ES2207208T3 - Composiciones y metodos para extender la accion de neurotoxina costridial. - Google Patents

Abstract

La utilización de una composición eficaz para prevenir la actividad neurorregenerativa de un polipéptido, comprendiendo dicha composición un agente seleccionado del grupo constituido por: IGF I, IGF II, factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de la leucemia, tenascina-C, ninjurina, molécula de adhesión neural celular, y agrina neural, seleccionándose dicho agente del grupo constituido por: a) un anticuerpo capaz de fijar selectivamente dicho polipéptido, b) un inhibidor competitivo de dicho polipéptido, c) una enzima que escinde un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, d) un agente antisentido capaz de fijarse selectivamente a un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, e) una proteína de fijación distinta de un anticuerpo, f) una ribozima, y g) un ácido nucleico que codifica un receptor inactivo de factores de crecimiento capaz de fijar dicho polipéptido, para la preparación de un medicamento para la prolongación delperíodo eficaz durante el cual un tejido tratado con una toxina clostridial se paraliza.

Description

Composiciones y métodos para extender la acción de neurotoxina costridial.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a composiciones para inhibir la formación de brotes neurales en neuronas que han estado sometidas a la toxina botulínica. Se describen también composiciones para prolongar el período de tiempo durante el cual el tratamiento de células nerviosas con toxina botulínica es eficaz para evitar la inervación de una célula o tejido, tales como células o tejido musculares. Tales composiciones son eficaces en el tratamiento de espasmos o tétanos muscular. También se describen composiciones para estimular el crecimiento neural.

Antecedentes de la invención

Las neurotoxinas, tales como las obtenidas a partir de Clostridium botulinum y Clostridium tetanus, son venenos altamente potentes y específicos para las células neurales. Estas bacterias Gram-positivas segregan dos toxinas relacionadas pero distintas, cada una de las cuales comprende dos cadenas de aminoácidos enlazadas por disulfuro: una cadena ligera (L) de aproximadamente 50 KDa y una cadena pesada (H) de aproximadamente 100 KDa, que son totalmente responsables de los síntomas de estas enfermedades.

Las toxinas del tétanos y el botulismo están entre las substancias más letales conocidas por el hombre, teniendo una dosis letal en humanos comprendida entre 0,1 ng y 1 ng por kilogramo de peso corporal. Tonello et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 389:251-260 (1996). Ambas toxinas funcionan inhibiendo la liberación de neurotransmisores en las neuronas afectadas. La neurotoxina del tétanos (TeNT) actúa principalmente en el sistema nervioso central, mientras que la neurotoxina del botulismo (BoNT) actúa en la unión neuromuscular inhibiendo la liberación de acetilcolina del axón de la neurona afectada hacia la sinapsis, dando como resultado una parálisis fláccida localizada. El efecto de la intoxicación sobre la neurona afectada es de larga duración y ha sido considerado como irreversible.

Se sabe que la neurotoxina del tétanos (TeNT) existe en un solo tipo inmunológicamente distinto; y se sabe que las neurotoxinas del botulismo (BoNT) existen en siete tipos inmunogénicamente diferentes, llamados BoNT/A hasta BoNT/G. Aunque todas estos tipos son producidos por materiales aislados de C. botulinum, otras dos especies, C. baratii y C. butyricum producen también toxinas similares a /F y /E, respectivamente. Véase, por ejemplo, Coffield et al., The Site and Mechanism of Action of Botulinum Neurotoxin, en Therapy with Botulinum Toxin 3-13 (Jankovic J. & Hallett M., compiladores, 1994), cuyo contenido se incorpora aquí por referencia.

Independientemente del tipo, el mecanismo molecular de la intoxicación parece ser similar. En el primer paso del proceso, la toxina se fija a la membrana presináptica de la neurona diana por una interacción específica entre la cadena pesada y un receptor de la superficie de la célula; se cree que el receptor es diferente para cada tipo de toxina botulínica y para TeNT. El término carboxilo de la cadena pesada parece ser importante para direccionar la toxina hacia la superficie de la célula.

En el segundo paso, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. La toxina es envuelta primeramente por la célula por endocitosis mediada por receptores, y se forma un endosoma que contiene la toxina. La toxina escapa luego del endosoma hacia el citoplasma de la célula. Se cree que este último paso está mediado por el término amino de la cadena pesada, que desencadena un cambio de conformación de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5,5 o menor. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que disminuye el pH intra-endosómico. El cambio de conformación expone residuos hidrófobos en la toxina, lo cual permite a la toxina integrarse en la membrana endosómica. La toxina sufre luego una translocación hacia el citosol a través de la membrana endosómica.

El último paso del mecanismo de la actividad de la toxina botulínica parece implicar la reducción del enlace disulfuro que une las cadenas pesada y ligera. La actividad tóxica total de las toxinas del botulismo y del tétanos está contenida en la cadena ligera de la holotoxina; la cadena ligera es una endopeptidasa de zinc (Zn++) que selectivamente escinde proteínas esenciales para el reconocimiento y el acoplamiento de vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. TxNT, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G causan degradación de la sinaptobrevina 2 (también llamada proteína de membrana asociada con vesículas (VAMP)), una proteína de la membrana sinaptosómica. La mayor parte de la VAMP presente en la superficie citosólica de la vesícula sináptica es eliminada como resultado de cualquiera de estos sucesos de escisión. Cada toxina escinde específicamente un enlace diferente.

BoNT/A y /E escinden selectivamente la proteína SNAP-25 asociada con la membrana plasmática; esta proteína está unida a y está presente en la superficie citosólica de la membrana plasmática. BoNT/C escinde la sintaxina, una proteína integral que tiene la mayor parte de su masa expuesta al citosol. La sintaxina interacciona con los canales de calcio en las zonas activas del terminal presináptico. Véase Tonello et al., Tetanus and Botulism Neurotoxins in Intracellular Protein Catabolism 251-260 (Suzuki K & Bond J. compiladores, 1996), cuyo contenido se incorpora aquí por referencia como parte de esta memoria descriptiva. BoNT/C_{1} escinde también SNAP-25 en un enlace peptídico contiguo al escindido por BoNT/A.

Tanto TeNT como BoNT se fijan en la unión neuromuscular. BoNT permanece dentro de las neuronas periféricas, y bloquea la liberación del neurotransmisor acetilcolina por estas células. A través de su receptor, TeNT entra en vesículas que se mueven de manera retrógrada a lo largo del axón hacia el soma, y se descarga en el espacio intersináptico entre las neuronas motoras y las neuronas inhibidoras de la médula espinal. En este punto, TeNT se fija a receptores de las neuronas inhibidoras, se internaliza de nuevo, y la cadena ligera entra en el citosol para bloquear la liberación de los neurotransmisores inhibidores ácido 4-aminobutírico (GABA) y glicina de estas células. Id.

Debido a sus efectos específicamente localizados, se han utilizado preparaciones diluidas de BoNT desde 1981 como agentes terapéuticos en el tratamiento de pacientes que padecen diversas afecciones espásticas, incluyendo estrabismo (desalineamiento del ojo, beflaroespasmo (cierre involuntario de los párpados) y espasmo hemifacial. Véase por ejemplo Borrodic et al., Pharmacology and Histology Botulinum Toxin, en Therapy with Botulinum Toxin 3-13 (Jankovic J. & Hallett M., compiladores, 1994), incorporado aquí por referencia. De los siete tipos de la toxina, BoNT/A es la más potente de las BoNTs, y la mejor caracterizada. La inyección intramuscular de tejido espástico con preparaciones diluidas de BoNT/A ha sido utilizada también eficazmente para tratar la espasticidad debida a lesión cerebral, lesión en la médula espinal, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple y parálisis cerebral. El grado de parálisis depende tanto de la dosis como del volumen de dosis administrado al sitio diana. Típicamente, la neurotoxina se administra en una preparación que contiene también varias proteínas no tóxicas, incluyendo hemaglutininas y glicoproteínas asociadas que contribuyen a maximizar su estabilidad y presentación a la neurona motora diana.

Típicamente existe un retardo de 24 a 72 horas entre la administración de la toxina y el inicio del efecto clínico. La exposición a la toxina causa atrofia por desnervación. Véase por ejemplo, Dutton J., Acute and Chronic Effects of Botulinum Toxin in the Management of Blepharospasm, en Therapy with Botulinum Toxin en 199, que se incorpora aquí por referencia. Aunque la aplicación terapéutica de BoNT ha sido extraordinariamente eficaz, los efectos secundarios que se han observado son principalmente efectos inmediatos asociados con el suceso del tratamiento propiamente dicho. Pueden ocurrir en ocasiones efectos periféricos que causan debilidad en músculos adyacentes; estos efectos normalmente no persisten más allá de una a dos semanas. Las manifestaciones específicas de estos efectos sobre los grupos de músculos adyacentes dependen de la indicación particular de que se trate. Por ejemplo, los pacientes tratados por blefaroespasmo experimentan a veces ptosis, y pueden presentarse problemas de deglución después de la inyección en los músculos del cuello para tratamiento de la tortícolis.

Otras posibles consecuencias del tratamiento incluyen la posibilidad de sobredosis por cálculo erróneo o diferencias de actividad entre diferentes preparaciones de la toxina, fatiga generalizada y la posibilidad de reacciones alérgicas.

Una característica del tratamiento con BoNT/A, y otros tipos de neurotoxinas clostridiales es que la acción paralizante es temporal, reapareciendo los síntomas en los pacientes en el transcurso de unos pocos meses después de la inyección de la toxina. Se ha pensado que esta característica está asociada con la formación observada de brotes de procesos nacientes sinápticamente activos en la unión neuromuscular (NMJ). Parece ser que la producción de tales brotes después del tratamiento terapéutico con BoNT/A contribuye a la reinervación del tejido tratado y por lo tanto a la necesidad de inyecciones seriadas repetidas de la toxina.

La duración de la acción paralizante causada por la neurotoxina clostridial y la extensión de la formación de brotes, parece depender del sub-tipo de neurotoxina estudiado y por lo tanto parece estar relacionada con la diana SNARE específica escindida por cada neurotoxina. Así, BoNT/A y BoNT/C_{1}, que escinden la proteína t-SNARE SNAP-25 con diferencia de un aminoácido una de otra, causan una parálisis de larga duración, observándose una longitud media de brote larga. BoNT/F, que escinde la proteína v-SNARE VAMP, causa una parálisis de menor duración y brotes de longitud media más corta. BoNT/E, que escinde SNAP-25 en una posición diferente que la de BoNT/A y BoNT/C_{1} (liberando por tanto un fragmento SNAP de tamaño diferente de la membrana plasmática), tiene un período de duración corto de aproximadamente 5 días, y virtualmente no se observa formación alguna de brotes neurales. Sin desear quedar ligados a la teoría, estas observaciones sugieren que los brotes neurales y la duración de la parálisis son sucesos normalmente relacionados, y que los productos de escisión de la digestión proteolítica de BoNT (es decir, el fragmento liberado o el fragmento unido a la membrana) pueden regular directa o indirectamente la formación de brotes neurales, o ser co-regulados con ella.

Por consiguiente, sería ventajoso diseñar un método mediante el cual el fenómeno de formación de brotes pudiera desacoplarse de la duración del efecto terapéutico, y retardarse, bloquearse o atenuarse de este modo a fin de prolongar los efectos de la inyección del tejido con la toxina. Aunque los experimentos descritos aquí utilizan una preparación de BoNT/A, será evidente para los expertos en la técnica que los métodos expuestos en esta memoria podrán ser utilizados adecuadamente utilizando otras toxinas clostridiales, tales como BoNT/B hasta BoNT/G, y TeNT, en las que se pueda observar una senda de formación de brotes.

Adicionalmente, sería ventajoso en este contexto proporcionar composiciones eficaces para la inhibición o prevención del fenómeno la formación de brotes. Tales composiciones y métodos disminuirían la necesidad de que los pacientes tuvieran que sufrir tratamiento repetido con neurotoxinas.

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Sumario de la invención

La presente invención concierne a composiciones para incrementar el período de tiempo entre los tratamientos terapéuticos de tejido neural con una neurotoxina clostridial; permitiendo así aumentar la eficacia de tales tratamientos. Una ventaja directa de tales composiciones es una "vida" terapéutica aumentada y una disminución concomitante en la frecuencia requerida de tratamiento del paciente con neurotoxina. La reducción de la frecuencia de tratamiento proporcionaría menos oportunidad de que un paciente experimente los efectos secundarios descritos anteriormente que se observan después del tratamiento, pero que tienden a disminuir mucho tiempo antes que haya disminuido la eficacia de la toxina en el área diana. Adicionalmente, una frecuencia de tratamiento reducida proporciona menos oportunidad de cálculos erróneos de la cantidad de dosificación y otros riesgos específicos del tratamiento.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la invención concierne a una composición que comprende un primer agente que comprende una neurotoxina clostridial para utilización como agente terapéutico y un segundo agente capaz de prolongar la duración del beneficio terapéutico de dicho primer agente, en la cual el segundo agente es eficaz para atenuar la formación de brotes terminales nerviosos después del tratamiento de una unión neuromuscular con la neurotoxina clostridial.

En una realización particular de este aspecto de la invención, el primer y segundo agentes pueden constituir una entidad única que se proporciona al paciente en una sesión de tratamiento única. Por ejemplo, la entidad puede comprender una molécula única, o un polipéptido multicatenario con enlaces disulfuro. Adicional o alternativamente, la entidad puede comprender uno o más heterogrupos adsorbidos o enlazados, tales como una pequeña molécula orgánica o un ácido nucleico unido a ella. La entidad comprende preferiblemente ambas actividades de unión con el receptor y translocación de una cadena pesada clostridial, y una porción activa de una cadena ligera de toxina clostridial. La cadena ligera puede comprender también una actividad enzimática auxiliar, por ejemplo una ribonucleasa, que escinde específicamente un ácido nucleico que codifica un factor intraneuronal que es responsable de la expresión, activación y/o secreción de factores neurotróficos o moléculas de adhesión celular. En una realización preferida, dicha actividad auxiliar es proporcionada por una ribozima. Por ribozima se entiende un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico que tiene una actividad de nucleasa específica de la secuencia; la construcción y utilización de ribozimas son bien conocidas en la técnica; véase por ejemplo, Cech, T., Science 236:1532-1539 (1987); Cech, T.R., Curr. Opin. Struct. Biol. 2:605-609 (1922); y Usman et al., Nucleic Acids & Mol. Biol. 10:243-264 (1996), cuyas descripciones se incorporan por la presente por referencia. Por análogo de ácido nucleico se entiende una molécula polímera capaz de formar un híbrido específico de la secuencia con un ácido nucleico monocatenario diana; tales análogos pueden contener nucleótidos modificados (o ribonucleótidos) tales como 3'-O-metil-nucleótidos, nucleótidos modificados con fosforotioato, nucleótidos de metilfosfonato, o bases de nucleótidos separadas por un enlace cuasi-peptídico.

Alternativamente, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico comprendido en la entidad única a que se hace referencia anteriormente puede ser un agente antisentido capaz de unirse selectivamente a un ácido nucleico que codifica un factor intraneuronal que es responsable de la expresión, activación y/o secreción de factores neurotróficos o moléculas de adhesión celular. Este agente antisentido puede proporcionar adicionalmente un sustrato bicatenario para la acción de una actividad de RNAsa H intracelular. Detalles que conciernen a ciertas realizaciones de estos aspectos de la invención están contenidos por ejemplo en Dolly et al., Publicación Internacional No. WO95/32738, titulada Modificación de Toxinas Clostridiales para Uso como Proteínas de Transporte y en Uherek et al., J. Biol. Chem. 273:8835-8841 (1998). Estas dos citas se incorporan por referencia como parte de la presente solicitud.

Una porción de polipéptido de la entidad enlazada a un resto de ácido nucleico puede codificar una proteína o polipéptido que tenga susceptibilidad de expresarse dentro de una neurona y regular directa o indirectamente la expresión, activación y/o secreción de factores neurotróficos o moléculas de adhesión celular.

En aspectos preferidos de la invención, el segundo agente se selecciona del grupo constituido por agentes capaces de competir con, regular en sentido decreciente o neutralizar los efectos de: IGF I, IGF II, un factor neurotrófico, un factor inhibidor de la leucemia, una molécula de adhesión de células nerviosas y agrina neural. En un aspecto más preferido de la invención, el factor neurotrófico se selecciona del grupo constituido por: factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, y factor neurotrófico derivado de cerebro, y/o la molécula de adhesión de células nerviosas se selecciona del grupo constituido por: tenascina-C, ninjurina, y molécula de adhesión neural celular.

Los Solicitantes han descubierto sorprendentemente que la recuperación de la función neural después del envenenamiento de los terminales nerviosos con neurotoxina clostridial implica dos sucesos distintos y aparentemente coordinados. En primer lugar, la placa terminal envenenada se vuelve sinápticamente inactiva. Poco después, la placa terminal elabora tenues procesos neurales de axones nacientes. Estos procesos o "brotes" son sinápticamente competentes aproximadamente 14 días después del tratamiento con la neurotoxina clostridial. Los brotes continúan creciendo, alcanzando su longitud y nivel de complejidad máximos aproximadamente 42 días después del tratamiento con la neurotoxina. Durante este tiempo, la placa terminal permanece sinápticamente inactiva.

En segundo lugar, después de aproximadamente 42 días, los brotes comienzan a regresar, acortándose en longitud y disminuyendo en complejidad. Al mismo tiempo, la placa terminal original comienza a volverse sinápticamente activa, experimentando la renovación de la vesícula sináptica. El incremento en dicha renovación alcanza el de la placa terminal no envenenada aproximadamente 91 días después del tratamiento, más o menos al mismo tiempo que el fenómeno de formación de brotes ha regresado completamente, y ya no puede observarse brote alguno. Estos descubrimientos han sido comunicados en DePaiva et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 96:3200-3205 (marzo 1999), documento que se incorpora aquí por referencia.

Estas observaciones son diametralmente opuestas a la opinión prevaleciente en la técnica, en la que se ha supuesto generalmente que la placa terminal original se desactiva permanentemente por el tratamiento con toxina clostridial, y que todo retorno de la actividad sináptica se debe a la extensión de brotes que compensan la falta de una placa terminal neurológicamente funcional. Sin embargo, como se ha indicado, ha sido demostrado por los presentes Solicitantes que el viejo paradigma es erróneo, en el sentido de que la placa terminal envenenada recupera función neurológica con el tiempo, mientras que los brotes de axones regresan de tal manera que después de un período de tiempo dado el terminal nervioso parece estar esencialmente igual que antes del tratamiento. Por lo tanto, los Solicitantes han descubierto que, lejos de ser una característica permanente, los brotes axonales asumen un papel temporal en la rehabilitación de la placa terminal envenenada.

Aunque no desean quedar limitados por la teoría, los Solicitantes creen que estos resultados indican que los dos sucesos arriba mencionados están coordinados en el tiempo, en el sentido de que un bloqueo del fenómeno de formación de brotes neurales retardaría o bloquearía la recuperación de la placa terminal funcional. Tal coordinación en el tiempo podría deberse a la secreción de uno o más factores por la placa terminal neural dañada (o por la fibra muscular inactiva) que tiene(n) efectos neurotróficos que dan como resultado la formación de brotes neurales; estos brotes pueden elaborar luego un factor (ya sea el mismo o uno diferente del primer factor) que promueve la formación continuada de brotes. Este factor puede ser producido durante la formación de brotes neuríticos en cantidades suficientes para la reinervación de la placa terminal dañada por la neurotoxina incluso después del tratamiento con toxina clostridial. Así, el tratamiento de células con un agente capaz de bloquear la formación de brotes neurales podría retardar o atenuar también de otro modo la capacidad de la placa terminal tratada para experimentar retorno de la función neurológica, y de hecho puede bloquear totalmente dicho retorno.

Como se ha indicado, el suceso señalizador que indica la iniciación del fenómeno de formación de brotes neurales parece estar mediado por una citoquina u otro mensajero intercelular. Uno de dichos agentes, la agrina, parece ser un factor importante, si no la molécula clave, en la formación de la unión neuromuscular en desarrollo, y en la regeneración neuromuscular. Véase Ruegg M.A. y Bixby J.L., Trends in Neurol. Sci. 21:22-27 (1998), cuya exposición se incorpora aquí por referencia. La agrina parece estar presente en varias isoformas, que resultan del corte y empalme alternativos del mRNA. La agrina soluble aislada de extractos de lámina sináptica basal (a la cual se une después de la secreción) es capaz de inducir la agregación de receptores de acetilcolina en las porciones postsinápticas de las células musculares. La agrina presente en los terminales de las neuronas motoras (n-agrina) contiene una inserción, con relación a otras especies de agrina, en una región denominada la región B/z; esta inserción es importante para conferir a la n-agrina la capacidad de agregar receptores de acetilcolina en el tejido post-sináptico. La agrina neural es liberada por el terminal del nervio motor, y los Solicitantes creen que induce la especialización post-sináptica y la regulación en sentido creciente de otros factores, tales como factores difusibles del músculo, implicados en la respuesta de formación de brotes neurales.

Se prevé que las composiciones que interfieren con el fenómeno de formación de brotes (por ejemplo por prevención de la acción de la agrina) retardarían el retorno de la inervación a las células que están controladas por neuronas que han sido envenenadas terapéuticamente (por ejemplo, con BoNT o TeNT) o dañadas por otra causa. Esto es porque, como se ha indicado arriba, la tasa de retorno de la función neuronal parece ser parcialmente dependiente de la presencia de brotes sinápticamente activos. Adicionalmente, los agentes utilizados en la inhibición de la formación de brotes pueden retardar o evitar también la recuperación de la actividad neural de la placa terminal después del envenenamiento.

Por lo tanto, sería de esperar que la utilización de tales composiciones prolongara el período eficaz de tratamiento de los tejidos con una toxina clostridial, por retardar la regeneración de las sinapsis activas neuromusculares, tanto por inhibición de la formación de brotes como por recuperación de la placa terminal envenenada.

Descripción detallada de la invención

Esta invención está orientada a composiciones para incrementar la eficacia terapéutica del tratamiento de tejidos con neurotoxina clostridial. Este incremento en eficacia se hace posible por el descubrimiento sorprendente de que la regeneración del tejido neural dañado por tratamiento con neurotoxina clostridial es un fenómeno complejo en el cual tienen lugar dos sucesos coordinados.

En el primero de estos sucesos, la placa terminal neuromuscular envenenada se vuelve sinápticamente inactiva, demostrando la ausencia de exocitosis de vesículas sinápticas y por lo tanto la ausencia de transporte de acetilcolina intracelular. Al cabo de cuatro días después del tratamiento, la placa terminal comienza a formar brotes neurales que se ha demostrado liberan y regeneran vesículas sinápticas. Estos brotes crecen en longitud y complejidad hasta aproximadamente 42 días después del tratamiento con la neurotoxina; en este punto, los brotes neurales comienzan a regresar y acortarse. Al cabo de noventa y un días después del tratamiento, ya no se pueden ver los brotes neurales.

En el segundo suceso, simultáneamente con el comienzo de la regresión de los brotes neurales, la placa terminal sinápticamente inactiva comienza a recuperar la capacidad de liberar acetilcolina y reciclar vesículas sinápticas. Esta capacidad, que comienza a niveles relativamente bajos, aumenta a lo largo del período de tiempo indicado anteriormente. Aproximadamente a los noventa y un días después del tratamiento con neurotoxina clostridial, la placa terminal es histológica y sinápticamente indistinguible de la condición de la placa terminal antes del tratamiento con neurotoxina clostridial.

Estos descubrimientos indican que es posible intervenir terapéuticamente en uno de los pasos principales del fenómeno de formación de brotes para atenuar o prevenir la formación de brotes neurales como un método para prolongar el período eficaz durante el cual el tejido tratado con la toxina permanece paralizado. En un paso inicial, las células musculares que rodean la placa terminal neural responden, ya sea sensibilizando el músculo inactivo o en respuesta a una señal del terminal nervioso envenenado, produciendo factores difusibles derivados del músculo. La expresión de varios factores señalizadores derivados del músculo parece estar regulada en sentido creciente por la desactivación del músculo; dichos factores incluyen factores de crecimiento semejantes a la insulina (IGF-1 e IGF-2). Se cree que un factor tal como la agrina neural es la señal inicial que ordena a la célula muscular la producción de las moléculas IGF. Algunos informes han demostrado que IGF I e IGF II efectúan el crecimiento de neuritas en ganglios cultivados de la raíz dorsal tratados con BoNT/A, y son capaces además de estimular la respuesta inicial de formación de brotes en músculo glúteo de ratones paralizados. Véase Caroni, P. y Schneider, C. J. Neurosci. 14:3378-3388 (1994) y Caroni, P., et al. J. Cell Biol. 125:893-902 (1994).

Así pues, el bloqueo de los efectos de tales factores difusibles derivados de músculos que afectan positivamente al crecimiento de neuritas y la formación de brotes puede atenuar no sólo la formación de brotes inducida por la neurotoxina clostridial, sino que puede retardar también la recuperación final de la neurotransmisión en los terminales nerviosos envenenados. Dicho bloqueo puede ocurrir por la utilización de anticuerpos específicos para el factor difusible derivado del músculo en cuestión, o que son comunes a dichos factores difusibles derivados del músculo. Alternativamente, existen proteínas de fijación naturales, tales como las proteínas de fijación IGF IGF-BP4 e IGF-BP5, que pueden fijarse al efecto neurotrófico de dichos factores difusibles, y bloquear por tanto el mismo.

IGF-BP4 tiene una secuencia de aminoácidos (desde el término amino) de:

1

(SEQ ID NO: 1)

Esta secuencia está codificada dentro de la secuencia de bases nucleotídicas (desde 5' a 3') de:

2

3

(SEQ ID NO: 3)

4

(SEQ ID NO. 2)

y está codificada dentro de una secuencia de bases nucleotídicas (desde 5' a 3') de:

(Secuencia pasa a página siguiente)

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(SEQ ID NO: 4)

Estas proteínas de fijación pueden producirse sintéticamente o clonarse y producirse para fines terapéuticos, mientras se pueda mantener una línea de células que produzca un anticuerpo monoclonal deseado, para producción de anticuerpos en escala relativamente grande. La clonación y las metodologías generales de anticuerpos son lugar común en la técnica; estas metodologías se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), cuya exposición se incorpora aquí por referencia como parte de la presente exposición.

En lugar de utilizar métodos competitivos, otro aspecto de la invención implica la utilización de un transportador colinérgico especial para insertar un gen que produce receptores inactivos para uno o más factores implicados en la promoción de la formación de brotes neurales. Tales receptores mantendrían altas constantes específicas de fijación a sus ligandos, pero la actividad biológica de los receptores estaría anulada; tales receptores podrían ser generados y escrutados fácilmente mediante la introducción de mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, y ensayo de los mutantes en cuanto a su fuerza de fijación y actividad biológica. Alternativamente, las actividades neurotróficas de los factores producidos por la placa terminal neural o los brotes nacientes pueden inhibirse mediante direccionamiento intracelular y suministro de un inhibidor competitivo, una ribozima, un supresor de la transcripción u otro agente capaz específicamente de bloquear o atenuar dichas actividades, como se ha descrito anteriormente. Dicho direccionamiento intracelular se describe en referencias tales como, por ejemplo, en: Dolly et al., Publicación de Patente Internacional No. WO95/32738, incorporada previamente aquí por referencia.

El segundo punto en el que se puede intervenir en el fenómeno de la formación de brotes es durante la etapa de crecimiento axonal y desarrollo de la arborescencia. En esta etapa ya se ha iniciado dicho crecimiento, pero parecen ser necesarios factores auxiliares para mantener el crecimiento axonal. Se conocen una diversidad de factores que afectan a las tasas de crecimiento, y que pueden afectar también a la supervivencia de muchos tipos de neuronas. Tales factores incluyen al factor neurotrófico ciliar (CNTF); neurotrofinas, con inclusión de NT-3, NT-4, y factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); y factor inhibidor de la leucemia (LIF). Estos factores no sólo son importantes para establecer una tasa inicial de crecimiento axonal, sino que parecen estimular directa o indirectamente su propia producción - - por lo cual el bloqueo del crecimiento inicial de los brotes puede ser esencial para evitar la propagación ulterior de los mismos por la expresión continuada de tales factores.

Los mismos métodos descritos anteriormente pueden utilizarse para evitar que uno o más de los agentes arriba enumerados manifiesten su actividad. Como podría ser esperado por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción, dichos agentes destruyen estos factores o se fijan a ellos, y por lo tanto atenúan la actividad de los mismos, o bloquean su capacidad para fijarse a sus receptores, o formas inactivas de sus receptores, serían útiles cuando se utilizan en conjunción con una neurotoxina clostridial, para evitar o reducir la tasa de formación de brotes de neuritas por la placa terminal envenenada o dañada.

La tercera etapa en la que se puede atenuar o inhibir el fenómeno de formación de brotes concierne a la fijación de axones a la matriz extracelular. Los axones son guiados a los procesos celulares que contienen los receptores del neurotransmisor apropiado por fijación a componentes de la matriz extracelular. Dicha fijación implica una diversidad de moléculas de adhesión transportadas por las células o asociadas a la matriz. Un componente de la matriz extracelular es la tenascina-C derivada de las células de Schwann, que parece fijar procesos neurales. La ninjurina es una molécula de adhesión de la superficie celular que se regula en sentido creciente después de una lesión de nervios periféricos y que se cree está implicada en el guiamiento axonal. Véase Araki, T., et al., J. Biol. Chem. 272:21373-21380 (1997), que se incorpora aquí por referencia. Análogamente, la molécula de adhesión neural-celular (N-CAM), es una molécula de adhesión que se cree está implicada en la fijación de los brotes neurales a la matriz extracelular. Se pueden emplear las mismas técnicas indicadas anteriormente para evitar la expresión o inhibir la actividad de estas moléculas cuando se utilizan como parte de una terapia con neurotoxina clostridial.

Así, en uno de sus aspectos, la presente invención está orientada a composiciones para prolongar el período eficaz durante el cual el tejido tratado con la toxina clostridial se paraliza. El agente capaz de evitar la actividad neurorregenerativa de un polipéptido se selecciona del grupo constituido por IGF-1, IGF-2, factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de la leucemia, tenascina-C, ninjurina, molécula de adhesión neural celular y agrina neural.

En una realización preferida, el agente comprende un polipéptido capaz de fijarse a IGF-1 y/o IGF-2 de manera que evita que una molécula IGF se fije a o active un receptor de la superficie celular implicado en la iniciación de la formación de brotes neurales. En una realización muy preferida, el polipéptido comprende por lo menos una porción de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: IGFBP-4 (SEQ ID NO: 1) o IGFBP5 (SEQ ID NO:2). Preferiblemente dicha porción comprende por lo menos 10 aminoácidos contiguos de dicha secuencia; más preferiblemente, dicha porción comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de dicha secuencia. Muy preferiblemente, la porción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia entera de aminoácidos de IGFBP-4 o IGFBP-5.

El tratamiento de las células con una composición de este tipo puede efectuarse antes del tratamiento con toxina clostridial o simultáneamente al mismo. Preferiblemente, la toxina clostridial es una toxina botulínica. Todavía más preferiblemente, la toxina botulínica comprende BoNT/A. En otras realizaciones, la toxina clostridial es TeNT. A la luz de la presente solicitud, sería de esperar que los agentes que son capaces de fijarse a cualquiera de estos factores de una manera que inhibe su actividad neurotrófica, o que se fijan a los receptores de dichos factores, funcionen como agentes para prolongar el período eficaz entre los tratamientos de tejidos con una neurotoxina.

Otra realización comprende un transportador colinérgico específico unido a un gen que codifica un gen que produce un receptor inactivo para uno o más factores implicados en la promoción de la formación de brotes neurales cuando se suministra a una célula neural in vivo. Preferiblemente, los receptores mantienen altas constantes de fijación específicas a dicho(s) factor(es) y la actividad biológica del receptor es reducida o está ausente. En una realización particularmente preferida, el transportador comprende una parte o la totalidad de una cadena pesada de neurotoxina clostridial, aunque otros transportadores tales como el transportador de la toxina de la difteria pueden ser igualmente eficaces a este respecto.

En otra realización, la invención comprende un transportador colinérgico específico que está unido covalente o no covalentemente a un ácido nucleico que comprende una ribozima o un ácido nucleico antisentido capaz de destruir específicamente los ácidos nucleicos que codifican agentes neurotróficos o sus receptores. Dicha unión puede hacerse por métodos que incluyen, sin carácter limitante, enlace covalente o fuerzas electrostáticas.

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En otra realización, la presente invención está orientada a la estimulación del crecimiento de brotes neurales a partir de tejido neural dañado. Esto podría ser eficaz para incrementar la tasa a la que ocurre la reinervación después de una lesión neural. Esto puede hacerse con una composición que comprende un polipéptido que comprende un dominio neurotróficamente activo derivado de un agente seleccionado de un grupo constituido por IGF-1, IGF-2, factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de la leucemia, tenascina-C, ninjurina, molécula de adhesión neural celular, y agrina neural. Dicha lesión puede ser resultado de envenenamiento con neurotoxina o debida a un suceso traumático, con inclusión, pero sin carácter limitante, de lesiones por aplastamiento de nervios o de la médula espinal, lesiones traumáticas del cerebro, daños a la retina y/o al nervio óptico inducidos por glaucoma, o traumatismo o lesión quirúrgicos.

Los ejemplos siguientes ilustran diversas realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención, el cual está definido únicamente por las reivindicaciones que concluyen esta memoria descriptiva.

Ejemplo 1

El blefaroespasmo es una afección médica caracterizada por el movimiento incontrolado de los párpados. En sus primeras etapas, la afección se caracteriza por parpadeo o aleteo excesivo de los párpados. La afección es generalmente progresiva, reemplazándose en sus últimas etapas el parpadeo excesivo con espasmos de cierre de los ojos que interfieren con la función visual. Los espasmos se hacen más frecuentes e intensos e implican los músculos preseptal, pretarsal y orbicular. La afección conduce frecuentemente a ceguera funcional con relativa rapidez(en cuestión de dos a tres años) después que se han encontrado los síntomas por primera vez.

Un paciente que sufre blefaroespasmo idiopático moderado se trata con inyecciones de preparación de toxina BoNT/A que contienen proteínas no tóxicas y hemaglutininas en solución salina estéril. Alternativamente, puede utilizarse la misma preparación de toxina sin hemaglutininas. Las inyecciones son generalmente de un volumen de 100 \mul; y cada inyección contiene 1,25 a 2,5 unidades de la preparación de toxina. Las inyecciones se efectúan en el músculo pretarsal orbicular del párpado superior en posición lateral y medial y en el párpado inferior en posición lateral y medial. Adicionalmente, se efectúan inyecciones de 2,5 unidades (de 100 \mul cada una) lateralmente al canto lateral y en posición medial de la ceja. La cantidad total de toxina BoNT/A inyectada es aproximadamente 6,25 a 12,5 unidades por ojo. La toxina Bo/A se proporciona en una solución salina estéril y exenta de conservantes y se utiliza la misma solución para diluir la toxina BoNT/A si la preparación magistral es demasiado concentrada.

Después de la inyección, los músculos tratados se paralizan suficientemente debido a este tratamiento para aliviar los síntomas principales del blefaroespasmo. Se observa alguna debilidad suave concomitante en el tejido muscular circundante; estos efectos secundarios son moderados y bien tolerados por el paciente. El efecto de este tratamiento dura aproximadamente 8 semanas, y tiene que repetirse al final de este tiempo para mantener los efectos beneficiosos.

Ejemplo 2

Un paciente con blefaroespasmo se somete a pre-tratamiento con toxina BoNT/A como se indica en el ejemplo 1 con la diferencia siguiente. Antes de la inyección con la preparación de toxina BoNT/A, se suministra al paciente un exceso de 10 veces de IGFBP-4, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La preparación de proteína de fijación se disuelve en solución salina estéril y exenta de conservantes. Cada inyección se efectúa en la misma área que las inyecciones de toxina que siguen al pre-tratamiento; el volumen de cada inyección es 100 \mul. La preparación de toxina BoNT/A se inyecta 10 minutos después de la inyección de IGFBT-4.

La respuesta terapéutica del paciente a la toxina BoNT/A es similar a la observada en el ejemplo 1. La duración del beneficio proporcionado por el tratamiento con toxina BoNT/A se extiende a 12 semanas o más, tiempo durante el cual no es necesario efectuar más inyecciones.

Ejemplo 3

Un paciente con blefaroespasmo se somete a pre-tratamiento con toxina BoNT/A como se indica en el ejemplo 1 con la diferencia siguiente. La toxina BoNT/A ha sido modificada para tener unido a ella un ácido nucleico que comprende una ribozima direccionada específicamente para destruir por acción enzimática el mRNA de la agrina neural. No se efectúa inyección suplementaria alguna.

La respuesta terapéutica del paciente a la toxina BoNT/A es similar a la observada en el ejemplo 1. La duración del beneficio proporcionado por el tratamiento con toxina BoNT/A se extiende a 12 semanas o más, tiempo durante el cual no es necesario efectuar más inyecciones.

Ejemplo 4

Un paciente con blefaroespasmo se somete a pre-tratamiento con toxina BoNT/A como se indica en el ejemplo 1 con la siguiente diferencia. La toxina BoNT/A ha sido modificada para tener unido a ella un ácido nucleico que codifica un receptor neurotrófico inactivo que retiene la capacidad de fijación a su neurotrofina diana. No se efectúa inyección suplementaria alguna.

La respuesta terapéutica del paciente a la toxina BoNT/A es similar a la observada en el ejemplo 1. La duración del beneficio proporcionado por el tratamiento con toxina BoNT/A se extiende más allá de lo observado con BoNT/A sola, tiempo durante el cual no es necesario efectuar más inyecciones.

Se entenderá que, aunque en los ejemplos anteriores se hace referencia a BoNT/A, ésta toxina podría sustituirse por cualquier otra de las especies de toxinas botulínicas (e.g. BoNT/B a G), con ajustes apropiados posiblemente necesarios debido a las diferencias en actividad específica de cada toxina. Adicionalmente, el segmento de cadena ligera podría derivarse de cualquier neurotoxina clostridial (u otra neurotoxina), manteniendo la cadena pesada las actividades de fijación de los receptores de las neuronas y del transporte exo-vascular retenidas por la cadena pesada de BoNT.

Estos ejemplos no pretenden agotar las realizaciones de la presente invención, y la invención no debe considerarse limitada por ellos. Realizaciones adicionales se expondrán en las reivindicaciones que concluyen esta memoria descriptiva.

Claims (13)

1. La utilización de una composición eficaz para prevenir la actividad neurorregenerativa de un polipéptido, comprendiendo dicha composición un agente seleccionado del grupo constituido por: IGF I, IGF II, factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de la leucemia, tenascina-C, ninjurina, molécula de adhesión neural celular, y agrina neural, seleccionándose dicho agente del grupo constituido por:

a) un anticuerpo capaz de fijar selectivamente dicho polipéptido,

b) un inhibidor competitivo de dicho polipéptido,

c) una enzima que escinde un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido,

d) un agente antisentido capaz de fijarse selectivamente a un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido,

e) una proteína de fijación distinta de un anticuerpo,

f) una ribozima, y

g) un ácido nucleico que codifica un receptor inactivo de factores de crecimiento capaz de fijar dicho polipéptido,

para la preparación de un medicamento para la prolongación del período eficaz durante el cual un tejido tratado con una toxina clostridial se paraliza.

2. La utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho agente es un anticuerpo capaz de fijar selectivamente dicho polipéptido.

3. La utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho agente es un inhibidor competitivo de dicho polipéptido.

4. La utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho agente es un agente antisentido capaz de fijarse selectivamente a un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

5. La utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicho agente es una proteína de fijación distinta de un anticuerpo.

6. La utilización de acuerdo con la reivindicación 5, en la cual dicho polipéptido se selecciona del grupo constituido por IGF I e IGF II, y dicha proteína de fijación se selecciona del grupo constituido por IGF-BP4 e IGF-BP5.

7. La utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual dicho medicamento se administra al mismo tiempo que dicho tejido se trata con dicha toxina clostridial.

8. La utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual dicho medicamento se administra antes del tratamiento de dicho tejido con dicha toxina clostridial.

9. La utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual dicha toxina clostridial comprende BoNT.

10. La utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual dicha toxina clostridial comprende BoNT/A.

11. La utilización de un polipéptido que comprende las actividades de fijación y translocación de receptores de una cadena pesada de toxina clostridial, una porción activa de una cadena ligera de toxina clostridial, y un dominio neurotróficamente activo derivado de un agente seleccionado del grupo constituido por IGF I, IGF II, factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de la leucemia, tenascina-C, ninjurina, molécula de adhesión neural celular, y agrina neural, para la preparación de un medicamento para estimular el crecimiento de brotes neurales a partir de tejido neural dañado.

12. Una composición que comprende una toxina clostridial y un agente eficaz para prevenir la actividad neurorregenerativa de un polipéptido seleccionado del grupo constituido por IGF I, IGF II, factor neurotrófico ciliar, NT-3, NT-4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de la leucemia, tenascina-C, ninjurina, molécula de adhesión neural celular, y agrina neural, seleccionándose dicho agente del grupo constituido por:

a) un anticuerpo capaz de fijar selectivamente dicho polipéptido,

b) un inhibidor competitivo de dicho polipéptido,

c) una enzima que escinde un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido,

d) un agente antisentido capaz de fijarse selectivamente a un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido,

e) una proteína de fijación distinta de un anticuerpo,

f) una ribozima, y

g) un ácido nucleico que codifica un receptor inactivo de factores de crecimiento capaz de fijar dicho polipéptido,

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12 en la cual dicho polipéptido se selecciona del grupo constituido por IGF I e IGF II y dicha proteína de fijación distinta de un anticuerpo se selecciona del grupo constituido por IGF- BP4 e IGF-BP5.