ES2199837T3

ES2199837T3 - Cromeno(4,3,2-de)isoquinolinas como ligandos potentes de receptores de la dopamina.

Info

Publication number: ES2199837T3
Application number: ES00942943T
Authority: ES
Inventors: David E. Nichols; Russell A. Grubbs; Richard B. Mailman
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Purdue Research Foundation; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Purdue Research Foundation; University of North Carolina System
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2020-06-20
Also published as: CA2373497A1; EP1192161B1; US6916832B2; WO2000078765A2; AU777522B2; DE60002867T2; AU777522C; NZ515613A; MXPA01013229A; WO2000078765A3; US20050080266A1; EP1192161A2; NO20016255D0; US6413977B1; JP2003502428A; DK1192161T3; AU5749200A; ATE240959T1; NO20016255L; DE60002867D1

Abstract

Compuesto de la fórmula y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que R1, R2 y R3 son hidrógeno, C1-C4 alquilo, o C2- C4 alquenilo; R8 es hidrógeno o C1-C4 alquilo; X9 es hidrógeno, haluro o un grupo de la fórmula ¿OR, en el que R es hidrógeno o C1-C4 alquilo y además, cuando X9 es un grupo de la fórmula ¿OR, los grupos R8 y R se pueden coger conjuntamente para formar un grupo de la fórmula ¿CH2-; y R4, R5 y R6 están, independientemente, seleccionados del hidrógeno, C1-C4 alquilo, fenilo, haluro, o un grupo -OR, en el que R es tal como se ha definido anteriormente.

Description

Cromeno [4,3,2-de] isoquinolinas como ligandos potentes de receptores de la dopamina.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a nuevos ligandos para receptores de dopamina. Más particularmente, la presente invención se dirige, a compuestos 1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3,2-de]isoquinolina opcionalmente sustituidos y su uso en formulaciones farmacéuticas para el tratamiento de disfunciones, relacionadas con la dopamina, del sistema nervioso central y periférico.

Antecedentes y características de la invención

La dopamina, un neurotransmisor del sistema nervioso central, ha sido relacionada con numerosos desórdenes neurológicos. Por ejemplo, se ha hecho la hipótesis de que una estimulación excesiva de los subtipos de receptor de dopamina puede relacionarse con la esquizofrenia. Adicionalmente, se reconoce, generalmente, que la actividad dopaminérgica funcional tanto excesiva como insuficiente en el sistema nervioso central y/o periférico, pueden causar hipertensión, narcolepsia, y otros desórdenes del comportamiento, neurológicos, fisiológicos y del movimiento, incluyendo la enfermedad de Parkinson, enfermedad crónica y progresiva caracterizada por la incapacidad para controlar el sistema motor voluntario.

Tradicionalmente, los receptores de dopamina se han clasificado en dos familias (las familias de receptores de dopamina D_{1} y D_{2}) basadas en pruebas farmacológicas y funcionales. Preferentemente, los receptores D_{1} reconocen las feniltetrahidrobenzazepinas y generalmente conducen a la estimulación de la enzima adenilato ciclasa, mientras que los receptores D_{2} reconocen las butirofenonas y benzamidas y a menudo, se acoplan negativamente (o no se acoplan en absoluto) con adenilato ciclasa. Actualmente, se conoce que, por lo menos, existen cinco genes que codifican los subtipos de receptores de dopamina: los subtipos de receptores D_{1}, D_{2}, D_{3}, D_{4} y D_{5}. Sin embargo, la clasificación tradicional sigue siendo útil, comprendiendo la clase de tipo D_{1} los subtipos de receptor D_{1} (D_{1A}) y D_{5} (D_{1B}), mientras que la clase de tipo D_{2} consiste en los subtipos de receptor D_{2}, D_{3} y D_{4}. También puede ocurrir una variación a través de variantes de unión (por ejemplo, las variantes de unión D_{2L} y D_{2S}), y también a través de diferentes alelos (por ejemplo, repeticiones múltiples del gen D_{4}).

Generalmente, los medicamentos del sistema nervioso central que exhiben una afinidad hacia los receptores de dopamina, se clasifican no solamente por su selectividad receptora, sino también por su actividad agonista (activación del receptor) o antagonista (bloqueo del receptor). Mientras que las actividades fisiológicas asociadas a la interacción de dopamina con varios subtipos de receptores no están completamente comprendidas, se conoce que los ligandos que exhiben la selectividad en un subtipo receptor particular producirán más o menos resultados neurofarmacológicos predecibles. La disponibilidad de compuestos antagonistas y agonistas selectivos de receptor de dopamina permite el diseño de experimentos para incrementar el conocimiento de muchos papeles funcionales que representan los receptores D_{1}, y puede conducir a nuevos tratamientos para varios desordenes del sistema nervioso central y periférico. Además, si los agonistas están disponibles con una alta afinidad hacia ambos receptores D_{1} y D_{2}, estos agonistas se podrían utilizar bajo circunstancias en las cuales la aglomeración de ambos receptores D_{1} y D_{2} es beneficiosa.

El enfoque previo de los estudios del receptor de dopamina era en la familia D_{2}, pero el papel crítico que representa el receptor de dopamina D_{1} en la función del sistema nervioso llega a ser recientemente aparente. Ante todo, ese trabajo previo sobre los ligandos selectivos de receptores D_{1} se enfocaba sobre moléculas a partir de una clase química simple, las feniltetrahidrobenzazepinas, tales como el antagonista SCH23390 (1)

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Se ha encontrado que varias feniltetrahidrobenzazepinas son agonistas de receptores D_{1}; sin embargo, los agonistas derivados de esta clase [incluyendo, por ejemplo, SKF38393 (+)-2] son generalmente agonistas parciales. Incluso SKF82958, propuesto por ser un agonista completo, ha mostrado recientemente no tener la eficacia intrínseca completa en las preparaciones con la reserva disminuida del receptor. La diferencia entre los agonistas D_{1} de eficacia completa y parcial es importante para la comunidad de investigación médica porque esto puede influir en las acciones de estos compuestos en los eventos mediados en el sistema nervioso central complejo. Por ejemplo, los dos agonistas completos (dihidrexidina y A-77636) tienen efectos antiparkinsonianos excepcionales sobre un mono modelo tratado con MPTP, mientras que los agonistas parciales son sin actividad significativa. Un dato más reciente sugiere que los agonistas completos y parciales también difieren en sus efectos sobre las funciones neurales complejas. Además, existen eventos mediadores de receptor (por ejemplo, reclutamiento de proteínas G y quinasas receptoras asociadas) que pueden afectar a la actividad agonista. Estos últimos eventos bioquímicos pueden ocurrir independientemente de los cambios en los niveles de mensajero secundario (por ejemplo, cAMP) mediados por un medicamento.

De acuerdo con ello, los investigadores han centrado sus esfuerzos en diseñar ligandos que son agonistas completos (es decir, tienen una eficacia intrínseca completa) para el receptor D_{1}. Un compuesto de este tipo es la dihidrexidina (3), una hexahidrobenzo[a]fenantridina de fórmula:

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La estructura de dihidrexidina (3) es única frente a otros agonistas D_{1} porque el sistema accesorio anular está atado, volviendo la molécula relativamente rígida. Los estudios de modelización molecular de la dihidrexidina (3) han mostrado que el compuesto tiene un número limitado de conformaciones de baja energía, y los anillos aromáticos están sujetos en una disposición relativamente coplanar en todas las conformaciones. La elucidación reciente de la configuración del enantiómero activo de la dihidrexidina (3) era consistente con las predicciones de este modelo.

A pesar de otros agonistas D_{1} de alta afinidad y alta actividad intrínseca tales como 3-sustituido aminometilisocromanos, la dihidrexidina (3) proporcionaba una plantilla semi-rígida para desarrollar un modelo de ligando dopamina. Las características esenciales de este modelo incluyen la presencia de una fracción transoid \beta-fenildopamina, un par libre de electrones orientado ecuatorialmente en el átomo de nitrógeno base, y casi una coplanaridad de un anillo fenilo suspendido con el anillo catecol. El modelo basado en dihidrexidina tiene una fracción transoid \beta-fenildopamina, mientras que las feniltetrahidrobenzazepinas dopaminérgicas tienen una conformación tipo cisoid \beta-fenildopamina. El modelo basado en dihidrexidina ha servido como base para el diseño de agonistas receptores D_{1} adicionales. El diseño y la síntesis de agonistas receptores D_{1} que tienen una alta actividad intrínseca son importantes para la comunidad de investigación médica debido al uso potencial de agonistas completos para el tratamiento de eventos complejos mediados por el sistema nervioso central, y también a las condiciones a las cuales se implican los receptores periféricos de dopamina. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención tienen un uso potencial como agentes para bajar la presión en la sangre y para afectar a la función del pulmón y del riñón.

Una realización de la presente invención es una nueva clase de agonistas receptores de dopamina de la fórmula general:

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y las sales farmacéuticamente aceptables de la misma y formulaciones farmacéuticas de dichos compuestos. Los presentes compuestos son útiles para tratamientos de pacientes que tienen una disfunción, relacionada con la dopamina, del sistema nervioso central (tal como se evidencia por un desorden aparente neurológico, psicológico, fisiológico o del comportamiento) y también de condiciones en las cuales se implican los receptores periféricos de la dopamina (incluyendo tejidos diana tales como sistemas del riñón, del pulmón, endocrino y cardiovasculares).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación gráfica de la afinidad de dinoxilina (círculos), dinapsolina (diamantes) y (+)-SCH23390 (triángulos) para receptores estriatales D_{1}. Los receptores D_{1} de una rata estriatal se etiquetan con [^{3}H]SCH23390 (1), y se añaden los no etiquetados dinoxilina, dinapsolina o (+)-SCH23390, para determinar la unión específica de cada compuesto al receptor D_{1}.

La figura 2 es una representación gráfica de la afinidad de dinoxilina (círculos), dinapsolina (diamantes) y (+)-SCH23390 (triángulos) para receptores D_{1} de primates expresados en las células C-6. Los receptores D_{1} se etiquetan con [^{3}H]SCH23390 (1), y se añaden los no etiquetados dinoxilina, dinapsolina o (+)-SCH23390, para determinar la unión específica de cada compuesto al receptor D_{1}.

La figura 3 es una representación gráfica de la afinidad de dinoxilina (círculos), dinapsolina (diamantes) y clorpromazina (triángulos) para receptores D_{2} estriatales etiquetados como [^{3}H]spiperone. Se añaden los no etiquetados dinoxilina, dinapsolina o clorpromazina para determinar la unión específica de cada compuesto al receptor D_{2}.

La figura 4 es una representación gráfica del número de rotaciones contralaterales en el tiempo (horas) en ratas tratadas en el modelo unilateral de lesión 6-OHDA con dinoxilina (cuadros) o dihidrexidina (círculos).

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un compuesto de fórmula general:

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y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, en el que R_{1}-R_{3} son hidrógeno, C_{1}-C_{4} alquilo o C_{2}-C_{4} alquenilo; R_{8} es hidrógeno, C_{1}-C_{4} alquilo o grupo fenoxi de protección; X_{9} es hidrógeno, haluro incluyendo cloro, fluoro y bromo, o un grupo de la fórmula -OR en el que R es hidrógeno, C_{1}-C_{4} alquilo o grupo fenoxi de protección, y R_{4}, R_{5} y R_{6} son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, C_{1}-C_{4} alquilo, fenilo, haluro, o un grupo -OR en el que R es tal como se ha definido anteriormente, y cuando X_{9} es un grupo de la fórmula -OR, los grupos R_{8} y R se pueden tomar conjuntamente para formar un grupo de la fórmula –CH_{2}-.

El término "C_{2}-C_{4} alquenilo" se refiere a alilo, 2-butenilo, 3-butenilo, y vinilo.

El término "C_{1}-C_{4} alquilo" tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a grupos alquilos de cadena lineal o ramificada que comprenden de uno a cuatro átomos de carbono, incluyendo, pero sin limitación, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo y ciclopropilmetilo.

En una realización, por lo menos uno de R_{4}, R_{5} o R_{6} es hidrógeno. En otra realización, por lo menos dos de R_{4}, R_{5} y R_{6} son hidrógeno.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a aquellas sales formadas utilizando ácidos orgánicos o inorgánicos, en los cuales sus sales son adecuadas para su uso en humanos y animales menores sin toxicidad indeseable, irritación, respuesta alérgica y similares. Se conocen en el estado de la técnica ácidos adecuados para formar sales farmacéuticamente aceptables de compuestos biológicamente activos que tienen la funcionalidad de aminas. Se pueden preparar las sales, de acuerdo con los métodos convencionales, in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos presentes, o separadamente mediante la reacción de los compuestos aislados en forma de base libre con una sal adecuada para formar el ácido.

El término "grupo fenoxi de protección" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a sustituyentes en el oxígeno fenólico que previenen reacciones no deseadas y degradaciones durante la síntesis y que se pueden eliminar más tarde sin efectos en otros grupos funcionales en la molécula. Semejantes grupos de protección y los métodos de su aplicación y eliminación son muy conocidos en el estado de la técnica. Estos grupos incluyen éteres, tales como éteres ciclopropilmetilo, ciclohexilo, alilo y similares; éteres alcoxialquilo tales como éteres metoximetilo o metoxietoximetilo y similares; éteres alquiltioalquilo tales como éteres metiltiometilo; éteres tetrahidropiranilo; éteres arilalquilo tales como éteres bencilo, o-nitrobencilo, p-metoxibencilo, 9-antrilmetilo, 4-picolilo y similares; éteres trialquilsililo tales como éteres trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo y similares; ésteres alquilo y arilo tales como acetatos, propionatos, butiratos, isobutiratos, trimetilacetatos, benzoatos y similares; carbonatos tales como metilo, etilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, bencilo y similares; y carmabatos tales como metilo, isobutilo, fenilo, bencilo, dimetilo y similares.

El término "C_{1}-C_{4} alcoxi" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a grupos alquilo de cadena ramificada o lineal que comprenden de uno a cuatro átomos de carbono unidos a través de un átomo de oxígeno, incluyendo, pero sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi y t-butoxi.

Por otro lado, de acuerdo con otras realizaciones de esta invención, los presentes compuestos se pueden formular en forma convencional de dosis de medicamento para su uso en métodos para el tratamiento de un paciente que sufre una disfunción, relacionada con la dopamina, del sistema nervioso central o periférico. Las dosis efectivas de los presentes compuestos dependen de muchos factores, incluyendo la indicación del tratamiento, la vía de administración, y la condición global del paciente. Para administración oral, por ejemplo, se prevé que las dosis efectivas de los presentes compuestos estén en el rango de unos 0,1 a unos 50 mg/kg, más típicamente de unos 0,5 a 25 mg/kg. Las dosis efectivas parenterales pueden ser de unos 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal. En general, los regímenes de tratamiento utilizando compuestos, de acuerdo con la presente invención, comprenden administración de 1 mg a unos 500 mg de los compuestos de esta invención por día en dosis múltiples o en una dosis simple.

Las dosis en forma líquida para administración oral pueden incluir emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, y jarabes que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en el estado de la técnica tales como agua. Semejantes composiciones también pueden comprender adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes de suspensión y de emulsión, agentes edulcorantes y aromatizantes. Las preparaciones inyectables de los compuestos de la presente invención se pueden formular utilizando productos conocidos en el estado de la técnica mediante la dispersión o la disolución de la dosis efectiva del compuesto en un diluyente parenteralmente aceptable tal como agua, o más preferiblemente solución isotónica de cloruro de sodio. Las formulaciones parenterales se pueden esterilizar utilizando técnicas de microfiltración conocidas en el estado de la técnica.

Los compuestos de esta invención también se pueden formular como dosis en forma sólida para administración oral tal como cápsulas, tabletas, polvos, píldoras y similares. Típicamente, el compuesto activo se mezcla con un diluyente inerte o con un transportador tal como azúcar o almidón y otros excipientes apropiados para la forma de dosis. Así, las formulaciones de tabletas incluirán lubricantes aceptables, aglutinantes y/o desintegrantes. Opcionalmente, las composiciones de polvo que comprenden un compuesto activo de esta invención y, por ejemplo, un transportador de almidón o azúcar se pueden rellenar en las cápsulas de gelatina para una administración oral. Otras formas de dosis de los compuestos de la presente invención se pueden formular utilizando técnicas reconocidas en el estado de la técnica en formas adaptadas para el modo específico de la administración.

Un compuesto proporcionado, de acuerdo con la presente invención, es hidrobromuro de (\pm)-8,9-dihidroxi-1,2,3, 11b-tetrahidrocromeno[4,3,2-de]isoquinolina denominado en adelante "dinoxilina". Se sintetiza la dinoxilina a partir de 2,3-dimetoxifenol, tal como se describe en el esquema 1. El grupo fenólico está protegido como derivado de metoximetilo ("MOM") seguido por un tratamiento con butil litio, luego se ilustra con el borolano sustituido, dando lugar al derivado de borolano 2.

Tal como se muestra en el esquema 1, este derivado de borolano se emplea luego en una reacción Pd-catalítica de acoplamiento transversal tipo Suzuki con 5-nitro-4-bromoisoquinolina. A continuación, se trata el producto de acoplamiento resultante 4 con ácido toluensulfónico en metanol para eliminar el grupo de protección MOM del fenol. Un tratamiento simple de este nitrofenol 5 con carbonato potásico en DMF a 80ºC conlleva al cierre del anillo con pérdida del grupo nitro, dando lugar al núcleo básico cromenoisoquinolina tetracíclico 6. Una hidrogenación catalítica simple causa la reducción del anillo que contiene nitrógeno dando lugar al producto 7. El uso de tribromuro de boro para romper los enlaces metil-éter da lugar al compuesto madre 8.

Es aparente que por sustitución apropiada en el anillo de isoquinolina, se puede obtener una variedad completa de compuestos sustituidos. Una sustitución en el átomo de nitrógeno en ambos productos 6 y 7, seguida por una reducción, dará lugar a una serie de compuestos sustituidos en el átomo de nitrógeno por grupos alquilo reducidos. Asimismo, el uso de sustituyentes alquilo en las posiciones 1, 3, 6, 7 u 8 de la nitroisoquinolina 3 daría lugar a una variedad de compuestos sustituidos en el anillo. Además, se puede también sustituir directamente la posición 3 en el producto 6 con una variedad de grupos alquilo. De modo semejante, el reemplazo del grupo 4-metoxi del producto 2, en el esquema 1, por fluoruro, cloruro o grupos alquilo, da lugar a compuestos en cuestión con variaciones en X_{9}. Cuando los grupos están presentes en el núcleo y no son estables a las condiciones de hidrogenación catalítica utilizada para convertir 6 en 7, se ha encontrado que la reducción se puede llevar a cabo utilizando cianoborohidruro de sodio a un pH ligeramente ácido. Adicionalmente, la formación de sales de n-alquilo cuaternario de los derivados del producto 6 da lugar a compuestos que también se reducen fácilmente con borohidruro de sodio, dando lugar a derivados de 7.

Esquema 1 Esquema para la síntesis de hidrobromuro de 8,9 dihidroxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3,2,de]isoquinolina

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Se han comparado las representaciones espaciales de las conformaciones de baja energía de (+)-trans-10,11-dihidroxi-5,6,6a,7,8,12b-hexahidrobenzo[a]fenantridina [(+)dihidrexidina] y el enantiómero de dinoxilina 11bR que es homoquiral a (+)-dihidrexidina y a su centro quiral 12bS. Dos mayores caracterizaciones estructurales son evidentes. Primero, se ha eliminado el volumen estérico proporcionado por el puente etano C(7)-C(8) en la dihidrexidina (3). Segundo, se ha cambiado ligeramente el ángulo del anillo fenilo suspendido respecto al plano del anillo catecol. Esto es más evidente, en vistas frontales, cuando el hidrógeno aromático H(1) en dihidrexidina (3) se proyecta por encima del anillo catecol. Sin embargo, se utiliza en dinoxilina esta posición para unir el anillo fenilo suspendido a través del átomo de oxígeno, al anillo catecol. Este hecho fuerza el anillo fenilo suspendido a torcerse en la dirección del sentido del reloj, relativo a la dihidrexidina (3), cuando se ve desde arriba. Los grupos amino están en posición similar, dado el grado de flexibilidad conformacional de los anillos heterocíclicos. Además, ambas moléculas pueden presentar un vector N-H en una orientación ecuatorial, una característica del fármaco que se cree importante para los agonistas de receptor D_{1}. Coherente con aquellas observaciones, las propiedades farmacéuticas de estas dos moléculas son similares.

Se han llevado a cabo experimentos para determinar la unión de dinoxilina en los receptores D_{1}. Se ha encontrado que la dinoxilina tiene una afinidad similar (K_{0,5} < 5nM) a la de dinapsolina para receptores D_{1} en ratas estriatales. Además, los experimentos de competición utilizando el no etiquetado SCH23390 (1) como competidor, han demostrado que la dinoxilina compite con una alta afinidad, con una curva superficial de competición (n_{H} = aproximadamente 0,7) coherente con las propiedades agonistas (Ver figuras 1 y 2). Las propiedades agonistas de la dinoxilina en los receptores D_{1} se confirman in vitro midiendo la habilidad de la dinoxilina en incrementar la producción cAMP en ratas estriatales y células C-6-mD_{1}. En ambas ratas estriatales y células C-6-mD_{1}, la dinoxilina tiene una actividad agonista completa con un EC_{50} de menos de 30nM en la síntesis de estimulación de cAMP con intermedio de receptores D_{1}.

Por consiguiente, los datos famacológicos confirman que la dinoxilina tiene una alta afinidad para los receptores de dopamina D_{1} etiquetados con [^{3}H]SCH23390 que es ligeramente más grande que la de (+)-trans-10,11-dihidroxi-5,6,6a,7,8,12b-hexahidrobenzo[a]fenantridina (dihidrexidina 3). Por otra pla técnica, la dinoxilina, en ambas membranas de la rata estriatal y en receptores D_{1A} de primates expresados en clones, es un agonista completo relativo a la dopamina, similar a la dihidrexidina (3) pero diferente al agonista parcial (+)-SKF 38393 (ver figuras 2 y 3: (+)-SKF 38393 = (+)-2; (\pm)-trans-10,11-dihidroxi-5,6,6a,7,8,12b-hexahidrobenzo[a]fenantridina = (\pm)-3, y (\pm)-8,9-dihidroxi-2,3,7, 11b-tetrahidro-1H-nafto[1,2,3-de]isoquinolina = 4; dinapsolina).

Basado en el modelo subyacente del generador de fármacos D_{1}, se anticipa que ambas afinidad y actividad intrínseca de la dinoxilina racémica (y sus análogos sustituidos) residen en solamente uno de su enantiómeros- la configuración absoluta 11bR (y sus análogos homoquirales). Se prevé que la resolución de una mezcla racémica utilizando las técnicas de separación reconocidas en el estado de la técnica, da lugar a un isómero dinoxilano con una afinidad D_{1} aproximadamente doble que la exhibida por la mezcla racémica.

Se determina que la dihidrexidina es aproximadamente 10 veces selectiva en D_{1}:D_{2}. Además, mientras que se espera que la dihidrexidina tenga una actividad agonista de dopamina, también tiene una propiedad inusual nombrada en la presente invención como "selectividad funcional". Específicamente, en ratas (in vivo o in vitro), la dihidrexidina actúa como un agonista con los receptores similares a D_{2} localizados post-sinápticamente, pero como un antagonista en los receptores similares a D_{2} localizados pre-sinápticamnete. Es posible obtener dicho efecto debido a las diferencias en el ligando-receptor-proteína G compleja, localizados post-sinápticamente frente a pre-sinápticamente, tal como se determina mediante las proteínas G específicas presentes en un medio celular dado. Tal como se muestra en la figura 1, la dinoxilina tiene una afinidad a los receptores D_{2} más grande que la de dihidrexidina, proporcionando el primer agonista completo que tiene una afinidad muy elevada para ambos receptores D_{1} y D_{2} en un cerebro mamífero. Además, la dinoxilina difiere de la dihidrexidina en sus propiedades de "selectividad funcional".

Se ha mostrado que estas propiedades D_{2} de dihidrexidina residen en el mismo enantiómero (es decir, 6aR, 12bS) que es el agonista completo con alta afinidad en el receptor D_{1}. En base a esto, se anticipa que ambas propiedades D_{1} y D_{2} de la dinoxilina también residen en el enantiómero homoquiral. Los isómeros ópticos de la dinoxilina, y sus análogos apropiados, constituyen herramientas significantes para estudiar los fenómenos de la "selectividad funcional".

Previamente, se han descrito los efectos antiparkinsonianos de la dihidrexidina en el modelo MPTP de la enfermedad de Parkinson, y se ha anticipado que la dinoxilina mostrará efectos similares. Tal como se muestra en la figura 4, se ha ensayado la dinoxilina en ratas unilaterales modelo 6-OHDA-lesión, un paradigma que muestra in vivo la actividad agonista de la dopamina, y se ha propuesto por algunos predecir la eficacia de los medicamentos antiparkinsonianos. Como se puede ver, la dinoxilina causa una rotación significativa que persiste durante cinco horas aproximadamente después de una dosis subcutánea simple. Esto es más que el doble de duración de acción de una dosis similar de dihidrexidina administrada por la misma vía. De acuerdo con estos datos, también se han mejorado estudios preliminares en monos tipo tití que tienen una denervación de dopamina inducida por MPTP moderadamente severa. Se ha encontrado que la dinoxilina tiene efectos antiparkinsonianos significantes, causando un incremento en la locomoción y lucidez, y una reducción en los signos de Parkinson. De acuerdo con ello, la dinoxilina y sus derivados tienen una potencial utilidad clínica en las enfermedades de Parkinson y en otras condiciones en las cuales la perturbación de los receptores de dopamina puede ser terapéutica. Además, se ha descrito que la modificación apropiada de la dihidrexidina producirá análogos que pueden ser objetivo a las subpoblaciones específicas de la familia receptora de dopamina. Mientras que estrategias similares con dinoxilina deben resultar en compuestos con selectividad de nuevos subtipos de receptor y/o perfiles funcionales, el efecto de estas sustituciones no es el mismo que en la cadena principal de la dihidrexidina.

En pocas ocasiones, se utiliza la dopamina en si misma como un medicamento porque, aunque se activa en todos los receptores de dopamina, se debe administrar por vía intravenosa, tiene una vida media farmacocinética muy corta, y también puede activar otros receptores monoaminas. Esta serie difiere de los anteriores análogos de dopaminas rígidas en varias vías importantes. Primero, es la primera serie de agonistas D_{1} completas con alta afinidad que también tiene igualmente, por lo menos, una alta afinidad para receptores D_{2}. Por consiguiente, mientras que la dihidrexidina es 10 veces selectiva en D_{1}:D_{2}, y la dinapsolina es 5 veces selectiva en D_{1}:D_{2}, actualmente la dinoxilina tiene igualmente una alta afinidad para ambos receptores. En las dos series anteriores, era posible incrementar la afinidad de D_{2}, pero solamente a expensas de la afinidad de D_{1}. Esta serie proporciona la habilidad de tener medicamentos con alta afinidad para ambas poblaciones de receptores. Los medicamentos con alta afinidad simultáneamente para ambos D_{1} y D_{2}, ofrecen ventajas clínicas específicas respecto a agentes con alta afinidad para solamente una de las principales familias. La novedad de esta serie es evidente cuando se examina la interacción con las isoformas del receptor específico de dopamina. Una diferencia importante entre esta serie y los medicamentos anteriores, tales como la dihidrexidina y la dinapsolina, es que estos agentes esencialmente no tienen afinidad para la isoforma de receptor D_{4}. Inversamente, la dinoxilina tiene un K_{0,5} de menos de 45 nM en el receptor D_{4} humano clonado, tal como se compara a >1.000 para ambas dinapsolina y dihidrexidina o sus derivados. Aunque los antagonistas D_{4} han mostrado una eficacia deficiente en el tratamiento de la esquizofrenia, existe un gran potencial para el uso de agonistas D_{4} de alta eficacia para enfermedades psiquiátricas y neurológicas seleccionadas.

Otra diferencia mayor con esta serie es el efecto de los sustituyentes en la actividad receptora. Basado en datos disponibles de la dihidrexidina, se debe predecir que las adiciones de N-propilo o N-alilo incrementarían notablemente la afinidad D_{2} de los ligandos madre. En efecto, estas N-sustituyentes disminuyen significativamente la afinidad D_{2} del compuesto madre. Esta diferencia dramática sugiere que la dinoxilina está unida al receptor D_{2} en un modo inesperado, y debería también tener una única utilidad terapéutica.

Referente a los siguientes procedimientos experimentales descritos, los puntos de fusión se determinan con el equipo de punto de fusión Thomas-Hoover y no están corregidos. Los espectros ^{1}H NMR se registran con un instrumento NMR Varian VXR 500S (500 MHZ) y los desplazamientos químicos se describen en valores (ppm) relativos a TMS. Los espectros IR se registran mediante pastillas de KBr o una película líquida utilizando un espectrómetro de serie FTIR de marca Perkin Elmer 1600. Los espectros de masa de ionización química (CIMS) se registran en un espectrómetro cuádruple de masas de marca Finnigan 4000. Los espectros CI de alta resolución se registran utilizando un espectrómetro Kratos MS50. Los datos de los análisis elementales se obtienen del laboratorio microanalítico de la Universidad de Purdue, West Lafayette, IN.

Inmediatamente antes de uso, se destila THF a partir benzofenona - sodio bajo atmósfera de nitrógeno; antes de uso, se destila 1,2-dicloroetano a partir pentóxido fosfórico.

Ejemplo 1A Síntesis de hidrobromuro de 8,9-dihidroxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3, 2-de]isoquinolina (Dinoxilina) 1,2-dimetoxi-3-metoximetoxibenceno (1)

Se prepara una solución turbia de hidruro sódico por adición de 1000 ml de THF seco a 7,06 g (0,18 mol) de hidruro sódico (60% de dispersión en aceite mineral) bajo atmósfera de argón a 0ºC. A la solución turbia, se añade mediante una jeringa 2,3-dimetoxifenol (23,64 g; 0,153 mol). Se lleva la solución resultante a temperatura ambiente y se agita durante dos horas. Se enfría la solución de color negro a 0ºC y se le añaden lentamente mediante una jeringa 13,2 ml de clorometilmetiléter (14 g; 0,173 mol). La solución se lleva a temperatura ambiente y se agita durante 8 horas adicionales. Se concentra la mezcla amarilla a un aceite que se disuelve en 1000 ml de éter dietílico. La solución resultante se lava con agua (500 ml), 2N de NaOH (3x400 ml), se seca (MgSO_{4}), se filtra y se concentra. Después de una destilación de Kugelrohr (90-100ºC, 0,3 atm), se obtienen 24,6 g de un aceite claro (84%): ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 6,97 (t, 1H, J = 8,7 Hz); 6,79 (dd, 1H, J = 7,2; 1,8 Hz); 6,62 (dd, 1H, J = 6,9; 1,2 Hz); 5,21 (s, 2H); 3,87 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 3,51 (s, 3H). CIMS m/z: 199 (M+H^{+}, 50%); 167 (M+H^{+}-CH_{3}OH, 100%). Anal. Calculados para C_{10}H_{14}O_{4}: C, 60,59; H, 7,12. Encontrados: C, 60,93; H, 7,16.

2-(3,4-Dimetoxi-2-metoximetoxifenil)-4,4,5,5-tetrametil[1,3,2]dioxaborolano (2)

Se disuelve el fenol MOM protegido 1 (10 g; 0,0505 mol) en 1000 ml de éter dietílico seco y se enfría a –78ºC. Se añade mediante una jeringa, una solución de n-butil litio (22,2 ml de 2,5 M). Se elimina el baño de enfriamiento y se lleva la solución a temperatura ambiente. Después de agitar la solución a temperatura ambiente durante dos horas, se observa un precipitado de color amarillo. Se enfría la mezcla a -78ºC y se le añaden mediante una jeringa 15 ml de 2-isopropoxi-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (0,080 mol). Dos horas más tarde, se elimina el baño de enfriamiento. Se continúa la agitación durante cuatro horas a temperatura ambiente. A continuación, se vierte la mezcla en 300 ml de agua y se extrae varias veces con éter dietílico (3x300 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra a un aceite de color amarillo (12,37 g; 76%) que se utiliza sin purificación adicional: ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}):7,46 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 6,69 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 5,15 (s, 2H); 3,87 (s, 3H); 3,83 (s, 3H); 1,327 (s, 12H).

4-Bromo-5-nitroisoquinolina (3)

Se añade nitrato potásico (5,34 g; 0,052 mol) a 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y se disuelve lentamente mediante un calentamiento cuidadoso. Se añade la solución resultante gota a gota a una solución de 4-bromoisoquinolina (10 g; 0,048 mol) disuelta en 40 ml del mismo ácido a 0ºC. Después de quitar el baño de enfriamiento, se agita la solución durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se vierte la mezcla de reacción en hielo triturado (400 g) y se vuelve básica mediante la adición de hidróxido de amonio. El precipitado resultante de color amarillo se recoge mediante filtración y se extrae el filtrado con éter dietílico (3x500 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra dando lugar a un sólido de color amarillo que se combina con el precipitado inicial. Una recristalización de metanol da lugar a 12,1 g (89%) de cristales ligeramente amarillos: mp 172-174ºC; ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 9,27 (s, 1H); 8,87 (s, 1H); 8,21 (dd, 1H, J = 6,6; 1,2 Hz); 7,96 (dd, 1H, J = 6,6; 1,2 Hz); 7,73 (t, 1H, J = 7,5 Hz). CIMS m/z: 253 (M+H^{+}, 100%); 255 (M+H^{+}+2, 100%). Anal. Calculados para C_{9}H_{5}BrN_{2}O_{2}: C, 42,72; H, 1,99; N, 11,07. Encontrados: C, 42,59; H, 1,76; N, 10,87.

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4-(3,4-Dimetoxi-2-metoximetoxifenil)-5 nitroisoquinolina (4)

Se suspenden en 100 ml de dimetoxietano (DME) isoquinolina 3 (3,36 g; 0,0143 mol), pinacol boronate éster 2 (5,562 g; 0,0172 mol) y 1,0 g (6 mol%) de tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0). Hidróxido de potasio (3,6 g; 0,064 mol) y 0,46 g (10 mol%) de bromuro de tetrabutilamonio se disuelven en 14,5 ml de agua y se añaden a la mezcla de DME. Se desgasifica la suspensión resultante durante 30 minutos con argón y a continuación se calienta a reflujo durante cuatro horas. La solución resultante de color negro se lleva a enfriar a temperatura ambiente, se vierte en 500 ml de agua, se extrae con éter dietílico (3x500 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra. A continuación se purifica el producto mediante cromatografía de columna (gel de sílice, 50% acetato de etilo: hexano) dando lugar a 5,29 g de cristales amarillos (80,1%): mp 138-140ºC; ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 9,33 (s, 1H); 8,61 (s, 1H); 8,24 (dd, 1H, J = 7,2; 0,9 Hz); 8,0 (dd, 1H, J = 6,3; 1,2 Hz); 7,67 (t, 1H, J = 7,8 Hz); 7,03 (d, 1H, J = 9,6 Hz); 6,81 (d, 1H, J = 8,1 Hz); 4,86 (d, 1H, J = 6 Hz); 4,70 (d, 1H, J = 5,4 Hz); 3,92 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 2,613 (s, 3H). CIMS m/z: 371 (M+H^{+}, 100%). Anal. Calculados para C_{19}H_{18}N_{2}O_{6}: C, 61,62; H, 4,90; N, 7,56. Encontrados: C, 61,66; H, 4,90; N, 7,56.

2,3-Dimetoxi-6(5-nitroisoquinolin-4-il)fenol (5)

Después de disolver isoquinolina 4 (5,285 g; 0,014 mol) en 200 ml de metanol mediante un calentamiento suave, se le añade en varias porciones ácido p-toluensulfónico monohidratado (8,15 g; 0,043 mol). Se continúa la agitación durante cuatro horas a temperatura ambiente. Después de la finalización de la reacción, ésta se vuelve básica mediante la adición de bicarbonato sódico saturado. A continuación, se extrae el producto con diclorometano (3x250 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra. El sólido amarillo resultante (4,65 g; 98%) se utiliza directamente en la siguiente reacción. Una muestra analítica se recristaliza a partir de metanol: mp 170-174ºC; ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 9,33 (s, 1H); 8,62 (s, 1H); 8,24 (dd, 1H, J = 7,2; 0,9 Hz); 7,99 (dd, 1H, J = 6,3; 1,2 Hz); 7,67 (t, 1H, J = 7,8 Hz); 6,96 (d, 1H, J = 8,7 Hz); 6,59 (d, 1H, J = 8,7 Hz); 5,88 (bs, 1H); 3,94 (s, 3H); 3,92 (s, 3H). CIMS m/z: 327 (M+H^{+}, 100%). Anal. Calculados para C_{17}H_{14}N_{2}O_{5}: C, 62,57; H, 4,32; N, 8,58. Encontrados: C, 62,18; H, 4,38; N, 8,35.

8,9-Dimetoxicromeno[4,3,2-de]isoquinolina (6)

Se disuelve fenol 5 (4,65 g; 0,014 mol) en 100 ml de N,N-dimetilformamida seca. Se desgasifica la solución con argón durante treinta minutos. Se añade en una sola porción carbonato potásico (5,80 g; 0,042 mol) a la solución de color amarillo. Después de calentar a 80ºC durante una hora, la mezcla cambia de color a marrón y no queda más material de partida. A continuación se enfría la solución a temperatura ambiente, y se le añaden 200 ml de agua. Se extrae la capa acuosa con diclorometano (3x500 ml), este extracto orgánico se lava con agua (3x500 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra. Se obtiene un polvo de color blanco (3,65 g, 92%) que se utiliza en la siguiente reacción sin purificación adicional. Una muestra analítica se recristaliza a partir de acetato etilo: hexano: mp 195-196ºC; ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 9,02 (s, 1H); 8,82 (s, 1H); 7,87 (d, 1H, J = 8,7 Hz); 7,62 (m, 3H); 7,32 (dd, 1H, J = 6,0; 1,5 Hz); 6,95 (d, J = 9,6 Hz); 3,88 (s, 3H); 3,82 (s, 3H). CIMS m/z: 280 (M+H^{+}, 100%).

8,9-Dimetoxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3,2-de]isoquinolina (7)

Se añade óxido de platino (IV) (200 mg) a una solución que contiene 50 ml de ácido acético e isoquinolina 6 (1 g; 3,5 mmol). Después de añadir 2,8 ml de HCl concentrado, se agita la mezcla en un hidrogenador Parr a 60 psi durante 24 horas. La solución de color verde se filtra mediante Celite para eliminar el catalizador y la mayoría del ácido acético se elimina en el rotavapor. Se neutraliza el ácido restante utilizando una solución saturada de bicarbonato sódico, se extrae con éter dietílico (3x250 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}) y se concentra. El aceite resultante (0,997 g; 99%) se utiliza sin purificación adicional: ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 7,10 (t, 1H, J = 7,5 Hz); 7,00 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 6,78 (m, 2H); 6,60 (d, 1H, J = 9 Hz); 4,10 (s, 2H); 3,84 (m, 8H); 2,93 (t, 1H, J = 12,9 Hz).

Hidrobromuro de 8,9-dihidroxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3,2-de] isoquinolina (8)

Se disuelve el crudo 7 (0,834g; 3,0 mmol) en 50 ml de diclorometano anhidro. Se enfría la solución a –78ºC y se le añaden lentamente 15,0 ml de solución de tribromuro de boro (1,0 M en diclorometano). Se agita la mezcla toda la noche, mientras se calienta la reacción lentamente a temperatura ambiente. Se reenfría la solución a –78ºC y se añaden lentamente 50 ml de metanol a la reacción fría. A continuación se concentra la solución a sequedad. Se añade metanol y se concentra la solución. Este proceso se repite tres veces. El sólido resultante de color marrón se trata con carbón activo y se recristaliza con etanol: mp 298-302ºC dec; ^{1}H NMR: (300 MHz, D_{2}O): 7,32 (t, 1H, J = 6,6 Hz); 7,13 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 7,04 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 4,37 (m, 2H); 4,20 (t, 3H, J = 10 Hz). Anal. Calculados para C_{15}H_{14}BrNO_{3}\cdotH_{2}O: C, 50,87; H, 4,55; N, 3,82. Encontrados: C, 51,18; H, 4,31; N, 3,95.

N-Allil-8,9-dimetoxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3, 2-de]isoquinolina (10)

Se disuelve tetrahidroisoquinolina 7 (1,273g; 4,5 mmol) en 150 ml de acetona. Se añaden carbonato potásico (0,613 g; 4,5 mmol) y 0,4 ml (4,6 mmol) de bromuro de alilo. Se agita la reacción a temperatura ambiente durante cuatro horas. A continuación se elimina el sólido por filtración y se lava el sólido varias veces con éter. Se concentra el filtrado y se purifica mediante cromatografía flash (gel de sílice, 50% acetato etilo: hexano) dando lugar a 1,033 g (71%) de un aceite de color amarillo que se utiliza sin purificación adicional: ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 7,15 (t, 1H, J = 9 Hz); 7,04 (d, 1H, J = 9 Hz); 6,83 (m, 2H); 6,65 (d, 1H, J = 6 Hz); 5,98 (m, 1H); 5,27 (m, 2H); 4,10 (m, 3H), 3,95 (s, 3H); 3,86 (s, 3H), 3,46 (d, 1H, J = 15 Hz); 3,30 (d, 2H, J = 6 Hz); 2,56 (t, 1H, J = 12 Hz).

N-Allil-8,9-dihidroxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno[4,3, 2-de]isoquinolina (11)

Se disuelve N-alilamina 10 (0,625g; 1,93 mmol) en 50 ml de diclorometano. Se enfría la solución a -78ºC y se añade lentamente 10,0 ml de BBr_{3} (1,0 M en diclorometano). Se agita la solución toda la noche, mientras que la solución se calienta lentamente a temperatura ambiente. Después de reenfriar la solución a –78ºC, se añaden lentamente 50 ml de metanol a la reacción fría. A continuación se concentra la reacción a sequedad. Se añade metanol y se concentra la solución. Este proceso se repite tres veces. Una recristalización del sólido de color marrón con etanol da lugar a 0,68 g (61%) de un sólido blanco: mp 251-253ºC dec; ^{1}H NMR: (300 MHz, D_{2}O): 10,55 (s, 1H); 10,16 (s, 1H); 8,61 (t, 1H, J = 9 Hz); 8,42 (d, 1H, J = 9 Hz); 8,31 (d, 1H, J = 9 Hz); 7,87 (d, 1H, J = 9 Hz); 7,82 (d, 1H, J = 9 Hz); 7,36 (q, 1H, J = 9 Hz); 6,89 (m, 2H); 6,85 (d, 1H, J = 15 Hz); 5,58 (m, 3H); 5,28 (m, 2H); 3,76 (d, 1H, J = 3 Hz). HRCIMS m/z: Calculado: 295,1208; Encontrado: 295,1214.

N-Propil-8,9-dimetoxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno (4,3,2-de)isoquinolina (12)

Se disuelve N-alilamina 10 (1,033 g; 3,2 mmol) en 50 ml de etanol. A continuación se añade paladio sobre carbón (10% seco, 0,103 g). Se agita la mezcla en un hidrogenador Parr bajo 60 psi de H_{2} durante 3 horas. Después de que TLC muestre que no hay más material de partida, se filtra la mezcla mediante Celite y se concentra dando lugar a 0,95 g (91%) de un aceite que se utiliza sin purificación adicional: ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 7,15 (t, 1H, J = 7,2 Hz); 7,04 (d, 1H, J = 8,1 Hz); 6,84 (t, 2H, J = 7,5 Hz); 6,65 (d, 1H, J = 8,4 Hz); 4,07 (m, 2H); 3,95 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 3,71 (q, 1H, J = 5,1 Hz); 3,42 (d, 2H, J = 15,6 Hz); 2,62 (m, 2H); 2,471 (t, J = 10,5 Hz); 1,69 (h, 2H, J = 7,2 Hz); 0,98 (t, 3H, J = 7,5 Hz). CIMS m/z: 326 (M+H^{+}, 100%).

N-Propil-8,9-dihidroxi-1,2,3,11b-tetrahidrocromeno [4,3,2-de]isoquinolina (13)

Se disuelve N-propilamina 12 (0,90 g; 2,8 mmol) en 200 ml de diclorometano y se enfría a –78ºC. En un frasco de fondo redondo separado de 250 ml, se enfrían 125 ml de diclorometano seco a –78ºC, y se añade con una jeringa 1,4 ml (14,8 mmol) de BBr_{3}. Se transfiere la solución de BBr_{3} utilizando una cánula al frasco de fondo redondo que contiene el material de partida. Se agita la solución toda la noche, mientras se calienta la reacción lentamente a temperatura ambiente. Después de enfriar la solución a –78ºC, se añaden lentamente 50 ml de metanol a la reacción fría. Luego se concentra la reacción a sequedad. Se añade metanol y se concentra la solución. Este proceso se repite tres veces. Se suspende el sólido resultante en alcohol isopropílico caliente. Un enfriamiento lento a temperatura ambiente resulta en un precipitado fino de color amarillo. Se recoge el sólido por filtración (0,660 g; 63%): mp 259-264ºC dec; ^{1}H NMR: (300 MHz, CDCl_{3}): 7,16 (t, 1H, J = 9 Hz); 6,97 (d, 1H, J = 12 Hz); 6,83 (d, 1H, J = 9 Hz); 6,55 (d, 1H, J = 9 Hz); 6,46 (d, 1H, J = 9 Hz); 4,45 (d, 1H, J = 15 Hz); 4,10 (m, 3H); 3,17 (q, 2H, J = 6 Hz); 3,04 (t, 1H, J = 9 Hz); 1,73 (q, 2H, J = 9 Hz); 0,90 (t, 3H, J = 6 Hz). Anal. Calculados para C_{18}H_{20}BrNO_{3}: C, 57,16; H, 5,33; N, 3,70. Encontrados: C, 56,78; H, 5,26; N, 3,65.

Farmacología de la dinoxilina Métodos Estudios de radiorreceptores en el tejido del cerebro

Se homogeniza una rata estriata congelada mediante siete golpes manuales en un homogenizador Wheaton Teflón-glass en 8 ml de hielo frío tampón 50 mM HEPES con 4,0 mM de MgCl_{2}, (pH 7,4). Se centrifuga el tejido a 27.000 x g durante 10 min, se descartan los sobrenadantes, se homogeniza el granulado (5 golpes), se resuspende en un hielo frío tampón y se centrifuga otra vez. Se suspende el granulado final a una concentración de 2,0 mg de peso neto/ml aproximadamente. La cantidad del tejido añadida a cada tubo de ensayo es de 1,0 mg, en un volumen de ensayo final de 1,0 ml. Se etiquetan los receptores D_{1} con [^{3}H]SCH23390 (0,30 nM). Se etiquetan los receptores D_{2} con [^{3}H]spiperone (0,07 nM); se añade la ketanserina no etiquetada (50 nM) para enmascarar el aglutinante a los sitos 5HT_{2}. Se define la aglutinación total como el enlace radioligando en ausencia de cualquier medicamento competente. Se estima un aglutinante no específico mediante la adición del no etiquetado SCH23390 (1 \muM) o del no etiquetado clorpromazina (1M) para ensayos de aglutinantes de receptores D_{1} y D_{2} respectivamente. Se realizan determinaciones triplicadas para cada concentración de medicamento en cada ensayo. Se incuban los tubos de ensayo a 37ºC durante 15 minutos. Se termina la aglutinación por filtración con tampón enfriado con hielo en un recolector Skatron 12 well cell (Skatron, Inc., Sterling, VA) utilizando esterillas de filtros de fibra de vidrio (Skatron nº. 7034). Se llevan los filtros a secado y se añaden 2,0 ml de fluido de centelleo Optiphase HI-SAF II. Después de agitar durante 30 minutos, se determina la radioactividad en un contador de líquido de centelleo LKB Wallac 1219 RackBeta (Wallac, Gaithersburg, MD). Se estiman los niveles de proteínas en el tejido utilizando el reactivo de proteína de ensayo BCA.

Estudios funcionales en el tejido del cerebro

Se homogeniza el tejido estriatal congelado (aproximadamente 40 mg) en 4 ml de Tampón (5 mM Hepes, 2 mM EGTA, pH 7,5) utilizando diez golpes en un homogenizador Wheaton Teflon-glass. Se añaden 4 ml de 50mM de Hepes con 2 mM de EGTA tampón (pH 7,5), y se homogeniza el tejido mediante 3 golpes adicionales. Se añaden a la reacción preparada 20 \mul alícuota de este tejido homogenizado. La mezcla de reacción consiste en 100 mM de Hepes (pH 7,4), 100 mM de NaCl, 4 mM de MgCl_{2}, 2mM de EDTA, 500 \muM de metilxantina de isobutilo (IBMX), 0,01% de ácido ascórbico, 10 \muM de pargilina, 2mM de ATP, 5 \muM de GTP, 20 mM de fosfocreatina, 5 unidades de creatina fosfokinasa (CPK), y concentraciones seleccionadas de DA. El volumen de la reacción final es de 100 \mul. Se determina la actividad basal de cAMP por incubación del tejido en la mezcla de la reacción sin añadir medicamento. Se ensayan los tubos por duplicado. Después de 15 minutos de incubación a 30ºC, se para la reacción con la adición de 500 \mul de HCl 0,1N. Se someten los tubos a acción de turbulencia, y luego se hacen girar en una microcentrífuga BHG Hermle Z 230 M durante 5 minutos a 15.000 x g para eliminar las partículas grandes.

Se determina la concentración de cAMP en cada muestra con un RIA de cAMP acetilado, modificado por aquel previamente descrito (Harper y Broker, 1975). Se mejora la iodinación de cAMP utilizando un método descrito previamente (Patel y Linden, 1988). El tampón de ensayo es 50 mM de Tampón acetato sódico con 0,1% de azuro sódico (pH 4,75). Se preparan las curvas estándares de cAMP en tampón a concentraciones de 2 a 500 fmoles/tubo de ensayo. Para mejorar la sensibilidad del ensayo, todas las muestras y los estándares se acetilan con 10 \mul de solución de trietilamina: acético anhidro 2:1. Se ensayan las muestras por duplicado. Cada tubo de ensayo contiene 100 \mul de muestra diluida, 100 \mul de anticuerpo primario (de oveja, anti-cAMP, dilución 1:100.000 con 1% de BSA en tampón) y 100 \mul de [^{125}I]-cAMP (50.000 dpm/100 \mul de tampón); el volumen total de ensayo es de 300 \mul. Se someten los tubos a acción de turbulencia y se almacenan a 4ºC toda la noche (aproximadamente 18 h). A continuación, se separa la radioactividad del enlace anticuerpo por adición de 25 \muL de conejo BioMag, anti-cabra IgG (Advanced Magnetics, Cambridge MA), seguido por un vórtice y luego una incubación adicional a 4ºC durante una hora. A estas muestras, se les añade 1 ml de polietilenglicol 12%/50 mM de acetato sódico tampón (pH 6,75) y se centrifugan todos los tubos a 1700 x g durante 10 min. Se aspiran los sobrenadantes y se determina la radioactividad en el granulado resultante utilizando un contador LKB Wallac gamma (Gaithersburg, MD).

Estudios radiorreceptores con receptores expresados

Se han llevado a cabo también los estudios radiorreceptores y funcionales para receptores clonados, en humanos o en monos, transfectados a una o varias líneas celulares [por ejemplo, C-6 glioma o células del ovario de un hámster chino (CHO)]. Se hacen crecer las células en un medio apropiado, y en confluencia, se recolectan para la preparación de la membrana. Se raspan los frascos de las células en el mismo paso utilizando un elemento (policeman) de caucho y se recogen en tubos centrífugos de 50 ml. Se hacen girar estos tubos durante 10 min a 1200 x g, a la totalidad de células del granulado. Se descarta el sobrenadante y luego se añaden 5 ml de PBS (tampón de solución salina de fosfato)/frasco a los tubos centrífugos para resuspender las células. A continuación se centrifugan otra vez los tubos durante 20 min a 28.500 x g. Se elimina el PBS y se suspende el granulado en una solución de DMSO 10% en PBS. Se homogenizan las células con un politrón durante 10 segundos en posición 5. Se almacena 1 ml de alícuota a -80ºC hasta su uso en los estudios de la unión del receptor. Los alícuotas contienen aproximadamente 1 mg/ml de proteína, tal como se mide utilizando el reactivo de proteína de ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL).

Para receptores similares D_{1}, se incuba la membrana proteína (50-75 g) con cada compuesto de ensayo y con [^{3}H] SCH23390 (0,3 nM) en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), con 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl_{2}, y 1 mM de MgCl_{2}. Se utiliza SCH23390 (5 \muM) para definir el aglutinante no específico. Se realizan los tubos por triplicado en un volumen final de 500 \mul. Después de una incubación durante 30 minutos a 37ºC, se filtran los tubos rápidamente a través de un filtro esterilla de fibra de vidrio Skatron (11734), y se aclara con 5 ml de hielo tampón (50 mM Tris, pH 7,4) utilizando un colector microcélulas de Skatron (Skatron Instruments Inc., Sterling, VA). Se llevan los filtros a secado, luego se perfora en frascos de centelleo (Skatron Instruments Inc., Sterling, VA). Se añade a cada frasco un cóctel de centelleo Optiphase "HiSafe" II (1 ml). Después de agitar durante 30 minutos, se determina la radioactividad en cada muestra en un contador de centelleo LKB Wallac 1219 Rackbeta líquido (Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Se usa un protocolo similar para receptores similares a D_{2}, excepto en [^{3}H]spiperone (0,07 nM) que se utiliza como un radioligando.

Estudios funcionales con receptores expresados

Se evalúa una actividad intrínseca agonista mediante la habilidad de compuestos seleccionados para estimular adenilato ciclasa, tal como se mide por la formación de cAMP en las células enteras. En las células C-6, por ejemplo, la curva de respuesta de la dosis de cada medicamento se ajusta utilizando una función sigmoidea para determinar la concentración máxima efectiva (el máximo de la meseta de la curva) y también el EC_{50}s. Se realizan todas las drogas en el mismo ensayo para disminuir la variabilidad a través de los pasos celulares. Se incuban los platos confluentes de las células con medicamentos disueltos en un medio simple de DMEM-H suplementado con 20 mM de Hepes, 0,01% de ácido ascórbico y 500 \muM de iso-butil-metilxantina (IBMX; pH 7,2; medio A). El volumen final por cada pocillo es de 500 \mul. Adicionalmente a las curvas de respuesta de las dosis puestas en marcha para cada medicamento, los niveles basales de cAMP y se evalúan los niveles de cAMP estimulados con isoproterenol (a través de receptores endógenos \beta_{2}, control positivo), para cada placa. Cada condición se realiza en pocillos duplicados. Siguiendo una incubación de 10 minutos a 37ºC, se aclaran las células brevemente con un medio, y se para la reacción con la adición de 500 \mul de HCl 0,1 N. A continuación se llevan las células a enfriar durante 5-10 min a 4ºC, se raspan los pocillos y se pone el volumen en tubos centrífugos de 1,7 ml. Se añade a cada tubo 1 ml de HCl 0,1N, para un volumen final de 1,5 ml/tubo. Se someten los tubos a acción de turbulencia, y luego se hacen girar en un microcentrifugador BHG Hermle Z 230 M durante 5 minutos a 15.000 x g para eliminar las partículas celulares grandes. Los niveles de AMP cíclico de cada muestra se determinan tal como se ha descrito anteriormente.

Se calculan los datos para cada muestra, y se expresan inicialmente como pmol/mg/min cAMP. Los valores base de cAMP se sustraen de la cantidad total del cAMP producido para cada condición de medicamento. Para minimizar la variación de los inter-ensayos, se incluye un compuesto de referencia (DA, 100 \muM) en cada ensayo para servir como un estándar interno que permite la normalización de los datos. Los datos por cada medicamento se expresaran con relación al porcentaje de la estimulación producida por 100 M DA. Las curvas normalizadas de respuesta de la dosis se analizan mediante una regresión no lineal utilizando un algoritmo para las curvas sigmoideas en un programa InPlot de ajuste de curvas (Graphpad, Inc.; San Francisco, CA). Para cada curva, el programa proporciona puntos estimados de ambos EC_{50} y la estimulación máxima producida (es decir, el máximo de la meseta de la curva sigmoidea).

Variaciones adicionales reivindicadas de los compuestos objetivos

Utilizando los procedimientos generales descritos en el ejemplo 1 citado anteriormente, los compuestos de los ejemplos 1-56 tal como se presentan en la tabla II a continuación, se sintetizan utilizando los compuestos de partida correspondiente a aquellos ilustrados en el esquema 1, pero sustituidos con grupos funcionales apropiados para proporcionar los patrones de sustitución descritos en el producto combinado cromenoisoquinolina mostrado para cada ejemplo. Por lo tanto, por ejemplo, los análogos sustituidos 6, 7 y/o 8 del compuesto 3 (esquema 1) proporcionan los sustituyentes correspondientes R_{6}, R_{5} y R_{4} respectivamente en la fórmula I. El uso de 1 y 3 isoquinolinas sustituidas (análogos del compuesto 3 en el esquema 1) proporciona los patrones de sustitución correspondientes a C_{3} y C_{1} en la fórmula I.

Ejemplo Número	R_{1}	R_{2}	R_{3}	R_{4}	R_{5}	R_{6}	R_{8}	X_{9}
1B	H	H	H	CH_{3}	H	H	H	OH
2	H	H	H	H	CH_{3}	H	H	OH
3	H	H	H	H	H	CH_{3}	H	OH
4	H	H	H	C_{6}H_{5}	H	H	H	OH
5	CH_{3}	H	CH_{3}	CH_{3}	H	H	H	OH
6	H	H	C_{3}H_{7}	H	CH_{3}	H	H	OH
7	H	H	H	C_{2}H_{5}	H	H	H	OH
8	H	H	H	H	C_{2}H_{5}	H	H	OH
9	H	H	H	H	CH_{3}	CH_{3}	H	Cl
10	CH_{3}	H	C_{3}H_{7}	CH_{3}	CH_{3}	H	H	OH
11	CH_{3}	H	C_{2}H_{5}	H	CH_{3}	CH_{3}	H	Cl
12	CH_{3}	H	CH_{3}	H	H	C_{2}H_{5}	H	OH
13	CH_{3}	H	C_{4}H_{9}	H	OH	H	H	OH
14	H	H	H	CH_{3}	OH	H	H	OH
15	H	H	H	H	F	H	H	OH
16	H	H	H	OH	H	H	H	Cl
17	H	H	H	Br	H	H	H	OH
18	H	CH_{3}	H	H	Br	H	H	OCH_{3}
19	H	CH_{3}	H	H	H	Br	H	OCH_{3}
20	H	CH_{3}	H	CH_{3}	Br	H	H	OCH_{3}
21	CH_{3}	H	CH_{3}	F	H	H	H	OH
22	CH_{3}	H	CH_{3}	H	F	H	H	OH
23	CH_{3}	H	CH_{3}	H	H	F	H	OH
24	C_{2}H_{5}	H	C_{2}H_{5}	H	OH	H	H	F
25	C_{2}H_{5}	H	C_{2}H_{5}	CH_{3}	OH	H	H	F
26	C_{2}H_{5}	H	C_{2}H_{5}	CH_{3}O	H	CH_{3}	H	F
27	C_{3}H_{7}	H	C_{3}H_{7}	H	CH_{3}O	H	H	Cl
28	C_{3}H_{7}	H	C_{3}H_{7}	H	CH_{3}	CH_{3}O	H	Cl
29	C_{3}H_{7}	H	C_{3}H_{7}	C_{2}H_{5}O	H	H	H	OH
30	C_{3}H_{7}	H	C_{3}H_{7}	H	H	OH	H	OH
31	C_{4}H_{9}	H	C_{4}H_{9}	CH_{3}	H	H	H	OH
32	C_{4}H_{9}	H	C_{4}H_{9}	H	OH	CH_{3}	H	OH
33	C_{4}H_{9}	H	C_{4}H_{9}	OH	Cl	H	H	OH
34	C_{4}H_{9}	H	C_{4}H_{9}	OH	Cl	H	H	OH
35	H	H	H	H	H	H	H	H
36	H	H	H	CH_{3}	H	H	H	H

Ejemplo Número	R_{1}	R_{2}	R_{3}	R_{4}	R_{5}	R_{6}	R_{8}	X_{9}
37	H	H	H	H	CH_{3}	H	H	H
38	H	H	H	H	H	CH_{3}	H	H
39	H	H	H	H	H	H	CH_{3}	OH
40	H	H	H	H	H	H	CH_{2}(CH_{3})_{2}	OH
41	H	H	H	H	H	H	CH_{3}	H
42	H	H	H	H	H	H	CH_{2}(CH_{3})_{2}	H
43	H	H	H	CH_{3}	H	H	CH_{3}	OH
44	H	H	H	H	CH_{3}	H	CH_{3}	OH
45	H	H	H	H	H	CH_{3}	CH_{3}	OH
46	H	H	H	H	H	H	CH_{2}CH_{3}	OH
47	H	C_{3}H_{5}	H	H	CH_{3}	H	H	OH
48	H	C_{3}H_{5}	H	H	H	H	OH	H
49	H	C_{3}H_{5}	H	H	H	H	H	OCH_{3}
50	H	C_{3}H_{5}	H	H	C_{2}H_{5}	H	H	OH
51	H	C_{3}H_{5}	H	CH_{3}	H	OCH_{3}	H	OH
52	H	C_{3}H_{5}	H	H	H	H	H	OCH_{3}
53	H	C_{3}H_{5}	H	H	CH_{3}	H	H	OCH_{3}
54	H	C_{3}H_{5}	H	H	H	H	H	OH
55	H	C_{3}H_{5}	H	H	C_{2}H_{5}	H	H	OH
56	H	C_{3}H_{5}	H	OCH_{3}	H	C_{2}H_{5}	H	OH

Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la invención y no se pretende limitar la invención a los compuestos presentados. Las variaciones y las modificaciones de los compuestos en los ejemplos manifestados obvios para un experto en la materia, se pretende que estén en el ámbito y naturaleza de la invención especificada en las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Compuesto de la fórmula

3

y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que

R_{1}, R_{2} y R_{3} son hidrógeno, C_{1}-C_{4} alquilo, o C_{2}-C_{4} alquenilo;

R_{8} es hidrógeno o C_{1}-C_{4} alquilo;

X_{9} es hidrógeno, haluro o un grupo de la fórmula -OR, en el que R es hidrógeno o C_{1}-C_{4} alquilo y además, cuando X_{9} es un grupo de la fórmula -OR, los grupos R_{8} y R se pueden coger conjuntamente para formar un grupo de la fórmula -CH_{2}-; y

R_{4}, R_{5} y R_{6} están, independientemente, seleccionados del hidrógeno, C_{1}-C_{4} alquilo, fenilo, haluro, o un grupo -OR, en el que R es tal como se ha definido anteriormente.

2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que X_{9} es un hidroxi y R_{8} es un hidrógeno

3. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son hidrógeno.

4. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que cada uno de R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} es hidrógeno.

5. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que X_{9} y R_{8} son hidrógeno

6. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R_{1} y R_{3} son hidrógeno

7. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R_{1} y R_{3} son C_{1}-C_{4} alquilo.

8. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que R_{2} es C_{2}-C_{4} alquenilo.

9. Compuesto, según la reivindicación 2, en el que R_{2} es C_{1}-C_{4} alquilo.

10. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que por lo menos uno de R_{4}, R_{5} o R_{6} es hidrógeno.

11. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que por lo menos dos de R_{4}, R_{5} o R_{6} son hidrógeno.

12. Composición farmacéutica que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un transportador del mismo farmacéuticamente aceptable.

13. Uso de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene disfunción, relacionada a la dopamina, del sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, u órganos periféricos que contienen receptores de dopamina, tal como se evidencia por un desorden neurológico, psicológico, fisiológico o un desorden en el comportamiento.

\newpage

14. Variante del compuesto, según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 11, en el que R_{8} es un grupo fenoxi-protector y/o, por lo menos, uno de X_{9}, R_{4}, R_{5} y R_{6} es un grupo -OR, en el que R es un grupo fenoxi-protector.