EP4713470A1

EP4713470A1 - Verfahren zur herstellung von d-talitol, d-tagatose und d-psicose

Info

Publication number: EP4713470A1
Application number: EP24725218.2A
Authority: EP
Inventors: Nicole STAUNIG; Maria Dupont; Melanie Trobe
Original assignee: Annikki GmbH
Current assignee: Annikki GmbH
Priority date: 2023-05-15
Filing date: 2024-05-15
Publication date: 2026-03-25
Also published as: AR132695A1; WO2024236043A1

Abstract

Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Talitol, indem aus D-Fructose, welche in einer wässerigen Lösung gelöst vorliegt, durch Behandeln mit einer Epimerase in vitro D-Psicose gebildet wird, wonach die D-Psicose durch Behandeln mit einer NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase in vitro zu D-Talitol reduziert wird. Das in der wässerigen Lösung enthaltene D-Talitol kann auf einfache Weise durch Behandeln mit einer Oxidoreduktase zu D-Tagatose oder D-Psicose oxidiert werden.

Description

Verfahren zur Herstellung von D-Talitol, D-Tagatose und D-Psicose

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von D-Talitol. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Tagatose oder D-Psicose.

Hintergrund der Erfindung

Der sechswertige Zuckeralkohol D-Talitol (auch bekannt als D-Altritol) gehört aufgrund seines geringen natürlichen Vorkommens (z.B. in Braunalgen wie Himanthalia elongata (Reed et al., 1995)) zu den sogenannten seltenen Zuckern. Aufgrund des Fehlens einer einfachen Herstellungsmethode für den Zuckeralkohol sind die Anwendungsmöglichkeiten von D-Talitol nicht gut untersucht (Li et al., 2013).

In der sogenannten Izumoring-Strategie nimmt D-Talitol eine wichtige Rolle ein, da dessen Oxidation zu den Ketohexosen D-Tagatose und D-Psicose sowie zu den Aldohexosen D-Altrose und D-Talose führt, die ebenfalls zu den seltenen Zuckern gezählt werden (Izumori, 2006).

D-Tagatose findet sich unter anderem im Gummi des Tropenbaums Sterculia setigera (Hirst et al., 1949), in der Flechte Roccella (Lindberg, 1955) und in stark erhitzter Milch (Adachi, 1958). D-Psicose konnte in den Blättern von Rosmarinweiden (Itea sp.) nachgewiesen werden (Hough & Stacey, 1963), findet sich aber auch in verarbeiteten Lebensmitteln wie Konfekt und Gewürzsaucen, wo sie unter Einwirkung von Hitze aus D-Fructose, ihrem C3-Epimer, entsteht (Oshima et al., 2006).

Sowohl D-Tagatose als auch D-Psicose zeichnen sich durch ihren süßen Geschmack bei einem deutlichen geringeren Energiegehalt (bezogen auf Saccharose) aus (Jiang et al., 2020; Oh, 2007; Roy et al., 2018), was beide Zucker als Süßungsmittel für die Lebensmittelindustrie besonders interessant macht.

D-Tagatose und D-Psicose sind als Generally Recognized as Safe (GRAS)-Süßungsmittel von der US- amerikanischen Lebensmittelaufsichtsbehörde Food and Drug Administration (FDA) zugelassen, in der Europäischen Union hingegen findet sich nur D-Tagatose auf der sogenannten Novel Foods-Liste und darf damit in der EU als Süßungsmittel verwendet werden (Levin, 2002; Ahmed et al., 2022).

D-Tagatose kann auch als Fungizid eingesetzt werden - so inhibiert sie den D-Mannose-Metabolismus von Pilzen und Oomyceten und wirkt damit gegen den Falschen Mehltau (Mochizuki et al., 2020). US 10638752 B2 sowie Chahed et al. (2021) beschreiben den Einsatz von D-Tagatose gegen diverse Erreger von Pflanzenkrankheiten. D-Psicose beeinflusst den Lipid-Stoffwechsel sowie den Kohlenhydrat-Stoffwechsel (z.B. antidiabetisch) positiv und wirkt entzündungshemmend sowie antioxidativ (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020; Chen et al., 2022).

Zur Herstellung von D-Tagatose existieren einige chemische oder biotechnologische Routen wie z.B. die baseninduzierte Isomerisierung von D-Galactose gewonnen aus Lactose (EP 0518874 Bl; US 9150938 B2; US 8802843 B2), die enzymatische Isomerisierung von D-Galactose mittels L-Arabinose- Isomerase (Heath et al., 1958; Oh, 2007; Roy et al., 2018), die Herstellung ausgehend von Mono-, Di-, Oligo- oder Polysacchariden über phosphorylierte Intermediate mit der C4-Epimerisierung von D-Fructose-6-phosphat zu D-Tagatose-6-phosphat als Hauptschritt (EP 3322803 Bl; US 10138506 B2; US 11034988 B2; Dai et al., 2020; Lee et al., 2017) oder die Oxidation des Zuckeralkohols Galactitol mit Galactitol-2-Dehydrogenase (EC 1.1.1.16) (Roy et al., 2018; Shaw, 1956).

D-Tagatose kann durch C4-Epimerisierung direkt aus D-Fructose hergestellt werden. Durch gezielte Optimierungen des Enzyms Tagaturonat-3-Epimerase aus Thermotoga petrophila konnte eine Tagatose-4-Epimerase (T4E) entwickelt werden, welche 213 g/l D-Tagatose aus 700 g/l D-Fructose in 2 h bei 80 °C in Anwesenheit von 1,5 mM Ni²⁺ produzierte (Shin et al., 2020). Auch weitere aus thermophilen Mikroorganismen stammende Epimerasen sind bekannt (z.B. EP 3006568 Bl; EP 3211078 Bl; US 10196626 B2; US 11180785 B2; US 11408017 B2; EP 3677675 Al), diese benötigen aber auch erhöhte Reaktionstemperaturen (> 50 °C) und Zusatz von Zn-, Ni- oder Mn-Ionen für eine optimale Aktivität.

In einer aktuellen Studie wurden Tagatose-4-Epimerasen aus Thermotoga neapolitana sowie aus Kosmotoga olearia getestet. Dazu wurden diese in Corynebacterium glutamicum exprimiert und in Form von Ganzzell-Biokatalysatoren eingesetzt. Auf diese Weise konnten Umsätze von 13,8% D-Tagatose (T4E aus T. neapolitana) bzw. 14,4% D-Tagatose (T4E aus K. olearia; 21,7% nach Codon- Optimierung) erreicht werden (30 g/l D-Fructose als Substrat, 60 °C für 2,5 h), jedoch müssen ebenfalls Schwermetallsalze (1 mM NiSCU für T. neapolitana und 3 mM COSO4 für K. olearia) zugesetzt werden (Jeon et al., 2023).

Da es sich bei D-Tagatose um ein Süßungsmittel handelt, sind Schwermetallionen im fertigen Produkt unerwünscht. Die höheren Reaktionstemperaturen sowie der nicht vollständige Umsatz sind weitere Nachteile der C4-Epimerisierung.

D-Psicose wiederum kann durch Epimerisierung von D-Fructose mit einer Ketose-3-Epimerase gewonnen werden (Izumori et al., 1993). Ketose-3-Epimerasen lassen sich je nach Substratspezifität in drei Gruppen einteilen: 1) D-Tagatose-3-Epimerase (DTE), 2) D-Psicose-3-Epimerase (DPE) oder D-Allulose-3-Epimerase (DAE) und 3) L-Ribulose-3-Epimerase (LRE) (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020).

Die Umsetzung von D-Fructose zu D-Psicose mittels Ketose-3-Epimerasen läuft jedoch nicht vollständig ab, vielmehr bildet sich ein Gleichgewichtsverhältnis zwischen beiden Epimeren aus. Je nach Reaktionsbedingungen (Temperatur zwischen 40 und 70 °C, pH-Wert zwischen 6 und 11) liegt dieses zwischen 80:20 und 62,5:37,5 (D-Fructose : D-Psicose). Viele der Epimerasen benötigen außerdem ein zweiwertiges Metailion wie Mn²⁺ oder Co²⁺ (toxisch) als Kofaktor (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020).

Die bei der Epimerisierung von D-Fructose entstehenden D-Fructose/D-Psicose-Mischungen müssen entweder durch chromatographische Verfahren oder durch die „biologische Methode" (Fermentation der überschüssigen D-Fructose zu z.B. Ethanol) getrennt werden (Jiang et al., 2020). In US 2021/0189441 Al wird die überschüssige D-Fructose durch einen probiotischen Mikroorganismus (Lactobacillus oder Saccharomyces) in L-Milchsäure umgewandelt. EP 3423460 Bl beschreibt ein Verfahren mit lonenaustausch und kontinuierlicher Chromatographie zur Aufreinigung einer D-Fructose/D-Psicose-Mischung und zur Gewinnung hochreiner D-Psicose. EP 3553069 Al sowie Van Duc Long et al. (2009) legen eine Methode zur Trennung von D-Psicose und D-Fructose basierend auf der Simulated Moving Bed-Chromatographie offen.

Zur Herstellung von D-Psicose existieren noch einige weitere biotechnologische Routen wie z.B. die Herstellung ausgehend von Mono-, Di-, Oligo- oder Polysacchariden über phosphorylierte Intermediate mit der C3-Epimerisierung von D-Fructose-6-phosphat zu D-Psicose-6-phosphat als Hauptschritt (Li et al., 2021; US 11168342 B2; US 10907182 B2) oder die Aldol-Reaktion von Dihydroxyacetonphosphat und D-Glyceraldehyd mit anschließender Dephosphorylierung von D-Psicose-l-phosphat (Wang et al., 2020; Li et al., 2020).

Die unvorteilhafte Lage des Gleichgewichts der Epimerisierung von D-Fructose zu D-Psicose kann auch durch nachgeschaltete Reaktionen günstig beeinflusst werden. Eine Möglichkeit ist die gezielte Phosphorylierung von D-Psicose zu D-Psicose-l-phosphat mit L-Rhamnulose-Kinase und anschließender Dephosphorylierung mit einer sauren Phosphatase (Xiao et al., 2019). Der Nachteil an diesem Verfahren ist der stöchiometrische Verbrauch des teuren Phosphat-Donors Adenosintriphosphat (ATP).

Eine Alternative dazu ist die Kombination der Epimerase mit einer Ribitol-Dehydrogenase (RDH) und Formiat-Dehydrogenase (FDH; oxidiert Formiat zu CO2) als Regenerationsenzym für den Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotid (NADH), mit der D-Fructose über D-Psicose zu Allitol umgewandelt wird (Takeshita et al., 2000). Durch einen anschließenden Oxidationsschritt kann Allitol wieder zu D-Psicose umgesetzt werden.

Wang et al. (2023) beschreiben ein System bestehend aus zwei E. co//-Ganzzell-Biokatalysatoren zur Umwandlung von D-Fructose (90 g/l) zu D-Psicose mit einem Umsatz von 90%. Im ersten Schritt (Umsetzung von D-Fructose zu Allitol) wurden E. co//-Zellen, welche eine DPE aus Clostridiales, eine RDH aus Providentia alcalifaciens, eine FDH aus Starkeya sowie eine weitere DPE aus Rhizobium straminoryzae beinhalteten, verwendet. Auf diese Weise wurde D-Fructose (500 mM = 90 g/l) innerhalb von 12 h bei 37 °C und pH 6 unter Einsatz von 1000 mM Natrium-Formiat (zwei Äquivalente bezogen auf D-Fructose) zu 452 mM Allitol umwandelt (Umsatz 90,4%). Als Nebenprodukt entstand ca. 30 mM D-Sorbitol (das Reduktionsprodukt der D-Fructose). Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und ausgetretene Proteine im Allitol-haltigen Überstand wurden durch Hitzeeinwirkung deaktiviert. Danach wurden E. co//-Zellen, welche eine RDH aus Rubrivivax sp. und eine NADH-Oxidase aus Streptococcus pyogenes beinhalteten, zur Allitol-Lösung zugesetzt. Allitol (452 mM) wurde innerhalb von 24 h bei pH 7 zu D-Psicose (450 mM) und das Nebenprodukt D-Sorbitol wurde wieder zu D-Fructose oxidiert. Der Gesamtumsatz des Verfahrens betrug also 90%.

Izumori (2002) beschreibt in einem Artikel eine Toolbox bestehend aus einer Epimerase (D-Tagatose- 3-epimerase) sowie Oxidoreduktasen zur Bioproduktion von Ketohexosen mit den Hexitolen als Intermediaten (bekannt als Izumoring-Strategie). Die in dem Artikel angeführten Beispiele zur Produktion von Hexitolen aus Ketohexosen und umgekehrt verwenden ausschließlich mikrobielle Zellen als Katalysatoren (Izumori, 2002).

Durch heterogen-katalytische Hydrierung von D-Psicose an Raney-Nickel oder Metallen der Platingruppe wird eine Mischung der Epimere Allitol und D-Talitol erhalten, die chromatographisch getrennt werden muss (US 2004/0143024 Al). Im Gegensatz dazu erlaubt die Verwendung von Mikroorganismen die stereoselektive Reduktion von Ketosen zu Zuckeralkoholen (bevorzugte Bildung eines der beiden Epimere).

Generell kann gesagt werden, dass in den letzten Jahren bei Bioproduktionsprozessen ein Trend zu Ganzzellverfahren (mikrobielle und fermentative Verfahren) hingeht (vgl. Wang et al., 2023) besteht. So weisen isolierte (Uronat-)Dehydrogenasen („in vitro") laut Boverio et al. (2023) „inhärente Nachteile" auf und ein industrieller Einsatz wird von Vastano et al. (2019) aufgrund des Kofaktorbedarfs (NADH) als „nicht praktikabel" angesehen.

So kann D-Talitol beispielsweise durch Reduktion von D-Tagatose mit dem Pilz Aureobasidium pullulans (Stamm 113B) (Muniruzzaman et al., 1994) hergestellt werden. Die Rückreaktion kann durch die Verwendung der Altritol-5-Dehydrogenase (EC 1.1.1.407), die ein Teil des D-Altritol-Katabolismus in Agrobacterium tumefaciens C58 ist, bewerkstelligt werden (Wichelecki et al., 2015).

D-Talitol kann beispielsweise mit dem Bakterium Alcaligenes sp. 701B zu D-Psicose oxidiert werden (Izumori et al., 1990).

Yoshihara et al. (2006) beschreiben die direkte Umwandlung von D-Psicose zu D-Tagatose (über D-Talitol) mit verschiedenen Pilzen aus der Familie Mucoraceae wie z.B. Rhizopus oryzae MYA-2483. Dieses Verfahren zeichnet sich aber durch lange Reaktionszeiten (8 bis 14 Tage) mit nur geringen Titern bis zu 3 g/l D-Talitol und 4,2 g/l D-Tagatose bei einer D-Psicose-Startkonzentration von 12 g/l aus. Um die Umsetzungen ökonomischer zu gestalten, schlagen die Autoren ein Screening für effektivere Stämme, Züchtung mittels Mutation und Genetic Engineering sowie die Optimierung des Bioprozesses vor.

Auch Sasahara et al. (1998) beschäftigen sich mit der Herstellung von D-Talitol aus D-Psicose. Darin (sowie in JP 2020039301 A und JP 2006166718 A) wird die Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol mit dem halotoleranten Hefe-Stamm Candida famata R28 beschrieben. Die Autoren beobachteten, dass die Reduktion in Gegenwart von Zuckeralkoholen wie D-Sorbitol beschleunigt werden kann. Allerdings ist die Reaktionsgeschwindigkeit sehr langsam, sodass das Verfahren 10 Tage benötigt, um 10% D-Psicose (100 g/l) zu 95% zu D-Talitol in Gegenwart von 5% D-Sorbitol (50 g/l) umzusetzen. Bei Halbierung der eingesetzten D-Sorbitol-Menge, also 25 g/l, konnte nach 10 Tagen gar nur noch ein Umsatz von etwa 55% erreicht werden.

Hier setzt nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung an und möchte ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von D-Talitol und von wässrigen Lösungen von D-Tagatose und/oder D-Psicose zur Verfügung stellen, welches effizienter und insbesondere im Eintopf-Verfahren durchgeführt werden kann.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Aufgabe zur Herstellung von D-Talitol wird erfindungsgemäß gelöst, indem zunächst aus D-Fructose, welche in einer wässerigen Lösung gelöst vorliegt, durch Behandeln mit einer Epimerase in vitro D-Psicose gebildet wird, wonach die D-Psicose durch Behandeln mit einer NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase in vitro zu D-Talitol reduziert und die Epimerase und die Oxidoreduktase abgetrennt oder deaktiviert werden.

Aus der erhaltenen Lösung kann D-Talitol aufkonzentriert und auskristallisiert werden. Es hat sich Überaschenderweise gezeigt, dass die Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol in vitro viel effizienter bewerkstelligt werden kann, als im Stand der Technik bekannt ist (Sasahara et al., 1998). Der Zeitverlauf der D-Talitol-Konzentration ist in der beiliegenden Figur 2 dargestellt.

Die Aufgabe zur Herstellung einer wässerigen Lösung von D-Tagatose oder D-Psicose wird gelöst, indem die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte, wässerige, D-Talitol enthaltende Lösung mit einer NAD(P)⁺-abhängigen Oxidoreduktase unter Bildung von reduziertem Kofaktor NAD(P)H behandelt wird, um D-Talitol zu D-Tagatose bzw. D-Talitol zu D-Psicose zu oxidieren, wonach die Oxidoreduktase abgetrennt wird. Diese Oxidationen werden vorteilhaft in vitro durchgeführt.

In der beiliegenden Figur 1 ist das Reaktionsschema der erfindungsgemäßen Verfahren wiedergegeben. Die Abkürzung „Reg. -Enzym" in Figur 1 steht dabei für Regenerationsenzym.

Im Fall der Herstellung von D-Psicose werden vor der Ausführung des letzten Schritts (Oxidation) die Enzyme (Epimerase und Reduktase/Dehydrogenase) des ersten Schritts (D-Fructose D-Talitol) durch Hitzeeinwirkung vorteilhaft deaktiviert oder durch Ultrafiltration abgetrennt, um zu verhindern, dass ein Teil der durch die Oxidation entstandene D-Psicose von der Epimerase wieder zu D-Fructose umgewandelt wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Talitol besteht darin, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)⁺ mittels einer Alkoholdehydrogenase und einem sekundären Alkohol unter Bildung eines Ketons reduziert wird, wie z.B. in EP 2812439 Bl beschrieben.

Es hat sich ferner gezeigt, dass der sekundäre Alkohol 2-Propanol (Isopropanol) besonders geeignet ist. 2-Propanol ist ein sehr günstiger Wasserstoff-Donor zur Regeneration von NAD(P)H und das Oxidationsprodukt Aceton ist aufgrund seiner Flüchtigkeit leicht abtrennbar (Xu et al., 2021). Aus dem Abgasstrom gewonnenes Aceton kann heterogen-katalytisch wieder zu 2-Propanol hydriert werden (Al-Rabiah et al., 2022), entweder in der Gasphase, in Lösung oder in 2-Propanol/Aceton/Wasser- Mischungen, wobei in Zukunft vermehrt auf Wasserstoff aus nachhaltigen Quellen („grüner Wasserstoff") gesetzt werden könnte.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Talitol besteht darin, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)⁺ mittels einer Formiat-Dehydrogenase und einem Salz der Ameisensäure (Formiat) unter Bildung von Kohlenstoffdioxid reduziert wird. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der durch die Oxidation entstandene reduzierte Kofaktor NAD(P)H mittels einer Oxidase und Sauerstoff zu NAD(P)⁺ oxidiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird der durch die Oxidation entstandene reduzierte Kofaktor NAD(P)H mittels NAD(P)-abhängiger Alkoholdehydrogenase und eines Ketons zu NAD(P)⁺ unter Bildung eines sekundären Alkohols oxidiert wird.

Es hat sich ferner gezeigt, dass als Keton Aceton besonders geeignet ist, wobei als Reduktionsprodukt 2-Propanol gebildet wird.

Für die Regeneration der bei den Redoxreaktionen benötigten Kofaktoren werden im Falle der Reduktion der D-Psicose zu D-Talitol eine NAD(P)-abhängige Alkoholdehydrogenase oder eine NAD(P)- abhängige Formiat-Dehydrogenase und im Falle der Oxidation des Zuckeralkohols zu D-Tagatose oder D-Psicose eine F O-bildende NAD(P)H-Oxidase oder eine NAD(P)-abhängige Alkoholdehydrogenase verwendet.

Eine weitere bevorzugte Variante der erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass sie als Eintopf-Reaktion ohne Isolierung von Zwischenprodukten durchgeführt werden.

Die Abtrennung der Enzyme kann z.B. durch Hitzedeaktivierung und/oder Zentrifugieren oder Ultrafiltration bewerkstelligt werden.

Die besonders bevorzugte Konzentration von D-Fructose beträgt 50 - 250 g/l.

Der besonders bevorzugte Temperaturbereich für den ersten Schritt (Epimerisierung und Reduktion) liegt zwischen 25 und 40 °C, für den zweiten Schritt (Oxidation) zwischen 20 und 35 °C.

Der besonders bevorzugte pH-Bereich beider Schritte liegt zwischen 7,0 und 8,5.

Bei einer weiteren, bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die Enzyme in einer Suspension, im Homogenat und/oder im Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vor, wobei Lysate besonders bevorzugt sind. Zudem können die Enzyme auch in lyophilisierter oder sprühgetrockneter oder immobilisierter Form im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme können auch in einer im Wesentlichen gereinigten Form verwendet werden, so dass die Enzympräparate keine oder im Wesentlichen keine Bestandteile umfassen, die von den Zellen bzw. der Kultur, in der diese exprimiert wurden, stammen. Die beispielsweise durch rekombinante Expression (z.B. in E. coli) hergestellten Enzyme können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt werden, um nach u.a. Ultrafiltration und DNA-Entfernung auch in und zur Herstellung von Lebensmitteln eingesetzt zu werden.

Suspension bedeutet in diesem Kontext eine Suspension von resting cells. Diese werden nach der Kultivierung geerntet (vom Nährmedium abgetrennt) und in einem geeigneten Puffersystem suspendiert. Im Gegensatz zu fermentativen Verfahren, bei denen auch mit ganzen Zellen gearbeitet wird, können die resting cells aufgrund der Entfernung von Kohlenstoff-Quellen und Nährstoffen nicht mehr wachsen, sondern dienen nur der Umsetzung von Substraten (Lin & Tao, 2017). Homogenat steht in diesem Kontext für eine physikalisch und/oder chemisch behandelte Suspension (z.B. mittels Druckes, Lysozym oder Ultraschall behandelt), wobei die Zellbestandteile aus den Zellen freigesetzt werden. Ein Lysat wird erhalten, wenn die unlöslichen Zellbestandteile des Homogenats beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden (siehe Produktion der Enzyme & Herstellung der Lysate für Details).

In einer weiteren Variante können die Enzyme auch mit einem wasserlöslichen Polymer wie Polyethylenglycol am N-Terminus modifiziert, in oder auf einer festen Matrix immobilisiert oder Teil eines Fusionsproteins sein.

In einer weiteren Variante können die Enzyme in Pulverform, in lyophilisierter oder sprühgetrockneter Form vorliegen.

In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden für die Konversion des Startmaterials nur Enzyme aus den Enzymgruppen Epimerasen und Oxidoreduktasen verwendet, wobei eines oder mehrere dieser Enzyme aus jeder dieser Gruppen ausgewählt werden.

Die im Verfahren verwendete Epimerase kann aus einer der Gruppen EC 5.1.3.30 (D-Psicose-3- Epimerase) oder EC 5.1.3.31 (D-Tagatose-3-Epimerase/L-Ribulose-3-Epimerase) stammen, wobei die erstgenannte besonders bevorzugt ist.

Die NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr.

15, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet.

SEQ ID Nr. 1:

ATGAACGATCCCGTTCTGGAAGCCAGACCGATTTTGGAGAGATTTCGCCTCGACGGCCGCGTGGCGC TGGTGACCGGCGGTGGGCAGGGCATCGGCCGCGCCTTCGCCCATGCGCTGTGCGAGGCAGGCGCCG CAGTGGCCGTCGTCGATCTGCGCCTGGACCTGGCCGAGGAAGTGGCGCATGAGCTGGTAAACAAGC AGATCGACGCCATCGCAATTCAGGCCGATGTGACGAAGCCCGATCAGGTGCAGACGATGGTTGATGC CATTCTGTCCAGGTGGGGGACGTTGACGATCGGTGTCAACAACGCCGGCATCGGCTTGTGGGCGGAT GCCGAAAGCATGGCATACACAGACTGGCTGCGCGTGATCGATATTGATCTGAACTCGGTTTTCCTCTG CGCCCAGGCTGAAGCGAGGGTCATGCTGCCGGCCGGCTACGGCAAGATCATCAACACGGCGTCGAT GTCCGGCCATATCAGCAACACGCCGCAAAATCAGGCTGCTTACAACACGGCCAAGGCTGGCGTGATC CATCTGACGCGCAGCCTTGCCGCGGAATGGGCCAAGCGGGGAGTGCGCGTCAACAGCATCAGCCCC GGCTATACGCGCACCAAATTGGTTGACGACCTGCTCGCCACGCCGATCGGACAGACGATGTTGCCCA CCTGGATGGGCATGACGCCCATGGGACGAATGGCCGAGGTCACCGATCTGCAAGGCGCCGTCGTCT ACCTGGCGTCGTCGGCGTCCGACTATATGACCGGCCATGACATGGTGATTGACGGCGGCTATTGTTG CTGGTAA

SEQ ID Nr. 2:

M NDPVLEARPILERFRLDGRVALVTGGGQGIGRAFAHALCEAGAAVAVVDLRLDLAEEVAHELVNKQIDA IAIQADVTKPDQVQTMVDAILSRWGTLTIGVNNAGIGLWADAESMAYTDWLRVIDIDLNSVFLCAQAEA RVMLPAGYGKIINTASMSGHISNTPQNQAAYNTAKAGVIHLTRSLAAEWAKRGVRVNSISPGYTRTKLVD DLLATPIGQTM LPTWMGMTPMGRMAEVTDLQGAVVYLASSASDYMTGHDMVIDGGYCCW

SEQ ID Nr. 5:

ATGTATCCAGATTTAAAAGGAAAAGTTGTCGCTATTACAGGAGCTGCTTCAGGATTAGGGAAGGCAA TGGCCATTCGCTTCGGCAAGGAGCAGGCAAAAGTGGTTATCAACTACTACAGCAATAAGCAGGATCC GAACGAGGTAAAGGAAGAGGTCATCAAGGCGGGCGGTGAAGCTGTTGTCGTCCAAGGAGACGTAA CAAAAGAGGAAGATGTAAAAAACATCGTCCAAACAGCGATTAACGAGTTCGGTACACTCGATATTAT GATTAATAATGCCGGTCTTGAAAATCCCGTTCCTTCTCATGAAATGCCGCTGAAGGATTGGGATAAAG TAATCAGCACGAACTTAACGGGCGCCTTTTTAGGAAGCCGTGAAGCGATTAAATATTTTGTTGAAAAC GATATAAAAGGAAATGTCATTAATATGTCGAGCGTACATGAAGTGATTCCGTGGCCATTATTTGTTCA

CTATGCGGCAAGTAAAGGCGGAATCAAGCTGATGACGGAAACATTGGCGCTGGAATATGCGCCGAA AGGCATTCGTGTCAACAATATCGGGCCAGGCGCGATCAACACGCCAATCAATGCTGAAAAATTTGCT

GATCCTAAGCAGAGAGCAGATGTAGAAAGCATGATTCCGATGGGATATATCGGTGAACCGGAGGAA

ATTGCGGCAGTAGCAGCCTGGCTTGCTTCGAAGGAAGCCAGCTACGTCACAGGCATCACGTTATTCG CGGACGGCGGTATGACCCAATATCCTTCCTTCCAGGCAGGACGCGGATAA

SEQ. ID Nr. 6:

MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKE

EDVKNIVQTAINEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVISTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVI

NMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQRADVES M IPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG

SEQ. ID Nr. 7:

ATGACTATTCCTAATACTACTGAAATTACCTCGTTTACAAACCCTGCTCTTGGACCATTACCCACTTCAG

CACCAGAACTAGCTACTAGTGTGCTTGATTTATTTCTGCTTAAGGGCAAAGTAGCATCAGTTACTGGA

TCCTCTACTGGTATAGGGTACGCTGTGGCAGAAGCTTTTGCACAGGCAGGTGCCGATGTTGCAATTTG

GTACAACAATCATCCTGCAACCGAAAAGGCTGAAAAATTGGCTAAAAAATATGGCGTTAAATGCAGG

GCATACAAATGCAACATTTCCAATGCTGACGATGTTGATCTGACGATTAAGCAGATTGAGCAAGATTT

TGGAACGATTGATATCTTTGTTGCCAATGCTGGTGTGGCTTGGACTTCTGGTTCCATGGTTGATGTGG

ACGATAATCATGAAAGTTGGCACAAGATTGTCGACTTGGATTTGAATGGAGTATACTATTGTTGTCAT

TCAATAGGGAAAGTATTCAAGAGGAAAGGAAAGGGTTCCTTGGTTATTACTTCATCAATGTCGGGCC

TGATTGTCAATGTTCCACAGCTACAGGCTCCTTATAATGCTGCTAAGGCTGCTGTAAAACATTTAGCTA

AATCGTTAGCAGTTGAATGGGCTCCATTTGCTAGAGTCAATAGTATATCTCCAGGATATATCACTACT

GATATTTCTGAATTCGCCGATCCTGAAATGAAGGCAAGATGGTGGCAATTAACTCCTTTGGGGAGAG

AGGGATTGCCACAAGAATTAGTAGGAGCTTACTTATACTTAGCCTCCAATGCCTCTACATTTACTACG GGAGCCGATCTCGTTGTGGACGGTGGATACACTGCTCCATAA

SEQ ID Nr. 8:

MTIPNTTEITSFTNPALGPLPTSAPELATSVLDLFLLKGKVASVTGSSTGIGYAVAEAFAQAGADVAIWYNN

HPATEKAEKLAKKYGVKCRAYKCNISNADDVDLTIKQIEQDFGTIDIFVANAGVAWTSGSMVDVDDNHES

WHKIVDLDLNGVYYCCHSIGKVFKRKGKGSLVITSSMSGLIVNVPQLQAPYNAAKAAVKHLAKSLAVEWA

PFARVNSISPGYITTDISEFADPEMKARWWQLTPLGREGLPQELVGAYLYLASNASTFTTGADLVVDGGYT AP

SEQ ID Nr. 9: ATGGAAAAACTCCGCCTCGATAACCGCGTCGCCATCGTCACCGGCGGCGCACAGAACATCGGCCTGG

CCTGCGTCACCGCACTGGCCGAGGCTGGCGCCCGCGTCATCATCGCCGATCTCGATGAAGCCATGGC

CGCAAAAGCCGTGGAAGATCTGCGCATGGAAGGCCATGATGTCAGCAGCGTCGTCATGGACGTCAC

GAACACGGAAAGTGTGCAGAACGCTGTCCGCAGCGTTCACGAGCAGGAAGGCCGCGTGGATATCCT

GGTCGCCTGCGCCGGCATCTGCATTTCCGAAGTCAAGGCCGAGGACATGACGGATGGCCAGTGGCTC

AAGCAGGTCGATATCAACCTGAACGGCATGTTCCGCTCCTGTCAGGCCGTCGGGCGCATCATGCTCG

AACAGAAACAGGGCGTCATTGTCGCAATCGGCTCCATGTCCGGCCTGATCGTCAACCGCCCGCAGCA

GCAGGCGGCCTATAATGCGTCGAAAGCCGGCGTTCACCAGTATATCCGCTCGCTCGCCGCAGAATGG

GCTCCCCATGGCATTCGTGCCAACGCCGTTGCCCCCACCTATATCGAAACGACGCTCACCCGCTTCGG

CATGGAAAAGCCGGAACTCTACGACGCCTGGATCGCCGGAACCCCGATGGGCCGCGTGGGCCAGCC

CGATGAAGTCGCTTCCGTCGTGCAGTTCCTGGCGTCCGACGCAGCCAGCCTGATGACCGGCGCCATC GTGAATGTGGATGCGGGCTTCACCGTCTGGTAA

SEQ. ID Nr. 10:

M EKLRLDNRVAIVTGGAQNIGLACVTALAEAGARVIIADLDEAMAAKAVEDLRMEGHDVSSVVMDVTN

TESVQNAVRSVHEQEGRVDILVACAGICISEVKAEDMTDGQWLKQVDINLNGM FRSCQAVGRIM LEQK

QGVIVAIGSMSGLIVNRPQQQAAYNASKAGVHQYIRSLAAEWAPHGIRANAVAPTYIETTLTRFGM EKPE

LYDAWIAGTPMGRVGQPDEVASVVQFLASDAASLMTGAIVNVDAGFTVW

SEQ. ID Nr. 11:

ATGTCTCAAGCTATCTCAGCAATCAACGAAAGAGTTGGCCCATTGCCCACTAAAGCACCCCAACTTTC

AAAAAACGTATTAGACCTCTTTTCCTTGAAAGGCAAGGTAGCATCGGTGACAGGTTCATCGAAGGGA

ATAGGCTTTGCTGTCGCAGAAGCATACGCTCAAGCAGGGGCTGATGTTGCTTTGTGGTACAATTCAA

GTCCTGTCGAGGATAAGGTAAAATACTTGAAAGAGACCTACGGCGTGAAAGTCAAAGCCTACAAGTG

TAACGTGGGAAACAGCGAGGAGGTTGAGAAAATAGTAGACCAAATTGCAGAGGACTTCGGCACAAT

TGACGTTTTTGTTGCTAATGCGGGCATTGCTTGGAGCGAAGGTAGATCTCTCGAGGTTAAGGGTTAC

GACGCTTGGCAAAAAATTGTCGACTACGACTTGAGCAGTGTATACTACTGTGCTAAGGCAGTGGGTA

AGATCTTCCAAGAAAAGGGCTCCGGTTCGTTAATCCTCACCGCATCCATGTCCGGACACATTGTGAAT

GTTCCTCAAATGCAGGCACCATACAATGCGGCCAAGGCGGCTGTGATCCATCTAGGAAAATCTTTGG

CTGTCGAATGGGCTCCATTTGCCAGGGTCAACACCGTTTCTCCTGGCTATATTGCCACTGATATTGGTG

AATTTGTGCTGCCCGATGAGAAGAAAAAGTGGTGGTCATTGACACCCTTGGGTAGAGAAGGTCTTCC

TCAAGAACTCACTGGTGCATACTTGTATTTTGCTTCTAACGCATCGACCTACACTACTGGGGCTGACTT GGTCGTAGACGGTGGCTACACTGTACCATAA

SEQ ID Nr. 12: MSQAISAINERVGPLPTKAPQLSKNVLDLFSLKGKVASVTGSSKGIGFAVAEAYAQAGADVALWYNSSPVE

DKVKYLKETYGVKVKAYKCNVGNSEEVEKIVDQIAEDFGTIDVFVANAGIAWSEGRSLEVKGYDAWQKIV

DYDLSSVYYCAKAVGKIFQEKGSGSLILTASMSGHIVNVPQMQAPYNAAKAAVIHLGKSLAVEWAPFARV

NTVSPGYIATDIGEFVLPDEKKKWWSLTPLGREGLPQELTGAYLYFASNASTYTTGADLVVDGGYTVP

SEQ. ID Nr. 13:

ATGTCACACCCAACATCAGTTATTAACGAGCAGGTAGGCCCATTACCAACTAAGGCCCCACAACTTTC

TAAGAATGTGAATGATTTGTTCTCATTAAAGGGTAAGGTAGCTTCTGTCACCGGTTCCTCAGGAGGGA

TTGGTTGGGCTGTAGCTGAAGCGTATGCCCAAGCAGGAGCAGACGTTGCTGTTTGGTACAATTCTAA

AAATGCAGATGCTAAGGCTGAATACTTAACTAAGACTTACGGTGTGAAGTCGAAGGCATACAAGTGT

AACATTTCTGATCCAGAAGACGTCGAAAAGGTAATTGGACAAATTGAAAAGGATTTCGGTACCATTG

ACGTTTTCGTTGCCAATGCCGGTGTTCCATGGACAGAAGGTAGAAGTATTGAAGTTGAAGGATATGA

TTCGTGGAAGAAGGTTATAGATTTGGACTTGAGTGGTGTCTACTATTGCGCTAAGGCTGTCGGAAAG

ATTTTCAAGAAGAATGGTAAGGGTTCGCTTGTGTTCACAGCATCAATGTCTGGCCACATTGTGAATGT

TCCACAATTGCAAGCTCCATACAACGCCGCAAAGGCCGGTGTTTTGCACTTGAGTAAGTCATTAGCTG

TCGAATGGGCCCCATTCGCTAGAGTTAACACCATTTCACCTGGTTATATTGCCACAGAAATTTCCGACT

TCGTTCCGGACGATGTCAAGGCTAAGTGGTGGCAATTAATTCCATTAGGAAGAGAAGCTCTTCCACA AGAATTAGTTGGTGCTTACTTATATTTTGCATCCGATGCGTCTACTTACACTACAGGATCGGACTTATT AGTCGATGGTGGTTACTCTGCTCCATAA

SEQ. ID Nr. 14:

MSHPTSVINEQVGPLPTKAPQLSKNVNDLFSLKGKVASVTGSSGGIGWAVAEAYAQAGADVAVWYNSK

NADAKAEYLTKTYGVKSKAYKCNISDPEDVEKVIGQIEKDFGTIDVFVANAGVPWTEGRSIEVEGYDSWKK

VIDLDLSGVYYCAKAVGKIFKKNGKGSLVFTASMSGHIVNVPQLQAPYNAAKAGVLHLSKSLAVEWAPFA

RVNTISPGYIATEISDFVPDDVKAKWWQLIPLGREALPQELVGAYLYFASDASTYTTGSDLLVDGGYSAP

SEQ ID Nr. 15:

ATGGGCAAGACTGTAGCAACTGGTATTGAAACCCCCCAACCTTATCCACAATTGCCTGAACATGTTAT

GGACATGTTTTCATTAAAAGGTAAGGTGGCCTCTGTGACTGGTGCTTCCGGTGGTATTGGTTATGAAG

TGGCCGTTGCATTTGCACAGGCAGGTGCCAATGTTGCTATGTGGTACAACTCGCATTCTGTCGAGGA

GGAAGCTGAAAAGCTGTCGAAGAAATACAACGTCACCGTTAAGGCTTATAAATGTTCATTGACTGAT

ACTAAGGCTGTTGAAGAAACTGTGCAACAGATTAAGAAGGACTTTGGTGGTAGAATTGATATAATGG

TGGCTAATGCTGGTGTGGCGTGGGATAAGGGTCCCTTGACCGAGCTGGCCGAAAAAGATTCTGAGCT

TTGTGACAAGGAATGGCAGAAAGTTTTGAGCATCGATATCAATGGTGTCTATAATGCAGCCAAGAGT

ATTGGTCCAATTTTCAAGAAGCAAGGATCAGGTTCTTTCATTGCAACTGGTTCGATGTCTGGTCACATT GCAAACGTTCCGCAATTACAGGTCGCATACAATACTGCAAAGGCTGCCGTTATTCATATGTGCAAATC

GCTGGCTGTCGAATGGACAGGTTACGCCCGTGCTAACACTGTATCCCCAGGTTACGTAGCCACTCCAT

TGAATGCTGGGATGGACGAAGAGATGCTAAAGAAATGGAACACCTTAGTCCCACTAGGTCGTCTCGC

TTTGCCCAAGGAAATGGTTGGTGCTTATTTGTACTTGGCCTCTAATGCCTCAACATACACGACCGGTA GCGACATACTAGTGGATGGTGGTTACTGTAGTGTTTAA

SEQ. ID Nr. 16:

MGKTVATGIETPQPYPQLPEHVMDM FSLKGKVASVTGASGGIGYEVAVAFAQAGANVAMWYNSHSVE

EEAEKLSKKYNVTVKAYKCSLTDTKAVEETVQQIKKDFGGRIDIMVANAGVAWDKGPLTELAEKDSELCDK

EWQKVLSIDINGVYNAAKSIGPIFKKQGSGSFIATGSMSGHIANVPQLQVAYNTAKAAVIHMCKSLAVEW

TGYARANTVSPGYVATPLNAGMDEEMLKKWNTLVPLGRLALPKEMVGAYLYLASNASTYTTGSDILVDG GYCSV

SEQ. ID Nr. 17:

ATGGTTGATAAGATTCTGGATAGGTTCAGTTTAAAAGGGAAAACCGCATTGGTGACAGGTGGTGGTC

AGGGTATTGGACGCGGATATGCTTTTGCGCTGGGAGAAGCCGGGGCCAAGGTAGCCATTGTTGATA

TCAATGGAGAAACTGCTGAAGCGACAGCCAAGGACCTGCAAGCAGCGGGGATTGCATCAATGTCCT

ATGTCTGTGATGTAACTAATCCCGATCAGGTGATGGCAATGGTGAAACATATTGTCAAAGAATGGGG

GACTTTGACTATAGGGGTTAACAACGCTGGCATGGGAATCTGGAGCGATGCAGTAACCATGCCCTAT

GAGATGTGGAGAAAGACCATGGCTTTAAACATGGATGGGATTTTTCTTTGTGCCAGGGAGGAGGCA

AAGTATATGATACGCGAGGGGTATGGGAAAATTATCAATACTGCTTCGATGAGCGCCCATATATCGA

ATACCCCACAGAATCAAGTAGCTTACAATGCATCCAAGGCGGGGGTTCTCCACATGACCAGATCTTTG

GCCGCAGAATGGGCTCCCTATGGCGTGAGGGTGAACTCCATCAGTCCCGGATATACAAGGACAGAG

CTGGTCGAAAAGCTGCTTGCAACTCCAGAGGGGAAAAAAATGGAATCAGACTGGTTGCAACTGATTC

CCCAAAAAAAGATGGCTACCGTCGAGGATTTGCAAGGCGCTTGCTTGTACCTTGCCTGCAGGGCTTC GGATTACACAACAGGTAGCGATATTCTCATAGATGGTGGGTATTGCTGTTGGTAA

SEQ ID Nr. 18:

MVDKILDRFSLKGKTALVTGGGQGIGRGYAFALGEAGAKVAIVDINGETAEATAKDLQAAGIASMSYVCD

VTNPDQVMAMVKHIVKEWGTLTIGVNNAGMGIWSDAVTMPYEMWRKTMALNM DGIFLCAREEAKY

M IREGYGKIINTASMSAHISNTPQNQVAYNASKAGVLHMTRSLAAEWAPYGVRVNSISPGYTRTELVEKL

LATPEGKKM ESDWLQLIPQKKMATVEDLQGACLYLACRASDYTTGSDILIDGGYCCW

SEQ ID Nr. 19: ATGGCAGAAAAAATTCTTGACAGATTCAAGCTGGACGGCAAGACCGCCCTGGTTACCGGAGGAGGG

CAGGGCATTGGCCAGGCCTACTGTTTCGCCCTGGGCGAAGCAGGCGCAAAGATAGCTGTGGTAGAC

ATCAACACCACCGTTGCGGAAGAGACCGCCCAGGCCCTGACAAAAAAAGGCATAGAGGCTATTGCG

ATAACCACAGATGTTACAAAAGAAGACGAAGTAATAAAGATGGTTAAAACCGTCATAGACAAATGGG GCTTCCTCACCATAGGCGTCAACAACGCCGGCATGGGTGTCTGGCGCGATGCGTTAACCCAGGACTTT GCCGAATGGCGGAAGATCCTCTCCCTCAACCTCGATTCGATCTTCCTCTGCTCTCGCACCGAAGCCGT

GGAAATGGCAAAGAAAGGCTATGGCAAGATCGTCAACACCGCTTCCATGTCCGCCCATATTTCCAAC ACCCCCCAGAACCAGGCAGCCTACAACAGCTCCAAAGCCGGTGTGCTCCATCTGACCCGCAGCCTCGC TGCCGAATGGGCGCCCAAAAATATCAGGGTAAACAGCATCTCCCCGGGTTATACAAAAACCGCCCTG

GTAGACAAGCTCCTCGAAACCCCGGAAGGCAAAACCATGCTGCCCAAGTGGCTGGAAAAAGTCCCCA

TGGGGCGCATGGCTACCGTGGAAGATCTGCAAGGCGCCGTTGTGTATCTGGCATCGCCCGCATCGGA TTATGCCACCGGCACAGATATTATCATTGACGGCGGATATTGCTGCTGGTAA

SEQ. ID Nr. 20:

MAEKILDRFKLDGKTALVTGGGQGIGQAYCFALGEAGAKIAVVDINTTVAEETAQALTKKGIEAIAITTDVT

KEDEVIKMVKTVIDKWGFLTIGVNNAGMGVWRDALTQDFAEWRKILSLNLDSIFLCSRTEAVEMAKKGY

GKIVNTASMSAHISNTPQNQAAYNSSKAGVLHLTRSLAAEWAPKNIRVNSISPGYTKTALVDKLLETPEGK TMLPKWLEKVPMGRMATVED LQG AVVYLAS PAS DYATGTD 111 DGG YCCW

SEQ. ID Nr. 21:

ATGGTTCTCTCTCAGCCCGAAAACAAGCATGTTATGAAAGCCTTCGATTTGACCGGCAAGGTCGCAGC

TGTGACAGGAGGAGCTCGCGGGATCGGTCTTGAGGTCTCCAGAGGGCTTGCAGAAGCTGGTGCGAA TGTTGCAGTCATCTACAGCTCGTCCAAGAATGCCGACGCCGTTGCAGCCGAGATCGCAGCTGCCAAC AACGTCAAGACAGCCGCATACAAGGCAGATGTAAGCAACCAGCAGGATATCGAGAGCACCATTCAG

CAGATAGCAAAGGACTTTGGAAAACTGGACATAATCGTGGCGAATTCTGGAATCGCAAGCACGCATC

CCGCTGAAGACTACACAGTGGAGGAGTGGAGAGATATCCTCAAAGTGAATCTAGATGGAGCGTTCTA

CACAGCGCAGGCGGCGGCAAGGATCTTCAAGACGCAAGGGCATGGAAACGTCATCTTCACGGCTTCT

GTCAGCGCAAGGCTGGTCAATGTCCCCCAGAAACAAGCTGCGTACAACGCCTCGAAAGCTGGTCTTG

TCCAGCTGGCAAAGTGCTTGTCAGTGGAATGGATAGACTATTGTCGTGTCAACTGCATTTCGCCTGGT

TTTATTGCGACAGAAATCTTGGATATCCACCCCAAGGAGTGGAGAGAAAAATGGCTCGACATGGTTC CCGCGCGTCGGATGGCTGCTACTTACGAGCTAAAGGGGGCGTATGTTTTCTGTGCTTCTGACGCGTCA AGCTACATGACCGGCGCTGATATAGTCATTGATGGTGGATATACGCTTCCGTAA

SEQ ID Nr. 22: MVLSQPENKHVMKAFDLTGKVAAVTGGARGIGLEVSRGLAEAGANVAVIYSSSKNADAVAAEIAAANNV KTAAYKADVSNQQDIESTIQQIAKDFGKLDIIVANSGIASTHPAEDYTVEEWRDILKVNLDGAFYTAQAAA RIFKTQGHGNVIFTASVSARLVNVPQKQAAYNASKAGLVQLAKCLSVEWIDYCRVNCISPGFIATEILDIHP KEWREKWLDMVPARRMAATYELKGAYVFCASDASSYMTGADIVIDGGYTLP

SEQ. ID Nr. 23:

ATGGCTGCGTCTCCCATCACCAACGGCCTCTTCAACCATGACAACTCCACCCCGCCCGAGCATCCCAG CCTGTTCGCGCTGTTCTCGCTCAAGGGCAAGACCGCCATCGTCACGGGCGCCGGTGCTGGCATCGGC CTGCATGTGGCTCATGGTCTGGCTGAGGCTGGCGCCAACGTTGCGCTCTTCTACAACACCAACACCAA GACGCCGGAGCGCGCTGCCGAGATCGAGCAGCAGTATGGCGTGAAGGCCAAGGCATACCAGGTCG ACGTCCGCGACGCCAAGAAGCTCGAGGAGACGGTCAACCAGGCCGTGCGCGACCTCAACGGCCGCC TGGACATCTTCATCGCCAACGCCGGCATCCCGTGGACCAAGGGCCCCAGCGTTGACGGCCCGCTGGA CCACTACCAGGCCGTCGTGCAGACCGACCTGGACGGCGTCTTCTACTCGGCCAAGGCGGCGGCAGCC CACTGGCGGCGCCAGAAGGAGGAGGGCACCGACCTGTTCGGCAACAAGCTGCAGAACTTCACCTAC GGCAGCTTCGTGGCCACGGCGTCGATGAGCGGCCATATCGTGAACATTCCCCAGCTGCAGGCGGCGT ACAACGCCGCCAAGGCGGGCGTCATCCACATGGTCAAATCGTTTGCCGTCGAATGGGCGCGCTTCGC CCGTGCCAACTCGGTCTCTCCTGGCTACATCGCCACGGAGATCTCCAACTTCGTTCCCGCGGAGACCA AGAAGCTCTGGCGGGACAAGACGCCGCTGGGCCGCGAGGGTCTGCCGCAGGAGCTCAAGGGCGCC TACCTGTACCTGGCCAGCGATGCGGCCAGCTTCACGACGGGCGCGGACCTGGTGGTCGACGGAGGC TACACCCTGCCTTAA

SEQ. ID Nr. 24:

MAASPITNGLFNHDNSTPPEHPSLFALFSLKGKTAIVTGAGAGIGLHVAHGLAEAGANVALFYNTNTKTPE RAAEIEQQYGVKAKAYQVDVRDAKKLEETVNQAVRDLNGRLDIFIANAGIPWTKGPSVDGPLDHYQAVV QTDLDGVFYSAKAAAAHWRRQKEEGTDLFGNKLQNFTYGSFVATASMSGHIVNIPQLQAAYNAAKAGVI HMVKSFAVEWARFARANSVSPGYIATEISNFVPAETKKLWRDKTPLGREGLPQELKGAYLYLASDAASFTT GADLVVDGGYTLP

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass eine Oxidoreduktase mit einer der Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20 nicht nur in der Lage ist, D-Psicose zu D-Talitol zu reduzieren, wobei die Reaktion vorzugsweise in Anwesenheit von NAD(P)H stattfinden kann, sondern auch D-Talitol zu D-Psicose zu oxidieren, wobei diese Reaktion vorzugsweise in Anwesenheit von NAD(P)⁺ stattfinden kann. Die Oxidoreduktase zur Bildung von D-Talitol aus D-Psicose bzw. von D-Psicose aus D-Talitol umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ. ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zur Bildung von D-Talitol aus D-Psicose die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 20 oder besteht aus dieser.

Alternativ umfasst die Oxidoreduktase zur Bildung von D-Talitol aus D-Psicose bzw. von D-Psicose aus D-Talitol vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zur Bildung von D-Talitol aus D-Psicose kodiert, die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 oder besteht aus dieser.

Der Begriff „Identität", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Prozentsatz der identischen Nukleotid- bzw. Aminosäureübereinstimmungen zwischen mindestens zwei, unter Verwendung eines standardisierten Algorithmus miteinander ausgerichteten Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen („Alignment"). Ein solcher Algorithmus kann, in einer standardisierten und reproduzierbaren Weise, Lücken („Gap") in die verglichenen Sequenzen einfügen, um das Alignment zwischen zwei Sequenzen zu optimieren, und somit einen aussagekräftigeren Vergleich der beiden Sequenzen erreichen.

Die prozentuale Identität zwischen Sequenzen kann unter Verwendung von ein oder mehreren Computeralgorithmen oder im Stand der Technik bekannten oder hierin beschriebenen Programmen bestimmt werden. Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung der Identität das durch National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgestellte Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) verwendet. Die BLAST-Software-Reihe enthält verschiedene Programme, einschließlich eines als „BLAST 2 Sequences" genannten Werkzeuges, das für den direkten paarweisen Vergleich von zwei Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen verwendet wird. "BLAST 2 Sequences" kann auch über die NCBI World Wide Web-Seite im Internet interaktiv abgerufen und verwendet werden. Das blastn- Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das blastp-Programm als Vorgaben eine Wortlänge von 3 und eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUIVI62-Scoring-IVIatrix (Henikoff & Henikoff, 1989), Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4.

Alternativ, umfasst die Oxidoreduktase zur Bildung von D-Talitol aus D-Psicose bzw. von D-Psicose aus D-Talitol vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ. ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet. Wie hierin verwendet, beziehen sich die stringenten Bedingungen auf Bedingungen, unter denen sogenannte spezifische Hybride, jedoch keine unspezifischen Hybride gebildet werden. Beispielsweise umfassen die stringenten Bedingungen eine Hybridisierung in 6xSSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) bei 45 °C und dann Waschen mit 0,2 bis lxSSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65 °C; oder derartige Bedingungen können eine Hybridisierung in lxSSC bei 65 bis 70°C und dann Waschen mit 0,3xSSC bei 65 bis 70 °C umfassen. Die Hybridisierung kann durch herkömmlich bekannte Verfahren, wie etwa jene, die von J. Sambrook et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989), beschrieben sind, durchgeführt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Talitol oder D-Psicose umfassend den Schritt des Behandelns von D-Psicose bzw. D-Talitol mit einer Oxidoreduktase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 bindet. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Talitol umfassend den Schritt des Behandelns von D-Psicose mit einer Oxidoreduktase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol und/oder zur Oxidation von D-Talitol zu D-Psicose umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr.

20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr.

15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 bindet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet. Die NAD(P)⁺-abhängige Oxidoreduktase zur Oxidation von D-Talitol zu D-Tagatose umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 3 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID Nr. 3 bindet.

SEQ ID Nr. 3:

ATGGCTGCCAACGTCCCCAAGACCATGAAGGCTCTCAGATATGAGAAGCCTGAGACGTTCTCCATCGT CGACATTCCCGTTCCCACTCTGCGTGAGAACGATGTCTTGATCAAGGTCAAGGCTTGCGGTGTCTGTG GTACCGACCTGCACATTCACGAGGGAGAATTCCTTGCCAAGTTCCCTCTCGTTCCTGGCCACGAGACT GTCGGTGTTGTTGCCGCAGTTGGACCCAAGGTCAAGGGTTTCGAGATCGGTGACCGTGTTGTTGCCG ACAACTCCGAGCTTTGCGGCCAATGCTTCTACTGCCGACGAGGAGAGGAGTTGCTCTGCGAGCACTT CGAAGCTCACGGTGTCACGATGAACGGCGGTTTCGCTGAGTACTGCGCCTACCCTGCCGGCCGTGTC TTCAAGATCAAGAACCTCTCTGACGTGGACGCCACTCTGCTTGAGCCCGCGTCCTGCGCCGCTCACGG TCTGGACAAGATTGCCCCCAAGATGGGCTCGTCCGTCCTGGTGTTCGGCGCCGGTCCCACCGGTCTG GTCCTTGCTCAGATGCTCCGTCTGAACGGAGGATGCCGCGTCGTCGTCGCTGCGCCCGAGGGTCTGA AGATGGACCTGGCCCAGAAGCTCGGCGCTGGTGATGAATACGTTGCTCTTTCTCGCACGAACCCTCA GGCTCAGTTTGACAAGCTGAAGGCCGACAACCCGTACGGCTTCGACATTGTCGTCGAGGCTACCGGC AATGCCAAGATCCTGGAGGATGCCATCAACTATGTCCGCCGTGGAGGCAAACTGGTCGTGTACGGTG TGTACGCGAACAAGGACCGCGTCTCGTGGCCCCCGAGCAAGATCTTCGGTGACGAAATCACCATTCT GGGTAGCTTCTCCGAGACCTACAAGTTCCCCGCCGCCATCGACTACCTGGACTCCGGCAAGGTGAAG GTCCAGGGCATCGTGAACAAGACCTTCCGGCTGGAGCAGTGGGAGGAGTGTCTGGCGTCGTTGAAG AACAAGAGCGCCATCAAGGCGGCGATCGTCTTTGACTAA

SEQ ID Nr. 4:

MAANVPKTMKALRYEKPETFSIVDIPVPTLRENDVLIKVKACGVCGTDLHIHEGEFLAKFPLVPGHETVGV VAAVGPKVKGFEIGDRVVADNSELCGQCFYCRRGEELLCEHFEAHGVTM NGGFAEYCAYPAGRVFKIKNL SDVDATLLEPASCAAHGLDKIAPKMGSSVLVFGAGPTGLVLAQMLRLNGGCRVVVAAPEGLKMDLAQKL GAGDEYVALSRTNPQAQFDKLKADNPYGFDIVVEATGNAKILEDAINYVRRGGKLVVYGVYANKDRVSW PPSKIFGDEITILGSFSETYKFPAAIDYLDSGKVKVQGIVNKTFRLEQWEECLASLKNKSAIKAAIVFD Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass eine Oxidoreduktase mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz in der Lage ist, D-Talitol zu D-Tagatose zu oxidieren, wobei die Reaktion vorzugsweise in Anwesenheit von NAD(P)⁺ stattfinden kann.

Die Oxidoreduktase zur Bildung von D-Tagatose aus D-Talitol umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zur Bildung von D-Tagatose aus D-Talitol die Aminosäuresequenz SEQ. ID Nr. 4 oder besteht aus dieser.

Alternativ umfasst die Oxidoreduktase zur Bildung von D-Tagatose aus D-Talitol vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zur Bildung von D-Tagatose aus D-Talitol kodiert, die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder besteht aus dieser.

Alternativ umfasst die Oxidoreduktase zur Bildung von D-Tagatose aus D-Talitol vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen (siehe obige Definition) an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Tagatose umfassend den Schritt des Behandelns von D-Talitol mit einer Oxidoreduktase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Oxidoreduktase zur Oxidation von D-Talitol zu D-Tagatose umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 3 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.

Die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte Alkoholdehydrogenase (ADH) kann aus einer der Gruppen EC 1.1.1.1 (NAD-abhängige ADH) und EC 1.1.1.2 (NADP-abhängige ADH) stammen.

Das bei der Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol entstehende NAD(P)⁺ wird mittels Formiat und einer Formiat-Dehydrogenase unter Bildung von CO2 zu NAD(P)H reduziert (Kofaktor-Regeneration).

Besonders bevorzugt wird eine Formiat-Dehydrogenase eingesetzt, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 26 umfasst oder daraus besteht, oder ein funktionelles Fragment dieser Formiat- Dehydrogenase. Die bevorzugt eingesetzte Formiat-Dehydrogenase wird vorzugsweise durch die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 25 kodiert. Ein „funktionelles Fragment" der Formiat-Dehydrogenase umfasst eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Variante der Formiat-Dehydrogenase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 26, die zumindest 50%, vorzugsweise zumindest 60%, noch mehr bevorzugt zumindest 70%, noch mehr bevorzugt zumindest 80%, noch mehr bevorzugt zumindest 90%, noch mehr bevorzugt zumindest 95%, Enzymaktivität im Vergleich zur nicht trunkierten Formiat- Dehydrogenase aufweist.

SEQ ID Nr. 25:

ATGGCGAAAATACTTTGCGTTCTCTATGACGATCCGGTCGACGGCTACCCGAAGACCTATGCGCGCG ACGACCTGCCGAAGATCGACCACTATCCGGGCGGGCAGACGCTGCCCACGCCCAAGGCGATCGACTT CACGCCGGGCGCGCTGCTCGGCTCGGTCTCCGGCGAGCTCGGCCTGCGCAAATACCTGGAAGCCAAC GGCCATACCTTCGTCGTCACCTCCGATAAGGACGGCCCGGATTCGGTGTTCGAGAGGGAACTCGTCG ACGCCGACGTGGTGATCTCGCAGCCCTTCTGGCCGGCCTATCTGACGCCCGAGCGCATCGCCAAGGC GAAGAACCTGAAGCTCGCGCTCACCGCCGGCATCGGCTCCGATCATGTCGATCTTCAGTCAGCTATCG ACCGTGGCATCACTGTGGCCGAAGTCACATATTGCAACTCGATCAGCGTCGCCGAGCACGTGGTGAT GATGATCCTCGGCCTGGTACGAAACTACATTCCCTCGCATGACTGGGCGCGCAAGGGCGGCTGGAAC ATAGCCGACTGCGTAGAGCACTCCTACGACCTCGAGGGCATGACCGTCGGCTCGGTGGCCGCCGGCC GCATCGGCCTCGCCGTGCTGCGCCGCCTCGCGCCGTTCGACGTGAAGCTGCACTATACCGACCGCCA CCGTCTGCCAGAAGCGGTCGAGAAGGAGCTGGGCCTCGTCTGGCACGATACCCGCGAGGACATGTA CCCGCATTGCGACGTGGTCACGCTCAACGTGCCGCTGCACCCCGAAACCGAGCACATGATCAATGAC GAGACGCTGAAGCTGTTCAAGCGCGGCGCCTATATCGTCAACACCGCCCGCGGCAAGCTCGCCGACC GCGACGCCATCGTCCGCGCGATCGAGAGCGGGCAGCTCGCGGGCTATGCCGGCGACGTGTGGTTCC CGCAGCCGGCTCCGAAGGACCACCCCTGGCGCACCATGAAGTGGGAAGGCATGACGCCGCACATCT CCGGCACCTCGCTCTCTGCCCAGGCGCGCTACGCGGCGGGCACGCGCGAGATCCTCGAATGCTTCTT CGAGGGCCGGCCGATCCGCGACGAGTACCTGATCGTGCAGGGCGGCGCGCTCGCCGGCACCGGCGC GCATTCCTACTCGAAGGGCAATGCGACCGGCGGTTCGGAAGAGGCCGCGAAGTTCAAGAAGGCTGG CTGA

SEQ. ID Nr. 26:

MAKILCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPKAIDFTPGALLGSVSGELGLRKYLEANGHTFV VTSDKDGPDSVFERELVDADVVISQPFWPAYLTPERIAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQSAIDRGITVAEVT YCNSISVAEHVVMM ILGLVRNYIPSHDWARKGGWNIADCVEHSYDLEGMTVGSVAAGRIGLAVLRRLAP FDVKLHYTDRHRLPEAVEKELGLVWHDTREDMYPHCDVVTLNVPLHPETEHM INDETLKLFKRGAYIVNT ARGKLADRDAIVRAIESGQLAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRTMKWEGMTPHISGTSLSAQARYAAGTR EILECFFEGRPIRDEYLIVQGGALAGTGAHSYSKGNATGGSEEAAKFKKAG

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte Formiat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 26 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 25 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 25 bindet.

Die Formiat-Dehydrogenase umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 26 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist.

Alternativ umfasst die Formiat-Dehydrogenase vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine

Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 25 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist.

Die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte NAD(P)H-Oxidase kann aus einer der Gruppen EC 1.6.3.1 (NAD(P)H-Oxidase (H₂O₂-bildend)), EC 1.6.3.2 (NAD(P)H-Oxidase (H₂O-bildend)), EC 1.6.3.3 (NADH- Oxidase (H₂O₂-bildend)) sowie EC 1.6.3.4 (NADH-Oxidase (H₂O-bildend)) stammen, wobei die H₂O- bildenden Klassen besonders bevorzugt sind.

Eine besonders bevorzugt eingesetzte H₂O-bildende NAD(P)H-Oxidase umfasst oder besteht vorzugsweise aus eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 30 oder SEQ ID Nr. 32 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. TI, SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 bindet.

SEQ ID Nr. 27:

ATGAAAGTAGTAGTAGTAGGCTGTACACATGCAGGAACAGCGGCAGTTAAGACGATTTTAAATGAAC ATCCAGATGCATCAGTATCAGTATATGAGCGTAATGACAATGTCTCATTTCTATCTTGTGGGATTGCGT TGTATGTTGGTGGAGTTGTGAAAGATCCTGCAGGTTTGTTTTATTCAAGTCCAGAAGAACTTGCATCA ATGGGCGCGAAAATTAACATGGAACACAATGTGAAAAATATAGATAATGAGAATAAGGTCGTAGTA ATTGAGAATTTAAAAACAGGCGAAACATTTGAAGAAAGCTATGATAAGTTGGTAATGACAACTGGAT CATGGCCAATTATTCCTCCAATTGATGGAATCAATAGTGAAAATATTCTTTTGTGTAAAAACTATAACC AAGCAAATGAAATTATTAAAGAATCAAAAAATGCTAAAAAGATTGTCATTGTTGGTGGTGGCTATATT GGAATTGAATTAGTTGAGGCATTTGCAGAATCTGGCAAGCAAGTGACGCTAGTTGATGGATTAGATC GTATTTTAAACAAATATTTAGATGCTGAATTCACTTCTGTTTTAGAGCATGATTTACAAGAAAGAGGC GTTACGCTAGCTTTAAACCAAACCGTCGAGAAATTTGTTGCCAATGAATCAGGTGCTGTGACAGCTGT GAAAACACCAGTTGGAGAATATGAGGCTGATTTAGTTATTTTATGTGTTGGATTTAAACCAAATACTG ATTTGTTGAAGGATAAAGTAGAGATGTTGCCAAATGGTGCCATCGTAGTGGATGAATATATGAGAAC AAGCGATGAAGCGATTTTTGCTGCTGGCGATAGTTGCGCGGTTCATTATAATCCAACTGGAGGCTCTG CGTATATTCCGTTAGCTACAAATGCAGTTAGAATGGGAGCTTTAGTTGGGAAAAATATTGTTTCTCCA ACAGTTAAATATCGTGGCACGCAAGCAACTTCTGGTTTATATTTATTTGGTTTTAATATAGGTTCAACC GGATTGACTGAAAATAGCGCTCCTCATTTTGGCGTAGAGGTTCGTTCAGTAGTTGTAGAAGATAATTA TCGTCCAGAGTTTATGCCGACAACAGAGAAAGTAACGATGAAATTAGTTTATGAAGTAGGAACGAAT CGGATTGTTGGAGGTCAAATCATGTCAAAATATGATGTGACACAATCTGCCAATACGTTATCTTTATG

TGTTCAAAATAAAATGACGATTGAGGATTTGGCTTATGTAGATTTCTTCTTCCAACCTCACTTTGATCG

TCCTTGGAACTATTTAAATATTTTAGCGCAAGCAGCTGTTGAGCAAGAGCGTAAACTAGCAAAATAA

SEQ. ID Nr. 28:

M KVVVVGCTHAGTAAVKTILNEHPDASVSVYERNDNVSFLSCGIALYVGGVVKDPAGLFYSSPEELASMG

AKINMEHNVKNIDNENKVVVIENLKTGETFEESYDKLVMTTGSWPIIPPIDGINSENILLCKNYNQANEIIKE

SKNAKKMVGGGYIGIELVEAFAESGKQVTLVDGLDRILNKYLDAEFTSVLEHDLQERGVTLALNQTVEKFV

ANESGAVTAVKTPVGEYEADLVILCVGFKPNTDLLKDKVEMLPNGAIVVDEYM RTSDEAIFAAGDSCAVH

YNPTGGSAYIPLATNAVRMGALVGKNIVSPTVKYRGTQATSGLYLFGFNIGSTGLTENSAPHFGVEVRSVV

VEDNYRPEFM PTTEKVTMKLVYEVGTNRIVGGQIMSKYDVTQSANTLSLCVQNKMTIEDLAYVDFFFQP

HFDRPWNYLNILAQAAVEQERKLAK

SEQ. ID Nr. 29:

ATGAGCAAAATTGTTATCGTGGGTGCAAATCATGCAGGCACCGCAGCAATTAATACCATTCTGGATAA

TTATGGCAGCGAAAATGAAGTGGTTGTGTTTGATCAGAATAGCAACATTAGCTTTCTGGGTTGTGGTA

TGGCACTGTGGATTGGTAAACAAATTAGCGGTCCGCAGGGTCTGTTTTATGCAGATAAAGAAAGCCT

GGAAGCAAAAGGTGCCAAAATCTATATGGAAAGTCCGGTTACCGCCATTGATTATGATGCAAAACGT

GTTACCGCACTGGTTAATGGTCAAGAACATGTTGAAAGCTACGAGAAACTGATTCTGGCAACCGGTA

GCACCCCGATTCTGCCTCCGATTAAAGGTGCAGCCATTAAAGAAGGTAGTCGCGATTTTGAAGCAACC

CTGAAAAATCTGCAGTTCGTGAAACTGTATCAGAATGCCGAAGATGTGATTAACAAACTGCAGGATA

AAAGCCAGAATCTGAATCGTATTGCAGTTGTTGGTGCAGGTTATATTGGTGTTGAACTGGCAGAAGC

ATTTAAACGTCTGGGTAAAGAAGTGATTCTGATTGACGTTGTTGATACCTGTCTGGCAGGTTATTATG

ATCAGGATCTGAGCGAAATGATGCGTCAGAATCTGGAAGATCATGGTATCGAACTGGCATTTGGTGA

AACCGTTAAAGCAATTGAAGGTGATGGTAAAGTGGAACGTATTGTTACCGATAAAGCAAGCCATGAT

GTGGATATGGTTATTCTGGCAGTTGGTTTTCGTCCGAATACAGCACTGGGTAATGCAAAACTGAAAAC

CTTTCGTAATGGTGCCTTTCTGGTGGATAAAAAACAAGAAACCAGCATCCCGGATGTTTATGCAATTG

GTGATTGTGCAACCGTGTATGATAATGCCATTAACGACACCAACTATATTGCACTGGCAAGCAATGCA

CTGCGTAGCGGTATTGTTGCAGGTCATAATGCAGCCGGTCATAAACTGGAAAGTCTGGGTGTTCAGG

GTAGCAATGGTATTTCAATTTTTGGCCTGAATATGGTTAGCACCGGTCTGACCCAAGAAAAAGCCAAA

CGTTTTGGTTATAATCCGGAAGTTACCGCCTTTACCGATTTTCAGAAAGCCAGCTTTATCGAGCATGAT

AACTATCCGGTTACGCTGAAAATTGTGTATGACAAAGATAGCCGTCTGGTTCTGGGTGCACAGATGG

CCAGCAAAGAAGATATGAGCATGGGTATTCACATGTTTAGCCTGGCCATTCAAGAGAAAGTTACCATT

GAACGTCTGGCCCTGCTGGATTATTTCTTTCTGCCGCATTTTAATCAGCCGTACAACTATATGACCAAA

GCAGCACTGAAAGCCAAATAA SEQ ID Nr. 30:

MSKIVIVGANHAGTAAINTILDNYGSENEVVVFDQNSNISFLGCGMALWIGKQISGPQGLFYADKESLEAK

GAKIYMESPVTAIDYDAKRVTALVNGQEHVESYEKLILATGSTPILPPIKGAAIKEGSRDFEATLKNLQFVKLY

QNAEDVINKLQDKSQNLNRIAVVGAGYIGVELAEAFKRLGKEVILIDVVDTCLAGYYDQDLSEMMRQNLE

DHGIELAFGETVKAIEGDGKVERIVTDKASHDVDMVILAVGFRPNTALGNAKLKTFRNGAFLVDKKQETSI

PDVYAIGDCATVYDNAINDTNYIALASNALRSGIVAGHNAAGHKLESLGVQGSNGISIFGLNMVSTGLTQE

KAKRFGYNPEVTAFTDFQKASFIEHDNYPVTLKIVYDKDSRLVLGAQMASKEDMSMGIHMFSLAIQEKVTI

ERLALLDYFFLPHFNQPYNYMTKAALKAK

SEQ ID Nr. 31:

ATGAAAGTAGTAGTAGTAGGCTGTACACATGCAGGAACAGCGGCAGTTAAGACGATTTTAAATGAAC

ATCCAGATGCATCAGTATCAGTATATGAGCGTAATGACAATGTCTCATTTCTATCTTGTGGGATTGCGT

TGTATGTTGGTGGAGTTGTGAAAGATCCTGCAGGTTTGTTTTATTCAAGTCCAGAAGAACTTGCATCA

ATGGGCGCGAAAATTAACATGGAACACAATGTGAAAAATATAGATAATGAGAATAAGGTCGTAGTA

ATTGAGAATTTAAAAACAGGCGAAACATTTGAAGAAAGCTATGATAAGTTGGTAATGACAACTGGAT

CATGGCCAATTATTCCTCCAATTGATGGAATCAATAGTGAAAATATTCTTTTGTGTAAAAACTATAACC

AAGCAAATGAAATTATTAAAGAATCAAAAAATGCTAAAAAGATTGTCATTGTTGGTGGTGGCTATATT

GCGATTGAATTAGTTGAGGCATTTGCAGAATCTGGCAAGCAAGTGACGCTAGTTGCGCGTAGCGATC

GTATTTTACGTAAATATTTAGATGCTGAATTCACTTCTGTTTTAGAGCATGATTTACAAGAAAGAGGCG

TTACGCTAGCTTTAAACCAAACCGTCGAGAAATTTGTTGCCAATGAATCAGGTGCTGTGACAGCTGTG

AAAACACCAGTTGGAGAATATGAGGCTGATTTAGTTATTTTATGTGTTGGATTTAAACCAAATACTGA

TTTGTTGAAGGATAAAGTAGAGATGTTGCCAAATGGTGCCATCGTAGTGGATGAATATATGAGAACA

AGCGATGAAGCGATTTTTGCTGCTGGCGATAGTTGCGCGGTTCATTATAATCCAACTGGAGGCTCTGC

GTATATTCCGTTAGCTACAAATGCAGTTAGAATGGGAGCTTTAGTTGGGAAAAATATTGTTTCTCCAA

CAGTTAAATATCGTGGCACGCAAGCAACTTCTGGTTTATATTTATTTGGTTTTAATATAGGTTCAACCG

GATTGACTGAAAATAGCGCTCCTCATTTTGGCGTAGAGGTTCGTTCAGTAGTTGTAGAAGATAATTAT

CGTCCAGAGTTTATGCCGACAACAGAGAAAGTAACGATGAAATTAGTTTATGAAGTAGGAACGAATC

GGATTGTTGGAGGTCAAATCATGTCAAAATATGATGTGACACAATCTGCCAATACGTTATCTTTATGT

GTTCAAAATAAAATGACGATTGAGGATTTGGCTTATGTAGATTTCTTCTTCCAACCTCACTTTGATCGT

CCTTGGAACTATTTAAATATTTTAGCGCAAGCAGCTGTTGAGCAAGAGCGTAAACTAGCAAAATAA

SE ID Nr. 32:

M KVVVVGCTHAGTAAVKTILNEHPDASVSVYERNDNVSFLSCGIALYVGGVVKDPAGLFYSSPEELASMG

AKINMEHNVKNIDNENKVVVIENLKTGETFEESYDKLVMTTGSWPIIPPIDGINSENILLCKNYNQANEIIKE SKNAKKIVIVGGGYIAIELVEAFAESGKQVTLVARSDRILRKYLDAEFTSVLEHDLQERGVTLALNQTVEKFV ANESGAVTAVKTPVGEYEADLVILCVGFKPNTDLLKDKVEMLPNGAIVVDEYM RTSDEAIFAAGDSCAVH YNPTGGSAYIPLATNAVRMGALVGKNIVSPTVKYRGTQATSGLYLFGFNIGSTGLTENSAPHFGVEVRSVV VEDNYRPEFM PTTEKVTMKLVYEVGTNRIVGGQIMSKYDVTQSANTLSLCVQNKMTIEDLAYVDFFFQP HFDRPWNYLNILAQAAVEQERKLAK

Die bevorzugt verwendete F O-bildende NAD(P)H-Oxidase umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 30 oder SEQ ID Nr. 32 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die F O-bildende NAD(P)H-Oxidase die Aminosäuresequenz SEQ. ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 30 oder SEQ ID Nr. 32 oder besteht aus dieser.

Alternativ umfasst die F O-bildende NAD(P)H-Oxidase vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. TI, SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die F O-bildende NAD(P)H- Oxidase kodiert, die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. TI , SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 oder besteht aus dieser.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer F O-bildende NAD(P)H- Oxidase zur Kofaktor-Regeneration (NAD(P)H zu NAD(P)⁺), welche eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 30 oder SEQ ID Nr. 32 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. TI , SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 bindet.

Materialien

D-Tagatose und D-Talitol wurden von TCI, D-Psicose wurde von TCI und Hunan Garden Naturals Inc. (China), D-Fructose, NADPH-Tetranatriumsalz, Aceton, 2-Propanol und Methanol wurden von PanReac AppliChem (ITW Reagents), Zinkchlorid, IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) wurden von Sigma- Aldrich, Magnesiumchlorid-Hexahydrat, Kaliumdihydrogenphosphat, di-Kaliumhydrogenphosphat, NAD⁺, NADH-Dinatriumsalz, NADP⁺-Dinatriumsalz sowie Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Carl Roth, Natriumformiat wurde von Fluka und Triethanolamin (TEA) wurde von Chem-Lab NV bezogen.

Produktion der Enzyme & Herstellung der Lysate

Allgemeines zur Expression von rekombinanten Enzymen in E. coli

Für die rekombinante Enzymproduktion in einem Escherichia co//-Stamm wurde zunächst das zu exprimierende Gen in einer PCR unter der Verwendung der genomischen DNA oder deren synthetisch an die Codon-Verwendung von E. coli angepasstes Äquivalent als Matrize zusammen mit spezifischen Oligonukleotiden, die zusätzlich Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen tragen, amplifiziert und aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Nach dem Nukleinsäure-Verdau mit den Restriktionsenzymen Sphl und Hindlll wurde das für das Target-Enzym kodierende Genfragment in das mit Sphl und Hindlll geschnittene Rückgrat des Expressionsvektors pQE70-Kan ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in chemisch kompetente E. co//-Zellen ToplOF transformiert und die entstandenen Kolonien wurden für die Plasmid-Isolierung und Restriktionsanalyse benutzt.

Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA- Sequenzierung überprüft. Das resultierende Konstrukt trägt das Target-Gen unter dem IPTG- induzierbaren T5-Promotor.

Für die Überexpression des Enzymes in E. coli wurde das resultierende Expressionsplasmid in die kompetenten Expressionszellen RB791 transformiert. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden entstandene Kolonien für die Expressionstests in LB-Medium angeimpft.

Am nächsten Tag wurden damit Expressionskulturen mit einer optische Dichte OD550 von 0,02 angeimpft und bei 37 °C geschüttelt, bis eine OD550 von 0,3 erreicht wurde. Anschließend wurde die Temperatur auf 25 °C gesenkt und die Kulturen wurden beim Erreichen einer OD550 von 0,5 mit 0,1 mM IPTG induziert. Nach 22 h wurden die Kulturen geerntet (vom Medium mittels Zentrifugation in Form eines Zellpellets abgetrennt) und auf die Expression des rekombinanten Enzymes mit Hilfe von SDS- Gelelektrophorese und einer Aktivitätsbestimmung (Verwendung in Use-Test oder optischenzymatischer Assay) analysiert.

Herstellung von Zell-Lysaten mittels Sonifier-Aufschlusses

Zur Herstellung einer Zell-Suspension wurde das nach obigen Verfahren hergestellte Zellpellet in einem geeigneten Gefäß eingewogen und mit Puffer und Lysozym (finale Konzentration 0,5 mg/ml) versetzt (z.B. Triethanolamin (TEA) - HCl) und unter Rührung gelöst. Der Massenanteil an Biomasse beträgt üblicherweise 20%, der Rest entfällt auf den Puffer.

Zum Zell-Aufschluss wurde ein Branson Sonifier 450 verwendet. Die Suspension wurde dreimal mit je 15 Ultraschall-Stößen (Einstellungen am Gerät: Timer = 15; Duty Cycle = 50; Output Control = 3 - 5) behandelt.

Das erhaltene Homogenat wurde 10 min lang bei 4 °C und 16000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5417R), um die unlöslichen Zellfragmente abzutrennen und das Lysat zu erhalten.

Tabelle 1. Enzymklassen und Spenderorganismen für die in den Beispielen verwendeten Enzyme.

Analytische Methoden

High Performance Liquid Chromatography

Zur Quantifizierung von D-Psicose, D-Tagatose und D-Fructose sowie der Zwischenstufe D-Talitol mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) wurde ein Agilent HPLC 1260 Infinity II Series System verwendet. Die Detektion erfolgte mittels eines Brechungsindex-Detektors (Rl-Detektion). Zur Messung wurde eine Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) Säule mit entsprechender Vorsäule verwendet und mit Reinstwasser isokratisch eluiert.

Bestimmung von Enzym-Aktivitäten (optisch-enzymatischer Assay)

Enzym-Aktivitäten in den Lysaten wurden mit einem Shimadzu UV-1900 Spektrophotometer bestimmt. Dazu wurde die Bildung bzw. der Verbrauch von NAD(P)H bei einer Wellenlänge von 340 nm über die Änderung der Absorption verfolgt. Die Messungen wurden mit 0,2 mM Kofaktor (NAD(P)⁺ oder NAD(P)H) durchgeführt. Dazu wurden 20 pl einer 10 mM Stock-Lösung des Kofaktors in einer Küvette (Greiner bio-one Semi-Micro-Küvette aus Polystyrol) vorgelegt und der gewünschte pH-Wert wurde mit 100 mM TEA-HCl-Puffer eingestellt (870 pl). 10 pl Lysat (verdünnt oder unverdünnt) und 100 pl Substrat-Lösung wurden zur Küvette zugesetzt und die Messung unmittelbar danach gestartet. Die Messungen wurden standardmäßig bei 25 °C durchgeführt. Über den Extinktionskoeffizienten von NAD(P)H bei 340 nm (E = 6220 L mol ¹ cm ¹) kann die Enzym-Aktivität des Lysats in U/ml (bezogen auf das Volumen des Lysats) oder U/g (bezogen auf die zur Herstellung eingesetzte Biomasse) bestimmt werden. 1 U steht dabei für 1 pmol Substratumsatz pro Minute (1 U = 1 pmol/min = l,67-10^_8 kat).

Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens noch näher beschrieben. Die in diesen Beispielen eingesetzten Lysate wurden nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Beispiel 1

Herstellung von D-Talitol aus D-Fructose - Kofaktor-Regeneration mit Alkoholdehydrogenase

Die Reaktion wurde in einem Labfors 5 Tisch-Bioreaktor (Infors AG) durchgeführt. Als Gefäß wurde ein Glasreaktor (Volumen 3,4 I) mit aufgesetztem Rührwerk und pH-Elektrode verwendet. Die pH- Kontrolle erfolgte durch die Zudosierung von IM NaOH oder IM H2SO4.

Zu Beginn wurden 50 ml einer D-Fructose-Lösung (500 g/l), 238,7 ml deionisiertes Wasser, 89 ml eines 200 mM TEA-HCl-Puffers (pH 7,5) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 35 °C gebracht.

Zum Start der Reaktion wurden 25 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat zugesetzt. Danach wurden 35 ml Oxidoreduktase I-Lysat, 8 kll Alkoholdehydrogenase I-Lysat, 10 ml einer 10 mM NAD⁺-Lösung sowie 40 ml 2-Propanol eingebracht.

Während des Betriebs wurden laufend Proben von der Reaktorlösung genommen, die folgendermaßen analysiert wurden: 100 pl der Reaktorlösung wurden mit 200 pl Methanol versetzt und im Eppendorf Thermomixer bei 60 °C und 1200 rpm für 15 min inkubiert. Die Probe wurde in einer Zentrifuge kurz zentrifugiert, mit 700 pl deionisiertem Wasser versetzt, gevortext und anschließend für 5 min bei max. g zentrifugiert. 200 pl des Überstands wurden in ein HPLC-Vial mit Insert überführt und mittels HPLC (Rl-Detektion) vermessen.

Nach 24 h und 42 h Laufzeit wurden je 15 ml 2-Propanol nachdosiert.

Nach 67 h wurden 98,0% der D-Fructose zu D-Talitol umgesetzt (gefundene Konzentration: 45,1 g/l).

Im Anschluss wurde der Reaktorinhalt unter Rührung für 30 min auf 70 °C erhitzt. Die heiße Mischung wurde durch einen Faltenfilter (Schleicher & Schuell 595 %, 185 mm) filtriert. Das Filtrat wurde mit Aktivkohle für 30 min bei 50 °C gerührt, wonach die Aktivkohle abfiltriert wurde (Faltenfilter Schleicher & Schuell 595 %, 185 mm). Die farblose Lösung wurde mit einem Mischbett-Ionentauscherharz (Amberlite MB20) für 30 min bei 50 °C behandelt, welches danach durch Filtration (Faltenfilter Schleicher & Schuell 595 %, 185 mm) entfernt wurde. Am Rotationsverdampfer (60 °C, 150 - 60 mbar) wurde die Lösung bis zu einer Konzentration von ca. 600 g/l D-Talitol aufkonzentriert. Der entstandene Sirup wurde über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank inkubiert. Da keine Kristallbildung beobachtet werden konnte, wurde ein Impfkristall zugesetzt und der Sirup wieder über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Der Sirup wurde mit demselben Volumen an IPA versetzt und bei -20 °C im Tiefkühlschrank gelagert, um die Kristallisation auszulösen. Die farblosen Kristalle wurden nach Anlegen eines Vakuums durch eine Glasfritte (P4, 10-16 pm) abfiltriert und 24 h bei 50 °C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Eine HPLC-Analyse der Kristalle (50 % Ausbeute) ergab, dass es sich bei dem Produkt um D-Talitol (Reinheit 94%) handelte.

Beispiel 2

Herstellung von D-Talitol aus D-Fructose - Kofaktor-Regeneration mit Formiat-Dehydrogenase

Zu Beginn wurden 17,5 g D-Fructose, 125 ml deionisiertes Wasser sowie 4,2 ml eines 500 mM TEA-HCI- Puffers (pH 7,5) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 35 °C gebracht.

Zum Start der Reaktion wurden 17,5 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat zugesetzt. Danach wurden 4,7 kll Oxidoreduktase I-Lysat, 5,5 kll Formiat-Dehydrogenase-Lysat, 3,5 ml einer 10 mM NAD⁺-Lösung sowie 45,5 ml einer 5 M Natrium-Formiat-Lösung eingebracht. Zur Entfernung des durch die Formiat- Dehydrogenase gebildeten CO2 wurde Luft in die Reaktionsmischung eingeblasen.

Nach 26 h wurden 99% der D-Fructose (50 g/l) zu D-Talitol umgesetzt (gefundene Konzentration: 34,4 g/l).

Beispiel 3

Oxidation von D-Talitol zu D-Tagatose (Kofaktor-Regenerierung mit NAD(P)H-Oxidase)

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vermischt: 147,2 pl deionisiertes Wasser, 125 pl eines 400 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8,5), 150 pl einer D-Talitol-Lösung (168 g/l), 35 pl Oxidoreduktase I I-Lysat, 10 U NAD(P)H-Oxidase-Lysat sowie 5 pl einer 5 mM NADP⁺-Lösung. Der Ansatz wurde in einem Eppendorf-Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln (24 °C, 800 rpm) für 20 h inkubiert.

Zur Analyse wurden 100 pl des Ansatzes mit 200 pl Methanol versetzt und im Eppendorf-Thermomixer bei 60 °C und 1200 rpm für 15 min inkubiert. Die Probe wurde in einer Zentrifuge kurz zentrifugiert, mit 700 pl deionisiertem Wasser versetzt, gevortext und anschließend für 5 min bei max. g zentrifugiert. 200 pl des Überstands wurden in ein HPLC-Vial mit Insert überführt und mittels HPLC (Rl- Detektion) vermessen.

Auf diese Weise wurden 81,7% des D-Talitols zu D-Tagatose (gefundene Konzentration: 47,7 g/l) umgesetzt.

Beispiel 4

Oxidation von D-Talitol zu D-Tagatose (Kofaktor-Regenerierung mit Alkoholdehydrogenase)

Die Reaktion wurde in einem Labfors 5 Tisch-Bioreaktor (Infors AG) durchgeführt. Als Gefäß wurde ein Glasreaktor (Volumen 3,4 I) mit aufgesetztem Rührwerk und pH-Elektrode verwendet. Die pH- Kontrolle erfolgte durch die Zudosierung von IM NaOH oder IM H2SO4. Zu Beginn wurden 43,8 ml einer D-Talitol-Lösung (571 g/l), 379,5 ml deionisiertes Wasser, 43,4 ml eines 500 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 30 °C gebracht.

Zum Start der Reaktion wurden 25 ml Oxidoreduktase Il-Lysat, 12 kll Alkoholdehydrogenase I I-Lysat sowie 25 ml Aceton eingebracht. Zusätzlich wurde ein Überdruckangelegt, um die Verdunstungsverluste zu minimieren.

Nach 14 h wurden 25 ml Oxidoreduktase Il-Lysat, 12 kll Alkoholdehydrogenase Il-Lysat sowie 5 ml einer 10 mM NADP⁺-Lösung eingebracht.

Nach 34 h wurden 43% des D-Talitols zu D-Tagatose umgesetzt (gefundene Konzentration: 18,1 g/l).

Beispiel 5

Herstellung von D-Tagatose aus D-Fructose (Eintopf-Verfahren)

Die Reaktion wurde in einem Labfors 5 Tisch-Bioreaktor (Infors AG) durchgeführt. Als Gefäß wurde ein Glasreaktor (Volumen 3,4 I) mit aufgesetztem Rührwerk, pH-Elektrode und O2-Sensor verwendet. Die pH-Kontrolle erfolgte durch die Zudosierung von IM NaOH oder IM H2SO4.

Zu Beginn wurden 50 ml einer D-Fructose-Lösung (500 g/l), 238,8 ml deionisiertes Wasser, 89 ml eines 200 mM TEA-HCl-Puffers (pH 7,5) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 35 °C gebracht.

Zum Start der Reaktion wurden 25 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat zugesetzt. Danach wurden 35 ml Oxidoreduktase I-Lysat, 8 kU Alkoholdehydrogenase I-Lysat, 10 ml einer 10 mM NAD⁺-Lösung sowie 40 ml 2-Propanol eingebracht.

Nach 24 h Laufzeit wurden 15 ml 2-Propanol nachdosiert.

Nach 47 h wurden 94,0% der D-Fructose zu D-Talitol umgesetzt (gefundene Konzentration: 41,3 g/l).

Nach Abkühlen des Reaktorinhalts auf 24 °C wurden 15 ml Oxidoreduktase Il-Lysat, 5 kll NAD(P)H- Oxidase-Lysat sowie 10 ml einer 5 mM NADP⁺-Lösung zugesetzt. Zusätzlich wurde der pH-Wert der Reaktorlösung auf 8 erhöht.

Nach 97 h Gesamtlaufzeit wurde der Reaktorinhalt auf 70 °C erhitzt, der pH-Wert auf 4 eingestellt und für 30 min bei 70 °C gerührt. Der Niederschlag wurde über eine Glasfritte (P3) abfiltriert.

Im Filtrat wurden 29,9 g/l D-Tagatose detektiert.

Das Filtrat wurde bis zu einer D-Tagatose-Konzentration von 257 g/l am Rotationsverdampfer aufkonzentriert.

Beispiel 6

Oxidation von D-Talitol zu D-Psicose

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vermischt: 30 pl deionisiertes Wasser, 250 pl eines 200 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8), 125 pl einer D-Talitol-Lösung (200 g/l), 50 pl Oxidoreduktase I- Lysat, 40 pl NADH-Oxidase-Lysat sowie 5 pl einer 10 mM NAD⁺-Lösung. Der Ansatz wurde in einem Eppendorf-Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln (30 °C, 800 rpm) für 20 h inkubiert.

Auf diese Weise wurden 75,3% des D-Talitols zu D-Psicose (gefundene Konzentration: 39,3 g/l) umgesetzt.

Beispiel 7 Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose (Eintopf-Verfahren)

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vermischt: 73,8 pl deionisiertes Wasser, 250 pl eines 200 mM TEA-HCl-Puffers (pH 7,5), 50 pl einer D-Fructose-Lösung (500 g/l) sowie 25 pl D-Psicose- 3-Epimerase-Lysat. Danach wurden 35 pl Oxidoreduktase I-Lysat, 8 U Alkoholdehydrogenase I-Lysat, 5 pl einer 10 mM NAD⁺-Lösung sowie 50 pl 2-Propanol zum Ansatz hinzugefügt. Der Ansatz wurde unter kontinuierlichem Schütteln (35 °C, 800 rpm) für insgesamt 20 h inkubiert.

Danach wurde der Ansatz 60 min lang auf 70 °C erhitzt. Nach Abkühlen wurden 25 pl Oxidoreduktase I- Lysat, 10 U NADH-Oxidase-Lysat, 5 pl einer 5 mM NAD⁺-Lösung sowie 100 ml deionisiertes Wasser zugesetzt. Der Ansatz wurde in einem Eppendorf-Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln (24 °C, 800 rpm) für weitere 20 h inkubiert.

Auf diese Weise wurden 76,9% der D-Fructose (50 g/l) zu D-Psicose umgesetzt (gefundene Konzentration: 39,9 g/l).

Beispiel 8

Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol

Zu Beginn wurden 98,8 ml einer D-Psicose-Lösung (508 g/l), 270,9 ml deionisiertes Wasser, 41,2 ml eines 500 mM TEA-HCl-Puffers (pH 7,5) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 35 °C gebracht.

Zum Start der Reaktion wurden 35 ml Oxidoreduktase Vll-Lysat, 12 kll Alkoholdehydrogenase I I-Lysat, 5 ml einer 10 mM NADP⁺-Lösung sowie 40 ml 2-Propanol eingebracht.

Nach 24 h und 48 h Laufzeit wurden je 20 ml 2-Propanol nachdosiert.

Nach 25 h konnten 94% der D-Psicose (100 g/l) zu D-Talitol reduziert werden - nach 52 h war die Reduktion vollständig (siehe Figur 2).

Zur Abtrennung der Enzyme wurde der Reaktorinhalt auf 70 °C erhitzt, der pH-Wert auf 4 eingestellt und für 30 min bei 70 °C gerührt. Der Niederschlag wurde über eine Glasfritte (P3) abfiltriert.

Der Zeitverlauf der D-Talitol-Konzentration ist in Figur 2 dargestellt. Der Vergleich zu den Zeitverläufen in der Publikation (Figur 6) von Sasahara et al. (1998) zeigt, dass die Reduktion von D-Psicose (10% = 100 g/l) zu D-Talitol mit einem in v/tro-System in ca. 1/10 der Zeit bewerkstelligt werden kann.

Beispiel 9

Herstellung von D-Talitol aus D-Glucose (Eintopf-Verfahren)

In diesem Beispiel wird D-Fructose mittels Glucose-Isomerase in situ aus D-Glucose generiert und weiter zu D-Talitol umgesetzt.

In einem 2 ml Glas-Vial wurden folgende Komponenten vermischt: 95,2 pl deionisiertes Wasser, 100 pl eines 500 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8), 100 pl einer D-Glucose-Lösung (500 g/l), 50 pl einer 5 mM MgSCU-Lösung sowie 15 mg Glucose-Isomerase (Streptomyces murinus; Sigma-Aldrich G4166).

Danach wurden zuerst 25 pl D-Psicose-3-Epimerase-Lysat und im Anschluss 35 pl Oxidoreduktase IX- Lysat, 12 U Alkoholdehydrogenase I-Lysat, 5 pl einer 10 mM NAD⁺-Lösung, sowie 50 pl 2-Propanol zugesetzt. Der Ansatz wurde unter kontinuierlichem Schütteln (40 °C, 800 rpm) für insgesamt 20 h inkubiert.

Zur Analyse wurden 100 pl des Ansatzes mit 200 pl Methanol versetzt und im Eppendorf-Thermomixer bei 60 °C und 1200 rpm für 15 min inkubiert. Die Probe wurde in einer Zentrifuge kurz zentrifugiert, mit 700 pl deionisiertem Wasser versetzt, gevortext und anschließend für 5 min bei max. g zentrifugiert. 200 pl des Überstands wurden in ein HPLC-Vial mit Insert überführt und mittels HPLC (Rl- Detektion) vermessen. Nach 20 h konnten 100 g/l D-Glucose zu 60 g/l D-Talitol umgesetzt werden.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Talitol, indem aus D-Fructose, welche in einer wässerigen Lösung gelöst vorliegt, durch Behandeln mit einer Epimerase in vitro D-Psicose gebildet wird, wonach die D-Psicose durch Behandeln mit einer NAD(P)H- abhängigen Oxidoreduktase in vitro zu D-Talitol reduziert und die Epimerase und die Oxidoreduktase abgetrennt oder deaktiviert werden.

2. Verfahren zur Herstellung von D-Talitol, dadurch gekennzeichnet, dass die nach Anspruch 1 hergestellte wässerige Lösung konzentriert und das D-Talitol auskristallisiert wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)⁺ mittels einer Alkoholdehydrogenase und einem sekundären Alkohol unter Bildung eines Ketons reduziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der sekundäre Alkohol 2-Propanol ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)⁺ mittels einer Formiat-Dehydrogenase und Formiat unter Bildung von Kohlenstoffdioxid reduziert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die NAD(P)H- abhängige Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ. ID Nr. 10, SEQ. ID Nr. 12, SEQ. ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr.

15, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet.

7. Verfahren zur Herstellung von D-Talitol oder D-Psicose umfassend den Schritt des Behandelns von D-Psicose oder D-Talitol mit einer Oxidoreduktase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ. ID Nr. 10, SEQ. ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr.

15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 bindet.

8. Verfahren zur Herstellung von D-Talitol umfassend den Schritt des Behandelns von D-Psicose mit einer Oxidoreduktase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet.

9. Verwendung einer Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol oder zur Oxidation von D-Talitol zu D-Psicose umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr.

20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ. ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 bindet.

10. Verwendung einer Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu D-Talitol umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 24 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 23 bindet.

11. Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung von D-Tagatose oder D-Psicose, dadurch gekennzeichnet, dass die nach den Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 6 hergestellte, wässerige, D-Talitol enthaltende Lösung in vitro mit einer NAD(P)⁺-abhängigen Oxidoreduktase unter Bildung von reduziertem Kofaktor NAD(P)H behandelt wird, um D-Talitol zu D-Tagatose bzw. D-Talitol zu D-Psicose zu oxidieren, wonach die Oxidoreduktase abgetrennt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Oxidation entstandene, reduzierte Kofaktor NAD(P)H mittels einer Oxidase und Sauerstoff zu NAD(P)⁺ oxidiert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Oxidation entstandene, reduzierte Kofaktor NAD(P)H mittels einer Alkoholdehydrogenase und eines Ketons zu NAD(P)⁺ oxidiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Keton Aceton ist.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase zur Oxidation von Kofaktor NAD(P)H zu NAD(P)⁺ eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 30 oder SEQ ID Nr. 32 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. TI, SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 31 bindet.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es als Eintopf- Reaktion ohne Isolierung von Zwischenprodukten durchgeführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme als Homogenat oder Lysat, Lyophilisat oder sprühgetrocknetes Enzymprodukt der entsprechenden, sie bildenden Zellen vorliegen, die Enzyme mit einem wasserlöslichen Polymer, vorzugsweise Polyethylenglycol, am N-Terminus modifiziert, oder die Enzyme in oder auf einer festen Matrix immobilisiert oder Teil eines Fusionsproteins sind.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die NAD(P)⁺- abhängige Oxidoreduktase zur Oxidation von D-Talitol zu D-Tagatose eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die NAD(P)⁺- abhängige Oxidoreduktase zur Oxidation von D-Talitol zu D-Psicose eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ. ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr.

15, SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19 bindet.

20. Verfahren zur Herstellung von D-Tagatose umfassend den Schritt des Behandelns von D-Talitol mit einer Oxidoreduktase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.

21. Verwendung einer Oxidoreduktase zur Oxidation von D-Talitol zu D-Tagatose umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3 bindet.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8 und 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Formiat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 26 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 25 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 25 bindet.