ES2216070T3 - Clonacion molecular y caracterizacion de moleculas relacionadas con la relaxina y la familia de ligandos de insulina. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION TRATA DE LA CLONACION MOLECULAR Y LA CARACTERIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN MOLECULAS, DENOMINADAS FACTORES RELACIONADOS CON LA RELAXINA, QUE ESTAN RELACIONADAS CON LA HORMONA RELAXINA Y CON LA FAMILIA DE LIGANDOS DE LA INSULINA. DE FORMA MAS ESPECIFICA, ESTA INVENCION DESCRIBE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CODIFICA EL FACTOR 1 RELACIONADO CON LA RELAXINA. ESTA INVENCION TAMBIEN DESCRIBE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA QUE CODIFICA EL FACTOR 2 RELACIONADO CON LA RELAXINA. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN DESCRIBE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA UN FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA, ASI COMO CELULAS QUE ESTAN CREADAS MEDIANTE INGENIERIA GENETICA PARA PRODUCIR EL FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA. LA INVENCION TAMBIEN DESCRIBEN UN FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA AISLADO SUSTANCIALMENTE EXENTO DE OTRAS PROTEINAS, ASI COMO UN ANTICUERPO QUE UNE DE FORMA ESPECIFICA CON EL FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA. LA INVENCION TAMBIEN DESCRIBE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE INCLUYEN EL FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA, O UN ANTICUERPO QUE SE UNE DE FORMA ESPECIFICA CON EL FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA, Y UN VEHICULO FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE, ASI COMO PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO DE UN CUERPO HUMANO O ANIMAL. LA INVENCION ADEMAS DESCRIBE UN CUERPO - LIGANDO DE FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA QUE INCLUYE UN FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA UNIDO A UNA REGION CONSTANTE DE INMUNOGLOBULINA. LA INVENCION ADEMAS DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO QUE INCLUYE ADMINISTRAR UN CUERPO - LIGANDO DE FACTOR RELACIONADO CON LA RELAXINA A UN CUERPO HUMANO O ANIMAL.

Description

Clonación molecular y caracterización de moléculas relacionadas con la relaxina y la familia de ligandos de insulina.

Esta invención se refiere a la clonación molecular y caracterización de secuencias de ácidos nucleicos que codifican moléculas, denominadas de aquí en adelante como factores relacionados con relaxina, que están relacionadas con la hormona relaxina, y con la familia de ligandos de insulina. Más específicamente, esta invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican factores relacionados con relaxina. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser expresadas en células hospedantes adecuadas, y son así útiles para la producción de factores relacionados con relaxina y ligandos-cuerpos de factores relacionados con relaxina, así como para la producción de sondas que pueden utilizarse para posteriores escrutinios para miembros de la familia relacionados adicionales. La invención también proporciona factores relacionados con relaxina aislados, sustancialmente libres de otras proteínas. Las proteínas factores relacionados con relaxina aisladas, así como sus derivados, pueden utilizarse para la preparación de anticuerpos y composiciones terapéuticas, y como factores de crecimiento para mantener cultivos de células que tienen receptores para factores relacionados con relaxina.

Antecedentes de la invención

La relaxina es una hormona polipeptídica que se ha encontrado en las hembras de todas las especies estudiadas. La relaxina se sintetiza y se almacena en el cuerpo lúteo de los ovarios durante la gestación, y se libera a la corriente sanguínea antes del parto. El cuerpo lúteo de la gestación es la principal fuente de relaxina en muchas especies, pero en otras, la decidua tiene aparentemente mayor importancia. Hisaw sugirió un importante papel para la relaxina en los mamíferos, a través de sus efectos sobre la dilatación de la sínfisis del pubis, facilitando así el proceso del nacimiento. (Hisaw, F.L., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 23, 661-663 (1926)). Desde entonces se ha encontrado que la relaxina tiene otros posibles papeles, incluyendo la preparación del endometrio para la implantación, la inhibición de la actividad uterina en la primera época de la gestación, la apertura cervical y el inicio del parto. La principal acción celular de la relaxina en la gestación puede ser dirigir la biosíntesis de colágeno en sus órganos diana, facilitando así la remodelación del tejido conectivo. La solicitud de Patente PCT WO8907945 publicada el 8 de septiembre de 1989, presentada por Genetech, Inc., describe composiciones de relaxina de las que se afirma que son útiles para la modulación de la fisiología reproductora de los mamíferos durante la gestación y el parto. Se ha descrito que la relaxina es capaz de alterar la naturaleza del tejido conectivo, influenciando la contracción del músculo liso, y que tiene las propiedades generales de un factor de crecimiento. También se ha referido que la relaxina puede influenciar la presión intraocular cuando se administra en dosis farmacológicas. (Kass, M.A. et al., Survey of Ophtalmology 22(3):153-176 (1977)).

Aunque el cuerpo lúteo del ovario, así como los tejidos deciduales y placentarios son los lugares más adecuados de expresión de los genes relacionados con relaxina, la relaxina también se ha encontrado en otros tejidos tales como el líquido prostático y los testículos. Hay evidencia en cerdos de expresión de genes de relaxina y traducción en proteínas en las células de la teca interna del folículo antes de la ovulación, en el cuerpo lúteo del ciclo y en el útero. La relaxina se ha identificado en el plasma seminal de jabalí y puede mantener o aumentar la motilidad del esperma. (Véase Bagnell, C.A., et al., J. Reprod. & Fert. (Supp.) 48:127-138 (1993), para revisión). Se ha referido que hay lugares de unión para relaxina humana altamente específicos, de alta actividad, en regiones discretas del cerebro de rata, de tal forma que la distribución de alguno de estos lugares puede ser consistente con el papel de la relaxina en el control del volumen vascular y de la presión arterial. (Osheroff, P.L. y Phillips, H.S., Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 88 (15):6413-6417 (1991)).

La relaxina biológicamente activa consiste en dos cadenas de polipéptidos (conocidas como cadenas A y B), unidas ambas por un puente disulfuro intracadena y dos intercadena. La estructura se asemeja así a la insulina, lo que ha dado lugar a la especulación de un gen ancestral común para estas hormonas (Schwabe, C., et al., Biochem. Biophys. Res. Común. 75, 503-510 (1977); James, R., et al., Nature, 267:544-546 (1977)). La relaxina se considera un miembro de la familia de la insulina, que también incluye insulina, IGF1, IGF2 y proteína similar a insulina Leydig. Se han obtenido clones de cDNA para relaxina tanto porcina como de rata, a partir de técnicas de DNA recombinante. (Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J., y Niall, H. Nature, 291:127-131 (1981). Además, se ha descrito la clonación molecular y la caracterización de la secuencia del gen que codifica la relaxina humana. (Patente de EE.UU. N1 4.871.461, presentada el 3 de Octubre de 1989, por Hudson, et al.).

Sumario de la invención

La invención se refiere a la clonación molecular y caracterización de ácidos nucleicos que codifican moléculas, denominadas factores relacionadas con relaxina, que están relacionadas con la hormona relaxina y con la familia de ligandos de insulina.

Más específicamente, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica la secuencia de aminoácidos de los factores relacionados con relaxina, como se describe en la Figura 1. La invención también proporciona vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, así como células hospedantes que están manipuladas genéticamente para producir RRF-1.

La presente invención además proporciona un factor relacionado con relaxina, como se describe en la Figura 1, sustancialmente libre de otras proteínas. La invención proporciona también un anticuerpo que se un e específicamente a RRF-1. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene RRF-1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une específicamente a RRF-1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además un ligando-cuerpo de factor relacionado con relaxina, que comprende RRF-1 fusionada a una región constante de inmunoglobulinas.

La invención proporciona además RRF-1, un anticuerpo específico para RRF-1, una composición farmacéutica que comprende RRF-1 o un anticuerpo específico para RRF-1 o un ligando-cuerpo para RRF-1, para utilización en un método de tratamiento de un ser humano o animal o en un método para su diagnóstico.

Breve descripción de las figuras

Figura 1- Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos (código de una letra), de factor 1 relacionado con relaxina (RRF-1)

Figura 2- Alineamiento comparativo de las secuencias de aminoácidos de factor 1 relacionado con relaxina (RRF-1) y factor 2 relacionado con relaxina (RRF-2), con secuencias de aminoácidos de otros miembros de la familia de insulina, incluyendo: relaxina H1; relaxina H2, proteína similar a insulina Leydig (leydig); insulina; factor de crecimiento 1 similar a insulina (IGF1), y factor de crecimiento 2 similar a insulina (IGF2). Los residuos de cisteína conservados se indican mediante asteriscos sobre la secuencia de RRF1. Los puntos indican los residuos de aminoácidos. Las carreras representan inserciones artificiales con el propósito del alineamiento. Las deleciones que van de los aminoácidos 14-123, así como las deleciones de las secuencias de señal, se han realizado para el propósito del alineamiento, y se indican entre paréntesis.

Figura 3- Análisis Northern blot mostrando expresión del mensaje que codifica el factor 1 relacionado con relaxina (RRF-1) en testículo humano, pero no en otros tejidos humanos analizados. Las carreras, desde la izquierda, son Cerebro, Cerebelo, Timo, Corazón, Hígado, Intestino Delgado, Músculo Esquelético, Médula Ósea, Próstata, Testículo, Ovario, Útero, Placenta.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a la clonación molecular y la caracterización de ácidos nucleicos que codifican moléculas, de aquí en adelante denominadas factores relacionados con relaxina, que están relacionadas con la hormona relaxina y con la familia de ligandos de la insulina. Más específicamente, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el factor 1 relacionado con relaxina (RRF-1). La presente invención también proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica RRF-1, así como células que están genéticamente preparados para producir la molécula, mediante, por ejemplo, transfección, transducción, infección, electroporación, o microinyección de un ácido nucleico que codifica RRF-1, como se describe aquí, en un vector de expresión adecuado.

La invención también proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica factor 1 relacionado con relaxina. En una realización, el vector está unido operativamente a una secuencia de control de expresión capaz de dirigir su expresión en una célula hospedante. En otra realización, el vector es un plásmido.

La invención también proporciona un sistema hospedante-vector, para la producción de un factor relacionado con relaxina, o uno de sus fragmentos peptídicos, que comprende un vector de la invención en una célula hospedante. La célula hospedante preferiblemente puede ser una célula bacteriana tal como E. coli o una levadura, o célula de insecto o de mamífero. La invención también proporciona un método para producir un factor relacionado con relaxina, que comprende células en crecimiento de un sistema hospedante-vector, bajo condiciones que permiten la producción del factor relacionado con relaxina, y la recuperación del factor relacionado con relaxina así producido. En una realización de la invención, el factor relacionado con relaxina es RRF-1.

La invención además proporciona un factor relacionado con relaxina RRF-1 aislado, sustancialmente libre de otras proteínas. En una realización, el factor relacionado con relaxina aislado, está codificado por la secuencia de nucleótidos que comprende la región que codifica RRF-1 como se expresa en la Figura 1.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une específicamente al factor relacionado con relaxina RRF-1. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende factor relacionado con relaxina RRF-1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une específicamente al factor relacionado con relaxina RRF-1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención además proporciona un ligando-cuerpo de factor relacionado con relaxina, que comprende un factor relacionado con relaxina RRF-1, fusionado a una región constante de inmunoglobulina. En una realización del ligando-cuerpo del factor relacionado con relaxina, la región constante de la inmunoglobulina es la porción Fc de la IgG1 humana.

Como se utiliza aquí, la expresión "factor relacionado con relaxina" incluye las moléculas de RRF-1 aquí descritas, así como moléculas funcionalmente equivalentes, en los que los residuos de aminoácidos se sustituyen por residuos dentro de la secuencia, que da como resultado un cambio silente. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia, pueden sustituirse por otros aminoácidos de una polaridad similar, que actúan como equivalentes funcionales, dando como resultado una alteración silente. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece dicho aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares neutrales incluyen glicina, serina, treonina, cisterna, tiroxina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. También incluido dentro del ámbito de la expresión "factor relacionado con relaxina", son fragmentos o sus derivados, que exhiben la misma o similar actividad biológica, y derivados que están modificados diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc.

Cualquier experto en la técnica, también reconoce que las secuencias de DNA y RNA pueden hibridarse con una secuencia que codifica un factor relacionado con relaxina, bajo condiciones de astringencia moderada, como se define en, por ejemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, páginas 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Un ácido nucleico que codifica un factor relacionado con relaxina como el descrito aquí, facilitará la modificación genética de células, para producir el factor relacionado con relaxina, mediante, por ejemplo, transfección, transducción, electroporación, o microinyección de una célula hospedante adecuada, utilizando una secuencia de nucleótido que codifica el factor relacionado con relaxina, en un vector de expresión adecuado, formando así un sistema de vector-célula hospedante, para la producción de un polipéptido que tiene la actividad biológica del factor relacionado con relaxina. Una célula hospedante adecuada puede seleccionarse del grupo que consiste en células bacterianas (tales como E. coli), células de levadura, células fúngicas, células de insecto y células animales. Células animales adecuadas incluyen, pero no se limitan, a células Vero, células HeLa, células Cos, células CV1 y diversas células de mamífero primarias.

Cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de DNA en un vector, pueden utilizarse para construir vectores de expresión que codifican el factor relacionado con relaxina, utilizando señales de control trascripcionales/traslacionales y secuencias que codifican proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas de DNA recombinante y sintéticas in vitro y recombinaciones (recombinación genética) in vivo. La expresión de secuencias de nucleótidos que codifican factor relacionado con relaxina o uno de sus fragmentos peptídicos puede ser regulado por una segunda secuencia de nucleótidos, de tal forma que la proteína o el péptido se expresen en un hospedante transformado con la molécula de DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión del factor relacionado con relaxina aquí descrito puede ser controlado por cualquier elemento promotor/aumentador conocido en la técnica. Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión del factor relacionado con relaxina incluyen, pero no se limitan a la repetición terminal larga, como se describe en Squinto et al., (Cell 65:1-20 (1991)); la región del promotor precoz SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 240:304-310), el promotor de CMV, la repetición terminal 5' M-MuLV, el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de la quinasa de timidita del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445 (1981)), el promotor de adenovirus, las secuencias reguladoras del gen de la metalotioeína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procariótica tales como el promotor de la \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731 (1978)), o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25 (1983)), véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 242:74-94 (1980); elementos promotores de levaduras u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADH (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control trascripcional animal, que exhiben especificidad de tejido, y que han sido utilizadas en animales transgénicos: región de control del gen 1 de elastasa, que es activo en células acinares de páncreas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald. Hepatology 7:425-515 (1987); región de control del gen de la insulina, que es activo en células pancreáticas beta (Hanahan, Nature 315:115-122 (1985)), la región de control del gen de la insulina, que es activo en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón, que es activo en testículo, mama, células linfoides y células cebadas (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina, que es activo en el hígado (Pinkert et al., 1987, Science 235:53-58); la región de control del gen de la alfa-1 antitripsina, que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), la región de control del gen de la beta-globina, que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica de la mielina, que es activa en las células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina, que es activa en músculo esquelético (Shani, 1985, Nature 314:283-286), y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina, que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378). La invención además proporciona la producción de compuestos anti-sentido, que son capaces de hibridarse específicamente con una secuencia de RNA que codifica el factor relacionado con relaxina, para modular su expresión. (Ecker, Patente de EE. UU. N1 5.166.195, publicada el 24 de noviembre de 1992).

Así, de acuerdo con la invención, los vectores de expresión capaces de replicarse en un hospedante bacteriano o eucariótico, que comprenden un ácido nucleico que codifica un factor relacionado con relaxina, se utilizan para transfectar un hospedante, y de esta forma dirigir la expresión de dicho ácido nucleico, para producir el factor relacionado con relaxina, que después puede recuperarse en su forma biológicamente activa. Como aquí se utiliza, una forma biológicamente activa incluye una forma capaz de unirse a un receptor del factor relacionado con relaxina, y producir una respuesta biológica tal como una función diferenciada, o influenciar el fenotipo de la célula que expresa el receptor.

Los vectores de expresión que contienen los insertos del gen, pueden identificarse mediante cuatro aproximaciones generales: (a) hibridación DNA-DNA, (b) presencia o ausencia de "marcador" de funciones genéticas, (c) expresión de secuencias insertadas y (d) detección por PCR. En la primera aproximación, la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión puede detectarse mediante hibridación DNA-DNA, utilizando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen insertado que codifica un factor relacionado con relaxina. En la segunda aproximación, el sistema vector recombinante/hospedante puede identificarse y seleccionarse, basado en al presencia o ausencia de cierto "marcador" de funciones del gen (por ejemplo, actividad quinasa de timidina, resistencia a antibióticos, trasformación de fenotipo, formación de cuerpos de oclusión en báculovirus, etc.), producidas por la inserción de genes extraños en el vector. Por ejemplo, si un ácido nucleico que codifica un factor relacionado con relaxina se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contienen el inserto pueden identificarse mediante la ausencia de la función del gen marcador. En la tercera aproximación, los vectores de expresión recombinante pueden identificarse mediante el ensayo del producto del gen extraño expresado por el recombinante. Dicho ensayo puede basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del producto del gen del factor relacionado con relaxina, por ejemplo, mediante la unión del factor relacionado con relaxina con su receptor, o una de sus partes, que puede marcarse con, por ejemplo, un anticuerpo detectable o una de sus partes, o mediante la unión a anticuerpos producidos contra el factor relacionado con relaxina o una de sus partes. Las células de la presente invención pueden expresar transitoriamente, o preferiblemente constitutivamente y permanentemente, factor relacionado con relaxina como el aquí descrito. En la cuarta aproximación, pueden prepararse cebadores de nucleótidos de DNA, correspondientes a secuencias de DNA específicas de factor relacionado con relaxina. Estos cebadores podrían utilizarse en técnicas de PCR para un fragmento del gen del factor relacionado con relaxina. (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, editado por Michael A. Innis et al., Academic Press (1990)).

Un factor relacionado con relaxina puede purificarse mediante cualquier técnica que permita la formación posterior de una proteína estable, biológicamente activa. Por ejemplo, y sin que signifique ninguna limitación, un factor relacionado con relaxina puede recuperarse de células, bien como proteínas solubles o como cuerpos de inclusión, a partir de los cuales pueden extraerse cuantitativamente mediante hidrocloruro de guanidino SM y diálisis. Para purificar mejor el factor relacionado con relaxina, pueden utilizarse cromatografía de intercambio iónico convencional, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa o filtración en gel.

En realizaciones adicionales de la invención, puede utilizarse un gen que codifica un factor relacionado con relaxina recombinante, para inactivar o hacer desaparecer (knock out) el gen endógeno mediante recombinación homóloga, y de esta forma crear una célula, tejido o animal deficientes en factor relacionado con relaxina. Por ejemplo, y sin que sirva como limitación, el gen que codifica el factor relacionado con relaxina recombinante puede manipularse genéticamente para que contenga una mutación de inserción, por ejemplo el gen neo, que podría inactivar el gen natural que codifica el factor relacionado con relaxina. Tal construcción, bajo el control de un promotor adecuado, puede introducirse en una célula, tal como una célula embrionaria pluripotencial, mediante una técnica tal como transfección, transducción o inyección. Las células que contienen la construcción pueden entonces seleccionarse mediante resistencia a G418. Las células que carecen de un gen que codifica el factor relacionado con relaxina intacto, pueden entonces identificarse, por ejemplo mediante Southern blotting, detección mediante PCR, Northern blotting o análisis de expresión. Las células que carecen de un gen que codifica el factor relacionado con relaxina intacto, pueden entonces fusionarse con células embrionarias tempranas, para generar animales transgénicos deficientes en dicho factor relacionado con relaxina. Dichos animales pueden utilizarse para definir procesos específicos in vivo, que dependen normalmente del factor relacionado con relaxina.

La presente invención también proporciona anticuerpos contra el factor relacionado con relaxina aquí descritos, que son útiles para la detección del factor en, por ejemplo, aplicaciones diagnósticas. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un factor relacionado con relaxina, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica de hibridoma original desarrollada por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96) y similares, están dentro del ámbito de la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales para utilización diagnóstica o terapéutica, pueden ser anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales quiméricos ser humano-ratón (u otras especies). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, Teng et al., 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Las moléculas de anticuerpos quiméricos pueden prepararse conteniendo un dominio de unión a antígeno de ratón y regiones constantes humanas (Morrison et al., 1984; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., Nature 314:452).

Pueden utilizarse diversos procedimientos conocidos en la técnica, para la producción de anticuerpos policlonales contra epítopos de un factor relacionado con relaxina descrio aquí. Para la producción de anticuerpo, pueden inmunizarse varios animales hospedantes, mediante inyección con un factor relacionado con relaxina, o un fragmento peptídico o sus derivados, incluyendo, pero no limitándose a conejos, ratones y ratas. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies de hospedantes, e incluyendo, pero no limitados a, adyuvante de Freunds (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptiodos, emulsiones oleosas, hemocianinas de keyhole limpet, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Un clon molecular de un anticuerpo contra un epítopo seleccionado del factor relacionado con relaxina, puede prepararse mediante técnicas conocidas. Puede utilizarse la metodología de DNA recombinante (Véase por ejemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), para construir secuencias de nucleótidos que codifican una molécula de anticuerpo monoclonal, o una de sus regiones de unión a antígeno.

La presente invención proporciona moléculas de anticuerpos así como fragmentos de dichas moléculas de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: el fragmento F(ab')_{2}, que puede producirse mediante digestión por pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse mediante reducción de los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}; y los fragmentos Fab' que pueden generarse mediante tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. Las moléculas de anticuerpo pueden purificarse mediante técnicas conocidas, por ejemplo, cromatografía de inmunoabsorción o inmunoafinidad, métodos cromatográficos tales como HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), o una de sus combinaciones.

Habiendo aislado una molécula de ácido nucleico que codifica un factor relacionado con relaxina, no debería suponer una gran dificultad crear una construcción de expresión que pudiera proporcionar una proteína secretada que consiste en la secuencia de codificación completa del factor relacionado con relaxina, fusionada a la región constante de la inmunoglobulina gamma-1 humana (IgG1 Fc). Estas proteínas de fusión se denominan "ligandos-cuerpos de factor relacionado con relaxina". El factor relacionado con relaxina puede ser RRF-1.

La parte Fc puede prepararse como sigue. Un fragmento de DNA que codifica la parte Fc de la IgG1 humana, que abarca desde la región finge hasta el extremo carboxi de la proteína, puede amplificarse a partir de cDNA de placenta humana, mediante PCR, con los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia publicada de la IgG1 humana; el fragmento de DNA resultante puede clonarse en un vector plásmido. Pueden ligarse fragmentos de restricción de DNA apropiados de un plásmido que codifica el factor relacionado con relaxina de longitud completa, y del plásmido de la Fc de IgG1 humana, a cada lado de un fragmento corto derivado de amplificación por PCR, que está diseñado para fusionar, dentro de un marco, el factor relacionado con relaxina elegido con las secuencias de codificación de la proteína Fc de la IgG1 humana.

La presente invención también proporciona, de esta forma, un ligando-cuerpo de factor relacionado con relaxina, que se une específicamente al receptor elegido del factor relacionado con relaxina. En una realización, la presente invención proporciona un ligando-cuerpo de un factor relacionado con relaxina, que comprende un ligando de factor relacionado con relaxina, fusionado a una región constante de inmunoglobulina. En otra realización, el ligando-cuerpo comprende un factor relacionado con relaxina y la parte Fc de la IgG1 humana. En otra realización, el ligando-cuerpo comprende RRF-1 y la parte Fc de la IgG1 humana. Un ligando-cuerpo de factor relacionado con relaxina puede ser útil como un reactivo diagnóstico para detectar un receptor de factor relacionado con relaxina mediante, por ejemplo, tinción tisular o imagen de cuerpo completo.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas de ligandos o ligandos-cuerpos del factor relacionado con relaxina aquí descritos, sus fragmentos peptídicos, o sus derivados, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína del factor relacionado con relaxina, o sus fragmentos peptídicos o sus derivados, pueden administrarse de forma sistémica o local. Puede utilizarse cualquier forma de administración apropiado conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, intravenosa, intratecal, intraarterial, intranasal, oral, subcutánea, intraperitoneal, o mediante inyección local o implante quirúrgico. También se proporcionan formulaciones de liberación sostenida.

La invención se entenderá mejor a través de los Ejemplos que siguen. Sin embargo, cualquier experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos específicos y los resultados discutidos no son limitantes, y son meramente ilustrativos de la invención.

Ejemplo 1 Clonación de una molécula relacionada con relaxina, y de la familia de ligandos de insulina

Una búsqueda de las bases de datos de marcadores de secuencia expresadas, utilizando la secuencia de la relaxina (un miembro de la familia de la insulina, que también incluye la insulina, IGF1, IGF2, y "proteína Leydig similar a insulina"), como la secuencia de ensayo, reveló la existencia de una secuencia, encontrada en testículos humanos, relacionada con relaxina en el nivel de aminoácidos. Las características de la familia de proteínas de insulina consisten principalmente en una colocación particular de los residuos de cisterna, dos cerca del extremo amino y cuatro hacia el extremo carboxi, que forman una estructura característica de puentes disulfuro. La secuencia encontrada en la base de datos contenía las dos primeras cisternas, junto con otros pocos residuos en su inmediata vecindad, que también son característicos de la familia de la insulina. Esta homología era bastante débil, y la presencia de un codón de terminación en el medio de la secuencia de la base de datos, sin evidencia de las características cisternas C-terminales, aumentó las dudas sobre si esta secuencia representaba un auténtico nuevo miembro de la familia de la insulina.

Se sintetizaron oligonucleótidos que correspondían a la secuencia de la base de datos, y se unieron mediante PCR para constituir una sonda de 400 bases. Se construyó una biblioteca de cDNA de testículo humano, y después se escrutó con esta sonda sintética. Se secuenciaron varios clones resultantes de este escrutinio, y se encontró que al menos uno de los clones contenía un marco de lectura abierta, cuya secuencia predicha de proteína mostraba todos los datos esperados de un nuevo miembro de la familia de la insulina, particularmente con respecto al núcleo de cuatro cisternas en el extremo C de la molécula. Las secuencias de nucleótidos y deducida de aminoácidos (código de letra única) de la molécula, se muestran en la Figura 1. Globalmente, la molécula está mas cercanamente relacionada con la relaxina que con cualquier otro miembro de la familia de la insulina.

El análisis mediante Northern blot se realizó haciendo correr las muestras de un poli-A-RNA humano adulto en un gel de agarosa al 1%-formaldehído, transfiriendo el gel a una membrana de nylon, y haciéndolo reaccionar con la sonda de 400 pares de bases derivada de la secuencia de nucleótidos del factor relacionado con relaxina. Como se muestra en la Figura 3, el mensaje para RRF-1 se expresaba de forma elevada en testículos humanos, pero no se detectaba en ninguna otra de las muestras de tejido analizadas, incluyendo cerebro, cerebelo, timo, corazón, hígado, intestino delgado, músculo esquelético, médula ósea, próstata, ovario, útero y placenta. Dado que la producción de RRF-1 parece ser específica de los testículos, puede estar implicada en la maduración del esperma y de esta forma puede tener un papel en el tratamiento de las alteraciones de fertilidad.

Ejemplo 2 Expresión de c-DNA de factor-1 relacionado con relaxina

Se construyeron vectores de expresión que contenían el cDNA del factor-1 relacionado con relaxina. Una versión tenía un triple marcador myc insertada en su extremo C, para hacer detectable la proteína. Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con el vector de expresión o con un vector testigo, mediante el protocolo de transfección de DEAE-dextrano.

Brevemente, las células COS-7 se plantaron a una densidad de 1,0 x 10^{6} células por cada placa de 100 mm, 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se cultivaron en medio DMEM libre de suero, que contenía 400 \mug/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 1 \muM, y glutamina 2 mM, y 1 \mug del DNA apropiado durante 3-4 horas, a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}. El medio de transfección se aspiró y se reemplazó con solución salina tamponada con fosfato, con 10% de DMSO durante 2-3 minutos. Después del "choque" de DMSO, las células COS-7 se plantaron en DMEM con 1% de cada uno de penicilina y estreptomicina y glutamina 2 mM. El medio de COS que contenía el ligando secretado se recogió después de tres días. La expresión de la versión marcada con myc se verificó mediante Western blot de los sobrenadantes, utilizando anticuerpos contra el marcador myc como sonda.

Claims (16)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del factor relacionado con relaxina como el que se expone en la Figura 1.

2. Un ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende la región que codifica el factor relacionado con relaxina como el que se expone en la Figura 1.

3. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2.

4. Un vector según la reivindicación 3, en el que la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia de control de expresión, capaz de dirigir la expresión de dicho ácido nucleico en una célula hospedante.

5. Un plásmido según la reivindicación 3 ó 4.

6. Un factor relacionado con relaxina como el que se expone en la Figura 1, sustancialmente libre de otras proteínas.

7. Un sistema vector-hospedante para la producción de un factor relacionado con relaxina, que comprende un vector de la reivindicación 4 en una célula hospedante.

8. Un sistema vector-hospedante según la reivindicación 7, en el que la célula hospedante es una célula de bacteria, levadura, insecto o mamífero.

9. Un método para producir un factor relacionado con relaxina, que comprende cultivar células de un sistema vector-hospedante como el de la reivindicación 7 u 8, bajo condiciones que permitan la producción del factor relacionado con relaxina, y la recuperación del factor relacionado con relaxina así producido.

10. Un anticuerpo que se une específicamente al factor relacionado con relaxina de la reivindicación 6.

11. Un anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo monoclonal.

12. Una composición farmacéutica que comprende un factor relacionado con relaxina según la reivindicación 6, o un anticuerpo según la reivindicación 10 u 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un factor relacionado con relaxina según la reivindicación 6, un anticuerpo según las reivindicaciones 10 u 11, o una composición según la reivindicación 12, para utilizar en un método de tratamiento de un ser humano o animal, o en un método de diagnóstico.

14. Un ligando-cuerpo que comprende un factor relacionado con relaxina como se definió en la reivindicación 6, fusionado a una región constante de inmunoglobulina.

15. Un ligando-cuerpo según la reivindicación 14, en el que la región constante de inmunoglobulina es la parte Fc de la IgG1 humana.

16. Un ligando-cuerpo según la reivindicación 14 ó 15, para utilizar en un método de tratamiento de un ser humano o animal, o en un método de diagnóstico.