ES2218448T3 - Productos de ciclizado de tocotrienolquinona con accion antihiperecolesterol. - Google Patents
Productos de ciclizado de tocotrienolquinona con accion antihiperecolesterol.Info
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Abstract
Compuestos de la fórmula I donde R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí, representan H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono; en forma estereoisómera pura, o como mezclas de estereoisómeros.
Description
Productos de ciclizado de tocotrienolquinona con
acción antihipercolesterol.
La acumulación de colesterol en la circulación, o
bien el alto nivel de colesterol y LDL-colesterol
en plasma como consecuencia de una alimentación, que presenta un
contenido elevado en ácidos grasos saturados y colesterol, se
correlaciona con la incidencia de la enfermedad cardiaca coronaria.
Esta es una de las más frecuentes causas de muerte en las naciones
industriales. La hipercolesterolemia juega también un papel causal
en la patogénesis de arteriosclerosis, cáncer de hígado,
xantomatosis, y muchas otras enfermedades.
Los inhibidores de la biosíntesis de colesterina
eficaces, empleados en medicina, son las estatinas, como
atorvastatina, fluvastatina, cerivastatina, lovastatina,
mevastatina, prevastatina y sinvastatina. Además, los productos
activos alicina y ajoenos, contenidos en el extracto de ajo, la
luteolina contenida en el extracto de alcachofa, así como también
fibras, y el derivado de piperizina BM 15.766, muestran una acción
reductora de colesterol (Gebhardt, R. et al. (1994) Bochim.
Biophys. Acta 1213: 57-63; Gebhardt, R. (1998) J.
Pharmacol. Exp. Therap. 286: 1122-1128; Aufenanger,
J. et al. (1985) Biochem. Pharmacol. 35(6):
911-916). También el aceite de palma se distingue
por una acción reductora de colesterol, a pesar de su elevado
contenido en ácidos grasos saturados. En el aceite de palma están
contenidos tocoferoles (como por ejemplo la vitamina E), y
tocotrienoles, que se hicieron responsables de esta acción (US
5,217,992). Los tocoferoles y los toctrienoles se diferencian, en
primer término, porque los tocoferoles poseen una cadena lateral
saturada, por el contrario los tocotrienoles poseen una cadena
lateral insaturada, que es responsable respectivamente del enlace
en lipoproteínas y en membranas (Hood, R.L. (1998) Phytochemicals,
33-41). Debido a su acción antioxidante, se emplean
tocoferoles como agentes para la profilaxis ante daños por oxidación
del músculo, de la piel, de los cabellos, del sistema inmunitario,
y en fumadores. Además, se emplean los mismos como
anticancerígenos, como capturadores de nitrito, por ejemplo en
jamón ahumado, y en la medicina veterinaria
(Römpp-Lexikon Chemie (1999), editorial Georg
Thieme, Stuttgart, 4572-4573). No obstante, no
ejercen influencias sobre el metabolismo de lípidos, a pesar de
que, durante mucho tiempo, se asignó a la vitamina E la acción de
impedir la oxidación de LDL-colesterol. Por el
contrario, los tocotrienoles contenidos en el aceite de palma pueden
reducir el nivel de colesterol en plasma. La acción inhibidora, por
ejemplo, de \gamma-tocotrienol sobre la síntesis
de colesterol se efectúa mediante un farnesilado directo de HMGR o
mediante una inhibición por retroalimentación de HMGR a través de
una proteína farnesilada (Guthrie, N. y K.K. Caroll (1998), Biol.
Oxidants and Antioxidants: Molecular Mechanisms and Health Effects,
Champaign, AOCS Press, 257-264; Qureshi, N. (1993)
Vitamin E in Health and Disease, 247-267). Una
composición de \gamma-tocotrienol y lovastatina,
que actúa a través de otro mecanismo independiente, y cuya acción es
aditiva de este modo, es aún más efectiva. Para la determinación de
la influencia de un producto activo sobre la velocidad de síntesis
del colesterol se recurre a un ensayo in vitro, en el que,
en el caso de inhibición de HMGR, mediante
\gamma-tocotrienol, se llega a una incorporación
de acetato ^{14}C reducida en la fracción de microsomas a partir
de células HepG2.
El aceite de palma y los tocotrienoles contenidos
en el mismo poseen, por lo tanto, una acción ventajosa, reductora,
sobre el nivel de colesterol y LDL-colesterol en
plasma en aves y mamíferos, sin influir sobre el nivel de HDL.
Además, los tocotrienoles reducen el nivel de
apolipoproteína-B, igualmente una medida del nivel
de colesterina en la sangre (Brown et al. (1980), J. Lipid
Res. 21: 505-517). La US 5,318,993 describe un grupo
de substancias de análogos de tocotrienol sintéticos, quinonas de
anillo abierto, que se producen tras oxidación de tocotrienoles, y
que se distinguen por una eficacia elevada en comparación con
tocotrienoles in vitro (incorporación de acetato ^{14}C en
la fracción de microsomas a partir de células HepG2) e in
vivo (nivel de colesterol y LDL-colesterol en
gallinas).
La acción profiláctica de tocotrienoles en la
arteriosclerosis se basa, además de la acción reductora de
colesterol, en la inhibición de la agregación de plaquetas. De este
modo, en el caso de administración de tocotrienol reducen el nivel
de plasma de tromboxano B2, y el factor de coagulación IV (Wright
et al., A Symposium in Drugs Affecting Lipid Metabolism,
Houston, Texas (Nov. 1989); Papas, A. M. (1999), CRC, Boca Raton,
Florida, páginas 189-210).
Además se asigna a los tocotrienoles una acción
anticancerígena. De este modo, el aceite de palma es capaz de
impedir la producción de carcinomas hepáticos, mientras que una
deficiencia de tocotrienoles en tejidos grasos aumenta la
incidencia de cáncer de pecho y piel. La acción anticacerígena de
tocotrienoles en el caso de cáncer de hígado se basa igualmente en
la inhibición de la síntesis de colesterol, y con ello en una
acción inhibidora de crecimiento y proliferación, que se
identificó, por ejemplo, en células A549 (Hood, R. L. (1998),
Phytochemicals, 33-51; Watkins, T. R. et al.
(1999), CRC, Boca Raton, Florida, 479-496; Bennis
F. et al. (1993), Int. J. Cancer 55:
640-645). No obstante, juega un papel más decisivo
para la acción anticancerígena de los tocotrienoles su grupo
6'-OH, que actúa como capturador de radicales
debido a sus propiedades antioxidantes. Además, los tocotrienoles
inhiben la proteína quinasa C, que puede estar implicada, por
ejemplo, en el desarrollo de tumores, proliferación y diferenciación
celular, agregación de plaquetas y liberación de radicales. Por
último, presumiblemente a través de un farnesilado, se impide su
carácter cancerígeno (Hood, R. L. (1998), Phytochemicals,
33-51; Watkins, T. R. et al. (1999), CRC,
Boca Raton, Florida, 479-496). Debido a estas
propiedades anticancerígenas se pueden emplear tocotrienoles en
combinación con tamoxifeno y hesperatina (flavonoides), de manera
eficaz para la profilaxis y terapia de tumores (Hood, R. L. (1998),
Phytochemicals, 33-51, Guthrie, N. and K.K. Caroll
(1998), Biol. Oxidants and Antioxidants, Molecular Mechanism and
Health Effects, Champaign, AOCS-Press,
257-264).
A pesar de que las quinonas de anillo abierto
muestran una acción mejorada frente a los tocotrienoles que se
presentan en la naturaleza (US 5,318,993), se planteó el problema
de poner a disposición análogos sintéticos a un más eficaces.
Sorprendentemente se solucionó este problema
mediante puesta a disposición de productos sintéticos de ciclizado
de tocotrienolquinona, denominados a continuación como productos de
ciclizado, con una eficacia elevada en comparación con
\gamma-tocotrienol, o las quinonas de anillo
abierto. Sobre todo, era especialmente sorprendente el hecho de que
los productos de ciclizado según la invención desarrollaran una
eficacia significativamente elevada ya a concentraciones reducidas
de 10^{-6} a 10^{-5} M (mol/l).
La invención se refiere en especial a compuestos
de la fórmula I
representando
R^{1}, R^{2}, R^{3}y R^{4},
independientemente entre sí, H o alquilo con 1 a 6 átomos de
carbono; representando
R^{1} preferentemente H o CH_{3}, de modo
especialmente preferente H;
R^{2} preferentemente H o CH_{3}, de modo
especialmente preferente, CH_{3};
R^{3} preferentemente CH_{3}, y
R^{4} preferentemente H o CH_{3}; en forma
esterioisómera pura, o como mezcla de estereoisómeros. Además,
R^{1} puede representar halógeno, en especial Cl.
Alquilo con 1 a 6 átomos de carbono comprende
metilo, etilo, n- e i-propilo, n-, i- y
t-butilo, así como n-pentilo y
n-hexilo, y sus análogos ramificados.
La invención comprende en especial también ambos
diastereómeros (polar/apolar) así como los enantiómeros de
compuestos de la fórmula I. El diastereómero polar se distingue
porque se eluye por una columna de gel de sílice, mediante una
mezcla de disolventes, constituidos principalmente por un alcano,
más lentamente que el diastereómero apolar.
Además es objeto de la invención un procedimiento
para la obtención de un compuesto de la fórmula I, caracterizado
porque se hace reaccionar una tocotrienolquinona de la fórmula
III,
donde R^{1} a R^{4} poseen los significados
indicados en la fórmula I, en presencia de un catalizador, para dar
un compuesto de la fórmula I. En este caso, se obtiene el producto
de ciclizado de tocotrienolquinona correspondiente a la
tocotrienolquinona empleada, es decir, los restos R^{1} a R^{4}
son predeterminados por la tocotrienolquinona
empleada.
Los catalizadores preferentes son carbonatos
alcalinos, a modo de ejemplo carbonato sódico y potásico, es
especialmente preferente carbonato de cesio. A tal efecto se
disuelven y se hacen reaccionar 10 a 200 g/l, preferentemente 100
g/l, de una tocotrienolquinona de la fórmula III y 5 a 15 g/l,
preferentemente 10 g/l de uno de los catalizadores citados
anteriormente en un disolvente orgánico, preferentemente cloruro de
metileno.
Se puede efectuar la reacción en recipientes de
reacción de uso común, preferentemente reactores de vidrio, bajo
empleo de dispositivos de agitación y mezclado habituales. Se
seleccionará el tiempo de reacción de modo que se llegue a una
reacción completa de tocotrienolquinona para dar el correspondiente
producto de ciclizado, preferentemente 1 a 6 horas. La reacción se
efectúa, aproximadamente a 10 hasta 100ºC, preferentemente a 20
hasta 50ºC. A continuación se puede conseguir una separación de
fases, a modo de ejemplo, mediante adición de
n-heptano (en proporción 2: 1, referido al volumen
de la disolución de partida) y una disolución de hidrógenosulfato
sódico al 10% (en proporción 1: 1, referido al volumen de disolución
de partida), pudiéndose encontrar el producto de ciclizado y los
componentes secundarios producidos en la reacción en la fase
orgánica.
La disolución de reacción, o bien la fase
orgánica preferente, se puede concentrar por evaporación para la
purificación subsiguiente del producto de ciclizado, por ejemplo
tras secado sobre sulfato sódico, y purificar adicionalmente, por
ejemplo, mediante cromatografía.
A modo de ejemplo, se puede separar el producto
deseado de componentes secundarios con ayuda de una columna de gel
de sílice. En este caso, como se menciona anteriormente, el
diastereómero polar se eluye por la columna, a través de un
disolvente constituido principalmente por un alcano, más lentamente
que el diastereómero apolar. Mediante este procedimiento
cromatográfico correspondiente se consigue una separación parcial o
completa de ambos diastereómeros. No obstante, esto no es siempre
necesario, ya que ambos diastereómeros presentan una acción
reductora de colesterol elevada.
La tocotrienolquinona de la fórmula III, empleada
en el procedimiento según la invención, se puede obtener en un
procedimiento de síntesis que parte del procedimiento descrito
según la invención, una oxidación de reacción, a partir del
correspondiente tocotrienol de la fórmula II
donde R^{1} a R^{4} poseen los significados
indicados en la fórmula I. Los restos R^{1} a R^{4} de la
tocotrienolquinona resultante son predeterminados por el
tocotrienol empleado. Se pueden obtener por vía sintética, o aislar
tocotrienoles a partir de fuentes naturales (Khor H. T. y J.Y. Lai
(1991), Biologic Oxidants and Antioxidants, AOCS Press,
267-273; Goh S.H. et al. (1991) Biologic
Oxidants and Antioxidants, AOCS Press, 274-283;
Qureshi N. (1993), Vitamin E in Health and Disease,
247-267). La reacción de tocotrienol para dar
tocotrienolquinonas se efectúa mediante adición de una disolución
acuosa de un agente oxidante, seleccionado entre sales de cerio (IV)
o sales de hierro (III), preferentemente nitrato amónico de cerio
(IV) o nitrato amónico de hierro (III) en una concentración, a modo
de ejemplo, de 2 a 5 moles de agente oxidante/mol de tocotrienol,
preferentemente 2 a 3 moles/mol. La reacción se puede efectuar en
todos los recipientes de reacción de uso común, a temperatura
ambiente, en un tiempo de reacción de 0,5 a 8 horas, preferentemente
1
hora.
Además, las reacciones según la invención,
descritas anteriormente, se llevan a cabo de modo preferente en una
atmósfera de gas inerte, como por ejemplo bajo nitrógeno.
También es objeto de la invención el empleo de
compuestos de la fórmula I como complemento alimenticio. De este
modo, los productos de ciclizado pueden estar contenidos en comidas
y bebidas, o bien se pueden ingerir antes, durante, o después de la
comida, a modo de ejemplo en preparados en combinación con otros
agentes de complemento alimenticio.
La presente invención comprende además compuestos
de la fórmula I para la aplicación médica.
Los productos de ciclizado según la invención
encuentran empleo en la obtención de medicamentos y complementos
alimenticios para la reducción del nivel de colesterol en plasma en
aves y mamíferos, en especial en hombres. De este modo, se aplican
medicamentos según la invención en la medicina humana y
veterinaria, y sobre la base de los productos de ciclizado según la
invención se pueden obtener medicamentos que se pueden emplear para
el tratamiento de enfermedades en relación con hipercolesterolemia.
Además, también se pueden emplear medicamentos según la invención
para la prevención de tales enfermedades.
La base de la eficacia es, posiblemente, la
acción inhibidora de los productos de ciclizado según la invención
sobre la
3-hidroxi-3-metilglutaril-
CoA-reductasa (HMGR), el enzima que determina la
velocidad de biosíntesis de colesterol.
Además, los productos de ciclizado encuentran
empleo en la obtención de medicamentos y complementos alimenticios
para el tratamiento y para la prevención de enfermedades
cancerosas.
También son objeto de la invención agentes
farmacéuticos que comprenden una cantidad eficaz desde el punto de
vista farmacéutico de al menos un compuesto de la fórmula I según
la invención, y al menos un soporte compatible desde el punto de
vista farmacéutico. Dependiendo de la forma de dosificación
deseada, el soporte se puede presentar en forma sólida o líquida.
Los soportes preferentes son almidón, lactosa, sucrosa y aceites de
mesa.
Los medicamentos y complementos alimenticios
según la invención comprenden también composiciones o preparados en
combinación de productos de ciclizado con otros productos activos.
Ventajosamente, de este modo se pueden reducir las dosificaciones
de productos activos aislados.
Para el empleo de productos de ciclizado para la
obtención de un medicamento para el tratamiento de prevención de
enfermedades, en relación con hipercolesterolemia, son preferentes
composiciones o preparados en combinación. Tales preparados en
combinación pueden contener otros inhibidores de HMGR, para cuya
acción inhibidora sirve como base un mecanismo comparable o
diferente, y por este motivo, es de esperar una eficacia elevada.
Por consiguiente, las composiciones según la invención pueden
contener, a modo de ejemplo, atorvastatina, fluvastatina,
cerivastatina, lovastatina, mevastatina, prevastatina,
sinvastatina, SRI-62320, probucol, niacina (ácido
nicotínico), alicina, ajoenos, luteolina, BM 15.766, isoflavonas,
curcumina, fitosteroles, n-3 PUFA, probióticos y
fibras reductoras de colesterol, y sus derivados y conjugados, por
separado, o en combinación, como productos activos adicionales.
Para el empleo de los productos de ciclizado según la invención para
la obtención de un medicamento para el tratamiento y prevención de
enfermedades cancerosas, son preferentes composiciones o preparados
en combinación que contienen los productos activos tamoxifeno, y
flavonoides, como hesperatina o similares.
Los medicamentos, composiciones y preparados en
combinación según la invención se pueden presentar en forma de
comprimidos, granulados, polvos, grageas, pastillas, aglomerados en
bolas, cápsulas, conos, geles, disoluciones, emulsiones y
suspensiones para la administración enteral y parenteral. Además,
los compuestos según la invención pueden estar contenidos en geles,
lociones, y cremas para la aplicación cutánea. Los productos de
ciclizado pueden estar contenidos también como complementos
alimenticios en comidas y bebidas, o bien presentarse como
preparados en combinación con otros complementos alimenticios en la
forma citada anteriormente. Se puede administrar el producto de
ciclizado de gamma-tocotrienol en una dosificación
de 0,5 a 2000 mg/d, pero también en dosificaciones más elevadas o
más reducidas. La dosificación exacta y el tipo de tratamiento
dependerá del estado del paciente, de la gravedad y del desarrollo
de la enfermedad, así como de la disposición del paciente para esta
enfermedad, y se determinará exactamente, de modo apropiado, por el
médico asistente. Es válida una analogía para el empleo en la
medicina veterinaria.
Ahora se describe más detalladamente la invención
en los siguientes ejemplos no limitantes, y bajo referencia a
figuras adjuntas. En este caso muestra
La figura 1 la incorporación de acetato ^{14}C
en células HepG2 en el caso de concentración creciente de
R-\gamma-tocotrienol
La figura 2 la incorporación de acetato ^{14}C
en células HepG2 en el caso de concentración creciente de
\gamma-tocotrienolquinona
La figura 3 la incorporación de acetato ^{14}C
en células HepG2 en el caso de concentración creciente de
\alpha-tocotrienolquinona
La figura 4 la incorporación de acetato ^{14}C
en células HepG2 en el caso de concentración creciente del
diastereómero polar del producto de ciclizado, donde R^{1}
representa H y R^{2}, R^{3} y R^{4} representa respectivamente
CH_{3} (producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona),
La figura 5 la incorporación de acetato ^{14}C
en células HepG2 en el caso de concentración creciente del
diastereómero apolar del producto de ciclizado, donde R^{1}
representa H y R^{2}, R^{3} y R^{4} representa
respectivamente CH_{3} (producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona),
La figura 6 la incorporación de acetato ^{14}C
en células HepG2 en el caso de concentración creciente de la mezcla
de diastereómeros del producto de ciclizado, donde R^{1}
representa H y R^{2}, R^{3} y R^{4} representa
respectivamente CH_{3} (producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona).
El siguiente ejemplo explica la síntesis del
compuesto según la invención, sin limitarla.
En un matraz de vidrio de 6 litros con agitador
de disco, refrigerante, embudo de goteo y termómetro, se disolvió,
bajo protección de N_{2},
R-\gamma-tocotrienol
(gamma-T3, 100,0 g/0,24 mol) en etanol para análisis
(4.800 ml). A esta disolución se añadió, a temperatura ambiente,
nitrato amónico de cerio (IV) (307,2 g/0,56 mol), disuelto en agua
destilada (400 ml). Se agitó esta mezcla 1 hora a temperatura
ambiente, y se extrajo una muestra de DC. Esta mostró conversión
completa de
R-\gamma-tocotrienol.
Después se distribuyó la carga entre
n-heptano (800 ml) y agua destilada (8.000 ml). Se
separaron las fases, y se extrajo la fase acuosa una vez más con
n-heptano (800 ml).
Se reunieron las fases orgánicas, y se lavaron
dos veces con agua destilada (2.000 ml). Para la mejor separación
de fases se añadió en el segundo lavado ácido acético para análisis
(aproximadamente 3 ml/ca, 0,05 mol). A continuación se secó la fase
orgánica sobre sulfato sódico. Mediante concentración por
evaporación completa en un evaporador rotativo se obtuvo un
\gamma-tocotrienolquinona (104,5 g). Se hizo
reaccionar esta adicionalmente como sigue.
Se reunieron y se agitaron a reflujo en un
reactor de vidrio de 4 litros, con refrigerante, agitador de disco,
y termómetro, bajo protección de N_{2},
\gamma-tocotrienolquinona (104,5 g), carbonato de
cesio (Cs_{2}CO_{3}, 10,0 g/0,03 mol) y cloruro de metileno
(CH_{2}Cl_{2}, 1.000 ml). Después de 5 horas se extrajo una
muestra de DC. Esta mostraba conversión sensible, pero también
componentes secundarios.
Se añadieron n-heptano (2.000 ml)
y disolución de hidrógenosulfato sódico al 10% (1.000 ml/0,83 mol),
y se agitaron brevemente con índice de revoluciones elevado. A
continuación se separaron las fases, y se lavó la fase orgánica dos
veces más con agua destilada (1.000 ml). Después se secó la fase
orgánica sobre sulfato sódico, y se obtuvo el producto de ciclizado
de \gamma-tocotrienolquinona (100,7 g) mediante
concentración por evaporación completa en un evaporador
rotativo.
Se cromatografió los mismos completamente a
través de una columna de gel de sílice Flash 150 de la firma
Biotage. Se utilizó como agente eluyente acetato de etilo al 6% en
n-heptano. Tras concentración por evaporación
completa de las fracciones principales (control por DC) en el
evaporador rotativo se obtuvo el producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona (0,12 mol; 49,4 g). Un
DC del producto final mostró sólo ambos diastereómeros y ningún
otro producto secundario. Separación de diastereómeros: del mismo
modo se separaron completamente por medio de evaporador rotativo
dos fracciones secundarias de cromatografía, que contenían
respectivamente sólo uno de ambos diastereómeros. De este modo se
obtuvo diastereómero apolar (0,82 g; valor RF: 0,39) (agente
eluyente: 30% de MTB/n-heptano); valor de rotación
[\alpha]^{25}_{D}: +2,0º (c=1, etanol)) y
diastereómero polar (0,86 g; valor RF: 0,35 (agente eluyente: 30%
de MTB/n-heptano); valor de rotación
[\alpha]^{25}_{D}: -40,0º (c=1, etanol)).
Datos de ^{13}C-NMR de ambos
diastereómeros (en CDCl_{3}/DMSO-d_{6} 1: 4):
desplazamiento químico en \delta ppm (TMS), multiplicidad (S =
singlete, D = doblete, T = triplete, Q = cuadruplete).
| 1. | 85,14 S | 7. | 144,24 S | 13. | 134,08 S | 19. | 26,14 T | 25. | 17,50 Q |
| 2. | 35,83 T | 8. | 144,82 S | 14. | 39,37 T | 20. | 124,17 D | 26. | 25,97 Q |
| 3. | 32,82 T | 9. | 196,68 S | 15. | 26,35 T | 21. | 130,46 S | 27. | 12,53 Q |
| 4. | 85,25 S | 10. | 40,33 T | 16. | 123,94 D | 22. | 25,51 Q | 28. | 13,12 Q |
| 5. | 50,43 T | 11. | 22,92 T | 17. | 134,23 S | 23. | 15,69 Q | ||
| 6. | 195,13 S | 12. | 124,17 D | 18. | 39,37 T | 24. | 15,76 Q |
| 1. | 85,25 S | 7. | 144,24 S | 13. | 134,24 S | 19. | 26,14 T | 25. | 17,50 Q |
| 2. | 36,11 T | 8. | 144,62 S | 14. | 39,37 T | 20. | 124,17 D | 26. | 26,68 Q |
| 3. | 32,53 T | 9. | 196,39 S | 15. | 26,35 T | 21. | 130,45 S | 27. | 12,46 Q |
| 4. | 85,30 S | 10. | 40,85 T | 16. | 123,94 D | 22. | 25,51 Q | 28. | 13,08 Q |
| 5. | 50,69 T | 11. | 22,83 T | 17. | 134,23 S | 23. | 15,63 Q | ||
| 6. | 195,16 S | 12. | 124,28 D | 18. | 39,37 T | 24. | 15,78 Q |
Se llevó a cabo el análisis por GC en una columna
CP-Sil 5/CB de 50 m (Chrompack). Programa de
temperatura: 150ºC, 3 min- 15ºC/min- 300ºC, 45 min. Inyector:
280ºC. Detector (FID): 300ºC.
- Placas de DC: Kieselgel 60
- Agente eluyente: 30% de
metil-terc-butiléter/n-heptano
- Reactivo de pulverizado:
Sulfato-molibdato de cerio (IV)- ácido
fosfórico.
Para la identificación de una influencia de la
biosíntesis de colesterol mediante substancias de ensayo se
emplearon cultivos celulares de HepG2. Se cultivaron estas células
en cápsulas de incubación de cultivo celular de 6 ondulaciones de
35 mm en DMEM (Gibco, Eggenstein, Germany) con gentamina 2 mM, 10%
de suero de ternero fetal, 40 U/ml de estreptomicina y 50 U/ml de
penicilina hasta confluencia. Antes de empleo se cultivaron e
hicieron pasar las células congeladas una semana. Después se
incubaron las células confluyentes en un medio E de Williams,
exento de suero, durante 4 horas a 37ºC con la substancias de
ensayo. Después se alimentó a las cargas acetato de ^{14}C (18,5
kBq/ml; 0,5 \muCi/ml). Se diluyeron las substancias de ensayo en
DMSO, y se emplearon las concentraciones indicadas. Después de 2
horas más se eliminó el medio, se lavaron las células dos veces con
disolución salina fisiológica, se introdujeron en agua destilada, y
se homogeneizaron mediante ultrasonido de alta frecuencia (20
segundos, etapa 3).
La incorporación de acetato ^{14}C en la
fracción de lípidos no saponificable (fracción de esterol (se
determinó mediante el siguiente método: se incubaron 1,4 ml de
producto homogeneizado con 2,8 ml de KOH 0,5 M en EtOH bajo
agitación durante 1 hora a 70ºC. Se aplicaron 2,1 ml de esta
cantidad a columnas Extrelut® (Merck, Darmstadt). Después de 30
minutos se eluyeron las substancias neutras, lipófilas, no
saponificables, mediante 10 ml de n-heptano en
recipientes de escintilación. Tras adición de 10 ml de disolución de
escintilación (Ultima Gold®, Packard, Merident, Connecticut) se
determinó la actividad ^{14}C en las muestras en un contador de
escintilación. Los valores de medida mostrados se entienden como
valores medios de tres cápsulas de cultivo independientes por carga
de ensayo. Como valor de referencia se determinó en un 100% la
incorporación de acetato ^{14}C en ausencia de substancias de
ensayo.
Se sometieron a ensayo las siguientes substancias
del modo indicado en el ejemplo 2:
R-\gamma-tocotrienol;
\gamma-tocotrienolquinona;
\alpha-tocotrienolquinona; diastereómero polar del
producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona, diastereómero apolar
del producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona, racemato del producto
de ciclizado de \gamma-tocotrienolquinona. Los
resultados se representan en las figuras 1 a 6. Los valores
indicados en las figuras representan los valores medios de tres
valores de medida independientes en cada caso. Se expresan en
unidades relativas, referidas a la incorporación de acetato
^{14}C en células, con una adición de la cantidad equivalente de
DMSO como control.
R-\gamma-tocotrienol provoca, en
una concentración de 5 x 10^{-6} M, una inhibición aproximadamente
al 20% de incorporación de acetato ^{14}C, con una inhibición
significativa, de un máximo de aproximadamente un 50%, en el caso de
concentraciones \geq 5 x 10^{-5} M (fig. 1). \gamma- y
\alpha-tocotrienolquinona, sólo a partir de una
concentración de 10^{-5} M, provoca una inhibición significativa,
pero aproximadamente al 70 hasta el 75%, de la incorporación de
acetato ^{14}C (figuras 2 y 3). Tanto el diastereómero polar, como
también el apolar, del producto de ciclizado de
\gamma-tocotrienolquinona, así como la mezcla de
ambos diastereómeros (1: 1), provocan, ya a una concentración de
10^{-6} M, una inhibición significativa, al 20 hasta el 30%, de la
incorporación de acetato ^{14}C, a una concentración de 5 x
10^{-5}, una inhibición del 50% (figuras 4, 5 y 6). Con ello, los
productos de ciclizado según la invención son sensiblemente más
eficaces que \gamma-tocotrienol y
\gamma-tocotrienolquinona en el intervalo de
concentración de 10^{-6} M.
Claims (13)
1. Compuestos de la fórmula I
donde
R^{1}, R^{2}, R^{3}y R^{4},
independientemente entre sí, representan H o alquilo con 1 a 6
átomos de carbono; en forma estereoisómera pura, o como mezclas de
estereoisómeros.
2. Compuestos de la fórmula I, representando
R^{1} H o CH_{3}, R^{2} H o CH_{3}, R^{3} CH_{3} y
R^{4} H o CH_{3}.
3. Procedimiento para la obtención de un
compuesto de la fórmula I, caracterizado porque se hace
reaccionar una tocotrienolquinona de la fórmula III
donde R^{1} a R^{4} poseen los significados
indicados anteriormente, en presencia de un catalizador, para dar
un compuesto de la fórmula
I.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque se obtiene tocotrienolquinona de la
fórmula III mediante oxidación de un tocotrienol de la fórmula
II
donde R^{1} a R^{4} poseen los significados
indicados
anteriormente.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque se emplean como agentes oxidantes sales
de Ce(IV) o sales de Fe(III).
6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5,
caracterizado porque se lleva a cabo la oxidación de
tocotrienol de la fórmula II para dar tocotrienolquinona de la
fórmula III en un disolvente orgánico.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque se emplea un
carbonato alcalino como catalizador.
8. Empleo de compuestos de la fórmula I según la
reivindicación 1 ó 2 como complemento alimenticio.
9. Compuestos de la fórmula I según la
reivindicación 1 ó 2 para la aplicación médica.
10. Empleo de un compuesto de la fórmula I según
la reivindicación 1 ó 2 para la obtención de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de enfermedades en relación con
hipercolesterolemia, como enfermedades cardiovasculares, incluyendo
arteriosclerosis, trombosis e infarto de corazón, o para el
tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas.
11. Empleo de un compuesto de la fórmula I según
la reivindicación 1 ó 2 para la obtención de un medicamento para la
reducción del nivel de colesterol en plasma en el hombre.
12. Empleo de un compuesto de la fórmula I según
la reivindicación 1 ó 2 para la obtención de un medicamento para la
reducción del nivel de colesterol en plasma en mamíferos o
aves.
13. Agente farmacéutico que contiene al menos un
compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, y al menos
un soporte compatible desde el punto de vista farmacéutico.
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