ES2190877B2 - Metodo gedap (genotyping based on diagnostic amplification products) para detectar y/o prevenir errores de genotipado a partir de los productos de amplificacion de un locus polimorfico. - Google Patents
Metodo gedap (genotyping based on diagnostic amplification products) para detectar y/o prevenir errores de genotipado a partir de los productos de amplificacion de un locus polimorfico.Info
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Abstract
Método GEDAP (Genotyping Based on Diagnostic Amplification Products) para detectar y/o prevenir errores de genotipado a partir de los productos de amplificación de un locus polimórfico. El método se basa en el análisis conjunto de homodúplexes y Productos Adicionales con valor Diagnóstico (PAD) generados a partir de la amplificación de los alelos de un locus polimórfico. El método es altamente efectivo para detectar y/o prevenir errores de genotipado debidos a no-amplificaciones totales o parciales producidas durante el proceso de amplificación, incluida la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Description
Método GEDAP (Genotyping Based on Diagnostic
Amplification Products) para detectar y/o prevenir errores de
genotipado a partir de los productos de amplificación de un locus
polimórfico.
Un método para genotipar loci polimórficos por
medio del análisis de los productos generados a partir de la
amplificación de los alelos contenidos en muestras diploides o
poliploides. Más específicamente, se refiere a un método para
detectar y/o prevenir errores de genotipado originados por
no-amplificaciones totales o parciales de los
alelos, producidas durante el proceso de amplificación. También se
refiere a las aplicaciones genéticas y a los sistemas que pueden
utilizar de forma efectiva esa información genotípica, tales como
la diagnosis de enfermedades, la diagnosis genética
preimplantacional, los tests de paternidad, los análisis forenses,
la terapia génica, el transplante de tejidos y órganos, la
farmacogenética, la genética de poblaciones, el mapado genómico y
la genética epidemiológica.
El genotipado es el punto de partida
imprescindible para llevar a cabo la mayor parte de los estudios
genéticos, tanto en su vertiente básica como en su vertiente
aplicada y ha contribuido decisivamente al gran desarrollo de la
Genética y de sus aplicaciones. El genotipado de loci polimórficos
de DNA se ha visto facilitado en los últimos años por dos avances
fundamentales: la invención de la técnica de la Reacción en Cadena
de la Polimerasa (``Polymerase Chain Reaction'', PCR) (Saiki et
al., 1985; Mullis et al., 1986) y el descubrimiento de
gran cantidad de secuencias polimórficos de DNA a lo largo de los
genomas (fundamentalmente marcadores de DNA con repeticiones en
tándem de uno o más nucleótidos) (Dib et al., 1996; Tóth
et al., 2000). Ambos avances han contribuido decisivamente,
entre otros aspectos, al conocimiento de la estructura y función de
los genomas de los seres vivos y al desarrollo de la genética de
poblaciones, de la genética epidemiológica, del mapado genómico, de
la terapia génica, de la diagnosis de enfermedades, de la diagnosis
genética preimplantacional, de los análisis forenses, del
transplante de tejidos y órganos, de la farmacogenética, de los
tests de paternidad, etc.
Los métodos convencionales utilizados para
genotipar loci polimórficos de DNA se basan en la siguiente
estrategia: (a) amplificar los alelos del locus presentes en una
muestra (generalmente por medio de la PCR); (b) identificar los
alelos amplificados (generalmente por medio de electroforesis); y
(c) determinar el genotipo de la muestra a partir de los alelos
amplificados.
Esta estrategia de genotipado debería garantizar
que el genotipo determinado a partir de los productos de
amplificación es en efecto el genotipo real de la muestra. En la
práctica, sin embargo, los métodos convencionales de genotipado
llevan asociado un porcentaje de error, variable según las
condiciones experimentales utilizadas.
Los errores de genotipado tienen repercusiones
muy negativas en los análisis genéticos y en las aplicaciones
derivadas de los análisis genéticos. Obviamente, los errores de
genotipado pueden tener repercusiones especialmente graves cuando
provocan la identificación errónea de individuos humanos, ya sea en
análisis criminalísticos, en análisis de paternidad, etc. Asimismo,
los errores de genotipado pueden provocar diagnosis médicas
incorrectas especialmente perniciosas en el caso de la diagnosis de
enfermedades, la diagnosis preimplantacional, el transplante de
tejidos y órganos, etc. Por otra parte, es conocido que los errores
de genotipado condicionan negativamente la exactitud de los
análisis genéticos, provocando serios inconvenientes tales como
pérdida de potencia en estudios de mapado genómico, distorsión
significativa de las distancias de mapa, infraestimación de la
fuerza de las correlaciones entre loci marcadores y rasgos de
enfermedades y falsa exclusión de la verdadera localización de un
gen que predispone a padecer una enfermedad (Buetow, 1991;
Goldstein et al., 1997; Göring y Terwilliger, 2000). El
efecto negativo de los errores de genotipado puede ser aún mayor en
los análisis de desequilibrio gamético (Zapata et al.,
2001a; Zapata et al., 2001b), ya que un único error de
genotipado puede destruir la evidencia de meiosis no recombinantes
producidas a lo largo de la historia de una población (Terwilliger
et al., 1997; de La Chapelle y Wright, 1998; Göring et
al., 1997; Göring y Terwilliger, 2000; Akey et al.,
2001).
Una fuente importante de errores de genotipado es
la existencia de fallos durante la amplificación que provocan la
ausencia total o parcial del producto de amplificación de al menos
uno de los alelos originalmente presentes en la muestra. La
ausencia parcial del producto de amplificación de un alelo, o
no-amplificación parcial, también es conocida como
amplificación preferencial (Walsh et al., 1992). La ausencia
total del producto de amplificación de un alelo, o
no-amplificación total, también es conocida como
``allele dropout'' (Findlay et al., 1995; Gagneux et
al., 1997) y alelos nulos (Pemberton et al., 1995).
La ocurrencia de este tipo de fallos a lo largo
del proceso de amplificación tiene importantes consecuencias. En el
caso de muestras diploides heterocigóticas, las
no-amplificaciones totales y algunas
no-amplificaciones parciales provocan el genotipado
erróneo de esas muestras como homocigóticas (Demers et al.,
1995; Findlay et al., 1995; Pemberton et al., 1995;
Fishback et al., 1999; Anderson et al., 2000).
Dada la repercusión que tienen los errores de
genotipado en los análisis genéticos y en las aplicaciones
genéticas, se está haciendo un esfuerzo considerable para:
- 1.-
- Conocer las causas de las no-amplificaciones totales y parciales.
- 2.-
- Intentar detectar y/o prevenir los errores de genotipado debidos a no-amplificaciones totales y parciales.
Estudios recientes están permitiendo conocer las
causas que provocan la ocurrencia de las
no-amplificaciones totales y parciales. Diversos
factores pueden originar la no-amplificación
parcial de un alelo en muestras diploides tales como: (a)
diferencias significativas en el contenido GC de los alelos de una
muestra heterocigótica (estas diferencias pueden conducir a la
desnaturalización de sólo uno de los dos alelos, fenómeno conocido
como desnaturalización diferencial) (Walsh et al., 1992); (b)
diferencias en el tamaño de los dos alelos que conducen a la
amplificación preferencial del alelo de menor tamaño (esta
amplificación preferencial está probablemente favorecida cuando la
concentración de la Taq polimerasa es limitante) (Walsh
et al., 1992); (c) fluctuaciones estocásticas en el número
de copias de cada alelo (Walsh et al., 1992); (d)
hibridaciones incompletas entre los primers y uno de los alelos (se
pueden originar como consecuencia de la existencia de mutaciones en
la región de primado) (Walsh et al., 1992); (e) daños en el
DNA molde (debidos a irradiación con luz ultravioleta o a la
adición de sales monovalentes tales como cloruro sódico, acetato
sódico o acetato amónico) (Mutter y Boynton, 1995); (f) baja
estringencia en el primado entre los primers y el DNA molde (se
puede originar como consecuencia de la amplificación simultánea de
una muestra y un control interno para estimar el tamaño de los
alelos amplificados, o como consecuencia de la amplificación
simultánea de más de una secuencia polimórfica) (Weissensteiner y
Lanchbury, 1996).
Diversos estudios sugieren que la
no-amplificación total puede ser el resultado de
una no-amplificación parcial extrema (Findlay et
al., 1995; Ronai et al., 2000). Por tanto, los
mecanismos que provocan la existencia de
no-amplificación parcial también pueden provocar
no-amplificación total. Por otra parte, otras
evidencias indican que la no-amplificación total se
produce con una frecuencia especialmente elevada si la muestra
posee una cantidad muy reducida de la secuencia que se pretende
genotipar (Gagneux et al., 1997; Lissens y Sermon, 1997).
Esta situación se cumple cuando se genotipa un locus a partir de una
única célula (por ejemplo, en el caso de la diagnosis genética
preimplantacional), o a partir de restos biológicos degradados o con
poco DNA (por Ejemplo, en diversos análisis forenses). En esos
casos, la no-amplificación total se ve favorecida
por factores tales como (a) el mosaicismo cromosómico, y más
específicamente, la presencia de células haploides en un embrión
diploide (Harper et al., 1995); (b) el método utilizado para
lisar la célula antes de la PCR (Lissens y Sermon, 1997, y
referencias citadas en el mismo); (c) la temperatura utilizada
durante el primer ciclo de desnaturalización de la PCR (Ray y
Handyside, 1996); (d) las roturas en el DNA producidas por
endonucleasas endógenas (Lissens y Sermon, 1997); (e) el uso de
condiciones de PCR subóptimas (Handyside y Delhanty, 1997); y (f)
la degradación rápida del DNA molde durante el proceso de
termociclación (Handyside y Delhanty, 1997).
Se han propuesto diversas mejoras de los métodos
convencionales de genotipado para detectar y/o prevenir los errores
de genotipado debidos a no-amplificaciones totales
y parciales. Básicamente se pueden agrupar en dos tipos: (2.1)
Métodos directos y (2.2) Métodos indirectos.
Los métodos directos se basan en (a) mejora de
las condiciones de amplificación para prevenir la ocurrencia de
no-amplificaciones totales o parciales y (b) mejora
del sistema de detección de los alelos amplificados.
Entre las optimizaciones de las condiciones de
amplificación sugeridas para intentar prevenir la ocurrencia de
no-amplificaciones parciales se encuentran: (a) no
utilizar una concentración de DNA molde superior a 200 ng ni un
tiempo de extensión en cada ciclo superior a 2 minutos (Deka et
al., 1992); (b) sustituir el dGTP por
7-deaza-2'-dGTP
(Mutter y Boynton, 1995) o por
2'-desoxiinosina-5'-trifosfato
(dITP) (Ronai et al., 2000); (c) utilizar PNA (``Peptide
Nucleic Acid'') a lo largo del proceso de amplificación (Demers
et al., 1995); (d) utilizar cosolutos desestabilizantes de
DNAs de doble cadena tales como la betaína y el glicerol
(Weissensteiner y Lanchbury, 1996); (e) incrementar la
concentración de KCl (Fishback et al., 1999).
Entre las optimizaciones de las condiciones de
amplificación sugeridas para intentar prevenir la ocurrencia de
no-amplificaciones totales se encuentran: (a)
incrementar la temperatura de desnaturalización (Lissens y Sermon,
1997); (b) realizar ``whole-genome amplification''
por medio de ``primer extension pre-amplification''
(PEP) seguida por ``nested PCR'' (Handyside y Delhanty, 1997); (c)
aproximaciones para incrementar la cantidad de DNA molde, tales
como realizar la biopsia de más de una célula del embrión (Harper
et al., 1996), incrementar el número de células fetales a
partir del fluidos maternos (Garvin et al., 1998), etc.
Paralelamente, se han propuesto mejoras en el
sistema de detección de los alelos amplificados con objeto de
intentar detectar errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones totales o parciales. Por ejemplo,
Findlay et al. (1995) han demostrado que la PCR fluorescente
permite reducir la tasa de errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones totales. Esto se debe a que la
PCR fluorescente, mucho más sensible que la PCR convencional,
permite detectar muestras clasificadas por la PCR convencional como
muestras homocigóticas que son en realidad muestras heterocigóticas
con no-amplificación parcial extrema.
En este sentido, se ha asumido que el método
definitivo para el genotipado de alta resolución es la detección de
polimorfismos a través de la secuenciación automática fluorescente
por medio del uso de secuenciadores automáticos basados en la
electroforesis capilar tales como el ABI PRISM 310 o el ABI PRISM
3100 (Applied Biosystems, 2001). Este método podría detectar
potenciales errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones parciales. Sin embargo, el
problema de genotipado asociado con la
no-amplificación total no se resuelve incluso cuando
se usan secuenciadores automáticos tales como el ABI PRISM 310
(Garvin et al., 1998). De hecho, estudios recientes
señalaron que los errores de genotipado son inevitables (Douglas
et al., 2000; Göring y Terwilliger, 2000) y que son muy
difíciles o imposibles de detectar cuando no se dispone de
información mendeliana (Weeks et al., 2000).
Consecuentemente, tanto las mejoras en las
condiciones de amplificación como en el sistema de detección
propuestas, no permiten prevenir completamente la ocurrencia de
no-amplificaciones totales o parciales ni detectar
la totalidad de errores de genotipado debidos a estos fallos en la
PCR.
Una alternativa para poder detectar errores de
genotipado debidos a no-amplificaciones totales o
parciales es recurrir a métodos indirectos. Entre estos métodos se
encuentran (a) repetir la reacción un número de veces tal que
permita descartar un posible error de genotipado, y (b) el análisis
mendeliano.
Se ha sugerido que la realización de tres
réplicas en el análisis genético de una muestra (es decir, repetir
tres veces la amplificación a partir de la muestra y la detección
de los alelos amplificados) debería detectar un 95% de los errores
de genotipado debidos a no-amplificaciones totales o
parciales (Gagneux et al., 1997). Asimismo, Taberlet et
al. (1996) han propuesto que este porcentaje se incrementa hasta
un 99% cuando se realizan siete réplicas, aunque existe discusión
en este sentido (Weissensteiner, 1997; Taberlet, 1997).
Sin embargo, esta estrategia presenta dos
limitaciones fundamentales. En primer lugar, no permite identificar
a priori las muestras que han podido sufrir
no-amplificación total o parcial. Esto obligaría a
realizar réplicas de todas las muestras que son aparentemente
homocigóticas, dado que los métodos convencionales de genotipado no
permiten diferenciar entre muestras homocigóticas y muestras
heterocigóticas con no-amplificación total.
Obviamente, esta aproximación es difícilmente abordable en estudios
que requieren el genotipado de un amplio tamaño muestral (por
ejemplo, en el caso de los ``genome scans'' y en el caso de un gran
número de estudios poblacionales y estudios epidemiológicos). En
segundo lugar, la posible aplicación de esta estrategia se ve
seriamente limitada por la disponibilidad de DNA, ya que, en
ocasiones, la cantidad de DNA disponible es muy reducida (por
ejemplo, en estudios de genética preimplantacional, en estudios
forenses en los que las muestras están degradadas, cuando se parte
de muestras con poco DNA, tales como pelos, etc.).
Otro método indirecto que permite detectar un
amplio espectro de errores de genotipado es el análisis mendeliano
(Ewen et al., 2000). Sin embargo, no siempre es posible
recurrir a este procedimiento, ya que en ocasiones se carece de
muestras relacionadas biológicamente con la muestra objeto de
estudio. Además, se ha descrito que el análisis mendeliano no
siempre permite detectar errores de genotipado. Esta situación se
cumple especialmente cuando los núcleos familiares estudiados son
pequeños (Weeks et al., 2000).
Por todo lo expuesto, resulta evidente que los
métodos convencionales, basados en el genotipado a partir de los
alelos amplificados, no son eficientes para detectar y/o prevenir
errores de genotipado debidos a amplificaciones totales o
parciales. Notablemente, estos errores de genotipado se siguen
produciendo incluso tras la aplicación de mejoras derivadas del uso
de métodos directos e indirectos para detectarlos y/o prevenirlos
específicamente. Por lo tanto, existe una clara necesidad de un
nuevo Método de genotipado que permita detectar y prevenir de forma
efectiva los errores ocasionados por
no-amplificaciones totales o parciales.
Recientemente, se ha descrito que ciertos
productos generados por la PCR durante la amplificación de los
alelos (concretamente heterodúplexes) pueden ser utilizados como
una fuente de información adicional en la identificación de
muestras heterocigóticas (Wilkin et al., 1993; Neilan et
al., 1994; Ardren et al., 1999) y en la detección de
homoplasia (Szibor et al., 1996; Haddad et al., 1997;
Ardren et al., 1999). Sin embargo, estos trabajos no han
considerado que los productos adicionales a los alelos amplificados
pueden ser útiles en la detección y/o prevención de errores de
genotipado producidos por no-amplificaciones
totales o parciales.
En la presente invención, proponemos un método de
genotipado, denominado Genotyping Based on Diagnostic Amplification
Products (GEDAP), que permite detectar y/o prevenir de forma
efectiva errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones totales o parciales. El método es
reproducible, muy fiable y preciso. Se basa en una estrategia de
genotipado distinta a la empleada por los métodos convencionales.
El método GEDAP consiste en promover la formación de homodúplexes
de los alelos amplificados y de otros Productos Adicionales con
valor Diagnóstico (PAD) y analizarlos conjuntamente para determinar
el genotipo de un locus polimórfico a partir de una muestra
diploide o poliploide. En concreto, promueve la formación de PAD
específicos de genotipo y PAD específicos de alelo. El análisis
combinado de estos dos tipos de PAD y de los homodúplexes de los
alelos amplificados, es utilizado por el método GEDAP para poner en
evidencia si se ha producido, o no,
no-amplificación total o parcial de al menos un
alelo durante el proceso de amplificación del locus polimórfico de
interés.
Así, en un aspecto, GEDAP permite detectar
errores de genotipado debidos a no-amplificaciones
totales o parciales, en base a la detección de combinaciones
anómalas de homodúplexes y PAD. En otro aspecto, también permite
prevenir errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones totales o parciales, en base a
la detección de combinaciones esperadas de homodúplexes y PAD
específicas de cada genotipo.
El método GEDAP solventa en gran medida las
limitaciones de los métodos convencionales. Así, permite
identificar con gran precisión los productos de amplificación que
han sufrido no-amplificación total o parcial, por lo
que el número de réplicas necesario para detectar los errores de
genotipado asociados con esos fallos se reduce considerablemente.
Por otra parte, el método GEDAP proporciona un control interno de
la calidad de la amplificación, por lo que no es necesario recurrir
a métodos indirectos para detectar y/o prevenir errores de
genotipado. Además, puede ser automatizado parcial o totalmente,
por lo que puede ser utilizado para optimizar el genotipado a gran
escala (``high throughput genotyping'').
El método GEDAP es aplicable a todos los
organismos diploides o poliploides, tales como organismos animales
y organismos vegetales. Asimismo, es igualmente aplicable para
determinar el genotipo de organismos transgénicos y de organismos
clonados. En la práctica, su uso será más extendido en organismos
con aplicaciones útiles o comercialmente beneficiosas, tales como
el hombre y los organismos de interés para el hombre.
A título ilustrativo, se demuestra que el método
GEDAP permite detectar y/o prevenir de forma efectiva errores de
genotipado debidos a no-amplificaciones totales o
parciales producidas durante la amplificación de microsatélites de
naturaleza dinucleotídica. Por lo tanto, es útil en las
aplicaciones derivadas del uso de estos marcadores de DNA. En la
industria biotecnológica es de aplicación, por ejemplo, en la
diagnosis de enfermedades, la diagnosis genética preimplantacional,
la terapia génica, el transplante de tejidos y órganos, la
farmacogenética, los tests de paternidad, los análisis forenses y
la elaboración o el perfeccionamiento de programas informáticos
para el genotipado. En ciencia básica es de aplicación, por
ejemplo, en genética de poblaciones y en el mapado genómico.
Estos y otros objetivos, características y
ventajas del nuevo método de genotipado GEDAP serán comprendidos en
mayor profundidad por una persona con conocimientos básicos en el
campo tras la lectura de la siguiente descripción detallada,
ilustrada con las Figuras que se adjuntan a continuación.
La figura 1 muestra un esquema del genotipado de
un locus polimórfico (A) con dos alelos distintos (A_{x},
A_{y}) a partir de muestras diploides.
La figura 2 muestra un esquema de la base de los
métodos convencionales de genotipado.
La figura 3 muestra un esquema de la base del
método GEDAP.
La figura 4 ilustra esquemáticamente errores de
genotipado debidos a no-amplificaciones totales y
parciales que no se pueden detectar ni prevenir mediante los
Métodos convencionales de genotipado.
La figura 5 ilustra esquemáticamente la detección
y prevención de errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones totales y parciales mediante el
método GEDAP.
La figura 6 muestra la resolución y la precisión
del sistema electroforético, en base a los valores de R(f)
de los alelos de seis microsatélites de naturaleza
dinucleotídica.
La figura 7 corresponde a dos geles que ilustran
cómo las condiciones electroforéticas no desnaturalizantes
favorecen la presencia de PAD, en comparación con las condiciones
electroforéticas desnaturalizantes.
La figura 8 ilustra esquemáticamente las bandas
correspondientes a los homodúplexes (``homoduplex bands''), a los
PAD-AL (``diagnostic shadow bands'' y ``stutter
bands''), a los PAD-HOM (``faint bands'') y a los
PAD-HET (``heteroduplex bands'').
La figura 9 ilustra esquemáticamente la detección
de errores de genotipado mediante el método GEDAP, a través de la
identificación de patrones de bandas anómalos (B y C), en
comparación con los patrones de bandas normales (A y D).
La figura 10 corresponde a un gel que ilustra la
prevención de errores en el genotipado de muestras heterocigóticas
mediante el método GEDAP, a través del análisis combinado de
``homoduplex bands'', ``diagnostic shadow bands'', ``stutter
bands'', ``faint bands'' y ``heteroduplex bands''.
La figura 11 corresponde a un gel que ilustra una
aparente exclusión de parentesco detectada por medio del
microsatélite de naturaleza dinucleotídica D11S1760.
La figura 12 corresponde a un gel que ilustra
cómo el método GEDAP permite demostrar que la aparente exclusión de
parentesco es en realidad un error de genotipado debido a una
no-amplificación total.
A continuación se describe en detalle cómo
aplicar el método GEDAP. En un primer lugar, se describe cómo
generar e identificar los homodúplexes y los Productos Adicionales
con valor Diagnóstico (PAD). En segundo lugar, se describe cómo se
pueden detectar y/o prevenir errores de genotipado y las ventajas
que presenta GEDAP en relación a los métodos convencionales. En
tercer lugar, se evalúa la eficiencia del método. Finalmente, se
muestran dos ejemplos para ilustrar algunas de las aplicaciones de
la presente invención.
El locus que se puede genotipar mediante el
método GEDAP es cualquier secuencia de ácido nucleico de la que se
conozcan al menos dos alelos distintos. El locus preferido en la
presente encarnación es cualquier marcador de DNA con repeticiones
en tándem de uno o más nucleótidos.
El proceso de genotipado del locus comienza
obteniendo cualquier muestra que contenga, o que se presuma que
contenga, al menos dos alelos del locus que se pretende analizar.
Las muestras preferidas en la presente encarnación son muestras de
sangre de individuos humanos.
Una vez obtenida la muestra, se procede a
amplificar los alelos del locus bajo condiciones que induzcan la
formación de homodúplexes y PAD. La amplificación se puede llevar a
cabo a partir de los ácidos nucleicos contenidos en la muestra, sin
aislarlos del resto de los componentes (e.g. Yue et al.,
2001). Otra posibilidad consiste en purificar los ácidos nucleicos
previamente a la amplificación. En la encarnación preferida, el DNA
se purifica previamente a la amplificación de los alelos. Existen
numerosos métodos estándar para purificar el DNA a partir de sangre,
otros tejidos, pelo, heces, saliva, etc. En la encarnación
preferida, el DNA se purifica por medio de un kit comercial de
purificación de DNA a partir de muestras de sangre total (QIAamp
blood kit, QIAGEN).
Una técnica idónea para amplificar los alelos del
locus bajo condiciones que induzcan la formación de homodúplexes y
PAD es la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR),
aunque se pueden utilizar otros procedimientos para amplificar
secuencias de DNA o RNA tales como ``Nucleic Acid Sequence Based
Amplification'' (NASBA), ``Transcription-based
Amplification System'' (TAS), ``Self-sustained
Sequence Replication'' (3SR), ``Q-beta replicase'',
``Ligation Amplification Reaction'' (LAR) y ``Ligase Chain
Reaction'' (LCR) (Dr bek, 2001). La PCR permite la amplificación
in vitro de una o más secuencias específicas de DNA
presentes en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos
por medio del uso de primers y agentes para la polimerización.
Cuando el producto de extensión de un primer hibrida con el otro
primer, pasa a ser un molde para la producción de la secuencia
deseada y viceversa. Este proceso se repite el número de veces
necesario para producir la cantidad deseada de la secuencia. El
método de la PCR que se refleja a continuación es estándar y puede
ser utilizado fácilmente para amplificar cualquier marcador de DNA
con repeticiones en tándem de uno o más nucleótidos.
En la encarnación preferida para llevar a cabo la
amplificación, el ácido nucleico de la muestra se mezcla con otros
componentes de la mezcla de reacción de la PCR. Esos otros
componentes incluyen, pero no están limitados a, el tampón de la
PCR estándar (que contiene Tris pH 8,0, 2,5 mM KCI, cloruro
magnésico), los desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP), la polimerasa termoestable (e.g. Taq polimerasa)
y los primers. La cantidad total de cada uno de los componentes de
esta mezcla depende del volumen final de la mezcla de reacción y el
número de reacciones que se pretendan realizar.
Las secuencias de los primers y las condiciones
específicas adecuadas para amplificar cada marcador se pueden
obtener a partir de las bases de datos disponibles (por Ejemplo,
Genome Database, GDB: http://www. gdb.org o Généthon:
http://www.genethon.fr). Los primers para amplificar cada
marcador se pueden sintetizar (véase, por ejemplo, Beacauge et
al., 1981; Caruthers et al., 1988; Haralambidis et
al., 1990) o bien adquirir a casas comerciales. Los primers
también se pueden marcar para facilitar su detección (por ejemplo:
con fluorocromos, radioisótopos, ligandos que permitan su detección
mediante quimioluminiscencia, ligandos para su detección
inmunohistoquímica tales como la digoxigenina, etc).
Las reacciones de PCR se llevan a cabo calentando
y enfriando la muestra de reacción a las temperaturas específicas
establecidas y descritas para cada marcador. Típicamente, el
protocolo de termociclación consiste en:
a) Un paso inicial de desnaturalización (p. ej.
94ºC durante 3 minutos)
b) Repetir de 20 a 40 veces:
- b1.- un paso de desnaturalización (p. ej. 94ºC durante 30 segundos)
- b2.- un paso de primado o annealing (p. ej. 55ºC durante 30 segundos)
- b3.- un paso de elongación (p. ej. 72ºC durante 30 segundos)
c) Un paso final de elongación (p. ej. 72ºC
durante 2 minutos).
Las condiciones experimentales utilizadas en la
PCR favorecen la generación de homodúplexes de los alelos
amplificados y la generación de otros productos adicionales, entre
los que se encuentran los PAD. En concreto, la desnaturalización de
los ácidos nucleicos presentes en la mezcla de reacción utilizada
durante la PCR y su posterior renaturalización es una fuente
importante de homodúplexes y otros productos adicionales. El número
de homodúplexes y productos adicionales generados en la PCR depende,
en primera instancia, de si los ácidos nucleicos resultantes de la
amplificación tienen una secuencia distinta o no. Así, en las
mezclas de reacción de muestras homocigóticas (en las que los
alelos del locus tienen la misma secuencia), los sucesivos ciclos
de desnaturalización y renaturalización generarán un solo tipo de
homodúplex. Por el contrario, en las mezclas de reacción de
muestras heterocigóticas (en las que al menos dos alelos del locus
tienen secuencias diferentes), dichos ciclos generarán un número de
homodúplexes igual al número de secuencias distintas presentes en
esas mezclas de reacción. Además, en el caso de muestras
heterocigóticas, los sucesivos ciclos de desnaturalización y
renaturalización también inducirán la formación de heterodúplexes.
Estos surgen como consecuencia de la hibridación de dos cadenas
procedentes de ácidos nucleicos con secuencias distintas.
Además de los homodúplexes y los heterodúplexes
mencionados, la PCR también induce la formación de otros productos
adicionales distintos. Por ejemplo, cuando la Taq polimerasa
lleva a cabo el proceso de elongación, puede cometer errores que
provocan la síntesis de ácidos nucleicos con una secuencia distinta
a la secuencia del DNA molde. Uno de estos errores, producido por
el mecanismo conocido como ``DNA slippage'', se da con relativa
frecuencia en el transcurso de la amplificación de marcadores
microsatélites con repeticiones de uno o más nucleótidos. Así, en
el caso de marcadores microsatélites de naturaleza dinucleotídica,
el ``slippage'' genera la formación de ácidos nucleicos que
presentan una ganancia o una pérdida de una unidad repetitiva (2
nucleótidos) con respecto al DNA molde original, aunque la
probabilidad de perder una unidad repetitiva es mucho mayor que la
probabilidad de ganarla (Miller y Yuan, 1997). Por tanto, los
sucesivos ciclos de desnaturalización y renaturalización inducirán
la generación de ácidos nucleicos de doble cadena, distintos a los
homodúplexes, que resultarán de la hibridación de dos cadenas
complementarias generadas por ``slippage''. Asimismo, también se
podrán formar nuevos heterodúplexes, que resultarán de la
hibridación entre las cadenas generadas por ``slippage'' y las
cadenas de los alelos.
Por otra parte, la PCR también puede originar
otros tipos de productos adicionales. Así, se ha descrito que
ciertos oligonucleótidos tienen la tendencia a unirse al DNA de
doble cadena y formar tríplexes intermoleculares estables (Durland
et al., 1991; revisión de Frank-Kamenetskii
y Mirkin, 1995). Por tanto, una nueva fuente de productos
adicionales es la generación de tríplexes a través de la unión de
al menos uno de los primers utilizados para la amplificación y
cualquiera de los ácidos nucleicos de doble cadena presentes en la
mezcla de reacción. De forma análoga, otros componentes de la mezcla
de reacción utilizada en la amplificación también pueden inducir la
formación de tríplexes intermoleculares. Así, se ha descrito que el
análogo de DNA ``Peptide Nucleic Acid'' (PNA), utilizado en la PCR
para estimular la amplificación del DNA y reducir la ocurrencia de
amplificación preferencial (Demers et al., 1995), también
induce la formación de tríplexes (revisión de
Frank-Kamenetskii y Mirkin, 1995).
Una vez finalizada la PCR, se pueden generar
muchos otros tipos de productos adicionales. Entre las causas que
pueden inducir la formación de estos nuevos productos adicionales
se encuentran la formación de complejos entre los componentes de la
mezcla de reacción y la existencia de cambios conformacionales de
los ácidos nucleicos generados por la PCR. Por ejemplo, es conocido
que fragmentos de DNA con repeticiones en tándem del dinucleótido
CA se asocian espontáneamente entre sí in vitro formando
estructuras estables de cuatro cadenas que pueden ser detectadas
mediante electroforesis y microscopía electrónica (Gaillard y
Strauss, 1994). Asimismo, el motivo GA confiere un considerable
polimorfismo conformacional al DNA, lo que incluye la formación de
tetráplexes (Lee, 1990), ``single-stranded acid
fold'' (Dolinnaya y Fresco, 1992; Dolinnaya et al., 1993;
Ortiz-Lombardía et al., 1995),
``parallel-stranded duplex'' (Lee, 1990),
``antiparallel-stranded duplex'' (Huertas et
al., 1993; Casasnovas et al., 1993),
``zinc-specific duplex''
(Ortiz-Lombardía et al., 1995) y ``tetraplex
composed of two hairpins'' (Shiber et al., 1996; Mukerji
et al., 1996). De forma análoga, también es conocido que
otros motivos, tales como el motivo AT, también confieren un
considerable polimorfismo conformacional al DNA (véase Vorlícková
et al., 1998 y referencias citadas en el mismo).
La formación de estos productos adicionales una
vez finalizada la PCR puede ser espontánea. Eventualmente, la
generación de estos productos adicionales se puede inducir por el
uso de condiciones experimentales específicas. Entre estas
condiciones se encuentra (a) desnaturalizar los productos de
amplificación mediante el uso de cualquier procedimiento físico,
químico o biológico, tal como desnaturalización térmica,
desnaturalización electroquímica mediante la aplicación de voltaje,
el uso de agentes desnaturalizantes (e.g. formamida, urea, EDTA) y
enzimas, y (b) renaturalizarlos con posterioridad. Otras
condiciones experimentales para inducir la formación de productos
adicionales incluyen someter los productos de amplificación a
cambios de temperatura, cambios en la concentración de sales,
cambios en el pH y cambios en la concentración de iones divalentes
(véase, por ejemplo, Dolinnaya y Fresco, 1992; revisión de
FrankKamenetskii y Mirkin, 1995; Noonberg et al., 1995;
Ortiz-Lombardía et al., 1995; Vorlícková
et al., 1998).
Una vez generados los homodúplexes y los
productos adicionales, se procede a identificar los productos de
amplificación necesarios para determinar el genotipo de la muestra,
i.e., los homodúplexes y los PAD. Para identificarlos, se
puede utilizar cualquier sistema de identificación de ácidos
nucleicos que al menos mantenga homodúplexes y PAD generados con
anterioridad. Sin embargo, para aplicar el método reivindicado, es
más útil utilizar un sistema que, además de mantener homodúplexes y
PAD, también tenga la capacidad de inducir la generación de nuevos
PAD.
En este sentido, la electroforesis de DNA en
condiciones no desnaturalizantes es un sistema idóneo para mantener
homodúplexes y PAD, y generar nuevos PAD. Es conocido que la
electroforesis no desnaturalizante es un medio muy sensible a los
cambios conformacionales del DNA, lo que permite la separación e
identificación de una gran variedad de conformaciones de DNA. Así,
se sabe que los tríplexes permanecen intactos durante la
electroforesis en geles de poliacrilamida que contengan iones
magnesio (Durland et al., 1991). De forma similar, la
electroforesis no desnaturalizante es uno de los sistemas
utilizados para detectar la presencia de tetráplexes (Lee, 1990),
``single-stranded acid fold'' (Dolinnaya y Fresco,
1992; Dolinnaya et al., 1993; Ortiz-Lombardía
et al., 1995), ``parallel-stranded duplex''
(Lee, 1990), ``antiparallel-stranded duplex''
(Huertas et al., 1993; Casasnovas et al., 1993),
``zinc-specific duplex''
(Ortiz-Lombardía et al., 1995) y ``tetraplex
composed of two hairpins'' (Shiber et al., 1996; Mukerji
et al., 1996), etc. Por tanto, la electroforesis no
desnaturalizante permite mantener, además de los homodúplexes,
productos adicionales generados durante o tras la
amplificación.
Por otra parte, es conocido que la electroforesis
en gel no desnaturalizante también puede promover la formación de
productos adicionales tales como tríplexes intermoleculares. Por
ejemplo, la electroforesis no desnaturalizante genera tríplexes
cuando una cadena sencilla con alta tasa de migración alcanza a una
banda (de menor tasa de migración) que contiene una cadena doble de
ácido nucleico con una secuencia apropiada (captura en el gel)
(Belotserkovskii y Johnston, 1996). Además, se ha descrito la
formación de ``double-hairpin tetraplex'' cuando se
utiliza una alta fuerza iónica durante la electroforesis no
desnaturalizante (Shiber et al., 1996). De forma análoga, se
sabe que la electroforesis no desnaturalizante genera la aparición
de bandas diferentes a las bandas de los alelos en ciertos
marcadores microsatélites. Esas nuevas bandas se originan
probablemente a partir de alteraciones de la curvatura de la doble
hélice (Lareu et al., 1998) o como consecuencia de la
formación de ``hairpin loop'' en secuencias de DNA ricas en el
motivo AT (Prinz et al., 1996).
Además de mantener los homodúplexes y los PAD, y
generar nuevos PAD, la electroforesis de DNA en condiciones no
desnaturalizantes posibilita la identificación de los homodúplexes
y los PAD a través de su separación física por medio de la acción
de un campo eléctrico. Una vez finalizada la electroforesis, se
procede a visualizar las bandas generadas a través de cualquier
medio que permita la detección del DNA, tal como tinción con
nitrato de plata, bromuro de etidio, etc.
Sin embargo, no se pretende limitar la técnica de
identificación únicamente a electroforesis no desnaturalizante.
Así, se puede utilizar cualquier otra técnica que permita
identificar homodúplexes y PAD, tales como la espectrometría de
masas, la cromatografía, la hibridación diferencial, la
secuenciación por hibridación, etc.
Una vez identificados los homodúplexes y los PAD,
se procede a deducir el genotipo de la muestra en base al método
GEDAP.
La base y las ventajas del método propuesto se
ponen de manifiesto a través de su comparación con los métodos
convencionales de genotipado. Para establecer la comparación, se
toma como ejemplo el genotipado de un locus polimórfico con dos
alelos a partir de muestras diploides (figura 1).
La diferencia fundamental entre el método GEDAP y
los métodos convencionales tiene que ver con los productos
adicionales generados a partir de la amplificación. Así, los
Métodos convencionales se basan en determinar el genotipo de un
locus polimórfico considerando únicamente los alelos amplificados a
partir de la muestra (figura 2). Cualquier otro producto adicional
a los alelos es considerado como un resultado artefactual, por lo
que su presencia se intenta eliminar o reducir (véase, por ejemplo,
Perlin et al. 1994, Schlötterer, 1998). Por tanto, en
condiciones óptimas, las muestras homocigóticas presentarán un solo
alelo amplificado (figura 2, a y c), mientras que las muestras
heterocigóticas presentarán dos alelos amplificados distintos
(figura 2, b).
Por el contrario, el método GEDAP se basa en el
genotipado de un locus polimórfico a partir del análisis conjunto
de los homodúplexes y los PAD identificados (figura 3). Los PAD son
considerados como una información adicional útil para confirmar el
genotipo de la muestra, por lo que su presencia se intenta mantener
e inducir. Los PAD útiles para el genotipado se pueden clasificar
en dos tipos distintos: productos adicionales diagnósticos de
genotipo (PAD-HOM y PAD-HET) y
productos adicionales diagnósticos de alelo
(PAD-AL). La presencia de estos dos tipos de PAD
acentúa las diferencias existentes entre las muestras homocigóticas
y las muestras heterocigóticas. Así, en condiciones óptimas, las
muestras homocigóticas presentarán un solo homodúplex, al menos un
PAD-HOM y al menos un PAD-AL
específico del homodúplex identificado (figura 3, a y c). Por el
contrario, las muestras heterocigóticas presentarán dos
homodúplexes, al menos un PAD-HET y al menos un
PAD-AL específico de cada uno de los homodúplexes
identificados (figura 3, b).
El distinto planteamiento de los métodos
convencionales de genotipado y del Método GEDAP se traduce en una
distinta capacidad para detectar y/o prevenir errores de genotipado
debidos a no-amplificaciones totales o parciales.
Así, los métodos convencionales no permiten discriminar entre
muestras heterocigóticas con no-amplificación total
(figura 4, b1) y muestras verdaderamente homocigóticas (figura 4,
a), ya que ambas presentan un solo alelo amplificado. Por otra
parte, las muestras heterocigóticas que presentan
no-amplificación parcial (figura 4, b2) pueden ser
confundidas con muestras homocigóticas (figura 4, a), especialmente
si la cantidad del alelo hipoamplificado está por debajo del nivel
umbral de detección. Por tanto, los Métodos convencionales son
ineficientes en ambos casos, tanto para detectar como para prevenir
errores de genotipado.
Por el contrario, el método GEDAP permite
detectar y/o prevenir errores de genotipado en ambos casos de forma
eficiente. Por una parte, el método GEDAP sí permite discriminar
entre muestras heterocigóticas con no-amplificación
total y muestras verdaderamente homocigóticas. Esta propiedad se
debe a que, aunque ambos tipos de muestras poseen un solo
homodúplex, existen diferencias entre ellas en cuanto a los PAD.
Así, las muestras heterocigóticas con
no-amplificación total no presentan
PAD-HOM (figura 5, b1), mientras que las muestras
verdaderamente homocigóticas sí presentan PAD-HOM
(figura 5, a). Por otra parte, también evita la confusión entre
muestras heterocigóticas con no-amplificación
parcial y muestras verdaderamente homocigóticas. Esta propiedad se
debe a que las muestras heterocigóticas con
no-amplificación parcial pueden ser identificadas
por la presencia de los PAD-AL específicos de dos
homodúplexes y/o por la presencia de PAD-HET
(figura 5, b2), estando ausentes ambos PAD en muestras
verdaderamente homocigóticas (figura 5, a).
En definitiva, el método GEDAP permite detectar
errores de genotipado por medio de la identificación de
combinaciones anómalas de homodúplexes y PAD; también permite
prevenir errores de genotipado por medio de la identificación de
combinaciones esperadas de homodúplexes y PAD, específicas de cada
genotipo. En ambos casos, el uso de PAD-HOM,
PAD-HET y PAD-AL representa un
nivel de control fundamental para determinar que el genotipo de una
muestra es homocigoto o heterocigoto.
La eficiencia del método se puede determinar
estadísticamente. Para ello se puede testar si las frecuencias
genotípicas observadas en una muestra poblacional se desvían
significativamente de las proporciones genotípicas esperadas bajo
Hardy-Weinberg (HWP). La potencia estadística para
detectar desviaciones significativas se ve incrementada
notablemente cuando se utilizan tests estadísticos que concentran
las desviaciones de las HWP en un único grado de libertad (Gomes et
al., 1999) y se analiza un tamaño muestral elevado.
Este tipo de control estadístico es un medio muy
potente para detectar errores de genotipado (Chakraborty et
al., 1992; Gomes et al., 1999). La existencia
significativa de errores de genotipado puede ser detectada como
desviaciones de las HWP. En particular, las
no-amplificaciones de uno de los alelos presentes en
las muestras heterocigóticas causan una deficiencia de
heterocigotos con respecto a las HWP. Por tanto, si se genotipa una
amplia muestra poblacional y se determina que no existen
desviaciones significativas con respecto a las HWP, se podría
concluir que el método GEDAP es eficiente para detectar y/o
prevenir errores de genotipado.
A continuación se ilustran algunas de las
aplicaciones del método GEDAP, por medio de dos ejemplos: el
genotipado de marcadores microsatélites de naturaleza
dinucleotídica y los análisis de paternidad. Estos ejemplos tan
sólo son encarnaciones ilustrativas de la presente invención y no
pretenden limitar de ningún modo ni el alcance ni las aplicaciones
de la misma. Por otra parte, es obvio que se pueden llevar a cabo
modificaciones en los procedimientos que se describen a
continuación sin que suponga una vulneración del espíritu de la
invención recogido en las reivindicaciones.
El siguiente ejemplo ilustra en detalle cómo
utilizar el método GEDAP para detectar y/o prevenir errores en el
genotipado de marcadores microsatélites de naturaleza
dinucleotídica a partir de muestras de individuos humanos.
Se analizaron 405 individuos no relacionados
residentes en Galicia. El DNA se extrajo a partir de muestras de
sangre de cada uno de los individuos mediante un kit comercial
(QIAamp blood kit, QIAGEN). Todos los individuos se genotiparon
para 6 marcadores microsatélites de naturaleza dinucleotídica
localizados en el cromosoma 11 humano: D11S4177, D11S1323,
D11S4124, D11S1318, D11S909 y D11S1760 (Dib et al.,
1996).
Los alelos de cada marcador presentes en cada una
de las muestras se amplificaron mediante la Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR). Las secuencias de los primers específicos para
amplificar cada locus fueron tomadas a partir de la base de datos
Généthon (http://www.genethon.fr). Las amplificaciones se llevaron
a cabo en mezclas de reacción que contenían 120 ng de DNA, 10 mM
Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 0,1% Triton
X-100, 1,5 mM MgCl_{2}, Glicerol 10% (v/v), 50
picomoles de cada primer, 200 \muM de dNTP mix y 1 U de
Taq polimerasa, en un volumen final de 25 \mul. Las
amplificaciones se realizaron en termocicladores GeneAmp PCR System
2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, USA) y consistieron en
35 ciclos de desnaturalización (94ºC, 40 s) y primado (55ºC, 30s).
Una vez finalizado el último ciclo, un paso adicional de extensión
(72ºC, 2 min) completó el proceso de amplificación.
Las condiciones térmicas utilizadas en la
amplificación favorecieron la generación de homodúplexes y PAD.
Asimismo, el sistema electroforético utilizado para detectar los
homodúplexes y los PAD posibilitó mantener la presencia de
homodúplexes y PAD e inducir la formación de nuevos PAD (véase
apartado 5).
Los homodúplexes y los PAD generados a partir de
los productos de amplificación de cada una de las muestras se
separaron por medio de electroforesis no desnaturalizante en geles
ultrafinos de poliacrilamida utilizando un sistema de tampones
discontinuo borato/formato.
Los geles de poliacrilamida se elaboraron con un
grosor de 0,4 mm. Las dimensiones de los geles fueron 13,5 cm de
anchura por 20 cm de longitud para los loci D11S1760 y D11S909, y
13,5 cm de anchura por 24 cm de longitud para el resto de los
microsatélites analizados. El soporte utilizado para la
polimerización de los geles fue vidrio sencillo de 2 mm de grosor
tratado con Bind Silane (Pharmacia
17-1330-01). El tamaño de poro de
las mallas de poliacrilamida fue 7,7% T 6,3% C para los loci
D11S1760 y D11S909, y 6,7% T 7,1% C para el resto de microsatélites
analizados. La concentración total del monómero (% T) y la
concentración del monómero crosslinker (% C) se definen como
%T = [(a + b) / VT] 100%T = [a / (a +
b)] 100, siendo a y b los gramos de acrilamida y
piperacina di-acrilamida, respectivamente y
VT el volumen total de la solución del gel. El tampón del
gel empleado fue una solución 0,33 M TRIS, 110 mM ácido fórmico, 24
mM ácido bórico y 6% glicerol v/v (pH = 9,0). Para la
polimerización de la malla de poliacrilamida, se añadió persulfato
amónico 2,5 mM y 1,6 \mul de TEMED (Merck 1.10732) por mililitro
de solución del gel. Acto seguido, los geles se mantuvieron a 37ºC
en oscuridad durante 20 minutos antes de ser utilizados en las
electroforesis.
El tampón electrolítico se aplicó al gel mediante
dos tiras de secante (Blotting Paper, Sigma
P-7176) de 1 cm de anchura empapadas en una
solución 1 M TRIS y 0,28 M ácido bórico. Las tiras se dispusieron en
los extremos del gel y sobre ellas se colocaron los electrodos. La
distancia interelectrodo efectiva en los geles de 24 y 20 cm fue de
22 y 18 cm, respectivamente. Las soluciones con los productos de
amplificación se cargaron directamente sobre el gel a 0,5 cm de
distancia del cátodo. Para ello se utilizaron papeles de fibra de
vidrio (IEF sample appl. piece, Pharmacia Biotech
80-1129-46) de 3,3 x 2,5 mm,
impregnados con 3 \mul de cada solución. El voltaje y el tiempo
de recorrido utilizados para cada marcador variaron desde 600 V
hasta 700 V y de 2h 30 min a 4 h, respectivamente (véase tabla
adjunta). La intensidad y la potencia se mantuvieron constantes a
25 mA y 20 W. Las electroforesis se llevaron a cabo a una
temperatura constante de 15ºC en el sistema Multiphor II
(LKB Pharmacia), utilizando azul de bromofenol como indicador de
migración.
\dotable{\tabskip6pt\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Condiciones electroforéticas utilizadas para resolver cada
microsatélite \cr}
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|lcccccc|}\hline
Locus \+ D11S4177 \+ D11S1323 \+ D11S4124 \+ D11S1318 \+
D11S909 \+ D11S1760 \\ Voltaje \+ 700 V \+ 700 V \+ 700 V \+
600 V \+ 600 V \+ 600 V \\ Tiempo \+ 4 h \+ 3h 40min \+ 3h
15min \+ 3h 15min \+ 2h 45min \+ 2h 30min
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Una vez finalizada cada electroforesis, los
homodúplexes y los PAD se visualizaron mediante tinción con nitrato
de plata siguiendo el protocolo descrito por Budowle et al.
(1991).
El sistema electroforético utilizado para
detectar los homodúplexes y los PAD tiene características muy
ventajosas para reducir la probabilidad de errores de genotipado.
Por una parte, permite mantener los homodúplexes y los PAD
generados durante la PCR e inducir la formación de nuevos PAD, por
lo que es útil para detectar y/o prevenir errores de genotipado
mediante el método GEDAP. Por otra parte este sistema
electroforético también permite separar los productos de
amplificación de marcadores de naturaleza dinucleotídica con una
resolución de un nucleótido y con gran precisión en la
determinación del tamaño de los alelos. Por lo tanto, es útil para
prevenir errores de genotipado debidos tanto a la ausencia de
resolución de un nucleótido (Smith et al., 1995;
Schlótterer, 1998; Wenz et al., 1998) como a la existencia
de migraciones electroforéticas anormales entre los alelos de un
locus (Kimpton et al., 1995; Prinz et al., 1996).
La resolución y la precisión del sistema
electroforético se pone de manifiesto al representar gráficamente
el tamaño de los alelos frente a su movilidad relativa,
R(f), calculada como la relación entre la distancia de
migración desde el extremo anódico del punto de inserción de cada
muestra hasta la ``homoduplex band'' y la distancia desde el
extremo anódico del punto de inserción hasta el límite catódico de
migración. La figura 6 muestra la resolución y la precisión del
sistema electroforético, bajo las condiciones utilizadas para
resolver los alelos de los seis microsatélites analizados. Las
diferencias de Rf observadas entre las ``homoduplex bands'' con
diferencias de tamaño de 2 pares de bases, son suficientemente
grandes como para discriminar diferencias de un único par de bases.
De hecho, este sistema electroforético permite detectar diferencias
en tamaño de un único par de bases entre las ``homoduplex bands''
de un microsatélite de naturaleza dinucleotídica (D11S1759)
analizado en nuestro laboratorio (datos no mostrados).
En la figura 6 también se puede observar que este
sistema electroforético también proporciona una alta precisión para
determinar el tamaño de las ``homoduplex bands'' de microsatélites
de naturaleza dinucleotídica. Debe ser recordado que las anomalías
electroforéticas que provocan inexactitudes en la determinación del
tamaño de los alelos se caracterizan por la existencia de
``mobility shifts'', compresiones de bandas o migraciones anómalas
de las bandas (Prinz et al., 1996). Sin embargo, en la
figura 6 se puede observar que no existe ninguna evidencia de este
tipo de anomalías entre las ``homoduplex bands'' de los loci
analizados.
Por otra parte, las condiciones electroforéticas
fijadas en el sistema electroforético (condiciones no
desnaturalizantes, alta fuerza iónica, temperatura adecuada, etc.)
permiten mantener e inducir la presencia de homodúplexes y PAD
(figura 7, a). En este sentido, hay que destacar que las
condiciones electroforéticas inciden decisivamente en la detección
de PAD. La figura 7,b muestra cómo el uso de condiciones
desnaturalizantes y el empleo de una temperatura de recorrido de
50ºC provocan que únicamente se detecten las bandas de los alelos.
Este hecho es fácilmente explicable teniendo en cuenta que los PAD
son el resultado de la formación de complejos y/o de cambios
conformacionales de los productos de amplificación, y que el uso de
condiciones desnaturalizantes y una alta temperatura evitan la
hibridación de dos o más cadenas de ácidos nucleicos. Debe ser
recordado que ésta es la aproximación seguida por los métodos
convencionales de genotipado y que la presente invención se basa en
lo contrario, es decir, en estimular la formación de complejos y
cambios conformacionales para generar PAD.
Los homodúplexes y los PAD se identificaron a
partir de los patrones de bandas visualizados en los geles (figura
8).
Por una parte, este sistema electroforético
permitió la identificación de los homodúplexes y de los
PAD-AL a partir de la visualización de tres tipos
de bandas: ``homoduplex bands'', ``Diagnostic Shadow Bands'' (DSBs)
y ``stutter bands'' (figura 8). Estos tres tipos de bandas son
útiles para determinar qué alelo o alelos se han amplificado a
partir de cada una de las muestras analizadas.
Cada ``homoduplex band'' se forma a partir de
cada uno de los homodúplexes generados a partir de los alelos
amplificados. Las ``homoduplex bands'' se pueden diferenciar del
resto de las bandas porque generalmente tienen asociada una DSB y
al menos una ``stutter band''.
Las ``stutter bands'' se forman a partir de los
PAD-AL que se generan debido a la existencia de
errores en la amplificación de los alelos (concretamente debido al
``slippage'' de la Taq polimerasa). En este sistema
electroforético se visualizaron generalmente como una única banda
con una migración relativa dos pares de bases superior a la
migración de su correspondiente ``homoduplex band''. Cuando se
visualizaron mediante tinción con nitrato de plata, las ``stutter
bands'' presentaron una intensidad menor que la intensidad de sus
correspondientes ``homoduplex bands''.
Cada DSB se forma a partir de un
PAD-AL como consecuencia de un cambio
conformacional de un homodúplex. Las DSBs son fácilmente
diferenciables del resto de bandas porque tienen una migración
relativa menor que la de sus correspondientes ``homoduplex bands''.
Además, la distancia ``homoduplex band'' - DSB es prácticamente
constante dentro de cada locus. Asimismo, debe hacerse notar que la
distancia ``homoduplex band'' - DSB varía entre loci
(aproximadamente 4 pares de bases en D11S1760; 6 pb en D11S909; 8 pb
en D11S4177, D11S4124, y D11S1318; y 14 pb en D11S1323).
Por otra parte, este sistema electroforético
también permitió la identificación de los PAD-HOM y
de los PAD-HET, a partir de la visualización de dos
tipos de bandas: ``faint bands'' y ``heteroduplex bands'' (figura
8). Estos dos tipos de bandas son útiles para determinar si la
muestra analizada es homocigótica o es heterocigótica para un
microsatélite dado, de naturaleza dinucleotídica.
Las ``heteroduplex bands'' se forman a partir de
PAD-HET. Las ``heteroduplex bands'' son fácilmente
diferenciables del resto de bandas porque la distancia ``homoduplex
band'' - ``heteroduplex band'' es superior a la distancia
``homoduplex band'' - DSB.
Las ``faint bands'' se forman a partir de
PAD-HOM. Las ``faint bands'' son fácilmente
diferenciables del resto de bandas porque la distancia ``homoduplex
band'' - ``faint band'' es superior a la distancia ``homoduplex
band'' - DSB. Asimismo, la distancia ``homoduplex band'' - ``faint
band'' es generalmente inferior a la distancia ``homoduplex band''
``heteroduplex band''.
El método GEDAP nos permitió detectar y/o
prevenir un número relativamente elevado de errores de genotipado
debidos a no-amplificaciones totales o parciales.
Para ello, se utilizaron dos estrategias distintas: una estrategia
para detectar errores de genotipado y una estrategia para prevenir
errores de genotipado. Ambas estrategias se basaron en el análisis
conjunto de las bandas descritas en el apartado anterior. A
continuación se muestra cómo se aplicaron estas dos estrategias
para genotipar los seis microsatélites de naturaleza
dinucleotídica. La eficiencia del método se evaluará posteriormente
(ver apartado 7).
El método GEDAP nos permitió detectar errores de
genotipado debidos a no-amplificaciones totales o
parciales. Los errores de genotipado se detectaron a partir de
muestras con patrones de bandas anómalos. Fueron considerados
patrones de bandas anómalos:
- (a)
- aquellos patrones de bandas con una única ``homoduplex band'' y ninguna ``faint band'' (figura 9, B). Compárese con el patrón de bandas esperado específico de un genotipo homocigoto (figura 9, A).
- (b)
- aquellos patrones de bandas con una única ``homoduplex band'' y al menos una ``heteroduplex band'' (figura 9, C). Compárese con el patrón de bandas esperado específico de un genotipo heterocigoto (figura 9, D).
Para detectar errores de genotipado, analizamos
los patrones de bandas de los 405 individuos no relacionados (un
tamaño muestral lo suficientemente grande como para detectar la
posible ocurrencia de errores de genotipado) y realizamos réplicas
de todas las muestras aparentemente homocigóticas que carecían de
``faint bands'' o que presentaban al menos una ``heteroduplex
band'' en sus correspondientes patrones de bandas. Las réplicas se
realizaron hasta que se observó claramente la presencia de las
``faint bands'' o la presencia de un patrón de bandas
correspondiente a un genotipo heterocigoto.
Los resultados obtenidos a partir de las réplicas
confirmaron, por una parte, que un elevado porcentaje de las
muestras aparentemente homocigóticas que carecían de ``faint
bands'' en sus patrones de bandas eran en realidad muestras
heterocigóticas, en las que había habido una
no-amplificación total de uno de sus dos alelos. Por
lo tanto, el método GEDAP es útil para detectar errores de
genotipado debidos a no-amplificaciones totales. La
tasa de errores de genotipado detectados por medio de esta
estrategia varió entre un 0% (D11S1323 y D11S1760) y un 2%
(D11S909). Los errores de genotipado detectados afectaron a
distintos individuos en cada uno de los loci: individuos 37, 39,
57, 62, 263, 351 y 398 (D11S4177); individuos 104, 311 y 400
(D11S4124); individuo 134 (D11S1318); e individuos 48, 80, 216, 281
y 289 (D11S909). Al considerar los seis loci, el porcentaje de
errores de genotipado detectados fue del 5% (19/405). Es importante
subrayar que el porcentaje de genotipos multiloci tipados
erróneamente puede verse notablemente incrementado en estudios en
los que se requiere analizar un gran número de marcadores
(e.g. en el caso de los ``genome scans'').
Por otra parte, los resultados obtenidos a partir
de las réplicas también confirmaron que las muestras aparentemente
homocigóticas que presentaban al menos una ``heteroduplex band'' en
sus patrones de bandas eran en realidad muestras heterocigóticas en
las que había habido no-amplificación total o
parcial de uno de sus dos alelos. Por lo tanto, el método GEDAP
también es útil para detectar errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones parciales.
El método GEDAP también nos permitió prevenir
errores de genotipado. Para ello se utilizaron dos aproximaciones
distintas: una aproximación para prevenir errores en el genotipado
de muestras heterocigóticas y una aproximación para prevenir
errores en el genotipado de muestras homocigóticas.
La aproximación utilizada para prevenir errores
en el genotipado de muestras heterocigóticas consistió en asignar
un genotipo heterocigoto a una muestra, únicamente cuando el
sistema electroforético generó un patrón de bandas en el que se
detectaron dos ``homoduplex bands'' y:
- (a)
- al menos una ``heteroduplex band''; y/o
- (b)
- al menos una DSB asociada con cada una de las ``homoduplex bands'' y/o
- (c)
- al menos una ``stutter band'' asociada con cada una de las ``homoduplex bands''.
La reproducción de los patrones de bandas de
muestras heterocigóticas a partir de la mezcla de los DNAs de
muestras homocigóticas antes de la PCR y el análisis de los
patrones de bandas de los 405 individuos no relacionados, nos
permitieron confirmar que la presencia de las bandas mencionadas en
el párrafo anterior es suficiente para determinar que el genotipo
de una muestra es heterocigoto. Por otra parte, el uso de esta
aproximación nos permitió prevenir un número relativamente elevado
de errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones parciales. A continuación se
describen en detalle los datos experimentales que confirman ambas
aseveraciones.
En la figura 10 se ilustra cómo se pueden
prevenir errores en el genotipado de muestras heterocigóticas
debidos a no-amplificaciones parciales, en base al
análisis conjunto de las bandas generadas por el sistema
electroforético. En concreto, se muestra el patrón de bandas del
genotipo heterocigoto para los alelos 90 y 84 del locus D11S1760 en
ausencia (figura 10, B) y en presencia (figura 10, A y C) de
no-amplificación parcial. El patrón de bandas de
dicho genotipo se reprodujo mediante PCR bajo condiciones
inductoras de no-amplificación parcial (figura 10, A
y C). Dichas condiciones consistieron en mezclar de los DNAs de dos
individuos heterocigotos en proporciones desiguales y realizar la
amplificación a partir de los DNAs mezclados.
Los resultados obtenidos, tras inducir la
no-amplificación parcial de uno de los dos alelos
del genotipo heterocigoto, evidenciaron una diferencia sustancial
en la intensidad de las ``homoduplex bands'' generadas a partir de
los dos alelos (figura 10 , A y C). Atendiendo únicamente a las
``homoduplex bands'' (hecho en el que se basan los métodos
convencionales de genotipado), la diferencia en la intensidad de
ambas bandas podría provocar un error de genotipado. Sin embargo,
el método GEDAP permite prevenir esos errores de genotipado. Ello
se debe a que tanto las ``heteroduplex bands'' específicas del
genotipo 90/84, como las DSBs y las ``stutter bands'' asociadas con
las ``homoduplex bands'' generadas a partir de los alelos 90 y 84,
están presentes en los patrones de bandas obtenidos tras inducir la
no-amplificación parcial de cada uno de los alelos
de este genotipo. Por tanto, esas bandas son útiles para prevenir
errores en el genotipado de muestras heterocigóticas debidos a
no-amplificación parcial.
El uso de esta aproximación en el análisis de la
muestra de 405 individuos no relacionados nos permitió prevenir
errores de genotipado debidos a la no-amplificación
parcial de uno de los alelos, en un número relativamente elevado de
muestras heterocigóticas. Por ejemplo, en muestras heterocigóticas
para el locus D1154177 que presentaron el alelo 183 y otro alelo de
mayor tamaño, el alelo 183 mostró frecuentemente una amplificación
preferencial con respecto a los alelos de mayor tamaño. De forma
análoga, se han podido prevenir errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones parciales en muestras
heterocigóticas para alelos con menores diferencias en tamaño, en
los seis loci analizados. Por lo tanto, el método GEDAP es útil
para prevenir errores de genotipado debidos a
no-amplificaciones parciales.
Sin embargo, es importante destacar que la
aproximación utilizada por el método GEDAP para genotipar muestras
heterocigóticas no debe ser utilizada para genotipar muestras
homocigóticas. Es decir, la ausencia de ``heteroduplex bands'' y/o
dos ``stutter bands'' y/o dos DSBs correspondientes a dos
``homoduplex bands'' no es suficiente para establecer que el
genotipo de una muestra es homocigoto. Por el contrario, genotipar
microsatélites de naturaleza dinucleotídica teniendo en cuenta
únicamente la estrategia de genotipado de muestras heterocigóticas
puede incrementar la tasa de errores de genotipado porque, como se
ha demostrado con anterioridad, los patrones de bandas de muestras
heterocigóticas carecen de ``heteroduplex bands'' cuando existe
no-amplificación total. Por tanto, es necesario el
uso de una aproximación distinta para prevenir errores en el
genotipado de muestras homocigóticas.
La aproximación utilizada por el método GEDAP
para prevenir errores en el genotipado de muestras homocigóticas
consistió en asignar un genotipo homocigoto a una muestra
únicamente cuando el sistema electroforético generó un patrón de
bandas en el que se detectaron una única ``homoduplex band'' y al
menos una ``faint band''.
Los resultados obtenidos a partir del análisis de
los patrones de bandas de los individuos relacionados y no
relacionados mostraron que las ``faint bands'' siempre aparecen en
patrones de bandas en los que se detecta una única ``homoduplex
band'', a excepción de los patrones de bandas de muestras
heterocigóticas en las que existe no-amplificación
total de uno de los alelos (ver apartado 6.1). Por lo tanto, la
presencia de las ``faint bands'' representa un nivel adicional de
control para prevenir errores de genotipado consistentes en asignar
un genotipo homocigoto a muestras que en realidad son
heterocigóticas.
La eficiencia se determinó estadísticamente
testando si las frecuencias genotípicas observadas en la muestra de
405 individuos no relacionados se desvían significativamente de las
proporciones genotípicas esperadas bajo
Hardy-Weinberg (HWP).
Las desviaciones de las HWP para cada locus y
para cada alelo y su significación se estimaron siguiendo el
procedimiento y los estadísticos descritos por Robertson y Hill
(1984). Los resultados obtenidos mostraron que las frecuencias
genotípicas observadas concuerdan con las frecuencias genotípicas
esperadas en cada uno de los loci, no detectándose ninguna
desviación significativa de las HWP (ver tabla adjunta).
\newpage
Desviaciones de las HWP para cada locus
(\underline{f_{T}}) y su significación
(X^{2})
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|ccccc|}\hline
Locus \+ Het.Obs. \+ Het.Esp. ^{a} \+ f _{T}\pm S.E. \+
X ^{2} (g.l. = 1) \\\hline D11S4177 \+ 0.795 \+ 0.788 \+
0.005 \pm 0.020 \+ 0.12 \\ D11S1323 \+ 0.625 \+ 0.617 \+
0.001 \pm 0.018 \+ 0.01 \\ D11S4124 \+ 0.723 \+ 0.710 \+
0.001 \pm 0.018 \+ 0.00 \\ D11S1318 \+ 0.817 \+ 0.805 \+
-0.001 \pm 0.011 \+ 0.01 \\ D11S909 \+ 0.723 \+ 0.738 \+
0.024 \pm 0.039 \+ 2.51 \\ D11S1760 \+ 0.807 \+ 0.782 \+
-0.015 \pm 0.000 \+ 1.03
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{a}La heterocigosis esperada insesgada se
calculó por medio de la
ecuación
Por otra parte, sólo uno de los 68 alelos
observados se desvió significativamente de las HWP (datos no
mostrados). Esta desviación significativa se puede explicar
simplemente por la existencia de un error de tipo I, por lo que las
frecuencias genotípicas observadas para cada alelo también son
consistentes con las HWP. Además, las desviaciones detectadas
mediante el estadístico f fueron pequeñas y no sistemáticas.
En conclusión, no existen evidencias de una presencia significativa
de no-amplificaciones que conduzcan al genotipado de
muestras heterocigóticas como homocigóticas. Por lo tanto, los
resultados obtenidos mediante este análisis confirman que el método
GEDAP es eficiente para detectar y/o prevenir errores de genotipado
debidos a no-amplificaciones totales o
parciales.
En el siguiente ejemplo se ilustra la utilidad
del método GEDAP para identificar individuos humanos de forma
precisa. En concreto, se muestra cómo permite la prevención de
falsas exclusiones de parentesco.
Esta aplicación se pone en evidencia a partir del
genotipado, en individuos caucasoides relacionados biológicamente,
de los seis microsatélites de naturaleza dinucleotídica utilizados
en el ejemplo 1.
La extracción del DNA de los individuos
relacionados, la amplificación de los marcadores y la generación,
detección e identificación de los homodúplexes y PAD se realizaron
de acuerdo con los apartados 1, 2, 3, 4 y 5 del ejemplo 1.
La figura 11 muestra un resultado no mendeliano
para el marcador D 11S1760. En base a los métodos convencionales de
genotipado (es decir, atendiendo únicamente a las ``homoduplex
bands'' generadas a partir de los alelos en cada uno de los
individuos), se podría concluir que dos de los hijos del individuo
A (individuos B y C), no son hijos biológicos de dicho individuo. En
concreto, el individuo A sólo presentó una ``homoduplex band''
(generada a partir del alelo 84) y sus correspondientes bandas
asociadas: una DSB y una ``stutter band''. Por tanto, los métodos
convencionales de genotipado determinarían que el genotipo de este
individuo es homocigoto 84/84. De ser éste el genotipo real del
individuo A, este individuo debería transmitir necesariamente un
alelo 84 a cada uno de sus hijos. Sin embargo, los individuos B y C
no evidenciaron en su patrón de bandas ninguna ``homoduplex band''
generada a partir del alelo 84. Por el contrario, ambos presentaron
el patrón de bandas característico de un genotipo 94/90, es decir,
dos ``homoduplex bands'' (generadas a partir de los alelos 94 y 90,
respectivamente), las correspondientes DSBs y ``stutter bands''
asociadas con ambas ``homoduplex bands'', y tres ``heteroduplex
bands'' características del genotipo 94/90.
Sin embargo, el método GEDAP permitió descartar
esta posible exclusión de parentesco y demostrar que el aparente
resultado no mendeliano era debido en realidad a ocurrencia de
no-amplificación total de un alelo en el individuo
A. En concreto, el análisis del patrón de bandas del individuo A
mediante el método GEDAP evidencia que dicho patrón es un patrón de
bandas anómalo en el que se detecta una única ``homoduplex band'' y
no se detecta ninguna ``faint band'' (figura 11, A. Compárese con
los patrones de bandas de las muestras D y 54, que sí presentaron
las ``faint bands'' específicas del genotipo 84/84). Como se
demostró en el ejemplo 1, la presencia de este patrón de bandas
anómalo es un fuerte indicativo de no-amplificación
total. Para testar esta posibilidad, realizamos tres réplicas de
cada uno de los miembros de esta familia (figura 12). Las tres
réplicas confirmaron que el aparente problema de parentesco
detectado inicialmente era en realidad un error de genotipado del
individuo A debido a la no-amplificación total del
alelo 90. Este hecho se vio confirmado con el análisis de los 5
marcadores restantes analizados.
Por lo tanto, el método GEDAP es útil para
detectar y prevenir eficientemente falsas exclusiones de
parentesco. De hecho, el método GEDAP también permitió descartar
una nueva aparente exclusión de paternidad observada a partir de
dos de las réplicas del individuo B (B2 y B3, figura 12). En ambas
réplicas, los patrones de bandas generados a partir de este
individuo sólo presentaron el homodúplex correspondiente al alelo 94
(ausente en la madre). Sin embargo, ambos patrones también fueron
anómalos (ya que no se detectaron ``faint bands''), por lo que, al
igual que en el caso anterior, el Método GEDAP también permitió
determinar que esas aparentes falsas exclusiones son en realidad el
resultado de la no-amplificación total del alelo
90.
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Claims (21)
1. Método GEDAP (Genotyping Based on Diagnostic
Amplification Products) para detectar y/o prevenir errores de
genotipado a partir de los productos de amplificación de un locus
polimórfico. El método comprende las siguientes etapas:
(a) amplificar una secuencia de ácido nucleico
procedente de una o más células eucariotas
(b) realizar la amplificación bajo condiciones
que induzcan la generación de:
- (b.1) homodúplexes de los alelos amplificados (abreviadamente homodúplexes)
- (b.2) otros Productos Adicionales con valor Diagnóstico (abreviadamente PAD)
(c) someter los productos de amplificación a
condiciones que favorezcan:
- (c.1) mantener los homodúplexes y los PAD generados y, en su caso, la generación de nuevos PAD
- (c.2) detectar los homodúplexes y los PAD
(d) realizar el genotipado a partir del análisis
conjunto de los homodúplexes y los PAD.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado por la amplificación de al menos uno de los
alelos del locus de interés por cualquier procedimiento, tal como
la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
3. Uso del método, según la reivindicación 1,
para detectar errores de genotipado provocados por
no-amplificaciones totales o parciales de al menos
uno de los alelos. En la no-amplificación total o
parcial se incluyen la amplificación preferencial, el "allele
dropout" y los alelos nulos.
4. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado en la etapa (b) por realizar la amplificación
mediante cualquier procedimiento que induzca la generación de
homodúplexes y PAD, tal como cualquier sistema de amplificación que
permita la desnaturalización de ácidos nucleicos de doble cadena y
su posterior renaturalización.
5. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado en la etapa (c.1.) por someter los productos
de amplificación a condiciones experimentales que mantengan los
homodúplexes y los PAD generados, incluidas las condiciones nativas
o no desnaturalizantes.
6. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado en la etapa (c.1) por someter los productos de
amplificación a cualquier condición experimental que permita
inducir, en su caso, la generación de nuevos PAD, tal como la
desnaturalización por cualquier procedimiento físico, químico o
biológico desnaturalizante (desnaturalización térmica,
desnaturalización electroquímica mediante la aplicación de voltaje,
el uso de enzimas y agentes desnaturalizantes tales como
formamida, urea y EDTA), y posterior renaturalización.
7. Método, según la reivindicación 6,
caracterizado por someter los productos de amplificación a
condiciones experimentales, tales como cambios en la temperatura,
cambios en la concentración de sales, cambios en el pH y cambios en
la concentración de iones divalentes.
8. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado en la etapa (c.2) por la detección de los
homodúplexes y los PAD, a través de la utilización de cualquier
procedimiento técnico tal como la electroforesis no
desnaturalizante, la espectrometría de masas, la cromatografía, la
hibridación diferencial y la secuenciación por hibridación.
9. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado en la etapa (d) por realizar el genotipado a
partir del análisis conjunto de los homodúplexes y los PAD
presentes y ausentes, mediante cualquier procedimiento manual o
cualquier procedimiento mecánico. En los PAD se incluyen los
productos característicos o específicos de los homocigotos
(abreviadamente PAD-HOM), heterocigotos
(abreviadamente PAD-HET) y de cada alelo
(abreviadamente PAD-AL).
10. Método, según las reivindicaciones 1, 4, 5 y
6, caracterizado por la utilización de Productos Adicionales
que son diferentes a los homodúplexes generados a partir de los
alelos de la muestra. Específicamente, son Productos
Adicionales:
- (a)
- cualquier ácido nucleico de cadena sencilla con una secuencia distinta a las secuencias de las cadenas de los alelos amplificados a partir de la muestra
- (b)
- cualquier ácido nucleico de doble cadena con una secuencia distinta a las secuencias de los homodúplexes generados a partir de los alelos de la muestra
- (c)
- cualquier ácido nucleico de doble cadena constituido por cadenas no totalmente complementarias
- (d)
- cualquier producto de amplificación que resulte de la interacción entre al menos una cadena sencilla generada durante la amplificación y al menos un componente de la mezcla de reacción utilizada para la amplificación
- (e)
- cualquier producto de amplificación que resulte de la interacción entre al menos una cadena sencilla generada durante la amplificación y al menos un componente del sistema utilizado para la detección de los productos de amplificación
- (f)
- cualquier producto de amplificación resultado de la hibridación de tres o más cadenas generadas durante la amplificación
- (g)
- cualquier cambio conformacional de cualquiera de los homodúplexes
- (h)
- cualquier cambio conformacional de cualquiera de los productos adicionales
- (i)
- cualquier producto de amplificación que resulte de la interacción entre al menos un homodúplex y al menos un Producto Adicional
- (j)
- cualquier producto de amplificación que resulte de la interacción entre al menos dos homodúplexes
- (k)
- cualquier producto de amplificación que resulte de la interacción entre al menos dos Productos Adicionales.
11. Método, según la reivindicación 9,
caracterizado por realizar el genotipado a partir del
análisis conjunto de los homodúplexes y los PAD presentes y
ausentes mediante cualquier procedimiento mecánico, incluido el uso
de cualquier tipo de soporte o programa informático.
12. Método, según las reivindicaciones
anteriores, caracterizado por detectar y/o prevenir errores
de genotipado debidos a no-amplificaciones
parciales o totales de loci microsatélites de naturaleza
dinucleotídica, mediante a) la separación de los productos de
amplificación por electroforesis no desnaturalizante, y b) el
análisis conjunto del patrón de bandas que corresponde a los
homodúplexes ("homoduplex bands") y los PAD-HOM
("faint bands"), PAD-HET ("heteroduplex
bands") y PAD-AL ("diagnostic shadow bands"
y "stutter bands") presentes o ausentes.
13. Método, según la reivindicación 12,
caracterizado por incluir la separación de los productos de
amplificación mediante un sistema electroforético horizontal en
geles ultrafinos de poliacrilamida que contienen glicerol y una
concentración del "crosslinker" piperacina
di-acrilamida superior al 5%, utilizando
condiciones no desnaturalizantes, un sistema de tampones discontinuo
borato/formato con una alta fuerza iónica y una temperatura durante
la electroforesis inferior a 50°C.
14. Método, según la reivindicación 13, en el que
el sistema se caracteriza por permite resolver bandas que se
diferencian entre sí en un par de bases, en un rango de tamaños
comprendido, al menos, entre 70 y 220 pares de bases.
15. Método, según la reivindicación 13, en el que
el sistema permite identificar "stutter bands", con las
siguientes propiedades:
- (a)
- se asocian con cada una de las "homoduplex bands"
- (b)
- migran más que sus correspondientes "homoduplex bands"
- (c)
- su intensidad disminuye gradualmente a medida que se incrementa la distancia "stutter band" - "homoduplex band".
16. Método, según la reivindicación 13, en el que
el sistema permite identificar "diagnostic shadow bands", con
las siguientes propiedades:
- (a)
- se asocian con cada una de las "homoduplex bands"
- (b)
- migran menos que sus correspondientes "homoduplex bands"
- (c)
- migran más que las "faint bands" o las "heteroduplex bands" generadas a partir de los productos de amplificación de la muestra
17. Método, según la reivindicación 13, en el que
el sistema permite identificar "faint bands", con las
siguientes propiedades:
- (a)
- migran menos que las correspondientes "homoduplex bands" y que las "diagnostic shadow bands"
- (b)
- generalmente se detectan si existe una única "homoduplex band"
18. Método, según la reivindicación 13, en el que
el sistema permite identificar "heteroduplex bands", con las
siguientes propiedades:
- (a)
- migran menos que las correspondientes "homoduplex bands" y que las "diagnostic shadow bands"
- (b)
- generalmente se detectan si existe más de una "homoduplex band"
19. Uso del método, según las reivindicaciones
anteriores, para detectar y/o prevenir errores de genotipado
debidos a no-amplificaciones parciales o totales en
muestras diploides o poliploides.
20. Uso del método, según las reivindicaciones
anteriores, para detectar y/o prevenir errores de genotipado a
partir de los productos de amplificación de más de un locus y/o en
el genotipado a gran escala ("high throughput genotyping"), lo
que incluye el uso de cualquier sistema parcial o totalmente
automatizado.
21. Uso del método, según las reivindicaciones
anteriores, en aplicaciones tales como la diagnosis de
enfermedades, la genética preimplantacional, los tests de
paternidad, los análisis forenses, la terapia génica, el transplante
de tejidos y órganos, la farmacogenética, la genética de
poblaciones, el mapado genómico y la genética epidemiológica.
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