ES2206489T3 - Complejos metalicos de coordinacion ion-ligando, anticuerpos dirigidoscontra estos y dosificados realizados con estos anticuerpos. - Google Patents

Complejos metalicos de coordinacion ion-ligando, anticuerpos dirigidoscontra estos y dosificados realizados con estos anticuerpos.

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ES2206489T3 ES95905452T ES95905452T ES2206489T3 ES 2206489 T3 ES2206489 T3 ES 2206489T3 ES 95905452 T ES95905452 T ES 95905452T ES 95905452 T ES95905452 T ES 95905452T ES 2206489 T3 ES2206489 T3 ES 2206489T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LOS INMUNOENSAYOS PARA IONES DE METAL. LA INVENCION PRESENTA: COMPLEJOS DE COORDINACION DE LIGANTES DE IONES DE METAL ("MLC"), NUEVOS LIGANTES, ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA MLC, INMUNOENSAYOS QUE UTILIZAN LOS ANTERIORES, Y METODOS PARA SELECCIONAR LOS ANTICUERPOS.

Description

Complejos metálicos de coordinación ion-ligando, anticuerpos dirigidos contra estos y dosificados realizados con estos anticuerpos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los inmunoensayos para iones metálicos.
Antecedentes de la invención
En la Patente U.S. Nº 4.722.892, según Meares y col., se revelan anticuerpos monoclonales específicos para un complejo que consta de un agente quelante y un ion metálico. También revelada allí es la detección o separación de iones metálicos a partir de una solución conteniendo otros metales, por ejemplo, añadiendo el agente quelante a la solución y pasando la solución sobre una fase sólida a la que han sido preunidos los anticuerpos. De este modo, los anticuerpos capturando el complejo de agente quelante e ion metálico.
La Patente U.S. N^{os} 5.239.078 y 5.189.178 según Galardy y col., revela el producir antisueros inmunizando un animal con un quelador (acoplado a un soporte inmunogénico) que es capaz de unirse a un ion metálico en una proporción uno a uno. Los anticuerpos son útiles para ensayo in vitro de muestras de fluidos biológicos, para supervisar los regímenes terapéuticos o profilácticos de pacientes que reciben el quelador.
Tilby y col. revelan anticuerpos que se unen específicamente a un complejo de ADN y dicloruro de platino en lugar de dicloro-diamino-platino [Tilby y col., Cancer Res., 51, 123-129 (1991)]. El dicloro-diamino-platino es administrado a pacientes con cáncer de ovario y reacciona con el ADN en células en desarrollo, tales como células cancerígenas, para formar el complejo de guanidina y dicloruro de platino y, de ese modo, rompiendo el ADN y causando muerte celular. Los anticuerpos son útiles para ensayo in vitro de muestras de pacientes para la formación del complejo de guanidina y dicloruro de platino, para determinar la respuesta de los pacientes al tratamiento.
Philomin y col. revelan la síntesis de carbonilcomplejos de cobalto de cortisol y testosterona, y anticuerpos policlonales específicos para el ligando esteroideo pero no el ion metálico de cobalto en los complejos [Philomin y col., Bioconjugate Chem., 4, 419-424 (1993)]. Philomin y col. sugieren también el empleo de estos complejos organometálicos como trazadores en inmunoensayos de carbonilmetales no isotópicos. Supra.
La Patente U.S. Nº 5.053.226, según Rosenblum y col, revela anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a uno de los dos ligandos (esto es, 1,2-diaminociclohexano pero no sulfato) de un complejo ternario de platino (II): complejo de sulfato de platino y 1,2-diaminociclohexano disódico.
Las técnicas de polarización fluorescente están basadas en el principio de que un compuesto marcado fluorescente, cuando es excitado por la luz de polarización plana, emitirá fluorescencia que tiene un grado de polarización inversamente relacionada a su velocidad de rotación. Por lo tanto, cuando un complejo de trazador marcado fluorescente-anticuerpo es excitado con luz de polarización plana, la luz emitida permanece muy polarizada porque el fluoróforo está constreñido al rotar entre el tiempo que la luz es absorbida y emitida. Cuando un compuesto trazador "libre" (esto es, no unido a un anticuerpo) es excitado mediante luz de polarización plana, su rotación es mucho más rápida que la del correspondiente conjugado de trazador-anticuerpo, y las moléculas están orientadas más al azar, por lo tanto, la luz emitida se despolariza. De este modo, la polarización fluorescente proporciona un método cuantitativo para medir la cantidad de conjugado de trazador-anticuerpo producido en un inmunoensayo de unión competitivo.
La Patente U.S. N^{os} 4.510.251 y 4.614.823, según Kirkemo y col., revela inmunoensayos de polarización fluorescente (FPIA) para ligandos utilizando derivados de aminometilfluoresceína como trazadores, y los derivados de aminometilfluoresceína, respectivamente. La Patente U.S. Nº 4.476.229, según Fino y col., revela carboxifluoresceínas sustituidas, incluyendo aquellas conteniendo un análogo de tiroxina, para su uso en inmunoensayos de polarización de fluorescencia. La Patente U.S. Nº 4.668.640, según Wang y col., revela un inmunoensayo de polarización de fluorescencia que utiliza carboxifluoresceínas sustituidas.
Ejemplos de FPIA disponibles comercialmente son aquellos para tiroxina tales como los ensayos de T4 Imx®, TDx®, y TDxFLx™ (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
Sumario de la invención
Un aspecto de la invención presenta un complejo de coordinación ion metálico-ligando (el complejo es mencionado aquí como un "CML") constando de dos o más ligandos unidos a un ion metálico. El CML preferido es un CML ternario (mencionado aquí como "CMLT").
Otro aspecto de la invención presenta nuevos ligandos capaces de unirse a iones metálicos. Los nuevos ligandos se pueden utilizar en cualquiera de los aspectos anteriores de la invención.
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Otro aspecto de la invención presenta un CML con un soporte proteico atado a él, para formar un conjugado de CML-proteína que es, preferentemente, inmunogénico.
Otro aspecto de la invención presenta un método que utiliza conjugado de CML- proteína para la producción de anticuerpos específicos para el CML. También presentado es un método para escrutar anticuerpos que se unen al CML, y un método para escrutar anticuerpos que no son reactivos cruzadamente con un CML conteniendo un ion metálico que no sea de interés. De este modo, también presentada es una fase sólida, a la que se une el CML, útil para tal escrutinio.
Otro aspecto de la invención presenta los anticuerpos producidos según el método anterior. Preferentemente, estos anticuerpos reaccionan con un epítopo que combina características estructurales de al menos dos ligandos en un CML, mostrando mientras una mínima reactividad con el ligando individualmente o con el mismo ion metálico.
Otro aspecto de la invención presenta un método que utiliza dos o más ligandos para unirse a un ion metálico de interés, para formar un CML. Preferentemente, este método se aplica a un ensayo in vitro o in vivo para un ion metálico, detectando el CML resultante. Preferentemente, la detección es mediante una unión específica de un agente de unión al CML para formar un complejo (el complejo está mencionado aquí como "agente de unión al CML"). Más preferentemente, los agentes de unión son los anticuerpos anteriores. El método puede ser también aplicado a una eliminación in vitro o in vivo del ion metálico, eliminando el agente de unión al CML resultante.
Otro aspecto de la invención presenta el agente de unión al CML.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta las estructuras de ligandos preferidos.
La Figura 2 muestra, esquemáticamente, un conjugado de CML-proteína en el que la proteína está ligada al CML vía el grupo carboxilo en el CML.
La Figura 3 muestra, esquemáticamente, un conjugado de CML-proteína en el que la proteína está ligada al CML vía el grupo sulfhidrilo en el CML.
La Figura 4 presenta los nuevos ligandos preferidos, en concreto, para su unión a iones plomo.
La Figura 5 muestra el CMLT preferido para el ion plomo.
La Figura 6 presenta la ruta sintética para fabricar un conjugado de CMLT-proteína, M_{3}, comenzando con ligandos L_{9} y L_{13}.
La Figura 7 presenta otra ruta sintética para fabricar el mismo conjugado de CMLT-proteína, M_{3}, comenzando con ligandos L_{13} y L_{15}.
La Figura 8 presenta el nuevo trazador de fluoresceína L_{16}.
La Figura 9 presenta un CMLT de ligando mixto, marcado fluorescente, M_{5}.
La Figura 10 muestra, esquemáticamente, un brazo espaciador bifuncional unido al grupo carboxilo del ligando en el CMLT.
La Figura 11 muestra, esquemáticamente, un brazo espaciador bifuncional unido al grupo sulfhidrilo del ligando en el CMLT.
La Figura 12 presenta el conjugado de CMLT-fluoresceína, PbL_{14}L_{16}, también indicado M_{6}.
Descripción detallada de la invención
La presente invención presenta agentes de unión que se unen específicamente a complejos de coordinación ion metálico-ligando basados en sus configuraciones. Los complejos de coordinación ion metálico-ligando son mencionados, de ahora en adelante, como "CML". Preferentemente, los agentes de unión son agentes de unión biológicos. Los agentes de unión biológicos preferidos son anticuerpos específicos para CML que tengan dos o más moléculas de ligando. Estos anticuerpos son producidos, preferentemente, contra un inmunógeno en el que el CML está unido a una proteína soporte vía uno de los ligandos. La invención descubre que la identificación por anticuerpos de un ion metálico de interés es más específica si el CML tiene dos o más moléculas de ligando, en comparación con los anticuerpos de técnica anterior, los cuales fueron producidos contra conjugados proteicos de CML binarios.
El mayor número de grados de libertad intrínsecos en un complejo multimolecular de 3 componentes (o mayor), comparado con su homólogo de 2 componentes, produce una amplia gama de posibles conformaciones de ligando y estequiometrías ligando-metal, y, por lo tanto, una mayor probabilidad de que exista una configuración particular que sea única para el ion metálico concreto de interés. Los anticuerpos de técnica anterior identifican complejos binarios rígidos, tales como quelatos EDTA y porfirinas, las configuraciones de los cuales varían poco de un metal al siguiente ya que están determinadas, en su mayor parte, por restricciones estéricas inherentes en los mismos ligandos (configuración "controlada por el ligando"). De este modo, tales anticuerpos exhiben baja especificidad por un ion metálico de interés, y no han resultado útiles para, por ejemplo, detectar un ion metálico dado en una muestra conteniendo otros iones metálicos no objetivo.
La presente invención incrementa la especificidad porque las configuraciones de los CMLT (y aquellos con mayor número de ligandos) están determinadas por la naturaleza del ion metálico (esto es, muestran configuración "controlada por el ion metálico") hasta un grado más remoto que las de los complejos binarios. Cuando la configuración está controlada por el ion metálico, se pueden obtener anticuerpos selectivos de la configuración que, para un conjunto fijo de ligandos, muestren alta especificidad para un ion metálico dado cuando está presente en forma de un CML.
Estos ligandos y/o anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, para ensayar o eliminar metales tóxicos en una muestra, por ejemplo, niveles de plomo en muestras biológicas o niveles de mercurio en residuos industriales o plantas de tratamiento de aguas. También pueden ser utilizados para ensayar los niveles terapéuticos de metales en muestras biológicas, tales como el nivel de oro en un paciente al que ha sido administrado oro para tratar su artritis reumatoide. Pueden ser utilizados adicionalmente para ensayar niveles de iones metálicos endógenos, tales como hierro, cobre, cromo, cobalto, etc.
La presente invención también presenta nuevos ligandos útiles para los fines anteriores. Estos ligandos pueden ser utilizados adicionalmente para eliminar metales de una muestra, tal como para eliminar metales tóxicos de muestras industriales, para limpiar plata de soluciones de tratamiento fotográfico. Los ligandos pueden ser adicionalmente administrados in vivo (terapéuticamente) para tratar pacientes que padecen intoxicación por metales, tales como el envenenamiento por plomo.
Los metales descritos aquí pueden ser cualquier metal de interés.
La presente invención también describe criterios para seleccionar los ligandos apropiados para los objetivos anteriores.
La presente invención presenta también anticuerpos específicos para un CML, en donde la especificidad está controlada por el ion metálico.
Lo siguiente explica, con muchos detalles, las anteriores nociones generales.
Complejo de coordinación ion metálico-ligando (CML)
Un CML consta de un ion metálico central unido a algunas otras moléculas, llamadas ligandos. La naturaleza del enlace químico formado entre un ligando y un metal puede ser considerada como implicando la donación de un par de electrones presentes en la molécula de ligando o, en términos de orbitales moleculares, como un orbital molecular formado combinando un orbital lleno del ligando con un orbital vacante del metal. Aquellos átomos en la molécula de ligando que están directamente implicados en formar un enlace químico hacia el ion metálico son denominados, por lo tanto, átomos donantes, y estos comprenden generalmente elementos de los Grupos V y VI de la Tabla Periódica, con nitrógeno oxígeno, azufre, fósforo y arsénico siendo los más frecuentemente empleados.
Las moléculas que contienen dos o más átomos donantes capaces de unirse a un único ion metálico son denominadas agentes quelantes o queladores, y los correspondientes complejos metálicos son llamados quelatos. El número de átomos donantes presentes en un quelador dado se denomina denticidad de ese quelador, siendo llamados bidentados los ligandos que poseen dos sitios donantes, tridentados aquellos con tres sitios donantes, y así sucesivamente. En general, cuanto mayor sea la denticidad de un quelador más estable serán los quelatos formados, hasta el punto en el que la denticidad del quelador satisfaga el número de coordinación máximo alcanzable por el ion metálico concreto de interés. El máximo número de coordinación de un ion metálico dado, en un estado de oxidación dado, es una propiedad intrínseca de ese metal, reflejando el número de orbitales vacantes y, por eso, el número de enlaces químicos que es capaz de formar con los átomos donantes del ligando. Cuando todos los orbitales vacantes disponibles han sido utilizados para formar enlaces hacia los átomos donantes en el ligando o ligandos, se dice que el metal está saturado coordinativamente.
Ligandos
En la presente invención, el número de ligandos implicados en el CML tiene que ser dos como mínimo y, dependiendo del ion metálico de interés, puede ser ocho como mucho. En cualquier complejo dado, el número de ligandos estará determinado por la naturaleza del ion metálico concreto (principalmente su máximo número de coordinación) y la naturaleza de los ligandos seleccionados (su denticidad, grupo de átomos donantes, carga, tamaño, etc.). No se necesita que el sitio que reúne los anticuerpos identifique las características de todos los ligandos presentes en el complejo. Con tal que el anticuerpo identifique una combinación de al menos dos ligandos, pueden estar presentes ligandos adicionales, que no contribuyan al epítopo, para estabilizar el complejo o para intensificar otras propiedades tales como la solubilidad acuosa.
Para cualquier ion metálico dado, por un especializado en la técnica se pueden seleccionar ligandos útiles según la presente invención, empleando los criterios siguientes. Los ligandos deben poseer átomos donantes (o grupos de átomos donantes en el caso de ligandos quelantes) que favorezcan la unión al ion metálico objetivo, siendo bien conocida en la técnica la preferencia general de cualquier ion metálico dado por átomos donantes concretos (generalmente seleccionados del grupo que se compone de átomos de oxígeno carboxílicos, fenólicos o de éter; átomos de nitrógeno amino, imino o aromáticos; y átomos de azufre cargados o neutros).
No es esencial que alguno de los ligandos que contribuyen al epítopo identificado por un anticuerpo, según la presente invención, sean ligandos quelantes. Aunque los ligandos apropiados para su uso en la presente invención son, preferentemente, ligandos quelantes, no es esencial la presencia de un ligando quelante ya que también pueden ser útil la presencia de ligandos no quelantes tales como ciertas fosfinas y análogos de azúcares. El único requerimiento es que el anticuerpo identifique una combinación de al menos dos ligandos en la esfera de coordinación de un CML, y estos ligandos pueden ser monodentados o de denticidad superior.
Sin embargo, los ligandos también tienen que ofrecer la expectativa de formar uniones ligando-metal que sean apropiadas para permanecer estables in vivo, esto es, la unión ligando-metal no se disocie durante el tiempo requerido para producir una respuesta inmune hacia el complejo (generalmente varios meses). Para muchos metales de interés, existe una considerable técnica acerca de la estabilidad in vivo de uniones ligando-metal concretas, las cual puede ser utilizada para guiar la selección de los ligandos. Para muchos iones metálicos de interés, este requerimiento favorece la selección de ligandos quelantes, ya que los ligandos quelantes forman, generalmente, complejos de coordinación de estabilidad termodinámica superior a la de las correspondientes combinaciones de ligandos monodentados.
Ligandos quelantes útiles, que forman CML muy estables con muchos iones metálicos, incluyen ácidos poliaminopolicaboxílicos tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), y aminopolicarboxilatos conteniendo fenol tales como el ácido N,N'-bis(hidroxibencil)etilendiamino-N,N'-diacético (HBED). Estos queladores tienen una denticidad de 6 o superior y, como la mayoría de los metales del grupo de transición y principal, tienen un máximo número de coordinación de 6, las especies resultantes son CML binarios saturados coordinativamente, esto es, complejos constando de una única molécula de ligando y un único ion metálico.
Los anticuerpos preferidos según la presente invención identifican el CML que consta del ion metálico de interés más 2 ó 3 ligandos, siendo particularmente preferidos aquellos que contengan 2 ligandos.
En casos donde no haya técnica directa acerca de estabilidad in vivo, se puede utilizar la técnica relativa a la estabilidad termodinámica y/o cinética de diversas combinaciones ligando-metal, como base para la selección de los ligandos.
Un requerimiento adicional es que, cada uno de esos ligandos que comprenden el epítopo identificado por un anticuerpo según la presente invención, sea bifuncional. Un ligando bifuncional es una molécula que contiene, además de como mínimo un sitio de unión de metal (átomo donante), una segunda porción reactiva mediante la cual el ligando pueda ser unido covalentemente a, por ejemplo, una proteína, una fase sólida o un marcador, sin afectar significativamente a las propiedades de unión del ligando al metal. La bifuncionalidad de los ligandos es esencial para configurar ensayos de escrutinio utilizados para identificar y seleccionar anticuerpos monoclonales que sean específicos para el CML, para preparar medios para cromatografía de afinidad utilizados para purificar tales anticuerpos, y para preparar trazadores de antígeno-marcador para su uso en inmunoensayos.
Un especializado en la técnica identificará fácilmente posiciones dentro de una molécula de ligando dada, donde la incorporación de una porción reactiva adicional no afectará a las propiedades de unión al metal, y también identificará fácilmente porciones que sean útiles para acoplar el ligando a otra molécula o fase sólida. Los ligandos también deberían ser seleccionados de manera que contengan un esqueleto orgánico sumamente diferenciado, incorporando dondequiera posibles estructuras aromáticas, sistemas de anillos rígidos y centros de carbonos asimétricos. Habiendo seleccionado el grupo de átomos donantes, la denticidad, el brazo lateral bifuncional y el esqueleto orgánico de los ligandos, la estequiometría del CML diana resultante (esto es, si ternario o de molecularidad superior) estará dictada por el máximo número de coordinación del ion metálico concreto de interés.
Además de exponer la bifuncionalidad y la unión estable ligando-metal in vivo, los ligandos preferidos incorporan también características estructurales que se cree contribuyen a la inmunogenicidad e identificación diferencial por proteínas. Tales características estructurales incluyen sistemas de anillos aromáticos [Zoller y col., J. Nucl. Med., 33, 1.366-72 (1992)], estructuras cíclicas rígidas [Kosmas y col., Cancer Res., 53, 904-11 (1992)], y centros de carbonos asimétricos [Reardon y col., Nature, 316, 265-68 (1985); Zoller y col., J. Nucl. Med., 33, 1.366-72 (1992)].
Ligandos preferidos
Los ligandos preferidos son queladores tridentados que son bifuncionales y tienen carácter aromático. Un grupo particularmente preferido de tales ligandos está formado por la base de Schiff por condensación de un aminoácido, conteniendo sulfhidrilo, con aldehídos o cetonas aromáticos que contengan un átomo donante (nitrógeno u oxígeno) colocado 2 ó 3 átomos de carbono distante del átomo de oxígeno del aldehído (o cetona). Los sistemas de anillos aromáticos son derivatizados, opcionalmente, con grupos cargados negativamente para aumentar la inmunogenicidad y solubilidad acuosa. De estos, son particularmente preferidos los ligandos mostrados en la Figura 1. Aquí, estos ligandos son mencionados también como L_{1} a L_{8}. Por lo que el inventor conoce, estos ligandos son nuevos excepto el L_{6} cuando su r es CH_{2} y su X = OH.
Los ligandos matriz (L_{1} a L_{8}, donde X = -OH) son potencialmente tetradentados, proporcionando en todos los casos un donante de sulfhidrilo, un donante de nitrógeno imino, un donante de oxígeno carboxilato, y un donante de nitrógeno aromático (L_{1}-L_{4}) o un donante de oxígeno fenólico (L_{5}-L_{8}). Cuando se utilizan en la presente invención, los ligandos se unen a otras moléculas mediante la función carboxilato o la función sulfhidrilo, dejando tres sitios donantes sobrantes. Los ligandos unidos a carboxilato se unen a iones metálicos como se muestra esquemáticamente en la Figura 2, mientras que los ligandos unidos a sulfhidrilo se unen a iones metálicos como se muestra esquemáticamente en la Figura 3. La selección de un sito de unión está dictada por la naturaleza del ion metálico de interés. Para aquellos metales que muestren parcialidad hacia los donantes de azufre sobre los donantes de oxígeno, se utiliza una unión carboxilato a fin de dejar un sitio tridentado residual que conste del grupo sulfhidrilo, el nitrógeno imino, y un nitrógeno aromático (en el caso de L_{1} a L_{4}) o un oxígeno fenólico (en el caso de L_{5} a L_{8}. Para aquellos metales que muestren parcialidad hacia los donantes de oxígeno, se utiliza una unión sulfhidrilo, dejando un sitio tridentado residual que conste de un oxígeno carboxilato, un nitrógeno imino, y un nitrógeno aromático (en el caso de L_{1} a L_{4}) o un oxígeno fenólico (en el caso de L_{5} a L_{8}).
Los CMLTs de diversos iones metálicos del grupo de transición y principal, apropiados para su uso como dianas para la producción de anticuerpos específicos para el CML, pueden ser construidos a partir de combinaciones de ligandos simétricas (todos los ligandos idénticos) o mixtas (esto es, combinaciones de ligandos distintos) de los ligandos preferidos mostrados en la Figura 1. Tales CMLs, cuando se conjugan a una proteína soporte, son útiles como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para ese ion metálico en forma de complejo. Los ligandos L_{1}-L_{4} (Y = Z = Hidrógeno) portan una única carga negativa formal cuando están en una forma unida al metal (Figura 2), mientras que los ligandos L_{5}-L_{8} (Y = Z = Hidrógeno) están doblemente cargados. Además de la selección de un átomo donante preferido (azufre u oxígeno), la selección de la carga electrónica del ligando cae también dentro de la naturaleza del ion metálico concreto de interés.
De interés particular para la presente invención son los anticuerpos para CMLs de plomo (II). El plomo (II) muestra parcialidad hacia los donantes de azufre sobre los donantes de oxígeno, y requiere únicamente dos ligandos cargados individuamente para lograr la neutralización de la carga bipositiva en el ion plomo. Los anticuerpos preferidos que manifiestan especificidad por los CMLs de plomo (II) son producidos contra complejos ternarios construidos a partir de combinaciones de ligando simétricas y mixtas de los ligandos mostrados en la Figura 4.
Los ligandos L_{9}-L_{12} forman CMLTs electrónicamente neutros con plomo (II), de fórmula general [(Ligando)_{2}Pb]. Tales CMLTs pueden ser complejos de ligando simétricos [(L_{9})_{2}Pb, (L_{10})_{2}Pb, (L_{11})_{2}Pb, (L_{12})_{2}Pb] o mixtos (L_{9}L_{10}Pb, L_{9}L_{11}Pb, L_{9}L_{12}Pb, L_{10}L_{11}Pb, L_{10}L_{12}Pb, L_{11}L_{12}Pb). Los anticuerpos particularmente preferidos según la presente invención identifican un CML simétrico basado en el ligando L_{9}, y teniendo la estructura mostrada en la Figura 5. Este CMLT (M_{1}) contiene dos sistemas de anillos aromáticos deslocalizados, cuatro anillos quelato de 5 miembros, y dos centros de carbonos asimétricos (marcados con "*" en la Figura 5).
Iones metálicos de interés
De particular interés para la presente invención son anticuerpos que reconocen aquellos iones metálicos que se pueden encontrar en la corriente sanguínea humana. Tales metales incluyen iones metálicos endógenos esenciales e iones metálicos no fisiológicos que puedan estar presentes como consecuencia de su uso como productos terapéuticos o debido a la ingestión, absorción o inhalación de metales presentes en el ambiente. De este modo, los iones metálicos incluyen iones de plomo, mercurio, níquel, cadmio, talio, antimonio, plata, cromo, manganeso, platino, oro, aluminio, bismuto, galio, hierro, cobre, zinc, cobalto, molibdeno, selenio y vanadio. Según una forma de realización preferida de la presente invención, se proporcionan anticuerpos monoclonales específicos para el CML de plomo.
Conjugados de CML-proteína
Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan conjugados en donde un CML está unido covalentemente a una molécula de proteína. Tales conjugados de CML-proteína son utilizados como inmunógenos y como recubrimientos en los ensayos ELISA de microtitulación en placas recubiertas empleadas para escrutar y caracterizar anticuerpos monoclonales de la presente invención. Los métodos generales para la preparación de tales conjugados de CML-proteína pueden ser ilustrados, utilizando como ejemplo, el particularmente preferido CML de plomo (II) mostrado en la Figura 5 (M_{1}). En la Figura 6 se muestra la secuencia de reacción utilizada para preparar conjugados de M_{1} con proteínas. La proteína es, preferentemente, una que origine respuesta inmunogénica en un animal. Ejemplos de la proteína son: albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa (KLH), tiroglobulina, inmunoglobulina (IgG), etc. Alternativamente, en lugar de proteína, se pueden utilizar los siguientes: carbohidratos, polisacáridos, lipopolisacáridos, poli(amino)ácidos, ácidos nucleicos, y otros, de suficiente tamaño e inmunogenicidad. Los métodos sintéticos para estas alternativas pueden ser logrados, por un especializado en la técnica, basados en la revelación aquí.
Como se muestra en la Figura 6, se produce una unión amida entre una de las moléculas de ligando en el CML y la proteína, por transformación del grupo ácido carboxílico en un éster activo de N-hidroxisuccinimida (Fórmula L_{13}, Figura 6). El segundo ligando en el CML, que no está implicado en formar una unión covalente con la proteína, se utiliza en forma de n-butilamida (Fórmula L_{14}, Figura 6). Esto se hace para hacer indisponible el grupo carboxilo del segundo ligando para la unión al metal, y para producir un análogo estructural de la forma conjugada del ligando, el cual está unido a la proteína vía la cadena lateral de 4 carbonos de un residuo de lisina (Fórmula M_{3}, Figura 6). Los esquemas de conjugación preferidos suponen el hacer reaccionar la proteína con un CMLT preformado en el que un ligando está activado (por ejemplo, Fórmula M_{2}, Figura 6). Alternativamente (Figura 7), la proteína se hace reaccionar primero con un ligando libre activado (L_{13}), y el conjugado de proteína-ligando resultante (Fórmula L_{15}, Figura 7) es incubado primero con el ion metálico, para dar el intermedio M_{4} (Figura 7), después con el ligando en forma de n-butilamida para dar el conjugado final de CML-proteína (M_{3}, Figura 7).
Cuando al preparar conjugados de CML-proteína con fines de pruebas de reactividad cruzada, un ion metálico no diana, potencialmente interaccionante [por ejemplo hierro (III) cuando el ion metálico de interés es plomo (II)], reemplaza al ion metálico de interés en las secuencias de reacción mostradas en las Figuras 6 y 7. Se comprende que, en algunos casos, la estequiometría del CML de un metal interaccionante puede no ser la misma que la del correspondiente CML del ion metálico de interés.
Agentes de unión biológicos tales como anticuerpos monoclonales
Otro aspecto de la presente invención tiene que ver con agentes de unión biológicos que poseen sitios de unión específicos, de alta afinidad, para el CML. Específicamente, se refiere a agentes de unión biológicos, tales como anticuerpos monoclonales o polipéptidos recombinantes, que identifican y se unen fuertemente al CML que consta de dos o más ligandos junto con el ion metálico de interés, esto es, un CMLT y aquellos con mayores miembros de ligandos.
Estos anticuerpos reaccionan con un epítopo que combina características estructurales de al menos dos ligandos en un CML, mostrando mientras mínima reactividad con el ligando individualmente o con el mismo ion metálico, esto es, estos anticuerpos identifican un epítopo que es característico del CML completamente formado. Además de interaccionar con los esqueletos orgánicos de la menos dos de los ligandos en el complejo, el sitio que reúne los anticuerpos puede implicar también la formación de uno o más enlaces coordinados entre cadenas secundarias de aminoácidos y el ion metálico, aunque esto no es un prerrequisito parar obtener anticuerpos que exhiban especificidades útiles por el ion metálico.
Además de inmunoglobulinas íntegras, aquí los anticuerpos incluyen aquí fragmentos de unión de antígeno de las inmunoglobulinas. Ejemplos de estos fragmentos son Fab, F(ab')_{2} y Fv. Tales fragmentos pueden ser producidos mediante métodos conocidos.
Para cualquier ion metálico dado, el proceso de desarrollar un anticuerpo específico para ese metal consta de: a) seleccionar un CML de dicho ion metálico que contenga al menos dos ligandos; y b) preparar un inmunógeno en el que dicho CML diana esté unido covalentemente a una proteína soporte para formar un conjugado de CML-proteína que sirva como inmunógeno. Los anticuerpos que exhiben especificidad por el ion metálico pueden ser producidos contra un CML de iones metálicos del grupo principal, iones metálicos de transición o iones metálicos de la series de elementos de los lantánidos y actínidos. Los inmunógenos preferidos son conjugados de CML-proteína con más de dos ligandos, y más preferentemente, los ligandos son aquellos mostrados en las Figuras 1 y 4, discutidos anteriormente. Abajo, en el Ejemplo 7, se describe un ejemplo del conjugado de CML-proteína preferido.
El inmunógeno puede ser utilizado para preparar anticuerpos, policlonales y monoclonales, según métodos conocidos en la técnica, para su uso en un sistema de inmunoensayos según la presente invención. Generalmente, un animal huésped, tal como un conejo, cabra, ratón, cobaya, o caballo es inyectado, en uno o más sitios diversos, con el inmunógeno, normalmente una mezcla con un adyuvante. Se hacen inyecciones adicionales en el mismo sitio o sitios diferentes, a intervalos regulares o irregulares, después de lo cual siendo tomadas sangrías para valorar el título del anticuerpo hasta que se determine qué título óptimo se ha logrado. Se obtienen anticuerpos sangrando al animal huésped para producir un volumen de antisuero, o mediante técnicas de hibridación celular somática u otras técnicas conocidas en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales, y se pueden almacenar, por ejemplo, a -20ºC.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos mediante el método de Kohler y Milstein [Nature, 256, 495-497 (1975)], inmortalizando células del bazo de un animal inoculado con el inmunógeno o fragmento del mismo, por lo general mediante fusión con una línea celular inmortal (preferentemente una línea celular de mieloma) de la misma o diferentes especie que el animal inoculado, seguido por las adecuadas etapas de clonación y escrutinio. En la presente invención, los hibridomas resultantes son escrutados por la producción de anticuerpos monoclonales que se unan al CML diana, pero no se unan a los ligandos libres o al CML de iones metálicos no diana.
Los anticuerpos monoclonales según la presente invención ofrecen la ventaja de una alta especificidad por el ion metálico diana. La unión específica al complejo ternario (o de superior molecularidad) elegido del ion metálico diana se logra incluso en presencia de un exceso masivo de metales no diana contaminantes o ligandos libres, o de ambos. Esto hace posible configurar inmunoensayos sensibles y específicos para cualquier ion metálico de interés, añadiendo una combinación de al menos dos ligandos a muestras que se cree contienen el ion metálico diana, y utilizando un anticuerpo de la presente invención para investigar la presencia del CML diana. Se cree que el sorprendente alto grado de especificidad por el ion metálico, exhibido por los anticuerpos de la presente invención, surge porque el mayor número de grados de libertad intrínseca en un complejo multimolecular de 3 componentes (o superior), comparado con su homólogo de 2 componentes, produce una amplia gama de posibles conformaciones de ligando y estequiometrías ligando-metal y, por lo tanto, una mayor probabilidad de que exista una configuración particular que sea única para el concreto ion metálico de interés.
Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos según los métodos revelados en Reading, Patente de los Estados Unidos Nº 4.474.893, o Cabilly y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567. Los anticuerpos también pueden ser construidos químicamente según el método revelado en Segel y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.676.980.
En la técnica anterior se han descrito métodos más específicos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales, específicos para CML (ver la discusión abajo, las referencias citadas aquí están incorporadas como referencia), y se pueden utilizar para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales de esta invención excepto que los inmunógenos y el método para escrutar los anticuerpos deseados serían como los descritos en esta invención. Estas modificaciones permiten la producción y selección específicas para anticuerpos que identifican un epítopo que combina características estructurales de al menos dos ligandos en un CML, los cuales no se encuentran en la técnica anterior. Los anticuerpos monoclonales preferidos son sumamente específicos para un complejo de coordinación dado, de un ion metálico dado y un grupo dado de ligandos. Preferentemente, estos anticuerpos identifican un CML partiendo de la base de su configuración. Además de identificar características estructurales presentes en al menos dos moléculas de ligando, el sitio de unión del anticuerpo puede implicar también la formación de uno o más enlaces coordinados entre el ion metálico y cadenas laterales de aminoácidos de la inmunoglobulina. Sin embargo, no es esencial que las cadenas laterales del anticuerpo funcionen como ligandos para que un anticuerpo, según la presente invención, muestre especificidad para un CML dado.
De este modo, los anticuerpos de la presente invención superan el problema de la reactividad cruzada con formas del ligando(s) sin metales, y exhiben una inesperada alta especificidad por el ion metálico diana, el cual puede ser un metal del grupo principal, un metal de transición o un miembro de las series de metales de los lantánidos o actínidos. De este modo, se pueden configurar inmunoensayos sensibles y específicos para tales metales, utilizando estos anticuerpos. Estos anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, para construir ensayos para medir la concentración de un ion metálico concreto en cualquier muestra de interés. En una forma de realización particularmente preferida, se utilizan anticuerpos monoclonales, para un CML de plomo (II), para construir inmunoensayos para niveles de plomo en sangre, orina y otros fluidos y tejidos corporales, siendo tales ensayos de uso en escrutar y supervisar concentraciones de plomo en el cuerpo humano.
Por contraste, la técnica anterior únicamente revela anticuerpos para un CML que identifican un ligando del CML o el ion metálico solamente. Los primeros tales anticuerpos fueron descritos por Meares y col., Patente U.S. Nº 4.722.892, quienes emplearon un inmunógeno constando de KLH conjugada al complejo de indio (III) de un derivado aminobencilo de EDTA. Se obtuvieron anticuerpos que se unían al complejo de In-EDTA con alta afinidad (K = 4 x 10). Aunque estos anticuerpos también se unirían a complejos de EDTA de metales que no sean el indio, la constate de afinidad para su unión al complejo de In-EDTA fue de un orden de magnitud mayor que la de para cualquier otro complejo de EDTA estudiado. En conjunto, las constantes de afinidad para unión de los anticuerpos a diversos complejos de EDTA de iones metálicos divalentes y trivalentes abarcaron un rango logarítmico de 4. Revelaciones posteriores han descrito anticuerpos monoclonales producidos contra el complejo de EDTA de cobalto (II) [Goodwin y col., J. Nucl. Med., 29, 226-34 (1988)], complejos de DTPA de indio (III) [Eillette y col., J. Immunol. Methods, 124, 277-82 (1989); Le Doussal y col., Cancer Res., 50, 3.445-52 (1990)], complejos de meso-tetrakis(carboxifenil)porfirina de hierro (III) y cobalto (II) [Schwabacher y col., J. Am. Chem. Soc., 111, 2.344-46 (1989)], N-metilmesoporfirina IX [Cochran y col., Science, 249, 781-83 (1990)], el complejo de meso-tetrakis(4-carboxivinilfenil)porfirina [Keinan y col., Pure Appl. Chem., 62, 2.013-19 (1990)], y el complejo de HBED de galio (III) [Zoller y col., J. Nucl. Med., 33, 1.366-72 (1992)]. Además de estos esfuerzos premeditados para preparar anticuerpos para un CML, ha sido documentada una respuesta antiquelato humoral policlonal, como efecto secundario anticipado, en algunos pacientes con cáncer recibiendo infusiones intravenosas de un anticuerpo monoclonal conjugado al complejo de itrio (III) de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N'-N''-tetraacético (DOTA), un quelador macrocíclico de poliamino-policarboxilato [Kosmas y col., Cancer Res., 52, 904-11 (1992)].
Los sistemas antiporfirina, todos los cuales identifican complejos de metal:porfirina 1:1, son de interés como potenciales anticuerpos catalíticos, mientras que los demás anticuerpos monoclonales antiquelato fueron desarrollados para su uso in vivo en estrategias experimentales de terapia tumoral que empleen anticuerpos biespecíficos e iones metálicos radioisotópicos, como se reveló por Meares y col., Patente U.S. Nº 4.722.892. Como tales estrategias requieren que el complejo metálico permanezca absolutamente estable in vivo, fueron seleccionados queladores que forman complejos de muy alta estabilidad termodinámica (EDTA, DTPA, HBED). Estos son queladores de alta denticidad (6-8) y, de este modo, en todos estos descubrimientos anteriores, las especies inmunizadoras fueron CML binarios constando de un único ligando quelante orgánico y un único ion metálico. Los potenciales determinantes antigénicos, disponibles para evocar una respuesta a estos inmunógenos, fueron confinados, por lo tanto, en el esqueleto orgánico de un único ligando quelante y, posiblemente, el mismo ion metálico.
Aunque se cuenta con que, en general, los componentes orgánicos de un CML constituyan la característica más inmunogénica, se han descrito anticuerpos monoclonales que identifican especies metálicas "iónicas", no queladas, sencillas. Finnegan y col., EPO 0235457, revelan un anticuerpo monoclonal para cianuro de oro (I), obtenido mediante sensibilización in vitro de células esplénicas de ratón con la sal metálica, y posterior fusión con una línea celular de mieloma. El anticuerpo resultante mostró un 29% de reactividad cruzada con cianuro de plata (I). Wagner y col., WO 9010709, revelan anticuerpos monoclonales reactivos con cationes metálicos y, en particular, con Hg (II) y Pb (II). Estos anticuerpos fueron obtenidos mediante procedimientos estándar a partir de ratones inmunizados con conjugados de BSA-glutatión acomplejados con el ion metálico de interés. En el caso de mercurio, se demostró que el anticuerpo reacciona con iones mercurio libres, independiente de los agentes coordinadores, y, de este modo, no se requiere esa preformación de un CML con ion mercurio para la identificación del ion mercurio por el anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos antiquelato de la técnica anterior exhiben propiedades que limitarían gravemente su uso para construir inmunoensayos para metales. La principal entre estas es la especificidad de la inmunoglobulina por el ion metálico. Una diferencia logarítmica de 1-2 en la constante de afinidad entre el metal diana y el siguiente más reactivo es, probablemente, inadecuada para muchas aplicaciones, particularmente aquellas que impliquen la medición de metales traza en muestras biológicas donde puedan estar presentes otros iones metálicos (no diana) a niveles 4 logarítmicos o más superiores que el metal diana. Una segunda preocupación es la reactividad de anticuerpos antiquelato con el agente quelante "vacío" (esto es, no metalizado). En las aplicaciones de terapia tumoral para las que se han desarrollado la mayoría de los anticuerpos antiquelato, tal reactividad cruzada presenta pocos problemas. Sin embargo, en un formato de inmunoensayo in vitro, la concentración de metal diana en la muestra será generalmente desconocida y, por consiguiente, se necesitará añadir, en general, un gran exceso de agente quelante a la muestra para asegurar la completa acomplejación. Por lo tanto, las muestras contendrán frecuentemente concentraciones significativas de quelador libre, el cual puede en algunos casos exceder, en varios órdenes de magnitud, la concentración de quelato en la muestra. La reactividad cruzada del anticuerpo con el agente quelante libre daría origen, de este modo, a valores artificialmente altos.
Cromatografía de afinidad para aislar y purificar anticuerpos reactivos con un CML
Otro aspecto de la presente invención proporciona medios para cromatografía de afinidad compuestos de un CMLT acoplado covalentemente a una fase sólida apropiada. Tales medios para cromatografía de afinidad son utilizados para aislar y purificar anticuerpos monoclonales que sean reactivos con un CML. Utilizando una fase sólida derivatizada de amino, tal como aminoetil-Sepharose 4B, las mismas secuencias de reacción, utilizadas para preparar conjugados de CML-proteína, pueden ser utilizadas para preparar cuentas de Sepharose derivatizadas con CML. Como con los conjugados de CML-proteína, se pueden obtener cuentas de Sepharose que estén derivatizadas con un CMLT, mixto o simétrico, de un ion metálico diana o de un ion metálico interaccionante.
Se ha informado que es difícil la purificación por cromatografía de afinidad de anticuerpos monoclonales para complejos binarios de EDTA-metal, y Beidler y col., U.S. 5.112.951, revelan el empleo de soportes sólidos derivatizados de ácidos oxo, tales como resinas de sulfopropilo, como un medio alternativo para purificar anticuerpos para quelatos de metal-EDTA 1:1.
Los medios para cromatografía de afinidad de la presente invención ofrecen la ventaja de que el anticuerpo puede ser liberado del soporte sólido bajo condiciones relativamente suaves, empleando alguna de diversas estrategias. Como el epítopo identificado por el anticuerpo implica el CML formado, cualquier proceso que cause la disociación de dicho complejo puede proporcionar una base para la elución controlada del anticuerpo de la matriz de afinidad. Tales procesos incluyen reacciones de intercambio de ligando en general, siendo particularmente preferidos aquellos que empleen ligandos pequeños con alta afinidad por los iones metálicos (por ejemplo, el ion cianuro). Alternativamente, también se puede utilizar un gran exceso de un ion metálico no diana para accionar una reacción de intercambio de ligandos que rompa el complejo ternario diana, originando la liberación del anticuerpo de la fase sólida. Todas las tales estrategias producen una fase sólida que, después de la elución del anticuerpo, contiene todavía el primer ligando acoplado covalentemente. La regeneración del medio para cromatografía de afinidad es, por lo tanto, fácilmente lograda reequilibrando la fase sólida con ion metálico diana y segundo ligando (no unido covalentemente) nuevos.
Ensayos de actividad
En una configuración de ensayo preferida, los conjugados de CML-proteína son revestidos sobre una fase sólida, y utilizados para capturar anticuerpos reactivos con el CML. Nuevamente, utilizando plomo (II) como ejemplo, se recubren placas de microtitulación de 96 pocillos con un conjugado de CML-proteína de plomo (II) (por ejemplo, Fórmula M_{3}). La placa, que lleva el conjugado de CML-proteína adsorbido, es utiliza luego en un ensayo ELISA en el que se incuba en pocillos una muestra que se cree contiene anticuerpos murinos reactivos con el CML, los cuales son luego lavados y expuestos a un anti-anticuerpo de ratón (por ejemplo, cabra anti-ratón) que está conjugado a una porción generadora de señales [por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRPO)].
En el ensayo anterior, los anticuerpos que sean reactivos con el CML del ion metálico de interés, son luego ensayados adicionalmente para establecer su modelo de reactividad cruzada con CMLs análogos construidos a partir del mismo ligando(s) mas un ion metálico no diana. Al escrutar, por ejemplo, medios de cultivo tisular de sobrenadantes de hibridomas para anticuerpos útiles en la presente invención, se utilizan tres ensayos secuenciales (ELISA o FPIA en placas de microtitulación). La primera etapa en la secuencia emplea el CML diana, como conjugado de CML-proteína (tal como conjugado de CML-BSA para ELISA) o como trazador (tal como un trazador de fluoresceína para FPIA), para identificar todos los anticuerpos reactivos con el CML presentes en los medios de cultivo tisular. Estos anticuerpos reactivos con el CML son ensayados luego frente al correspondiente conjugado de ligando libre-proteína (tal como un conjugado de ligando libre-BSA para ELISA) o trazador-ligando libre (tal como trazador de ligando libre-fluoresceína para FPIA), y se descartan los anticuerpos que sean reactivos en este ensayo, ya que fracasan para satisfacer el criterio de unirse a dos o más ligandos en un CML. Aquellos anticuerpos que sean reactivos con el CML diana, pero no reactivos con el correspondiente ligando libre, son después escrutados además por su reactividad con CML análogos de metales interaccionantes.
De este modo, en el caso de escrutinio ELISA para un anticuerpo selectivo para plomo (II), cualquier anticuerpo que reaccione con la placa recubierta con CML de plomo (II)-proteína es comprobado luego en ensayos similares en los que las placas de microtitulación están recubiertas con los análogos de hierro (III), cobre (II) o zinc (II) de M_{3}. Cualquier anticuerpo que reaccione con la placa recubierta con CML de plomo (II)-proteína es también ensayada por su reactividad con ligando libre, utilizando un ensayo ELISA análogo en el que se utiliza conjugado de ligando-proteína (Fórmula L_{15}, Figura 7) para recubrir la placa. Los anticuerpos selectivos para plomo (II) son identificados en base a su mínima reactividad con las placas de ligando libre y metal no diana, y máxima reactividad con la placa con CML de plomo (II).
En el escrutinio FPIA, la reactividad de una muestra que se cree contiene un anticuerpo reactivo con M_{3} sería evaluada utilizando cinco trazadores fluorescentes: L_{16} (Figura 8), (L_{16})_{2}Pb, (L_{16})_{3}Fe, (L_{16})_{2}Cu y (L_{16})_{2}Zn. Nuevamente, cualquier muestra que origine un cambio de polarización con (L_{16})_{2}Pb es ensayada frente a los otros trazadores, y se seleccionan los anticuerpos que produzcan un fuerte cambio de polarización al unirse a (L_{16})_{2}Pb, pero poco o ningún cambio en presencia de L_{16}, (L_{16})_{2}Cu, (L_{16})_{2}Zn o (L_{16})_{3}Fe.
Trazadores de ligando y de CML fluorescentes
También se pueden utilizar secuencias de reacción análogas a las utilizadas para preparar conjugados de CMLT-proteína y fase sólida-CMLT, para obtener conjugados que consten de un marcador detectable unido covalentemente a un ligando libre o a un CMLT. Los marcadores detectables preferidos son los fluoróforos, siendo particularmente preferida la fluoresceína. Ejemplos de otros marcadores detectables están adicionalmente descritos abajo. La preparación de tales trazadores marcados con fluoresceína puede ser ilustrada, nuevamente, utilizando como ejemplo un CML preferido de plomo (II) (Fórmula M_{1}, Figura 5). De este modo, se hace reaccionar la forma activada del ligando (Fórmula L_{13}, Figura 6) con 5-aminofluoresceína o 5-aminometilfluoresceína para dar un trazador de ligando-fluoróforo (Fórmula L_{16}, Figura 8). Los correspondientes trazadores de CML-fluoróforo pueden contener un ligando marcado fluorescentemente [por ejemplo (L_{16})(L_{14})Pb] o dos [por ejemplo (L_{16})_{2}Pb].
Según un aspecto de la presente invención, los CMLTs de ligando mixto, marcados fluorescentemente, particularmente preferidos, tienen la estructura mostrada en la Figura 9. Tales CMLTs, conteniendo un ligando fluorescente y un ligando activado reactivo con aminas, pueden funcionar en diversos formatos como marcadores fluorescentes dependientes del ion metálico, selectivamente escindibles, para proteínas, fases sólidas, polinucleótidos, etc.
También se comprende que se pueda incorporar, opcionalmente, un brazo espaciador dentro de cualquier CML o conjugado de ligando de la presente invención, con independencia de si ese conjugado está formado con una proteína, una fase sólida, un fluoróforo o cualquier otro substrato tal. Esto se logra mediante métodos bien conocidos para la técnica, por lo que se utilizan conectores bifuncionales (p-Q-r, a-B-c) para producir estructuras del tipo general mostrado en las Figuras 10 y 11. La unión p'-Q-r (Figura 10) es un brazo espaciador bifuncional en donde p' es el residuo de la reacción de uno de los grupos funcionales del conector bifuncional (p) con la función carboxilato (o éster carboxílico activado) presente en el ligando o CML, y r es un grupo funcional que es reactivo con las correspondientes funcionalidades en proteínas, fluoróforos, fases sólidas, etc. De manera similar, a'-B-c (Figura 11) es un brazo espaciador en donde a' es el residuo de la reacción de uno de los grupos funcionales del conector bifuncional (a) con la función sulfhidrilo presente en el ligando o CML. Generalmente, al preparar CML o conjugados de ligando de la presente invención, Q y B son porciones de unión que constan de 0- 50 carbonos y heteroátomos, incluyendo no más de 10 heteroátomos, dispuestos en una cadena lineal o ramificada, o porción cíclica, o cualquier combinación de los mismos, saturadas o insaturadas, con la condición de que: (1) no puedan estar directamente unidos más de 2 heteroátomos; (2) Q y B no puedan contener uniones -O-O-; (3) las porciones cíclicas contengan 6 o menos miembros; y (4) la ramificación solo pueda ocurrir en los átomos de carbono. Los heteroátomos pueden incluir nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Ejemplos de Q y B son alquileno, aralquileno y grupos cicloalquileno sustituidos con alquileno. c y r son elegidos del grupo que se compone de hidroxi (-OH), carboxi (-C(=O)OH), amino (-NH_{2}), aldehído (-CHO) y azido (-N_{3}). a y p son seleccionados del grupo que se compone de -OH, -halógeno (por ejemplo Cl, Br, I), -SH y -NHR', donde R' se selecciona de H, alquilo, alquilo sustituido y arilo.
Aunque se prefiere el marcaje fluorescente, de manera similar se puede conjugar al CMLT de la presente invención cualquier otra porción generadora de señales (quimioluminiscente, radioisotópica, etc.), para dar moléculas de trazador. Dichos trazadores son utilizados conjuntamente con anticuerpos, según la presente invención, para configurar inmunoensayos para medir la concentración de un ion metálico diana concreto, en cualquier muestra de interés. Aunque cualquier configuración de ensayo útil para medir especies hapténicas de bajo PM puede ser utilizada para medir concentraciones de CMLT, se prefieren los inmunoensayos de polarización de fluorescencia competitivo (FPIAs), y se pueden utilizar para ilustrar los procedimientos y principios generales que sirven de base a tales ensayos:
Generalmente, los FPIA están basados en el principio de que un trazador fluorescente, cuando es excitado por luz de polarización plana de una longitud de onda característica, emitirá luz a otra longitud de onda característica (esto es, fluorescencia) que conserva un grado de polarización relativa a la luz estimuladora incidente, que está inversamente relacionada con la velocidad de rotación del trazador en un medio dado. Como consecuencia de esta propiedad, una substancia trazadora con rotación constreñida, tal como en una fase de solución viscosa, o cuando esté unido a otro componente de la solución con una velocidad de rotación relativamente inferior, conservará un grado de polarización relativamente mayor de luz emitida que si estuviera en solución libre.
Cuando al realizar un inmunoensayo de polarización fluorescente para la cuantificación específica de un ion metálico específico según la presente invención, una muestra de ensayo, sospechosa de contener el ion metálico, es puesta en contacto con el ligando(s) y antisuero o anticuerpos monoclonales preparados con inmunógenos según la presente invención, en presencia de reactivo marcado de la presente invención, el cual es capaz de producir una respuesta de polarización de fluorescencia detectable a la presencia de antisuero o anticuerpos monoclonales preparados con inmunógenos según la presente invención. Luego se pasa luz de polarización plana, a través de la solución, para obtener una respuesta fluorescente, y se detecta la respuesta como una medida de la cantidad de ion metálico presente en la muestra de ensayo.
De este modo, lo siguiente presenta un ejemplo de un FPIA para un metal:
En un procedimiento de pretratamiento de la muestra, la muestra (que puede ser una muestra biológica y, en concreto, una muestra sanguínea) se trata en primero lugar para liberar el ion metálico en una forma iónica soluble. Tal tratamiento incluirá, generalmente, la adición de un ácido fuerte y/o un detergente. La fase en solución resultante, conteniendo el ion metálico de interés en forma iónica a pH bajo, se trata luego con uno o más ligandos bajo condiciones que favorezcan la formación del CML diana. Tales condiciones implicarán, a menudo, la neutralización de la muestra tratada dentro del intervalo de pH de 6-9. A menudo es conveniente realizar esta etapa añadiendo una única solución que contenga la sal(es) tampón y el ligando(s), siendo seleccionados la concentración(s) del tampón, la concentración de cada ligando y el pH de la solución final de manera tal para optimizar la formación del CML diana. Después se incuba la solución resultante junto con a) un anticuerpo monoclonal, según la presente invención, que sea específico para el CML diana; y b) una molécula de trazador constando del mismo CML conjugado a un fluoróforo. Las concentraciones de anticuerpo y trazador son seleccionadas de tal manera que el CML formado por el metal diana presente en la muestra compita eficazmente con el trazador por un número limitado de sitios de unión del anticuerpo, dentro del intervalo de concentración de interés del ion metálico de la muestra. La medición de la polarización de la fluorescencia de la solución resultante proporciona una medida de la proporción de fluoróforo que se une al anticuerpo. Luego se calcula la concentración de ion metálico diana en la muestra a partir de una curva patrón que relaciona la polarización de la fluorescencia con la concentración de ion metálico.
El FPIA puede ser conducido en instrumentos automatizados disponibles comercialmente tales como los instrumentos IMx®, TDx®, y TDxFLx™ (disponibles por Abbott Laboratories, Abbott Park, Ilinois, EE.UU.).
Aunque particularmente útiles para desarrollar inmunoensayos sensibles y específicos para iones metálicos, se pretende que los anticuerpos de la presente invención encuentren uso en una amplia variedad de otras aplicaciones. Por ejemplo, se espera que los anticuerpos según la presente invención sean útiles para separar y recuperar iones metálicos concretos, a partir de mezclas de complejos, utilizando técnicas de inmunoafinidad. Así, se podría inmovilizar un anticuerpo de la presente invención en un soporte sólido, y la matriz de afinidad resultante utilizada para recuperar iones metálicos de corrientes de procesos (por ejemplo, oro en galvanoplastia, plata en un tratamiento fotográfico, etc.). Para un especializado en la técnica serán evidentes tales numerosos ejemplos.
Otros formatos de ensayo
Además del FPIA, se pueden seguir otros diversos formatos de inmunoensayo para la cuantificación de un ion metálico específico según la presente invención. Tales formatos de sistemas de inmunoensayo incluyen, pero no se pretende limitar a, técnicas competitivas, tipo sándwich e inmunométricas. Generalmente, tales sistemas de inmunoensayo dependen de la capacidad de una inmunoglobulina, esto es, de un anticuerpo íntegro o fragmento del mismo, para unirse a un analito específico, de una muestra de ensayo, con un reactivo marcado constando de un anticuerpo de la presente invención, o fragmento del mismo, unido a un marcador o porción detectable. Tales marcadores detectables incluyen, pero no se pretende limitar a, enzimas, radiomarcadores, biotina, toxinas, fármacos, haptenos, ADN, ARN, liposomas, cromóforos, quimioluminiscentes, partículas coloreadas y micropartículas coloreadas, compuestos fluorescentes tales como aminometilfluoresceína, 5-fluoresceinilo, 6-fluoresceinilo, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína, aminofluoresceína, tioureafluoresceína, y metoxitriazinolil-aminofluoresceína, y otros derivados fluorescentes.
Típicamente, la extensión de la unión en tales formatos de sistemas de inmunoensayo está determinada por la cantidad de porción detectable en el reactivo marcado que ha participado o no en la reacción de unión con el analito, en donde la cantidad de porción detectable, detectada y medida, puede ser correlacionada con la cantidad de analito presente en la muestra de ensayo. Por ejemplo, en un sistema de inmunoensayo competitivo, una substancia a medir, mencionada a menudo como analito, compite con una substancia, de estrecha semejanza estructural, acoplada a una porción detectable, mencionada a menudo como trazador, por un limitado número de sitios de unión en anticuerpos específicos para la porción o porciones del analito y trazador con semejanza estructural, compartidos con un inmunógeno empleado para producir tales anticuerpos. Un ejemplo de tal ensayo implicaría: (a) poner en contacto una muestra de ensayo (sospechosa de tener un analito de interés) con un reactivo marcado (esto es, un trazador) y un anticuerpo que es capaz de unirse al reactivo marcado y al analito, para formar una solución de reacción; (b) incubar la solución de reacción durante una suficiente cantidad de tiempo para permitir que el anticuerpo se una al reactivo marcado y al analito, si estuviera presente; y (c) medir la cantidad de reactivo marcado en la solución de reacción, el cual se ha unido a dichos anticuerpos en función de la cantidad de analito presente en la muestra de ensayo. El trazador y el anticuerpo pueden ser añadidos a la muestra de ensayo simultánea o secuencialmente, en ningún orden concreto. Preferentemente, el anticuerpo se añade a la muestra de ensayo después de la adición del trazador. El ensayo preferido utiliza trazador M_{6} con anticuerpos producidos con inmunógeno M_{3}, en donde la proteína es BSA. Abajo, en los Ejemplos 7 y 8, respectivamente, se muestran ejemplos preferidos de los inmunógenos y trazadores.
Juegos de ensayo
Según la presente invención, un juego de ensayo consta de todos los reactivos esenciales necesarios para realizar un inmunoensayo deseado para la cuantificación de un ion metálico específico en una muestra de ensayo. Los ejemplos de tales inmunoensayos incluyen un FPIA. El juego de ensayo se presenta, preferentemente, en una forma envasada comercialmente como combinación de uno o más recipientes llevando los reactivos necesarios, como composición o mezcla cuando lo permita la compatibilidad de los reactivos.
Particularmente preferido es un juego de ensayo para la cuantificación FPIA de un ion metálico específico en una muestra de ensayo, constando de cualquier ligando, trazador, y anticuerpo, como se describe en esta solicitud de patente, para la cuantificación de un ion metálico específico. Se comprende que el juego de ensayo pueda incluir, por supuesto, otros materiales que son conocidos en la técnica y que puedan ser convenientes desde el punto de vista del usuario, tales como tampones, diluyentes, patrones, y otros.
Para ilustrar la invención, en los siguientes Ejemplos se proporcionan ligandos tridentados bifuncionales apropiados para unirse a plomo (II), junto con complejos ternarios de estos ligandos con plomo (II), y anticuerpos monoclonales que son específicos para dicho CMLT. Se proporciona un inmunoensayo homogéneo de polarización de la fluorescencia para medir niveles de plomo en muestras sanguíneas y otras biológicas, basado en un anticuerpo monoclonal que es específico para un CMLT de plomo (II).
Ejemplo 1 Síntesis de ligando L_{9} (X = -OH, figura 6)
Se disolvió quinolina-2-carboxaldehído (15'7 g, 100 mmol) con agitación en MeOH (140 ml) a reflujo. La solución resultante fue agitada a reflujo, y se añadió en alícuotas de 1-2 ml, durante un periodo de 10 minutos, una solución de D-penicilamina (14'9 g, 100 mmol) y NaOH (4'0 g, 100 mmol) en MeOH (40 ml). Después de agitar a reflujo durante unas 3 horas adicionales, se enfrió la solución a temperatura ambiente (aquí mencionada también como "TA") y se concentró a unos 125 ml utilizando un evaporador rotativo. Se agitó la solución resultante y se añadió ClH conc. (10 ml) en alícuotas de 1 ml. La adición de la alícuota final de ácido produjo un denso precipitado blanco, el cual fue separado por filtración, lavado con MeOH/ClH (2 x 30 ml) y desecado a vacío para dar 20'53 g (71%) de ligando 9 (X = -OH, Figura 6). Espectro de masas (DCl) m/e 289 (M+H)^{+}, 243 (M+H -CO_{2}H)^{+}, 211 (M+H -CO_{2}H -SH)^{+}; RMN-^{1}H (300 MHz, CD_{3}OD) d 8'22-8'48 (m, 1H), 8'03-8'11 (m, 1H), 7'88-7'95 (m, 1H), 7'73-7'82 (m, 1H), 7'56-7'68 (m, 1H), 7'45 (d, 1H), 5'98 (s, 1H), 4'84 (s, 1H), 4'00 (s, 1H), 1'70 (s, 3H), 1'47 (s, 3H).
Los ligandos L_{10}, L_{11} y L_{12} fueron preparados de manera similar utilizando, respectivamente, piridina-2-carboxaldehído, di-piridinil cetona o isoquinolil fenil cetona en lugar del quinolina-2-carboxaldehído en el ejemplo anterior.
Ejemplo 2
Formación de un CMLT simétrico de Pb (II) y ligando L_{10}
Una solución de ligando L_{10} (X = -OH, Figura 6, 2'38 g, 10 mmol) y NaOH (0'8 g, 20 mmol) en MeOH (40 ml) fue agitada a TA, y se añadió, gota a gota, una solución recién preparada de (AcO)_{2}Pb \cdot 3H_{2}O (1'89 g, 5'0 mmol) en MeOH (15 ml), produciéndose una pequeña cantidad de precipitado blanco. Después de agitar a TA durante unas 4 horas adicionales, se filtró la mezcla de reacción y el filtrado evaporado hasta sequedad para dar el simétrico CMLT de Pb(L_{9})_{2}^{2-}. 2'48 g de rendimiento (73%). Espectro de masas (FAB) m/e 727 (M+ 2Na)^{+}, 705 (M+H+Na)^{+}. Los modelos de distribución isotópica observados para ambos iones moleculares matriz del m/e 705 y el m/e 727 casaron con los pronosticados basados en los 4 isótopos estables de existencia natural del plomo.
Ejemplo 3 Formación de un CMLT de ligando mixto: [(L_{10})(L_{11})Pb]
Una solución de ligando L_{10} (X = -OH, Figura 6, 1'19 g, 5'0 mmol) y NaOH (0'4 g, 10 mmol) en MeOH (20 ml) fue agitada a TA, y se añadió, gota a gota, una solución recién preparada de (AcO)_{2}Pb \cdot 3H_{2}O (1'89 g, 5'0 mmol) en MeOH (15 ml), como bolo. La solución resultante fue agitada durante la noche a TA, y luego filtrada. Después, se agitó el filtrado como solución de ligando L_{11} (X = -OH, Figura 6, 1'58 g, 5'0 mmol) y se añadió, gota a gota, NaOH (0'40 g, 10 mmol) en MeOH (30 ml). Después de agitar a TA durante unas 2 horas adicionales, la mezcla de reacción fue filtrada y el filtrado evaporado a vacío, hasta sequedad, para dar el asimétrico CMLT de [(L_{10})(L_{11})Pb]^{2-} en forma de un sólido amarillo (3'36 g, 89%). Espectro de masas (FAB) m/e 804 (M+2Na) +, 782 (M+H+Na)^{+}.
Ejemplo 4 Preparación de un ligando portanto un grupo activo para su conjugación posterior: síntesis de ligando L_{13}
Se suspendieron ligando L_{9} (8'64 g, 30 mmol) y N-hidroxisuccinimida (3'45 g, 30 mmol) en THF (250 ml). La mezcla resultante fue agitada a TA, y se añadió una solución de diciclohexilcarbodiimida (6'18 g, 30 mmol) en THF (20 ml). Se continuó agitando a TA durante unas 24 horas adicionales, luego se filtró la mezcla de reacción. El filtrado fue concentrado a vacío, hasta unos 30 ml, produciéndose un pequeño precipitado blanco adicional, el cual fue separado por filtración. Después, se agitó el filtrado y se añadió, gota a gota, hexano (120 ml), precipitando el producto en forma de un denso sólido blanco. Este fue separado por filtración, lavado con hexano (50 ml) y desecado a vacío para dar 9'54 g (83%) de ligando L_{13} (Figura 6). Espectro de masas (FAB) m/e 386 (M+H) ^{+}; RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) d 8'07-8'15 (m, 2H), 7'78-7'83 (m, 1H), 7'68-7'75 (m, 1H), 7'50-7'56 (m, 1H), 7'26-7'29 (m, 1H), 5'99 (d, 1H), 5'17 (t, 1H), 4'23 (d, 1H), 2'89 (s, 4H), 1'80 (s, 3H), 1'52 (s, 3H).
Ejemplo 5 Preparación de una forma bloqueada de ligando DE n-butilamida: síntesis de ligando L_{14}
Se suspendió ligando L_{13} (1'93 g, 5'0 mmol) en Et_{2}O (60 ml), y la mezcla resultante fue agitada vigorosamente a TA durante 15 minutos. La pequeña cantidad de sólido no disuelto que quedó con el tiempo fue eliminada por filtración. Se agitó el filtrado y se añadió una solución de n-butilamina (0'37 g, 5'0 mmol) en Et_{2}O (5 ml), produciéndose un inmediato precipitado blanco. La mezcla de reacción fue agitada durante unos 60 segundos adicionales, después se filtró rápidamente. Se dejó que el filtrado permaneciera tranquilo a TA durante la noche, durante el cual tiempo el producto cristalizó en las paredes del matraz. Se separó por decantación la solución madre, y se desecó a vacío el producto cristalino para dar 0'67 g (39%) de ligando L_{14}. Espectro de masas (FAB) m/e 344 (M+H)^{+}; RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) d 8'07-8'15 (m, 2H), 7'78-7'82 (m, 1H), 7'68-7'75 (m, 1H), 7'50-7'55 (m, 1H), 7'35 (d, 1H), 6'72 (t, ancho, 1H), 5'90 (s, 1H), 3'77 (s, 1H), 3'25-3'50 (m, 2H), 1'75 (s, 3H), 1'50-1'60 (m, 2H), 1'45 (s, 3H), 1'33-1'45 (m, 2H), 0'95 (t, 3H).
Ejemplo 6 Preparación de un conjugado de proteína-ligando: BSA-ligando L_{9} (fórmula L_{15}, figura 7)
Se disolvió BSA (50 mg, 8 x 10^{-4} mmol) en un tampón constando de acetato sódico 0'1M, acetato de zinc al 0'1% (p/v), pH 5'3 (6'5 ml). Se añadió acetonitrilo (2'0 ml) a la solución de proteína tamponada, la cual no cambió en apariencia o pH como resultado. A la solución de BSA se añadió, gota a gota, una solución de ligando L_{13} (15'4 mg, 4 x 10^{-2} mmol) en acetonitrilo (1'5 ml), y se incubó la solución resultante a TA durante la noche. Durante las primeras 4 horas después de la adición de ligando, se examinó periódicamente el pH de la solución de reacción, y se mantuvo en el intervalo de 5'0-5'5. Después de la incubación durante la noche, se quitó el ligando no conjugado mediante filtración por gel en una columna Sephadex LH-20, de 2'5 x 20 cm, equilibrada y elucionada con AcONa 0'1M/(AcO)_{2}Zn al 0'1%, 65%/35% (v/v), pH 5'3:acetonitrilo. Se identificaron los conjugados basados en la absorbancia característica en el ultravioleta (UV), asociada con el sistema aromático del ligando (\lambda_{max} = 319'304 nm para M_{2} en solución de acetonitrilo).
Ejemplo 7 Preparación de un conjugado de CMLT-proteína: BSA-(PbL_{13}L_{14}) (M_{3}, figura 6)
La reacción siguiente se lleva a cabo bajo atmósfera de nitrógeno hasta la etapa en la que hayan sido añadidos los ligandos.
Se disuelve ciclohexanobutirato de plomo (II) (0'56 g, 1'0 mmol) en THF (20 ml) y la solución resultante se agita como solución de Ligando L_{14} (0'34 g, 1'0 mmol), y se añade, gota a gota, 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (0'22 g, 1'0 mmol) en THF (26 ml). La mezcla de reacción resultante es puesta a reflujo durante 30 minutos, luego se añade, gota a gota, una solución de ligando L_{13} (0'39 g, 1'0 mmol) y 1,8- bis(dimetilamino)naftaleno (0'22 g, 1'0 mmol) en THF (20 ml). Después de unos 30 minutos adicionales a reflujo, se enfría la mezcla de reacción a TA, se concentra y filtra, y se evapora a vacío el filtrado hasta sequedad. El residuo es disuelto en acetonitrilo (100 ml), para proporcionar una solución madre de CMLT activado (Fórmula M_{2}, Figura 6).
Se disuelve BSA (50 mg, 8 x 10^{-4} mmol) en tampón de acetato sódico 0'1M, pH 6'0 (6'5 ml), y se añade acetonitrilo (2'0 ml). Una alícuota de la solución madre de M_{2} (1'5 ml, 1'5 x 10^{-2} mmol) es añadida, gota a gota, a la solución de BSA, y la mezcla resultante es incubada durante la noche a TA. Durante las primeras 4 horas después de la adición del CMLT activado, se supervisa frecuentemente el pH y se mantiene en el intervalo de 5'5-6'0. Después de la incubación durante la noche, se elimina el CMLT no conjugado mediante filtración por gel en una columna Sepharose LH-20, de 2'5 x 20 cm, equilibrada y elucionada con AcONa 0'1M/(AcO)_{2}Zn al 0'1%, 65%/35% (v/v), pH 6:acetonitrilo. Se recoge el pico que contiene proteína y se liofiliza. Se determina el contenido de plomo del producto liofilizado (Fórmula M_{3}, Figura 6) mediante espectroscopia de adsorción atómica.
Ejemplo 8 Preparación de un conjugado de CMLT-fluoresceína: síntesis de PbL_{14}L_{16} (mostrado como M_{6} en la Figura 12)
El CMLT de fórmula M_{2} (1'0 mmol, Figura 6) es preparado en solución de THF como se describe en el Ejemplo 7. Se elimina el disolvente a vacío, y se vuelve a disolver el residuo en DMF (10 ml), luego se añade a una solución de 5-aminometilfluoresceína (0'44 g, 1'0 mmol) y trietilamina (0'10 g, 5 mmol) en DMF (20 ml). La mezcla de reacción resultante es agitada, protegida de la luz, durante 16 horas, evaporada luego a vacío hasta sequedad. El trazador de CMLT-fluoresceína bruto puede ser purificado mediante TLC preparativa en placas de sílice (Baxter) elucionadas con CHCl_{3}:MeOH 40%/60% (v:v).
Ejemplo 9 Inmunoensayo de polarización de la fluorescencia para plomo en sangre: pretratamiento
Una muestra de sangre (200 \mul) a ensayar para el contenido de plomo es tratada con NO_{3}H 3M (50 \mul) y centrifugada a 2.000 g durante 15 minutos. Se mezcla una alícuota del sobrenadante (100 \mul) con una solución de ligando L_{14} (0'36 mg), preparada como se describe en el Ejemplo 5, en tampón de borato, pH 10, conteniendo 10% (v:v) de DMF (50 \mul). El pH final de la solución resultante es 9'0-9'5.
Ejemplo 10 Inmunoensayos de polarización de la fluorescencia para plomo en sangre
Como se describió anteriormente, los reactivos para el FPIA de la presente invención se componen de trazadores y anticuerpos producidos contra inmunógenos de la presente invención. Además, se preparan soluciones de ensayo utilizadas convencionalmente, incluyendo un tampón de dilución y calibradores de M_{6} y controles.
El procedimiento preferido está diseñado para ser utilizado conjuntamente con los sistemas automatizados TDx, ADx, o IMx; sin embargo, también se pueden realizar ensayos manuales. En ambos procedimientos, la muestra de ensayo puede ser mezclada con el sobrenadante después del pretratamiento (Ejemplo 9), y anticuerpo en tampón de dilución después de que se tome una lectura de fondo. Luego se añade el trazador a la solución de ensayo. Después de la incubación, se toma lectura de la polarización de la fluorescencia.
En los ensayos automatizados, se determina el valor de polarización de la fluorescencia de cada calibrador, control o muestra de ensayo, y se imprime en la cinta de transferencia del instrumento TDx, ADx o IMx. El instrumento también genera una curva patrón trazando gráficamente la polarización de cada calibrador frente a su concentración, utilizando un análisis de regresión no lineal. La concentración de cada control o muestra se lee a partir de la curva almacenada, y se imprime en la cinta de transferencia.
En los ensayos automatizados preferidos para plomo en sangre, se utilizan los siguientes reactivos.
1) la solución de pretratamiento;
2) el trazador diluido en metanol al 50% en tampón de fosfato potásico (tampón de fosfato 0'15M, pH 7'5);
3) los antisueros de conejo constando de anticuerpos, o anticuerpo monoclonal de ratón producido contra inmunógeno M_{3} (Figura 6, en donde la proteína es BSA), diluido en tampón TDx (tampón de fosfato 0'1M, pH 7'5, conteniendo 0'01% de gammaglobulina bovina y 0'1% de azida sódica) con 30% de glicerol;
4) un tampón diluyente constando de tampón TDx;
5) un juego de calibradores;
6) controles comprendiendo 5 mg/ml de M_{6};
Todas las mediciones fluorescentes polarizadas son hechas utilizando el instrumento TDx, el cual ejecuta el ensayo según el protocolo siguiente:
1) 22'5 ml de patrón o muestra de ensayo desconocida, y 12'5 ml del reactivo de anticuerpos repartidos en la cubeta, y se añade suficiente volumen de tampón diluyente para que el volumen aumente hasta 1 ml, y se toma la lectura de la intensidad de fondo;
2) 12'5 ml de anticuerpo, 25 ml de trazador, y los segundos 22'5 ml de muestra, y se añaden a la cubeta, y se añade suficiente volumen de tampón diluyente para que el volumen aumente hasta 2 ml;
3) se incuba la mezcla de reacción;
4) la polarización de la fluorescencia, debida a la unión del trazador al anticuerpo, es obtenida restando las intensidades de la fluorescencia polarizada del fondo de las intensidades de la fluorescencia polarizada de la mezcla; y
5) el valor de polarización de la muestra de ensayo desconocida es comparado con una curva patrón preparada utilizando calibradores de contenido conocido de M_{6}.

Claims (17)

1. Un anticuerpo monoclonal que es específico para un complejo de coordinación ion metálico-ligando (CML) compuesto de al menos dos ligandos y un ion metálico, en donde el epítopo identificado por el anticuerpo monoclonal consta de dos o más ligandos en el CML, y en donde los ligandos son seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} mostrado en la Figura 1, siendo los ligandos en el CML iguales o diferentes.
2. El anticuerpo monoclonal según la Reivindicación 1, en donde el ion metálico se selecciona de los metales del grupo principal de la Tabla Periódica de los Elementos.
3. Un anticuerpo monoclonal según la Reivindicación 1, en donde el ion metálico se selecciona del grupo que se compone de los metales de transición de la Tabla Periódica de los Elementos.
4. El anticuerpo monoclonal según la Reivindicación 1, en donde el ion metálico se selecciona del grupo que se compone de los metales lantánidos y actínidos de la Tabla Periódica de los Elementos.
5. El anticuerpo monoclonal según la Reivindicación 1, en donde el ion metálico se selecciona del grupo que se compone de:
Plomo,
Mercurio,
Níquel,
Cadmio,
Talio,
Antimonio,
Plata,
Cromo,
Manganeso,
Platino,
Oro,
Aluminio,
Bismuto,
Galio,
Hierro,
Cobre,
Zinc,
Cobalto,
Molibdeno,
Selenio, y
Vanadio.
6. Un CML constando de dos o más ligandos, en donde los ligandos son seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} de la Figura 1, siendo los ligandos iguales o diferentes.
7. El CML de la Reivindicación 6, en donde los ligandos son seleccionados del grupo que se compone de L_{9} a L_{12} de la Figura 4.
8. Un ligando teniendo una estructura seleccionada del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} de la Figura 1, excepto L_{6} cuando su r es CH_{2} y su X = OH.
9. Un conjugado comprendiendo un CML que consta de dos o más ligandos bifuncionales conjugados a una molécula inmunogénica, en donde los ligandos son seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} mostrado en la Figura 1, siendo los ligandos en el CML iguales o diferentes.
10. Un medio para cromatografía de afinidad comprendiendo un CML que consta de dos o más ligandos bifuncionales acoplados covalentemente a un soporte sólido, en donde los ligandos son seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} mostrado en la Figura 1, siendo los ligandos en el CML iguales o diferentes.
11. Un ensayo para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales que son reactivos con un CML, en donde los ligandos en el CML son seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} mostrado en la Figura 1, siendo los ligandos en el CML iguales o diferentes, comprendiendo las etapas de:
(a) acoplar covalentemente un CML preformado a una proteína, para formar un conjugado de CML-proteína como fase sólida;
(b) incubar la fase sólida de la etapa (a) con los anticuerpos monoclonales reactivos con el CML, en donde el epítopo identificado por el anticuerpo monoclonal consta de dos o más ligandos en el CML;
(c) lavar la fase sólida y detectar anticuerpo unido exponiendo la fase sólida a anti-anticuerpo de ratón para dicho anticuerpo monoclonal que está marcado con una porción generadora de señales; y
(d) comparar los resultados de la etapa (c) con los de ensayos análogos en los que, en la etapa (a), el ion metálico de interés está reemplazado con un ion metálico potencialmente interaccionante.
12. Un conjugado comprendiendo un CML que consta de dos o más ligandos bifuncionales seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} de la Figura 1, unidos covalentemente a un marcador mediante una porción, no reactiva a la unión del metal, de al menos uno de los ligandos.
13. El conjugado M_{6} de la fórmula mostrada en la Figura 12.
14. Un inmunoensayo para detectar o cuantificar un ion metálico en una muestra, comprendiendo las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra con un trazador que es un conjugado de la Reivindicación 12, al menos dos ligandos capaces de unirse al metal para formar un CML, en donde dichos ligandos son seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} mostrado en la Figura 1, siendo los ligandos en el CML iguales o diferentes, y un anticuerpo específico para el CML en donde el epítopo identificado por el anticuerpo monoclonal consta de dos o más ligandos en el CML; y
(b) detectar o medir la cantidad de trazador que está unido al anticuerpo, la cual es inversamente proporcional a la cantidad de ion metálico en la muestra.
15. El inmunoensayo de la Reivindicación 14, en donde el ion metálico es ion de plomo.
16. El inmunoensayo de la Reivindicación 15, en donde el trazador es el conjugado M_{6} de la fórmula mostrada en la Figura 12, y el anticuerpo es producido con el conjugado M_{3} de la fórmula mostrada en la Figura 6.
17. Un juego de ensayo comprendiendo:
(a) un ligando seleccionado del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} de la Figura 1; y
(b) un anticuerpo específico para un CML constando de un ion metálico unido a al menos dos ligandos seleccionados del grupo que se compone de L_{1} a L_{8} de la Figura 1, en donde el anticuerpo identifica un epítopo constando de al menos dos de los ligandos en el CML.
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