ES2201061T3

ES2201061T3 - Genes de receptores opioides delta.

Info

Publication number: ES2201061T3
Application number: ES93920068T
Authority: ES
Inventors: Christopher J. Evans; Duane E. Keith, Jr.; Robert H. Edwards; Daniel Kaufman
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1992-08-13
Filing date: 1993-08-13
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2013-08-13
Also published as: DK0656007T3; EP0656007B1; PT656007E; AU5012393A; EP1306437A3; DE69333019T2; EP1306437A2; US5985600A; ATE242321T1; CA2142305A1; DE69333019D1; EP0656007A4; JP2004154144A; WO1994004552A1; JP4208960B2; EP0656007A1; US6265563B1; JPH08502164A

Abstract

GENES QUE CODIFICAN RECEPTORES OPIOIDES PUEDEN SER RECUPERADOS DE ESTRATOS VERTEBRALES QUE SON LA SONDA DE MURINA DESCRITA AQUI SEGUN CONDICIONES DE BAJA ESTRINGENCIA. LA SECUENCIA DE ADN MOSTRADA EN LA FIG.5 O SU COMPLEMENTO PUEDE USARSE PARA OBTENER LOS GENES DELTA, KAPPA Y MU HUMANOS ASI COMO EL GEN MU DE MURINA. LA SONDA PREVISTA CODIFICA EL RECEPTOR OPIOIDE DE DELTA MURINA, QUE COD

Description

Genes de receptores opioides delta.

Campo técnico

La invención se refiere a sustancias implicadas en los sistemas nerviosos de vertebrados, y en particular a los receptores opioides y a actividades mediadas por los mismos. En consecuencia, la invención se refiere a materiales recombinantes útiles para la producción de receptores opioides y a métodos de uso del receptor para seleccionar fármacos que modulan la actividad del receptor.

Antecedentes de la técnica

El término "opioide" indica genéricamente todos los fármacos, naturales y sintéticos, que tienen acciones similares a la morfina. Antiguamente, el término "opiáceo" se utilizaba para designar fármacos derivados del opio, por ejemplo morfina, codeína, y muchos congéneres semisintéticos de la morfina. Después del aislamiento de compuestos peptídicos con acciones similares a la morfina, el término opioide se introdujo para indicar genéricamente todos los fármacos con acciones similares a la morfina. Se incluyen entre los opioides diversos péptidos que exhiben actividad similar a la morfina, tales como endorfinas, encefalinas y dinorfinas. Sin embargo, algunas fuentes han seguido utilizando el término "opiáceo" en un sentido genérico, y en dichos contextos, opiáceo y opioide son intercambiables. Adicionalmente, el término opioide se ha utilizado para indicar antagonistas de fármacos similares a la morfina así como para caracterizar receptores o sitios de unión que se combinan con dichos agentes.

Los opioides se emplean generalmente como analgésicos, pero pueden tener muchos otros efectos farmacológicos también. La morfina y opioides relacionados producen sus efectos principalmente sobre los sistemas nervioso central y digestivo. Los efectos son diversos, incluyendo analgesia, somnolencia, cambios del ánimo, depresión respiratoria, mareo, obnubilación mental, disforia, prurito, aumento de la presión en el tracto biliar, reducción de la motilidad gastrointestinal, nausea, vómito y alteraciones de los sistemas nervioso endocrino y autónomo.

Un rasgo significativo de la analgesia producida por opioides es que aparece sin pérdida de consciencia. Cuando se administran dosis terapéuticas de morfina a pacientes con dolor, informan de que el dolor es menos intenso, menos incómodo, o desaparece totalmente. Además de experimentar alivio del sufrimiento, algunos pacientes experimentan euforia. Sin embargo, cuando se administra morfina en una dosis seleccionada aliviadora del dolor a un individuo libre de dolor, la experiencia no es siempre placentera; la nausea es común, y puede aparecer también vómito. Pueden resultar somnolencia, incapacidad de concentración, dificultad para la cogitación, apatía, reducción de la actividad física, reducción de la agudeza visual y letargo.

El desarrollo de tolerancia y dependencia física con el uso repetido es un rasgo característico de todos los fármacos opioides, y la posibilidad de desarrollar dependencia psicológica sobre el efecto de estos fármacos es una limitación importante para su uso clínico. Existen evidencias de que la fosforilación puede asociarse a la tolerancia en poblaciones celulares seleccionadas (Louie, A. et al ., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1988) 152: 1369-1375).

El envenenamiento agudo por opioides puede resultar de sobredosis clínica, sobredosis accidental o intento de suicidio. En un entorno clínico, la triada de coma, pupilas contraídas y respiración deprimida sugiere envenenamiento por opioides. Envenenamientos mixtos que incluyen agentes tales como barbituratos o alcohol pueden contribuir también al cuadro clínico de envenenamiento agudo por opioides. En cualquier escenario de envenenamiento por opioides, el tratamiento debe administrarse inmediatamente.

Los opioides interaccionan con lo que parecen ser varios receptores estrechamente relacionados. Se han extraído diversas conclusiones de los datos que han intentado correlacionar los efectos farmacológicos de las interacciones de los opioides con una constelación particular de receptores opioides (Goodman y Gilman, "THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS", 7ª ed., pág. 493-495 (MacMillan, 1985)). Por ejemplo, la analgesia se ha asociado a receptores mu y kappa. Los receptores delta se cree que están implicados en alteraciones del comportamiento afectivo, basándose principalmente en la localización de estos receptores en las regiones límbicas del cerebro. Adicionalmente, la activación, por ejemplo la unión de ligando con estimulación de respuestas adicionales mediadas por receptor, de receptores opioides delta se cree que inhibe la liberación de otros neurotransmisores. Las rutas que contienen poblaciones relativamente altas de receptor opioide delta son similares a las rutas implicadas en la enfermedad de Huntigton. En consecuencia, se postula que la enfermedad de Huntington puede correlacionarse con cierto efecto sobre los receptores opioides delta.

Dos clases distintas de moléculas opioides pueden unirse a receptores opioides: los péptidos opioides (por ejemplo, encefalinas, dinorfinas y endorfinas) y los opiáceos alcaloides (por ejemplo morfina, etorfina, diprenorfina y naloxona). Posteriormente a la demostración inicial de los sitios de unión a opiáceos (Pert, C.B. y Snyder, S.H., Science (1973) 179: 1011-1014), los efectos farmacológicos y fisiológicos diferenciales tanto de análogos peptídicos opioides como de opiáceos alcaloides sirvieron para delinear múltiples receptores opioides. En consecuencia, se han descrito tres tipos de receptor opioide anatómica y farmacológicamente distintos: delta, kappa y mu. Además, cada tipo se cree que tiene subtipos (Wollemann, M., J. Neurochem. (1990) 54: 1095-1101; Lord, J.A., et al., Nature (1977) 267: 495-499).

Los tres de estos tipos de receptor opioide parecen compartir los mismos mecanismos funcionales a nivel celular. Por ejemplo, los receptores opioides causan la inhibición de la adenilato ciclasa y la inhibición de la liberación de neurotransmisores mediante tanto la activación de los canales de potasio como la inhibición de los canales de Ca^{2+} (Evans, C.J., en Biological Basis of Substance Abuse, S.G. Korenman y J.D. Barchas, Eds., Oxford University Press (en prensa); North, A.R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87: 7025-7029; Gross, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 7025-7029; Sharma, S.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) 72: 3092-3096). Aunque los mecanismos funcionales son los mismos, las manifestaciones de comportamiento de fármacos selectivos de receptor difieren en gran medida (Gilbert, P.E. y Martin, W.R., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1976) 198: 66-82). Dichas diferencias pueden ser atribuibles en parte a la localización anatómica de los diferentes receptores.

Los receptores delta tienen una distribución más discreta en el SNC de mamíferos que los receptores mu o kappa, con altas concentraciones en el complejo amigdaloide, complejo estriado, sustancia negra, bulbo olfatorio, tubérculos olfatorios, formación del hipocampo y corteza cerebral (Mansour, A. et al., Trends in Neurosci. (1988) 11: 308-314). El cerebelo de rata está marcadamente desprovisto de receptores opioides, incluyendo receptores opioides delta.

Diversas moléculas opioides son conocidas por unirse selectiva o preferencialmente a receptores delta. De los opioides endógenos de vertebrados, las encefalinas, particularmente met-encefalina y leu-encefalina, parecen poseer la más alta afinidad por los receptores delta, aunque las encefalinas tienen también una alta afinidad por los receptores mu. Adicionalmente, los deltorfanos, péptidos aislados de la piel de rana, comprenden una familia de péptidos opioides que tienen alta afinidad y selectividad por receptores delta (Erspamer, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 5188-5192).

Una serie de análogos sintéticos de encefalina son también selectivos de receptor delta, incluyendo (D-Ser^{2}), leucina encefalina Thr (DSLET) (Garcel, G., et al., (1980) FEBS. Lett. 118: 245-247) y (D-Pen^{2}, D-Pen^{5}) encefalina (DPDPE) (Akiyama, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 2543-2547).

Recientemente, se han sintetizado una serie de otros ligandos selectivos de receptor delta, y sus bioactividades y características de unión sugieren la existencia de más de un subtipo de receptor delta (Takemori, A.E. et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., (1992) 32: 239-269; Negri, L., et al., Eur. J. Pharmacol. (1991) 196: 355-335; Sofuoglu, M. et al., Pharmacologist (1990) 32: 151).

Aunque el pentapéptido sintético 2dAla, 5dLeu encefalina (DADLE) se consideró que era selectivo de delta, se une igualmente bien a receptores mu. El péptido sintético D-Ala^{2}-N-Me-Phe^{4}-Gly-ol^{5}-encefalina (DAGO) se ha encontrado que es un ligando selectivo de receptores mu.

La existencia de múltiples receptores opioides delta se ha supuesto no sólo por los estudios farmacológicos indicados anteriormente, sino también por estimaciones de peso molecular obtenidas mediante el uso de ligandos de afinidad irreversible. Los pesos moleculares para el receptor opioide delta están en el intervalo de 30 kDa a 60 kDa (Evans, C.J., supra; Evans, C.J. et al., Science 258: 1952-1955 (1992), cuyo documento corresponde a la exposición del documento de prioridad de la presente solicitud; Bochet, P. et al., Mol. Pharmacol. (1988) 34: 436-443). Los diversos tamaños de receptor pueden representar productos de ayuste alternativos, aunque esto no se ha establecido.

Se han realizado muchos estudios del receptor opioide delta con la estirpe celular de neuroblastoma/glioma NG108-15, que se generó mediante fusión de la estirpe celular glial de rata (C6BU-1) y la estirpe celular de neuroblastoma de ratón (N18-TG2) (Klee, W.A. y Nirenberg, M.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71: 3474-3477). La estirpe celular glial de rata no expresa esencialmente ningún receptor opioide delta, mientras que la estirpe celular de neuroblastoma de ratón expresa bajas cantidades del receptor. Por tanto, se ha sugerido que el receptor delta en las células NG108-15 es de origen cromosómico de ratón (Law, Mol. Pharm. (1982) 21: 438-491). Cada célula NG108-15 se estima que expresa aproximadamente 300.000 receptores delta. Sólo se expresan los receptores opioides de tipo delta, aunque no se sabe si estos representan más de un solo subtipo. Por tanto, la estirpe celular NG108-15 ha servido para proporcionar un considerable conocimiento de la caracterización de unión de receptores opioides, particularmente receptores opioides delta. Sin embargo, la estirpe celular NG108-15 es un híbrido de cáncer, y puede no ser completamente representativa del receptor delta en neuronas endógenas debido al entorno celular único en las células híbridas.

Una extensa bibliografía ha argumentado que los receptores opioides se acoplan a proteínas G (véase, por ejemplo, Schofield, P.R., et al., EMBO J., 8: 489-495 (1989)), y son por tanto miembros de la familia de receptores acoplados a proteína G. Las proteínas G son proteínas de unión a nucleótido de guanina que acoplan las señales extracelulares recibidas por los receptores de la superficie celular a diversos sistemas segundo mensajero intracelulares. Los miembros identificados de la familia acoplada a proteína G comparten una serie de rasgos estructurales, siendo el más altamente conservado siete regiones aparentemente transmembrana, que son altamente homólogas entre los miembros de esta familia (Strosberg, A.D., Eur. J. Biochem. 196: 1-10 (1991)). La evidencia de que los receptores opioides son miembros de esta familia incluye la estimulación de la actividad GTPasa por opioides, la observación de que análogos de GTP afectan drásticamente la unión de agonista de opioide y opiáceo, y la observación de que la toxina pertussis (que inactiva selectivamente por ribosilación con ADP tanto las subfamilias Gi como Go de proteínas G) bloquea el acoplamiento de receptor opioide a la adenilato ciclasa y a los canales de K^{+} y Ca^{2+} (Evans, C.J., supra).

Los miembros de la familia de receptores acoplados a proteína G exhiben un intervalo de características. Muchos de los receptores acoplados a proteína G, por ejemplo el receptor de somatostatina y el receptor de angiotensina, tienen un solo exón que codifica la región que codifica la proteína entera (Strosberg, supra); Langford, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138: 1025-1032 (1992)). Sin embargo, otros receptores, tales como el receptor de sustancia P y el receptor D2 de dopamina, contienen la región que codifica la proteína. El receptor D2 es particularmente interesante porque el ayuste alternativo del gen da lugar a diferentes productos transcritos (concretamente receptores) (Evans, C.J., supra; Strosberg, supra). De forma interesante, se ha informado de que los ligandos de somatostatina se unen a receptores opioides (Terenius, L., Eur. J. Pharmacol. 38: 211 (1976); Mulder, A.H., et al., Eur. J. Pharmacol. 205: 1-6 (1991)) y, además, que tienen mecanismos moleculares similares (Tsunoo, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9832-9836 (1986)).

En los esfuerzos anteriores por describir y purificar receptores opioides, se han descrito dos clones que se hipotetizó que codificaban una porción o bien los receptores opioides enteros. El primer clon, que codifica la proteína de unión a opiáceo OBCAM (Schofield et al., supra), se obtuvo utilizando una sonda diseñada a partir de una secuencia aminoacídica de una proteína purificada en una columna de afinidad por morfina. La OBCAM carece de cualquier dominio transmembrana, pero tiene un dominio C-terminal que es característico de la adhesión de la proteína a la membrana a través de un enlace fosfatidilinositol (PI). Este rasgo, que es compartido por miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, no es común a la familia de receptores acoplados a proteína G. Por tanto, se ha propuesto que la OBCAM es parte de un complejo receptor junto con otros componentes que están acoplados a proteínas G (Schofield, et al., supra). Actualmente, sin embargo, no existen evidencias directas de dicho complejo.

Se obtuvo un segundo clon del receptor opioide propuesto en un esfuerzo para clonar un receptor que se una a ligandos de receptor opioide kappa (Xie, G.X., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4124-4128 (1992)). Se aisló una molécula de ADN que codificaba un receptor acoplado a G a partir de una biblioteca de ADNc de placenta. Este receptor tiene una homología extremadamente alta con el receptor de neurocinina B (84% idéntico a lo largo de la secuencia proteica propuesta). Cuando se expresó este clon en células COS, presentó una unión desplazable por péptido opioide de ^{3}H-bremazocina (un ligando opiáceo con alta afinidad por receptores kappa). Sin embargo, la baja afinidad de este receptor por la ^{3}H-bremazocina, y la carencia de selectividad apropiada de este receptor (que une ligandos tanto mu como delta), hacía dudoso que esta molécula clonada fuera realmente un receptor opioide.

Además, la caracterización de proteínas de receptor opioide se ha probado difícil debido a su inestabilidad una vez solubilizadas de la membrana; no se han aislado receptores opioides delta purificados. Las estimaciones previas de pesos moleculares de receptor opioide en el intervalo de 30 kDa a 60 kDa reflejan adicionalmente la dificultad de aislar y caracterizar estas proteínas.

Recientemente, se ha informado de ADN que codifica receptores opioides kappa y delta de múridos de cerebro de ratón por Yasuda, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6736-6740. La secuencia de los clones indicó la presencia de las siete regiones transmembrana esperadas. El receptor opioide delta de ratón se expuso que había sido clonado (Kieffer, B.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12048- 12052 (dic. 1992) después de la fecha de presentación del documento de prioridad de la presente solicitud. Sin embargo, la secuencia reseñada en dicha memoria difiere de la secuencia reseñada por los presentes inventores para el receptor delta de ratón (Evans et al., 1992, supra; esta exposición).

Eberwine, J.H., et al., Fed. Proc. (1987) 46: 1444, resumen 6582, describe la transfección de una biblioteca de ADNc de NG108 enriquecida en estirpes celulares que no poseen sitios de unión de receptor opioide, y por tanto proporcionan a las células actividad de unión a opioide. Simonds, W.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 4974-4978 informaron de la purificación de receptores opiáceos a partir de estirpes celulares NG108-15 hasta homogeneidad aparente.

Exposición de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican el receptor opioide delta de múrido, así como moléculas de ácido nucleico recombinante que pueden recuperarse utilizando hibridación de bajo rigor con este ADN expuesto. Por tanto, la invención proporciona genes que codifican los receptores delta de cualquier especie que contenga genes que codifiquen dichos receptores suficientemente homólogos para hibridar en las condiciones de bajo rigor descritas en la presente memoria.

Por tanto, en un aspecto, la invención se dirige a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un receptor opioide delta que híbrida en condiciones de bajo rigor con la secuencia nucleotídica de la Figura 5 o su complemento. Por "bajo rigor" se quiere indicar 50% de formamida/6 x SSC, durante una noche a 37ºC para la hibridación, seguido de lavados a 2 x SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente.

Se proporciona también una molécula de ADN que comprende un sistema de expresión capaz, cuando se transforma en una célula hospedadora, de producir un receptor opioide en la célula, cuyo sistema de expresión comprende una secuencia nucleotídica que codifica dicho receptor opioide ligado operativamente a secuencias de control heterólogas operables en dicha célula. El receptor puede producirse de modo recombinante utilizando este sistema de expresión y células hospedadoras modificadas para contenerlo.

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Son especialmente útiles células de vertebrados que expresan el gen de receptor opioide de modo que la proteína de receptor opioide se presente en la superficie de las células. Estas células ofrecen medios para seleccionar agonistas y antagonistas nativos y sintéticos candidatos a receptores opioides.

En otros aspectos más, la invención se dirige a métodos para seleccionar agonistas y/o antagonistas candidatos que actúan en los receptores opioides utilizando las células transformadas recombinantes de la invención. Dichos ensayos incluyen (1) ensayos de unión que utilizan la competición con ligandos conocidos por unirse a receptores opioides, (2) ensayos de agonista que analizan la activación de las rutas secundarias asociadas a la activación del receptor opioide en las células transformadas y (3) ensayos que evalúan el efecto de la unión del candidato al receptor por la presencia o ausencia de ión sodio y GTP. Los ensayos de antagonista incluyen la combinación de la capacidad del candidato de unirse al receptor con la incapacidad de efectuar una activación posterior, y más importante, con la competición con un agonista conocido.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa una comparación de la unión de ^{3}H-diprenorfina (curvas de saturación) entre células NG108-15 y células COS tres días después de la transfección (por electroporación) de cada una con DOR-1 en el vector CDM8. La unión específica de opioide fue indetectable en células COS no transfectadas o células COS transfectadas con plásmido solo.

La Figura 2 representa curvas de desplazamiento de ^{3}H-diprenorfina 5 mM de membranas de células COS transfectadas con DOR-1. La ^{3}H-diprenorfina se desplazó con diprenorfina, etorfina, morfina y levorfanol, pero no con dextrorfano (el isómero óptico no activo como opiáceo de levorfanol).

La Figura 3 representa curvas de desplazamiento de ^{3}H-diprenorfina 5 nM de membranas de células COS de células transfectadas con DOR-1. La ^{3}H-diprenorfina se desplazó con DPDPE y DSLET, que son agonistas selectivos de delta, con DADLE, un ligando de alta afinidad por receptores mu y delta, y con dinorfina 1-17, un ligando preferencial de kappa. La ^{3}H-diprenorfina no se desplazó con DAGO, un ligando selectivo de mu.

La Figura 4 representa los resultados de un análisis Northern de ARNm de células NG108-15 y células de diversas regiones de cerebro de rata.

La Figura 5 muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica deducida del clon DOR-1.

La Figura 6 representa la secuencia aminoacídica deducida de DOR-1, en comparación con el receptor de somatostatina de rata. Los sitios de glicosilación de consenso que se prevé que entran dentro de los dominios extracelulares se indican con un asterisco. Los sitios de proteína quinasa C potenciales se enumeran en el ejemplo 5. Las siete regiones transmembrana previstas (subrayadas) se prevén basándose en el perfil de hidrofobicidad y en previsiones publicadas (programa de software MacVector (IBI); T. Hopp, y K. Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3842-3828 (1981)). Para secuenciar, el inserto de ADNc se subclonó en pBluescript y se secuenciaron ambas cadenas a partir de ADN monocatenario utilizando secuenciación cíclica con Sequenase y Taq. Por ambigüedades debidas a compresiones, el 7-desaza-dGTP reemplazó al dGTP en las reacciones de secuenciación, y los productos se resolvieron en geles de formamida.

La Figura 7 representa una transferencia Southern de una sonda de ADNc de DOR-1 marcada radiactivamente hibridada con alto rigor a ADN de NG108-15, de ratón, de rata y de ser humano cortado con BamHI.

La Figura 8 muestra una secuencia nucleotídica parcial del clon genómico H3 de receptor opioide delta humano (también designado como DORa humano o hDORa).

La Figura 9 muestra la homología de diversas secuencias aminoacídicas de receptor.

Modos de realización de la invención

La invención proporciona ADN que codifica proteína de receptor opioide delta de mamífero y ácidos nucleicos recombinantes adicionales, vectores de expresión y métodos útiles para la producción de estas proteínas. Además, son útiles células eucarióticas, tales como células COS, transformadas con las moléculas recombinantes de la invención de modo que expresen proteínas de receptor opioide en su superficie, en ensayos de examen para identificar agonistas y antagonistas opioides candidatos. Además, pueden generarse anticuerpos ante proteínas de receptor opioide producidas de modo recombinante. Estos anticuerpos son útiles en inmunoensayos para dicha proteína y en la purificación por afinidad de la misma.

Receptor opioide recombinante

Se ilustra a continuación en la presente memoria la obtención de un ADNc que codifica un receptor opioide delta de múrido. La secuencia de ADN completa del ADNc, y la secuencia aminoacídica codificada por el mismo, se indican en la presente memoria en la Figura 5. La disponibilidad de este ADNc permite la recuperación del correspondiente ADN que codifica receptor opioide de otras especies vertebradas. En consecuencia, la presente invención pone en posesión de la técnica moléculas recombinantes y métodos para la producción de células que expresan receptores opioides delta de diversas especies vertebradas. Por tanto, el ADNc de la Figura 5, o una porción del mismo, puede utilizarse como una sonda para identificar esa porción del ADN o ADNc genómico de vertebrado que codifica una proteína de receptor opioide delta. Los métodos ilustrativos utilizados para preparar una biblioteca genómica e identificar los genes que codifican el receptor opioide se describen por conveniencia a continuación en la presente memoria.

El clon DOR-1 descrito en la Figura 5 es un clon de ADNc correspondiente al receptor opioide delta de múrido. Los presentes inventores encontraron, y describen en la presente memoria, que el examen de una biblioteca genómica humana en condiciones de bajo rigor da como resultado la recuperación de ADN que codifica los tres tipos de receptores opioides humanos. De forma similar, se obtuvo un clon genómico de múrido. Además, se obtuvo un clon de ADNc a partir de una biblioteca de cerebro de ratón que codifica el receptor opioide mu de múrido. Por tanto, las bibliotecas de ADNc de fuentes apropiadas, tales como el cerebro, o bien bibliotecas genómicas, son fuentes o sustratos fructíferos para obtener el ADN de la presente invención y los correspondientes materiales recombinantes. La invención está dirigida por tanto a ADN que codifica un receptor opioide delta de un vertebrado, en el que el receptor opioide está codificado por una secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones de bajo rigor con las secuencias nucleotídicas mostradas en la Figura 5 ó 6 o con su complemento.

Como alternativa, puede utilizarse el ADN de la Figura 5 o una porción del mismo para identificar tejidos o células específicos que expresan proteína de receptor opioide analizando el ARNm, por ejemplo, utilizando técnicas de transferencia Northern. Aquellos tejidos que se identifica que contienen ARNm que codifica proteína de receptor opioide utilizando las sondas de la invención, son entonces fuentes adecuadas para la preparación de bibliotecas de ADNc que pueden ensayarse adicionalmente utilizando el ADNc descrito a continuación en la presente memoria.

El ADN que codifica las diversas proteínas de receptor opioide de vertebrados, obtenido en general como se indica anteriormente, según técnicas estándar descritas a continuación en la presente memoria, puede utilizarse para producir células que expresan el receptor opioide en su superficie; dichas células son típicamente células eucarióticas, en particular células de mamífero tales como células COS o células CHO. Se describen a continuación en la presente memoria los sistemas de expresión adecuados en células eucarióticas para dicha producción. Las proteínas de receptor opioide pueden producirse también en sistemas de expresión procariótica o eucariótica alternativos para la producción de la proteína per se. El ADN que codifica la proteína puede ligarse a vectores de expresión precedido por secuencias señal para efectuar su secreción, o puede producirse de forma intracelular así como en la superficie celular, dependiendo de la elección del sistema de expresión y el hospedador. Si se desea, la proteína de receptor opioide así producida de modo recombinante puede purificarse utilizando medios adecuados de purificación de proteína, y en particular, mediante purificación de afinidad utilizando anticuerpos o fragmentos de los mismos inmunoespecíficos de la proteína de receptor opioide.

Examen de agonistas y antagonistas opioides utilizando células recombinantes

La capacidad de un compuesto candidato de actuar como un agonista o antagonista opioide puede evaluarse utilizando las células recombinantes de la invención en una variedad de maneras. Para exhibir actividad agonista o antagonista, el compuesto candidato debe unirse al receptor opioide. Por tanto, para evaluar la capacidad del candidato de unirse, puede utilizarse un ensayo de unión directa o indirecta. Para un ensayo de unión directa, el compuesto de unión candidato se marca de forma detectable en sí misma, tal como un radioisótopo o un marcaje fluorescente, y se evalúa la unión a las células recombinantes de la invención comparando la adquisición del marcaje por las células recombinantes con la adquisición del marcaje por las células no transformadas (control) correspondientes.

Más conveniente, sin embargo, es el uso de un ensayo competitivo en el que el compuesto candidato compite por la unión a las células recombinantes de la invención con una forma marcada detectablemente de un ligando opioide conocido por unirse al receptor. Dichos ligandos se marcan ellos mismos utilizando radioisótopos o restos fluorescentes, por ejemplo. Un opioide particularmente adecuado conocido por unirse a este receptor es la diprenorfina. Un protocolo típico para dicho ensayo es el siguiente:

En general, se incuban aproximadamente 10^{6} células recombinantes en suspensión en 1,0 ml de tampón Hepes Ringer de Kreb (KRHB) a pH 7,4, a 37ºC durante 20 min con ^{3}H-diprenorfina. La unión no específica se determina mediante la adición de diprenorfina 400 nM a las mezclas de unión. Se añaden diversas concentraciones de compuestos candidatos a las mezclas de reacción. Las incubaciones se terminan recogiendo las células en filtros Whatman GF-B, con eliminación de la radiactividad en exceso por lavado de los filtros tres veces con 5 ml de KRHB a 0ºC. Después de incubar a 20ºC durante una noche en 5 ml de fluido de centelleo, tal como Liquiscint (National Diagnostics, Somerville, NJ), se determina la radiactividad en los filtros mediante recuento de centelleo líquido.

Los valores de K_{d} (constante de disociación) para los ligandos opiáceos candidatos pueden determinarse a partir del valor de CI_{50} ("concentración inhibitoria_{50}" significa la concentración de ligando candidato que da como resultado un 50% de reducción de la unión de diprenorfina marcada).

Los efectos de sodio y GTP sobre la unión de ligandos a los receptores expresados de modo recombinante pueden utilizarse para distinguir las actividades agonista de antagonista. Si la unión de un compuesto candidato es sensible a Na^{+} y GTP, es más probable que sea un agonista que un antagonista, puesto que el acoplamiento funcional de receptores opioides a moléculas segundo mensajero tales como adenilato ciclasa requiere la presencia tanto de sodio como de GTP (Blume et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 26-35 (1979)). Además, se ha mostrado que sodio, GTP y análogos de GTP efectúan la unión de opioides y agonistas de opioides a receptores opioides (Blume, Life Sci. 22: 1843-1852 (1978)). Puesto que los antagonistas opioides no exhiben unión que sea sensible a nucleótidos de guanina y sodio, este efecto se utiliza como un método para distinguir agonistas de antagonistas utilizando ensayos de unión.

Además, la actividad agonista puede evaluarse directamente mediante el resultado funcional en la célula. Por ejemplo, es conocido que la unión de agonistas opioides inhibe la formación de AMPc, inhibe la activación de canales de potasio, inhibe la activación de canales de calcio y estimula la GTPasa. La evaluación de estas actividades en respuesta a un compuesto candidato es un diagnóstico de actividad agonista. Además, la capacidad de un compuesto de interferir con la actividad activadora de un agonista conocido tal como etorfina lo clasifica eficazmente como un antagonista.

En un ensayo típico, la medida de los niveles de AMPc en células que expresan receptores opioides se lleva a cabo determinando la cantidad de ^{3}H-AMPc formada a partir de depósitos intracelulares de ATP premarcados con ^{3}H-adenina (Law et al., supra). Por tanto, los ensayos de formación de AMPc se llevan a cabo con 0,5 x 10^{6} células/0,5 ml de KRHB a pH 7,4, incubadas a 37ºC durante 20 minutos. Después de la adición del patrón interno ^{32}P-AMPc, se separa el AMPc radiactivo de otros nucleótidos marcados con ^{3}H mediante métodos cromatográficos conocidos de doble columna. Se determina después la capacidad de los agonistas de opiáceo de inhibir la acumulación de AMPc como se describe en Law et al. (supra).

La potencia de un antagonista opiáceo candidato puede determinarse midiendo la capacidad de la etorfina de inhibir la acumulación de AMP cíclico en presencia y ausencia de cantidades conocidas del antagonista candidato. La constante de inhibición (k_{i}) de un antagonista puede calcularse después a partir de la ecuación para inhibidores competitivos.

Un rasgo interesante de los ensayos de examen utilizando células NG108-5 de la técnica anterior es que la función agonista de la inhibición de adenilato ciclasa aparentemente no requiere la unión de todos los receptores en estas células. Por tanto, los valores de K_{d} y K_{i} para los ligandos opioides diferían cuando se utilizaban estas células.

Los ensayos precedentes, como se describen anteriormente, realizados en las células transformadas de modo recombinante de la presente invención, proporcionan un examen más directo y más conveniente de compuestos candidatos que tienen actividad opioide agonista y antagonista que los previamente disponibles en la técnica. Además, dichos ensayos son más sensibles, puesto que las células pueden modificarse por ingeniería genética, según la presente invención, para expresar altos niveles del receptor opioide.

Adicionalmente, las células modificadas por ingeniería genética según la presente invención evitarán el problema de las células NG108-15 que, debido a su trasfondo celular tumoral, tienen un entorno celular que afecta artificialmente la expresión del receptor opioide.

Métodos para preparar proteína de receptor opioide o porciones de la misma

La presente invención proporciona la secuencia aminoacídica de un receptor opioide de múrido; de forma similar, la disponibilidad del ADNc de la invención pone en posesión de la técnica los correspondientes receptores opioides de vertebrados cuyas secuencias aminoacídicas pueden determinarse también mediante métodos estándar. Ya que las secuencias aminoacídicas de dichos receptores opioides son conocidas, o determinables, además de la purificación de dicha proteína de receptor a partir de fuentes nativas, pueden emplearse la producción recombinante o la metodología peptídica sintética para producir la proteína o péptido de receptor.

Pueden prepararse también el receptor opioide o porciones del mismo utilizando métodos de síntesis peptídica en fase sólida estándar (o en fase de solución), como es conocido en la técnica. Además, el ADN que codifica estos péptidos puede sintetizarse utilizando instrumentación comercialmente disponible de síntesis de oligonucleótidos para la producción de proteína de la manera indicada anteriormente. La producción utilizando síntesis peptídica en fase sólida es, por supuesto, necesaria si se han de incluir aminoácidos no codificados por el gen.

La nomenclatura utilizada para describir los péptidos y proteínas de la invención sigue la práctica convencional en la que el grupo amino N-terminal se supone que está a la izquierda y el grupo carboxi a la derecha de cada residuo aminoacídico en el péptido. En las fórmulas que representan realizaciones específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino- y carboxi-terminales, aunque a menudo no mostrados específicamente, se entenderá que están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique otra cosa. Por tanto, el NH_{3}^{+} N-terminal y el COO^{-} C-terminal a pH fisiológico se entiende que están presentes, aunque no se especifiquen y muestren necesariamente, en ejemplos específicos o en fórmulas genéricas. Los grupos funcionales libres en las cadenas laterales de los residuos aminoacídicos pueden modificarse también mediante glicosilación, fosforilación, unión de cisteína, amidación, acilación u otra sustitución, que pueden alterar, por ejemplo, las propiedades fisiológicas, bioquímicas o biológicas de los compuestos sin afectar su actividad dentro del significado de las reivindicaciones adjuntas.

En los péptidos mostrados, cada residuo codificado por gen, cuando sea apropiado, está representado por una designación de una sola letra, correspondiente al nombre trivial del aminoácido, según la siguiente lista convencional:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Aminoácido  \+  Símbolo de una  \+  Símbolo de
tres \cr  \+  letra  \+  letras \cr  Alanina \+ A \+
Ala\cr  Arginina \+ R \+ Arg\cr  Asparagina \+ N \+ Asn\cr  Ácido
aspártico \+ D \+ Asp\cr  Cisteína \+ C \+ Cys\cr  Glutamina \+ Q \+
Gln\cr  Ácido glutámico \+ E \+ Glu\cr  Glicina \+ G \+ Gly\cr 
Histidina \+ H \+ His\cr  Isoleucina \+ I \+ Ile\cr  Leucina \+ L \+
Leu\cr  Lisina \+ K \+ Lys\cr  Metionina \+ M \+ Met\cr 
Fenilalanina \+ F \+ Phe\cr  Prolina \+ P \+ Pro\cr  Serina \+ S \+
Ser\cr  Treonina \+ T \+ Thr\cr  Triptófano \+ W \+ Trp\cr  Tirosina
\+ X \+ Tyr\cr  Valina \+ V \+
Val\cr}

Nomenclatura de encefalinas

Las encefalinas son cualquiera de dos péptidos que tienen cinco residuos con el residuo N-terminal numerado 1:

13

En la "met encefalina", el quinto residuo es metionina:

tyr-gly-gly-phe-met.

En la "leu encefalina", el quinto residuo es leucina:

tyr-gly-gly-phe-leu.

Los análogos de encefalina pueden prepararse con (1) sustituciones aminoacídicas, (2) sustituciones D-aminoacídicas y/o (3) aminoácidos adicionales. El sitio en el que se realiza la sustitución se anota al inicio del nombre del compuesto. Por ejemplo, "(D-ala^{2}, D-leu^{5}) encefalina" significa que D-ala está presente en la segunda posición y D-leu está presente en la quinta posición:

tyr-[D-ala]-gly-phe-[D-leu]

Pueden utilizarse también abreviaturas de una letra. Por tanto, "(D-Ser^{2}) leu encefalina" podría abreviarse como "DSLE". Los residuos adicionales son anotados también. Por tanto, la adición de un residuo de treonina (en la sexta posición) de (D-Ser^{2}) leu encefalina sería "(D-Ser^{2}) leu encefalina thr", que podría abreviarse como "DSLET":

tyr-[D-ser]-gly-phe-leu-thr

Anticuerpos

Los anticuerpos inmunorreactivos con la proteína o péptido de receptor opioide delta de la presente invención pueden obtenerse mediante inmunización de sujetos mamíferos adecuados con péptidos que contienen como regiones antigénicas aquellas porciones del receptor que se pretende alcanzar con los anticuerpos. Se han determinado ciertas secuencias proteicas que tienen un alto potencial antigénico. Dichas secuencias se enumeran en índices antigénicos, por ejemplo el software MacVector (I.B.I.). Así, al determinar la secuencia de la proteína de receptor opioide y evaluar la secuencia con un índice antigénico, se localizan las secuencias antigénicas probables.

Los anticuerpos se preparan inmunizando hospedadores mamíferos adecuados según protocolos de inmunización conocidos utilizando los haptenos peptídicos solos, si son de suficiente longitud, o, si se desea, o si es necesario para potenciar la inmunogenicidad, conjugados a vehículos adecuados. Los métodos para preparar conjugados inmunogénicos con vehículos tales como BSA, KLH u otras proteínas vehículo son bien conocidos en la técnica. En algunas circunstancias, puede ser eficaz la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, pueden ser deseables reactivos de unión tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, para proporcionar accesibilidad al hapteno. Los péptidos hapténicos pueden extenderse o intercalarse con residuos de cisteína, por ejemplo para facilitar la unión al vehículo. La administración de los inmunógenos se realiza generalmente mediante inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con el uso de coadyuvantes adecuados, como se da por entendido generalmente en la técnica. Durante el programa de inmunización, se toman valoraciones de anticuerpos para determinar la idoneidad de la formación de anticuerpos.

Aunque los antisueros policlonales producidos de esta manera pueden ser satisfactorios para algunas aplicaciones, para composiciones farmacéuticas se prefiere el uso de preparaciones de anticuerpos monoclonales (mAb). Pueden prepararse estirpes celulares inmortalizadas que secretan los mAb deseados utilizando el método estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que efectúan la inmortalización de linfocitos o células de bazo, como es generalmente conocido. Las estirpes celulares inmortalizadas que secretan los mAb deseados se examinan por inmunoensayo en el que el antígeno es el hapteno peptídico o es el receptor opioide mismo presentado en una célula hospedadora recombinante. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que secreta el mAb deseado, las células pueden cultivarse in vitro o mediante inyección intraperitoneal en animales, en los que los mAb se producen en el fluido ascítico.

Los mAb deseados se recuperan después del sobrenadante de cultivo o del fluido ascítico. Además de anticuerpos intactos, pueden utilizarse como antagonistas fragmentos de los mAb o de anticuerpos policlonales que contienen la porción de unión a antígeno. El uso de fragmentos de unión a antígeno inmunológicamente reactivos, tales como fragmentos Fab, Fab' o F(ab')_{2}, es a menudo preferible, especialmente en un contexto terapéutico, ya que estos fragmentos son generalmente menos inmunogénicos que la molécula de inmunoglobulina completa.

Métodos estándar

Las técnicas para secuenciar, clonar y expresar secuencias de ADN que codifican las secuencias aminoacídicas correspondientes a un receptor opioide, por ejemplo reacción en cadena con polimerasa (PCR), síntesis de oligonucleótidos, sondeo de una biblioteca de ADNc, transformación de células, construcción de vectores, preparación de secuencias oligonucleotídicas sin sentido basadas en secuencias nucleotídicas con sentido conocidas, extracción de ARN mensajero, preparación de bibliotecas de ADNc y similares están bien establecidas en la técnica. Los expertos cualificados están familiarizados con los materiales de partida, condiciones y procedimientos específicos estándar. Los siguientes párrafos se proporcionan por conveniencia, entendiéndose que la invención está limitada sólo por las reivindicaciones adjuntas.

Preparación de ARN y transferencia Northern

La preparación de ARN es como sigue: las muestras utilizadas para la preparación de ARN se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y después se almacenan hasta su uso a -80ºC. El ARN se prepara mediante centrifugación con CsCl (Ausubel et al., supra) utilizando un tampón de homogeneización modificado (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)). Se selecciona ARN poli(A^{+}) por cromatografía oligo(dT) (Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972)). Las muestras de ARN se almacenan a -80ºC.

El análisis de la expresión génica y la distribución de tejido pueden realizarse utilizando transferencia Northern, por ejemplo con sondas marcadas radiactivamente. El ARNm se separa por tamaño utilizando electroforesis en gel y después se transfiere típicamente a una membrana de nailon o nitrocelulosa y se hibrida con la sonda marcada radiactivamente. La presencia de la sonda hibridada se detecta utilizando autorradiografía.

Clonación

Las secuencias de ADNc que codifican la proteína de receptor opioide se obtienen a partir de una biblioteca de ADNc seleccionado por tamaño cebado aleatoriamente.

Como alternativa, las secuencias de ADNc que codifican la proteína de receptor opioide se obtienen a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de ARNm aislado a partir de células que expresan la proteína de receptor en diversos órganos tales como el cerebro, según los procedimientos descritos en Sambrook, J. et al., "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

El inserto de ADNc del clon exitoso, escindido con una enzima de restricción tal como EcoRI, se utiliza después como sonda de la biblioteca de ADNc original u otras bibliotecas (a bajo rigor) para obtener los clones adicionales que contienen insertos que codifican otras regiones de la proteína que conjuntamente o por separado abarcan la secuencia completa de nucleótidos que codifica la proteína.

\newpage

Un procedimiento adicional para obtener secuencias de ADNc que codifican la proteína de receptor opioide es la PCR. La PCR se utiliza para amplificar secuencias a partir de una biblioteca de ADNc combinada de ARN transcrito inversamente, utilizando cebadores oligonucleotídicos basados en las secuencias transportadoras ya conocidas.

Construcción de vector

La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias de codificación y control deseadas emplea técnicas de ligamiento y restricción que son bien entendidas en la técnica (Young et al., Nature 316: 450-452 (1988)). Se sintetiza ADNc bicatenario que codifica proteína de receptor opioide y se prepara para inserción en un vector de plásmido CDM8. Como alternativa, pueden utilizarse vectores tales como Bluescript^{2} o Lambda ZAP^{2} (Stratagene, San Diego, CA) o un vector de Clontech (Palo Alto, CA) según procedimientos estándar (Sambrook, J. et al., supra).

La escisión de ADN específica de sitio se realiza tratando con la enzima de restricción adecuada, tal como EcoRI, o más de una enzima, en condiciones que se dan por entendidas generalmente en la técnica, y cuyos particulares se especifican por los fabricantes de estas enzimas de restricción comercialmente disponibles. Véase, por ejemplo, New England Biolabs, catálogo de productos. En general, se escinde aproximadamente 1 \mug de ADN con una unidad de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón; en los ejemplos de la presente memoria, se utiliza típicamente un exceso de enzima de restricción para asegurar la digestión completa del sustrato de ADN. Los tiempos de incubación de aproximadamente una a dos horas aproximadamente a 37ºC son funcionales, sin embargo pueden tolerarse variaciones. Después de cada incubación, se elimina la proteína mediante extracción con fenol/cloroformo, que puede seguirse por otra extracción, y se recupera el ácido nucleico a partir de fracciones acuosas mediante precipitación con etanol.

En la construcción de vector empleando "fragmentos de vector", el fragmento de vector se trata habitualmente con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIP) para eliminar el fosfato 5' y evitar el religamiento del vector. Las digestiones se realizan a pH 8 en Tris aproximadamente 150 mM, en presencia de Na^{+} y Mg^{++} utilizando aproximadamente 1 unidad de BAP o CIP por \mug de vector a 60ºC ó 37ºC, respectivamente, durante aproximadamente 1 hora. Para recuperar los fragmentos de ácido nucleico, la preparación se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Como alternativa, puede evitarse el religamiento en vectores que se han digerido dos veces mediante digestión con enzimas de restricción adicionales de los fragmentos indeseados.

Los ligamientos se realizan en volúmenes de 15-50 \mul en las siguientes condiciones y temperaturas estándar: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 \mug/ml, NaCl 10 mM a 50 mM y ATP 40 \muM, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de ligasa T4 de ADN a 0ºC (para ligamiento de "extremos cohesivos") o bien ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de ligasa T4 de ADN a 14ºC (para ligamiento de "extremos romos"). Los ligamientos intermoleculares de "extremos cohesivos" se realizan habitualmente a 33-100 \mug/ml de concentraciones totales de ADN (5-100 nM de concentración de extremo total). Los ligamientos intermoleculares de extremos romos (que emplean habitualmente un exceso de 10-30 veces molar de engarces) se realizan a una concentración de extremos total 1 \muM. Los ligamientos correctos para la construcción de vector se confirman según los procedimientos de Young et al., Nature 316: 450-452 (1988).

Examen de biblioteca de ADNc

Las bibliotecas de ADNc pueden examinarse utilizando condiciones de rigor reducido, como se describe en Ausubel et al., "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York (1990), o utilizando métodos descritos en Sambrook et al., supra, o utilizando un procedimiento de hibridación en colonia o placa con un fragmento del ADN de DOR-1 que codifica la proteína de receptor opioide.

La hibridación en placa se lleva a cabo típicamente como sigue: se hacen crecer durante una noche a 37ºC en caldo LB (Sambrook et al., supra) bacterias hospedadoras tales como LE 392 (Stratagene), se sedimentan suavemente y se resuspenden a la mitad del volumen original de MgSO_{4} 10 mM, CaCl_{2} 10 mM. Después de la valoración, se añade una cantidad de la biblioteca de fago que contiene aproximadamente 50.000 unidades de formación de placa (pfu) a 300 \mul de las bacterias hospedadoras, se incuba a 37ºC durante 15 minutos y se siembra en agar NZYCM con 10 ml de agarosa NZYCM por encima. Se examinan un total de un millón de placas distribuidas en veinte placas de 15 cm. Para el examen en colonia, se siembran bacterias transfectadas en placas de caldo LB con los antibióticos apropiados. Después de que las placas o colonias hayan crecido a 1 mm, las placas se enfrían a 4ºC durante al menos 2 horas, y después se recubren con filtros duplicados de nitrocelulosa, seguido de la desnaturalización de los filtros en NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M durante cinco minutos y la neutralización en Tris 0,5 M, pH 7,4/NaCl 1,5 M durante cinco minutos. Los filtros se secan después al aire, se calientan a 80ºC durante 2 horas, se lavan con 5 x SSC/0,5% de SDS a 68ºC durante varias horas, y se prehibridan en NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,2/1% de BSA/EDTA 1 mM/7% de SDS/ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml durante más de 4 horas. Utilizando el ADNc de DOR-1 (descrito en la presente memoria) marcado por cebado aleatorio como sonda, se lleva a cabo una hibridación de alto rigor en la misma solución a 68ºC, y la temperatura se reduce a 50-60ºC para una hibridación de menor rigor. Después de hibridación durante 16-24 horas, los filtros se lavan primero con NaPO_{4} 40 mM, pH 7,2/0,5% de BSA/5% de SDS/EDTA 1 mM dos veces durante una hora cada vez, después con NaPO_{4} 40 mM, pH 7,2/1% de BSA/EDTA 1 mM durante una hora cada uno, ambos a la misma temperatura que la hibridación (Boulton et al., Cell 65: 663-675 (1991)). Los filtros se exponen después a una película con una retícula potenciadora a -70ºC durante un día a una semana.

Las señales positivas se alinean con las placas, y el fago positivo correspondiente se purifica en rondas ulteriores de examen, utilizando las mismas condiciones que en el examen primario. Los clones de fago purificados se utilizan después para preparar ADN de fago para subclonar en un vector de plásmido para análisis de secuencia. Se analiza la distribución en tejido del ADN correspondiente a los diversos clones independientes utilizando transferencia Northern e hibridación in situ utilizando métodos estándar. La función del ADN se ensaya utilizando la expresión en un sistema de expresión eucariótico heterólogo tal como células COS.

Expresión de proteína de receptor opioide

La secuencia nucleotídica que codifica la proteína de receptor opioide puede expresarse en una variedad de sistemas. El ADNc puede escindirse por enzimas de restricción adecuadas y ligarse a vectores de expresión procarióticos o eucarióticos para dicha expresión.

Por ejemplo, como se indica a continuación, el ADNc que codifica la proteína se expresa en células COS. Para efectuar la expresión funcional, se utilizó el vector de expresión de plásmido CDM8 (Aruffo y Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573- 8577 (1987), proporcionado por los Dr. Aruffo y Seed (Universidad de Harvard, Boston, MA). Como alternativa, pueden utilizarse otros vectores de expresión adecuados tales como vectores retrovirales.

Pueden utilizarse sistemas procarióticos, y preferiblemente eucarióticos, para expresar el receptor opioide. Pueden utilizarse microbios eucarióticos, tales como levaduras, como hospedadores para la producción en masa de proteína de receptor opioide. Se utilizan principalmente las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae, levadura de panadería, aunque están habitualmente disponibles una serie de otras cepas. Pueden utilizarse vectores que emplean, por ejemplo, el origen de replicación 2\mu (Broach, Math. Enz. 101: 307 (1983)) u otros orígenes de replicación compatibles con levaduras (por ejemplo, Stinchcomb, et al., Nature 282: 39 (1979)); Tschempe et al., Gene 10: 157 (1980); y Clarke et al., Meth. Enz. 101: 300 (1983)). Las secuencias de control para vectores de levadura incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17: 4900 (1978)). Los promotores adicionales conocidos en la técnica incluyen el promotor de 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)), y aquellos para otras enzimas glicolíticas. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas al metabolismo del nitrógeno y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Se cree también que son deseables secuencias terminadoras en el extremo 3' de las secuencias de codificación. Dichos terminadores se encuentran en la región 3' no traducida después de las secuencias de codificación en genes derivados de levadura.

Como alternativa, los genes que codifican la proteína de receptor opioide se expresan en cultivos celulares hospedadores eucarióticos derivados de organismos multicelulares (véase, por ejemplo, Tissue Cultures, Academic Press, Cruz y Patterson, eds. (1973)). Estos sistemas tienen la ventaja adicional de la capacidad de eliminar intrones por ayuste, y por tanto pueden utilizarse directamente para expresar fragmentos genómicos. Las estirpes celulares útiles incluyen oocitos de anfibios tales como Xenopus oocytes, células COS, células VERO y HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO) y células de insecto tales como células SF9. Los vectores de expresión para dichas células incluyen habitualmente secuencias promotoras y de control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos utilizados habitualmente de baculovirus, virus Vaccinia, virus de simio 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273: 113 (1973)), u otros promotores virales tales como los derivados de polioma, adenovirus 2, papilomavirus bovino o virus de sarcoma aviar. Puede utilizarse también el promotor controlable hMTII (Karin et al., Nature 299: 797-802 (1982)). Se han descrito los aspectos generales de transformaciones de un sistema hospedador celular de mamífero por Axel, patente de EE.UU. nº 4.399.216. Ahora parece que las regiones "potenciadoras" son importantes para optimizar la expresión; éstas son, generalmente, secuencias encontradas cadena arriba o cadena abajo de la región promotora en regiones de ADN no de codificación. Los orígenes de replicación pueden obtenerse, si es necesario, a partir de fuentes virales. Sin embargo, la integración en el cromosoma es un mecanismo común de replicación de ADN en eucariontes.

Si se utilizan sistemas procarióticos, debe utilizarse una secuencia de codificación libre de intrones, junto con secuencias de control adecuadas. El ADNc de proteína de receptor opioide puede escindirse utilizando enzimas de restricción adecuadas y ligarse a vectores procarióticos junto con secuencias de control adecuadas para dicha expresión.

Los procariontes están representados lo más frecuentemente por diversas cepas de E. coli; sin embargo, pueden utilizarse también otras especies y cepas microbianas como las secuencias de control procarióticas utilizadas habitualmente, que se definen en la presente memoria para incluir promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de unión a ribosoma, incluyendo aquellos promotores utilizados habitualmente tales como los sistemas promotores de \beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)) y el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids. Res. 8: 4057 (1980)) y el promotor P_{L} derivado de \lambda y el sitio de unión a ribosoma del gen N (Shimatake et al., Nature 292: 128 (1981)).

Dependiendo de la célula hospedadora utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. Puede utilizarse el tratamiento que emplea cloruro de calcio, como se describe por Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1972) 69: 2110 (1972) o por Sambrook et al. (supra) para células procarióticas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede utilizarse el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 54: 546 (1978), opcionalmente modificado por Wigler et al., Cell 16: 777-785 (1979), o por Chen y Okayama, supra. Las transformaciones en levadura pueden llevarse a cabo según el método de Van Solingen et al., J. Bact. 130: 946 (1977), o de Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3829 (1979).

Otros métodos de transfección representativos incluyen transfección viral, técnicas de transfección mediada por DEAE-dextrano, fusión de lisozimas o fusión de eritrocitos, rascado, captación directa, shock osmótico o shock de sacarosa, microinyección directa, microinyección indirecta tal como mediante técnicas mediadas por eritrocitos, y/o sometiendo las células hospedadoras a corrientes eléctricas. La lista anterior de técnicas de transfección no se considera exhaustiva, ya que sin duda se desarrollarán otros procedimientos para introducir información genética en células.

Modulación de la expresión por secuencias sin sentido

Como alternativa, pueden insertarse secuencias sin sentido en células que expresan receptores opioides como un medio para modular la expresión funcional de los receptores codificados por oligonucleótidos con sentido. Las secuencias sin sentido se preparan a partir de secuencias con sentido conocidas (ADN o ARN), mediante métodos estándar conocidos en la técnica. Pueden utilizarse secuencias sin sentido específicas del gen de receptor opioide o transcripto de ARN para unirse a o inactivar los oligonucleótidos que codifican el receptor opioide.

Terminología

Como se utilizan en la presente memoria, las formas singulares "un", "uno" y "el/la" incluyen la referencia al plural al menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un receptor" incluye mezclas de dichos receptores, la referencia a "un opioide" incluye una pluralidad y/o mezclas de dichos opioides y la referencia a "la célula hospedadora" incluye una pluralidad de dichas células del mismo tipo o similar y así.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que da por entendido habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Los siguientes ejemplos se pretenden que ilustren, pero no que limiten la invención. Las temperaturas están en ºC y las presiones son casi atmosféricas a menos que se especifique otra cosa.

Preparación de mono ^{125}I-DADLE

Se yodó DADLE (Peninsula Laboratories Inc.) utilizando el método yodogénico (Maidment et al., en: MICRODIALYSIS IN THE NEUROSCIENCES, T. Robinson y J. Justice, Eds., pág. 275-303 (Elsevier, 1991)). Se producen ambas formas mono- y diyodadas. Se ha informado de que la diyodo-DADLE no se une a receptores opiáceos debido a la diyodación del residuo de tirosinasa (Miller, R.J., et al., Life Sci. 22: 379-388 (1978)). En consecuencia, se prefiere la DADLE monoyodada. La mono-^{125}I-DADLE se prefiere también porque tiene una actividad específica extremadamente alta en comparación con la DADLE marcada con otros isótopos. Por tanto, pueden utilizarse tiempos de exposición del orden de días, en lugar de semanas o meses.

Empleando una relación molar de yoduro de sodio a péptido de aproximadamente 1:100 cuando se lleva a cabo la yodación, se aumentó el rendimiento de la DADLE monoyodada preferida. Adicionalmente, para potenciar más el rendimiento de la forma monoyodada, se purificó DADLE yodada (que contiene ambas formas mono- y diyodadas) mediante HPLC en fase inversa (Maidment et al., supra). Empleando este procedimiento, se separó un solo pico mayoritario marcado radiactivamente de DADLE monoyodada de las formas diyodada y no yodada.

La DADLE monomarcada con ^{125}I es crucial para un examen exitoso. La ^{125}I- DADLE marcada radiactivamente difiere de la DADLE en diversos parámetros importantes: tamaño, hidrofobicidad y afinidad de unión (ligeramente menor). La purificación de la DADLE monoyodada de la diyodada y no yodada mediante la etapa de HPLC proporciona un ligando con actividad específica muy alta (aproximadamente 2.000 Ci/mmol). La actividad específica de la forma monoyodada es aproximadamente 100 veces mayor que la obtenida utilizando la mezcla no separada de DADLE mono-, di- y no yodada. La ^{125}I-DADLE monomarcada debe utilizarse a los pocos días de su preparación.

Ejemplo 1 Preparación de DOR-1

La estirpe celular NG108-15 (disponible en el Dr. Christopher Evans, UCLA) comprende una fuente homogénea y enriquecida de receptores opioides delta. Utilizando ARNm aislado a partir de NG108-15, se construyó una biblioteca de ADNc de tamaño seleccionado y cebado aleatoriamente en el vector de plásmido CDM8. La biblioteca de ADNc se amplificó en bacterias. La biblioteca de ADNc se transfectó en células COS-7 por electroporación. Se examinaron céspedes COS transfectados transitoriamente y se seleccionaron con mono-^{125}I-2dAla, 5dLeu encefalina (^{125}I-DADLE) altamente purificada. Se identificaron los clones positivos por autorradiografía en película, y los plásmidos de estas células se recuperaron y amplificaron en bacterias. Después de ello, los plásmidos se volvieron a transfectar en células COS. Después de tres ciclos de dicho enriquecimiento de plásmidos, se transfectaron clones individuales y se identificó un clon puro que se unía a ^{125}I-DADLE.

A. Construcción de la biblioteca de ADNc

Se preparó ARN a partir de células NG108-15 mediante homogeneización en isotiocianato de guanidinio 6 M, seguido de centrifugación a través de cloruro de cesio (J.M. Chirgwin, et al., Biochemistry 18: 5294 (1979)). El ARN poli-A^{+} se aisló mediante cromatografía sobre oligo-dT-celulosa (H. Aviv y P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408 (1972)). Utilizando este ARN como molde, se utilizaron hexámeros aleatorios para cebar la síntesis de ADNc por transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (Life Sciences Inc.). La síntesis de la segunda cadena se realizó con ARNasa-H y ADN polimerasa de E. coli (U. Gubler y B.J. Hoffman, Gene 24: 263 (1983)). Los extremos de los ADNc se volvieron romos con ADN polimerasa T4 y se añadieron engarces BstXI. Se seleccionó el ADNc más largo de 1,5 kb por electroforesis a través de acrilamida al 5%, seguido de electroelución. El ADNc de 1,5 kb se ligó al vector CDM8 (A. Aruffo y B. Seed, supra) y después se transformó en bacterias MC-1061 mediante electroporación (W.J. Dower et al., Nucl. Acids Res. 16: 6127 (1988)). En consecuencia, se prepararon seis combinaciones de ADN de plásmido a partir de la biblioteca de ADNc original de aproximadamente 2 x 10^{6} recombinantes.

B. Transfección de plásmido por electroporación y expresión en células COS

Se hicieron crecer células COS a alta densidad y se recogieron en tripsina, después se resuspendieron a 2 x 10^{7}/ml en 1,2 x RPMI que contenía suero fetal bovino al 20%. Estas células se incubaron después durante 10 minutos a 4ºC con 20 \mug de ADN de plásmido recombinante de la biblioteca de ADNc descrita anteriormente, y después se electroporaron a 960 \muF y 230 V en una cubeta de 0,4 cm de paso (BioRad). Las células se incubaron después 10 minutos adicionales a 4ºC, y después se sembraron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más suero fetal bovino al 10% (FCS).

C. Examen de células COS transfectadas

Se hicieron crecer células COS transfectadas como se obtuvieron anteriormente durante tres días, después se examinaron utilizando mono ^{125}I-DADLE marcada radiactivamente. Se lavaron los céspedes COS transfectados con PBS, después se incubaron a temperatura ambiente con ^{125}I-DADLE 10-20 nM en KHRB que contenía 1% de BSA. Después de 1 hora, las placas se lavaron rápidamente varias veces con PBS enfriado con hielo y después se secaron en hielo con un fuerte flujo forzado de aire frío. Las placas se expusieron a película Dupont Cronex en módulos a temperatura ambiente. Los clones positivos se identificaron mediante el cuidadoso alineamiento de la película con la placa Petri mediante microscopía de baja potencia.

El ADN se eliminó de las células positivas por solubilización en SDS al 0,1% y TE que contenía ARNt 1 \mug/\mul suministrado por una jeringuilla unida a un tubo capilar con un micromanipulador. Los plásmidos se purificaron a partir de las células extraídas utilizando el procedimiento de lisis Hirt (Hirt, B., J. Mol. Biol. 26: 365-369 (1997)), y se electroporaron en bacterias MC-1061. Los plásmidos se purificaron y después se volvieron a transfectar en células COS. Después de tres de dichos ciclos de enriquecimiento, se transfectaron clones de plásmido individual en células COS, proporcionando un solo clon, denominado clon DOR-1.

Ejemplo 2 Caracterización de DOR-1

El clon DOR-1 se caracterizó inicialmente examinando las fracciones de membrana celular, a partir de células que expresan DOR-1; con DADLE marcada se encontró que la unión de ^{125}I-DADLE se desplazaba por concentraciones nanomolares de los alcaloides opiáceos diprenorfina, morfina, etorfina y DADLE, DSLET y DPDPE. El dextrorfano (10 \muM) no desplazaba la ^{123}I-DADLE, mientras que su enantiómero activo como opioide levorfanol desplazaba la DADLE marcada radiactivamente. Adicionalmente, el ligando DAGO selectivo de receptor mu (5 \muM) no desplazaba las cuentas.

El clon DOR-1 se caracterizó además farmacológicamente evaluando la unión de ^{3}H-diprenorfina a células intactas que expresan el clon DOR-1 (Figura 1) y evaluando el desplazamiento de la ^{3}H-diprenorfina de las fracciones de membrana de dichas células (Figuras 2 y 3).

Los ensayos de unión se realizaron en células intactas en KRHB, 1% de BSA; o en membranas en HEPES 25 mM, MgCl_{2} 5 mM, pH 7,7. Las células se recogieron con PBS que contenía EDTA 1 mM, se lavaron dos veces con PBS y después se resuspendieron en KHRB. Las membranas preparadas a partir de las células (Law, P.Y.E. et al., Mol. Pharm. 23: 26-35 (1983)) se utilizaron directamente en el ensayo de unión. Los ensayos de unión se realizaron en placas agrupadas de polipropileno de 96 pocillos (Costar) a 4ºC en un volumen total de 100 \mul con una cantidad apropiada del ligando marcado radiactivamente. Después de 1 hora de incubación, las placas se recogieron con un recolector Tomtec y se contaron las Filtermat de tipo "B" en un contador de centelleo Betaplate (Pharmacia) utilizando láminas de centelleo de fusión Meltilex B/HS (Pharmacia).

Se analizaron células intactas que expresan DOR-1 con el antagonista opiáceo de alta afinidad ^{3}H-diprenorfina. La unión específica se definió por las cuentas desplazadas por diprenorfina 400 nM. La Figura 1 muestra una curva de saturación de ^{3}H-diprenorfina para células NG108-15, y células COS-7 transfectadas con el clon de receptor opioide delta. Las células COS no transfectadas o células COS transfectadas con plásmido sin inserto no mostraron unión específica. Por tanto, la unión de opioide de células COS-DOR-1 fue similar a la de células NG108-15.

Se emplearon membranas preparadas mediante métodos estándar a partir de células COS-7 transfectadas para una caracterización farmacológica más extensa del receptor codificado por el clon DOR-1. Las afinidades por los opiáceos alcaloides siguientes en competición con la ^{3}H-diprenorfina se ilustran en la Figura 2: diprenorfina no marcada, un antagonista de alta afinidad por receptores delta; etorfina, un agonista de alta afinidad por receptores delta, mu y kappa; levorfanol, un agonista de baja afinidad por receptores delta; morfina, un agonista de baja afinidad por receptores delta y un agonista de alta afinidad por receptores mu; y dextrorfano, un enantiómero no activo como opiáceo de levorfanol que no debe unirse a receptores delta.

Como se muestra en la Figura 2, el desplazamiento de la ^{3}H- diprenorfina, en orden decreciente de afinidad, se observó con diprenorfina, etorfina, levorfanol y morfina. Como se esperaba, la ^{3}H-diprenorfina no se desplazaba por el dextrorfano.

Las afinidades de los siguientes péptidos opioides en competición por ^{3}H-diprenorfina se indican en la Figura 3: DADLE, un agonista de alta afinidad por receptores mu y delta; DSLET y DPDPE, ambos agonistas de alta afinidad por receptores delta (pero no mu); DAGO, un agonista selectivo de receptores mu; y dinorfina 1-17, un agonista de alta afinidad selectivo de receptores kappa y un agonista de moderada a baja afinidad por receptores delta. Como se muestra en la Figura 3, el desplazamiento de ^{3}H- diprenorfina, en orden decreciente de afinidad, se observó para DSLET, DPDPE y DADLE, y dinorfina 1-17. Sólo se observó un débil desplazamiento por DAGO.

Ejemplo 3 Análisis de transferencia Northern de ARN

Para análisis de transferencia Northern, se separó el ARNm de células NG108-15 y de células extirpadas de regiones del cerebro de rata mediante electroforesis a través de formaldehído 2,2 M/1,5% de agarosa, se transfirió a nailon y se hibridó en solución acuosa de alto rigor. Los filtros se prehibridaron en NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,2; 1% de BSA; EDTA 1 mM; 7% de SDS y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml durante al menos cuatro horas a 68ºC (Boulton et al., supra). Los filtros se hibridaron después durante una noche en estas mismas condiciones con un inserto de ADN purificado de = 5 x 10^{6} cpm/ml marcado por cebado aleatorio (A.P. Feinberg y B. Vogelstein, Anal. Biochem. 132: 6 (1983)). Los filtros se lavaron dos veces en NaPO_{4} 40 mM, pH 7,2; 0,5% de BSA; 5% de SDS y EDTA 1 mM durante una hora, y después se lavaron dos veces en NaPO_{4} 40 mM, pH 7,2, 1% de SDS y EDTA 1 mM durante una hora cada vez, todo a 68ºC. Después de ello, se realizó la autorradiografía con DuPont Cromex Lightening Plus a -70ºC.

Los resultados del análisis Northern del ARNm mostraron la presencia de múltiples bandas que hibridaban con la sonda aproximadamente a 8,7, 6,8, 4,4, 2,75 y 2,2 kilobases (kb) (Figura 4). Además, el análisis Northern indica que el patrón de ARNm puede variar entre las regiones cerebrales. Actualmente, no está claro si estos ARNm codifican diferentes secuencias proteicas, y si lo hacen, si estos mensajeros representan diferentes tipos o subtipos de receptores opioides.

Ejemplo 4 Análisis de transferencia Southern de ADN

La sonda de ADNc de DOR-1 marcado radiactivamente se hibridó a transferencias Southern genómicas mediante métodos estándar (Sambrook et al., supra). En consecuencia, la sonda de ADNc de DOR-1 marcado radiactivamente se hibridó en condiciones de alto rigor a una transferencia de ADN de NG108-15, de ratón, de rata y de ser humano cortado con la endonucleasa de restricción BamHI (Figura 7). Se observaron bandas sencillas en los clones que contenían el ADN de NG108-15, ratón y rata. Los tamaños de las bandas que hibridan con la sonda de ADNc se estimó que eran 5,2 kb (NG108-15), 5,2 kb (ratón) y 5,7 kb (rata). Estos resultados indican la estrecha homología de los genes de ratón y rata, y demuestran también que el clon DOR-1 es del original múrido de la estirpe celular NG108-15.

En una transferencia que contiene ADN genómico cortado con EcoRI de muchas especies diferentes, la hibridación del ADNc de DOR-1 en condiciones de rigor moderado mostró dos bandas en cada carril de ratón, rata, ser humano, conejo y diversas otras especies de mamífero. Esto demuestra una estrecha relación entre los genes de receptor opioide en todas estas especies. Además, estos resultados muestran que los genes o ADNc de cada una de estas especies pueden clonarse fácilmente utilizando hibridación a rigor moderado.

Ejemplo 5 Determinación de la secuencia de ADNc

Se analizó ADNc aislado representado por el clon DOR subclonando el inserto del clon de ADNc en un plásmido tal como pBluescript™ (Stratagene, San Diego, CA) y utilizando el método de didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)). La secuencia del ADNc se determinó a partir de ADN monocatenario y cebadores internos específicamente diseñados, utilizando tanto kits de secuenciación cíclica Sequenase como \DeltaTaq (USB). Estos kits, ampliamente utilizados en la técnica, utilizan el método de terminación de cadena didesoxi. La secuencia de ADN y secuencia proteica prevista se compararon después con la secuencia de bancos de datos establecidos tales como GenBank.

La secuenciación del inserto de ADNc en el clon DOR-1 reveló un marco abierto de lectura de 370 aminoácidos (Figura 5). Las comparaciones con secuencias conocidas en GenBank mostró la mayor homología entre DOR-1 y el receptor de somatostatina acoplado a proteína G (57% de identidad de aminoácidos), y una homología ligeramente menor con los receptores que unen angiotensina, los dos factores quimiotácticos IL-8 y péptido N-formilo. La Figura 6 muestra la homología con el receptor 1 de somatostatina humana. La estrecha homología del presente clon de receptor con el receptor de somatostatina es especialmente notable, puesto que los ligandos de somatostatina se ha informado de que se unen a receptores opioides, y que tienen mecanismos moleculares similares a los de los receptores delta.

Otros rasgos de la secuencia aminoacídica del clon DOR-1 deducida de la secuencia de ADNc incluyen tres sitios de glicosilación de consenso en los residuos 18 y 33 (que se prevé que están en el dominio N-terminal extracelular) y el residuo 310 (cercano al extremo C-terminal y que se prevé que es intracelular). Los sitios de consenso de fosfoquinasa C están presentes en los dominios previstos como intracelulares, en los residuos 242, 255, 344 y 352. Se identificaron siete regiones transmembrana putativas basándose en los perfiles de hidrofobicidad, así como en la homología con la rodopsina y otros receptores acoplados a proteína G que se han analizado con respecto a regiones transmembrana utilizando análisis McVector (I.B.I.). El clon DOR-1 aislado según los principios de la presente invención produce un receptor delta con un peso molecular previsto de 40.558 Da antes de modificaciones postraduccionales tales como N-glicosilación.

Ejemplo 6 Aislamiento de clones genómicos de receptor opioide

El aislamiento de clones genómicos se llevó a cabo según técnicas conocidas en la técnica. Para aislar clones genómicos de receptor opioide, se sembraron 300.000 clones genómicos humanos en \gammagem 11 (Promega) y un número similar de clones genómicos de ratón en lambda Fix (Stratagene) en la cepa hospedadora Le392 y se sondearon con el fragmento Pst/Xba I de DOR-1 de 1,1 kb, que contiene principalmente la región de codificación. Las condiciones de hibridación fueron de rigor bastante bajo: 50% de formamida/6 x SSC, durante una noche a 37ºC. Los lavados se realizaron también a bajo rigor: 2 x SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente.

Se aislaron un clon de ratón y un clon genómico humano y se purificaron mediante rondas secuenciales de hibridación y purificación en placa.

El clon H3 se digirió en fragmentos menores con EcoRI y TaqI y después se clonó aleatoriamente en el sitio apropiado de Bluescript para secuenciación. La secuencia nucleotídica parcial para H3 se muestra en la Figura 8.

El clon genómico se cartografió mediante hibridación in situ en cromosomas humanos en metafase por el Dr. Glenn Evans del Instituto Salk. H3 se cartografía en el cromosoma 1P.

La comparación de los datos de secuencia obtenidos como se describe anteriormente con las secuencias publicadas para las contrapartidas de múrido referidas anteriormente en la presente memoria, y con el clon DOR-2 descrito a continuación en la presente memoria, confirmó que H3 codifica el receptor opioide delta humano.

El clon genómico se digirió en fragmentos menores con EcoRI y TaqI, después se clonó aleatoriamente en el sitio apropiado de Bluescript para secuenciación.

Ejemplo 7 Aislamiento de clones de receptor opioide de organismos adicionales

Para aislar el receptor opioide de células de cerebro de mamífero, por ejemplo células de cerebro humano, se examinó una biblioteca de ADNc de tallo cerebral humano cebado aleatoriamente en \lambda Zap (Stratagene) utilizando el ADNc de múrido que codifica el DOR-1 descrito en la presente memoria. Las placas positivas se purificaron y reexaminaron. Los clones positivos individuales se secuenciaron y caracterizaron como anteriormente.

Ejemplo 8 Determinación de las secuencias antigénicas probables

Al evaluar la secuencia aminoacídica del receptor opioide codificado por DOR-1 con el índice antigénico MacVector (I.B.I.) y el índice antigénico según Jameson, B. y H. Wolf, Comput. Applic. In Biosci. 4: 181-186 (1988), se determinó que las siguientes secuencias subrayadas del receptor opioide delta tenían un alto potencial antigénco:

1

La secuencia N-terminal es extracelular, las otras cuatro secuencias se prevé que son intracelulares.

La Figura 9 muestra una comparación de las secuencias aminoacídicas del receptor delta de múrido con los receptores mu y kappa de rata. Hay regiones extensas de homología.

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un receptor opioide delta que hibrida en condiciones de bajo rigor con una sonda constituida por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 5 o su complemento.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que codifica el receptor opioide delta humano o el receptor opioide delta de múrido.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, que codifica el receptor opioide delta de múrido, en la que el receptor opioide delta de múrido comprende la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica de la Figura 5.

4. Una molécula de ADN que comprende un sistema de expresión capaz, cuando se transforma en una célula hospedadora, de producir un receptor opioide en la célula, cuyo sistema de expresión comprende una secuencia nucleotídica que codifica dicho receptor opioide como se define en la reivindicación 1, 2 ó 3, ligado operativamente a secuencias de control heterólogas operables en la citada célula.

5. Una célula hospedadora modificada para comprender el sistema de expresión de la reivindicación 4.

6. Un método para producir una célula que presenta un receptor opioide en su superficie, comprendiendo dicho método cultivar la célula de la reivindicación 5 en condiciones que efectúan la expresión de la secuencia de codificación para producir dicha proteína de receptor en la superficie.

7. Una célula preparada mediante el método de la reivindicación 6.

8. Un método para seleccionar una sustancia candidata en lo que se refiere a su actividad agonista o antagonista opioide, comprendiendo dicho método:

incubar una célula de la reivindicación 7 en presencia y ausencia de la sustancia candidata en condiciones adecuadas para la detección de dicha actividad, y

detectar la presencia, ausencia o valor de dicha actividad.

9. Un método in vitro para modular la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor opioide, comprendiendo dicho método tratar una célula capaz de dicha expresión con un ADN complementario al de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones en las que dicho ARN hibrida con dicha molécula de ácido nucleico.