ES2218527T3 - Agentes intercalantes que presentan una afinidad para el adn y procedimientos de utilizacion asociados. - Google Patents
Agentes intercalantes que presentan una afinidad para el adn y procedimientos de utilizacion asociados.Info
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- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
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Abstract
SE PRESENTAN COMPUESTOS INTERCALADORES QUE ESTAN COMPUESTOS DE UNIDADES INTERCALADORAS, O DE UNIDADES INTERCALADORAS SUSTITUIDAS, QUE TIENEN UNA O MAS CADENAS FUNCIONALIZADAS, O UNIDADES, Y CUYOS COMPUESTOS PRESENTAN UNA ALTA AFINIDAD A ENLAZARSE A LA MOLECULA DE ADN Y MUESTRAN UN AUTOAPAGADO REDUCIDO, AL TIEMPO QUE PROPORCIONAN UNA CINETICA DE TRANSPORTE SUPERIOR. SE HA DESCUBIERTO QUE LOS COMPUESTOS PRESENTAN UNA MAYOR FLUORESCENCIA CUANDO SE ENCUENTRAN UNIDOS A UNA MOLECULA DE ADN DENTRO DE UN ENTORNO DE CITOMETRIA DE FLUJO FLUORESCENTE EN DONDE LA FLUORESCENCIA ES DE OCHO APROXIMADAMENTE A DIEZ VECES MAS BRILLANTE QUE LA DE LOS AGENTES DE INTERCALACION CONVENCIONALES CON UNA ESTRUCTURA "BIS" Y LA DE OTROS AGENTES DE INTERCALACION CONOCIDOS UTILIZADOS EN UN ENTORNO DE CITOMETRIA DE FLUJO.
Description
Agentes intercalantes que presentan una afinidad
para el ADN y procedimientos de utilización asociados.
La invención se refiere a un compuesto
intercalador y al uso de tal compuesto, que se compone un resto
intercalador sustituido, derivatizado con una cadena funcionalizada,
teniendo dicho compuesto alta afinidad para unirse a una molécula de
ADN. Este compuesto intercalador muestra una mejor unión a una
molécula de ADN dentro de las metodologías conocidas que requieren
la inserción de un intercalador en la molécula de ADN. Además, la
invención se refiere a la unión mejorada de moléculas de ADN
mediante un segmento que funciona como intercalador en el marcaje,
captura, inserción terapéutica, ensayos y similares, con un mejor
rendimiento del intercalador debido a la mayor eficacia de
utilización del compuesto.
El término "intercalador" se introdujo en el
campo de la química hace más de 30 años para describir la inserción
de compuestos planos aromáticos o heteroaromáticos entre pares de
bases adyacentes de ADN bicatenario (dsDNA). Muchos compuestos que
se intercalan en el ADN tienen propiedades biológicas interesantes.
Generalmente, se admite que estas propiedades están relacionadas con
su reactividad con el ADN. En la búsqueda de compuestos más activos,
es lógico diseñar moléculas con la mayor afinidad posible al ADN. En
1990, se informó de que los complejos de homodímero de etidio con
dsDNA actuaban con una relación de un dímero por cuatro a cinco
pares de bases y de que eran estables a la electroforesis en geles
de agarosa. Esto permitió la fluorescencia, detección y
cuantificación de fragmentos de ADN con sensibilidad en picogramos
después de la separación y ausencia completa de mancha de fondo. Tal
resultado se ha buscado mediante diversas manipulaciones de
compuestos intercaladores, por ejemplo, mediante compuestos
funcionales formados por tinciones de intercalación de ADN. Como
resultado de estos esfuerzos, en diversos procedimientos analíticos
de ADN se han usado agentes de intercalación de ADN que utilizan
bromuro de etidio.
Se han usado diversos agentes de intercalación de
ADN que utilizan bromuro de etidio en multitud de procedimientos
analíticos de ADN, por ejemplo:
Christen, et al., "An Ethidium
Bromide-Agarose Plate Assay for the Nonradiactive
Detection of CDNA Synthesis", Anal. Biochem., 178 (2), 1
de Mayo de 1989, págs. 269-272 informan de que se
usó bromuro de etidio para determinar el éxito de reacciones de
síntesis de ADNc. Como el bromuro de etidio en agarosa se puede usar
para cuantificar ARN y ADN, se elaboraron condiciones, bajo las
cuales se utiliza la mayor fluorescencia del ADN bicatenario, para
ensayar la síntesis de ADN bicatenario a partir de ARNm. El bromuro
de etidio a 5 microgramos/ml en agarosa permitió la detección
cuantitativa de ADNc en el intervalo de 0,03 a 0,0015 microgramos.
El dodecilsulfato sódico tuvo un efecto adverso en la medición de
ADNc. El análisis de ADNc posterior mediante electroforesis con gel
alcalino y la tinción en 5 microgramos/ml de bromuro de etidio
permitió un dimensionamiento preciso y rápido de ADNc y sólo
requirió 0,01-0,05 microgramos de ADNc.
Petersen, S.E. "Accuracy and Reliability of
Flow Cytometry DNA Analysis Using a Simple, One-Step
Ethidium Bromide Staining Protocol", Cytometry,
7(4), Julio de 1986, págs. 301-306, informa
de que se investigaron fuentes de variación y error para un
análisis citométrico de flujo simple del contenido de ADN de núcleos
aislados con detergente pigmentados con bromuro de etidio.
En "Ethidium Bromide in the Detection of
Antibodies to DNA and of Circulating DNA by
Two-Stage Counterimmunoelectrophoresis", J.
Immunol. Methods, 85(1), 17 de diciembre de 1985, págs.
217-220, Riboldi et al., informan de que en
un intento por superar las limitaciones de la
contrainmunoelectroforesis en la detección de anticuerpos
anti-ADN precipitante o ADN circulante, se usó
bromuro de etidio para aumentar la visibilidad de las líneas de
precipitación así como para confirmar su especificidad.
W.A. Denny informó en
"DNA-Intercalating Ligands as
Anti-Cancer Drugs: Prospects for Future Design",
Anticancer Drug Des., 4(4), Dic. de 1989, págs.
241-263, de que a partir del éxito clínico de la
doxorrubicina se ha desarrollado, en gran medida, un interés por
ligandos de intercalación de ADN como fármacos
anti-cancerosos.
Se han descrito varios agentes para marcar ácidos
nucleicos, como sonda o diana, para facilitar la detección del ácido
nucleico diana. Los marcadores adecuados pueden proporcionar señales
detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría,
difracción o absorción de rayos X, magnetismo o actividad enzimática
e incluyen, por ejemplo, fluoróforos, cromóforos, isótopos
radiactivos, enzimas y ligandos que tienen pares de unión
específicas.
Los tintes fluorescentes son adecuados para
detectar ácidos nucleicos. Por ejemplo, el bromuro de etidio es un
agente de intercalación que muestra un aumento de la fluorescencia
cuando se une al ADN bicatenario en lugar de cuando está en solución
libre. El bromuro de etidio se puede usa para detectar tanto ácidos
nucleicos monocatenarios como bicatenarios, aunque la afinidad del
bromuro de etidio para el ácido nucleico monocatenario es
relativamente baja. El bromuro de etidio se usa de forma rutinaria
para detectar ácidos nucleicos después de la electroforesis en gel.
Después del fraccionamiento por tamaño en una matriz de gel
aproximada, por ejemplo, agarosa o acrilamida, el gel se empapa en
una solución diluida de bromuro de etidio.
También se ha informado del uso de sondas
polinucleotídicas marcadas con fluorescencia y de ensayos de
hibridación de polinucleótidos. De acuerdo con estos métodos, las
sondas se preparan uniendo un resto
absorbedor-emisor particular a los extremos tres
prima y cinco prima de los fragmentos de ácido nucleico. Los
fragmentos pueden hibridarse a posiciones adyacentes de un ADN diana
de forma que si se hibridan ambos fragmentos, la proximidad de los
restos absorbedor y emisor da como resultado una fluorescencia
emisora detectable. De acuerdo con estos métodos, el tinte
fluorescente se introduce en el ADN diana después de que se hayan
completado todas las polimerizaciones in vitro del ácido
nucleico. Los efectos inhibidores de agentes de intercalación en
polimerasas de ácido nucleico se han descrito en varios sitios.
Los tintes de unión a ADN son útiles como
antibióticos debido a los efectos inhibidores de los procesos de
replicación del ácido nucleico que resultan de la unión del agente
al molde. Se ha informado del uso de agentes de intercalación para
bloquear la infectividad del virus de la gripe o del herpes. También
se ha informado y descrito que varios agentes de unión a ADN, tanto
intercaladores como no intercaladores, inhiben la replicación del
ácido nucleico. Por ejemplo, el bromuro de etidio inhibe la
replicación del ácido nucleico.
Se han proporcionado métodos para detectar un
ácido nucleico diana en una muestra. Estos métodos comprenden las
etapas de (a) proporcionar una mezcla de reacción amplificada que
comprende una muestra, un agente de unión a ADN, donde dicho agente
se caracteriza por proporcionar una señal detectable cuando se une
al ácido nucleico bicatenario, puediéndose distinguir dicha señal de
la señal proporcionada por dicho agente cuando no esta unido, y
reactivos para la amplificación; (b) determinar la cantidad de señal
producida por la mezcla de la etapa (a); (c) tratar dicha mezcla en
condiciones para amplificar el ácido nucleico diana; (d) determinar
la cantidad de señal producida por la mezcla de la etapa (c); y (e)
determina si ha tenido lugar la amplificación. Estos agentes de
intercalación de ADN, tales como bromuro de etidio u homodímero de
etidio permiten el estudio fluorométrico de la interacción de
diversas moléculas con ADN.
El agente de intercalación útil para la unión a
ADN o para detectar ácidos nucleicos amplificados es un agente o
resto que puede insertarse entre pares de bases apilados en la doble
hélice del ácido nucleico. Los agentes de intercalación tales como
homodímero de etidio y bromuro de etidio tienen una fluorescencia
más intensa cuando se intercalan en ADN bicatenario que cuando se
unen a ADN, ARN monocatenario o en solución. Existen otros usos de
intercaladores en el campo de la separación y aislamiento o
purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas o
clínicas complejas.
En la técnica se conocen varios métodos para
separar ácidos desoxirribonucleicos (ADN) de muestras biológicas
líquidas, pero consumen mucho tiempo o tienen muchas complicaciones.
Se sabe que el ADN se adhiere a la nitrocelulosa. La muestra líquida
que contiene el ADN se aplica a un filtro de nitrocelulosa y el ADN
se adhiere o se une al filtro.
Otro método para separar el ADN de las muestras
es la ultracentrifugación con gradientes de densidad de sacarosa o
cloruro de cesio. El ADN se separa de las otras macromoléculas tales
como proteínas mediante este método de acuerdo con la densidad
flotante o el coeficiente de sedimentación. La muestra biológica se
coloca en capas en el gradiente de densidad en un tubo de centrífuga
y se centrifuga a velocidades muy altas durante un largo período de
tiempo para que el ADN pase a través del gradiente de densidad. Este
método, aunque satisfactorio, lleva mucho tiempo y trabajo. El
tiempo de centrifugación puede ser de 20 horas o más por muestra.
Además, si la muestra se centrifuga durante demasiado tiempo, el ADN
no sólo se separará de la muestra sino que también pasará
completamente a través del gradiente al fondo del tubo de centrífuga
junto con otros constituyentes en la muestra. Por lo tanto, este
método tampoco es adecuado como método rápido y fácil para separar
ADN de muestras complejas.
La electroforesis en gel de agarosa
poliacrilamida también se usa para separar el ADN de muestras
biológicas. En este método, la muestra se aplica a un extremo del
receptáculo de vidrio o plástico que contiene el gel y se aplica
una corriente eléctrica a lo largo del receptáculo. Las moléculas de
ácido nucleico cargadas negativamente se mueven hacia el ánodo,
moviéndose las moléculas más grandes más lentamente. Las velocidades
de migración de las moléculas dependen de sus pesos moleculares y de
la concentración y grado de reticulación en el material gel.
Después, el ADN se retira del gel eliminando la porción de gel en
donde se encuentra el ADN y extrayendo finalmente el ADN. De nuevo,
este método requiere mucho tiempo y trabajo, y el ADN todavía debe
separarse del gel. Cuando el ADN se separa mediante el método de
electroforesis en gel o por centrifugación, es necesario teñir el
ADN de alguna forma para que se pueda visualizar. Normalmente, se ha
usado bromuro de etidio (EtBr) como agente de tinción. El bromuro de
etidio se adhiere al ADN por intercalación entre los pares de bases
de la estructura de doble hélice del ADN.
Más recientemente, se ha sintetizado un
homodímero de etidio y se ha introducido con intercaladores
bifuncionales para permitir el estudio fluorométrico incluyendo la
interacción de tales moléculas con ADN. Se ha determinado que el
homodímero de etidio ("EthD") se une al ADN bicatenario
("dsDNA") con que es aproximadamente dos (2) órdenes de
magnitud más fuerte que el bromuro de etidio. Los complejos de EthD
con dsDNA han conseguido una relación de dímero por 4 a 5
pares de bases y se ha descubierto que eran estables para la
electroforesis en base de agarosa. En la unión a dsDNA, el campo
cuántico de fluorescencia del dímero aumenta 40 veces
independientemente de la secuencia de nucleótidos.
Se pueden formar complejos estables de
dsDNA-fluoróforo para obtener en cualquier parte de
varios a varios miles de fluoróforos, según se desee. En condiciones
controladas adecuadas estos complejos no transfieren el tinte a
otros ácidos nucleicos o proteínas. Una propiedad importante de
estos complejos es que su intensidad de emisión de fluorescencia es
una función lineal del número de moléculas de tinte intercaladas.
Según se hacen más disponibles aparatos de detección de
fluorescencia de alta sensibilidad, la capacidad para usar tintes
para sustituir, por ejemplo, radiactividad para la detección de la
sensibilidad de ADN, se hace más y más valiosa.
Los complejos de tinte dsDNA representan una
nueva familia de marcadores de fluorescencia con un amplio intervalo
de propiedades espectroscópicas cuya composición, estructura y
tamaño pueden ajustarse a aplicaciones particulares. Las moléculas
de ADN pueden derivatizarse fácilmente para unirse a biotina,
digoxigenina o cualquier otro sustituyente que pueda reconocerse con
avidina o anticuerpos. Tales moléculas de ADN derivatizadas cargadas
con tinte pueden permitir la detección a una sensibilidad mucho más
alta en diversas aplicaciones, por ejemplo, inmunoensayos,
fluorescencia e hibridación in situ de cromosomas y similares
que actualmente usan otros marcadores de fluorescencia.
Las sondas con una región bicatenaria, que
proporciona sitios de intercalación y una región monocatenaria para
permitir el reconocimiento por hibridación de secuencias diana
específicas, ofrecen otro enfoque a la generación de marcadores
fluorescentes versátiles. El desarrollo de condiciones que permitan
una discriminación clara entre la unión de intercaladores a ácidos
nucleicos mono y bicatenarios es un prerrequisito esencial para el
uso de tales sondas.
Las sondas fluorescentes son reactivos valiosos
para el análisis y separación de moléculas y células. Algunos
ejemplos específicos de su aplicación son la identificación y
separación de una subpoblación de células en una mezcla de células
mediante técnicas de fluorescencia, citometría de flujo,
clasificación celular activada por fluorescencia y microscopía de
fluorescencia. Otras aplicaciones incluyen la determinación de una
concentración de sustancia o miembro de un par de unión específico
que se une a una segunda especie, o miembro del par de unión
específico, por ejemplo, reacciones
antígeno-anticuerpo en un ensayo de
inmunofluorescencia. Otra aplicación más es la localización de la
sustancia en geles y otros vehículos insolubles mediante las
técnicas de tinción de fluorescencia.
Varias limitaciones impiden la elección de
fluorescentes para estos propósitos; siendo una las características
de absorción y emisión del fluorescente ya que muchos ligados,
receptores y otros miembros de pares de unión, así como otros
materiales extraños asociados con la muestra, por ejemplo, sangre,
orina y líquido cefalorraquídeo, tendrán una fluorescencia propia e
interferirán con una determinación o cuantificación precisa de la
señal fluorescente generada con el marcador fluorescente cuando la
muestra se expone al estímulo apropiado. Otra consideración es la
eficacia cuántica del fluorescente. Otra cuestión es la
auto-inactivación; esto puede tener lugar cuando las
moléculas de fluorescente interactúan entre sí cuando están
próximas. Otra cuestión más es la unión no específica del
fluorescente a otros compuestos o incluso con el recipiente de
ensayo.
Se ha demostrado que el dsDNA forma complejos
altamente fluorescentes con el bis-intercalador
EthD. Las observaciones con relación al
bis-intercalador EthD sugieren que el intercalador
puede aprovecharse para generar una familia de complejos estables
altamente fluorescentes de dsDNA-tinte con
propiedades características. Tales complejos podrían aprovecharse
por detección múltiple de fragmentos de dsDNA, así como en muchas
aplicaciones analíticas en las que se podrían usar fragmentos
apropiadamente diversificados de dsDNA marcados de forma no
covalente con distintos tintes como una familia única de sondas
fluorescentes:
Sin embargo, este compuesto puede tener una
tendencia a la auto-inactivación cuando se une a
ADN.
En los aparatos de citometría de flujo, se hace
que las células u otras partículas fluyan en una corriente líquida
de forma que se facilite la investigación de ciertas
características de las mismas. En general, un aparato de citometría
de flujo es útil para identificar la presencia de ciertas células o
partículas de interés, para enumerar estas células o partículas y,
en algunos casos, para proporcionar una capacidad de clasificación
de forma que se puedan recoger las células o partículas de interés.
En un aparto típico de citometría de flujo, una muestra líquida que
contiene células se dirige a través del aparato en una corriente
líquida que se mueve rápidamente de forma que cada célula pasa en
serie y sustancialmente una en un período de tiempo, a una a través
de una región de detección. El volumen de la célula se puede
determinar mediante los cambios en la impedancia eléctrica al pasar
cada célula por la región de detección. De forma similar, si se
dirige un haz de luz incidente en la región de detección, las
células que pasan dispersan tal luz al pasar a través de la misma.
Esta luz dispersada ha servido como función del tamaño y forma de
la célula, índice de refracción, opacidad, granularidad, dureza y
similares. Además, la fluorescencia emitida por células marcadas, o
células autofluorescentes, que se han excitado como resultado del
paso a través de la energía de excitación del haz de luz incidente,
puede detectarse para la identificación de células que tienen
propiedades fluorescentes. Después de realizar el análisis celular
mediante el aparato de citometría de flujo, pueden clasificarse las
células que se ha identificado que tienen las propiedades deseadas
si el aparato se ha diseñado con tal
capacidad.
capacidad.
Los instrumentos tales como aparatos de
citometría de flujo son particularmente útiles para investigadores y
científicos que estudian diversas respuestas, reacciones y funciones
del sistema inmune. Los estudios de inmunofluorescencia, así como
los inmunoensayos de fluorescencia, ayudan al investigador a
identificar y a fijar como objetivo células seleccionadas de
interés de forma que los estados de enfermedad, afecciones y
similares puedan caracterizarse de forma apropiada. Además de las
investigaciones del sistema inmune, el análisis de fluorescencia
también es bastante beneficioso en las investigaciones de biología y
morfología celular, incluyendo el estudio del sustrato de material
celular.
Dependiendo de la fluorescencia para proporcionar
datos e información sobre las células, la mecánica de ensayos de
realización para la respuesta de la fluorescencia es una
consideración muy importante en el diseño del instrumento así como
en los resultados obtenidos. Específicamente, los marcadores
fluorescentes, ya sean manchas o tintes fluorescentes, se excitan
típicamente con energía lumínica. Normalmente hay una longitud de
onda óptima que proporciona el mayor nivel de excitación del
marcador fluorocromático que se está usando. Una vez excitados, la
emisión de fluorescencia tiene lugar típicamente en longitudes de
onda diferentes de la longitud de onda de excitación. Los
instrumentos de análisis de fluorescencia, ya sean microscopios de
fluorescencia, analizadores de imagen o citómetros de flujo, se
diseñan generalmente para detectar la emisión de fluorescencia en la
longitud de onda de máxima emisión en la que la señal de
fluorescencia es más fuerte.
Antes del descubrimiento y publicación de las
utilidades del homodímero de etidio como intercalador importante, el
intercalador habitual elegido era el bromuro de etidio. Los usos de
los intercaladores de bromuro de etidio incluyen metodologías
fluorométricas, fluorescencias cuantitativas de bromuro de etidio
intercalado en ADN sobre geles de agarosa, ensayos en placas de
bromuro de etidio-agarosa o detección de análisis de
ADN falso y similares. El bromuro de etidio y bromuro de propidio se
usaron además en citometría de flujo, así como en aplicaciones para
la formación directa de imágenes electrónicas, cuantificación
rápida y directa de fluorescencia y geles electroforéticos en
aplicaciones como agente de tinción del ADN. El bromuro de etidio
también se ha usado para aumentar la visibilidad de las líneas de
precipitación y para confirmar la especificidad en metodologías de
contrainmunoelectroforesis de dos etapas para la detección de
anticuerpos anti-ADN participantes o ADN circulante.
La utilización de bromuro de etidio como intercalador en numerosos
medios, así como la utilización más reciente del intercalador
homodímero de etidio están bien documentadas en la bibliografía y
representan el frente director de la metodología y eficacia de
los
intercaladores.
intercaladores.
En una aplicación algo distinta del bromuro de
etidio como agente de tinción, se ha unido bromuro de etidio a un
vehículo sólido. La Patente de Estados Unidos Nº 4.119.521 emitida
para Chirikjian el 10 de octubre de 1978, describe un agente
fluorescente de intercalación de ADN derivado de polisacáridos
activados. Los derivados en la patente funcionan como tinciones
fluorescentes para proporcionar una visualización directa del ADN y
sus fracciones, bajo una excitación de radiación de onda corta,
ultravioleta. Los agentes de intercalación usados en esta patente
son haluros de etidio, siendo el agente preferido bromuro de etidio.
Este agente se acopla covalentemente a un polisacárido activado tal
como agarosa.
La utilización de bromuro de etidio como
intercalador para uso en numerosos entornos, así como la utilización
más reciente del intercalador homodímero de etidio están bien
documentadas en la bibliografía y representan el frente director de
la metodología y eficacia de intercaladores. Sin embargo, sigue
existiendo una necesidad de mejorar la utilización de los
intercaladores y la viabilidad del uso de intercaladores con ADN,
abordando específicamente (1) alta afinidad para unir los
intercaladores a la molécula de ADN; (2) reducción de la
auto-inactivación; y (3) proporcionar una cinética
de transporte superior. Los intercaladores que poseen estas
cualidades reducen la cantidad de intercalador requerida para
realizar una de las muchas funciones implicadas en las metodologías
mencionadas anteriormente, lo cual también puede mejorar las
metodologías. Además, la mejora en la precisión y fiabilidad de los
distintos usos de interés es una preocupación continua.
El documento
WO-A-9426931, que es una técnica
anterior bajo los términos del Artículo 52(3) y (4) EPC para
los Estados Contratantes de EPC DE, FR y GB, describe
dietilentriamina etidio como tinte fluorescente que se une a ADN y
por lo tanto es útil para la detección de ADN. Las aplicaciones
descritas incluyen la detección en reacciones de cadena de
polimerasa, separaciones tales como electroforesis y clasificación
celular activada por fluorescencia y métodos de ensayos
diagnósticos.
La presente invención proporciona un compuesto
que tiene la fórmula
en la que A es un contraión monovalente
aceptable.
Preferiblemente, A se selecciona entre el grupo
compuesto por cloruro, bromuro y yoduro. Para los Estados
Contratantes de EPC DE, FR y GB, A es cloruro.
La presente invención también se refiere a un
método para detectar un ácido nucleico diana en una muestra,
comprendiendo dicho método:
(a) proporcionar una mezcla de reacción de
amplificación que comprende dicha mezcla, un agente de unión a ADN
de la fórmula anterior, donde dicho agente proporciona una señal
detectable cuando se une a ácido nucleico bicatenario, cuya señal
puede distinguirse de la señal proporcionada por dicho agente cuando
no está unido, y reactivos para la amplificación;
(b) determinar la cantidad de dicha señal
producida por la mezcla de la etapa (a);
(c) tratar dicha mezcla en las condiciones para
amplificar dicho ácido nucleico diana;
(d) determinar la cantidad de dicha señal
producida por dicha mezcla de la etapa (c); y
(e) determinar si ha tenido lugar
amplificación.
En una realización de tal método, el agente de
unión a ADN es un agente de intercalación y es un tinte
fluorescente, y más particularmente el agente de unión a ADN se
caracteriza adicionalmente por proporcionar una cantidad de señal
fluorescente detectable cuando dicho agente se une a ácidos
nucleicos bicatenarios que es superior a la cantidad de dicha señal
detectable producida cuando dicho agente no está unido.
La presente invención también se refiere al uso
de un agente de intercalación que comprende al compuesto de la
invención anterior para la separación y aislamiento o purificación
de ácidos nucleicos en muestras biológicas o clínicas complejas.
Además, la presente invención proporciona un
método para determinan una o más características de células usando
citometría de flujo que comprende:
mover las células, sustancialmente una a una, en
una corriente de flujo líquido, incluyendo dichas células un
marcador fluorescente que es el compuesto de la invención
anterior;
dirigir un haz de luz incidente a las células en
dicha corriente de flujo para excitar al marcador fluorescente;
identificar las células que tienen propiedades
fluorescentes detectando la fluorescencia emitida por las células
que se mueven en la corriente de flujo; y
usar dicha fluorescencia detectada para
determinar una o más características de dichas células.
Además, para todos los Estados Contratantes de
ECP designados, la presente invención se refiere al uso de un agente
de intercalación que comprende el compuesto anterior donde A es
cualquier contraión monovalente aceptable para la captura de ADN de
fase sólida por tal compuesto. En la invención también se incluye la
fase sólida modificada por tal compuesto para la captura de ADN de
fase sólida.
Para todos los Estados Contratantes de ECP
designados, la presente invención se refiere al uso de un agente de
intercalación que comprende al compuesto anterior donde A es
cualquier contraión monovalente aceptable para usar como agente
terapéutico para la inserción en el ADN.
El compuesto anterior proporciona una alta
afinidad para la unión a la molécula de ADN y muestra una menor
auto-inactivación aunque proporciona una cinética de
transporte superior. Se ha descubierto que el intercalador de la
invención proporciona mejor fluorescencia cuando se une a una
molécula de ADN en un medio de citometría de flujo fluorescente que
es aproximadamente de ocho a diez veces más brillante en la
fluorescencia que el homodímero de etidio utilizado en el mismo
medio de citometría de flujo. Debido a la mejora de la
fluorescencia, la detección de la hibridación de ADN puede
realizarse usando concentraciones mucho menores de compuesto
intercalador de la presente invención que usando agentes de
intercalación convencionales, tales como homodímero de etidio o
bromuro de etidio. Usando las mismas concentraciones, el compuesto
intercalador de la presente invención puede detectar cantidades
mucho menores de hibridación de ADN que los agentes de intercalación
convencionales. De esta forma, el compuesto intercalador de la
presente invención es mucho más sensible que los agentes de
intercalación conocidos en la detección de la hibridación de
ADN.
Las mejoras en la citometría de flujo, ensayos de
fluorescencia de hibridación in situ, electroforesis en gel,
detección de ADN, inmunoensayo para ADN y otros estudios de ADN son
sustanciales. El uso de intercaladores con ADN y múltiples métodos
han demostrado que el homodímero de etidio es aproximadamente dos
órdenes de magnitud más brillante que la metodología de tinción
convencional, es decir, bromuro de etidio. Sin embargo, el compuesto
intercalador de acuerdo con la presente invención proporciona, por
ejemplo, un tinte que muestra un aumento de ocho a diez veces en la
luminosidad frente al de EthD en el mismo medio, o una mejora de
aproximadamente mil veces sobre metodologías de tinción
convencionales. Con la detección de la pre-tinción y
la post-electroforesis, el nivel de sensibilidad de
la detección por radioinmunoensayo de ADN ahora se puede conseguir
con fluoróforos. Las composiciones de compuesto proporcionadas por
esta invención superan los límites de detección hasta 10 veces sobre
EhtD, proporcionando por tanto un potencial para nuevos usos en
aplicaciones de intercaladores para el estudio de análisis de ADN,
así como agentes terapéuticos y similares.
La Figura 1 es una visualización FACScan^{TM}
para la dispersión lateral frente a la dispersión frontal;
La Figura 2 es un histograma de intensidad de
fluorescencia (abscisas) frente a la frecuencia de eventos
(ordenadas);
La Figura 3 es una representación del diagrama de
dispersión para la dispersión lateral (SSC en abscisas) frente a la
intensidad de fluorescencia (ordenadas);
La Figura 4 es una visualización FACScan^{TM}
para la dispersión lateral frente a la dispersión frontal;
La Figura 5 es un histograma de intensidad de
fluorescencia (abscisas) frente a la frecuencia de eventos
(ordenadas);
La Figura 6 es una representación del diagrama de
dispersión para la dispersión lateral (SSC en el eje de abscisas)
frente a la intensidad de fluorescencia (ordenadas);
La Figura 7 es una representación fotográfica de
una electroforesis en gel de agarosa irradiada con luz UV realizada
sobre un ADN plasmídico PBR322 cortado con una enzima BAMH;
La Figura 8 es un gráfico de saturación de la
hibridación para equivalentes;
La Figura 9 muestra curvas de titulación de
hibridación con respecto a la intensidad de fluorescencia frente a
equivalentes;
La Figura 10A es una visualización FACScan^{TM}
(SCC frente a FCS) de una distribución típica de glóbulos blancos
lisados;
La Figura 10B es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra de sangre que la Figura 10A a la que se le han
añadido núcleos de eritrocitos de pollo ("CEN") no teñidos;
La Figura 10C es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra lisada con diluyente de glóbulos blancos ("WBC
DIL");
La Figura 10D es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra que se presenta en la Figura 10C, pero con
CEN;
La Figura 10E es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra lisada en el mismo diluyente que la Figura 10D,
pero con 0,5 \mug/ml de tinte de glóbulos rojos nucleados
("NRBC");
La Figura 10F es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra lisada en el mismo diluyente que la Figura 10D,
pero con 0,25 \mug/ml de tinte NRBC;
La Figura 11 es una representación gráfica de la
eficacia de la captura de ADN plasmídico cortado con enzima de
restricción radiomarcado con 32P en micropartículas de poliestireno
activado con fenatridinio preparadas como se describe en el Ejemplo
6;
La Figura 12 es una representación gráfica de la
eficacia de la captura de ADN plasmídico radiomarcado con 32P en
perlas de carboximetil sepharose activada con fenatridinio
sintetizadas como se describe en el Ejemplo 6;
La Figura 13 es un esquema de reacción para la
síntesis del compuesto 24 y sus precursores;
La Figura 14 es una representación esquemática de
micropartículas de fase sólida derivatizadas con el
intercalador;
La Figura 15 es una comparación de las
intensidades relativas de fluorescencia obtenidas de la tinción del
ADN por el compuesto 24, bromuro de etidio, yoduro de
propidio y homodímero de etidio.
En sentido amplio, la presente invención se
refiere al compuesto intercalador descrito anteriormente que tiene
alta afinidad para unirse a una molécula de ADN. Tal compuesto
intercalador muestra una mejor unión a una molécula de ADN en
metodologías conocidas que requieren la inserción del intercalador
en la molécula de ADN. Una mejor unión de moléculas de ADN mediante
un segmento que funciona como intercalador es de utilidad en el
marcaje, captura, inserción terapéutica, ensayos y similares, con
una mejor actuación del intercalador debido a la mayor eficacia de
utilización de los compuestos. Se consigue una mejor unión a la
molécula de ADN del anterior intercalador, mostrando tal
intercalador alta afinidad para la unión, menor
auto-inactivación y una cinética de transporte
superior, especialmente cuando se compara con el homodímero de
etidio u otros bis-intercaladores.
Las diversas realizaciones de la presente
invención, incluyendo la síntesis de los compuestos y la utilización
de dichos compuestos, se muestran en las Figuras
1-9, 10A-10F, 11-15.
La información que se muestra en estas figuras muestra claramente
una alta afinidad por la unión, una menor
auto-inactivación y una cinética de transporte
superior, especialmente cuando se compara con el homodímero de
etidio u otros bis-intercaladores.
La Figura 1 es una visualización FACScan^{TM}
para la dispersión lateral frente a la dispersión frontal (SSC en el
eje de abscisas y FSC en el eje de ordenadas) para una distribución
típica de glóbulos blancos lisados con diluyente WBC DIL con tinte
NRBC de fenatridinio triamina (PTA) 24 y CEN. Los umbrales
del cuadrante se fijaron para excluir los linfocitos seleccionados
del gráfico de puntos de SSC frente a FSC.
La Figura 2 es un histograma de intensidad de
fluorescencia (abscisas) frente a la frecuencia de eventos
(ordenadas) con respecto a las poblaciones de células teñidas y no
teñidas en presencia de fenatridinio triamina (PTA) 24.
La Figura 3 es una representación del diagrama de
dispersión para la dispersión lateral (SSC en el eje de abscisas)
frente a la intensidad de fluorescencia (ordenadas) que muestra la
separación de células teñidas con PTA 24 (esquina superior
izquierda, cuadrante NW) de células no teñidas (restantes) por la
intensidad de la fluorescencia.
La Figura 4 es una visualización FACScan^{TM}
para la dispersión lateral frente a la dispersión frontal (SSC en el
eje de abscisas y FSC en el eje de ordenadas) para una distribución
típica de glóbulos blancos lisados con diluyente WBC DIL con tinte
NRBC de homodímero de etidio y CEN. Los umbrales del cuadrante se
fijaron para excluir los linfocitos seleccionados del gráfico de
puntos de SSC frente a FSC.
La Figura 5 es un histograma de intensidad de
fluorescencia (abscisas) frente a frecuencia de eventos (ordenadas)
de las poblaciones de células teñidas y no teñidas en presencia de
homodímero de etidio.
La Figura 6 es una representación del diagrama de
dispersión para la dispersión lateral (SSC en abscisas) frente a
intensidad de fluorescencia (ordenadas) que muestra la separación de
células teñidas con homodímero de etidio (esquina superior
izquierda, cuadrante NW) de células no teñidas (resto) por
intensidad de fluorescencia.
La Figura 7 es una representación fotográfica de
un gel de electroforesis en agarosa irradiado con luz UV realizada
en ADN del plásmido PBR322 cortado con BAMH. Se prepararon cargas de
5 \mul de soluciones madre para las bandas 3-14.
Se usaron las siguientes soluciones madre de ADN e intercalador para
cargar las bandas 1-14: Banda 1: marcador; Banda 2:
blanco; Banda 3: 20 ng/ml de plásmido teñido con bromuro de etidio;
Banda 5: 160 pg/ml de plásmido teñido con bromuro de etidio; Banda
6: 40 pg/ml de plásmido teñido con bromuro de etidio; Banda 7: 20
ng/ml de plásmido teñido con homodímero de etidio; Banda 8: 800
pg/ml de plásmido teñido con homodímero de etidio; Banda 9: 160
pg/ml de plásmido teñido con homodímero de etidio; Banda 10: 40
pg/ml de plásmido teñido con homodímero de etidio; Banda 11: 20
ng/ml de plásmido teñido con PTA 24; Banda 12: 800 pg/ml de
plásmido teñido con PTA 24; Banda 13: 160 pg/ml de plásmido
teñido con PTA 24; Banda 14: 40 pg/ml de plásmido teñido con
PTA 24. En todos los casos, la relación de tinte/pares de
bases fue de 1/20. En todos los casos, el tinte se
pre-incubó con el ADN y no se realizó tinción
post-electroforesis en gel.
La Figura 8 es una gráfica de saturación de la
hibridación para equivalentes de d(pT)9 añadidos a
d(pA)9 a ADN 6,6 micromolar y tinte 3,08 micromolar de
homodímero de etidio y PTA 24 con una relación de tinte/pares
de bases de 1:4. La representación gráfica de equivalentes de
oligonucleótido complementario d(pT)9 en las abscisas
añadidos a d(pA)9 frente a la intensidad relativa de
fluorescencia en las ordenadas generada usando el protocolo descrito
en el Ejemplo 2 se usó para comparar el homodímero de etidio y PTA
24. La concentración de fluoróforo en ambos casos fue 3,08
micromolar usando una corrección estadística doble para los
equivalentes 2,0 molar de resto de fenantridinio por cada mol de
homodímero de etidio. Las dos curvas se normalizan con respecto al
efecto de fondo para la fluorescencia relativa. La excitación fue a
488 nm (534 nm es el máximo de excitación) para este experimento y
la emisión fue a 625 nm.
La Figura 9 muestra las curvas de titulación de
la hibridación para la intensidad de fluorescencia frente a
equivalentes de d(pT)9 añadidos a d(pA)9
a ADN 6,6 micromolar y bromuro de etidio 3,08 micromolar y PTA
24. La representación gráfica de equivalentes de
oligonucleótido complementario d(pT)9 en abscisas
añadidos a d(pA)9 frente a la intensidad relativa de
la fluorescencia (ordenadas) generada usando el protocolo descrito
en el Ejemplo 2 se usó para comparar bromuro de etidio y PTA
24. La concentración de fluoróforo en ambos casos fue 3,08
micromolar. Ambas curvas se normalizan con respecto al efecto de
fondo. La excitación fue a 488 nm (534 es el máximo de excitación) y
la emisión fue a 625 nm y las intensidades se midieron usando un
fluorímetro Hitachi F-3010.
La Figura 10A es una visualización FACScan^{TM}
(SSC frente a FSC) de una distribución típica de glóbulos blancos
lisados con WBC DIL CD4000 sin tinte NRBC o CEN. Los umbrales del
cuadrante se fijaron para excluir los linfocitos seleccionados del
gráfico de puntos de SSC frente a FSC.
La Figura 10B es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra de sangre de la Figura 10A a la que se le ha
añadido CEN sin teñir. Como se puede apreciar, los CEN no teñidos
muestran algo de auto-fluorescencia FRL3. La región
1 se fijó para incluir todos los eventos FL3+ en esta muestra no
teñida, de forma que las células pigmentadas en las muestras de
ensayo se puedan contar en la región 2. La región 3 se fija para
incluir la población CEN solamente para medir la FL3 media de la
población.
La Figura 10C es una representación
FACScan^{TM} de la misma muestra lisada con WBC DIL que contenía
1,0 \mug/ml de tinte NRBC. Se detectaron 1,3% de eventos FL2+ en
\mul de los linfocitos seleccionados y se detecta un 1,08% de
eventos FL3+ en la población total no seleccionada de glóbulos
blancos.
La Figura 10D es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra presentada en la Figura 10C, pero con CEN. La
región 2 del histograma FL3 de la población no seleccionada muestra
la población de CEN teñida que tiene una media FL3 de 3319,8.
La Figura 10E es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra lisada en el mismo diluyente que la Figura 10D,
pero con 0,5 \mug/ml de tinte NRBC.
La Figura 10F es una visualización FACScan^{TM}
de la misma muestra lisada en el mismo diluyente que la Figura 10D,
pero con 0,25 \mug/ml de tinte NRBC. Como se puede apreciar, el
CEN teñido se sigue separando bien de los glóbulos blancos.
La Figura 11 es una representación gráfica de la
eficacia de la captura de ADN plásmido radiomarcado con el isótopo
32P en micropartículas de poliestireno activado con fenatridinio
preparado como se describe en el Ejemplo 6. A: recuento inicial
radiactivo en solución que supone la concentración total del ADN;
B: recuento radiactivo que permanece en la solución después de
retirar el ADN por centrifugación como se describe en el Ejemplo 6;
C: recuento radiactivo inicial en el ADN unido a la micropartícula
por el resto de fentridina antes de que se inicie la liberación por
NaOH; y D: recuento radiactivo que permanece en el sólido después de
la retirada del ADN con NaOH.
La Figura 12 es una representación gráfica de la
eficacia de la captura de ADN plásmido radiomarcado con el isótopo
32P en perlas de carboximetil sepharose activadas con fenatridinio
sintetizadas como se describe en el Ejemplo 6; A: recuento inicial
radiactivo en solución que supone la concentración total del ADN;
B: recuento radiactivo que permanece en la solución después de
retirar el ADN por centrifugación como se describe en el Ejemplo 6;
C: recuento radiactivo inicial de ADN unido a la micropartícula por
el resto fentridina antes de que el NaOH inicie la liberación; y D:
recuento radiactivo que permanece en el sólido después de la
retirada del ADN con NaOH.
El presente compuesto intercalador es
sustancialmente un monointercalador frente a los (bis)
intercaladores polifuncionales.
La invención se define adicionalmente por medio
de los siguientes Ejemplos, que proporcionan la base para las
Figuras y pretenden ilustrar, pero no limitar.
PTA 24, el compuesto de acuerdo con la
invención, se sintetizó mediante la secuencia mostrada en el esquema
mostrado en la Figura 13. Los procedimientos experimentales usados
para obtener el producto 24 son los que se ilustran en este
documento. El Intermedio 21, Intermedio de Partida
20,
3,8-diamino-6-feno-fenantridina
(25,0 g, 0,0876 moles) se obtuvo en Aldrich Chemical Company
(Milwaukee, WI) y se añadió a un matraz de 3,0 litros, de una sola
boca y de fondo redondo en una atmósfera de Argón y se equipó con un
barra de agitación magnética y un condensador de reflujo. A este
recipiente se le añadió 1,0 litro de piridina seca con agitación. La
agitación de la suspensión resultante continuó durante 15 minutos
hasta que se disolvió todo el sólido. A esta solución se le añadió
una cantidad catalítica de N,N-dimetilformamida (1,07 g,
0,0086 moles) con agitación. Después se añadió anhídrido acético
(462 g, 4,9 moles) y la mezcla de reacción resultante se calentó a
reflujo durante 8-12 horas. Después, la mezcla de
reacción se dejó enfriar y el disolvente se retiró al vacío. Para
la purificación del Producto II, se usó una columna de gel de sílice
con gradiente usando 2,0 litros de 45/40/10/5 de acetato de
etilo/hexano/CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH seguido de 1,0 litro de
40/40/10/10 de EtOAc/hexano/CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH. Se
recogieron fracciones de 10,0 ml y las fracciones apropiadas se
recombinaron y el disolvente se retiró al vacío. Después, el
residuo de aspecto gomoso y pegajoso se disolvió en EtOH caliente
(220 ml) y precipitó por refrigeración a 0ºC. Las aguas madre se
retiraron por decantación y se añadieron 200 ml de EtOH reciente El
sólido se disolvió de nuevo por calentamiento y se dejó cristalizar
a -4ºC durante 48 horas. Se recogieron los cristales de las agua
madre y de la segunda recristalización y se lavaron con una pequeña
cantidad de EtOH frío y se secaron a alto vacío durante varias
horas. El rendimiento aislado de producto puro después de la
cromatografía en columna y dos recristalizaciones fue de 32%.
^{1}H RMN CD_{3}OD (300 MHz) 9,1 (d, 1H, 8,82 Hz), 9,0 (d, 1H,
8,75 Hz), 8,08 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,92 (d, 1H, 4,5 Hz), 7,8 (m,
3H), 7,65 (m, 3H), 2,45 (s, 6H), 2,35 (2, 6H); ^{13}C RMN
CD_{3}OD (75,45 MHz), 1,74,5, 163,7, 145,3, 142,1 140,6, 139,9,
134,4, 133,8, 130,8, 130,6, 129,8, 127,3 125,9, 125,6, 124,8, 27,1,
Masa Exacta Calc. para C_{27}H_{23}N_{3}O_{4}, Calc.
453,1688 masa exacta, Obs: 453,1683; Análisis CH calculado para
C_{27}H_{23}N_{3}O_{4} C: 71,51 H: 5,11 N: 9,27 Encontrado
C: 71,77 H: 5,10 N: 9,20.
Intermedio 22. El intermedio 22 se
sintetizó a partir de la diamida 21 mediante una
modificación de un procedimiento bibliográfico (Gaugain et
al., Biochemistry, Vol. 17, Nº 24, 1978, páginas
5071-5078) para la cuaternización de la amida de
3,8-diamino-6-fenil
fenantridina. La amida 21 (10,5 g, 0,023 moles) se introdujo
en un matraz de 2 litros de fondo redondo en una atmósfera de argón
equipado con una barra de agitación magnética y un condensador de
reflujo. Se añadió 1,3-dibromopropano (1,0 litro,
9,86 moles) a este matraz y la mezcla resultante se llevó a reflujo
durante 7 horas. La solución se enfrió durante una noche y el
precipitante se filtró y se lavó con éter dietílico. Se obtuvieron
10,44 g (68,7%) de material 22 bruto. Este material se
recristalizó en CH_{3}OH para producir 5,3 g de bromuro de
diacetilo 22. ^{1}H RMN CD_{3}OD (300 MHz) delta 10,75
(s, 1H), 10,45 (s, 1H), 9,3 (s, 1H), 9,09 (d, 9,2 Hz, 1H), 9,04 (d,
9,2 Hz, 1H), 8,45 (d, 9,1 Hz, 2,2 Hz, 1H), 8,12 (s, 1H), 8,07 (d,
9,0 Hz, 1H), 7,95 (m, 3H), 7,85 (m,3H), 5,0 (t, 9,0 Hz, 3H), 3,6
(t, 6,0 Hz, 2H), 2,65, 2,38, 7,75 ^{13}C RMN _{26}DMSO (75,45
MHz) delta 169,9, 169,3, 163,8, 142,1, 139,9, 134,2, 131,5, 130,5,
129,5, 128,4, 125,9, 125,4, 123,6, 122,3, 121,6, 119,0, 107,7,
55,7, 30,7, 24,5, 24,2; masa exacta calculada para
C_{26}H_{29}N_{3}O_{2}Br_{2} sal libre (FAB+) 490,1131
Obs: 490,1139; análisis CH calculado para
C_{26}H_{29}N_{3}O_{2}Br_{2} H: 4,41 C: 54,66 N: 7,36
Encontrado H: 4,25 C: 54,65 N: 7,30.
Intermedio 23. El Intermedio 22
(5,3 g, 0,0093 moles) se añadió a un matraz de 250 ml de fondo
redondo equipado con una barra de agitación magnética y un
condensador de reflujo. Después se añadió metanol (150 ml) con
agitación a este matraz en una atmósfera de nitrógeno y se añadió
dietilentriamina (29,2 g, 0,283 moles) mientras se continuaba
agitando. La solución transparente resultante se calentó a reflujo
durante una noche en una atmósfera de nitrógeno. Después, esta
solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en
H_{2}O destilada. Después, esta mezcla se concentró al vacío
hasta que sólo quedaba el H_{2}O. Se añadieron
50-75 ml más de H_{2}O y la solución se dejó
enfriar a 0ºC. Después, el sólido se filtró y se lavó con agua
enfriada en hielo. Después, este material se redisolvió en EtOH y
se precipitó con HCl 10N. Después de la filtración de la suspensión,
el sólido resultante se recristalizó en etanol caliente después de
la refrigeración a 0ºC durante 15 minutos. También se recogió una
segunda extracción del segundo filtrado después de un periodo de
reposo y por precipitación con EtOH del primer filtrado. Estos
sólidos después se combinaron y se obtuvo el producto final
23 (2,5 g) después de alto vacío durante una noche. ^{1}H
RMN CD_{3}OD (300 MHz) delta 9,2 (s, 1H), 9,05 (d, 1H), 8,95 (d,
1H), 8,4 (s ancho, 2H), 8,3 (s ancho, 1H), 7,9 (m ancho, 3H), 7,7
(m ancho, 2H), 5,1 (m ancho, 1H), 3,9 (s ancho, 3H), 3,45 (m ancho,
2H), 3,85 (m ancho, 2H), 2,5 (m ancho 3H), 2,3 (m ancho, 3H); MS
calc. para la sal libre C_{30}H_{37}N_{6}O_{2}(FAB+)
513 Obs: 513.
Producto 24. La síntesis y purificación de
la fenantridinio triamina, PTA, 24 se realizó por el
siguiente protocolo. La triamina 23 (2,35 g, 0,0036 moles)
se disolvió en 75,0 ml de metanol y se añadieron 75 ml de HCl 4N. La
mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas y se dejó enfriar. A
esta solución se le añadió etanol y el precipitado resultante se
filtró y se lavó con una cantidad mínima de etanol frío. El
filtrado se concentró de nuevo y se añadió etanol reciente y HCl
acuoso concentrado. Este precipitado resultante también se filtró.
Después, este filtrado se concentró casi a sequedad y se añadió
Et_{2}O y el sólido se retiró por filtración. Después, el último
residuo infiltrable restante se disolvió en HCl concentrado y se
precipitó con EtOH. Este material se filtró y se lavó con etanol,
se combinaron todos los materiales sólidos de la secuencia anterior
y se sometió este material a vacío durante una noche para obtener un
total de 2,03 g del tinte fluorescente de ADN de alta afinidad PTA
24. ^{1}H RMN d_{6}-DMSO (300 MHz) delta
10,0 (s ancho, 2H), 9,65 (s ancho, 2H), 8,68 (d, 14,2 H, 2H), 8,35
(s ancho, 2H), 7,75 (m, 4H), 7,65 (s, 1H), 7,55 (d, 9,2 Hz, 2H),
7,35 (d, 9,2 Hz, 2H), 6,28 (2, 1H), 4,5 (s ancho, 2H), 4,0 (s
ancho, 9H), 3,4 (s ancho, 2H), 3,0 (s ancho, 2H), 2,3 (m ancho,
2H); ^{13}C RMN d_{6}-DMSO (75,45 MHz) \delta
159,7, 151,1, 134,6, 131,7, 130,9, 129,4, 128,8, 128,4, 124,9,
122,9, 120,1, 117,4, 99,6, 51,4, 43,8, 42,5, 40,3, 34,9, 18,5;
Espectro de masas de alta resolución.
C_{26}H_{33}N_{6}(FAB+) Calc. 429,2767, Obs: 429,2766;
El análisis CH calc. para C_{26}H_{37}N_{6}Cl_{4}.3H_{2}O
fue H 6,89 C 49,61 N 13,35. Encontrado H: 6,16; C 49,74; N
13,08.
PTA 24 se usó para cuantificar la
hibridación al titular un oligonucleótido diana con su pareja
complementaria. En la Figura 9 se puede encontrar una comparación de
la tinción con bromuro de etidio frente a PTA 24 para
detectar esta hibridación, según el siguiente protocolo, y en la
Figura 8 se puede encontrar la comparación de homodímero de etidio
frente a PTA 24, según el siguiente protocolo. Se obtuvieron
cadenas complementarias de ADN (ácido oligodesoxitimidílico),
d(pT)_{9} y ácido oligodesoxiadenílico
(d(pA)_{9}) de Sigma Chemical Co. en St. Louis, MO.
Se preparó una solución madre de d(pA)_{9} a 5
unidades/ml de TRIS 0,05M, NaCl 0,2N, EDTA 1 MM, pH 8,4. Para polyA,
\epsilon = 8,4 AU/mM cm o 8.400 M^{-1}cm^{-1}; por lo tanto,
con 9 pares de bases para d(pA)_{9}, \epsilon es
75.600 M^{-1}cm^{-1}. Después, esta solución madre se diluyó 10
veces para obtener una solución madre a 6,61x10^{-6}M o 6,6
\muM. La solución madre de d(pT)_{9} se preparó a
25 unidades/5,0 ml y se uso para la titulación sin dilución
adicional en el mismo tampón. Como la \epsilon de polyT es 8,15
AU/mM cm o 8.150 M^{-1}cm^{-1} por par de bases, o 73.350
M^{-1}cm^{-1} por oligo, la concentración de la solución madre
de oligo era 68 \muM en moléculas de ADN. Se realizó una
titulación usando un Espectrofotómetro de Fluorescencia Hitachi
F-4010 equipado con 0,5 ml de microcélulas para
obtener un espectro totalmente corregido y una longitud de onda de
excitación de 488-550 nm (la óptima es de alrededor
de 534) y una longitud de onda de emisión de 600-650
nm (óptima alrededor de 635). Se añadieron equivalentes de
d(pT)_{9} con los siguientes incrementos: 0,02,
0,05, 0,080, 0,150, 0,300, 0,500, 0,700, 1,00, 2,00, 5,00
equivalentes. Cada muestra de la curva de titulación se preparó
individualmente dividiendo la solución madre inicial de
d(pA)_{9} en alícuotas de 10 x 1,0 ml. Después, se
realizó la adición del complemento añadiendo por medio de una
micropipeta una cantidad apropiada (2, 5, 8, 15, 30, 50, 70,100, 200
y 500 \mul, respectivamente) de solución madre de
d(pT)_{9} a cada serie de 10 alícuotas. Cada
alícuota, obteniendo progresivamente mayores relaciones molares de
las dos cadenas complementarias, se incubó a temperatura ambiente
durante 15 minutos, el tinte se añadió en forma de alícuotas de 20,0
\mul de una solución 154 \muM del tinte en solución tampón TRIS
0,05 M, NaCl 0,2 N, EDTA 1 mM, pH 8,4. Esto corresponde a una
relación tinte/par de bases de ADN de 1/20 en saturación con el
oligo complementario. Las concentraciones totales de tinte y oligo
varían en el gráfico de saturación debido al uso de adiciones
incrementales variadas de la misma solución madre. Después de un
periodo adicional de incubación de 15 minutos, se leyó la intensidad
relativa de fluorescencia a 625 nm y se registró para generar una
curva patrón que es directamente proporcional a la cantidad de
hibridación de dsDNA, o secuencia diana, en estas condiciones. La
fluorescencia de fondo, o fluorescencia residual inicial, después se
resta como una constante en todas las curvas para la comparación de
las distintas curvas de titulación en el mismo gráfico.
Se ensayó un gel de agarosa para comparar la
intensidad de tinción de bromuro de etidio (Aldrich Chemical Co.,
Milwaukee, WI), homodímero de etidio -1 (Molecular Probes, Cat., #
E 1169, Eugene, Oregon) y la tinción con PTA 24. El plásmido,
pBR322, 2,1 mg en 7 ml de solución madre se incubó a 37ºC durante 1
hora con 1 ml de enzima de restricción BAMH con 2 ml de tampón
React2 10X y se diluyó a 20 ml con 10 ml de H_{2}O. Esta mezcla se
uso posteriormente para preparar tres soluciones madre de plásmido
pBR322 cortado a 0,63 mg por 6 ml en cada vial. Cada una de estas
soluciones madre se diluyó adicionalmente con H_{2}O y glicerol al
20% hasta obtener soluciones madre de ADN finales de 20 ng/ml, 800
pg/ml, 160 pg/ml y 40 pg/ml con una relación 1:4 entre tinte y pares
de bases de ADN en cada una de ellas para un total de 12 soluciones
madre. Una alícuota de 5 ml de cada solución madre se introdujo en
12 bandas separadas en gel de agarosa y se realizó electroforesis
durante 30 minutos en TRIS 4 mM, pH 8,2, con tampón EDTA 0,01 mM.
Después, el gel se retiró y se fotografió con exposición a la luz UV
en un recipiente de gel convencional.
La síntesis del reactivo de captura de
micropartículas de fase sólida (MP) derivatizado con intercalador se
realizó por medio del esquema representado en el siguiente esquema
con el siguiente procedimiento:
Una alícuota 45 de micropartículas de 0,275 \pm
\mum (Seradyne, Indianapolis, IN) se introdujo en un vial de 4 ml
y el tensioactivo se intercambió usando resina en lecho mixto de
intercambio iónico Bio-Rex 501-D
(Bio-Rad, Richmond, CA). Después de agitar levemente
durante 2 horas, la resina se retiró de la mezcla por filtración
usando un embudo de vidrio poroso grueso equipado con una cámara de
recolección a presión reducida. La muestra se diluyó a una
concentración de MP de 10% de sólidos en peso.
La cantidad total de equivalentes de ácido
carboxílico reactivo se calculó a partir de las especificaciones de
titulación del vendedor.
Se preparó una solución madre de
sulfo-N-hidroxisuccinimida (Pierce, Rockford, IL) a 11 mg/ml
(20 mM) en H_{2}O y una solución madre de EDAC (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) a 10 mg/ml (5 mM) en H_{2}O. Se añadieron
cinco equivalentes de EDAC (290 \mul de solución madre) a la
mezcla de reacción de carboximicropartículas, seguido de 5,0
equivalentes de sulfo-N-hidroxisuccinimida (330 \mul de
solución madre). Esta mezcla se dejó incubar a temperatura ambiente
durante 2 horas y después se añadió un equivalente 2,0 molar de PTA
24 (4 mg) a una concentración de 8 mg/400 \mul, o 2,0
mg/100 \mul en NaCl 0,1 N, tampón fosfato Pi 0,1 N pH 8,0. La
sulfo-N-hidroxisuccinimida puede sustituirse por
N-hidroxisuccinimida (Pierce) si se disuelve primero en una
solución madre de DMF (dimetilformamida) y se extraen alícuotas
como se ha descrito anteriormente. Después de dejar 24 horas para
que se complete la reacción, el tinte libre se retiró por
centrifugación, se retiró la solución madre y se intentó
resuspender varias veces hasta que la solución se volvió
transparente y no se extrajo más tinte de las muestras. El reactivo
de captura purificado posteriormente se diluyó hasta que se obtuvo
una solución madre del 2-4% de material sólido en
H_{2}O.
En la Figura 14 se proporciona una representación
esquemática general de este Ejemplo.
Se obtuvo Sepharose CM (modificada con carboxi)
en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) en una mezcla de
etanol/H_{2}O. Se estimó que la solución contenía un 50% de
sólidos basándose en el volumen total ocupado por las porciones
sólidas y líquidas después de un largo periodo de reposo. Después,
esta suspensión se mezcló uniformemente y se diluyó hasta un 10% de
sólidos. Se retiraron 200 \mul de esta solución madre y se calculó
a 0,12 meq/gramo que tenía 0,012 meq de ácido total. Se preparó una
solución madre de EDAC y N-hidroxisuccinimida y se añadieron
5,0 equivalentes de cada reactivo de activación a esta suspensión.
Para esta preparación, se usaron 13,2 mg (en 1,32 ml) de HOSuc y
11,25 mg de EDAC (en 1,02 ml) y 8,0 mg en total del intercalador PTA
24. Después de la incubación durante 2-24
horas, las suspensiones se limpiaron mediante etapas repetidas de
lavado y centrifugación suave hasta que no se extrajo más color del
sólido tras la dilución. Se preparó una solución madre a un 10% de
sólidos en H_{2}O. Debe apreciarse que los controles se ensayaron
con fases sólidas modificadas con PTA 24 y no modificadas y
que la captura de ADN no específica mínima tuvo lugar con los
materiales no derivatizados.
1. Introducir 50 \mul de micropartículas
activadas en un eppendorf de 1,5 ml.
2. Añadir 150 \mul de PBS y
1-20 u de un plásmido linealizado de 5,0 kb marcado
terminalmente con ^{32}P. Como alternativa, añadir
1-50 \mul de muestra biológica u otro ADN
purificado.
3. Mezclar por rotación durante una hora a
temperatura ambiente.
4. Sedimentar las micropartículas por
centrifugación a 5.000 rpm durante 5 minutos.
5. Lavar una o más veces con 200 \mul de
PBS.
6. Liberar el ADN añadiendo 5 \mu de NaOH 0,5M
y mezclar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar y recoger el sobrenadante, que
contiene el ADN liberado.
La eficacia de la captura de ADN se midió usando
ADN plasmídico radiomarcado con ^{32}P en el protocolo descrito
anteriormente. Los resultados se encuentran en la Figura 11 usando
las micropartículas de poliestireno modificadas con intercalador
preparadas como en el Ejemplo 4 y la Figura 12 y usando las perlas
de Sepharose CM modificadas con intercalador preparadas como en el
Ejemplo 5. Los datos indican que la unión de ADN a la fase sólida
modificada con intercalador fue específica y se indujo por la unión
covalente de intercalador 24 a la fase sólida.
Protocolo: se añadieron 50 \mul de muestra de
sangre entera de dos donantes locales y 3 \mul de suspensión de
CEN a 1,0 ml de WBC DIL pre-calentado a 40ºC con y
sin el tinte NRBC a una concentración de 1 \mug/ml, se mezclaron
y se introdujeron en el FACScan^{TM} y se adquirieron lecturas de
20''. Se usaron núcleos de eritrocitos de pollo (CEN) para medir la
intensidad de la tinción FL3 (FL3 media de CEN). Las muestras de
sangre entera usadas tenían una antigüedad de aproximadamente
4-5 horas. Los datos para este experimento se
muestran en las Figura 1-6.
El efecto de una reducción en la concentración de
PTA 24 (Figuras 10A-F) en relación con el
homodímero de etidio se demostró como se indica a continuación:
Método: El experimento se diseñó para
mostrar la correlación entre la concentración de tinte y el
porcentaje de eventos FL2+ en el cuadrante UL de los gráficos de
puntos FL1 frente a FL2. El WBC DIL usando contenía un 0,5%
peso/volumen de cloruro amónico, un 0,075% de volumen de
formaldehído, un 0,01% en peso/volumen de saponina, un 0,01% en
peso/volumen de bicarbonato potásico y tampón acetato 20 mM con un
pH de aproximadamente 6,0 y una osmolalidad de aproximadamente 270
mOsm por litro. Se añadieron 50 \mul de muestras de sangre entera
de cada uno de los dos donantes locales a 1,0 de WBC DIL
precalentado a 40ºC con y sin tinte NRBC a distintas concentraciones
(0,25, 0,50, 0,75 y 1,0 \mug/ml), se mezclaron, se introdujeron
en el FACScan^{TM} y se adquirieron lecturas de 20''. Se usaron
núcleos de eritrocitos de pollo (CEN) para medir la intensidad de la
tinción FL3 (FL3 media de CEN). Las muestras de sangre entera usadas
para este experimento tenían una antigüedad de aproximadamente 6
horas.
Se observó que el ADN de CEN es esencialmente
indistinguible del efecto de fondo sin PTA 24 (Figura 10B) y
que la concentración de tinte puede reducirse al 75% de la del
homodímero de etidio (Figura 5) y mantener todavía una separación
aceptable del efecto de fondo (Figura 10F). Tal reducción puede
llevar a una unión no específica significativamente reducida y a
ahorros sustanciales en el uso del tinte.
Protocolo de aislamiento de las células:
Cada tubo de células aisladas con ficol se trató como se indica a
continuación: PBS con 0,1% de Azida sódica y 1,0% de albúmina (nº de
catálogo de Sigma 1000-3), gravedad específica de
Ficol 1,119 (nº de catálogo de Sigma Histopague
1119-1).
10 ml de sangre entera (anticoagulante EDTA) se
diluyeron con 10 ml de PBSW. En 4 tubos de fondo cónico de 15 ml se
depositaron 5 ml de sangre diluida sobre 5 ml de ficol. Los tubos se
centrifugaron durante 30 minutos a 400 x G. La capa de interfaz que
contiene los linfocitos, monocitos, granulocitos y plaquetas se
aspiró y se lavó una vez en 5 ml de PBS, centrifugando los tubos a
300 x G durante 6 minutos. El sedimento de células se resuspendió en
PBS, las células se contaron y se ajustaron a 8,5 x 10^{6} células
por ml.
Soluciones de tinte:
PTA 24 - Se preparó una solución madre de
10 \mug/ml disolviendo PTA 24 en PBS con azida sódica al
0,1%.
Yoduro de propidio (P.I.) - Se preparó una
solución madre de 0,5 mg/ml disolviendo P.I. en PBS con azida sódica
al 0,1%.
En un tubo de 12 x 75 mm, se mezclaron suavemente
117,6 \mul de células con 14,7 \mul de solución madre de tinte
P.I. Después de 20 segundos, el tubo se introdujo en un citómetro de
flujo Coulter Elite^{TM} y se recogieron los datos.
Procedimiento de "Discrimination of Viable and
Non-Viable Cells Using Prodidium Iodide in Two Color
Immunofluorescence", Cytometry de Sasaki et al.,
Vol. 8, 1987, pág. 413-320.
En un tubo de 12 x 75 mm, se mezclaron suavemente
23,5 \mul de células con 76 \mul de solución madre de tinte PTA
24. Después de 20 segundos, el tubo se introdujo en un
citómetro de flujo Coulter Elite^{TM} y se recogieron los
datos.
En un tubo de 12 x 75 mm, se mezclaron suavemente
5 \mul de solución de trabajo de Azul Trípano y 5 \mul de
células y las células se contaron en un mehacitómetro usando
iluminación convencional con luz blanca. Se contaron un mínimo de
500 células a los 3 minutos de la tinción.
Procedimiento de Selected Methods in Immunology
de Mishell y Shiigi, 1980, pág. 16-17.
Protocolo del citómetro de flujo: Las
células se analizaron en el citómetro de flujo Elite^{TM} (Coulter
Electronics, Inc.).
Las muestras se excitaron con un láser de argón a
488 nm y 15 mW de potencia. Los datos se recogieron basándose en el
tamaño y la granularidad para excluir glóbulos rojos, plaquetas y
residuos. La fluorescencia linear del tinte de la distribución
recogida se analizó usando células no pigmentadas como control. Se
registró el porcentaje de eventos positivos (células muertas) y la
fluorescencia media de la distribución de células muertas.
| Tiempo | Muestra | % Positivo (Células muertas) |
| 5 horas | P.I. | 2,5 |
| PTA | 2,2 | |
| Azul Trípano | 1,4 | |
| 27 horas | P.I. | 6,3 |
| PTA | 7,7 | |
| Azul Trípano | 4,8 | |
| 103 horas | P.I. | 26,8 |
| PTA | 19,1 | |
| Azul Trípano | 10,2 |
En un experimento, se usó PTA 24 para
cuantificar la hibridación cuando se tituló un oligonucleótido diana
con su pareja complementaria. Realizando también tres experimentos
simultáneos pero independientes, se realizó una comparación de la
tinción con bromuro de etidio, tinción con yoduro de propidio y
tinción con homodímero de etidio frente a PTA 24 como se
indica a continuación. Los resultados se pueden encontrar en la
Figura 15.
Las cadenas complementarias de ADN, ácido
oligodesoxitimidílico, d(pT)_{9} y ácido
oligodesoxiadenílico, (d(pA)_{9}) se obtuvieron de
Sigma Chemical Co. en St. Louis, MO. Se preparó una solución madre
de d(pA)_{9} con 5,0 unidades/0,5 ml de tampón TRIS
0,004 M, EDTA 0,001 M, pH 8,2. Para poli A, \epsilon = 8,4 AU/mM
cm o 8400 M^{-1}cm^{-1}; Por lo tanto, con 9 pares de bases
para d(pA)_{9}, la \epsilon es 75.600
M^{-1}cm^{-1}. Después, esta solución se diluyó 100 veces para
obtener una solución a 6,61x10^{-7}M o 0,66 \muM. La solución
madre de d(pT)_{9} se preparó a 25 unidades/5,0 ml y
se usó para la titulación después de la dilución 10 veces con el
mismo tampón. Como la \epsilon de poli T es 8,15 AU/mM cm o 8.150
M^{-1}cm^{-1} por par de bases o 73.350 M^{-1}cm^{-1} por
oligo, la concentración de la solución madre de oligo era de 6,8
\muM en las moléculas de ADN. Se realizó una titulación usando un
Espectrofotómetro de Fluorescencia Hitachi F-4010
usando cubetas desechadles de poliestireno de 4,0 ml para obtener un
espectro completamente corregido y una longitud de onda de
excitación de 488-550 nm (usando 488 nm para este
experimento) y una longitud de onda de emisión de
600-650 nm (usando 625 nm para este experimento). Se
añadieron equivalentes de d(pT)_{9} a los
siguientes incrementos: 0,020, 0,080, 0,150, 0,300, 0,500, 0,700,
1,000, 2,000 y 5,000 equivalentes. Cada muestra de la curva de
titulación se preparó individualmente dividiendo la solución madre
inicial de d(TA)_{9} en incrementos de 10 x 1,0 ml.
Después, se realizó la adición del complemento por medio de una
micropipeta, añadiendo una cantidad apropiada (2, 5, 8, 15, 30, 50,
70,100, 200 y 500 \mul, respectivamente) de solución madre de
d(pT)_{9} a cada serie de las 10 alícuotas. Cada
alícuota, que contenía progresivamente mayores relaciones molares de
las dos cadenas complementarias, se incubó a temperatura ambiente
durante 1 hora 45 minutos, y se añadió el tinte correspondiente en
forma de alícuotas de 100,0 \mul de una solución 15 \muM del
tinte correspondiente en solución tampón TRIS 0,004 M, EDTA 0,001 M,
pH 8,2. Esto corresponde a una relación tinte/par de bases de ADN de
1/4 en saturación con el oligo complementario. Las concentraciones
totales de tinte y oligo varían en el gráfico de saturación debido
al uso de distintas variaciones incrementales de la misma solución
madre. Después de un periodo adicional de incubación de 45 minutos
después de la adición del tinte apropiado correspondiente, se leyó
la intensidad relativa de fluorescencia a 625 nm y se registró para
generar una curva patrón que es directamente proporcional a la
cantidad de hibridación de dsDNA, o secuencia diana, en las mismas
condiciones. La fluorescencia de fondo, o fluorescencia residual
inicial, después se resta como una constante en todas las curvas
para la comparación de las distintas curvas de titulación en el
mismo gráfico.
Es evidente para los especialistas en la técnica
que la alta afinidad de unión del compuesto intercalador 24
de la presente invención es especialmente útil en relación a
intercaladores convencionales tales como bromuro de etidio (Figura
15). En la Figura 15, se muestra la sensibilidad de la respuesta a
la concentración de ds-DNA en presencia del
compuesto intercalador 24 en comparación con bromuro de
etidio, yoduro de propidio y homodímero de etidio. Cuando las
concentraciones de oligonucleótido son menores de 10^{-6}M, las
ventajas de tales intercaladores de alta afinidad son especialmente
evidentes.
En la comparación de PTA 24 con
intercaladores homobifuncionales tales como homodímero de etidio
(Figura 15), se observa otra vez una ventaja clara en la
sensibilidad. En este caso, la mayor sensibilidad puede estar
relacionada con la menor auto-inactivación en la PTA
24 así como en su alta afinidad por el ADN.
En la Figura 8 y Figura 9, la concentración de
dsDNA fue mayor y el diferencial entre el bromuro de etidio y PTA
24 (Figura 9) y el homodímero de etidio y PTA 24
(Figura 8) no fue significativo debido a la mayor concentración de
ADN usada.
En resumen, la presente invención ofrece ventajas
claras al permitir la detección de hibridación
ds-DNA a concentraciones mucho menores que los
métodos convencionales de tinción disponibles o conocidos
actualmente en la técnica.
El Intercalador de ADN 24 puede usarse
para cuantificar la hibridación cuando un oligonucleótido diana se
titula con su pareja complementaria.
Las cadenas complementarias de ADN, el ácido
oligodesoxitimidílico, d(pT)_{9} y el ácido
oligodesoxiadenílico, (d(pA)_{9}) pueden obtenerse
en Sigma Chemical Co. en St. Louis, MO. Se preparó una solución
madre de d(pA)_{9} a 5 unidades/ml de tampón TRIS
0,05 M, NaCl 0,2 N, EDTA 1 mM, pH 8,4 u otro tampón adecuado. Para
poli A, \epsilon = 8,4 AU/mM cm o 8400 M^{-1}cm^{-1}; por lo
tanto, con 9 pares de bases para d(pA)_{9}, la
\epsilon es 75.600 M^{-1}cm^{-1}. Esta solución madre después
se diluyó para obtener una solución madre de
0,066-66 \muM. La solución madre de
d(pT)_{9} se preparó a 25 unidades/5,0 ml y se usó
para la titulación sin dilución posterior con el mismo tampón. Como
la \epsilon de poli T es 8,15 AU/mM cm o 8.150 M^{-1}cm^{-1}
por par de bases o 73.350 M^{-1}cm^{-1} por oligo, la
concentración de la solución madre de oligo es 0,0068 - 660 \muM
en las moléculas de ADN. Se puede realizar una titulación usando un
Espectrofotómetro de Fluorescencia usando una longitud de onda de
excitación de 488-550 nm (la óptima es de alrededor
de 534) y una longitud de onda de emisión de 600-650
nm (óptima alrededor de 635). Se añadieron equivalentes de
d(pT)_{9} a los siguientes incrementos: 0,02, 0,05,
0,080, 0,150, 0,300, 0,500, 0,700, 1,00, 2,00, 5,00. Cada muestra
de la curva de titulación se preparó individualmente dividiendo la
solución inicial de d(pA)_{9} en alícuotas de 10 x
1,0 ml. Después, la adición del complemento se realizó añadiendo
por medio de una micropipeta una cantidad apropiada (2, 5, 8, 15,
30, 50, 70,100, 200 y 500 \mul, respectivamente) de solución madre
de d(pT)_{9} a cada serie de las 10 alícuotas cuando
la solución madre de d(pT)_{9} es 10 veces la
concentración de la solución madre de d(pA)_{9}.
Cada alícuota, obteniendo progresivamente mayores relaciones
molares de las dos cadenas complementarias, se incubó a temperatura
ambiente durante 0,25-2,5 horas, el tinte se añadió
como alícuotas de 1-500 \mul de una solución madre
1-1000 \muM del tinte en solución tampón TRIS
0,05 M, NaCl 0,2 N, EDTA 1 mM, pH 8,4 u otro tampón adecuado. Esto
corresponde a una relación tinte/par de bases de ADN de 1/1 - 1/1000
en saturación con el oligo complementario. Las concentraciones
totales de tinte y oligo varían en el gráfico de saturación debido
al uso de adiciones incrementales variadas de la misma solución
madre. Después de un periodo adicional de incubación de 15 minutos,
la intensidad relativa de fluorescencia se leyó a una longitud de
onda comprendida entre 625 nm y 680 nm y se registró para generar
una curva patrón que es directamente proporcional a la cantidad de
hibridación de dsDNA, o secuencia diana, en estas condiciones.
Usando el procedimiento descrito anteriormente en
el EJEMPLO 11, el compuesto intercalador 24 puede usarse para
determinar la cantidad de hibridación de cualquier otra cepa de ADN
complementaria sustituyendo d(pT)9 por el ADN
complementario apropiado y sustituyendo d(pA)9 por el
ADN diana apropiado en concentraciones apropiadas que determina el
especialista en la técnica y dependiendo del grado de regiones
complementarias esperadas como determina el especialista en la
técnica. En cada caso, se puede usar la longitud de onda de
excitación de 450-550 nm (la óptima es 534 nm) y
después se lee la intensidad relativa de fluorescencia entre
580-680 nm y se registra para generar una curva
patrón que es directamente proporcional a la cantidad de hibridación
de dsDNA, o secuencia diana, en estas condiciones.
Las cadenas complementarias de oligonucleótidos,
con 14 a 20 unidades con sentido y antisentido, pueden sintetizarse
en un sintetizador de ADN totalmente automatizado y purificarse como
se describe en Bioconjugate Chemistry, 4, pág.
94-102, (1993). La síntesis del conjugado entre la
enzima fosfatasa alcalina intestinal de ternero e IgG puede
realizarse como se indica a continuación.
Se disuelve PTA 24, 0,100 g (2,3x10^{-4}
moles) en 5 ml de DMF (dimetilformamida) acuosa al 50%. El engarce
heterobifuncional de 30 átomos,
4-[(N-maleimidometil)tricaproamido-ciclohexano-1-carboxilato
(SMTCC) 0,157 g, (2,3x10^{-4} moles) se sintetiza como se
describe en Bieniarz et al., Patentes de Estados Unidos Nº
4.994.385, 5.002.883, 5.053.520 y 5.063.109 en 3 ml de DMF y se
añade en una porción a la solución y se agita durante 24 horas a
temperatura ambiente. La PTA 24 derivatizada con maleimida
resultante se purifica en columna de gel de sílice usando acetona
metanólica al 10% como eluyente.
La fosfatasa alcalina intestinal de ternero, 6 mg
(4x10^{-9} moles) en 1 ml de tampón PBS se tiola por tratamiento
con un exceso molar de 450 veces de imiotiolato (164 ml de una
solución de 15 mg/ml en tampón PBS) durante 30 minutos a temperatura
ambiente. El exceso de reactivo se retira por exclusión molecular
con una columna Sephadex G-25 (1x45 cm) equilibrada
con tampón PBS. Las fracciones que contienen la enzima derivatizada
se reúnen y la concentración de la enzima se calcula por absorbancia
a 280 nm.
La fosfatasa alcalina intestinal de ternero
tiolada de la parte b) y la PTA 24 derivatizada con
maleimida de la parte a) se combinan con una relación molar 1:1 y se
incuban durante 18 horas a 5ºC. Los grupos tiol que no han
reaccionado se protegen por adición de N-etilmaleimida 5 mM a
una concentración final de 0,3 mM seguido de incubación durante 1
hora a temperatura ambiente.
La introducción de localización específica de
tiolatos en la región Fc de IgG se realiza como se describe en
Bieniarz et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.191.066. De
esta forma, se introducen entre 4 y 10 tiolatos en la región Fc de
la IgG.
La IgG tiolada con Fc de la parte d) y la PTA
24 derivatizada con maleimida de la parte a) se combinan con
una relación molar de 1:5 de IgG tiolada con PTA 24
derivatizada con SMTCC. La solución se incuba en tampón fosfato pH
7,0 durante 18 horas a 5ºC y el conjugado se purifica en una columna
de exclusión molecular Sephadex G-25. Las fracciones
que contienen proteínas se juntan y se concentran usando un
concentrador Amicon. El contenido en proteínas de la solución final
se establece usando un Ensayo de Unión con Tinte Coomassie, de
Pierce Company.
Las cadenas complementarias de los
oligonucleótidos se hibridan y examinan como se describe en
Bioconjugate Chemistry, 4, pág. 94-102,
(1993). La IgG derivatizada con PTA 24 de la parte e), la
fosfatasa alcalina intestinal de ternero derivatizada con PTA
24 y el oligonucleótido bicatenario de 20 unidades usando
como plantilla de conjugación se incuban durante una noche a pH 7,0
durante 18 horas en una relación molar de 1:1:1 a temperatura
ambiente. El conjugado se filtra a través de una columna de
exclusión molecular G-25. Las fracciones se analizan
para detectar la actividad fosfatasa alcalina usando el sustrato
fluorogénico fosfato de 4-metilumbeliferilo y para
detectar la actividad del anticuerpo usando la IgG antiidiotípica
marcada con fluoresceína.
El conjugado también se examina por columnas de
HPLC de exclusión molecular.
La preparación de los liposomas se realiza como
se describe en Fiechtner et al., Patente de Estados Unidos nº
4.912.208. Estos liposomas presentan aminas primarias en sus
superficies porque se preparan con lípidos de
difosfatidiletanolamina. La preparación de los liposomas se realiza
en presencia de tintes fluorescentes impermeables a la membrana
descritos en la Patente de Estados Unidos nº 4.912.208. De esta
forma, las moléculas de los tintes fluorescentes están, a
concentraciones muy altas auto-inactivantes, dentro
de los liposomas y por consiguiente no son fluorescentes. Las
aminas de la superficie de los liposomas se derivatizan con tiolatos
esencialmente por el mismo método usado para introducir tiolatos en
la fosfatasa alcalina descrito en el Ejemplo 13. La PTA 24
se derivatiza con maleimidas, utilizando el reactivo SMTCC, como se
describe en el Ejemplo 13. Los liposomas derivatizados con tiolatos
y la PTA 24 derivatizada con maleimida se incuban juntos en
un recipiente en condiciones esencialmente idénticas a las
descritas en el Ejemplo 13. Los liposomas que contienen tinte
fluorescente derivatizados con múltiples intercaladores se incuban
a un pH en el intervalo de 5 a 9, preferiblemente 7,0, conteniendo
la muestra pequeñas concentraciones de ADN bicatenario recubierto o
inmovilizado en una fase sólida. Después de la incubación se realiza
el lavado y adición de detergente. La lisis concomitante de la
membrana del liposoma tiene como resultado el derrame del tinte
fluorogénico, la activación de la fluorescencia y la aparición de
señal.
Como alternativa, el ADN sonda multimérico
monocatenario puede inmovilizarse en una fase sólida; la muestra del
paciente de la que se sospecha que contiene un ADN monocatenario
complementario se incuba en presencia de la sonda; el
intercalador-liposoma se pone en contacto con la
muestra hibridada y el contenido del recipiente se incuba y se lava
varias veces para retirar el exceso de liposomas derivatizados con
PTA 24. Si la sonda encuentra una secuencia complementaria en
la muestra del paciente, la adición del detergente tiene como
resultado la lisis de los liposomas y la obtención de señal. Sin
embargo, si la sonda y la muestra de ADN del paciente no son
complementarias, no está presente ADN bicatenario y sustancialmente
todo el liposoma derivatizado con PTA 24 se retira de la fase
sólida, no obteniendo señal.
La síntesis del intercalador funcionalizado con
maleimida puede efectuarse mediante el procedimiento ya descrito en
el Ejemplo 13.
Una entidad que genera una señal apropiada tal
como ficoeritrina o aloficocianina se une covalentemente a este
intercalador derivatizado con maleimida mediante un tiolato en la
proteína tiolada preparada como se ha descrito en el Ejemplo 13.
Después de dejar tiempo para la unión de la porción de intercalador
del conjugado con la molécula inmovilizada de ds-DNA
y lavar el conjugado no unido, se detecta ADN bicatenario en la fase
sólida u otra entidad inmovilizada usando la fluorescencia de la
ficoeritrina localizada por la unión de la porción de intercalador
con la molécula de ADN bicatenario. La emisión de fluorescencia se
lee a aproximadamente 580 nm usando métodos que conocen los
especialistas en la técnica mientras se excita la proteína
fluorescente a una longitud de onda apropiada para la excitación
eficaz tal y como determina un especialista en la técnica.
La síntesis del intercalador funcionalizado con
maleimida puede efectuarse mediante el procedimiento ya descrito en
el Ejemplo 13.
Una entidad que genera una señal apropiada tal
como fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa,
esterasa o \beta-lactamasa se une covalentemente a
este intercalador derivatizado con maleimida mediante un tiolato de
la proteína tiolada preparada como se ha descrito en el Ejemplo 13.
Después de dejar tiempo para la unión de la porción de intercalador
del conjugado con la molécula inmovilizada de
ds-DNA y lavar el conjugado no unido, se detecta el
ADN bicatenario en la fase sólida u otra entidad inmovilizada tal
como un coloide o micropartícula por fluorescencia o
quimioluminiscencia producida por la conversión de un sustrato no
fluorescente o no quimioluminiscente de la enzima apropiada en una
entidad fluorescente o quimioluminiscente respectivamente tal y como
determina un especialista en la técnica. Después, la emisión de
fluorescencia o quimioluminiscencia se lee a la longitud de onda
apropiada usando métodos convencionales de excitación de
fluorescencia o detección de quimioluminiscencia respectivamente que
conocen los especialistas en la técnica.
La síntesis del intercalador funcionalizado con
maleimida puede efectuarse mediante el procedimiento ya descrito en
el Ejemplo 13.
Una entidad que genera una señal activable
quimioluminiscente apropiada tal como sulfonamida de acridinio se
une covalentemente a este intercalador por el tiolato de la entidad
quimioluminiscente que se prepara de forma que reacciona hacia la
maleimida tal como puede concebir un especialista en la técnica.
Después de la unión del ds-DNA con el conjugado
intercalador - quimioluminóforo, el conjugado en exceso o no unido
se lava y el ADN bicatenario se retira de la fase sólida u otra
entidad inmovilizada por quimioluminiscencia directa provocada por
la adición de un reactivo de activación apropiado tal como peróxido
de hidrógeno que genera una entidad quimioluminiscente y después se
lee la quimioluminiscencia a las longitudes de onda apropiadas
usando métodos convencionales de detección de quimioluminiscencia
tales como los que conocen los especialistas en la técnica.
Claims (10)
1. Un compuesto que tiene la fórmula
en la que A es un contraión monovalente
aceptable.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que
dicho A^{-} es cloruro.
3. Un método para detectar un ácido nucleico
diana en una muestra, comprendiendo dicho método:
(a) proporcionar una mezcla de reacción de
amplificación que comprende dicha muestra, un agente de unión al ADN
de la reivindicación 1 ó 2, donde dicho agente proporciona una señal
detectable cuando se une a un ácido nucleico bicatenario, señal que
es distinguible de la señal proporcionada por dicho agente cuando
no esta unido, y reactivos para la amplificación;
(b) determinar la cantidad de dicha señal
producida por la mezcla de la etapa (a);
(c) tratar dicha mezcla en condiciones para
amplificar dicho ácido nucleico diana;
(d) determinar la cantidad de dicha señal
producida por dicha mezcla de la etapa (c); y
(e) determinar si ha tenido lugar la
amplificación.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho agente de unión a ADN es un agente de intercalación y es un
tinte fluorescente.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que el agente de unión al ADN se caracteriza
adicionalmente por proporcionar una cantidad de señal fluorescente
detectable cuando dicho agente se une a ácidos nucleicos
bicatenarios mayor que la cantidad de dicha señal fluorescente
detectable producida cuando dicho agente no está unido.
6. Uso de un agente de intercalación que
comprende el compuesto de la reivindicación 1 ó 2 para la separación
y aislamiento o purificación de ácidos nucleicos de muestras
biológicas o clínicas complejas.
7. Un método para determinar una o más
características de células usando citometría de flujo que
comprende:
mover las células, sustancialmente una a una, en
una corriente líquida, incluyendo dichas células un marcador
fluorescente que es el compuesto de la reivindicación 1 ó 2;
dirigir un haz de luz incidente a las células en
dicha corriente para excitar al marcador fluorescente;
identificar las células que tienen propiedades
fluorescentes detectando la fluorescencia emitida por las células
que se mueven en la corriente; y
usar dicha fluorescencia detectada para
determinar una o más características de dichas células.
8. Uso de un agente de intercalación que
comprende un compuesto de la reivindicación 1 ó 2 para la captura de
ADN en fase sólida por dicho compuesto.
9. Un agente de intercalación que comprende un
compuesto de la reivindicación 1 ó 2 para uso como un agente
terapéutico para la inserción en el ADN.
10. Una fase sólida modificada por un compuesto
de la reivindicación 1 para la captura de ADN en fase sólida por
dicho compuesto.
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