanentes. Debido a las fuerzas de atracción mutua originadas, las partículas tienden a agregarse y se sedimentan más rápidamente.

Si se reduce el tamaño de las partículas por debajo de un valor límite, éstas se comportan como "superferromagnéticas", es decir, al desaparecer el campo magnético no conservan ninguna magnetización residual. Al no existir magnetización residual y debido a su reducido tamaño, las partículas permanecen en forma de solución coloidal en vez de sedimentarse, resultando más apropiadas para los métodos de separación biotecnológicos. Sin embargo, el campo magnético que retiene a las partículas debe ser mayor para poder separar las partículas de la mezcla. Este problema puede solucionarse haciendo que la mezcla atraviese un "campo magnético de alto gradiente" (WO 90/07380; DE 3720 844).

Otro problema lo constituye el material ferromagnético de las partículas, ya que éste libera iones hierro que perturban muchos sistemas bioquímicos. Se ha intentado resolver este problema rodeando las partículas con una capa de polímero (WO 90/07380; DE 3720844).

Solución técnica de la presente invención

Según la presente invención, la separación de las células alcanzadas en la transferencia balística, en las que la sustancia a introducir se ha transportado con éxito, se consigue introduciendo junto con dicha sustancia unas partículas ferromagnéticas o superferromagnéticas. Inmediatamente después de bombardear las células con los microproyectiles transportadores de la sustancia y de las partículas magnéticas, se les someterá a un campo magnético momentáneo que retiene aquellas células alcanzadas que contienen las partículas magnéticas. Una vez eliminadas células no retenidas por el campo mediante lavado, se cesará el campo magnético y las células serán sometidas a posteriores tratamientos según cada proceso.

El método descrito permite la separación rápida y efectiva de las células alcanzadas. Los estudios realizados con líneas de cultivo celulares de mamíferos han demostrado que las células sobreviven varios días a este tratamiento. Los estudios en los que se introdujeron en las células oligómeros de ADN marcados por fluorescencia han demostrado que, de las células retenidas supervivientes, más del 90% habían sido alcanzadas, lo que supone un considerable avance, ya que en los estudios llevados a cabo sin aporte magnético, sólo un máximo del 40% de células supervivientes poseían los marcadores fluorescentes significativos del transporte realizado.

En caso necesario, las propias partículas magnéticas podrían utilizarse como proyectiles.

Según el procedimiento de la presente invención, los microproyectiles utilizados poseen un diámetro medio de 1 a 3 micrómetros. Si los microproyectiles son de hecho las propias partículas magnéticas, éstas podrán recubrirse con una capa de polímero biológicamente compatible. De esta forma se evitarán, por ejemplo, los efectos tóxicos de la liberación de iones metálicos en las células que se produce para mantener el equilibrio específico entre las cargas positivas y negativas intracelulares. Si las partículas magnéticas se recubren de polímero, se podrán emplear también partículas superferromagnéticas, ya que estas tienen un diámetro de 30 a 100 nm.

La aceleración de los microproyectiles que se emplean en el método de la presente invención, se puede llevar a cabo mediante descarga explosiva de gas a presión, principalmente helio a presión.

El procedimiento de la presente invención se puede utilizar también en células eucariotas e igualmente en células de mamíferos, las cuales podrían ser de origen humano. Incluso sería posible que se tratara de células humanas del sistema inmunológico o tumorales extraídas del organismo. También se puede aplicar el procedimiento de la presente invención a células vegetales.

El procedimiento descrito posee especial importancia para el tratamiento de enfermedades fundamentadas en la biología molecular en concreto. El tratamiento de los enfermos de cáncer sigue atrayendo hoy en día el máximo interés. Este tratamiento se basa en la inducción de una respuesta inmune a través de moléculas señal del sistema inmunológico dirigida contra las células tumorales. Las células tumorales se transforman de tal manera que expresan las moléculas señal (citoquinas, marcador superficial -MHC), para estimular, debido a su las células transfectadas. Durante el tiempo de incubación, las células no transfectadas aumentan más deprisa que las transfectadas. Cualquier dilución de las células transfectadas con las no transfectadas conduce a una disminución exponencial de la respuesta inmune deseada. Por ello, resulta evidente la necesidad de una separación eficaz.

Además de la separación satisfactoria de las células transfectadas procedentes de cultivos celulares, el método descrito abre las puertas a la posibilidad de transfección de células de tumores sólidos. Muchos tumores epidemiológicamente importantes, como el carcinoma de mama y de colon, no se pueden obtener, o solo escasamente, como cultivo primario ya que están habituados a determinadas condiciones de crecimiento específicas del tejido. Las células extraídas de tumores que crecen en cultivo no poseen casi parecido con las células tumorales nativas. Por ello, la premisa de la terapia génica de que las células transfectadas deben inducir una reacción inmunológiga sobre las células no transfectadas del mismo tipo es irrealizable. Como alternativa aparece la transfección de un corte del tejido tumoral sólido, del cual se separarán magnéticamente las células alcanzadas, una vez destruido el agregado celular.

Ejemplo

30 \mul de una suspensión de partículas de oro (diámetro 1,6 \mum, suministrada por Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU., concentración de la suspensión: 30 mg/ml), se pipetean a una placa polimérica Macrocarrier (Bio-Rad). Se espera hasta que el oro se haya sedimentado y se retira con cuidado el sobrenadante.

Sobre la superficie humedecida se pipetearán 30 \mul de una mezcla 3+1 de una disolución de ADN (concentración: 50 \mug/ml de oligodesoxirribonucleótido marcado con fluoresceína) y una suspensión coloidal de partículas magnéticas (diámetro medio: 65 nm; Miltenyi GmbH, Bergisch-Gladbach; añadida tal como la suministró el proveedor; de concentración desconocida; puede ser ventajoso dializar las partículas magnéticas con agua antes de utilizarlas, para eliminar la azida sódica contenida en el tampón de almacenaje). Se agita el oro que se haya depositado y se deja sedimentar la mezcla. Se elimina el líquido sobrenadante y se dejan secar las partículas de oro.

Se colocarán en el centro de una placa Petri (3,5 cm) 300 \mul de Polilisina, se deja reposar 30 min y se lava con PBS.

Entre 100.000 y 200.000 células (línea celular de eritroleucemia K 562) en 300 \mul de medio-RPMI (10% STF, suero de ternera fetal) se colocan en una placa Petri impregnada de polilisina y se deja reposar durante 10 min. Se recubre con 2 ml de medio-RPMI (10% STF) y se deja incubar entre 1 y 2 horas en la incubadora.

La transferencia balística se realiza en un aparato Biolistic PDS 1000/He (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU. ) siguiendo las instrucciones del fabricante. El disco de ruptura usado responde a una presión teórica de rotura de 1.100 psi. La presión de la célula de vacío es de 508 mm de Hg (20 pulgadas de Hg).

La separación se realizará en una columna de separación MACS (Milteny GmbH, Bergisch-Gladbach) siguiendo el protocolo del fabricante. Se trabajará todo el tiempo a una temperatura constante de 4ºC.

Las células ya tratadas se recogerán sobre 1 ml de medio PBS/BSA (5 mM EDTA) enfriado con hielo y se inyectarán en la columna, mientras que ésta se encuentra sometida a un campo magnético. Se lava con 3 volúmenes de columna de medio PBS/BSA (5mM EDTA) para un caudal de 0,3 ml/min (aguja de salida: tipo 25 G). Todo el medio que sale se reúne formando la fracción N (fracción no magnética).

A continuación, se deja de aplicar el campo magnético sobre la columna y se eluye desde abajo con 1 volumen de columna del medio PBS/BSA (5mM EDTA) para agitar las células agregadas.

Tras aplicar de nuevo sobre la columna un campo magnético, se deja el líquido salir de la misma y se lava con 4 a 5 volúmenes de columna del medio PBS/BSA (5mM EDTA) con un caudal de 0,6 ml/min (aguja de salida de tipo 24 G).

A continuación se vuelve a cesar el campo magnético. Las células retenidas por dicho campo se lavan con 1 ml de medio PBS/BSA (5mM EDTA) y se van extrayendo en pequeños pulsos. Esta fracción se denomina fracción M (fracción magnética).

Posteriormente las fracciones obtenidas serán analizadas por fluorescencia para evaluar las células contenidas en las mismas mediante un citómetro de flujo (FACS).

La actividad fluorescente fue medida en un citómetro de flujo Becton-Dickinson. Se midieron las células disparadas sin tratamiento magnético, la fracción N no magnética y también la fracción magnética M. Los citogramas del anexo muestran los resultados de las medidas:

El gráfico U representa las células no enriquecidas después de la transferencia balística (no clasificadas). En el eje de abcisas se representa la actividad fluorescente de las células en unidades logarítmicas relativas y en el eje de ordenadas el número de células.

En la tabla presentada como dibujo, aparece el número total de sucesos de fluorescencia contabilizados, los asignados a las células acertadas, los de la parte de población de fuerte fluorescencia y de muy baja fluorescencia, y también los de las subpoblaciones de células no alcanzadas representados en número de sucesos, así como sus correspondientes cuotas relativas respecto al total.

Lo mismo se aplica a la fracción N (no magnéticas retenidas) y M (magnéticas retenidas). En la fracción magnética retenida se obtiene de forma clara la máxima riqueza en células alcanzadas, frente a las células no clasificadas.

Ejemplo 2 Transfección de un cultivo primario de células de melanoma

Las células de melanoma se cultivan en matraces de cultivo de 800 ml. El medio se aspira y las células adheridas se lavan con PBS enfriado con hielo. Se añaden 2,5 ml de tripsina-EDTA (0,5 g de tripsina /l; 0,2 g de EDTA/l; 0,85 g
de NaCl/l) y las células se incuban a 37ºC durante 2 a 5 min. Para evitar la lisis celular, se observa el proceso y se interrumpe si es necesario. La tripsinación se para añadiendo 25 ml de PBS enfriado con hielo. Las células se trasladan a un tubo de centrifugación de 50 ml, el matraz de cultivo se enjuaga con 5 ml de PBS enfriado con hielo y el líquido se añade al tubo de la centrifugadora. Las células se centrifugan a 400g durante 7 min. El sobrenadante se elimina y las células se resuspenden en medio RPMI enfriado con hielo.

Las células se cuentan y se ajustan a 5 x 10^{6} - 1 x 10^{7} células por cada 10 ml. Cada grupo de 5 x 10^{6} - 1 x 10^{7} células se coloca en placas Petri de 9,8 cm para su cultivo y serán incubadas toda la noche en condiciones estándar (37ºC, 5% CO_{2}, 90% de humedad del aire).

Después de eliminar el medio quedan adheridas a la placa Petri aproximadamente 8 x 10^{6} - 1 x 10^{7} células. Las células se lavan con PBS enfriado con hielo y todo el sobrenadante se elimina con cuidado. Este paso es muy importante ya que los restos de película líquida sobre las células reducen drásticamente la eficacia del siguiente paso de transfección.

La transferencia balística se realiza en un Biolistic PDS 1000/He (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante del aparato. El disco de ruptura empleado equivale a una presión teórica de ruptura de 1.550 psi. La presión de la célula de vacío es de 508 mm de Hg (20 pulgadas de Hg).

Una variación importante introducida en el equipo utilizado es el empleo de un cabezal modificado, que permite la transfección simultánea de una cantidad de células mucho mayor. La onda de gas a presión se reparte entre siete soportes de macroproyectiles de tal manera que se forman siete ráfagas de proyectiles. La descripción exacta del equipo se encuentra en nuestra solicitud de patente "Dispositivo para el reparto de presión en el cabezal de un equipo para transferencia balística de células" de fecha 14.03.95 de la DPA (n.º de solicitud 195 10 696.2).

Se pipetean alícuotas de 30 \mul de una suspensión de partículas de oro (1,6 \mum de diámetro medio, suministrada por Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU., concentración de la suspensión: 30mg/ml) a siete placas de polímero Macrocarrier (Bio-Rad). Se espera hasta que el oro sedimente y se retira el sobrenadante con cuidado.

Sobre las superficies humedecidas se pipetearán 30 \mul de una mezcla 3+1 de una disolución de ADN (plásmido pCMV-IL7 1 mg/ml que soporta la secuencia de la interleucina 7 humana, bajo control de un promotor potente de citomegalovirus) y una suspensión coloidal de partículas magnéticas (diámetro medio: 65 nm; Miltenyi GmbH, Bergisch-Gladbach; añadida tal como la suministra el proveedor; de concentración desconocida; puede ser ventajoso dializar las partículas magnéticas con agua antes de utilizarlas para eliminar la azida sódica contenida en el tampón de almacenaje). Se agita el oro que se haya sedimentado y se deja reposar la mezcla para que sedimente. Se elimina el líquido sobrenadante y se dejan secar las partículas de oro.

Después de la transferencia balística (1.550 psi, cámara bajo presión 508 mm Hg), las células se recubren inmediatamente con 3 ml de PBS enfriado con hielo y se colocan durante 5 min sobre hielo para poder desprenderlas fácilmente de la placa Petri. Se lavan las células de placa con varios enjuagues y la suspensión obtenida se pasa por un tamiz celular (70 \mum, Costar GmbH, Bodenheim, Alemania). La separación magnética se realiza como se ha expuesto anteriormente.

Ejemplo 3 Transfección de un tumor sólido

El tejido tumoral es extraído quirúrgicamente y enfriado en hielo. Las partes de tejido necrosadas y los tejidos conjuntivos se eliminan todo lo posible. Se cortan secciones de aprox. 1 cm^{2}, se lavan con PBS enfriado en hielo y se fijan al portamuestras de un cortador de tejidos (sistema de seccionamiento Vibratome 1000; TPI, St. Louis, Missouri) con un pegamento de tejido. El tumor se corta en láminas de 500 \mum de espesor. Las secciones se guardan en PBS enfriado con hielo y se transfectan lo más rápidamente posible. El proceso es idéntico al descrito en el Ejemplo 2. Se disparará sobre ambas caras de la sección. Después de la transfección, se pasará la sección dos veces por un tamiz celular y las células se separarán como se ha descrito. Ya que la sección posee un grosor equivalente a 10 capas de células pero sólo la capa superior de ambos lados podía ser acertada, el rendimiento neto de células transfectadas es menor que en la transfección de células obtenidas por cultivo.

Resultados de la transfección de tejidos tumorales sólidos Experimento de corte con Vibratom de cuatro tejidos tumorales

Tumor 1	carcinoma de colon primario
Tumor 2	metástasis de hígado (carcinoma de colon)
Tumor 3	metástasis de hígado (carcinoma de colon)
Tumor 4	metástasis de hígado (carcinoma de recto)

N.º tumor	N.º de células	N.º de células	N.º de células no	% recuperado
	después disociación	transfectadas	transfectadas
	("no separadas")	("fracción mag.")	("fracción no mag.")
1	1,1x10^{7} \hskip0,7cm 100%	3,6x10^{5} \hskip0,7cm 3,3%	7,5x10^{6} \hskip0,7cm 68,2%	72
2	2,2x10^{7} \hskip0,7cm 100%	6,9x10^{5} \hskip0,7cm 3,1%	1,3x10^{7} \hskip0,7cm 59,1%	62
3	4,1x10^{7} \hskip0,7cm 100%	6,2x10^{5} \hskip0,7cm 1,5%	1,9x10^{7} \hskip0,7cm 46,3%	48
4	2,0x10^{7} \hskip0,7cm 100%	7,3x10^{5} \hskip0,7cm 3,7%	1,4x10^{7} \hskip0,7cm 70,0%	74

IL-7 ELISA

1

Claims (11)

1. Procedimiento para introducir sustancias en las células por transferencia balística, usando microproyectiles acelerados sobre las mismas. La sustancia a introducir estará adsorbida de forma permanente o transitoria, o unida de otra forma a los microproyectiles. También se pueden formar los microproyectiles con la propia sustancia a introducir ó con una disolución de la misma. Estos proyectiles se introducen en las células sin matarlas. Posteriormente serán separadas las células alcanzadas mediante un campo magnético, procedimiento caracterizando porque las partículas magnéticas se introducen en las células junto con la sustancia requerida mediante transferencia balística. Todas las células son posteriormente sometidas, después de la transferencia balística, a un campo magnético de forma que las células no magnéticas recuperables pueden ser extraídas del campo magnético mediante lavado, y aquellas células retenidas en el campo magnético pueden ser atrapadas después de desaparecer dicho campo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, por el cual los microproyectiles están compuestos por un metal pesado, preferiblemente oro.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, por el cual los microproyectiles tendrán un diámetro medio de 1 a 3 micrómetros.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, por el cual las partículas magnéticas estarán recubiertas de una capa de polímero biológicamente compatible.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, por el cual las partículas magnéticas tienen un tamaño de 30 a 100 nm en diámetro promedio, son superferromagnéticas, y el campo magnético aplicado será de alto gradiente.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, donde los microproyectiles son acelerados hacia las células por una descarga explosiva de gas a presión, preferentemente de helio,

7. Procedimiento según la reivindicación 6, por el que las células son eucariotas, especialmente células de mamíferos.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, por el cual las células son de origen humano.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, por el cual las células extraídas del cuerpo humano proceden del sistema inmunológico o de tumores.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, por el que las células se someten a transfección con unidades de ADN, las cuales contienen secuencias de citoquina, proteínas superficiales, factores de crecimiento, o partes de estas secuencias. También pueden contener secuencias que codifican partes de la ruta de señales de transducción intracelular o secuencias complementarias inversas de las secuencias mencionadas. Estas secuencias pueden ser expresadas por las células transfectadas de forma permanente o temporal.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10, por el cual las células son vegetales.