EP4652266A1 - Biotin-produktion in mikroorganismen, die gene für pantothenatkinasen mit verminderter produkthemmung durch coenzym a exprimieren - Google Patents

Biotin-produktion in mikroorganismen, die gene für pantothenatkinasen mit verminderter produkthemmung durch coenzym a exprimieren

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Publication number
EP4652266A1
EP4652266A1 EP23798673.2A EP23798673A EP4652266A1 EP 4652266 A1 EP4652266 A1 EP 4652266A1 EP 23798673 A EP23798673 A EP 23798673A EP 4652266 A1 EP4652266 A1 EP 4652266A1
Authority
EP
European Patent Office
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biotin
coenzyme
enzyme
dtb
feedback
Prior art date
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Pending
Application number
EP23798673.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Carina SOMMER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie AG filed Critical Wacker Chemie AG
Publication of EP4652266A1 publication Critical patent/EP4652266A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01033—Pantothenate kinase (2.7.1.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the invention provides a process for the production of biotin, dethiobiotin (DTB), or a mixture thereof, characterized in that a microbial production strain is cultivated which recombinantly expresses at least one coenzyme A feedback-resistant enzyme with the enzymatic activity of a pantothenate kinase (enzymatic activity of proteins of class EC 2.7.1.33), and then biotin or DTB or a mixture thereof is isolated.
  • DTB dethiobiotin
  • Biotin (D-biotin, vitamin B7, vitamin H, CAS number 58-85-5) is a water-soluble vitamin from the B complex. It plays an important role as a prosthetic group of enzymes in cellular metabolism, where it activates the otherwise inert CO2 in carboxylation reactions. Biotin-dependent enzymes include malonyl-CoA synthase, propionyl-coA carboxylase, pyruvate carboxylase, and geranyl-coA carboxylase. Biotin is a vitamin of great commercial importance as an additive in food supplements, animal feed, cosmetics, and the pharmaceutical sector.
  • Dethiobiotin (desthiobiotin, DTB, CAS number 533-48-2) is the biosynthetic precursor of biotin. Biotin is formed by the enzymatically catalyzed incorporation of sulfur into DTB. The microbial biosynthesis of biotin and the regulation of its biosynthesis are known (see review Sirithanakorn and Cronan, 2021, FEMS Microbiol. Rev. 45: fuab003). The biosynthesis of biotin in microorganisms is strictly regulated, so that no biotin can be detected in a wild-type strain with a functional biotin biosynthesis pathway (see also the examples of the present invention).
  • the functional biotin biosynthesis pathway is demonstrated by the fact that the wild-type strain grows on a minimal medium (defined mineral salt medium without biotin) can grow without biotin supplementation, while a biotin-auxotrophic mutant of the strain does not grow under the same conditions.
  • a minimal medium defined mineral salt medium without biotin
  • biotin-auxotrophic mutant of the strain does not grow under the same conditions.
  • Biotin biosynthesis is subject to strict regulation, and the biotin synthesized by the microorganism is immediately incorporated into the relevant enzymes as a cofactor and is not present in a free form. Furthermore, microorganisms can absorb biotin from the environment, and with a sufficient supply of biotin, e.g., from a culture medium, biotin synthesis, which is metabolically costly for the microorganism, is completely shut down. Thus, a WT strain will not produce its own biotin even with sufficient external supply.
  • Pantothenic acid (vitamin B5, CAS number 79-83-4 for the R-form, CAS number 5999-54-2 for the racemate, CAS number 137-08-6 for the Ca salt) is the central biosynthetic precursor of coenzyme A (CoA), which serves in metabolism to activate acyl groups (e.g., as acetyl-CoA, succinyl-CoA, or malonyl-CoA in the citric acid cycle, fatty acid synthesis, or fatty acid oxidation).
  • CoA coenzyme A
  • the biosynthesis of CoA is well known (see review by Leonardi and Jackowski, 2007, EcoSal Plus, 2).
  • Coenzyme A is produced from pantothenic acid via five enzymatic steps.
  • the first step of coenzyme A biosynthesis is described by the following equation: (1) catalyzed by the enzyme pantothenate kinase (EC 2.7.1.33, referred to as CoaA, CoaA enzyme or PanK).
  • pantothenate kinase EC 2.7.1.33, referred to as CoaA, CoaA enzyme or PanK.
  • Type I CoaA is represented, for example, by the enzyme from E. coli.
  • the activity of type I CoaA is feedback-inhibited by coenzyme A or its CoA thioester.
  • Type II CoaA enzymes are represented by the Staphylococcus aureus enzyme, which is not feedback-inhibited.
  • Type III CoaA enzymes are represented by the Pseudomonas aeruginosa enzyme, which is also not feedback-inhibited.
  • the microorganisms that express type II and type III CoaA enzymes are primarily pathogenic bacteria, whose genes one wants to avoid as much as possible in metabolic engineering. The influence of type I, type II, or type III CoaA enzymes on biotin synthesis has not yet been investigated.
  • pantothenate kinase which represents type I CoaA
  • pantothenate kinase is encoded by the coaA gene.
  • the activity of the CoaA enzyme is inhibited by coenzyme A, the end product of the biosynthetic pathway.
  • Coenzyme A is thus an inhibitor of the CoaA enzyme.
  • This form of product inhibition is characteristic of many metabolic pathways in microorganisms such as E. coli, ensuring that a microorganism produces only as much of the metabolite (in this case, coenzyme A) as is needed by the organism.
  • Pantothenate kinase is therefore the key enzyme for coenzyme A biosynthesis.
  • the aim of the investigations by Rock et al. was to produce mutants of the CoaA enzyme with reduced feedback inhibition of the enzyme activity by coenzyme A.
  • reduced feedback inhibition is used in the present invention synonymously with the term “increased feedback resistance” (feedback resistance or feedback-resistant, abbreviated to fbr).
  • fbr mutants of the CoaA are also referred to as coenzyme A feedback-resistant mutants of the CoaA
  • pantothenate kinase enzyme, or pantothenate kinase.
  • the WT CoaA enzyme is characterized by the fact that its enzyme activity in the presence of 20 ⁇ M coenzyme A is only approximately 40% of the activity of the WT CoaA enzyme without added coenzyme A. Coenzyme A is therefore an inhibitor of the WT CoaA enzyme.
  • the so-called inhibitor constant IC 50 indicates the concentration of an inhibitor at which the activity of an enzyme is only 50% of its activity without the inhibitor. According to Rock et al. (Fig. 4A), the IC 50 for the CoaA enzyme from E. coli is therefore less than 20 ⁇ M.
  • Point mutants of the CoaA enzyme which were mutated in one of the three amino acids R106 (fbr mutant CoaA [R106A]), H177 (fbr mutant CoaA [H177Q]), and F247 (fbr mutant CoaA [F247V]), were characterized by the fact that they no longer exhibited product inhibition towards coenzyme A (see Fig. 2 and Fig. 4A in Rock et al.). The fbr mutants were characterized with regard to their enzymatic properties.
  • biotin is currently produced chemically.
  • a thirteen-step synthesis starting from fumaric acid is known.
  • a biotechnological process for producing biotin is of great interest.
  • biotechnological approaches for the production of biotin production strains primarily target the recombinant expression of the various biotin biosynthetic genes, namely the bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, and bioH genes, or their functionally analogous genes.
  • biotin biosynthetic genes namely the bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, and bioH genes, or their functionally analogous genes.
  • HTS high-throughput screening
  • the object of the present invention was therefore to provide a process for the fermentative production of biotin or its biosynthetic precursor dethiobiotin.
  • the object is achieved by a process for the production of biotin, dethiobiotin (DTB), or a mixture thereof, characterized in that a microbial production strain is cultivated which recombinantly expresses at least one coenzyme A feedback-resistant enzyme with the enzymatic activity of a pantothenate kinase (enzymatic activity of proteins of class EC 2.7.1.33), and then biotin or DTB or a mixture thereof is isolated.
  • DTB dethiobiotin
  • the gene recombinantly expressed in the production strain which expresses a coenzyme A feedback-resistant enzyme with the enzymatic activity of a pantothenate kinase (enzymatic activity of proteins of class EC 2.7.1.33), may be a
  • WT gene encoding a CoaA enzyme not inhibited by coenzyme A feedback (e.g. encoding a pantothenate kinase type II or III), wherein the WT gene is either homologously overexpressed in the strain of origin or heterologously expressed in a strain other than the one from which it was isolated, with heterologous expression being preferred, or
  • mutated gene which in its wt form encodes a CoaA enzyme inhibited by coenzyme A feedback, which encodes a feedback-resistant CoaA enzyme due to the mutation.
  • the method is characterized in that the gene expressing the coenzyme A feedback-resistant enzyme with pantothenate kinase activity is a mutated gene that, in its wt form, encodes a coenzyme A feedback-inhibited CoaA enzyme. It is preferred that the pantothenate kinase is a bacterial type I CoaA.
  • pantothenate kinases are accessible, for example, in the NCBI database under the search term “pantothenate kinase”.
  • pantothenate kinases covered by the invention are pantothenate kinases selected from Escherichia coli, Pantoea ananatis, Raoultella terrigena, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Pasturella multocida, Haemeophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemocomitans, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diptheriae, and Streptomyces coelicolor. Protein and gene sequences of the selected pantothenate kinases can be found in sequence databases familiar to the expert, such as the NC
  • terrigena leads to the deregulation of biotin biosynthesis, thereby producing more biotin and its biosynthetic precursor DTB than is required for the viability of the microorganism. This results in freely available biotin and DTB.
  • the freely available biotin and DTB are exported (secreted) from the cell, so that the two products can be easily isolated from the cell culture supernatant after separation of the biomass.
  • pantothenate kinase that is feedback-inhibited in its wt form by coenzyme A, which has been mutated to a feedback-resistant enzyme to deregulate biotin biosynthesis.
  • the pantothenate kinase is particularly preferably CoaA from E. coli.
  • a great advantage of the present invention is that a process is provided for the fermentative production of biotin and/or DTB by using microorganism strains which are known feedback-resistant mutants of the CoaA
  • Metabolic engineering in contrast to biotransformation, is a biotechnology method in which an organism's metabolic pathways are modified by optimizing or altering genetic and regulatory processes. By supplementing the genome with enzyme genes, new or modified enzymes can be introduced into an organism, or genes of endogenous enzymes can be expressed in an increased or weakened form, thereby establishing new metabolic pathways in an organism or strengthening or weakening existing metabolic pathways.
  • the goal of metabolic engineering is for the organism to produce either a new metabolic product or a cellular metabolic product with increased yield.
  • a nutrient medium also referred to as a culture medium, which is required for the growth of the organism in question and is composed of a C source (e.g., glucose), an N source (e.g., an ammonium salt or a complex amino acid mixture such as peptone or yeast extract), and other salts required for growth.
  • C source e.g., glucose
  • N source e.g., an ammonium salt or a complex amino acid mixture such as peptone or yeast extract
  • the production strains disclosed in the present invention for the production of biotin and DTB originate from metabolic engineering approaches.
  • biotransformation is defined as the conversion of one or more reactants into a product under enzymatic catalysis, whereby the enzyme substrate is added to a reaction mixture with the enzyme and converted enzymatically.
  • the Enzymatic conversion of DTB to biotin is a biotransformation.
  • the open reading frame (ORF, synonymous with cds, coding sequence) is the region of DNA or RNA that begins with a start codon and ends with a stop codon and codes for the amino acid sequence of a protein.
  • the ORF is also referred to as the coding region or structural gene.
  • a gene, or expression unit is the DNA segment that contains all the basic information for producing biologically active RNA.
  • a gene contains the DNA segment from which a single-stranded RNA copy is produced through transcription, and the expression signals involved in regulating this copying process.
  • the expression signals include at least a promoter, a transcription start site, a translation start site, and a ribosome binding site (RBS). Further possible expression signals include a terminator and one or more operators.
  • bacterial proteins such as CoaA or PanK begin with a capital letter, while the sequences encoding these proteins (cds) are denoted by a lowercase letter (e.g., coaA or panK).
  • cds sequences encoding these proteins
  • a lowercase letter e.g., coaA or panK
  • the promoters controlling the expression of these cds are denoted by a lowercase letter (e.g., tac promoter).
  • a gene construct is a DNA molecule produced by cloning that contains at least one expression unit and may also contain other genetic elements, such as selection markers and the origin of replication.
  • the gene construct can be a linear DNA molecule integrated into the genome or a circular DNA molecule in the form of a plasmid, also known as a vector. This vector is then referred to as an expression vector.
  • the genetic elements of the vector When introduced (transformed) into a suitable host strain, the genetic elements of the vector cause its extrachromosomal inheritance during cell growth and the production of the protein encoded by the cds.
  • a promoter is a nucleotide sequence located upstream of the 5' end of the cds, which enables the expression of a cds.
  • the promoter is located upstream of the coding region in the direction of synthesis.
  • the promoter contains regions that determine the start of transcription of the gene by RNA polymerase and can also mediate the specific interaction with DNA-binding proteins (transcription factors) that influence transcription strength.
  • all promoters active in the host strain are suitable. This includes, for example, all native promoters of the approximately 5000 genes in E. coli, but also non-native ones (e.g.
  • Preferred promoters are native promoters from a strain of the Enterobacteriaceae family and artificial promoters such as the tac promoter, particularly preferred are native promoters from E. coli and artificial promoters such as the tac promoter.
  • the tac promoter as described, for example, in De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25, Fig. 2 (referred to therein as PtacI), is particularly preferred.
  • mRNA also called messenger RNA
  • messenger RNA is a single-stranded ribonucleic acid (RNA) that carries the genetic information for building a protein.
  • RNA ribonucleic acid
  • the mRNA molecule carries the message from the genetic information (DNA) necessary for protein construction to the protein-building ribosomes. In a cell, it is formed as a transcript of a subset of a gene. section of DNA. The genetic information stored in the DNA is not changed.
  • homologous genes or homologous DNA sequences are understood to mean that the nucleotide sequences of these genes or DNA segments are at least 70%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% identical.
  • the degree of DNA identity is determined using the "nucleotide blast” program, available at http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, which is based on the blastn algorithm.
  • the preset parameters were used as algorithm parameters for aligning two or more nucleotide sequences.
  • Homologous protein sequences mean that the amino acid sequences of these proteins or protein segments are at least 70%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% identical.
  • the default parameters were used as algorithm parameters for an alignment of two or more protein sequences.
  • Recombinantly expressed proteins are those produced using genetically modified microorganisms or genetically modified cell cultures.
  • Homologous expression means that a DNA segment (e.g. gene, cds or gene fragment) is recombinantly expressed in the microorganism from which it was isolated.
  • a DNA segment e.g. gene, cds or gene fragment
  • Heterologous expression means that a DNA segment (e.g. gene, cds or gene fragment) is recombinantly expressed in a different microorganism than the one from which it was isolated.
  • a DNA segment e.g. gene, cds or gene fragment
  • Wt wild type gene
  • a wild-type gene is the form of a gene that has naturally evolved through evolution and is present in the wild-type genome.
  • the DNA sequence of Wt genes is publicly available in databases such as NCBI.
  • Mutants are defined as the states of a gene that can be converted into one another by changes in the nucleotide sequence of the DNA.
  • the gene naturally occurring in a microorganism is referred to as the wild-type gene, and the variants derived from it are referred to as mutated genes.
  • the mutants of the present invention are point mutants, in which the DNA sequence of the gene is altered in such a way that only one amino acid of the protein sequence changes.
  • Recombinant expression of the CoaA enzyme is achieved by culturing the production strain.
  • the culture can be carried out on a laboratory scale by shake flask cultivation or on an industrial scale by fermentation, and the pantothenate kinase Activity can be examined from an aliquot of the resulting culture broth, i.e., the term "culture” is the generic term for cultivation in shake flasks or by fermentation.
  • Cell cultivation on an industrial scale is preferably carried out by fermentation.
  • Fermentation is a process step for the production (cultivation) of cell cultures on an industrial scale, in which a preferred microbial production strain is induced to grow under defined conditions of culture medium, temperature, pH, oxygen supply, and medium mixing. If all components of the fermentation are determined at the beginning of the cultivation and then not changed, this is referred to as batch fermentation.
  • media components such as e.g.
  • feed process If glucose (C source) or a complex amino acid mixture such as yeast extract (N source) is continuously added as a so-called feed, this is referred to as a fed-batch fermentation (so-called feed process).
  • Fed-batch fermentation can optimize the formation of biomass and target product.
  • the aim of fermentation is, depending on the configuration (genetic makeup) of the production strain, the production of a protein/enzyme or a metabolite, in each case with the highest possible yield for further use.
  • the product biotin can be produced by fermentation.
  • the end product of fermentation is a fermenter broth consisting of the biomass of the cells of the production strain (fermenter cells) and the fermentation medium (fermentation supernatant) freed of the biomass, which was formed during fermentation from the culture medium and the metabolites secreted by the fermenter cells.
  • the culture medium which is defined by its chemical composition
  • the composition of the fermentation medium is not clearly defined due to the unpredictable formation of metabolic products.
  • the product biotin is produced by fermentation.
  • Biotin and/or DTB can be used directly from the fermenter broth without further processing steps or can be enriched or purified using known methods. Such methods are known to the person skilled in the art, for example, from processes for
  • Isolation of amino acids is known. These include, for example, filtration, centrifugation, extraction, adsorption, ion exchange chromatography, precipitation, and crystallization.
  • the use according to the invention of feedback-resistant pantothenate kinases for the production of biotin and/or DTB comprises the use of a recombinant microorganism strain, wherein the microorganism strain is also referred to as a microbial production strain.
  • Production strain is a microorganism strain that can produce the desired product, in this case biotin and/or DTB, and by definition comprises a microorganism, referred to as host strain, and at least one gene construct.
  • a production strain for the production of biotin and/or DTB is characterized in that it contains a gene construct which comprises an expression unit, at least comprising the cds of a feedback-resistant pantothenate kinase, preferably the cds of a feedback-resistant mutant of a pantothenate kinase which is feedback-sensitive in its WT form, each functionally linked to a promoter.
  • the production strain is preferably characterized in that the gene construct is an expression vector.
  • biotin biosynthesis pathway is genetically defined by the genes bioA (7,8-diaminononanoate transaminase, enzymatic activity of proteins of class EC 2.6.1.62), bioB (biotin synthase, EC 2.8.1.6), and bioC (Malonyl-CoA O-methyltransferase, EC 2.1.1.197), bioD (Dethiobiotin synthase, EC 6.3.3.3), bioF (8-amino-7-oxononanoate synthase, EC 2.3.1.47), and bioH (Pimeloyl-[Acyl-Carrier Protein] Methylester Esterase, EC 3.1.1.85) or by genes functionally analogous to these genes.
  • biotin biosynthesis pathway An overview of the biotin biosynthesis pathway is provided by the KEGG Pathway Database under the entry "Biotin Metabolism.” Microorganisms with a biotin biosynthesis pathway are also capable of growing in a biotin-free culture medium without biotin supplementation.
  • the gene expressing a coenzyme A feedback-resistant enzyme with the enzymatic activity of a pantothenate kinase is preferably a bacterial gene, particularly preferably a bacterial gene from the Enterobacteriaceae family and especially preferably the coaA gene of Escherichia coli.
  • the coenzyme A feedback-resistant mutants of pantothenate kinase are mutants of the E. coli coaA gene with a cds selected from SEQ ID NO: 3, encoding a protein with
  • SEQ ID NO: 8 or a nucleotide sequence which is at least 70%, particularly preferably at least 80% and especially preferably at least 90% identical thereto, which encodes a protein with pantothenate kinase activity which is feedback-resistant to coenzyme A.
  • the method is preferably characterized in that the coenzyme A feedback-resistant enzyme with the enzymatic activity of a pantothenate kinase has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence which is at least 70%, particularly preferably at least 80% and especially preferably at least 90% identical thereto. it is particularly preferred that the amino acid sequence of the enzyme comprises the mutation R106A.
  • the coenzyme A feedback-resistant mutant of pantothenate kinase is the mutant of the E. coli coaA gene with the cds SEQ ID NO: 3.
  • the method is accordingly preferably characterized in that the enzyme has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence of the WT protein of the pantothenate kinase which has then been mutated to CoA feedback-resistant amino acid sequence contains a conserved amino acid sequence motif selected from the following peptide sequences: i) Peptide sequence GSVAVGKST (TS)(AS)R (VLI)LQX (LI)L, as indicated, for example, in the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 from position 95 to 112, where T at position 104 of SEQ ID NO: 2 can also be an S, A at position 105 of SEQ ID NO: 2 can also be an S, V at position 107 of SEQ ID NO: 2 can also be an L or
  • I and L at position 111 of SEQ ID NO: 2 can also be an I, or ii) peptide sequence AP(VI)YSH(X)(X)YD, as shown, for example, in the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 from positions 172 to 181, where V at position 174 of SEQ ID NO: 2 can be an I, the amino acids L at position 178 and I at position 179 of SEQ ID NO: 2 are not conserved, or
  • amino acid sequence motif is defined as a short amino acid sequence within the protein sequence of a protein that occurs in many homologous sequences of other microorganisms and denotes a sequence section that is important for the function of the protein.
  • a conserved amino acid sequence motif can also contain individual amino acids that are replaced by one or two other amino acids in homologous sequences. In peptides i) to iii), these amino acids are explicitly named and preferred. Non-conserved amino acids can be any amino acid and are designated by the wildcard X and are not preferred. Peptide ii), for example, contains two non-conserved amino acids.
  • the amino acid sequence is represented in a one-letter code, as is familiar to the person skilled in the art.
  • the WT protein sequence comprises the
  • the WT protein sequence of the pantothenate kinase then mutated to CoA feedback-resistant comprises the amino acid sequence motif GSVAVGKST (TS)(AS)R(VLI)LQX (LI)L, as indicated, for example, in the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 from position 95 to 112.
  • pantothenate kinase enzyme activity test can be carried out as follows: i) Preparation of the enzyme to be tested:
  • An enzyme produced by cultivation in a shake flask or in a fermentation can be used in the reaction as follows: as an aliquot from the not further processed
  • the total protein concentration obtained in each case can be determined, for example, with a commercially available Qubit 3.0 fluorometer from Thermo Fisher Scientific using the "Qubit® Protein Assay Kit” according to the manufacturer's instructions.
  • ii) Determination of pantothenate kinase enzyme activity The test is carried out according to a test described by Strauss and Begley (2002), J. Biol. Chem.
  • pantothenate kinase enzyme reaction according to equation (1) (consumes ATP to form ADP) is related to the reaction of pyruvate kinase, equation (2) (consumes phosphoenolpyruvate in the test by reaction with the phosphoenolpyruvate in the pantothenate kinase
  • reaction formed ADP with formation of pyruvate and ATP) and lactate dehydrogenase, equation (3) (reduces pyruvate to lactate with consumption of NADH).
  • a solution buffered with Tris-HCl to pH 7.6 contains the following test components (final concentration in the solution in brackets): ATP (1.5 mM), NADH (0.3 mM), phosphoenolpyruvate (0.5 mM), MgCl 2 x 7 H 2 O (10 mM), KCl (20 mM), pyruvate kinase (5 units/ml), lactate dehydrogenase (5 units/ml), and pantothenate kinase from i).
  • the amount of pantothenate kinase used from i) depends on the degree of purification.
  • test broth If culture broth, cell suspension of the reisolated cells, cell homogenate, or cell extract is used, at least 0.1 mg of the enzyme fractions prepared in i) is used.
  • purified enzyme at least 5 pg of the purified enzyme fraction is used.
  • the test volume is 1 ml.
  • the temperature at which the test is carried out is 25°C.
  • the test mixture is placed in a 1 ml cuvette in a spectrophotometer set to a wavelength of 340 nm.
  • the reaction is started by the addition of Ca pantothenate (160 ⁇ M final concentration). The measurement takes 5 minutes.
  • the decrease in absorbance at 340 nm indicates the activity of pantothenate kinase according to equations (1) to (3).
  • a ⁇ E at 340 nm of at least 0.02 is required after five minutes.
  • I has the enzyme activity of an enzyme designated EC 2.7.1.33 in the KEGG database, which catalyses the reaction of pantothenic acid to 4'-phosphopantothenate according to equation (1),
  • Pantothenate kinase can originate from the same microbial strain as the host strain (homologous pantothenate kinase) or it can be a foreign gene (heterologous pantothenate kinase), either synthetically produced (including the resulting adaptation of the cds to expression in the host strain through so-called codon optimization) or isolated from strains other than the host strain.
  • the homologous gene of a pantothenate kinase is preferred.
  • Preferred variants of pantothenate kinase exhibit feedback inhibition by coenzyme A that is reduced by at least a factor of 5 compared to the corresponding wild-type enzyme.
  • Particularly preferred CoaA variants exhibit feedback inhibition by coenzyme A that is reduced by at least a factor of 10 compared to the corresponding wild-type enzyme.
  • Particularly preferred CoaA variants exhibit no feedback inhibition by coenzyme A.
  • the factor of reduced feedback inhibition by coenzyme A is determined by a CoaA enzyme test as described above, for example.
  • the enzyme test is carried out without and in the presence of different concentrations of coenzyme A, and the respective enzyme activity is determined.
  • a reference relationship is thus established between enzyme activity and the coenzyme A concentration in the enzyme test (referred to as the control).
  • the enzyme activity of a WT enzyme without added coenzyme A is defined as 100% activity, and the coenzyme A concentration at which 50% activity is still measured is defined as the IC 50 (concentration of the inhibitor CoA in the test at which 50% of the enzyme activity is still measured without the addition of CoA).
  • the IC 50 is determined analogously for each mutant.
  • the factor of reduced feedback inhibition is determined by comparing the IC 50 of the mutant is divided by the IC 50 of the WT enzyme. For example, if a WT CoaA enzyme has an IC 50 for coenzyme A of 20 ⁇ M and the CoaA mutant has an IC 50 of 100 ⁇ M, the factor of reduced feedback inhibition is five. If the IC 50 of a mutant is determined to be 200 ⁇ M coenzyme A, the factor of reduced feedback inhibition is ten.
  • this mutant is defined as not feedback inhibitable by coenzyme A and shows no feedback inhibition by coenzyme A.
  • CoaA[H177Q] histidine of the E. coli CoaA enzyme at position 177 replaced by glutamine, referred to as fbr mutant CoaA-H177Q.
  • CoaA[F247V] phenylalanine of the E. coli CoaA enzyme at position 247 replaced by valine, referred to as fbr mutant CoaA-
  • Microorganism strains suitable as production strains include bacterial strains selected from the families Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae, Bacillaceae, or Gammaproteobacteria, as well as yeasts (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica) or fungi (e.g., Aspergillus niger).
  • the method is preferably characterized in that the microbial production strain is a bacterial strain, particularly preferably a strain of the family Enterobacteriaceae.
  • the bacterial strain is preferably selected from the group consisting of Corynebacterium ssp. (such as, particularly preferably, C.
  • the method is preferably characterized in that the microbial production strain is a strain of the species Escherichia coli, Raoultella terrigena or Pantoea ananatis and especially preferably of the species Escherichia coli.
  • the microorganism is the strain E. coli K12 W3110, commercially available under the strain number DSM 5911 from the DSMZ
  • a production strain containing a gene construct comprising an expression unit for a feedback-resistant mutant of a pantothenate kinase and thus for biotin and DTB
  • the expression unit preferably contains at least one cds selected from the group of feedback-resistant mutants a), b) or c), particularly preferably selected from a) or c) and especially preferably the mutant a) of the coaA gene: a)
  • the production strain comprises the cds of a modified coaA-
  • the conserved arginine is arginine at position 106 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, whereby the arginine can be mutated to all other 19 of the 20 natural amino acids, provided that the mutant still has pantothenate kinase activity but is no longer inhibited by coenzyme A.
  • the conserved arginine is arginine at position 106 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, whereby the arginine is mutated to alanine (mutation R106A).
  • the production strain comprises the cds of an altered coaA-
  • Pantothenate kinase activity is no longer present
  • the conserved histidine is preferably histidine at position 177 of the
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 wherein the histidine can be mutated to any of the other 19 of the 20 natural amino acids, provided that the mutant still possesses pantothenate kinase activity but is no longer inhibited by coenzyme A.
  • the conserved histidine is histidine at position 177 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the histidine is mutated to glutamine.
  • the production strain comprises the cds of a modified coaA-
  • Pantothenate kinase activity is no longer present
  • the conserved phenylalanine is phenylalanine of position 247 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, whereby the phenylalanine can be mutated to all other 19 of the 20 natural amino acids, provided that the mutant still
  • Coenzyme A is inhibited.
  • the conserved phenylalanine is phenylalanine of position 247 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the phenylalanine is mutated to valine (mutation F247V).
  • the mutant encoding pantothenate kinase is either present extrachromosomally on a vector in the microorganism strain (plasmid-encoded) or is integrated into the genome of the microorganism strain (genome-encoded).
  • the cds encoding the feedback-resistant mutant of pantothenate kinase is present extrachromosomally on a vector in the microorganism strain (plasmid-encoded).
  • the cds of the E. coli coaA-WT gene coaA-wt, SEQ ID NO:
  • coaA-cds are each functionally linked to the tac promoter, so that their expression occurs under the control of the tac promoter.
  • the production of a production strain is carried out in a known manner by transforming the gene construct according to the invention into a preferred microorganism (host strain), preferably the gene construct pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q or pcoaA-F247V, particularly preferably the gene construct pcoaA-R106A or pcoaA-F247V and especially preferably the gene construct pcoaA-R106A.
  • a preferred microorganism preferably the gene construct pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q or pcoaA-F247V, particularly preferably the gene construct pcoaA-R106A or pcoaA-F247V and especially preferably the gene construct pcoaA-R106A.
  • Preferred host strains for producing a production strain are selected from strains of the species Escherichia coli, Pantoea ananatis, or Raoultella terrigena, particularly preferably the strains E. coli K12 W3110 DSM 5911, Pantoea ananatis DSM30080, or Raoultella terrigena DSM2687. These strains are commercially available from DSMZ GmbH.
  • the host strain is the strain E. coli K12 W3110 DSM 5911.
  • Preferred production strains are the strains disclosed in Example 2 of the present invention:
  • the production strain is particularly preferred:
  • the production of biotin and/or its biosynthetic precursor DTB is carried out by cultivating a production strain according to the invention in a culture medium.
  • Shake flask culture is used to cultivate microorganisms on a laboratory scale, in contrast to production-scale fermentation. While shake flask culture also requires a specific medium and pH, and cultures are carried out in the presence of oxygen and with constant agitation (shaking), more defined conditions regarding the medium, temperature, pH, oxygen supply, and medium mixing can be adjusted and regulated in the fermenter. Culture on a smaller scale, for example, in a shake flask, can also be used as a pre-culture for inoculating a larger-scale culture, for example, in a fermenter.
  • the production scale in fermentation typically starts at 0.5 L batch volume and can reach 100,000 L or more.
  • the production scale in shake flask culture typically ranges from 10 ml to 1000 ml batch volume.
  • Yield as defined in the invention, is defined as the amount of product obtained by culturing a production strain. The yield can be expressed as an absolute amount of product (mmol or g, or mg) or as a volume yield (concentration) in the amount of product relative to the volume (mM or g/L, or mg/L).
  • the fermentation products can be present in the fermenter cells and/or in the fermentation medium.
  • biotin and DTB are found exclusively in the fermentation medium within the detection limit. Therefore, only the biotin and DTB produced by secretion into the fermentation medium are considered.
  • the method is preferably characterized in that the biotin content in the fermentation supernatant, based on the biotin content in the fermentation mixture, is above 70%, preferably above 80%, and particularly preferably above 90%.
  • the biotin/DTB content in the fermentation supernatant corresponds to the extracellular (secreted) biotin/DTB.
  • the biotin/DTB content in the fermentation mixture is the sum of the extracellular and intracellular biotin/DTB content, also referred to as the total biotin/DTB content.
  • the extracellular portion of biotin and DTB is determined as in
  • Example 3 (Sample Preparation). The intracellular content of biotin and DTB is determined as described in
  • Example 8 describes the detection limit of 0.1 mg/L biotin and 0.1 mg/L DTB, respectively.
  • the expression of a feedback-resistant mutant of pantothenate kinase in a production strain according to the invention is characterized by the fact that both biotin and DTB are synthesized in the cells of the microorganism and secreted from the cells.
  • the great advantage of dispensing biotin and DTB from the production strain into the culture medium is that the volume in which biotin and DTB can accumulate is not limited to the small volume of the cell contents (cystosol). This prevents high intracellular product concentrations from leading to toxic
  • Products can be isolated directly from the fermentation supernatant without the need for complex mechanical or chemical disruption of the cells. How biotin and DTB are secreted from the production strain is unknown. It may be a passive mechanism, with the products diffusing through the cell membranes, or one or more transport proteins may be involved in the secretion.
  • fermentation or shake flask cultivation of a recombinant production strain according to the invention comprising a host strain transformed with a
  • Gene construct comprising a cds encoding a coenzyme
  • a feedback-resistant pantothenate kinase inhibits the production of biotin and/or DTB, while the non-transformed host strain, despite a naturally present biotin
  • biosynthetic pathway cannot produce biotin or DTB in detectable quantities. This was not expected given the current state of technology.
  • the process for the fermentative production of biotin and/or DTB is characterized in that the fermentation volume is at least 0.5 L, with the production scale of at least 10 L being particularly preferred, of at least 1000 L being particularly preferred, and a fermentation volume of at least 10,000 L being especially preferred.
  • the biotin or DTB content can be quantified from the culture broth. For this purpose, a 1 ml aliquot can be taken from the culture broth with a cell density OD 600 /ml of at least 1.0/ml. Subsequently, all solid components can be separated, for example, by centrifuging for five minutes at maximum speed in a benchtop centrifuge. The supernatant can be quantified by LC-MS calibrated for biotin and DTB, as described in Example 3.
  • biotin is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • the process is characterized in that the DTB yield at the end of the fermentation after a fermentation time of up to
  • 65 h is at least 10 mg/L, particularly preferably at least 20 mg/L and especially preferably at least 50 mg/L.
  • DTB is a biosynthetic precursor of biotin
  • the process is characterized in that dethiobiotin is produced, which is then converted in a biotransformation to biotin, which is then isolated from the biotransformation mixture.
  • DTB can be used directly in the biotransformation or it can be enriched or isolated beforehand in order to use it in a more concentrated form in the biotransformation DTB is particularly preferably used in enriched or isolated form, particularly preferably in isolated form, for biotransformation.
  • Media for cultivating the production strain in shake flasks and by fermentation are familiar to experts in microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source), and additives such as vitamins, salts, and trace elements, as well as a sulfur source (S source), which optimize cell growth and biotin or DTB production.
  • C source carbon source
  • N source nitrogen source
  • S source sulfur source
  • C sources are those that can be used by the production strain for biotin or DTB product formation. These include all forms of monosaccharides, including C6 sugars (hexoses) such as glucose, mannose, fructose, or galactose, as well as C5
  • Sugars such as xylose, arabinose, or ribose, as well as all conceivable di- and polysaccharides formed from them, such as sucrose, lactose, maltose, maltodextrin, starch, or the monomers or oligomers released from them by hydrolysis (enzymatic or chemical).
  • Other usable carbon sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or acetate salts derived therefrom), ethanol, glycerol, citric acid (and their salts), or pyruvate (and its salts).
  • Gaseous carbon sources such as carbon dioxide or carbon monoxide are also conceivable.
  • Preferred C sources for cultivating the production strain are glucose, fructose, sucrose, mannose, xylose and arabinose, among which glucose and sucrose are particularly preferred and glucose is especially preferred.
  • N sources are those that can be used by the production strain to generate biomass. Examples include: - Ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or its salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate and/or the known nitrate salts such as KNO 3 , NaNO 3 , ammonium nitrate, Ca(NO 3 ) 2 , Mg(NO 3 ) 2 as well as other N sources such as
  • yeast extract such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (liquid or dried as so-called CSD) and/or
  • the addition of a sulfur source is necessary for the efficient production of biotin or DTB.
  • the continuous addition can be carried out as a pure feed solution or in a mixture with another feed component such as glucose.
  • the process is preferably characterized in that it is carried out in the presence of at least one compound selected from a salt of sulfates, sulfites, dithionites, thiosulfates and sulfides, whereby the use of the respective acids is also conceivable given a given stability.
  • Preferred sulfur sources are salts of sulfates, sulfites, thiosulfates and sulfides, particularly preferably salts of sulfates and thiosulfates.
  • the process is particularly preferably characterized in that it is carried out in the presence of sulfate salts.
  • a particularly preferred sulfate salt is a compound selected from the group consisting of sodium sulfate, ammonium sulfate and mixtures thereof.
  • cysteine amino acids cysteine, methionine, hypotaurine and taurine, preferably selected from cysteine and methionine, especially preferably from L-cysteine and D,L-methionine and particularly preferred is D,L-methionine.
  • Cultivation of microorganism cells can be carried out in so-called batch mode, i.e., to obtain biomass, the culture medium is inoculated with a starter culture of the production strain (microorganism cells carrying one or more gene constructs), and then cell growth occurs without further feeding of nutrient sources.
  • Cultivation can also be carried out in so-called fed-batch mode (also called feed-in mode), i.e., a process for obtaining biomass in which, after an initial growth phase in batch mode, additional nutrient sources are added (feed).
  • the feed can consist of the C source, the N source, the sulfur source, one or more vitamins or trace elements important for production, or a combination of the above.
  • the feed components can be added together as a mixture or separately in individual feed lines.
  • other feed components can be added together as a mixture or separately in individual feed lines.
  • Media components as well as additives that specifically increase biotin or DTB production, such as pimelic acid, can be added to the feed.
  • the feed can be supplied continuously or in portions (discontinuously), or in a combination of continuous and discontinuous
  • the process according to the invention for the fermentative production of biotin or DTB with a microbial production strain is preferably characterized in that the fermentative process is a process in the feed-
  • Preferred C sources in feed are glucose, sucrose, and glucose- or sucrose-containing plant hydrolysates, as well as mixtures of the preferred C sources in any ratio.
  • Glucose is the most preferred C source in feed.
  • the carbon source is added to the culture in such a way that the carbon source content in the fermenter during the production phase does not exceed 10 g/L.
  • a maximum concentration of 2 g/L is preferred, particularly preferably 0.5 g/L, and especially preferably 0.1 g/L.
  • Preferred N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, KNO 3 , NaNO 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor as well as NZ amines and yeast nitrogen base, among which particularly preferred are ammonia or ammonium salts, yeast extract, soy peptone or corn steep liquor (liquid or in dried form).
  • Preferred sulfur sources in the feed are salts of sulfates, sulfites, thiosulfates and sulfides, among which particularly preferred are salts of sulfates and thiosulfates and especially preferred are salts of sulfate, such as sodium sulfate and ammonium sulfate.
  • Further media additives include salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, iron, and, in trace amounts (i.e., in ⁇ M concentrations), salts of the elements molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc, copper, and nickel.
  • organic acids e.g., acetate, citrate
  • amino acids e.g., isoleucine
  • vitamins e.g., vitamin B1, vitamin B6
  • Further media additives include all types of fatty acids, monocarboxylic acids as well as dicarboxylic acids in the form of the free
  • Fatty acid or one of its salts preferably the C7 dicarboxylic acid pimelic acid.
  • the pH range is preferably from pH 5 to pH 9.
  • a pH Range from pH 5.5 to pH 8.
  • a pH range from pH 6.0 to pH 7.5 is particularly preferred.
  • the preferred temperature range for growth of the production strain is 20°C to 40°C.
  • the temperature range from 25°C to 37°C is particularly preferred, and from 29°C to 35°C is especially preferred.
  • the growth of the production strain can be optional without
  • the cultures can be grown with oxygen (anaerobic cultivation) or with oxygen (aerobic cultivation). Aerobic cultivation with oxygen is preferred.
  • a saturation of the oxygen content of preferably at least 5% (v/v), particularly preferably at least 15% (v/v), and especially preferably at least 30% (v/v) is established.
  • the regulation of the oxygen saturation in the culture is carried out automatically according to the state of the art via a combination of gas supply and
  • the oxygen supply can be ensured by introducing compressed air or pure oxygen. Aerobic cultivation with the introduction of compressed air is preferred.
  • the compressed air supply range for aerobic cultivation is preferably 0.05 vvm to 10 vvm (vvm: introduction of compressed air into the fermentation mixture expressed in liters of compressed air per liter of fermentation volume per minute).
  • a compressed air introduction of 0.2 vvm to 8 vvm is particularly preferred, particularly preferably 0.4 to 6 vvm, and especially preferably 0.8 to 5 vvm.
  • the maximum stirring speed is preferably 2500 rpm, particularly preferably a maximum of 2000 rpm and especially preferably a maximum of 1800 rpm.
  • the cultivation time is preferably between 10 h and 200 h.
  • a cultivation time of 20 h is particularly preferred. to 120 h.
  • a cultivation period of 30 h to 100 h is particularly preferred.
  • step i the claimed microbial production strain is cultivated and in step ii the
  • Fermentation supernatant isolated This means that fermentation batches obtained using the described method contain biotin or DTB accumulated extracellularly in the fermentation supernatant. Biotin or DTB can be used directly or isolated from the fermentation medium.
  • Various analytical methods for identifying, quantifying, and determining the purity of biotin or DTB are available, including spectrophotometry, NMR, gas chromatography, HPLC, mass spectroscopy, gravimetry, or a combination of these analytical methods.
  • Fig. 1 pKKj-SC101.
  • Fig. 2 pcoaA-wt.
  • TetR Gene that confers resistance to tetracycline.
  • Ptac tac promoter pSClOl ORI: origin of replication.
  • coaA coaA (pantothenate kinase gene)
  • EcoRI cleavage site for the restriction enzyme EcoRI
  • Styl cleavage site for the restriction enzyme
  • Example 1 Preparation of coaA expression vectors
  • the vector pKKj-SC101 (Fig. 1) was used to generate coaA expression vectors.
  • pKKj-SC101 was generated from the vector pKKj.
  • pKKj is disclosed in EP 2 670837 A1 (Wacker) and is a derivative of the expression vector pKK223-3.
  • the DNA sequence of pKK223-3 is disclosed in the GenBank gene database under accession number M77749.1. Approximately 1.7 kb was removed from the 4.6 kb plasmid (bp 262–1947 of the DNA sequence disclosed in M77749.1), resulting in the 2.9 kb expression vector pKKj.
  • Vector pKKj-tet Plasmid DNA from the vector pKKj was cut with BspHI, and the 1.9 kb vector fragment was isolated.
  • the tetracycline resistance gene was isolated from the plasmid pACYC184 as a 1.4 kb gene fragment by PCR.
  • the DNA sequence of pACYC184 is disclosed in the GenBank gene database under accession number X06403.1.
  • the 1.4 kb PCR product comprised the sequence disclosed in X06403.1 from nt 1434 to nt 2870.
  • the 1.4 kb PCR product was cloned into the 1.9 kb vector fragment. Correct cloning was verified by DNA sequencing (Eurofins Genomics).
  • the vector pKKj-tet was created, in which the tetracycline resistance gene has the same orientation as in the vector pKKj-SC101 described below (Fig. 1).
  • Vector pKKj-SC101 Plasmid DNA of the vector pKKj-tet was cut with Style and NdeI, and the 2.4 kb vector fragment was isolated.
  • the replication origin SC101 was generated by gene synthesis (Eurofins Genomics) as a 1.4 kb DNA fragment.
  • the DNA sequence of the replication origin SC101 is disclosed in the GenBank gene database under the
  • the 1.4 kb DNA fragment comprised nt 477 to nt 1816 of the sequence disclosed in K00042.1.
  • the 1.4 kb DNA fragment was reverse-complemented to the orientation disclosed in K00042.1 into the 2.4 kb Vector fragment was cloned. The result was the 3.8 kb vector pKKj-SClOl (Fig. 1).
  • Plasmid DNA of the vector pKKj-SC101 was cut with EcoRI and PstI and the 3.8 kb linearized vector was isolated.
  • the cds of the coaA variants to be cloned were prepared as 950 nt DNA fragments by PCR ("PhusionTM High-Fidelity" DNA Polymerase, Thermo ScientificTM) with the primers coaa-13f (SEQ ID NO:
  • Template DNA for the PCR reactions were genomic DNA of the E. coli K12 strain W3110 for the coaA WT gene (coaA-wt, SEQ ID NO: 1) as well as synthetic genes (produced at Eurofins Genomics) for the mutants coaA-R106A (SEQ ID NO: 3), coaA-H177Q (SEQ ID NO: 5) and coaA-F247V (SEQ ID NO: 7).
  • the respective 950 nt coaA DNA fragments were cloned into the 3.8 kb pKKj-SC101 vector fragment using the NEBuilder® cloning kit (NEB New England Biolabs). This resulted in the coaA expression vectors pcoaA-wt, pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q, and pcoaA-F247V.
  • the vector map for pcoaA-wt is shown in Fig. 2, representative of all four expression vectors.
  • the starting strains (host strains) for the production of production strains were the microorganism strains Escherichia coli K12 W3110, strain number DSM 5911, Raoultella terrigena, strain number DSM2687, and Pantoea ananatis, strain number DSM30080, commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH.
  • E. coli W3110 was transformed in a known manner with the vectors pcoaA-wt, pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q, and pcoaAA-F247V, and transformants were selected on LBtet plates.
  • LBtet plates contained 10 g/L tryptone (GIBCOTM), 5 g/L yeast extract (BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L agar, and 15 mg/L tetracycline (Sigma-Aldrich).
  • GEBCOTM tryptone
  • yeast extract BD Biosciences
  • 5 g/L NaCl 5 g/L agar
  • 15 mg/L tetracycline Sigma-Aldrich.
  • the production strains were designated E. coli W3110 x pcoaA-wt, E. coli W3110 x pcoaA-R106A, E. coli W3110 x pcoaA-H177Q and E. coli W3110 x pcoaA-F247V and were used for cultivation in shake flasks, fermentation and analysis of the
  • Designation R. terrigena x pcoaA-R106A and P. ananatis x pcoaA-R106A.
  • Pre-culture A pre-culture of E. coli W3110 was established in LB medium
  • E. coli W3110 x pcoaA-wt A preculture of each of the production strains E. coli W3110 x pcoaA-wt, E. coli W3110 x pcoaA-R106A, E. coli W3110 x pcoaA-H177Q, and E. coli W3110 x pcoaA-F247V was prepared in LBtet medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 15 mg/L tetracycline). Cultivation was carried out overnight at 37°C and 120 rpm.
  • LBtet medium 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 15 mg/L tetracycline.
  • Precultures of R. terrigena and P. ananatis were also prepared in LB medium, and the production strains R. terrigena x pcoaA-R106A and P. ananatis x pcoaA-R106A were prepared in LBtet medium. Cultivation was carried out overnight at 30°C and 120 rpm.
  • Main culture 0.5 ml of the respective preculture was transferred into a 300 ml Erlenmeyer flask (with baffle) containing 30 ml BS20 medium (WT strains E. coli W3110, R. terrigena, P. ananatis) or BS20 medium containing 15 mg/L tetracycline for all strains transformed with a plasmid.
  • BS20 medium WT strains E. coli W3110, R. terrigena, P. ananatis
  • Composition of the BS20 medium 4 g/LK 2 HPO 4 , 4 g/L KH 2 PO 4 , 10 g/L NH 4 sulfate, 2 g/L Na 2 SO 4 , 1 g/L NH 4 Cl, 10 g/L yeast extract (Sigma-Aldrich), 3 g/L Na 3 citrate x 2 H 2 O, 0.03 g/L FeSO 4 x 7 H 2 O, 0.05 g/L CaCl 2 x 2 H 2 O, 1 g/L MgSO 4 x 7 H 2 O, 20 g/L glucose, 0.1 g/LD,L-methionine, 5 mg/L Thiamine (Sigma-Aldrich), 50 mg/L pyridoxal phosphate (Sigma-Aldrich) and 3 ml/L trace element solution.
  • composition of the trace element solution 0.15 g/L Na 2 Mo0 4 x 2 H 2 0, 2.5 g/LH 3 BO 3 , 0.7 g/L CoCl 2 x 6 H 2 0, 0.25 g/L CuSO 4 x 5 H 2 O, 1.6 g/L MnCl 2 x 4 H 2 0, 0.3 g/L ZnSO 4x7H20 .
  • the main cultures of the E. coli strains were incubated for 24 h at 37°C and 140 rpm in a chest shaker (Infors).
  • the main cultures of the R. terrigena and P. ananatis strains were incubated for 24 h at 30°C and 140 rpm in a chest shaker (Infors).
  • 1 ml samples were taken, and the cell density was determined as OD 600 /ml (optical density of the main culture, measured photometrically at 600 nm) using a GenesysTM 10S UV-Vis spectrophotometer from ThermoScientificTM.
  • the content of biotin, dethiobiotin, and, if applicable, pantothenic acid was determined by LC-MS (liquid chromatography coupled with mass spectrometry).
  • the cell culture supernatant was isolated and analyzed by LC-MS for the
  • the strains E. coli W3110, E. coli W3110 x pcoaA-wt, and E. coli W3110 x pcoaA-R106A were grown as described in Example 3, with the main cultures of each of the three strains supplemented with 8 mg/L of Ca pantothenate. After 24 h of incubation at 37°C, the cell density (OD 600 /ml) and the pantothenic acid content in the culture supernatant were determined by LC-MS (Table 2).
  • strains E. coli W3110, E. coli W3110 x pcoaA-wt, E. coli W3110 x pcoaA-R106A, E. coli W3110 x pcoaA-H177Q and E. coli W3110 x pcoaA-F247V were grown as described in Example 3. After 24 h of incubation at 37°C, the Cell density OD 600 /ml, the content of biotin and dethiobiotin in
  • R106A was carried out as described in Example 3. After 24 h of incubation at 30°C, the cell density OD 600 /ml, the
  • R106A was carried out as described in Example 3. After 24 h of incubation at 30°C, the cell density OD 600 /ml, the
  • Example 8 Extraction of biotin and DTB from cells of the
  • Thermo ScientificTM Multifuge X1R, TX-400 rotor Centrifuged at 6300 rpm (Thermo ScientificTM Multifuge X1R, TX-400 rotor) and the supernatant discarded.
  • the cell pellet was resuspended in 10 ml H2O , centrifuged for 5 min at 6300 rpm and the supernatant discarded.
  • the cell pellet was suspended in 2 ml H2O .
  • a cell extract was prepared from the cell suspension using a FastPrep-24TM 5G cell homogenizer from MP BiomedicalsTM.
  • the cell pellet suspended in 2 ml H2O , was lysed in two 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes pre-filled by the manufacturer with glass beads ("Lysing Matrix B") (3 x 20 see at a Shaking frequency of 6000 rpm with 30 seconds rest between intervals).
  • the resulting cell homogenates were combined and centrifuged for 5 min at 13000 rpm (HeraeusTM FrescoTM 21 centrifuge) to produce a cell extract.
  • the cell extract was analyzed for biotin and DTB content by LC-MS. Neither biotin nor DTB could be detected, with a detection limit of 0.1 mg/L for biotin and DTB, respectively, in the LC-MS analysis.
  • 20 ml of LBtet medium was inoculated with the production strain E. coli W3110 x pcoaA-R106A in a 100 ml Erlenmeyer flask and incubated for 7 h on a shaker (150 rpm, 34°C).
  • 20 ml of LB medium was inoculated with the WT strain in a 100 ml Erlenmeyer flask.
  • precultures 1 were completely transferred to 100 ml of BS20 medium, with the medium for preculture 2 of the E. coli W3110 x pcoaA-R106A strain supplemented with 15 mg/L tetracycline (see Example 3 for the composition of the BS20 medium).
  • the cultures were each shaken in an Erlenmeyer flask (1 L volume) at 34°C for 17 h at 150 rpm (Infors chest shaker). After this incubation, the cell densities (OD 600 /ml) were between 3 and 5.
  • the fermentation was carried out in a fermenter of the type "DASGIP® Parallel Bioreactor Systems for Microbiology" from Eppendorf. A culture vessel with a total volume of 1.81 was used. The culture medium consisted of 600 ml
  • the pH in the fermenter was initially adjusted to 7.0 by pumping in a 25% NH4OH solution. During fermentation, the pH was maintained at 7.0 by automatic correction with 25% NH4OH or 4 MH3PO4 . Foam control was achieved by automatically dosing 4% v/v Struktol J673 in H2O (Schill & Seilacher).
  • vvm compressed air input into the fermentation mixture, expressed in liters of compressed air per liter of fermentation volume per minute.
  • the target value for O2 saturation during fermentation was set to 15%. Once the O2 saturation fell below the target value, a regulation cascade was initiated to return the O2 saturation to the target value. First, the gas supply was continuously increased (to a maximum of 5 vvm) and then the stirring speed was continuously increased (to a maximum of 1,500 rpm). Fermentation was carried out at a temperature of 34°C.
  • Glucose was determined using a glucose analyzer from YSI (Yellow Springs, Ohio, USA). The fermentation time was 65 h. 24 h, 42 h and 65 h after

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Biotin, Dethiobiotin (DTB), oder deren Gemisch, dadurch gekennzeichnet, dass ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der mindestens ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase (enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.7.1.33) rekombinant exprimiert, und anschließend Biotin oder DTB oder deren Gemisch isoliert wird.

Description

Biotin-Produktion in Mikroorganismen, die Gene für Pantothenatkinasen mit verminderter Produkthemmung durch Coenzym A exprimieren
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Biotin, Dethiobiotin (DTB), oder deren Gemisch zur Verfügung, dadurch gekennzeichnet, dass ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der mindestens ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase (enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.7.1.33) rekombinant exprimiert, und anschließend Biotin oder DTB oder deren Gemisch isoliert wird.
Biotin (D-Biotin, Vitamin B7, Vitamin H, CAS-Nummer 58-85-5) ist ein wasserlösliches Vitamin aus dem B-Komplex. Es spielt als prosthetische Gruppe von Enzymen im zellulären Stoffwechsel eine bedeutende Rolle, wo es das an sich reaktionsträge CO2 bei Carboxylierungsreaktionen aktiviert. Zu den Biotin-abhängigen Enzymen gehören z.B. Malonyl-CoA- Synthase, Propionyl-coaA-Carboxylase, Pyruvat-Carboxylase oder Geranyl-coA-Carboxylase . Biotin ist ein Vitamin von großer wirtschaftlicher Bedeutung als Zusatzstoff in Nahrungsergänzungsmitteln, Futtermitteln, in der Kosmetik und im Pharmabereich.
Dethiobiotin (Desthiobiotin, DTB, CAS-Nummer 533-48-2) ist die biosynthetische Vorstufe von Biotin. Biotin entsteht durch den enzymatisch katalysierten Einbau von Schwefel in DTB. Die mikrobielle Biosynthese von Biotin und die Regulation seiner Biosynthese sind bekannt (siehe Review Sirithanakorn and Cronan, 2021, FEMS Microbiol. Rev. 45: fuab003). Die Biosynthese von Biotin in Mikroorganismen ist strikt reguliert, sodass in einem Wildtyp-Stamm mit funktionellem Biotin-Biosyntheseweg kein Biotin nachgewiesen werden kann (siehe dazu auch die Beispiele der vorliegenden Erfindung). Der funktionelle Biotin-Biosyntheseweg zeigt sich darin, dass der Wildtypstamm auf einem Minimalmedium (definiertes Mineralsalzmedium ohne Biotin) ohne Biotinzusatz wachsen kann, während eine Biotin-auxotrophe Mutante des Stammes unter den gleichen Bedingungen nicht wächst. Der fehlende Nachweis einer Biotin-Produktion in einem Mikroorganismus bedeutet also nicht, dass er kein Biotin produzieren kann, sondern die
Biotin-Biosynthese unterliegt einer strikten Regulation und das durch den Mikroorganismus synthetisierte Biotin wird sofort als Cofaktor in die betreffenden Enzyme eingebaut und liegt nicht in freier Form vor. Außerdem können Mikroorganismen Biotin aus der Umwelt aufnehmen und bei ausreichender Biotin-Versorgung, z.B. durch ein Anzuchtmedium, wird die für den Mikroorganismus metabolisch kostspielige Biotin-Synthese vollständig abgeschaltet. Ein WT-Stamm wird somit bei ausreichender externer Versorgung kein eigenes Biotin produzieren.
Der Stand der Technik zur Regulation der Biotin-Biosynthese wird von Sirithanakorn und Cronan im Detail beschrieben. Diese strikte Regulation der Biotin-Biosynthese, die sicherstellt, dass nur so viel Biotin produziert wird, wie der Mikroorganismus für seine Lebensfähigkeit benötigt, hat bisher die Entwicklung eines wirtschaftlich konkurrenzfähigen biotechnologischen Herstellungsverfahrens für Biotin verhindert.
Pantothensäure (Vitamin B5, CAS-Nummer 79-83-4 für die R-Form, CAS-Nummer 5999-54-2 für das Racemat, CAS-Nummer 137-08-6 für das Ca-Salz) ist die zentrale biosynthetische Vorstufe von Coenzym A (CoA), welches im Stoffwechsel zur Aktivierung von Acylgruppen dient (z.B. als Acetyl-CoA, Succinyl-CoA oder Malonyl-CoA im Zitronensäurezyklus, der Fettsäuresynthese oder der Fettsäureoxidation). Die Biosynthese von CoA ist bekannt (siehe Review von Leonardi and Jackowski, 2007, EcoSal Plus, 2). Coenzym A wird über fünf enzymatische Stufen aus Pantothensäure hergestellt. Die erste Stufe der Coenzym A Biosynthese, die ATP-abhängige Phosphorylierung von Pantothensäure zu 4'-Phosphopantothenat, wird nach Gleichung (1) durch das Enzym Pantothenatkinase (EC 2.7.1.33, bezeichnet als CoaA, CoaA-Enzym oder auch PanK) katalysiert.
Gleichung (1):
(R)-Pantothenat + ATP <=> (R)-4'-Phosphopantothenat + ADP + H+
In Bakterien sind drei Arten von CoaA-Enzymen bekannt, siehe Hong et al. (2006), Structure 14: 1251-1261. Typ-I CoaA wird repräsentiert durch z.B. das Enzym aus E. coli. Die Aktivität der Typ-I CoaA's wird Feedback-gehemmt durch Coenzym A oder dessen CoA-Thioester. Typ-II CoaA-Enzyme werden repräsentiert durch das Staphylococcus aureus Enzym, welches nicht Feedback- gehemmt wird. Typ-III CoaA-Enzyme werden repräsentiert durch das Pseudomonas aeruginosa Enzym, welches ebenfalls nicht Feedback-gehemmt wird. Bei den Mikroorganismen der Typ-II und Typ-III CoaA-Enzyme handelt es sich vor allem um pathogene Bakterien, deren Gene man beim Metabolic Engineering möglichst vermeiden will. Ein Einfluss von Typ-I, Typ-II oder Typ-III CoaA-Enzymen auf die Biotinsynthese wurde bisher nicht untersucht.
In Escherichia coli wird das Enzym Pantothenatkinase, das Typ- I CoaA repräsentiert, durch das coaA-Gen kodiert. Die Aktivität des CoaA-Enzyms wird durch Coenzym A, das Endprodukt des Biosynthesewegs gehemmt. Coenzym A ist somit ein Inhibitor (Hemmstoff) des CoaA-Enzyms. Diese Form der Produkthemmung (Feedback-Hemmung) ist in Mikroorganismen wie E. coli charakteristisch für viele Stoffwechselwege, mit der sichergestellt wird, dass ein Mikroorganismus nur so viel des Stoffwechselprodukts (in diesem Fall Coenzym A) herstellt, wie vom Organismus benötigt wird. Für die Coenzym A-Biosynthese ist die Pantothenatkinase somit das Schlüsselenzym.
Rock et al. (2003), J. Bacteriol 185: 3410-3415 identifizieren anhand Betrachtungen der Proteinstruktur des CoaA-Enzyms von E. coli drei Aminosäuren, die für die Bindung von Coenzym A essenziell sind und somit die Hemmung der CoaA-Enzymaktivität durch Coenzym A vermitteln (siehe Fig. 2 in Rock et al.). Bei den drei Aminosäuren handelt es sich um Arginin an Position 106 (R106), Histidin an Position 177 (H177) und Phenylalanin an Position 247 (F247). Eine weitere mit Coenzym A interagierende Aminosäure, Lysin an Position 101 der Proteinsequenz, ist beteiligt an der Bindung des für die enzymatische Aktivität essenziellen ATP-Substrats und dessen Mutation führt zu inaktivem Enzym.
Ziel der Untersuchungen von Rock et al. war die Herstellung von Mutanten des CoaA-Enzyms mit verminderter Feedback-Hemmung der Enzymaktivität durch Coenzym A. Der Ausdruck „verminderte Feedback-Hemmung" wird in der vorliegenden Erfindung gleichbedeutend verwendet mit dem Ausdruck „erhöhte Feedback- Resistenz" (Feedback-Resistenz oder Feedback-resistent abgekürzt bezeichnet als fbr). In der vorliegenden Erfindung werden entsprechend gegen Coenzym A Feedback-resistente Mutanten der Pantothenatkinase auch als fbr-Mutanten des CoaA-
Enzyms, bzw. der Pantothenatkinase bezeichnet.
Das WT-CoaA-Enzym ist nach Rock et al. Fig. 4A gekennzeichnet dadurch, dass seine Enzymaktivität in Gegenwart von 20 μM Coenzym A nur noch ca. 40% der Aktivität des WT-CoaA-Enzyms ohne zugesetztem Coenzym A entspricht. Coenzym A ist somit ein Inhibitor des WT-CoaA-Enzyms. Die sog. Inhibitorkonstante IC50 gibt an, bei welcher Konzentration eines Inhibitors die Aktivität eines Enzyms nur noch 50% der Aktivität ohne Inhibitor beträgt. Entsprechend Rock et al. Fig. 4A liegt die IC50 für das CoaA-Enzym aus E. coli somit bei weniger als 20 μM
Coenzym A.
Punktmutanten des CoaA-Enzyms, die in jeweils einer der drei Aminosäuren R106 (fbr-Mutante CoaA [R106A]), H177 (fbr-Mutante CoaA[H177Q]) und F247 (fbr-Mutante CoaA[F247V]) mutiert waren, zeichneten sich dadurch aus, dass sie gegenüber Coenzym A keine Produkthemmung mehr aufwiesen (siehe Fig. 2 und Fig. 4A in Rock et al.). Die fbr-Mutanten wurden bezüglich ihrer enzymatischen Eigenschaften charakterisiert. Untersuchung der physiologischen Auswirkung der Überexpression einer Feedback- resistenten CoaA-Mutante, gleichbedeutend mit einer Deregulierung des Coenzym A-Biosynthesewegs, führte zum Ergebnis einer Akkumulierung phosphorylierter Metaboliten wie 4'-Phospho-Pantethein wie auch von Coenzym A (Fig. 6 in Rock et al.) in den E. coli Zellen. Somit wurde von Rock et al. untersucht, wie sich die Expression einer Feedback-resistenten CoaA-Mutante auf den Gehalt verschiedener phosphorylierter, von Pantothenat abgeleiteten Metaboliten wie 4- Phosphopantethein und Coenzym A in E. coli auswirkt. EP 3269 819 Bl verwendet eine Feedback-resistente CoaA-Mutante zur
Herstellung von O-Acetyl-Homoserin. Untersuchungen bezüglich der Produktion von Biotin wurden weder von Rock et al. noch in
EP 3269 819 Bl durchgeführt. Zwischen den Stoffwechselwegen zu Coenzym A und zu Biotin besteht kein mechanistischer Zusammenhang.
Für den kommerziellen Gebrauch wird Biotin derzeit chemisch hergestellt. Bekannt ist eine dreizehnstufige Synthese, ausgehend von Fumarsäure. Mit dem von Konsumentenwünschen beförderten Trend weg von chemisch hergestellten Inhaltsstoffen ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Biotin von großem Interesse.
Bekannte biotechnologische Ansätze zur Herstellung von Biotin- Produktionsstämmen (siehe dazu auch Sirithanakorn and Cronan) zielen vor allem auf die rekombinante Expression der verschiedenen biosynthetischen Gene für Biotin ab, nämlich der Gene bioA, bioB, bioC, bioD, bioF und bioH, bzw. ihrer funktionell analogen Gene. Des Weiteren konnten durch Hochdurchsatz-Screening (HTS, High-Throughput Screening) mikrobielle Stämme mit verbesserter Biotinproduktion durch Mutagenese und Selektion isoliert werden (Bali et al., 2020, Metab. Eng. 60:97-107).
Der Stand der Technik offenbart somit verschiedene Metabolic
Engineering- und HTS-Ansätze, um Biotin aus mikrobieller Produktion herzustellen. Alle diese Ansätze hatten nur begrenzten Erfolg, sodass gegenwärtig immer noch chemische Synthese die Methode der Wahl ist, um Biotin für kommerzielle Zwecke herzustellen. Da die bekannten biotechnologischen Ansätze bisher nicht geeignet sind, besteht ein Bedarf nach neuen genetischen Elementen, die zur Verbesserung biotechnologischer Verfahren zur Produktion von Biotin geeignet sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Biotin oder seiner biosynthetischen Vorstufe Dethiobiotin zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Biotin, Dethiobiotin (DTB), oder deren Gemisch, dadurch gekennzeichnet, dass ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der mindestens ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase (enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.7.1.33) rekombinant exprimiert, und anschließend Biotin oder DTB oder deren Gemisch isoliert wird.
Wie aus dem Stand der Technik bekannt (s.o.), wurde auch in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass ein nicht weiter veränderter WT-Mikroorganismus kein nachweisbares Biotin produziert (s. dazu Beispiele 5-7 der vorliegenden Erfindung). Biotin und auch die biosynthetische Vorstufe DTB waren weder intrazellulär noch extrazellulär nachweisbar (s. Beispiel 8). Überraschend wurde jedoch festgestellt, dass die Deregulierung des Coenzym A-Biosynthesewegs durch Expression von rekombinanten, Feedback-resistenten coaA-Mutanten dazu führt, die Biotin-Produktion in einem Mikroorganismus zu ermöglichen. Diese Deregulierung des Biotin-Biosynthesewegs ist von großem Interesse für die Entwicklung biotechnologischer Biotin- Produktionsverfahren durch Metabolic Engineering, insbesondere deshalb, da WT-Mikroorganismenstämme nicht genutzt werden können.
Beim im Produktionsstamm rekombinant exprimierten Gen, das ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase (enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.7.1.33) exprimiert, kann es sich handeln um ein
1. WT-Gen, das ein nicht durch Coenzym A Feedback-gehemmtes CoaA-Enzym kodiert (z.B. kodierend für eine Pantothenatkinase des Typs-II oder -III), wobei das WT-Gen entweder im Stamm seiner Herkunft homolog überexprimiert oder in einem anderen Stamm als dem, aus dem es isoliert wurde heterolog exprimiert wird, wobei die heterologe Expression bevorzugt ist, oder
2. mutiertes Gen, das in seiner Wt-Form ein durch Coenzym A Feedback-gehemmtes CoaA-Enzym kodiert, welches durch die Mutation für ein Feedback-resistentes CoaA-Enzym kodiert.
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Gen, das das gegenüber Coenzym A Feedback-resistente Enzym mit der Aktivität einer Pantothenatkinase exprimiert, um ein mutiertes Gen handelt, das in seiner Wt-Form für ein durch Coenzym A Feedback-gehemmtes CoaA-Enzym kodiert. Es ist bevorzugt, dass es sich bei der Pantothenatkinase um eine bakterielle CoaA vom Typ-I handelt.
Gen- und Proteinsequenzen von WT-Pantothenatkinase-Enzymen sind z.B. zugänglich in der NCBI-Datenbank unter dem Suchbegriff „pantothenate kinase". Beispiele für von der Erfindung betroffene Pantothenatkinasen sind Pantothenatkinasen ausgewählt aus Escherichia coli, Pantoea ananatis, Raoultella terrigena, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Pasturella multocida, Haemeophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemocomitans, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diptheriae, and Streptomyces coelicolor. Protein- und Gensequenzen der ausgewählten Pantothenatkinasen finden sich in dem Fachmann geläufigen Sequenzdatenbanken wie z.B. der NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Es ist ein unerwarteter Effekt der vorliegenden Erfindung, dass die homologe oder heterologe Expression einer in seiner Wt-Form durch Coenzym A Feedback-gehemmten Pantothenatkinase, die zu einem Feedback-resistenten Enzym mutiert wurde oder die heterologe Expression, bzw. homologe Überexpression einer in seiner Wt-Form nicht durch Coenzym A Feedback-gehemmten Pantothenatkinase, d.h. die Deregulierung der Coenzym A- Biosynthese (s. Beispiele 5-9), in Mikroorganismen wie z.B. E. coli, P. ananatis und R. terrigena dazu führt, dass die Biotin-Biosynthese dereguliert wird und dadurch mehr Biotin und seine biosynthetische Vorstufe DTB produziert wird, als für die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus erforderlich ist. Es entsteht somit frei verfügbares Biotin und DTB. Das frei verfügbare Biotin und DTB werden aus der Zelle ausgeschleust (exportiert, sezerniert), sodass die beiden Produkte aus dem Zellkulturüberstand nach Abtrennung der Biomasse leicht isoliert werden können.
Bevorzugt ist die homologe oder heterologe, besonders bevorzugt die homologe Expression einer in seiner Wt-Form durch Coenzym A Feedback-gehemmten Pantothenatkinase, die zu einem Feedback-resistenten Enzym mutiert wurde, um die Biotin- Biosynthese zu deregulieren. Insbesondere bevorzugt handelt es sich in diesem Fall bei der Pantothenatkinase um CoaA aus E. coli.
Ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Biotin und/oder DTB zur Verfügung gestellt wird, indem Mikroorganismenstämme, die an sich bekannte Feedback-resistente Mutanten des CoaA-
Enzyms exprimieren, eingesetzt werden, ohne am Biotin Stoffwechsel eine Veränderung vornehmen zu müssen. Das war nach dem Stand der Technik nicht bekannt und aufgrund der nicht miteinander verbundenen Stoffwechselwege zu Coenzym A und Biotin nicht zu erwarten.
Definitionen: Metabolic Engineering (auch „Pathwaydesign" genannt) ist im Gegensatz zur Biotransformation eine Methode der Biotechno- logie, bei der Stoffwechselwege eines Organismus durch Opti- mierung, bzw. Veränderung genetischer und regulatorischer Prozesse verändert werden. Dabei können durch Ergänzung des Genoms mit Genen von Enzymen neue oder veränderte Enzyme in einen Organismus eingeführt werden, bzw. Gene endogener Enzyme verstärkt oder abgeschwächt exprimiert werden und dadurch neue Stoffwechselwege in einem Organismus etabliert oder bestehende Stoffwechselwege verstärkt oder abgeschwächt werden. Ziel des Metabolic Engineering ist, dass der Organismus ein Stoffwech- selprodukt entweder neu oder ein zelleigenes Stoffwechselpro- dukt mit erhöhter Ausbeute produziert. In ein Metabolic Engineering-Verfahren werden keine für das Stoffwechselprodukt spezifischen Ausgangsstoffe wie ein Enzymsubstrat, wie z.B. DTB als Ausgangsverbindung zur Herstellung von Biotin, eingesetzt, sondern lediglich ein Nährstoffmedium, auch bezeichnet als Anzuchtmedium, welches für das Wachstum des betreffenden Organismus erforderlich ist und zusammengesetzt ist aus einer C-Quelle (z.B. Glucose), einer N-Quelle (z.B. ein Ammoniumsalz oder ein komplexes Aminosäuregemisch wie z.B. Pepton oder Hefeextrakt) und weiteren für das Wachstum erfor- derlichen Salzen. Solche Nährstoffmedien sind dem Fachmann aus der mikrobiologischen Praxis bekannt. Die in der vorliegenden Erfindung offenbarten Produktionsstämme zur Herstellung von Biotin und DTB stammen aus Ansätzen des Metabolic Engineering.
Dagegen ist Biotransformation definiert als Überführung eines oder mehrerer Edukte in ein Produkt unter enzymatischer Kata- lyse, wobei das Enzymsubstrat mit dem Enzym in einen Reakti- onsansatz gegeben und enzymatisch umgesetzt wird. Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wäre die enzymatische Konversion von DTB zu Biotin eine Biotransformation .
Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeu- tend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet.
Als Gen oder auch Expressionseinheit wird der DNS-Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS- Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expressionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs beteiligt sind. Die Expressionssignale umfassen mindestens einen Promotor, einen Transkriptionsstart, einen Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle (RBS). Des Weiteren sind als Expres- sionssignale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich.
Im Rahmen dieser Erfindung beginnen bakterielle Proteine wie z.B. CoaA oder PanK mit einem Großbuchstaben, während die diese Proteine kodierenden Sequenzen (cds) mit einem Klein- buchstaben bezeichnet werden (z.B. coaA oder panK). Ebenso werden die die Expression dieser cds kontrollierenden Promoto- ren mit einem Kleinbuchstaben bezeichnet (z.B. tac-Promotor).
Als Genkonstrukt wird ein durch Klonierung hergestelltes DNS- Molekül bezeichnet, das mindestens eine Expressionseinheit umfasst, und daneben noch weitere genetische Elemente umfassen kann, wie Selektionsmarker und Replikationsursprung. Beim Genkonstrukt kann es sich um ein lineares, ins Genom inte- griertes DNS-Molekül oder um ein zirkuläres DNS-Molekül in Form eines Plasmids, gleichbedeutend Vektor, handeln. Dieser Vektor wird dann als Expressionsvektor bezeichnet. In einen geeigneten Wirtsstamm eingebracht (transformiert), bewirken die genetischen Elemente des Vektors seine extrachromosomale Vererbung während des Zellwachstums und die Produktion des von der cds codierten Proteins.
Als Promotor wird eine stromaufwärts dem 5'-Ende der cds vor- geschaltete Nukleotid-Sequenz bezeichnet, welche die Expres- sion einer cds ermöglicht. Der Promotor liegt in Synthese- richtung vor dem codierenden Bereich. Der Promotor enthält Bereiche, welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA-Polymerase bestimmen und darüber hinaus die spezifi- sche Wechselwirkung mit die Transkriptionsstärke beeinflussen- den DNS-bindenden Proteinen (Transkriptionsfaktoren) vermit- teln können.
Als Promotoren geeignet sind grundsätzlich alle im Wirtsstamm aktiven Promotoren. Dazu zählen z.B. alle nativen Promotoren der ca. 5000 Gene in E. coli, aber auch nicht-native (z.B.
Promotoren aus anderen Spezies der Familie der
Enterobacteriaceae') oder „künstliche" Promotoren wie z.B. der tac-Promotor . Als Promotoren bevorzugt sind native Promotoren aus einem Stamm der Familie der Enterobacteriaceae und künstliche Promotoren wie z.B. der tac-Promotor, besonders bevorzugt native Promotoren aus E. coli und künstliche Promotoren wie z.B. der tac-Promotor. Insbesondere bevorzugt ist der tac-Promotor, wie er beispielsweise in De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25, Fig. 2 (dort bezeichnet als PtacI), beschrieben ist.
Eine mRNS, auch messenger-RNS oder Boten-RNS genannt, ist eine einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNS), welche die genetische Information für den Aufbau eines Proteins trägt. Mit einer mRNS steht die Bauanleitung für ein bestimmtes Protein in einer Zelle zur Verfügung. Das mRNS-Molekül trägt die zum Proteinaufbau notwendige Botschaft aus der Erbinformation (DNS) an die proteinaufbauenden Ribosomen. In einer Zelle wird es gebildet als Transkript eines zu einem Gen gehörenden Teil- abschnitts der DNS. Die in der DNS gespeicherte genetische Information wird dabei nicht verändert.
Unter homologen Genen bzw. homologen DNS-Sequenzen ist zu ver- stehen, dass die Nukleotidsequenzen dieser Gene bzw. DNS- Abschnitte zu mindestens 70%, bevorzugt zu mindestens 80% und besonders bevorzugt zu mindestens 90% identisch sind.
Der Grad der DNS-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukleotidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear.
Unter homologen Proteinsequenzen ist zu verstehen, dass die Aminosäuresequenzen dieser Proteine bzw. Protein-Abschnitte zu mindestens 70%, bevorzugt zu mindestens 80% und besonders bevorzugt zu mindestens 90% identisch sind.
Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „protein blast", auf der Seite http;//blast.ncbi.nlm.nih.gov/, genutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zurück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Matrix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment.
Als rekombinant exprimiert bezeichnet man Proteine, die mit Hilfe von gentechnisch veränderten Mikroorganismen oder gentechnisch veränderten Zellkulturen hergestellt werden.
Unter homologer Expression ist zu verstehen, dass ein DNS- Abschnitt (z.B. Gen, cds oder Genfragment) in dem Mikroorganismus rekombinant exprimiert wird, aus dem er isoliert wurde.
Unter heterologer Expression ist zu verstehen, dass ein DNS- Abschnitt (z.B. Gen, cds oder Genfragment) in einem anderen Mikroorganismus rekombinant exprimiert wird als dem, aus dem er isoliert wurde.
Die Abkürzung WT (Wt) bezeichnet den Wildtyp. Als Wildtyp-Gen wird die Form des Gens bezeichnet, die natürlicherweise durch die Evolution entstanden und im Wildtyp-Genom vorhanden ist. Die DNS-Sequenz von Wt-Genen ist in Datenbanken wie NCBI öffentlich zugänglich.
Als Mutanten werden die Zustandsformen eines Gens definiert, die durch Änderungen der Nukleotidsequenz der DNS ineinander überführt werden können. Dabei wird das natürlicherweise in einem Mikroorganismus vorkommende Gen als Wildtyp-Gen bezeichnet und die davon abgeleiteten Varianten als mutierte Gene. Bei den Mutanten der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Punktmutanten, wobei die DNS-Sequenz des Gens so abgeändert wird, dass sich nur eine Aminosäure der Proteinsequenz ändert.
Die rekombinante Expression des CoaA-Enzyms erfolgt, indem der Produktionsstamm kultiviert wird. Die Kultur kann im Labormaßstab durch Schüttelkolbenanzucht oder im technischen Maßstab durch Fermentation erfolgen und die Panthotenatkinase- Aktivität von einem Aliquot der resultierenden Kulturbrühe untersucht werden, d.h. der Begriff Kultur ist der Oberbegriff für die Anzucht im Schüttelkolben oder durch Fermentation. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung der Zellen im technischen Maßstab durch Fermentation.
Fermentation ist ein Verfahrensschritt zur Herstellung (Kulti- vierung) von Zellkulturen im technischen Maßstab, bei dem ein bevorzugt mikrobieller Produktionsstamm unter definierten Bedingungen von Kulturmedium, Temperatur, pH, Sauerstoffzufuhr und Medium-Durchmischung zum Wachstum gebracht wird. Werden alle Komponenten der Fermentation zu Beginn der Kultivierung festgelegt und dann nicht mehr verändert, spricht man von Batch-Fermentation .
Werden nach Start der Fermentation Medienbestandteile wie z.B.
Glucose (C-Quelle) oder ein komplexes Aminosäuregemisch wie z.B. Hefeextrakt (N-Quelle) als sog. Feed kontinuierlich zugeführt, spricht man von einer Fed-Batch Fermentation (sog. Zulaufverfahren) . Durch eine Fed-Batch Fermentation kann die Bildung von Biomasse und Zielprodukt optimiert werden. Ziel der Fermentation ist, abhängig von der Konfiguration (geneti- schen Ausstattung) des Produktionsstammes, die Produktion eines Proteins/Enzyms oder eines Stoffwechselprodukts, jeweils mit möglichst hoher Ausbeute für die weitere Verwendung. Das Produkt Biotin kann durch Fermentation hergestellt werden. Endprodukt der Fermentation ist eine Fermenterbrühe, bestehend aus der Biomasse der Zellen des Produktionsstammes (Fermenter- zellen) und dem von der Biomasse befreiten Fermentationsmedium (Fermentationsüberstand), das sich im Verlauf der Fermentation aus dem Anzuchtmedium und den von den Fermenterzellen sekre- tierten Stoffwechselprodukten gebildet hat. Im Gegensatz zum durch seine chemische Zusammensetzung definierten Anzucht- medium ist die Zusammensetzung des Fermentationsmediums infolge der nicht vorhersehbaren Bildung von Stoffwechsel- produkten nicht eindeutig definiert. In der vorliegenden Erfindung wird das Produkt Biotin durch Fermentation hergestellt. Biotin und/oder DTB kann aus der Fermenterbrühe entweder ohne weitere Aufarbeitungsschritte direkt weiterverwendet oder aber mittels bekannter Methoden angereichert oder gereinigt werden. Solche Methoden sind dem Fachmann z.B. aus Verfahren zur
Isolierung von Aminosäuren bekannt. Sie umfassen z.B. Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher-Chromatographie, Präzipitation, Kristallisation.
Die erfindungsgemäße Verwendung Feedback-resistenter Pantothenatkinasen zur Herstellung von Biotin und/oder DTB umfasst die Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismenstamms, wobei der Mikroorganismenstamm auch als mikrobieller Produktionsstamm bezeichnet wird. Ein
Produktionsstamm ist ein Mikroorganismenstamm, der das gewünschte Produkt, in diesem Fall Biotin und/oder DTB, produzieren kann und umfasst definitionsgemäß einen Mikroorganismus, bezeichnet als Wirtsstamm und mindestens ein Genkonstrukt.
Ein Produktionsstamm zur Herstellung von Biotin und/oder DTB ist gekennzeichnet dadurch, dass er ein Genkonstrukt enthält, welches eine Expressionseinheit umfasst, mindestens umfassend die cds einer Feedback-resistenten Pantothenatkinase, bevorzugt die cds einer Feedback-resistenten Mutante einer in ihrer WT-Form Feedback-sensitiven Pantothenatkinase, jeweils funktionell verknüpft mit einem Promotor.
Der Produktionsstamm ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Genkonstrukt um einen Expressionsvektor handelt.
Als Wirtsstamm geeignet ist jeder einen Biotin-Biosyntheseweg umfassende Mikroorganismus, der rekombinanten DNS-Techniken zugänglich ist. Der Biotin-Biosyntheseweg ist genetisch definiert durch die Gene bioA (7,8-Diaminononanoat Transaminase, enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.6.1.62), bioB (Biotinsynthase, EC 2.8.1.6), bioC (Malonyl-CoA O-Methyltransferase, EC 2.1.1.197), bioD (Dethiobiotinsynthase, EC 6.3.3.3), bioF (8-amino-7- Oxononanoatsynthase, EC 2.3.1.47) und bioH (Pimeloyl-[Acyl- Carrier Protein] Methylester Esterase, EC 3.1.1.85) oder durch zu diesen Genen funktionell analoge Gene. Einen Überblick über den Biotin Biosyntheseweg gibt die KEGG Pathway Datenbank unter dem Eintrag „Biotin Metabolism". Mikroorganismen mit einem Biotin-Biosyntheseweg sind darüber hinaus in der Lage, in einem Biotin-freien Anzuchtmedium ohne Supplementierung von Biotin zu wachsen.
Beim Gen, das ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase (enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.7.1.33) exprimiert, handelt es sich bevorzugt um ein bakterielles Gen, besonders bevorzugt um ein bakterielles Gen aus der Familie der Enterobacteriaceae und insbesondere bevorzugt um das coaA- Gen von Escherichia coli.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den gegen Coenzym A Feedback-resistenten Mutanten der Pantothenatkinase um Mutanten des E. coli coaA-Gens mit einer cds ausgewählt aus SEQ ID NO: 3, kodierend für ein Protein mit
SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5, kodierend für ein Protein mit
SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7, kodierend für ein Protein mit
SEQ ID NO: 8 oder ein dazu zu mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% identische Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit Pantothenatkinase-Aktivität kodiert, welches gegen Coenzym A Feedback-resistent ist. Das Verfahren ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass das gegenüber Coenzym A Feedback- resistente Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder eine dazu zu mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% identische Aminosäuresequenz aufweist. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass die Aminosäuresequenz des Enzyms die Mutation R106A umfasst.
In einer speziell bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der gegen Coenzym A Feedback-resistenten Mutante der Pantothenatkinase um die Mutante des E. coli coaA-Gens mit der cds SEQ ID NO: 3. Das Verfahren ist dementsprechend bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Aminosäuresequenz des WT-Proteins der dann zur CoA Feedback-resistent mutierten Pantothenatkinase ein konserviertes Aminosäuresequenzmotiv ausgewählt aus den folgenden Peptidsequenzen: i) Peptidsequenz GSVAVGKST (TS)(AS)R (VLI)LQX (LI)L, wie beispielsweise in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Position 95 bis 112 angegeben, wobei T an Position 104 von SEQ ID NO: 2 auch ein S sein kann, A an Position 105 von SEQ ID NO: 2 auch ein S sein kann, V an Position 107 von SEQ ID NO: 2 auch ein L oder
I sein kann sowie L an Position 111 von SEQ ID NO: 2 auch ein I sein kann, oder ii) Peptidsequenz AP(VI)YSH(X)(X)YD, wie beispielsweise in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Position 172 bis 181 angegeben, wobei V an Position 174 von SEQ ID NO: 2 ein I sein kann, die Aminosäuren L an Position 178 und I an Position 179 von SEQ ID NO: 2 nicht konserviert sind, oder
Peptidsequenz RFL (KAS)F (RL), wie beispielsweise in der
Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Position 243 bis 248 angegeben, wobei K an Position 246 von SEQ ID NO: 2 ein S oder A sein kann und die Aminosäure R an Position 248 von SEQ ID
NO: 2 ein L sein kann. Ein konserviertes Aminosäuresequenzmotiv (Peptidsequenzmotiv) ist dabei definiert als eine kurze Aminosäuresequenz innerhalb der Proteinsequenz eines Proteins, die in vielen homologen Sequenzen anderer Mikroorganismen vorkommt und einen für die Funktion des Proteins wichtigen Sequenzabschnitt bezeichnet. Ein konserviertes Aminosäuresequenzmotiv kann auch einzelne Aminosäuren enthalten, die in homologen Sequenzen durch eine oder zwei andere Aminosäuren ersetzt sind. In den Peptiden i) bis iii) sind diese Aminosäuren explizit genannt und bevorzugt. Nicht-konservierte Aminosäuren können jede Aminosäure sein und werden bezeichnet mit dem Platzhalter X und sind nicht bevorzugt. Peptid ii) z.B. enthält zwei nicht- konservierte Aminosäuren. Dabei wird die Aminosäuresequenz im Ein-Buchstaben Code dargestellt, wie dem Fachmann geläufig.
Besonders bevorzugt umfasst die WT-Proteinsequenz der dann zur
CoA Feedback-resistent mutierten Pantothenatkinase ein
Aminosäuresequenzmotiv ausgewählt aus den Peptidsequenzen GSVAVGKST (TS)(AS)R (VLI)LQX (LI)L, wie beispielsweise in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Position 95 bis 112 angegeben, und AP(VI)YSH(X)(X)YD, wie beispielsweise in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Position 172 bis 181 angegeben. Insbesondere bevorzugt umfasst die WT- Proteinsequenz der dann zur CoA Feedback-resistent mutierten Pantothenatkinase das Aminosäuresequenzmotiv GSVAVGKST (TS)(AS)R(VLI)LQX (LI)L, wie beispielsweise in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Position 95 bis 112 angegeben.
Der Pantothenatkinase-Enzym-Aktivitätstest kann wie folgt durchgeführt werden: i) Herstellung des zu testenden Enzyms:
Ein durch Anzucht im Schüttelkolben oder in einer Fermenta- tion produziertes Enzym kann wie folgt in die Reaktion ein- gesetzt werden: als ein Aliquot aus der nicht weiter aufgearbeiteten
Kulturbrühe oder als ein Aliquot der Zellsuspension nach Reisolierung der Zellen aus der Kulturbrühe, z.B. durch Zentrifugation oder in Form eines Aliquots des Zellhomogenats a) nach mechanischem Aufschluss der Zellsuspension oder b) in Form chemisch permeabilisierter Zellen (z.B. durch Chloroform) oder als Zellextrakt nach Abtrennung partikulärer Bestand- teile aus dem Zellhomogenat oder als z.B. chromatographisch gereinigtes Enzym.
Die jeweils erhaltene Gesamtproteinkonzentration kann z.B. mit einem kommerziell erhältlichen Qubit 3.0 Fluorometer der Fa. Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit® Protein Assay Kits" nach Angaben des Herstellers bestimmt werden. ii) Bestimmung der Pantothenatkinase-Enzymaktivität: Es wird nach einem von Strauss and Begley (2002), J. Biol. Chem. 277: 48205-48209, beschriebenen Test verfahren, bei dem die Pantothenatkinase Enzymreaktion nach Gleichung (1) (verbraucht ATP unter Bildung von ADP) an die Reaktion von Pyruvatkinase, Gleichung (2) (verbraucht Phosphoenolpyruvat im Test durch Reaktion mit dem in der Pantothenatkinase
Reaktion gebildeten ADP unter Bildung von Pyruvat und ATP) und Lactatdehydrogenase, Gleichung (3) (reduziert Pyruvat zu Lactat unter Verbrauch von NADH) gekoppelt wird.
(2) Phosphoenolpyruvat + ADP -> Pyruvat + ATP
(3) Pyurvat + NADH -> Lactat + NAD
Somit wird für jedes Molekül ADP aus der Pantothenatkinase Reaktion stöchiometrisch ein Molekül NADH verbraucht, was die Bestimmung der Pantothenatkinase-Aktivität im folgenden Test ermöglicht.
Eine mit Tris-HCl auf pH 7,6 gepufferte Lösung enthält folgende Testkomponenten (Endkonzentration in der Lösung in Klammern) ATP (1,5 mM), NADH (0,3 mM), Phosphoenolpyruvat (0,5 mM), MgCl2 x 7 H2O (10 mM), KCl (20 mM), Pyruvatkinase (5 Units/ml), Lactatdehydrogenase (5 Units/ml), und Pantothenatkinase aus i). Die Menge der eingesetzten Pantothenatkinase aus i) ist abhängig vom Reinigungsgrad. Werden Kulturbrühe, Zellsuspension der reisolierten Zellen, Zellhomogenat oder Zellextrakt verwendet, werden mindestens 0,1 mg der in i) hergestellten Enzymfraktionen eingesetzt. Im Falle von gereinigtem Enzym werden mindestens 5 pg der gereinigten Enzymfraktion eingesetzt. Das Ansatzvolumen des Tests beträgt 1 ml. Die Temperatur, bei der der Test durchgeführt wird, beträgt 25°C. Der Testansatz wird in einer 1 ml Küvette in einem Spektralphotometer vorgelegt, welches auf die Wellenlänge von 340 nm eingestellt ist. Die Reaktion wird gestartet durch die Zugabe von Ca- Pantothenat (160 μM Endkonzentration). Die Messdauer beträgt 5 min. Die Abnahme der Extinktion bei 340 nm (Verbrauch von NADH) zeigt nach den Gleichungen (1) bis (3) die Aktivität der Pantothenatkinase an. Dabei wird ein ΔE bei 340 nm von mindestens 0,02 nach den fünf Minuten
Messdauer (ΔE = E0 - E5min: Abnahme der Extinktion E0 startend vom Zeitpunkt 0 min bis zur Extinktion E5min nach Beendigung der Messung nach 5 min) als Nachweisgrenze festgelegt. Beträgt das ΔE bei 340 nm unter den genannten Testbedingungen weniger als 0,02, dann ist im Ansatz keine aktive Pantothenatkinase enthalten.
Die Feedback-resistente Mutante einer Pantothenatkinase und ihre erfindungsgemäße Verwendung ist gekennzeichnet dadurch, dass sie
I) die Enzymaktivität eines in der KEGG-Datenbank mit EC 2.7.1.33 bezeichneten Enzyms besitzt, welches nach Gleichung (1) die Reaktion von Pantothensäure zu 4'- Phosphopantothenat katalysiert,
II) ihre Enzymaktivität durch Coenzym A nicht Feedback- gehemmt wird,
III) ihre rekombinante Expression in einem Wirtsstamm zur Produktion von freiem Biotin und/oder DTB führt, welches aus dem Zellkulturüberstand isoliert werden kann.
Das WT-Gen der Feedback-resistenten Mutante einer
Pantothenatkinase kann aus dem Mikroorganismenstamm stammen, der auch der Wirtsstamm ist (homologe Pantothenatkinase) oder es kann sich um ein Fremdgen handeln (heterologe Pantothenatkinase), entweder synthetisch hergestellt (incl. der dadurch ermöglichten Anpassung der cds auf die Expression im Wirtsstamm durch sog. Codon-Optimierung) oder aus anderen Stämmen als dem Wirtsstamm isoliert. Bevorzugt ist das homologe Gen einer Pantothenatkinase.
Bevorzugte Varianten der Pantothenatkinase (CoaA) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5 verminderte Feedback-Hemmung durch Coenzym A auf. Besonders bevorzugte CoaA-Varianten weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 10 verminderte Feedback-Hemmung durch Coenzym A auf. Insbesondere bevorzugte CoaA-Varianten weisen keine Feedback-Hemmung durch Coenzym A auf.
Der Faktor der verminderten Feedback-Hemmung durch Coenzym A wird dabei bestimmt durch einen CoaA-Enzymtest wie z.B. oben beschrieben, wobei der Enzymtest ohne und in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Coenzym A durchgeführt und die jeweilige Enzymaktivität bestimmt wird. Für das WT-Enzym wird auf diese Weise eine Referenz-Beziehung zwischen Enzymaktivität und der Coenzym A-Konzentration im Enzymtest erstellt (bezeichnet als Kontrolle). Dabei wird die Enzymaktivität eines WT-Enzyms ohne zugesetztes Coenzym A als 100% Aktivität definiert und die Coenzym A-Konzentration, bei der noch 50% Aktivität gemessen wird, als IC50 (Konzentration des Inhibitors CoA im Test, bei der noch 50% der Enzymaktivität ohne Zusatz von CoA gemessen wird). Analog wird die IC50 für jede Mutante bestimmt. Der Faktor der verminderten Feedback-Hemmung wird bestimmt, indem die IC50 der Mutante durch die IC50 des WT-Enzyms dividiert wird. Hat also ein WT- CoaA-Enzym z.B. eine IC50 für Coenzym A von 20 μM und die CoaA- Mutante eine IC50 von 100 μM, beträgt der Faktor der verminderten Feedback-Hemmung fünf. Wird als IC50 einer Mutante 200 μM Coenzym A bestimmt, beträgt der Faktor der verminderten Feedback-Hemmung zehn. Kann für eine Mutante auch bei einer 20-fach höheren Coenzym A Konzentration als der IC50 des WT- Enzyms (entspricht 400 μM Coenzym A im gewählten Beispiel) keine IC50 bestimmt werden, weil die Enzymaktivität noch >50% der Aktivität ohne Inhibitor ist, so wird diese Mutante als nicht durch Coenzym A Feedback-hemmbar definiert und weist keine Feedback-Hemmung durch Coenzym A auf.
Die von Rock et al., 2002 bekannten, mutierten Pantothenatkinase-Enzyme mit verminderter Feedback-Hemmung stellen im Rahmen dieser Erfindung bevorzugte Mutanten des CoaA-Enzyms zur Herstellung von Produktionsstämmen dar: CoaA[R106A]: Arginin des E. coli CoaA-Enzyms an Position 106 ersetzt durch Alanin, bezeichnet als fbr-Mutante CoaA-R106A.
CoaA[H177Q]: Histidin des E. coli CoaA-Enzyms an Position 177 ersetzt durch Glutamin, bezeichnet als fbr-Mutante CoaA-H177Q.
CoaA[F247V]: Phenylalanin des E. coli CoaA-Enzyms an Position 247 ersetzt durch Valin, bezeichnet als fbr-Mutante CoaA-
F247V.
Als Produktionsstämme geeignete Mikroorganismenstämme umfassen Bakterienstämme, ausgewählt aus den Familien der Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae, Bacillaceae oder Gammaproteobacteria, außerdem Hefen (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica) oder Pilze (z.B. Aspergillus niger). Das Verfahren ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mikrobiellen Produktionsstamm um einen bakteriellen Stamm handelt, besonders bevorzugt um einen Stamm der Familie Enterobacteriaceae. Der Bakterienstamm ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium ssp. (wie besonders bevorzugt C. glutamicum), Pseudomonas ssp. (wie besonders bevorzugt P. mutabilis), Bacillus ssp. (wie besonders bevorzugt B. subtilis), Pantoea ssp. (wie besonders bevorzugt P. ananatis), Raoultella ssp. (wie besonders bevorzugt R. terrigena) und Escherichia ssp. (wie besonders bevorzugt E. coli). Das Verfahren ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mikrobiellen Produktionsstamm um einen Stamm der Art Escherichia coli, Raoultella terrigena oder Pantoea ananatis handelt und im speziellen bevorzugt der Art Escherichia coli. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Mikroorganismus um den Stamm E. coli K12 W3110, käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Ein Produktionsstamm, enthaltend ein Genkonstrukt umfassend eine Expressionseinheit für eine Feedback-resistente Mutante einer Pantothenatkinase und damit zur Biotin- und DTB-
Produktion geeignet ist dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionseinheit bevorzugt mindestens eine cds ausgewählt aus der Gruppe feedback-resistenter Mutanten a), b) oder c), besonders bevorzugt ausgewählt aus a) oder c) und insbesondere bevorzugt die Mutante a) des coaA-Gens enthält: a) Der Produktionsstamm umfasst die cds eines veränderten coaA-
Gens, bei dem das Codon eines konservierten Arginins so mutiert ist, dass die resultierende Punktmutante noch Pantothenatkinase-Aktivität besitzt aber nicht mehr durch
Coenzym A gehemmt wird. Bevorzugt handelt es sich beim konservierten Arginin um Arginin der Position 106 der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, wobei das Arginin zu allen anderen 19 der 20 natürlichen Aminosäuren mutiert sein kann, sofern die Mutante noch Pantothenatkinase-Aktivität besitzt, aber nicht mehr durch Coenzym A gehemmt wird. Insbesondere bevorzugt handelt es sich beim konservierten Arginin um Arginin der Position 106 der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, wobei das Arginin zu Alanin mutiert ist (Mutation R106A). b) Der Produktionsstamm umfasst die cds eines veränderten coaA-
Gens, bei dem das Codon eines konservierten Histidins so mutiert ist, dass die resultierende Punktmutante noch
Pantothenatkinase-Aktivität besitzt aber nicht mehr durch
Coenzym A gehemmt wird. Bevorzugt handelt es sich beim konservierten Histidin um Histidin der Position 177 der
Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, wobei das Histidin zu allen anderen 19 der 20 natürlichen Aminosäuren mutiert sein kann, sofern die Mutante noch Pantothenatkinase-Aktivität besitzt, aber nicht mehr durch Coenzym A gehemmt wird. Insbesondere bevorzugt handelt es sich beim konservierten Histidin um Histidin der Position 177 der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, wobei das Histidin zu Glutamin mutiert ist
(Mutation H177Q). c) Der Produktionsstamm umfasst die cds eines veränderten coaA-
Gens, bei dem das Codon eines konservierten Phenylalanins so mutiert ist, dass die resultierende Punktmutante noch
Pantothenatkinase-Aktivität besitzt aber nicht mehr durch
Coenzym A gehemmt wird. Bevorzugt handelt es sich beim konservierten Phenylalanin um Phenylalanin der Position 247 der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, wobei das Phenylalanin zu allen anderen 19 der 20 natürlichen Aminosäuren mutiert sein kann, sofern die Mutante noch
Pantothenatkinase-Aktivität besitzt, aber nicht mehr durch
Coenzym A gehemmt wird. Insbesondere bevorzugt handelt es sich beim konservierten Phenylalanin um Phenylalanin der Position 247 der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, wobei das Phenylalanin zu Valin mutiert ist (Mutation F247V).
Die cds, die für die Feedback-resistente Mutante der
Pantothenatkinse kodiert, liegt entweder extrachromosomal auf einem Vektor im Mikroorganismenstamm vor (Plasmid-kodiert) oder sie ist ins Genom des Mikroorganismenstammes integriert (Genom-kodiert). Bevorzugt ist, dass die cds, die für die Feedback-resistente Mutante der Pantothenatkinse kodiert, extrachromosomal auf einem Vektor im Mikroorganismenstamm vorliegt (Plasmid-kodiert). Wie in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung beschrieben, wurden die cds des E. coli coaA-WT-Gens (coaA-wt, SEQ ID NO:
1), kodierend für ein CoaA-Enzym mit SEQ ID NO: 2 und der drei in Rock et al. 2002 beschriebenen, Feedback-resiStenten Punktmutanten, nämlich coaA-R106A (SEQ ID NO: 3), kodierend für ein CoaA-Enzym mit SEQ ID NO: 4, coaA-H177Q (SEQ ID NO: 5), kodierend für ein CoaA-Enzym mit SEQ ID NO: 6 und coaA- F247V (SEQ ID NO: 7), kodierend für ein CoaA-Enzym mit SEQ ID NO: 8 in den ebenfalls im Beispiel 1 beschriebenen Vektor pKKj-SC101 kloniert. Es entstanden die Vektoren pcoaA-wt (Fig.
2), pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q und pcoaA-F247V. Die Herstellung der Genkonstrukte erfolgte entsprechend dem Stand der Technik vorzugsweise mit Hilfe von üblichen rekombinanten DNS- Techniken, wie in Beispiel 1 beschrieben und wie sie dem Fachmann geläufig sind. In pcoaA-wt, pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q und pcoaA-F247V sind die coaA-cds jeweils funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft, so dass ihre Expression unter Kontrolle des tac-Promotors erfolgt.
Die Herstellung eines Produktionsstammes erfolgt in bekannter Weise durch Transformation des erfindungsgemäßen Genkonstrukts in einen bevorzugten Mikroorganismus (Wirtsstamm), bevorzugt des Genkonstrukts pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q oder pcoaA-F247V, besonders bevorzugt des Genkonstrukts pcoaA-R106A oder pcoaA- F247V und insbesondere bevorzugt des Genkonstrukts pcoaA- R106A.
Zur Herstellung eines Produktionsstammes bevorzugte Wirtsstämme sind ausgewählt aus den Stämmen der Arten Escherichia coli, Pantoea ananatis oder Raoultella terrigena, besonders bevorzugt die Stämme E. coli K12 W3110 DSM 5911, Pantoea ananatis DSM30080 oder Raoultella terrigena DSM2687. Diese Stämme sind käuflich erhältlich bei der DSMZ GmbH.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Wirtsstamm um den Stamm E. coli K12 W3110 DSM 5911. Bevorzugte Produktionsstämme sind die in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung offenbarten Stämme:
E. coli W3110 x pcoaA-R106A
E. coli W3110 x pcoaA-H177Q
E. coli W3110 x pcoaA-F247V
R. terrigena x pcoaA-R106A
P. ananatis x pcoaA-R106A
Besonders bevorzugte Produktionsstämme sind die Stämme:
E. coli W3110 x pcoaA-R106A
E. coli W3110 x pcoaA-H177Q
E. coli W3110 x pcoaA-F247V
Insbesondere bevorzugt ist der Produktionsstamm:
E. coli W3110 x pcoaA-R106A
Die Produktion von Biotin und/oder seines biosynthetischen Vorläufers DTB erfolgt durch Kultivierung (Anzucht) eines erfindungsgemäßen Produktionsstammes in einem Anzuchtmedium.
Zur Kultivierung von Mikroorganismen im Labormaßstab dient die Schüttelkolbenanzucht, im Gegensatz zum Produktionsmaßstab durch Fermentation. Zwar wird auch bei der Schüttelkolben- kultur ein bestimmtes Medium und ein pH vorgegeben und in Gegenwart von Sauerstoff und unter permanenter Bewegung (Schütteln) kultiviert, aber definiertere Bedingungen betreffend das Medium, Temperatur, pH, Sauerstoffzufuhr und Mediumsdurchmischung lassen sich im Fermenter einstellen und regulieren. Die Kultur in einem kleineren Maßstab z.B. im Schüttelkolben kann auch als Vorkultur zum Animpfen einer Kultur im größeren Maßstab z.B. eines Fermenters genutzt werden.
Der Produktionsmaßstab in der Fermentation beginnt typischer- weise bei 0,5 L Ansatzvolumen und kann bis 100000 L oder auch mehr betragen. Der Produktionsmaßstab der Schüttelkolbenan- zucht reicht typischerweise von 10 ml bis 1000 ml Ansatz- volumen. Ausbeute im Sinne der Erfindung ist definiert als die Menge des Produkts, welche durch Anzucht eines Produktionsstammes erhalten wird. Die Ausbeute kann angegeben werden in absoluter Menge Produkt (mmol oder g, bzw. mg) oder als Volumenausbeute (Konzentration) in auf das Volumen bezogene Menge Produkt (mM oder g/L, bzw. mg/L).
Prinzipiell können sich die Produkte der Fermentation in den Fermenterzellen und/oder im Fermentationsmedium befinden. Wie in Beispiel 8 der vorliegenden Erfindung offenbart, finden sich Biotin und DTB innerhalb der Nachweisgrenze aus- schließlich im Fermentationsmedium wieder. Daher wird nur das durch Sekretion in das Fermentationsmedium hergestellte Biotin und DTB berücksichtigt.
Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass der Biotin-Gehalt im Fermentationsüberstand bezogen auf den Biotin-Gehalt im Fermentationsansatz über 70%, bevorzugt über 80 und insbesondere bevorzugt über 90% beträgt. Das Gleiche gilt für DTB. Der Biotin/DTB-Gehalt im Fermentationsüberstand entspricht dem extrazellulären (sekretierten) Biotin/DTB. Der Biotin/DTB-Gehalt im Fermentationsansatz ist die Summe aus extrazellulärem und intrazellulärem Biotin/DTB-Gehalt, auch mit Gesamt-Biotin/DTB-Gehalt bezeichnet. Dabei wird der extrazelluläre Anteil an Biotin und DTB bestimmt wie in
Beispiel 3 (Probenvorbereitung) beschrieben. Der intrazelluläre Anteil an Biotin und DTB wird bestimmt wie in
Beispiel 8 beschrieben, wobei jeweils eine Nachweisgrenze von 0,1 mg/L Biotin, bzw. 0,1 mg/L DTB gilt.
Die Expression einer Feedback-resistenten Mutante der Pantothenatkinase in einem erfindungsgemäßen Produktionsstamm zeichnet sich also dadurch aus, dass sowohl Biotin wie DTB in den Zellen des Mikroorganismus synthetisiert und aus den Zellen ausgeschleust werden. Diese extrazelluläre Produktion bzw. Anreicherung, d.h. die Biosynthese von Biotin und DTB gefolgt von der Ausschleusung (Export, Sekretion) aus dem Produktionsstamm heraus in das Anzuchtmedium, bietet den großen Vorteil, dass das Volumen, in dem sich Biotin und DTB akkumulieren können, nicht auf das geringe Volumen des Zellinhalts (Cystosol) beschränkt ist. Damit wird vermieden, dass hohe intrazelluläre Produktkonzentrationen zu toxischen
Effekten führen.
Die extrazelluläre Produktion von Biotin und DTB hat außerdem den Vorteil einer vereinfachten Produktisolierung, da die
Produkte direkt aus dem Fermentationsüberstand isoliert werden können, ohne dass vorher die Zellen aufwendig entweder mechanisch oder chemisch aufgeschlossen werden müssen. Wie Biotin und DTB aus dem Produktionsstamm sekretiert werden, ist unbekannt. Es kann sich um einen passiven Mechanismus handeln, wobei die Produkte durch die Zellmembranen diffundieren oder es können ein oder mehrere Transportproteine an der Sekretion beteiligt sein.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung offenbart, ermöglicht die Fermentation oder Anzucht im Schüttelkolben eines erfindungsgemäßen rekombinanten Produktionsstamms, umfassend einen Wirtsstamm transformiert mit einem
Genkonstrukt umfassend eine cds kodierend für eine gegen Coenzym A Feedback-resistente Pantothenatkinase die Produktion von Biotin und/oder DTB, während der nicht transformierte Wirtsstamm trotz eines natürlicherweise vorhandenen Biotin-
Biosynthesewegs kein Biotin oder DTB in nachweisbarer Menge produzieren kann. Dies war nach dem Stand der Technik nicht zu erwarten.
Bevorzugt ist das Verfahren zur fermentativen Herstellung von Biotin und/oder DTB dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsvolumen mindestens 0,5 L beträgt, wobei der Produktionsmaßstab von mindestens 10 L besonders bevorzugt, von mindestens 1000 L insbesondere bevorzugt und ein Fermentationsvolumen von mindestens 10000 L im speziellen bevorzugt ist. Der Gehalt an Biotin oder DTB kann aus der Kulturbrühe quantifiziert werden. Dazu kann der Kulturbrühe mit einer Zelldichte OD600/ml von mindestens 1,0/ml z.B. ein Aliquot von 1 ml entnommen werden, anschließend alle festen Bestandteile beispielsweise durch fünfminütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge abgetrennt und der Überstand durch für Biotin und DTB kalibrierte LC-MS quantifiziert werden, wie in Beispiel 3 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Biotin-
Ausbeute am Ende der Fermentation nach einer
Fermentationsdauer von bis zu 65 h mindestens 10 mg/L, besonders bevorzugt mindestens 20 mg/L und insbesondere bevorzugt mindestens 50 mg/L, während der nicht-transformierte Wirtsstamm kein nachweisbares Biotin produziert, wobei die Nachweisgrenze bei ca. 0,1 mg/L Biotin, bzw. DTB liegt. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Produktionsstämme wird somit die bisher nicht bekannte fermentative Herstellung von Biotin ohne Optimierung des Biotin-Biosynthesewegs für Anwendungen im Lebensmittel-, Futtermittel- und auch pharmazeutischen Bereich ermöglicht .
In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die DTB-Ausbeute am Ende der Fermentation nach einer Fermentationsdauer von bis zu
65 h mindestens 10 mg/L beträgt, besonders bevorzugt mindestens 20 mg/L und insbesondere bevorzugt mindestens 50 mg/L.
Da DTB eine biosynthetische Vorstufe von Biotin ist, ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass Dethiobiotin produziert wird, welches dann in einer Biotransformation zu Biotin umgesetzt wird, welches dann aus dem Biotransformationsansatz isoliert wird.
Dabei kann DTB direkt in die Biotransformation eingesetzt werden oder aber vorher angereichert oder isoliert werden, um es z.B. in konzentrierterer Form in die Biotransformation einsetzen zu können. Besonders bevorzugt wird das DTB in angereicherter oder isolierter Form, insbesondere bevorzugt in isolierter Form in die Biotransformation eingesetzt.
Medien zur Anzucht des Produktionsstamms im Schüttelkolben und durch Fermentation sind dem Fachmann aus der Praxis der mikro- biellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelemen- ten sowie einer Schwefelquelle (S-Quelle), durch die das Zell- wachstum und die Biotin, bzw. DTB-Produktion optimiert werden. Zu den möglichen, die Biotin, bzw. DTB-Produktion steigernden Medienzusätzen zählt z.B. auch die Pimelinsäure
(Heptandisäure, 1,5-Pentandicarbonsäure, CAS-Nummer 111-16-0).
C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biotin-, bzw. DTB-Produktbildung genutzt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker (Hexosen) wie z. B. Glucose, Mannose, Fructose oder Galactose sowie C5-
Zucker (Pentosen) wie z.B. Xylose, Arabinose oder Ribose sowie alle denkbaren daraus gebildeten Di- und Polysaccharide, wie z.B. Saccharose, Lactose, Maltose, Maltodextrin, Stärke, bzw. der daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freige- setzten Monomere oder Oligomere. Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essig- säure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze), Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze). Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlen- dioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht des Produktionsstamms sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose und Arabinose, darunter besonders bevorzugt Glucose und Saccharose und insbe- sondere bevorzugt Glucose.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomasse- bildung genutzt werden können. Dazu können beispielsweise ver- wendet werden: - Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammonium- chlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat und/oder die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO3, NaNO3, Ammonium- nitrat, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2 sowie andere N-Quellen wie z.B.
Harnstoff und/oder
- komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquell- wasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) und/oder
- NZ-Amine und/oder
- Yeast Nitrogen Base.
Die Zudosierung einer Schwefel-Quelle, entweder als einmalige Zugabe in Batch-Form oder als kontinuierlicher Feed, ist für die effiziente Produktion von Biotin, bzw. DTB erforderlich. Die kontinuierliche Zudosierung kann dabei als reine Feedlösung oder aber auch im Gemisch mit einer weiteren Feed- Komponente wie z.B. Glucose erfolgen. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch charakterisiert, dass es in Gegenwart mindestens einer Verbindung ausgewählt aus einem Salz der Sulfate, Sulfite, Dithionite, Thiosulfate und Sulfide, wobei auch bei gegebener Stabilität der Einsatz der jeweiligen Säu- ren denkbar ist, durchgeführt wird. Bevorzugte Schwefelquellen sind Salze der Sulfate, Sulfite, Thiosulfate und Sulfide, darunter besonders bevorzugt Salze der Sulfate und Thiosul- fate. Insbesondere bevorzugt ist das Verfahren dadurch charak- terisiert, dass es in Gegenwart von Salzen des Sulfats durchgeführt wird. Als Salz des Sulfats besonders bevorzugt ist eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumsulfat, Ammoniumsulfat und deren Gemische.
Weitere Schwefelquellen sind ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuren Cystein, Methionin, Hypotaurin und Taurin, bevorzugt ausgewählt aus Cystein und Methionin besonders bevorzugt aus L-Cystein und D,L-Methionin und insbesondere bevorzugt ist D,L-Methionin.
Die Anzucht (Kultivierung der Mikroorganismenzellen) kann erfolgen im sog. Batch Modus, d.h. dass zur Gewinnung von Bio- masse das Anzuchtmedium (Kulturmedium) mit einer Starterkultur des Produktionsstamms (ein oder mehrere Genkonstrukt/e tragende Mikroorganismenzellen) inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt. Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus (auch genannt Anzucht im Zulauf-Modus), d.h. ein Verfahren zur Gewinnung von Biomasse, in dem nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch-Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed, bzw. Zulauf). Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, der Schwefel-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der Vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere
Medienbestandteile sowie spezifisch die Biotin, bzw. DTB- Produktion steigernde Zusätze, wie z.B. Pimelinsäure, dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden, oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem
Feed. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren zur fermentativen Herstellung von Biotin, bzw. DTB mit einem mikrobiellen Produktionsstamm dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim fermentativen Verfahren um ein Verfahren im Fed-
Batch Modus handelt.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose sowie Glucose- oder Saccharose-enthaltende pflanzliche Hydrolysate sowie Mischungen der bevorzugten C-Quellen in beliebigem Mischungsverhältnis. Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Glucose. Bevorzugt wird die C-Quelle der Kultur so zudosiert, dass der Gehalt der Kohlenstoffquelle im Fermenter während der Produktionsphase 10 g/L nicht übersteigt. Bevorzugt ist eine maximale Konzentration von 2 g/L, besonders bevorzugt von 0,5 g/L, insbesondere bevorzugt von 0,1 g/L.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiter- hin Harnstoff, KNO3, NaNO3 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base, darunter besonders bevorzugt Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Hefeextrakt, Sojapepton oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).
Bevorzugte Schwefelquellen im Feed sind Salze der Sulfate, Sulfite, Thiosulfate und Sulfide, darunter besonders bevorzugt Salze der Sulfate und Thiosulfate und insbesondere bevorzugt Salze des Sulfats, wie z.B. Natriumsulfat und Ammoniumsulfat.
Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d. h. in μM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zuge- setzt werden. Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat), Aminosäuren (z.B. Isoleucin) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6) dem Medium zugesetzt werden.
Weitere Medienzusätze umfassen alle Arten von Fettsäuren, Mono-Carbonsäuren wie auch Di-Carbonsäuren in Form der freien
Fettsäure oder eines ihrer Salze, darunter bevorzugt die C7- Di-Carbonsäure Pimelinsäure.
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die Biotin-, bzw. DTB-Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der pH-Bereich reicht bevorzugt von pH 5 bis pH 9. Besonders bevorzugt ist ein pH- Bereich von pH 5,5 bis pH 8. Insbesondere bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7,5.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produk- tionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 37°C und insbesondere bevorzugt von 29°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne
Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff.
Bei der aeroben Kultivierung des erfindungsgemäßen Stammes zur Biotin-Produktion wird eine Sättigung des Sauerstoff-Gehalts von bevorzugt mindestens 5% (v/v), besonders bevorzugt von mindestens 15% (v/v) und insbesondere bevorzugt von mindestens 30% (v/v) eingestellt. Die Regulation der Sauerstoff-Sättigung in der Kultur erfolgt dabei entsprechend dem Stand der Technik automatisch über eine Kombination aus Gaszufuhr und
Rührgeschwindigkeit .
Die Sauerstoffversorgung kann durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet werden. Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft. Der Bereich der Pressluftzufuhr bei der aeroben Kultivierung beträgt be- vorzugt 0,05 vvm bis 10 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermentationsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentationsvolumen pro Minute). Besonders bevorzugt ist ein Presslufteintrag von 0,2 vvm bis 8 vvm, insbesondere bevorzugt von 0,4 bis 6 vvm und im speziellen bevorzugt von 0,8 bis 5 vvm.
Die maximale Rührgeschwindigkeit beträgt bevorzugt 2500 rpm, besonders bevorzugt maximal 2000 rpm und insbesondere bevor- zugt maximal 1800 rpm.
Die Kultivierungsdauer beträgt bevorzugt zwischen 10 h und 200 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Insbesondere bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur fermentativen Herstellung von Biotin, bzw. DTB wird in Schritt i der anspruchsgemäße mikrobielle Produktionsstamm kultiviert und in Schritt ii der
Fermentationsüberstand isoliert. D.h. Fermentationsansätze, die durch das beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten Biotin, bzw. DTB extrazellulär akkumuliert im Fermentationsüberstand. Biotin, bzw. DTB kann direkt weiterverwendet oder aus dem Fermentationsmedium isoliert werden. Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des Biotin, bzw. DTB sind verfügbar, darunter Spektralphotometrie, NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie, Gravimetrie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide.
Fig. 1: pKKj-SC101.
Fig. 2: pcoaA-wt.
In den Figuren verwendete Abkürzungen:
TetR: Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht.
Ptac: tac Promotor pSClOl ORI: Replikationsursprung. coaA: coaA (Pantothenatkinase-Gen) cds
EcoRI: Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI
Ndel: Schnittstelle für das Restriktionsenzym Ndel
Pstl: Schnittstelle für das Restriktionsenzym Pstl
Styl: Schnittstelle für das Restriktionsenzym Styl
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1: Herstellung von coaA-Expressionsvektoren
Vektor pKKj-SC101:
Zur Herstellung von coaA-Expressionsvektoren wurde der Vektor pKKj-SC101 (Fig. 1) verwendet. pKKj-SC101 wurde aus dem Vektor pKKj hergestellt. pKKj ist offenbart in EP 2 670837 Al (Wacker) und ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der GenBank Gendatenbank unter der Zugangsnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 - 1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequenz), wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj entstand.
Vektor pKKj-tet: Plasmid DNS des Vektors pKKj wurde mit BspHI geschnitten und das 1,9 kb Vektorfragment isoliert. Das Tetracyclin Resistenzgen wurde aus dem Plasmid pACYC184 als 1,4 kb Genfragment durch PCR isoliert. Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist offenbart in der GenBank Gendatenbank unter der Zugangsnummer X06403.1. Das 1,4 kb PCR-Produkt umfasste dabei die in X06403.1 offenbarte Sequenz von nt 1434 bis nt 2870. Das 1,4 kb PCR-Produkt wurde in das 1,9 kb Vektorfragment kloniert. Die korrekte Klonierung wurde durch DNS- Sequenzierung (Eurofins Genomics) überprüft. Es entstand der Vektor pKKj-tet, in dem das Tetracyclin-Resistenzgen die gleiche Orientierung wie im folgend beschriebenen Vektor pKKj- SC101 (Fig. 1) hat.
Vektor pKKj-SC101: Plasmid DNS des Vektors pKKj-tet wurde mit Styl und Ndel geschnitten und das 2,4 kb große Vektorfragment isoliert. Der Replikationsursprung SC101 wurde durch Gensynthese (Eurofins Genomics) als 1,4 kb DNS-Fragment hergestellt. Die DNS-Sequenz des Replikationsursprungs SC101 ist offenbart in der GenBank Gendatenbank unter der
Zugangsnummer K00042.1. Das 1,4 kb DNS-Fragment umfasste nt 477 bis nt 1816 der in K00042.1 offenbarten Sequenz. Das 1,4 kb DNS-Fragment wurde gegenüber der in K00042.1 offenbarten Orientierung in revers-komplementärer Form in das 2,4 kb Vektorfragment kloniert. Es resultierte der 3,8 kb Vektor pKKj-SClOl (Fig. 1).
Vektoren pcoaA, pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q und pcoaA-F247V:
Plasmid DNS des Vektors pKKj-SC101 wurde mit EcoRI und Pstl geschnitten und der 3,8 kb linearisierte Vektor isoliert.
Die cds der zu klonierenden coaA-Varianten wurden als 950 nt grosse DNS-Fragmente durch PCR („Phusion™ High-Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern coaa-13f (SEQ
ID NO: 9) und coaa-14r (SEQ ID NO: 10) hergestellt und durch
Agarose-Gelelektrophorese (QIAquick® Gel Extraction Kit, Qiagen) isoliert.
Template-DNS für die PCR-Reaktionen waren genomische DNS des E. coli K12 Stammes W3110 für das coaA WT-Gen (coaA-wt, SEQ ID NO: 1) sowie synthetische Gene (hergestellt bei Eurofins Genomics) für die Mutanten coaA-R106A (SEQ ID NO: 3), coaA- H177Q (SEQ ID NO: 5) und coaA-F247V (SEQ ID NO: 7).
Die jeweiligen 950 nt coaA DNS-Fragmente wurden mittels des NEBuilder® Klonierkit (NEB New England Biolabs) in das 3,8 kb pKKj-SC101 Vektorfragment kloniert. Es resultierten die coaA- Expressionsvektoren pcoaA-wt, pcoaA-R106A, pcoaA-H177Q und pcoaA-F247V. Repräsentativ für alle vier Expressionsvektoren ist die Vektorkarte für pcoaA-wt in Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 2: Herstellung von Produktionsstammen
Ausgangsstämme (Wirtsstämme) zur Herstellung von Produktions- stämmen waren die bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH käuflich erhältlichen Mikroorganismenstämme Escherichia coli K12 W3110, Stammnummer DSM 5911, Raoultella terrigena, Stammnummer DSM2687 und Pantoea ananatis, Stammnummer DSM30080. E. coli W3110 wurde in bekannter Weise mit den Vektoren pcoaA-wt, pcoaA-R106A, pcoaA- H177Q, pcoaAA-F247V transformiert und Transformanten auf LBtet Platten selektiert. LBtet-Platten enthielten 10 g/L Trypton (GIBCO™), 5 g/L Hefeextrakt (BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L Agar und 15 mg/L Tetracyclin (Sigma-Aldrich). Jeweils eine Transformante wurde als Produktionsstamm ausgewählt. Die Produktionsstämme erhielten die Bezeichnung E. coli W3110 x pcoaA-wt, E. coli W3110 x pcoaA-R106A, E. coli W3110 x pcoaA- H177Q und E. coli W3110 x pcoaA-F247V und wurden zur Anzucht im Schüttelkolben, bzw. Fermentation und Analyse der
Produktion von Biotin und Dethiobiotin eingesetzt. In analoger Weise wurden R. terrigena, bzw. PP.. ananatis mit dem Vektor pcoaA-R106A transformiert. Die Produktionsstämme erhielten die
Bezeichnung R. terrigena x pcoaA-R106A und P. ananatis x pcoaA-R106A.
Beispiel 3: Anzucht von Produktionsstammen im
Schüttelkolben und Analytik von Biotin, DTB und Pantothensäure
Vorkultur: Von E. coli W3110 wurde eine Vorkultur in LB-Medium
(10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl), von den Produktionsstämmen E. coli W3110 x pcoaA-wt, EE.. coli W3110 x pcoaA-R106A, E. coli W3110 x pcoaA-H177Q und E. coli W3110 x pcoaA-F247V wurde jeweils eine Vorkultur in LBtet-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Tetracyclin) hergestellt. Die Anzucht erfolgte bei 37°C und 120 rpm über Nacht.
Von R. terrigena und P. ananatis wurden ebenfalls Vorkulturen in LB-Medium hergestellt, von den Produktionsstämmen R. terrigena x pcoaA-R106A und P. ananatis x pcoaA-R106A in LBtet-Medium. Die Anzucht erfolgte bei 30°C und 120 rpm über Nacht.
Hauptkultur: 0,5 ml der jeweiligen Vorkultur wurde in einen 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml BS20-Medium (WT-Stämme E. coli W3110, R. terrigena, P. ananatis), bzw. BS20-Medium, enthaltend 15 mg/L Tetracyclin für alle mit einem Plasmid transformierten Stämme, überführt.
Zusammensetzung des BS20-Mediums: 4 g/L K2HPO4, 4 g/L KH2PO4, 10 g/L NH4-Sulfat, 2 g/L Na2SO4, 1 g/L NH4Cl, 10 g/L Hefeextrakt (Sigma-Aldrich), 3 g/L Na3Citrat x 2 H2O, 0,03 g/L FeSO4 x 7 H2O, 0,05 g/L CaCl2 x 2 H2O, 1 g/L MgSO4 x 7 H2O, 20 g/L Glucose, 0,1 g/L D,L-Methionin, 5 mg/L Thiamin (Sigma- Aldrich), 50 mg/L Pyridoxalphosphat (Sigma-Aldrich) und 3 ml/L Spurenelementlösung .
Zusammensetzung der Spurenelementlösung: 0,15 g/L Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g/L H3BO3, 0,7 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuSO4 x 5 H2O, 1,6 g/L MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/L ZnSO4 x 7 H20.
Die Hauptkulturen der E. coli-Stämme wurden für 24 h bei 37°C und 140 rpm in einem Truhenschüttler (Infors) inkubiert. Die Hauptkulturen der R. terrigena- und P. ananatis-Stämme wurden für 24 h bei 30°C und 140 rpm in einem Truhenschüttler (Infors) inkubiert. Nach 24 h wurden 1 ml Proben entnommen und die Zelldichte als OD600/ml-Wert (optische Dichte der Hauptkultur, photometrisch gemessen bei 600 nm) gemessen mit einem Genesys™ 10S UV-Vis Spektralphotometer der Fa. Thermo- Scientific™, sowie der Gehalt an Biotin, Dethiobiotin und ggf. auch Pantothensäure durch LC-MS (Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie) bestimmt.
Probenvorbereitung zur Quantifizierung von Biotin, bzw. DTB durch LC-MS:
1 ml Kulturbrühe aus der Schüttelkolbenanzucht wurden 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge).
Der Zellkulturüberstand wurde isoliert und durch LC-MS auf den
Gehalt an Biotin, Dethiobiotin bzw. Pantothensäure untersucht.
LC-MS-Analytik von Biotin, Dethiobiotin und Pantothensäure:
Zur quantitativen Bestimmung der in den Beispielen quantitativ analysierten Verbindungen wurde eine jeweils für Biotin, Dethiobiotin und Pantothensäure kalibrierte LC-MS-Methode
(Flüssigchromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie) eingesetzt, wobei die zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich sind (Sigma- Aldrich). Verwendet wurde das LC-MS-Gerät UHPLC 1290 Infinity II (Flüssigchromatographie) kombiniert mit dem 6470 Triple Quadrupol Massenspektrometer, beides von der Fa. Agilent. Für die Flüssigchromatographie wurde die Säule ACQUITY® UPLC HSS T3 column (2.1 x 100 mm, particle size: 1.8 μm) der Fa. Waters™ eingesetzt. Verwendete Laufmittel: Laufmittel A: 0,1% (v/v) Ameisensäure in H2O. Laufmittel B: 0,1% (v/v) Ameisensäure in Acetonitril. Laufbedingungen für die Flüssigchromatographie: 0,5 min isokratisch 0% Laufmittel B, dann Gradient in 1 min auf 15% Laufmittel B, dann 1,5 min isokratisch 15% Laufmittel
B, dann Gradient in 2 min auf 100% Laufmittel B, gefolgt von 2 min isokratisch 100% Laufmittel B. Die Flussrate betrug 0,4 ml/min. Die durch die Flüssigchromatographie aufgetrennten Analyten Biotin, Dethiobiotin und Pantothensäure wurden durch Massenspektrometrie entsprechend dem Stand der Technik durch sog. „Multi Reaction Monitoring" (MRM) quantifiziert. Die Nachweisgrenze für Biotin, DTB und Pantothensäure betrug jeweils 0,1 mg/L.
Eine Einführung in die theoretischen Grundlagen der Massenspektrometrie ist vom Hersteller Agilent verfügbar (https://www.agilent .com/cs/library/slidepresentation/public/5 991-5857 Agilent MS Theory DEE.pdf).
Für die Quantifizierung der Signale aus der Massenspektrometrie wurden die in Tab. 1 aufgeführten Molekulargewichte für den betreffenden Analyten („Precursor Ion") und für die bei der Massenspektrometrie entstandenen
Molekülfragmente („Produkt Ion") verwendet. Die Polarität " +" in Tab. 1 bedeutet, dass positiv geladene Ionen gemessen wurden.
Tab. 1: Für die Quantifizierung durch MRM Multi Reaction Monitoring verwendete Produkt Ionen:
Beispiel 4: Verwertung von Pantothenat
Die Anzucht der Stämme E. coli W3110, E. coli W3110 x pcoaA-wt und E. coli W3110 x pcoaA-R106A erfolgte, wie in Beispiel 3 beschrieben, wobei die Hauptkulturen der drei Stämme mit jeweils 8 mg/L Ca-Pantothenat supplementiert worden waren. Nach 24 h Inkubationsdauer bei 37°C wurden die Zelldichte OD600/ml und der Gehalt an Pantothensäure im Kulturüberstand durch LC-MS bestimmt (Tabelle 2).
Tab.2: Zelldichte und Pantothensäure-Gehalt im
Kulturüberstand nach 24 h Anzucht der Stämme E. coli W3110, E. coli W3110 x pcoaA-wt und E. coli
W3110 x pcoaA-R106A im Schüttelkolben
Beispiel 5: Produktion von Biotin und Dethiobiotin in E. coli-Stämmen
Die Anzucht der Stämme E. coli W3110, E. coli W3110 x pcoaA- wt, E. coli W3110 x pcoaA-R106A, EE.. coli W3110 x pcoaA-H177Q und E. coli W3110 x pcoaA-F247V erfolgte, wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach 24 h Inkubationsdauer bei 37°C wurden die Zelldichte OD600/ml, der Gehalt an Biotin und Dethiobiotin im
Kulturüberstand durch LC-MS bestimmt (Tabelle 3).
Tab. 3: Zelldichte, Biotin- und Dethiobiotin-Gehalt im
Kulturüberstand nach 24 h Anzucht der Stämme E. coli W3110, E. coli W3110 x pcoaA-wt, E. coli W3110 x pcoaA-R106A, E. coli W3110 x pcoaA-H177Q und E. coli W3110 x pcoaA-F247V im Schüttelkolben
Beispiel 6: Produktion von Biotin und Dethiobiotin in R. terrigena Stämmen
Die Anzucht der Stämme R. terrigena und R. terrigena x pcoaA-
R106A erfolgte, wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach 24 h Inkubationsdauer bei 30°C wurden die Zelldichte OD600/ml, der
Gehalt an Biotin und Dethiobiotin im Kulturüberstand durch LC-
MS bestimmt (Tabelle 4).
Tab. 4: Zelldichte, Biotin- und Dethiobiotin-Gehalt im
Kulturüberstand nach 24 h Anzucht der Stämme R. terrigena und R. terrigena x pcoaA-R106A im
Schüttelkolben Beispiel 7: Produktion von Biotin und Dethiobiotin in P. ananatis Stämmen
Die Anzucht der Stämme P. ananatis und P. ananatis x pcoaA-
R106A erfolgte, wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach 24 h Inkubationsdauer bei 30°C wurden die Zelldichte OD600/ml, der
Gehalt an Biotin und Dethiobiotin im Kulturüberstand durch LC-
MS bestimmt (Tabelle 5).
Tab. 5: Zelldichte, Biotin- und Dethiobiotin-Gehalt im
Kulturüberstand nach 24 h Anzucht der Stämme P. ananatis und P. ananatis x pcoaA-R106A im
Schüttelkolben
Beispiel 8: Extraktion von Biotin und DTB aus Zellen der
Schüttelkolbenanzucht
Verwendet wurde die Schüttelkolbenanzucht des
Produktionsstammes E. coli W3110 x pcoaA-R106A aus Beispiel 5 mit einem Gehalt an Biotin von 1,2 mg/L und DTB von 0,7 mg/L (Tabelle 2). 30 ml der Schüttelkolbenanzucht wurden 10 min bei
6300 rpm zentrifugiert (Thermo Scientific™ Multifuge X1R, TX- 400 Rotor) und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 10 ml H2O resuspendiert, 5 min bei 6300 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurden in 2 ml H2O suspendiert. Aus der Zellsuspension wurde ein Zellextrakt hergestellt. Dazu wurde der Zellhomogenisator FastPrep-24™ 5G der Fa. MP Biomedicals™ verwendet. Das in 2 ml H2O suspendierte Zellpellet wurde in zwei 1 ml Aliquots in vom Hersteller vorgefertigten 1,5 ml Röhrchen mit Glaskugeln („Lysing Matrix B") aufgeschlossen (3 x 20 see bei einer Schüttelfrequenz von 6000 rpm mit jeweils 30 see Pause zwischen den Intervallen). Die erhaltenen Zellhomogenate wurden vereinigt und 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge), um einen Zellextrakt herzustellen. Der Zellextrakt wurde durch LC-MS auf den Gehalt an Biotin und DTB untersucht. Es konnten weder Biotin noch DTB nachgewiesen werden, bei einer Nachweisgrenze der LC-MS- Analytik von jeweils 0,1 mg/L für Biotin, bzw. DTB.
Beispiel 9: Produktion von Biotin, bzw. DTB durch Fermentation
Vorkultur 1:
20 ml LBtet-Medium wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit dem Produktionsstamm E. coli W3110 x pcoaA-R106A beimpft und 7 h auf einem Schüttler (150 rpm, 34°C) inkubiert. 20 ml LB- Medium wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit dem WT-Stamm
E. coli W3110 beimpft und 7 h auf einem Schüttler (150 rpm,
34°C) inkubiert.
Vorkultur 2:
Anschließend wurden die Vorkulturen 1 vollständig in 100 ml BS20-Medium überführt, wobei das Medium für die Vorkultur 2 des Stammes E. coli W3110 x pcoaA-R106A mit 15 mg/L Tetracyclin supplementiert war (Zusammensetzung BS20-Medium siehe Beispiel 3). Die Kulturen wurden jeweils in einem Erlenmeyerkolben (1 L Volumen) bei 34°C für 17 h bei 150 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Nach dieser Inkubation lagen die Zelldichten OD600/ml jeweils zwischen 3 und 5.
Hauptkultur :
Die Fermentation wurde in einem Fermenter des Typs „DASGIP® Parallel Bioreactor Systems für die Mikrobiologie" der Firma Eppendorf durchgeführt. Es wurde ein Kulturgefäß mit 1,81 Gesamtvolumen verwendet. Das Anzuchtmedium bestand aus 600 ml
BS20-Medium und 15 mg/L Tetracyclin (Stamm E. coli W3110 x pcoaA-R106A), bzw. aus 600 ml BS20-Medium (Stamm E. coli
W3110).
Der pH-Wert im Fermenter wurde zu Beginn durch Zupumpen einer 25% NH4OH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit 25% NH4OH, bzw. 4 M H3PO4 auf einem Wert von 7,0 gehalten. Schaumbekämp- fung erfolgte durch automatische Zudosierung von 4 % v/v Struktol J673 in H2O (Schill & Seilacher).
Zum Animpfen wurden 60 ml der jeweiligen Vorkultur 2 in das Fermentergefäß gepumpt. Das Anfangsvolumen betrug somit 660 ml. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Belüftungsrate von 2 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermentationsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentationsvolumen pro Minute) mit einer über einen Steril- filter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedin- gungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden.
Der Soll-Wert für die O2-Sättigung während der Fermentation wurde auf 15% eingestellt. Nach Absinken der O2-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die O2-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit (auf max. 1.500 rpm) kontinuierlich gesteigert. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 34°C durchgeführt.
Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 20 g/L auf ca. 2 g/L abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zudosierung einer 56% (w/w) Glucose-Lösung. Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glucosekonzentration im Fermen- ter 2 g/L fortan nicht mehr überstieg. Die Glucose-Bestimmung erfolgte mit einem Glucoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA). Die Fermentationsdauer betrug 65 h. 24 h, 42 h und 65 h nach
Start der Fermentation wurden Proben vom Fermentationsansatz entnommen, die Zelldichte OD600/ml sowie der Gehalt an Biotin, bzw. DTB im Kulturüberstand durch LC-MS bestimmt. Die
Ergebnisse für den Stamm E. coli W3110 x pcoaA-R106A sind in
Tab. 6 zusammengefasst. Nach einer Fermentationszeit von 65 h betrug die Biotin-Ausbeute 20,1 mg/L und die DTB-Ausbeute 28,6 mg/L. In der parallel durchgeführten Fermentation des Stammes
E. coli W3110 konnten weder Biotin noch DTB nachgewiesen werden (Tab. 7).
Tab. 6: Zeitlicher Verlauf von Zelldichte, Biotin- und DTB-
Gehalt der Fermentation des Stammes E. coli W3110 x pcoaA-R106A
Tab. 7: Zeitlicher Verlauf von Zelldichte, Biotin- und DTB-
Gehalt der Fermentation des Stammes E. coli W3110

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Biotin, Dethiobiotin (DTB) oder deren Gemisch dadurch gekennzeichnet, dass ein mikrobieller Produktionsstamm kultiviert wird, der mindestens ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase (enzymatische Aktivität der Proteine der Klasse EC 2.7.1.33, CoaA) rekombinant exprimiert, und anschließend Biotin, DTB oder deren Gemisch isoliert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mikrobiellen Produktionsstamm um einen bakteriellen Stamm handelt.
3. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mikrobiellen Produktionsstamm um einen Stamm der Art Escherichia coli, Raoultella terrigena oder Pantoea ananatis handelt.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mikrobiellen Produktionsstamm um einen Stamm der Art Escherichia coli handelt.
5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Zellen im technischen Maßstab durch Fermentation erfolgt.
6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Gen, das das gegenüber Coenzym A Feedback-resistente Enzym mit der Aktivität einer Pantothenatkinase exprimiert, um ein mutiertes Gen handelt, das in seiner Wt-Form für ein durch Coenzym A Feedback-gehemmtes CoaA-Enzym kodiert.
7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mutierten Gen, das ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase exprimiert, um ein bakterielles Gen handelt.
8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mutierten Gen, das ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase exprimiert, um ein bakterielles Gen aus der Familie der Enterobacteriaceae handelt.
9. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim mutierten Gen, das ein gegenüber Coenzym A Feedback-resistentes Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase exprimiert, um das coaA-Gen von Escherichia coli handelt.
10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das gegenüber Coenzym A Feedback-resistente Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Pantothenatkinase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder eine dazu zu mindestens 70% identische Aminosäuresequenz aufweist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist.
12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Biotin im Fermentationsüberstand bezogen auf den Gehalt an Biotin im Fermentationsansatz über 70% beträgt.
13. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotin-Ausbeute am Ende der Fermentation nach einer Fermentationsdauer von bis zu
65 h mindestens 10 mg/L beträgt.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die DTB-Ausbeute am Ende der Fermentation nach einer Fermentationsdauer von bis zu 65 h mindestens 10 mg/L beträgt.
15. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass DTB produziert wird und in einer Biotransformation zu Biotin umgesetzt wird, welches dann aus dem Biotransformationsansatz isoliert wird.
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