EP4247344A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung einer flüssigkeit enthaltend liposomen und hergestellte flüssigkeit - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur herstellung einer flüssigkeit enthaltend liposomen und hergestellte flüssigkeit

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Publication number
EP4247344A1
EP4247344A1 EP21819358.9A EP21819358A EP4247344A1 EP 4247344 A1 EP4247344 A1 EP 4247344A1 EP 21819358 A EP21819358 A EP 21819358A EP 4247344 A1 EP4247344 A1 EP 4247344A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
liquid
liposomes
mixer
particularly preferably
range
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21819358.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Regina BLEUL
Raphael THIERMANN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP4247344A1 publication Critical patent/EP4247344A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes

Definitions

  • a method and a device for the production of a liquid containing liposomes are provided.
  • the method is characterized in that a first liquid and a second liquid are fed into a micro-mixer and to the outlet of the micro-mixer by gas pressure from at least one source of gas, optionally additionally by at least one device for conveying liquid, with the total flow rate of the liquids is adjusted so that it is at least 10 mL/min at the outlet of the micromixer.
  • the method and the device make it possible to provide liquids containing liposomes with a narrow size distribution in a simple and reproducible manner on an industrial scale. Furthermore, a liquid containing liposomes with a narrow size distribution is provided and uses thereof are proposed. Liposomes are the most established nanocarrier systems in pharmaceutical use worldwide. Doxil® was the first "nanodrug" to be approved by the FDA in 1995.
  • nano-liposomes on an industrial scale is a multi-stage batch process.
  • the lipids mostly large, multilamellar liposomes (MLV) are hydrated.
  • MLV multilamellar liposomes
  • downsizing is carried out in order to obtain nanoliposomes with a diameter of ⁇ 200 nm.
  • high-pressure extrusion is carried out through a membrane that has corresponding nano-sized pores (example: production of Doxil®)
  • high-pressure homogenization is carried out (examples: production of AmbiSome® and for nano-liposomes used in cosmetics).
  • Extrusion must be performed at elevated temperatures because the MLV lipid bilayers must be flexible enough to allow for shape changes required to achieve size reduction. Multiple passes through the extrusion membrane are necessary to achieve the narrow size distribution required. This procedure is time-consuming. In addition, this procedure is limited to heat-resistant lipid raw materials and corresponding embedded or encapsulated substances. In addition, the extrusion process is associated with material loss on the membrane. Furthermore, clogging (clogging) of the membranes requires frequent membrane replacement and the loss of possibly valuable substances such as lipids and active ingredients, which jeopardizes the implementation of a production process for providing a sterile liquid with liposomes and makes it more expensive.
  • the polycarbonate membranes usually used also show batch fluctuations due to different properties such as pore size, pore uniformity and surface wetting, which leads to a lack of process reproducibility.
  • high-pressure homogenization often leads to broad size distributions, including the production of large percentages of very small liposomes.
  • the high-pressure homogenization must also be carried out at high temperatures.
  • a method for the rapid and simple large-scale production of a sterile liquid containing nanometer-sized liposomes There is also a need for formulation methods for thermolabile (sensitive) lipids and drugs.
  • next-generation drugs such as nucleic acid-based immunotherapeutics.
  • WO 2017/103268 A1 discloses a continuous method for producing nanoparticles. The method disclosed there is not suitable for the large-scale production of sterile liquids containing liposomes.
  • EP 1337322 B1 discloses a method for producing lipid vesicles. This method is not strictly microfluidic and is limited in the use of demanding API (e.g. ultrahydrophobic agents) in the preparation of the liposomes. Furthermore, the narrowness of the size distribution of the liposomes produced can still be improved.
  • demanding API e.g. ultrahydrophobic agents
  • WO 2014/172045 A1 discloses a method for the industrial production of sterile liposome solutions on a large scale.
  • the reproducibility is problematic because the production takes place via a platform in which an absolutely equal distribution of the various channels of the platform must be ensured, which is not easy.
  • a continuous method for producing a liquid containing liposomes comprising the steps of a) providing a first liquid in a first container, the first liquid containing or consisting of at least one lipid; b) providing a second liquid in a second container, the second liquid containing or consisting of water; c) directing the first liquid along a first fluid line into a first inlet of a micro-mixer and in flow to an outlet of the micro-mixer; d) directing the second liquid along a second fluid line into a second inlet of the micromixer and in a flow alongside the first liquid to the outlet of the micromixer; wherein the first liquid and the second liquid mix within the micro-mixer, so that a liquid containing liposomes emerges at the outlet of the micro-mixer;
  • liposomes is understood to mean liposomes, liposomes and lipid nanoparticles, which can optionally be loaded with a substance (for example an active ingredient), with “loaded” meaning that a cavity inside the lipid particles and/or or a membrane of the lipid particles (preferably both) contains or contain a substance (eg an active ingredient).
  • a substance for example an active ingredient
  • the liposomes (ie the liposomes, lipoplexes and/or lipid nanoparticles) have in particular a diameter in the range from 20 nm to ⁇ 200 nm or in the range from >200 nm to ⁇ 500 nm, preferably in the range from 40 nm to 150 nm or in the range from 250 nm to 400 nm, particularly preferably in the range from 60 nm to 120 nm or in the range from 300 nm to 350 nm.
  • the diameter can be determined by dynamic light scattering and/or cryogenic Transmission electron microscopy, preferably via a measurement with cryogenic transmission electron microscopy, determined or be determined.
  • micro-mixer is preferably understood to mean all mixers whose mixing principle is based on the mixing principle of a micro-mixer, including those that are so large (scaled) that their fluid channels have larger dimensions (i.e. cross-sections) than in the micrometer range (range from 1 pm to 1000 pm).
  • the method according to the invention it is possible to provide liquids which contain liposomes with a narrow size distribution in a simple and reproducible manner on an industrial scale.
  • the method is also suitable for ensuring that sterile liquids containing liposomes can be provided since the liquid delivery takes place by gas pressure from at least one source of gas (optionally additionally by at least one device for liquid delivery).
  • the optional device for conveying liquid is arranged downstream of the at least one source of gas and its liquid-contacting surfaces can be ensured to be sterile. Since the components used in the process (e.g. the fluid lines and the micromixer) are sealed off from the outside, it can also be ensured that the liquids do not come into contact with microorganisms and/or viruses.
  • a micro-mixer enables a high level of control over the structure formation of the liposomes, ie excellent size control is possible and very narrow size distributions can be achieved.
  • Another advantage is that the method can be scaled up without having to be readjusted, ie without having to ensure, for example, an equal distribution of the streams during the "numbering-up" of the individual micromixers, which is often necessary for micromixers ("external numbering-up") and/or without having to change the mixer type.
  • a larger mixer of the same type (“scalable micromixer") can be used (e.g.
  • Scalable micromixers which can be used according to the invention as mixers or micromixers, are particularly characterized in that they do not require any additional distribution lines and collection lines in the event of scaling et al., Chemical Engineering Journal, Vol. 334, pp. 1996-2003), StarLam-like micromixers (e.g. as disclosed in DE 199 27 556 C2) and/or cyclone mixers (e.g. as disclosed in EP 1 390 131 B1) .
  • the method can be characterized in that all surfaces with which the first and second liquid come into contact on the way to the outlet of the micromixer are sterile. Furthermore, it is preferred that all of these surfaces are closed off in a fluid-tight manner to the outside, preferably form a closed system.
  • the advantage here is that the conditions for the micromixer and the fluid delivery devices (eg the gas pressure from at least one gas source, optionally the additional device for liquid delivery) can be set very precisely, which is advantageous for achieving desired PDI values and others quality criteria.
  • the liquids used do not come into contact with microorganisms and/or viruses. Apart from that, it is preferred that all of these surfaces have no areas where residues can collect.
  • none of these surfaces contain or consist of glass.
  • all of the fluids used in the method eg the first and second sterile liquids and the gas from the gas source
  • the same can apply to all components used in the process (e.g. micromixer, conveyor devices and containers), at least for their surfaces that come into contact with the fluids used in the process.
  • the method may be characterized in that the at least one source of gas includes or consists of a gas container.
  • the at least one source of gas may have a first fluidic connection to the first container and a second fluidic connection to the second container.
  • the at least one source of gas can contain a gas that does not contain oxygen, the gas preferably containing or consisting of a gas selected from the group consisting of nitrogen, noble gas and mixtures thereof.
  • the gas pressure of the source of gas provides a delivery pressure, optionally together with a liquid delivery device.
  • the total flow rate can be set here via a constant gas pressure from the source of gas, optionally also via the device for conveying liquid.
  • the gas pressure alone is preferably in the range of ⁇ 12 bar, more preferably ⁇ 8 bar, particularly preferably ⁇ 6 bar, very particularly preferably greater than 1 to 6 bar, in particular 1.5 to 5 bar.
  • delivery pressures of up to 50 bar can be achieved.
  • the total flow rate can then be kept constant via at least one, preferably at least one first and at least one second flow regulator, with the at least one first flow regulator particularly preferably being arranged on the first fluidic connection and the at least one second flow regulator being arranged on the second fluidic connection.
  • the at least one flow regulator serves to convert the original delivery pressure into a constant flow rate.
  • the gas source (then optionally the device for conveying liquid) and then the at least one flow regulator are arranged in the direction of flow.
  • the pressure loss in the mixing chamber of the mixer is preferably low, preferably in the range of ⁇ 6 bar, in particular in the range from 1.5 to 5 bar.
  • the total flow rate can be adjusted so that at the outlet of the micromixer it is ⁇ 80 mL/min, preferably ⁇ 320 mL/min, particularly preferably ⁇ 1280 ml/min, very particularly preferably ⁇ 2800 ml/min, in particular ⁇ 5120 mL/min.
  • the total flow rate can be set so that the mixer at the outlet of the micro-mixer per cross-sectional area of the outlet of the micro- ⁇ 20 ml / (min-mm 2 ), preferably ⁇ 100 ml / (min-mm 2 ), particularly preferably ⁇ 200 ml/(min-mm 2 ), very particularly preferably ⁇ 400 ml/(min-mm 2 ), optionally ⁇ 1000 ml/(min-mm 2 ), in particular from 100 to 400 ml/(min-mm 2 ), amounts to.
  • the total flow rate can be set such that the ratio of the flow rate of the second liquid to the flow rate of the first liquid is ⁇ 100:1, preferably ⁇ 20:1, particularly preferably ⁇ 16:1, very particularly preferably ⁇ 8:1 more preferably ⁇ 7:1, more preferably ⁇ 6:1, very much preferably ⁇ 5:1, in particular ⁇ 4:1.
  • the total flow rate can have a flow rate variation of less than 1% of the total flow rate, preferably less than 0.1% of the total flow rate.
  • the advantage here is that very low PDI values are achieved.
  • the overall flow rate can be adjusted in such a way that the flow has a Reynolds number in the range from >80 to ⁇ 1200, preferably >120 to ⁇ 1000.
  • the method can be characterized in that the micromixer has one or more mixing structures which extend obliquely or transversely to the direction of flow and are preferably suitable for deflecting the first liquid and/or second liquid in a direction obliquely or transversely to the direction of flow .
  • the micromixer particularly preferably all of the components used in the process, can contain or consist of stainless steel.
  • the advantage here is that the micro-mixer or all components used in the process can be sterilized simply by exposure to heat and cleaning validation can be established. Consequently, the micro-mixer does not have to be a single-use product whose reproducible mixing performance must be constantly checked and validated.
  • the other components used in the process ie to the entire device for carrying out the process if it contains or consists of stainless steel.
  • micromixer can be autoclavable.
  • the micromixer can be dismantled into at least two parts for cleaning fluid channels of the micromixer.
  • the micro-mixer can be a “split-recombine” micro-mixer, with the micro-mixer preferably being a “ramp-up/ramp-down” micro-mixer, particularly preferably a “caterpillar”-type micro-mixer (see, for example, Hermann et al. , Chemical Engineering Journal, Vol. 334, pp. 1996-2003.
  • Caterpillar-type micromixers have been found to have several advantages. First, they have a continuous channel. This is in contrast to many other "split-recombine” micromixers, in which the main channel is split up into, for example, section-by-section, fluidically separate channels, which then subsequently reunite.
  • the inclined surfaces are preferably inclined by less than 70°, particularly preferably less than 55° and very particularly preferably by less than 45° relative to the main flow direction (ie relative to a flow direction parallel to the walls of the fluid channels of the micromixer). Consequently, the liquid containing the liposomes is produced more gently, ie there is less degradation of the starting materials and the products.
  • this micromixer is very easily scalable, for example by increasing the cross-sectional area of the mixing channel perpendicular to the main flow direction while retaining the repeating basic structure typical of the caterpillar-like micromixer. With increasing magnification, the mixing performance if necessary, be adjusted by increasing the number of repeating basic structures.
  • the micro-mixer can also be a "split in micro-lamellae and combine in multilaminated stream" micro-mixer, particularly preferably a "StarLam” micro-mixer (see e.g. DE 199 27 556 C2 and Werner, B. et al., Chemical Engineering Technology, 2005, Vol. 28, p. 401ff) This has the advantage that it can also be made of stainless steel, is easy to assemble and disassemble and also shows simple scalability.
  • the micro-mixer in particular the "caterpillar" micro-mixer, following the mixing chamber has an essentially non-narrowing and/or an essentially straight outlet.
  • the advantage here is that there is no abrupt change in direction and/or narrowing of the cross-section of the fluid flow comes, there are no dead spaces and only a lower pressure loss and low shear forces act.
  • the method can be characterized in that the first liquid contains lipids in a total concentration of > 30 g/L, preferably > 50 g/L, particularly preferably > 80 g/L, very particularly preferably > 150 g/L, in particular 160 g/L to 400 g/L (optionally 210 g/L to 290 g/L).
  • the first liquid can contain at least one phospholipid, preferably at least one zwitterionic or anionic phospholipid, the phospholipid preferably being selected from the group consisting of phosphatidylcholine, DSPC, DOPE, DOPC, DSPE, HSPC and mixtures thereof, the concentration of the at least one phospholipid, or mixtures thereof, preferably >20 g/L, preferably >40 g/L, particularly preferably >80 g/L, very particularly preferably >160 g/L, in particular 210 g/L to 400 g /L, is.
  • the first liquid can contain phospholipids with saturated fatty acid residues and/or unsaturated fatty acid residues, such as DSPC (saturated) and DOPC (unsaturated), or mixtures thereof.
  • the first liquid can contain at least one PEGylated lipid, preferably DSPE-PEG2000 and/or DMG-PEG2000, the concentration of the PEGylated lipid preferably being in the range from 15 to 40 mol %, in particular preferably in the range of 31 to 35% by moles, based on the molar fraction of at least one phospholipid in the first liquid.
  • the first liquid can contain at least one lipid, preferably at least one cationic lipid (e.g. a pH-dependent cationically charged lipid).
  • a pH-dependent cationically charged lipid e.g. a pH-dependent cationically charged lipid.
  • the first liquid may contain at least one lipidoid, the concentration of the lipid being preferably in the range from 200 to 1000 mol%, particularly preferably in the range from 300 to 800 mol%, in relation to the molar proportion of at least one lipid is in the first liquid.
  • lipidoid is understood to mean lipid-like substances which result from the reaction of acrylamides or acrylic acid esters with secondary or primary amines (i.e. are produced).
  • the pH-dependent cationic charge is preferably achieved by means of a primary, secondary or tertiary amino group
  • at least one lipidoid is meant, which is selected from the group of lipidoids mentioned in the publication by Acinc, A. et al., Nature Biotechnology (2008), vol are.
  • the first liquid may contain cholesterol.
  • the first liquid can be characterized in that it contains no nonionic, cationic, anionic and/or amphoteric surfactant, preferably contains no surfactant (at all).
  • the first liquid may contain at least one organic solvent or no organic solvent.
  • the organic solvent is preferably an organic, water-miscible solvent, particularly preferably a solvent selected from the group consisting of alcohols, particularly preferably ethanol, 1-propanol, 2-propanol, and/or methanol, Acetone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, especially ethanol.
  • the first liquid is degassed. This prevents bubble formation during assembly of the liposomes.
  • the method can be characterized in that the second liquid contains a buffer substance, preferably a buffer substance selected from the group consisting of acetate, ammonium, citrate and combinations thereof, particularly preferably calcium acetate and/or ammonium sulfate.
  • concentration of the buffer substance is preferably in the range from 5 mM to 300 mM, particularly preferably in the range from 8 mM to 250 mM. The advantage of these concentrations is that the formation of a gradient is improved.
  • the second liquid is degassed. This prevents bubble formation during assembly of the liposomes.
  • the method can be characterized in that the liposomes of the liquid are loaded with at least one active substance, loading preferably taking place in the first micromixer, in a further mixer downstream of the first micromixer, after the liposomes have been assembled and/or after the liposomes are purified.
  • the active substance can be at least one organic active substance, preferably an active substance for treating a disease, particularly preferably a molecule selected from the group consisting of vitamin, protein, peptide, lipid, DNA, RNA, organic molecule with a mass ⁇ 500 Since and mixtures thereof, in particular contain or consist of a substance selected from the group consisting of ultrahydrophobic substance, siRNA and combinations thereof. Here the encapsulation is more demanding Active substances (e.g. ultrahydrophobic substances and/or siRNA) are possible which could not be encapsulated in other processes.
  • the active substance can contain or consist of at least one inorganic active substance, preferably a substance selected from the group consisting of magnetic substance, paramagnetic substance and mixtures thereof, particularly preferably iron oxide, manganese oxide and mixtures thereof.
  • the at least one active substance is preferably contained in the first liquid, in the second liquid and/or in another liquid (downstream of the micromixer).
  • the concentration of the at least one organic active substance and/or at least one inorganic active substance can be ⁇ 1% by weight, preferably 5 to 80% by weight, particularly preferably 10 to 60% by weight, in particular 15 to 30% by weight %, in relation to the total weight of the lipids (or the components of the liposomes except water).
  • the temperature can be from >10°C to ⁇ 70°C, preferably from 15 to 40°C , particularly preferably 22 to 30 ° C, in particular 23 ° C to 25 ° C, are heated. If necessary, the temperature can be adjusted to a temperature in the range from >0°C to ⁇ 10°C.
  • substances e.g. active ingredients
  • liposomes can be provided which have these temperature-sensitive substances.
  • the method can be characterized in that the liposomes of the liquid which emerge at the outlet of the micromixer are unilamellar liposomes, multilamellar liposomes or mixtures thereof.
  • the process can be designed in such a way that the liposomes of the liquid, which emerge at the outlet of the micromixer, have a diameter in the range from 20 nm to ⁇ 200 nm or in the range from >200 nm to ⁇ 500 nm, preferably in the range from 40 nm to 150 nm or in the range from 250 nm to 400 nm, particularly preferably in the range from 60 nm to 120 nm or in the range from 300 nm to 350 nm.
  • the diameter can be dynamic Light scattering and/or cryogenic transmission electron microscopy, preferably via a measurement using cryogenic transmission electron microscopy.
  • the process can be designed in such a way that the liposomes of the liquid that emerge at the outlet of the micromixer are more than 50%, more than 70%, or more than 90%, based on the total number of all liposomes in the liquid.
  • the method can be designed in such a way that the liposomes of the liquid that emerge at the outlet of the micromixer are more than 50%, more than 70% or more than 90%, based on the total number of all liposomes in the liquid, multilamellar liposomes and the liposomes have a PDI value in the range of ⁇ 0.500, preferably in the range of ⁇ 0.300, with regard to their size distribution.
  • the PDI can preferably be determined by means of dynamic light scattering according to the standard DIN ISO 22412:2018-09 or is determined in this way.
  • the method can be characterized in that the liquid is purified in a further step after step c), the purification being carried out preferably continuously after step c), particularly before ultrafiltration, gel filtration and/or evaporation - involves performing an ultrafiltration to enrich the liposomes.
  • the purification can include removing substances that are present alongside the liposomes, preferably removing buffer substances and/or organic solvents.
  • the purification can include exchanging substances that are present alongside the liposomes for a sterile, osmolar sugar solution, preferably for a sterile, osmolar glucose solution or sucrose solution.
  • the sterile, osmolar sugar solution particularly preferably has 4 to 15% by weight of sugar, in particular 4 to 6% by weight of glucose in the case of a glucose solution and/or 9 to 11% by weight of sucrose in the case of a sucrose solution.
  • the purification can Sterilization of the solution containing liposomes preferably comprises sterile filtration through a membrane with a pore diameter (cut-off) of 0.2 ⁇ m.
  • the method can further comprise the following steps i) conducting the liquid containing liposomes at the outlet of the micro-mixer along a third fluid line, optionally a dwell loop, into a first inlet of a further mixer and in a flow to an outlet of the further mixer; and ii) passing a further liquid along a fourth fluid line into a second inlet of the further mixer and in a stream alongside the liquid containing liposomes to the outlet of the further mixer.
  • the liquid containing liposomes mixes with the further liquid within the further mixer, so that a changed liquid containing liposomes emerges at the outlet of the further mixer.
  • the proportion of the solvent is preferably reduced and a further dilution is carried out, preferably a dilution to less than half, preferably less than a quarter, of the original concentration of the liposomes in the liquid.
  • the liposomes contained become more dimensionally stable.
  • other parameters, such as the pH can also be adjusted by the admixture, with the pH preferably being lowered or neutralized.
  • the liposomes can also be loaded with at least one active substance in this step.
  • the liquid containing liposomes and the further liquid can be conveyed into the further mixer by gas pressure from at least one source of gas, optionally also by at least one device for liquid delivery, with the total flow rate of the liquids being adjusted in such a way that they at the outlet of the further mixer is more than 10 mL/min, preferably at least 20 mL/min.
  • the further mixer is preferably a micromixer, preferably a static micromixer, particularly preferably a “split-recombine” micromixer, very particularly preferably a “caterpillar”-type micromixer. Alternatively, a so-called “StarLam" micro-mixer can also be used. Both mixers can be easily adaptable in relation to the required flow rate.
  • the liposomes of the liquid can be loaded with at least one active substance in the first micromixer, in the further mixer, after the liposomes have been assembled and/or after the liposomes have been purified.
  • a device for producing a liquid containing liposomes containing a) a first container containing a first liquid, the first liquid containing or consisting of at least one lipid; b) a second container containing a second liquid, the second liquid containing or consisting of water; c) a micromixer which has a first input, a second input and an output, the first container being connected to the first input of the micromixer via a first fluid line and the second container being connected to the second input of the micromixer via a second fluid line is connected, wherein the micro-mixer is configured to allow the first liquid and the second liquid to flow in a stream within the micro-mixer to the outlet of the micro-mixer and to mix them within the micro-mixer, with a liquid containing liposomes emerging at the outlet of the micro-mixer ; d) at least one source of gas, optionally also at least one device for conveying liquid; and e) a control unit; characterized in that the at least
  • the device can be characterized in that all surfaces of the device with which the first and second liquid can come into contact on the way to the outlet of the micromixer are sterile. Further all of these surfaces of the device can be closed off in a fluid-tight manner to the outside, preferably form a closed system.
  • the advantage here is that the conditions for the micromixer and the fluid delivery devices (eg the gas pressure from at least one gas source, optionally the additional device for liquid delivery) can be set very precisely, which is advantageous for achieving desired PDI values and other quality criteria.
  • the liquids used do not come into contact with microorganisms and/or viruses. That being said, all of these surfaces can be said to have no areas where debris can collect.
  • none of these surfaces contain or consist of glass.
  • Each of these features contributes to ensuring that the device can be used to continuously produce a sterile liquid containing liposomes, ie the liquid cannot be contaminated during its production.
  • all of the fluids present in the device eg the first and second sterile liquids and the gas from the gas source
  • the device can be characterized in that the device and/or the control unit of the device is/are configured to carry out the method according to the invention.
  • the device can have features that are mentioned above in connection with the method according to the invention and/or the control unit of the device can be configured to carry out steps that are mentioned above in connection with the method according to the invention.
  • a liquid containing liposomes which is characterized in that i) more than 50%, more than 70% or more than 90% of all liposomes in the liquid are unilamellar liposomes and the liposomes with regard to their size distribution a PDI value in the range of ⁇ 0.200, preferably in the range of ⁇ 0.150, particularly preferably in the range of ⁇ 0.100 particularly preferably in the range of ⁇ 0.090, in particular in the range of ⁇ 0.075; or ii) more than 50%, more than 70% or more than 90% of all liposomes in the liquid are multilamellar liposomes and the liposomes have a PDI value in the range of ⁇ 0.500, preferably in the range of ⁇ , with regard to their size distribution have 0.300; where the PDI is preferably determined by means of dynamic light scattering according to the standard DIN ISO 22412:2018-09.
  • a liquid that contains liposomes with a small PDI it can be better ensured that the liquid does not contain a dangerous proportion of liposomes that are too large, which are considered a risk factor for promoting the formation of embolisms.
  • a smaller PDI can therefore also offer a higher security aspect.
  • the stability of the liposomes is more uniform the smaller their PDI is, which allows more precise statements to be made about the storage capacity, transport stability and handling of the liposomes.
  • a smaller PDI of the liposomes means that when the liposomes are loaded with active substance, the active substance content per liposome is more uniform, which enables more precise active substance dosing.
  • the liquid can be produced by the method according to the invention.
  • the liquid containing liposomes provided is sterile.
  • the liquid is proposed for use in medicine, preferably for use in a method for the therapeutic treatment of the human or animal body, particularly preferably i) for the application of an active substance, particularly preferably for the topical application of an active substance; and/or ii) for targeting of an active substance; and/or iii) for the release of an active ingredient; in a method for the surgical or therapeutic treatment of the human or animal body, the active ingredient preferably being selected from the group consisting of vaccine, cytostatic agent, corticoid and combinations thereof (doxorubine and/or dexamethasone) and the treatment being in particular is the treatment of cancer, an inflammatory disease, a disease of the immune system and/or a neurodegenerative disease.
  • the active substance can optionally be at least one of the organic active substances mentioned above (in connection with the method according to the invention).
  • the liquid is proposed for use in a diagnostic method, preferably in a diagnostic method that is carried out on the human or animal body, in particular in a diagnostic method in which the liposomes contain a biomarker.
  • the at least one organic active substance and/or the at least one inorganic active substance can be one of the active substances mentioned above (in connection with the method according to the invention).
  • FIG. 1 shows a device according to the invention, which has a single micro-mixer 3 .
  • the first liquid, which is in a first container 1, and the second liquid, which is in a second container 2 are supplied by gas pressure, coming from two sources 9, 9' of gas, via a first fluid line 7 in introduced into a second inlet 5 of the micromixer 3 via a second fluid line 8 and transported to the outlet 6 of the micromixer.
  • a flow regulator 11, 11' ensures that the liquid flow in these fluid lines 7, 8 is kept at a desired value.
  • the outlet 6 of the first micro-mixer is fluidically connected to a reservoir 10 so that the liquid containing liposomes emerging from the first micro-mixer 3 is conducted into the reservoir 10 .
  • FIG. 2 shows a device according to the invention, which has a first micromixer 3 and a second micromixer 12 .
  • the first liquid, which is in a first container 1, and the second liquid, which is in a second container 2 are introduced by gas pressure, originating from two sources 9, 9' of gas, via a first fluid line 7 into the first Input 4 or via a second fluid line 8 introduced into a second input 5 of the micro-mixer 3 and transported to the output 6 of the micro-mixer.
  • a liquid containing liposomes emerges at the outlet of the micromixer 3 and is conducted via a third fluid line 20 into a first inlet 14 of a further mixer 12 (here: a further micromixer).
  • FIG. 3 shows a device according to the invention, which is constructed like the device shown in FIG. here: a pump) is supported in order to achieve the necessary delivery pressure.
  • the device 17 for conveying liquids also has the property of a flow regulator and ensures that the respective liquid flow in the first fluid line 7, the second fluid line 8 and the fourth fluid line 21 is kept at a desired value.
  • FIG 4 shows a device according to the invention, which is constructed essentially like the device shown in Figure 3, the device 17 for conveying liquids being a magnetic gear pump and downstream of the outlet 15 of the second micro-mixer 12 a 3-way valve 19 is arranged.
  • the liquid containing liposomes emerging from the second micromixer 12 can be conducted via the 3-way valve 19 either into a storage container 10 or via an ultrafiltration module 18 into another storage container 10′, 10′′.
  • the device contains a micromixer and a second micromixer connected after a short dwell loop at the outlet of the first micromixer, for example to achieve more asymmetric flow conditions or to achieve dilution before purification by diafiltration to further reduce solvent content.
  • the micromixer(s) and residence loop can be temperature-controlled if required.
  • a diafiltration module membrane stack
  • membrane stack can also be connected, which can be operated directly in series or as a separate module in the circuit.
  • the micromixer is preferably a "split-and-recombine” micromixer, particularly preferably a "Caterpillar” micromixer (continuous mixing channel with several mixing stages).
  • the mixing channel of this micro-mixer has a diameter in the micrometer to millimeter range. "Upscaling" is of course possible here. For example, the same product quality can be achieved when using a bead 600 with four times the flow rate and with a bead 1200 with 16 times the flow rate compared to R-300.
  • Bead 600: 8 - 320 ml/min 22.22 ml/(min *mm 2 ) - 888.88 ml/(min*mm 2 )
  • Bead 1200: 32 - 1280 ml/min 22.22 ml/(min*mm 2 ) - 888.88 ml/(min*mm 2 )
  • the micro-mixer and/or the second micro-mixer can also be a so-called StarLam micro-mixer.
  • the StarLam micro-mixer is also scalable and can be operated, for example, as StarLam 30, 300 and 3000 with flow rates from 12 l/h to 8000 l/h.
  • the two liquids are mixed at room temperature with an R300 bead.
  • This mixer works almost optimally under these flow conditions: Sufficient mixing, low pressure drop, straight outlet, solid process control, low risk of blockage, comparatively easy cleaning, open in two halves for cleaning and drying. This is then filled without purification. The liquid is stored in the refrigerator overnight.
  • the cationic lipidoid was combined with cholesterol, DSPC and DMG-PEG2000 and each dissolved in 90% ethanol (10% 10 mM citrate buffer, pH 3) in the molar ratio of the cationic lipid, with the molar ratios of DSPC: cholesterol: DMG-PEG2000 were 50:10:38.5:1.5.
  • si-RNA polynucleotide (30 pM) was dissolved in 10 mM citrate buffer, pH 3.0, to prepare a polynucleotide solution.
  • the polynucleotide solution and the lipid solution were mixed in a first micromixer (total flow rate 10 ml/min).
  • the mixed product was mixed in a second micro-mixer (total flow rate 20 ml/min) mixed with PBS buffer.
  • the freshly prepared lipid nanoparticles were dialyzed against PBS buffer to remove ethanol, exchange buffer, and unbound siRNAs.
  • Device for conveying liquid e.g. magnetic gear pump

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Abstract

Es wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen bereitgestellt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Leiten einer ersten Flüssigkeit und einer zweiten Flüssigkeit in einen Mikromischer und bis zum Ausgang des Mikromischers durch Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional zusätzlich durch mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, erfolgt, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des Mikromischers mindestens 10 mL/min beträgt. Das Verfahren und die Vorrichtung ermöglichen es, auf einfache und reproduzierbare Art und Weise in industriellem Maßstab Flüssigkeiten bereitzustellen, die Liposomen mit einer engen Größenverteilung enthalten. Ferner wird eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen mit einer engen Größenverteilung bereitgestellt und Verwendungen hiervon vorgeschlagen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Lipo- somen und hergestellte Flüssigkeit
Es wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen bereitgestellt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeich- net, dass das Leiten einer ersten Flüssigkeit und einer zweiten Flüssigkeit in einen Mikromischer und bis zum Ausgang des Mikromischers durch Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional zusätzlich durch mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, erfolgt, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des Mikromischers mindestens 10 mL/min beträgt. Das Verfahren und die Vorrichtung ermögli- chen es, auf einfache und reproduzierbare Art und Weise in industriellem Maßstab Flüssigkeiten bereitzustellen, die Liposomen mit einer engen Grö- ßenverteilung enthalten. Ferner wird eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen mit einer engen Größenverteilung bereitgestellt und Verwendungen hiervon vorgeschlagen. Liposome sind weltweit die etabliertesten Nanotransportersysteme in der pharmazeutischen Anwendung. Doxil® als erste „Nanodrug" wurde bereits 1995 von der FDA zugelassen.
Derzeit ist die Herstellung von Nano-Liposomen im industriellen Maßstab ein mehrstufiges Batch-Verfahren. In einer ersten Stufe wird eine Hydratation der Lipide, meist große, multilamellare Liposomen (MLV), vorgenommen. In einer zweiten Stufe wird ein „downsizing" durchgeführt, um Nanoliposome mit ei- nem Durchmesser von <200 nm zu erhalten. Hierfür wird eine Extrusion bei Hochdruck durch eine Membran durchgeführt, die entsprechende Poren in Nanogröße aufweist (Beispiel: Herstellung von Doxil®). Alternativ wird eine Hochdruckhomogenisierung durchgeführt (Beispiele: Herstellung von Ambi- Some® und für in Kosmetika verwendete Nano-Liposomen).
Die Extrusion muss bei erhöhten Temperaturen durchgeführt werden, da die MLV-Lipiddoppelschichten flexibel genug sein müssen, um Formänderung zuzulassen, die erforderlich ist, um eine Größenreduzierung zu erreichen. Mehrfache Durchläufe durch die Extrusionsmembran sind notwendig, um die erforderliche enge Größenverteilung zu erreichen. Dieses Vorgehen ist zeit- aufwändig. Zudem ist dieses Vorgehen auf hitzebeständige Lipidrohstoffe und entsprechende eingelagerte oder eingekapselte Substanzen beschränkt. Dar- über hinaus geht das Extrusionsverfahren mit Materialverlust auf der Memb- ran einher. Ferner erfordert ein Verstopfen (Zusetzen) der Membranen einen häufigen Membranaustausch und Verlust an ggf. hochwertigen Substanzen, wie Lipiden und Wirkstoffen, was die Durchführung eines Herstellungsverfah- rens zur Bereitstellung einer sterilen Flüssigkeit mit Liposomen gefährdet und verteuert. Die üblicherweise verwendeten Polycarbonatmembranen zeigen zudem Chargenschwankungen durch unterschiedliche Eigenschaften wie Po- rengröße, Porengleichmäßigkeit und Oberflächenbenetzung, was zu einer mangelnden Prozess-Reproduzierbarkeit führt.
Die Hochdruckhomogenisierung dagegen führt oft zu breiten Größenvertei- lungen, einschließlich der Produktion großer Prozentsätze von sehr kleinen Liposomen. Darüber hinaus muss die Hochdruckhomogenisierung ebenfalls bei hohen Temperaturen durchgeführt werden. Es besteht ein Bedarf an einem Verfahren zur schnellen und einfachen, groß- technischen Produktion einer sterilen Flüssigkeit, die Liposomen im Nanome- ter-Größenbereich enthält. Ferner besteht ein Bedarf an Formulierungsme- thoden für thermolabile (empfindliche) Lipide und Medikamente. Zudem be- steht ein Bedarf an einer Plattformtechnologie für Medikamente der nächsten Generation, wie z.B. Immuntherapeutika auf Nukleinsäurebasis.
Die WO 2017/103268 Al offenbart ein kontinuierliches Verfahren zur Herstel- lung von Nanopartikeln. Das dort offenbarte Verfahren ist nicht für die groß- technische Herstellung steriler Flüssigkeiten enthaltend Liposomen geeignet.
Die EP 1337322 Bl offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln. Dieses Verfahren ist kein streng mikrofluidisches Verfahren und ist hinsichtlich der Verwendung anspruchsvoller API (z.B. ultrahydrophober Agenzien) bei der Herstellung der Liposomen eingeschränkt. Des Weiteren ist die erreichte Enge der Größenverteilung der hergestellten Liposomen noch verbesserungsfähig.
Die WO 2014/172045 Al offenbart ein Verfahren zur industriellen Herstellung von sterilen Liposomenlösungen in großem Maßstab. Problematisch ist jedoch die Reproduzierbarkeit, weil die Herstellung über eine Plattform erfolgt, bei der eine absolute Gleichverteilung der verschiedenen Kanäle der Plattform sichergestellt werden muss, was nicht einfach ist.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver- fahren und eine Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Lipo- somen bereitzustellen, welche die Nachteile aus dem Stand der Technik nicht aufweisen. Insbesondere sollte es mit dem Verfahren und der Vorrichtung möglich sein, auf einfache und reproduzierbare Art und Weise in industriellem Maßstab Flüssigkeiten bereitzustellen, die Liposomen mit einer engen Grö- ßenverteilung enthalten und die insbesondere steril sind.
Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen von An- spruch 1, die Vorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 13, die Flüssigkeit mit den Merkmalen von Anspruch 16 und den Verwendungen mit den Merk- malen der Ansprüche 20 und 21. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhaf- te Weiterbildungen auf. Erfindungsgemäß wird ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen bereitgestellt, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer ersten Flüssigkeit in einem ersten Behälter, wobei die erste Flüssigkeit mindestens ein Lipid enthält oder daraus besteht; b) Bereitstellen einer zweiten Flüssigkeit in einem zweiten Behälter, wobei die zweite Flüssigkeit Wasser enthält oder daraus besteht; c) Leiten der ersten Flüssigkeit entlang einer ersten Fluidleitung in einen ersten Eingang eines Mikromischers und in einem Strom bis zu einem Ausgang des Mikromischers; d) Leiten der zweiten Flüssigkeit entlang einer zweiten Fluidleitung in einen zweiten Eingang des Mikromischers und in einem Strom neben der ersten Flüssigkeit bis zu dem Ausgang des Mikromischers; wobei sich die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit innerhalb des Mik- romischers mischen, sodass am Ausgang des Mikromischers eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen austritt; dadurch gekennzeichnet, dass das Leiten der ersten Flüssigkeit und der zwei- ten Flüssigkeit in den Mikromischer und bis zum Ausgang des Mikromischers durch Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional zusätzlich durch mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung (z.B. eine mag- netisch angetriebene Pumpe, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus Zahnradpumpe, Zahnringpumpe oder Kreiselpumpe), erfolgt, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des Mikromischers mindestens 10 mL/min beträgt.
Unter dem Begriff „Liposomen" werden erfindungsgemäß Liposomen, Lipop- lexe und Lipidnanopartikel verstanden, die optional mit einem Stoff (z.B. ei- nem Wirkstoff) beladen sein können, wobei unter „beladen" verstanden wird, dass ein Hohlraum im Inneren der Lipidpartikel und/oder eine Membran der Lipidpartikel (bevorzugt beide) einen Stoff (z.B. einen Wirkstoff) enthält bzw. enthalten. Die Liposomen (d.h. die Liposomen, Lipoplexe und/oder Lipidnano- partikel) haben insbesondere einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis < 200 nm oder im Bereich von > 200 nm bis < 500 nm, bevorzugt im Bereich von 40 nm bis 150 nm oder im Bereich 250 nm bis 400 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 60 nm bis 120 nm oder im Bereich von 300 nm bis 350 nm. Der Durchmesser kann durch dynamische Lichtstreuung und/oder cryogener Transmissionselektronenmikroskopie, bevorzugt über eine Messung mit cryo- gener Transmissionselektronenmikroskopie, bestimmt werden oder bestimmt sein.
Unter dem Begriff „Mikromischer" werden bevorzugt alle Mischer verstanden, deren Mischprinzip auf dem Mischprinzip eines Mikromischers basiert, auch solche, die so groß sind (skaliert sind), dass deren Fluidkanäle größere Abmes- sungen (d.h. Querschnitte) als im Mikrometerbereich (Bereich von 1 pm bis 1000 pm) aufweisen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, auf einfache und re- produzierbare Art und Weise in industriellem Maßstab Flüssigkeiten bereitzu- stellen, die Liposomen mit einer engen Größenverteilung enthalten. Das Ver- fahren ist auch dazu geeignet, sicherzustellen, dass sterile Flüssigkeiten ent- haltend Liposomen bereitgestellt werden können, da die Flüssigkeitsförde- rung durch Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas (optional zusätzlich durch mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung) erfolgt. Die op- tionale Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung ist stromabwärts der mindes- tens einen Quelle von Gas angeordnet und es kann sichergestellt werden, dass ihre mit der Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberflächen steril sind. Indem die in dem Verfahren verwendeten Komponenten (z.B. die Fluidleitun- gen und der Mikromischer) nach außen abgedichtet sind, kann zudem sicher- gestellt werden, dass die Flüssigkeiten nicht mit Mikroorganismen und/oder Viren in Kontakt kommen.
Die Mischung der Flüssigkeiten in einem Mikromischer ermöglicht hierbei eine hohe Kontrolle bei der Strukturbildung der Liposomen, d.h. es ist eine hervor- ragende Größenkontrolle möglich und es können sehr enge Größenverteilun- gen erzielt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren hochskaliert werden kann, ohne neu angepasst werden zu müssen, d.h. ohne dass bei- spielsweise eine Gleichverteilung der Ströme beim für Mikromischer oft not- wendigen „numbering-up" der einzelnen Mikromischer sichergestellt werden muss („externes numbering-up") und/oder ohne dass der Mischertyp geän- dert werden muss. Beim Hochskalieren des Verfahrens kann beispielsweise ein größerer Mischer des gleichen Typs („skalierbarer Mikromischer") ver- wendet werden (bspw. ein Caterpillar 600 anstelle eines Caterpillar 300, Star- Lam 300 anstelle eines StarLam 30), d.h. der Aufwand in der Änderung der Verfahrensführung bzw. Anlagengestaltung ist somit deutlich geringer oder entfällt gänzlich. Beim StarLam-Mikromischer wird dieses Vergrößern auch als „internes numbering-up" bezeichnet. Dies stellt vor allem für GMP-Verfahren einen entscheidenden Vorteil dar. Skalierbare Mikromischer, die erfindungs- gemäß als Mischer bzw. Mikromischer verwendet werden können, sind insbe- sondere dadurch charakterisiert, dass sie im Falle einer Skalierung keine zu- sätzlichen Verteilerleitungen und Sammelleitungen benötigen. Skalierbare Mikromischer sind bspw. die ramp-up/ramp-down Split and Recombine- Mischer, hier insbesondere die genannten caterpillar-artigen Mikromischer (z.B. wie in Hermann et al., Chemical Engineering Journal, Bd. 334, S. 1996- 2003 offenbart), StarLam -artige Mikromischer (z.B. wie in DE 199 27 556 C2 offenbart) und/oder Zyklonmischer (z.B. wie in EP 1 390 131 Bl offenbart).
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass alle Oberflächen, mit denen die erste und zweite Flüssigkeit auf dem Weg zum Ausgang des Mikro- mischers in Berührung kommen, steril sind. Ferner ist es bevorzugt, dass alle diese Oberflächen nach außen fluiddicht abgeschlossen sind, bevorzugt ein geschlossenes System bilden. Vorteil hierbei ist, dass bei dem Mikromischer und den Fluidfördereinrichtungen (z.B. der Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional die zusätzliche Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung) die Bedingungen sehr exakt einstellbar sind, was sich vorteilhaft auf die Erzie- lung gewünschter PDI-Werte und weitere Qualitätskriterien auswirkt. Zudem kann sichergestellt werden, dass die verwendeten Flüssigkeiten nicht mit Mik- roorganismen und/oder Viren in Kontakt kommen. Abgesehen davon ist es bevorzugt, dass alle diese Oberflächen keine Bereiche aufweisen, an denen sich Rückstände sammeln können. Zudem ist es bevorzugt, dass alle diese Oberflächen kein Glas enthalten oder daraus bestehen. Jedes dieser Merkma- le trägt dazu bei, sicherzustellen, dass mit dem Verfahren eine kontinuierliche Herstellung einer sterilen Flüssigkeit enthaltend Liposomen möglich ist, d.h. keine Kontamination der Flüssigkeit bei deren Herstellung stattfinden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle in dem Verfahren eingesetzten Fluide (z.B. die erste und zweite sterile Flüssigkeit und das Gas aus der Gas- quelle) steril. Entsprechendes kann für alle in dem Verfahren eingesetzten Bauteile (z.B. Mikromischer, Fördervorrichtungen und Behälter) gelten, zu- mindest für deren Oberflächen, die mit den im Verfahren eingesetzten Fluiden in Kontakt kommen.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, die mindestens eine Quelle von Gas einen Gasbehälter enthält oder daraus besteht.
Die mindestens eine Quelle von Gas kann eine erste fluidische Verbindung zum ersten Behälter und eine zweite fluidische Verbindung zum zweiten Be- hälter aufweisen.
Zudem kann die mindestens eine Quelle von Gas ein Gas enthalten, das kei- nen Sauerstoff enthält, wobei das Gas bevorzugt ein Gas ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Edelgas und Mischungen hiervon enthält oder daraus besteht.
Der Gasdruck der Quelle von Gas stellt, optional zusammen mit einer Vorrich- tung zur Flüssigkeitsförderung, einen Förderdruck bereit. Die Gesamtflussrate kann hierbei über einen konstanten Gasdruck der Quelle von Gas, optional zudem über die Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, eingestellt werden. Der Gasdruck alleine liegt dabei bevorzugt im Bereich von < 12 bar, weiter bevor- zugt < 8 bar, besonders bevorzugt < 6 bar, ganz besonders bevorzugt bei grö- ßer 1 bis 6 bar, insbesondere 1,5 bis 5 bar. Mit der optionalen Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung werden Förderdrücke von bis zu 50 bar erreicht. Die Gesamtflussrate kann dann über mindestens einen, bevorzugt mindestens einen ersten und mindestens einen zweiten Flussregler konstant gehalten werden, wobei besonders bevorzugt der mindestens eine erste Flussregler an der ersten fluidischen Verbindung angeordnet ist und der mindestens eine zweite Flussregler an der zweiten fluidischen Verbindung angeordnet ist. Kurz gesagt dient der mindestens eine Flussregler dazu, den ursprünglichen För- derdruck in eine konstante Flussrate umzuwandeln. In Strömungsrichtung sind hierbei zuerst die Gasquelle (dann optional die Vorrichtung zu Flüssig- keitsförderung) und dann der mindestens eine Flussregler angeordnet.
Der Druckverlust im Mischraum des Mischers ist vorzugsweise gering, bevor- zugt im Bereich von < 6 bar, insbesondere im Bereich von 1,5 bis 5 bar. Darüber hinaus kann die Gesamtflussrate so eingestellt werden, dass sie am Ausgang des Mikromischers ≥ 80 mL/min, bevorzugt ≥ 320 mL/min, besonders bevorzugt ≥ 1280 mL/min, ganz besonders bevorzugt ≥ 2800 mL/min, insbe- sondere ≥ 5120 mL/min, beträgt.
Abgesehen davon kann die Gesamtflussrate so eingestellt werden, dass sie die am Ausgang des Mikromischers pro Querschnittsfläche des Ausgangs des Mik- romischers ≥ 20 ml/(min-mm2), bevorzugt ≥ 100 ml/(min-mm2), besonders bevorzugt ≥ 200 ml/(min-mm2), ganz besonders bevorzugt ≥ 400 ml/(min-mm2), optional ≥ 1000 ml/(min-mm2), insbesondere von 100 bis 400 ml/(min-mm2), beträgt.
Ferner kann die Gesamtflussrate so eingestellt werden, dass das Verhältnis der Flussrate der zweiten Flüssigkeit zur Flussrate der ersten Flüssigkeit < 100:1, bevorzugt < 20:1, besonders bevorzugt <16:1, ganz besonders bevor- zugt < 8:1, noch weiter bevorzugt < 7:1, stark bevorzugt < 6:1, sehr stark be- vorzugt < 5:1, insbesondere < 4:1, beträgt.
Die Gesamtflussrate kann eine Flussratenschwankung von weniger als 1% der Gesamtflussrate, bevorzugt weniger als 0,1% der Gesamtflussrate, aufweisen. Vorteil hierbei ist, dass sehr niedrige PDI-Werte erreicht werden.
Ferner kann die Gesamtflussrate derart eingestellt werden, dass die Strömung eine Reynolds-Zahl im Bereich von >80 bis <1200, vorzugsweise >120 bis <1000, aufweist.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der Mikromischer eine oder mehrere sich schräg oder quer zur Strömungsrichtung erstreckende Mischstrukturen aufweist, die bevorzugt dazu geeignet sind, die erste Flüssig- keit und/oder zweite Flüssigkeit in eine Richtung schräg oder quer zur Strö- mungsrichtung abzulenken.
Ferner kann der Mikromischer, besonders bevorzugt alle in dem Verfahren eingesetzten Komponenten, Edelstahl enthalten oder daraus bestehen. Vor- teil hierbei ist, dass der Mikromischer bzw. alle in dem Verfahren eingesetzten Komponenten, einfach über Temperatureinwirkung sterilisierbar ist/sind und eine Reinigungsvalidierung etabliert werden kann. Folglich muss der Mikromi- scher kein Einmalprodukt sein, dessen reproduzierbare Mischleistung stetig kontrolliert und validiert werden muss. Entsprechendes gilt auch für die ande- ren in dem Verfahren eingesetzten Komponenten, d.h. für die gesamte Vor- richtung zur Durchführung des Verfahrens, falls diese Edelstahl enthält oder daraus besteht.
Zudem kann der Mikromischer autoklavierbar sein.
Abgesehen davon kann der Mikromischer in mindestens zwei Teile zur Reini- gung von Fluidkanälen des Mikromischers zerlegbar sein.
Bei dem Mikromischer kann es sich um einen „split-recombine" Mikromischer handeln, wobei der Mikromischer bevorzugt ein „ramp-up/ramp-down" Mik- romischer, besonders bevorzugt ein „caterpillar"-artiger Mikromischer (siehe z.B. Hermann et al., Chemical Engineering Journal, Bd. 334, S. 1996-2003) ist. Es wurde gefunden, dass „caterpillar"-artige Mikromischer mehrere Vorteile haben. Erstens weisen sie einen durchgehenden Kanal auf. Dies steht im Ge- gensatz zu vielen anderen „split-recombine" Mikromischern, in denen sich der Hauptkanal in bspw. abschnittsweise, fluidisch getrennte Kanäle aufsplittet, die sich dann anschließend wieder vereinen. Zudem ist die Herstellung und Reinigung bei „caterpillar"-artigen Mikromischern einfacher. Zudem sind die in diesen Mikromischern auftretenden Scherkräfte geringer, da es nur recht sachte, aber sich wiederholende Richtungsänderungen entlang der schrägen Flächen in Strömungsrichtung gibt. Vorzugsweise sind die schrägen Flächen gegenüber der Hauptströmungsrichtung (d.h. ggü. einer Strömungsrichtung parallel zu den Wänden der Fluidkanäle des Mikromischers) um weniger als 70°, besonders bevorzugt weniger als 55° und ganz besonders bevorzugt um weniger als 45° geneigt. Folglich erfolgt die Herstellung der Flüssigkeit enthal- tend die Liposomen schonender, d.h. es erfolgt eine geringere Degradation der Edukte und der Produkte. Darüber hinaus ist dieser Mikromischer sehr leicht skalierbar, beispielsweise durch eine Vergrößerung der Querschnittsflä- che des Mischkanals senkrecht zur Hauptströmungsrichtung unter Beibehal- tung der für die caterpillar-artigen Mikromischer typischen, sich wiederholen- den Grundstruktur. Mit zunehmender Vergrößerung kann die Mischleistung ggf. durch eine Erhöhung der Anzahl der sich wiederholenden Grundstruktu- ren angepasst werden.
Beim Mikromischer kann es sich auch um einen "split in micro-lamellae and combine in multilaminated stream"-Mikromischer, besonders bevorzugt ei- nen „StarLam"-Mikromischer (siehe z.B. DE 199 27 556 C2 und Werner, B. et al., Chemical Engineering Technology, 2005, Bd. 28, S. 401ff) handeln. Dieser hat den Vorteil, dass er auch aus Edelstahl gefertigt werden kann, leicht mon- tierbar und demontierbar ist und ebenfalls eine einfache Skalierbarkeit zeigt.
Vorzugsweise hat der Mikromischer, insbesondere der „caterpillar"- Mikromischer, im Anschluss an den Mischraum einen sich im Wesentlichen nicht verengenden und/oder einen im Wesentlichen geraden Ausgang. Vorteil hierbei ist, dass es nicht zu einer abrupten Richtungsänderung und/oder Querschnittsverengung des Fluidstroms kommt, keine Toträume vorliegen und nur ein geringerer Druckverlust und geringe Scherkräfte wirken.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die erste Flüssigkeit Lipide in einer Gesamtkonzentration von > 30 g/L, bevorzugt > 50 g/L, beson- ders bevorzugt > 80 g/L, ganz besonders bevorzugt > 150 g/L, insbesondere 160 g/L bis 400 g/L (optional 210 g/L bis 290 g/L), enthält.
Ferner kann die erste Flüssigkeit mindestens ein Phospholipid, bevorzugt min- destens ein zwitterionisches oder anionisches Phospholipid, enthalten, wobei das Phospholipid vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylcholin, DSPC, DOPE, DOPC, DSPE, HSPC und Mischungen hiervon, wobei die Konzentration des mindestens einen Phospholipids, oder Mischun- gen hiervon, bevorzugt > 20 g/L, bevorzugt > 40 g/L, besonders bevorzugt > 80 g/L, ganz besonders bevorzugt > 160 g/L, insbesondere 210 g/L bis 400 g/L, beträgt. Ferner kann die erste Flüssigkeit Phospholipide mit gesättigten Fett- säureresten und/oder ungesättigten Fettsäureresten, wie DSPC (gesättigt) und DOPC (ungesättigt), oder Mischungen davon enthalten.
Zudem kann die erste Flüssigkeit mindestens ein PEG-yliertes Lipid, bevorzugt DSPE-PEG2000 und/oder DMG-PEG2000, enthalten, wobei die Konzentration des PEG-ylierten Lipids bevorzugt im Bereich von 15 bis 40 Mol.-%, besonders bevorzugt im Bereich von 31 bis 35 Mol.-%, in Bezug auf den molaren Anteil von mindestens einem Phospholipid in der ersten Flüssigkeit liegt.
Darüber hinaus kann die erste Flüssigkeit mindestens ein Lipid, bevorzugt mindestens ein kationisches Lipid (z.B. ein pH-abhängig kationisch geladenes Lipid) enthalten. Insbesondere Stoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DOTMA (l,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propan), DOTAP (l,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)propan), DDAB Dimethyldioctade- cylammonium (Bromidsalz), DODMA (l,2-dioleyloxy-3- dimethylaminopropane) (kationisch geladen bei niedrigem pH) und Mischun- gen hiervon, wobei die Konzentration des mindestens einen Lipids, oder Mi- schungen hiervon, bevorzugt > 10 g/L, bevorzugt > 20 g/L, besonders bevor- zugt > 40 g/L, ganz besonders bevorzugt > 80 g/L, insbesondere 90 g/L bis 350 g/L, beträgt.
Darüber hinaus kann die erste Flüssigkeit mindestens eine Lipidoid enthalten, wobei die Konzentration des Lipoids bevorzugt im Bereich von 200 bis 1000 Mol.-%, besonders bevorzugt im Bereich von 300 bis 800 Mol.-%, in Bezug auf den molaren Anteil von mindestens einem Lipid in der ersten Flüssigkeit liegt. Unter dem Begriff „Lipidoid" werden erfindungsgemäß lipidähnliche Stoffe verstanden, welche aus der Reaktion von Acrylamiden oder Acrylsäureestern mit sekundären oder primären Aminen hervorgehen (d.h. hergestellt werden). Die pH-abhängige kationische Ladung wird bevorzugt mittels primärer, sekun- därer oder tertiärer Aminogruppe erreicht. Insbesondere ist mindestens ein Lipidoid gemeint, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Lipidoiden, die in der Veröffentlichung von Acinc, A. et al., Nature Biotechnology (2008), Bd. 26, Nr. 5, S. 561-569 genannt sind.
Zudem kann die erste Flüssigkeit Cholesterin enthalten.
Die erste Flüssigkeit kann sich dadurch auszeichnen, dass sie kein nicht- ionisches, kationisches, anionisches und/oder amphoteres Tensid enthält, bevorzugt (gar) kein Tensid enthält.
Ferner kann die erste Flüssigkeit mindestens ein organisches Lösungsmittel oder kein organisches Lösungsmittel enthalten. Enthält sie ein organisches Lösungsmittel, ist das organische Lösungsmittel bevorzugt ein organisches, mit Wasser-mischbares Lösungsmittel, besonders bevorzugt ein Lösungsmit- tel, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, besonders bevorzugt Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, und/oder Methanol, Aceton, Tet- rahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, insbesondere Ethanol.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform ist die erste Flüssigkeit entgast. Dies verhindert eine Bläschenbildung während der Assemblierung der Liposomen.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die zweite Flüssigkeit eine Puffersubstanz, bevorzugt eine Puffersubstanz ausgewählt aus der Grup- pe bestehend aus Acetat, Ammonium, Citrat und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt Calciumacetat und/oder Ammoniumsulfat, enthält. Die Konzentration der Puffersubstanz beträgt bevorzugt im Bereich von 5 mM bis 300 mM, besonders bevorzugt im Bereich von 8 mM bis 250 mM, liegt. Vorteil an diesen Konzentrationen ist, dass die Ausbildung eines Gradienten verbes- sert ist.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform ist die zweite Flüssigkeit entgast. Dies verhindert eine Bläschenbildung während der Assemblierung der Lipo- somen.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass eine Beladung der Liposomen der Flüssigkeit mit mindestens einer Wirksubstanz durchgeführt wird, wobei die Beladung bevorzugt im ersten Mikromischer erfolgt, in einem weiteren Mischer stromabwärts des ersten Mikromischers erfolgt, nach einer Assemblierung der Liposomen erfolgt und/oder nach einer Aufreinigung der Liposomen erfolgt.
Hierbei kann die Wirksubstanz mindestens eine organische Wirksubstanz, be- vorzugt ein Wirkstoff zur Behandlung einer Krankheit, besonders bevorzugt ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vitamin, Protein, Pep- tid, Lipid, DNA, RNA, organisches Molekül mit einer Masse < 500 Da und Mi- schungen hiervon, insbesondere eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ultrahydrophobe Substanz, siRNA und Kombinationen hiervon, enthalten oder daraus bestehen. Hierbei ist die Verkapselung anspruchsvoller Wirksubstanzen (z.B. ultrahydrophober Substanzen und/oder siRNA) möglich, die in anderen Verfahren nicht verkapselt werden könnten. Ferner kann die Wirksubstanz mindestens eine anorganische Wirksubstanz, bevorzugt eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus magnetischer Substanz, paramagnetischer Substanz und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt Eisenoxid, Manganoxid und Mischungen hiervon, enthalten oder daraus be- stehen.
Die mindestens eine Wirksubstanz ist bevorzugt in der ersten Flüssigkeit, in der zweiten Flüssigkeit und/oder in einer weiteren Flüssigkeit (stromabwärts des Mikromischers) enthalten. Die Konzentration der mindestens einen orga- nischen Wirksubstanz und/oder mindestens einen anorganischen Wirksub- stanz kann ≥ 1 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 80 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 30 Gew.-%, in Bezug auf das Gesamtge- wicht der Lipide (bzw. der Komponenten der Liposomen ausgenommen Was- ser), betragen.
In dem Schritt a), b) und/oder c), bevorzugt in den Schritten a) bis c), des Ver- fahrens, kann auf eine Temperatur von > 10 °C bis < 70°C, bevorzugt 15 bis 40 °C, besonders bevorzugt 22 bis 30 °C, insbesondere 23 °C bis 25 °C, temperiert werden. Gegebenenfalls kann auf eine Temperatur im Bereich von > 0°C bis <10 °C temperiert werden. Diese Verfahrensvariante hat den Vorteil, dass Stoffe (z.B. Wirkstoffe), die temperaturempfindlich sind, in dem Verfahren eingesetzt werden können, d.h. Liposomen bereitgestellt werden können, welche diese temperaturempfindlichen Substanzen aufweisen.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Liposomen der Flüssigkeit, die am Ausgang des Mikromischers austreten, unilamellare Lipo- somen, multilamellare Liposomen oder Mischungen hiervon sind.
Das Verfahren kann so ausgestaltet sein, dass die Liposomen der Flüssigkeit, die am Ausgang des Mikromischers austreten, einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis < 200 nm oder im Bereich von > 200 nm bis < 500 nm, bevor- zugt im Bereich von 40 nm bis 150 nm oder im Bereich 250 nm bis 400 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 60 nm bis 120 nm oder im Bereich von 300 nm bis 350 nm, aufweisen. Der Durchmesser kann durch dynamische Lichtstreuung und/oder cryogener Transmissionselektronenmikroskopie, be- vorzugt über eine Messung mit cryogener Transmissionselektronenmikrosko- pie, bestimmbar sein.
Ferner kann das Verfahren so ausgestaltet sein, dass die Liposomen der Flüs- sigkeit, die am Ausgang des Mikromischers austreten, zu mehr als 50%, mehr als 70%, oder mehr als 90%, in Bezug auf die Gesamtzahl aller Lipsomen der Flüssigkeit, unilamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von < 0,200, bevorzugt von < 0,150, besonders bevorzugt im Bereich von < 0,100, ganz besonders bevor- zugt im Bereich von < 0,090, insbesondere im Bereich von < 0,075, aufweisen.
Alternativ kann das Verfahren so ausgestaltet sein, dass die Liposomen der Flüssigkeit, die am Ausgang des Mikromischers austreten, zu mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, in Bezug auf die Gesamtzahl aller Liposomen der Flüssigkeit, multilamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von <0,500, bevorzugt im Bereich von < 0,300 aufweisen.
Der PDI ist bevorzugt mittels dynamischer Lichtstreuung nach der Norm DIN ISO 22412:2018-09 bestimmbar oder wird so bestimmt.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Flüssigkeit in ei- nem weiteren Schritt nach Schritt c) aufgereinigt wird, wobei die Aufreinigung ein an den Schritt c) anschließendes, vorzugsweise kontinuierliches Durchfüh- ren einer Ultrafiltration, Gelfiltration und/oder Evaporation, besonders bevor- zugt ein Durchführen einer Ultrafiltration, umfasst, um die Liposomen anzu- reichern. Ferner kann die Aufreinigung ein Entfernen von Substanzen, die ne- ben den Liposomen vorhanden sind, bevorzugt Entfernen von Puffersubstan- zen und/oder organischen Lösungsmitteln, umfassen. Darüber hinaus kann die Aufreinigung einen Austausch von Substanzen, die neben den Liposomen vorhanden sind, gegen eine sterile, osmolare Zuckerlösung, bevorzugt gegen eine sterile, osmolare Glukoselösung oder Sucroselösung, umfassen. Die steri- le, osmolare Zuckerlösung weist besonders bevorzugt 4 bis 15 Gew.-% Zucker auf, insbesondere 4 bis 6 Gew.-% Glukose bei einer Glukoselösung und/oder 9 bis 11 Gew.-% Sucrose bei einer Sucroselösung. Die Aufreinigung kann eine Sterilisierung der Lösung enthaltend Liposomen umfassen, bevorzugt umfas- send eine Sterilfiltration durch eine Membran mit einem Porendurchmesser (Cut-off) von 0,2 μm.
Das Verfahren kann ferner die folgenden Schritte umfassen i) Leiten der Flüssigkeit enthaltend Liposomen am Ausgang des Mikromi- schers entlang einer dritten Fluidleitung, optional einer Verweilschleife, in einen ersten Eingang eines weiteren Mischers und in einem Strom bis zu einem Ausgang des weiteren Mischers; und ii) Leiten einer weiteren Flüssigkeit entlang einer vierten Fluidleitung in ei- nen zweiten Eingang des weiteren Mischers und in einem Strom neben der Flüssigkeit enthaltend Liposomen bis zu dem Ausgang des weiteren Mischers.
Hierbei mischt sich die Flüssigkeit enthaltend Liposomen mit der weiteren Flüssigkeit innerhalb des weiteren Mischers, sodass am Ausgang des weiteren Mischers eine veränderte Flüssigkeit enthaltend Liposomen austritt. Vorzugs- weise wird in diesem weiteren Mischer der Anteil des Lösungsmittels ernied- rigt und eine weitere Verdünnung vorgenommen, vorzugsweise eine Verdün- nung auf weniger als die Hälfte, bevorzugt weniger als ein Viertel, der ur- sprünglichen Konzentration der Liposomen in der Flüssigkeit. Hierdurch wer- den die enthaltenen Liposomen formstabiler. Alternativ können auch andere Parameter, wie bspw. der pH-Wert, durch die Zumischung angepasst werden, wobei vorzugsweise eine Absenkung des pH-Wertes oder eine Neutralisierung durchgeführt wird. Weiterhin können die Liposomen auch in diesem Schritt mit mindestens einer Wirksubstanz beladen werden. Das Leiten der Flüssig- keit enthaltend Liposomen und der weiteren Flüssigkeit in den weiteren Mi- scher kann durch Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional zudem durch mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, erfolgen, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des weiteren Mischers mehr als 10 mL/min, bevorzugt mindestens 20 mL/min, beträgt. Vorzugsweise ist der weitere Mischer ein Mikromischer, bevorzugt ein statischer Mikromischer, besonders bevorzugt ein „split- recombine" Mikromischer, ganz besonders bevorzugt ein „caterpillar"-artiger Mikromischer. Alternativ kann auch ein so genannter „StarLam" Mikromischer zum Einsatz kommen. Beide Mischer sind durch passende Auswahl oder Ska- lierung leicht anpassbar in Bezug auf die geforderte Durchflussrate.
Grundsätzlich können die Liposomen der Flüssigkeit im ersten Mikromischer, in dem weiteren Mischer, nach einer Assemblierung der Liposomen und/oder nach einer Aufreinigung der Liposomen, mit mindestens einer Wirksubstanz beladen werden.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit ent- haltend Liposomen bereitgestellt, enthaltend a) einen ersten Behälter, der eine erste Flüssigkeit enthält, wobei die erste Flüssigkeit mindestens ein Lipid enthält oder daraus besteht; b) einen zweiten Behälter, der eine zweite Flüssigkeit enthält, wobei die zweite Flüssigkeit Wasser enthält oder daraus besteht; c) einen Mikromischer, der einen ersten Eingang, einen zweiten Eingang und einen Ausgang aufweist, wobei der erste Behälter über eine erste Fluidlei- tung mit dem ersten Eingang des Mikromischers verbunden ist und der zweite Behälter über eine zweite Fluidleitung mit dem zweiten Eingang des Mikromischers verbunden ist, wobei der Mikromischer konfiguriert ist, die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit jeweils in einem Strom innerhalb des Mikromischers bis zum Ausgang des Mikromischers fließen zu lassen und innerhalb des Mikromischers zu mischen, wobei am Aus- gang des Mikromischers eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen austritt; d) mindestens eine Quelle von Gas, optional zudem mindestens eine Vor- richtung zur Flüssigkeitsförderung; und e) eine Steuereinheit; dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Quelle von Gas konfigu- riert ist, die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit in den Mikromischer durch Gasdruck aus der mindestens einen Quelle von Gas, optional zudem durch die mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, zu beför- dern, wobei die Steuereinheit konfiguriert ist, die Gesamtflussrate der Flüssig- keiten so einzustellen, dass sie am Ausgang des Mikromischers mindestens 10 mL/min beträgt.
Die Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass alle Oberflächen der Vorrichtung, mit denen die erste und zweite Flüssigkeit auf dem Weg zum Ausgang des Mikromischers in Berührung kommen können, steril sind. Ferner können alle diese Oberflächen der Vorrichtung nach außen fluiddicht abge- schlossen sein, bevorzugt ein geschlossenes System bilden. Vorteil hierbei ist, dass bei dem Mikromischer und den Fluidfördereinrichtungen (z.B. der Gas- druck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional die zusätzliche Vorrich- tung zur Flüssigkeitsförderung) die Bedingungen sehr exakt einstellbar sind, was sich vorteilhaft auf die Erzielung gewünschter PDI-Werte und weitere Qualitätskriterien auswirkt. Zudem kann sichergestellt werden, dass die ver- wendeten Flüssigkeiten nicht mit Mikroorganismen und/oder Viren in Kontakt kommen. Abgesehen davon kann für alle diese Oberflächen gelten, dass sie keine Bereiche aufweisen, an denen sich Rückstände sammeln können. Dar- über hinaus ist es bevorzugt, dass alle diese Oberflächen kein Glas enthalten oder daraus bestehen. Jedes dieser Merkmale trägt dazu bei, sicherzustellen, dass mit der Vorrichtung eine kontinuierliche Herstellung einer sterilen Flüs- sigkeit enthaltend Liposomen möglich ist, d.h. keine Kontamination der Flüs- sigkeit bei deren Herstellung stattfinden kann. In einer bevorzugten Ausfüh- rungsform sind alle in der Vorrichtung vorhandenen Fluide (z.B. die erste und zweite sterile Flüssigkeit und das Gas aus der Gasquelle) steril. Entsprechen- des kann für alle Bestandteile der Vorrichtung (z.B. Mikromischer, Fördervor- richtungen und Behälter) gelten, zumindest für deren Oberflächen, die mit den in der Vorrichtung enthaltenen Fluiden in Kontakt kommen.
Die Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Vorrichtung und/oder die Steuereinheit der Vorrichtung konfiguriert ist/sind, das erfin- dungsgemäße Verfahren durchzuführen. Hierbei kann die Vorrichtung Merk- male aufweisen, die oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt sind und/oder die Steuereinheit der Vorrichtung kann kon- figuriert sein, Schritte durchzuführen, die oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt sind.
Erfindungsgemäß wird eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass i) mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, aller Liposomen der Flüs- sigkeit unilamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ih- re Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von < 0,200, bevorzugt im Bereich von < 0,150, besonders bevorzugt im Bereich von < 0,100, ganz besonders bevorzugt im Bereich von < 0,090, insbesondere im Bereich von < 0,075, aufweisen; oder ii) mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, aller Liposomen der Flüs- sigkeit mulitlamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von <0,500, bevorzugt im Bereich von < 0,300 aufweisen; wobei der PDI bevorzugt mittels dynamischer Lichtstreuung nach der Norm DIN ISO 22412:2018-09 bestimmt ist.
Je kleiner der PDI der Liposomen in der Flüssigkeit, desto höher ist die Einheit- lichkeit der Liposomen in Bezug auf deren Größe und deren weitere Eigen- schaften. Bei einer Applikation der Liposomen (in einen lebenden Körper) be- wirkt eine einheitlichere Größe der Liposomen beispielsweise, dass deren Biodistribution vorhersehbarer und genauer steuerbarer wird. Zudem kann bei einer Flüssigkeit, die Liposomen mit kleinem PDI enthält, besser sicherge- stellt werden kann, dass die Flüssigkeit keinen gefährlichen Anteil an zu gro- ßen Liposomen enthält, die als Risikofaktor gelten, eine Ausbildung von Embo- lien zu begünstigen. Ein kleinerer PDI kann somit auch einen höheren Sicher- heitsaspekt bieten. Darüber hinaus ist auch die Stabilität der Liposomen ein- heitlicher, je kleiner deren PDI ist, was genauere Aussagen zur Lagerungsfä- higkeit, Transportstabilität und Handhabung der Liposomen erlaubt. Ferner bewirkt ein kleinerer PDI der Liposomen, dass im Falle eines Beladens der Lip- osomen mit Wirkstoff der Wirkstoffgehalt pro Liposom einheitlicher ist, was eine genauere Wirkstoffdosierung ermöglicht.
Die Flüssigkeit kann durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbar sein. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die bereitgestellte Flüssigkeit enthaltend Liposomen steril.
Es wird die Flüssigkeit zur Verwendung in der Medizin, bevorzugt zur Verwen- dung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, vorgeschlagen, besonders bevorzugt i) zur Applikation von einem Wirkstoff, besonders bevorzugt zur topischen Applikation von einem Wirkstoff; und/oder ii) zum Targeting von einem Wirkstoff; und/oder iii) zur Freisetzung von einem Wirkstoff; in einem Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei der Wirkstoff bevorzugt ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Impfstoff, Zytostatikum, Corticoid und Kombinationen hiervon, (Doxorubin und/oder Dexamethason) und es sich bei der Behandlung insbesondere um die Behandlung von Krebs, einer inflamma- torischen Erkrankung, einer Erkrankung des Immunsystems und/oder eine neurodegenerative Erkrankung handelt. Bei dem Wirkstoff kann es sich optio- nal um mindestens eine der oben (im Zusammenhang mit dem erfindungsge- mäßen Verfahren) genannten organischen Wirksubstanzen handeln.
Ferner wird die Flüssigkeit zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, bevorzugt in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tieri- schen Körper vorgenommen wird, insbesondere an einem Diagnostizierver- fahren, in dem die Liposomen einen Biomarker enthalten, vorgeschlagen.
Zudem wird die Verwendung der Flüssigkeit in der Kosmetik und/oder als Zu- satz in einem Nahrungsmittel vorgeschlagen.
Darüber hinaus wird die Verwendung der Flüssigkeit i) zur Verkapselung mindestens einer Substanz , optional in einem ersten Mikromischer, in einem weiteren Mischer, nach einer Assemblierung der Liposomen und/oder nach einer Aufreinigung der Liposomen; und/oder ii) zum Targeting mindestens einer Substanz; und/oder iii) zur Freisetzung mindestens einer Substanz; und/oder iv) Herstellung eines Kompositmaterials; vorgeschlagen, wobei die mindestens eine Substanz bevorzugt mindestens eine organische Wirksubstanz und/oder mindestens eine anorganische Wirksubstanz enthält oder daraus besteht, und es sich bei der Verwendung optional um eine in-vitro-Verwendung handelt. Bei der mindestens einen or- ganischen Wirksubstanz und/oder der mindestens einen anorganischen Wirksubstanz kann es sich um eine der oben (im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren) genannten Wirksubstanzen handeln.
Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten, spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen. Figur 1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die einen einzelnen Mikro- mischer 3 aufweist. Die erste Flüssigkeit, die sich in einem ersten Behälter 1 befindet und die zweite Flüssigkeit, die sich in einem zweiten Behälter 2 be- findet, werden durch Gasdruck, der aus zwei Quellen 9, 9' von Gas stammt, über eine erste Fluidleitung 7 in den ersten Eingang 4 bzw. über eine zweite Fluidleitung 8 in einen zweiten Eingang 5 des Mikromischers 3 eingeleitet und bis zum Ausgang 6 des Mikromischers transportiert. In der ersten Fluidleitung 7 und in der zweiten Fluidleitung 8 sorgt jeweils ein Flussregler 11, 11' dafür, dass der Flüssigkeitsstrom in diesen Fluidleitungen 7, 8 auf einem gewünsch- ten Wert gehalten wird. Der Ausgang 6 des ersten Mikromischers ist fluidisch mit einem Vorratsbehälter 10 verbunden, sodass die am ersten Mikromischer 3 austretende, Flüssigkeit enthaltend Liposomen in den Vorratsbehälter 10 geleitet wird.
Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die einen ersten Mikromi- scher 3 und einen zweiten Mikromischer 12 aufweist. Die erste Flüssigkeit, die sich in einem ersten Behälter 1 befindet und die zweite Flüssigkeit, die sich in einem zweiten Behälter 2 befindet, werden durch Gasdruck, der aus zwei Quellen 9, 9' von Gas stammt, über eine erste Fluidleitung 7 in den ersten Eingang 4 bzw. über eine zweite Fluidleitung 8 in einen zweiten Eingang 5 des Mikromischers 3 eingeleitet und bis zum Ausgang 6 des Mikromischers trans- portiert. Am Ausgang des Mikromischers 3 tritt eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen aus und wird über eine dritte Fluidleitung 20 in einen ersten Ein- gang 14 eines weiteren Mischers 12 (hier: ein weiterer Mikromischer) geleitet. Eine weitere Flüssigkeit, die sich in einem dritten Behälter 13 befindet, wird durch Gasdruck, der aus einer Quelle 9" von Gas stammt, über eine vierte Fluidleitung 21 in einen zweiten Eingang 16 des weiteren Mischers 12 geleitet. Im weiteren Mischer 12 wird die Flüssigkeit enthaltend Liposomen mit der weiteren Flüssigkeit gemischt, wobei die Mischung am Ausgang 15 des zwei- ten Mikromischers 12 austritt und in einen Vorratsbehälter 10 geleitet wird. In der ersten Fluidleitung 7, in der zweiten Fluidleitung 8 und in der vierten Flu- idleitung 21 sorgt jeweils ein Flussregler 11, 11', 11” dafür, dass der Flüssig- keitsstrom in diesen Fluidleitungen 7, 8, 21 auf einem gewünschten Wert ge- halten wird. Figur 3 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die wie die in Figur 2 darge- stellt Vorrichtung aufgebaut ist, mit dem Unterschied, dass die Förderung der Flüssigkeiten nicht allein durch Gasdruck aus Quellen von Gas erfolgt, sondern zudem durch eine Vorrichtung 17 zur Beförderung von Flüssigkeiten (hier: eine Pumpe) unterstützt wird, um den notwendigen Förderdruck zu erreichen. Die Vorrichtung 17 zur Beförderung von Flüssigkeiten hat auch die Eigenschaft eines Flussreglers und sorgt dafür, dass der jeweilige Flüssigkeitsstrom in der ersten Fluidleitungen 7, der zweiten Fluidleitung 8 und der vierten Fluidlei- tung 21 auf einem gewünschten Wert gehalten wird.
Figur 4 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die im Wesentlichen wie die in der Figur 3 dargestellte Vorrichtung aufgebaut ist, wobei es sich bei der Vorrichtung 17 zur Beförderung von Flüssigkeiten um eine magnetische Zahn- radpumpe handelt und stromabwärts vom Ausgang 15 des zweiten Mikromi- schers 12 ein 3-Wege-Ventil 19 angeordnet ist. Über das 3-Wege-Ventil 19 kann die am zweiten Mikromischer 12 austretende Flüssigkeit enthaltend Lip- osomen entweder in einen Vorratsbehälter 10 geleitet werden oder über ein Ultrafiltrationsmodul 18 in einen anderen Vorratsbehälter 10', 10” geleitet werden.
Beispiel 1 - Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
Die Vorrichtung enthält einen Mikromischer und einen zweiten Mikromischer, der hinter einer kurzen Verweilschleife am Ausgang des ersten Mikromischers angeschlossen ist, um beispielsweise asymmetrischere Flussbedingungen zu erreichen oder eine Verdünnung vor der Aufreinigung mittels Diafiltration zu erzielen, um Lösungsmittelgehalt weiter zu reduzieren.
Der oder die Mikromischer und Verweilschleife können bei Bedarf temperiert werden. Angeschlossen werden kann zudem ein Diafiltrationsmodul (Memb- ranstapel), das direkt in Reihe betrieben werden kann oder als separates Mo- dul auch im Kreislauf betrieben werden kann.
Bei dem Mikromischer handelt es sich bevorzugt um einen „Split-and- Recombine"-Mikromischer, besonders bevorzugt einen „Caterpillar"- Mikromischer (durchgehender Mischkanal mit mehreren Mischstufen). Der Mischkanal dieser Mikromischer weist einen Durchmesser im Mikrometerbe- reich bis Millimeterbereich auf. Natürlich ist hier ein „upscaling" möglich. Bei- spielsweise kann eine gleiche Produktqualität erreicht beim Einsatz einer Rau- pe 600 mit 4-facher Flussrate, sowie mit einer Raupe 1200 mit 16-facher Flussrate verglichen mit R-300, erreicht werden.
Beispiele für die Skalierungsfähigkeit:
Raupe 300: 2 - 80 ml / min = 22,22 ml/(min*mm2) - 888,88 ml/(min*mm2) Raupe 600: 8 - 320 ml / min = 22,22 ml/(min*mm2) - 888,88 ml/(min*mm2) Raupe 1200: 32 - 1280 ml / min = 22,22 ml/(min*mm2) - 888,88 ml/(min*mm2)
Raupe 2400: 128 - 5120 ml/min = 22,22 ml/(min*mm2) - 888,88 ml/(min*mm2)
Mögliche Skalierung auf Kanalstrukturbreite bezogen (gerundet) sind:
20 ml/(min*mm2) - 1000 ml/(min*mm2)
Skalierbar von 300 - 2400er Raupe: 0,12 - 345,6 L / h
Alternativ kann der Mikromischer und/oder der zweite Mikromischer auch ein so genannter StarLam-Mikromischer sein. Der StarLam-Mikromischer ist eben- falls skalierbar und kann bspw. als StarLam 30, 300 und 3000 mit Durchfluss- raten von 12 l/h bis 8000 l/h betrieben werden.
Beispiel 2 - Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen
Erste Flüssigkeit:
100 g/L (HSPC:PEG-Lipid:Cholesterol 3:1:1) in Ethanol
Zweite Flüssigkeit:
250 mM Calciumacetat
Es erfolgt ein Mischen der beiden Flüssigkeiten bei Raumtemperatur mit einer R300 Raupe. Vorteil: Dieser Mischer funktioniert bei diesen Flussbedingungen nahezu optimal: Ausreichende Mischung, geringer Druckabfall, gerader Aus- gang, solide Prozessführung geringes Risiko der Blockierung, vergleichsweise einfache Reinigung, öffnen in zwei Hälften zum Reinigen und trocknen. Dann erfolgt eine Abfüllung ohne Aufreinigung. Die Flüssigkeit wird im Kühl- schrank über Nacht gelagert.
Am nächsten Tag erfolgt eine Aufreinigung mittels Ultrafiltration und danach ein Austausch von Calciumacetat außen gegen 5% Glucoselösung (wegen et- was niedriger Viskosität im Vergleich zu Sucroselösung gleicher Osmolarität)
Eigenschaften der Liposomen in der Flüssigkeit:
Durchmesser (gemäß DLS): 80 nm
PDI: 0,011
Beispiel 3 - Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen, die siRNA verkapseln
Die Lipidmischung enthielt das Lipidoid Dodecyl-3-[3-[3-[3-[3-[bis(3-dodecoxy- 3-oxo-propyl)amino]propyl-methyl-amino]propyl-(3-dodecoxy-3-oxo- propyl)amino]propanoat (M = 1106,8 g/mol), l,2-Distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholin (DSPC), Cholesterin und l,2-Dimyristoyl-rac-glycero-3- methoxypolyethylenglykol-2000, (DMG-PEG 2000).
Zur Herstellung einer Lipidlösung wurde das kationische Lipidoid mit Choleste- rin, DSPC und DMG-PEG2000 kombiniert und jeweils in 90%-igem Ethanol (10% 10 mM Citratpuffer, pH 3) im molaren Verhältnis des kationischen Lipids gelöst, wobei die molaren Verhältnisse von DSPC : Cholesterin : DMG- PEG2000 50 : 10 : 38,5 : 1,5 betrugen.
Zur Herstellung einer Polynukleotid-Lösung wurde ein si-RNA-Polynukleotid (30 pM) in 10 mM Citratpuffer, pH 3,0, gelöst.
Zur Herstellung der Lipoplex-Lipidnanopartikel wurden die Polynukleotid- Lösung und die Lipidlösung in einem ersten Mikromischer (Gesamtdurchfluss- rate 10 ml/min) gemischt.
Das Mischprodukt wurde in einem zweiten Mikromischer (Gesamtdurchfluss- rate 20 ml/min) mit PBS-Puffer gemischt.
Die relative volumetrische Flussraten von Polynukleotidlösung : Lipidlösung : Puffer betrug 1: 1: 2.
Die frisch präparierten Lipidnanopartikel wurden gegen PBS-Puffer dialysiert, um Ethanol, Austauschpuffer und ungebundene siRNAs zu entfernen.
Bezugszeichenliste:
1: erster Behälter;
2: zweiter Behälter;
3: Mikromischer;
4: erster Eingang des Mikromischers;
5: zweiter Eingang des Mikromischers;
6: Ausgang des Mikromischers;
7: erste Fluidleitung;
8: zweite Fluidleitung;
9, 9', 9": Quelle von Gas;
10, 10', 10": Vorratsbehälter;
11, 11', 11": Flussregler;
12: weiterer Mikromischer;
13: dritter Behälter;
14: erster Eingang eines weiteren Mikromischers;
15: Ausgang des weiteren Mikromischers
16: zweiter Eingang eines weiteren Mikromischers;
17: Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung (z.B. magnetische Zahn- radpumpe);
18: Ultrafiltrationsmodul;
19: 3-Wege-Ventil;
20: dritte Fluidleitung;
21: vierte Fluidleitung.

Claims

Patentansprüche Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer ersten Flüssigkeit in einem ersten Behälter, wobei die erste Flüssigkeit mindestens ein Lipid enthält oder daraus besteht; b) Bereitstellen einer zweiten Flüssigkeit in einem zweiten Behälter, wobei die zweite Flüssigkeit Wasser enthält oder daraus besteht; c) Leiten der ersten Flüssigkeit entlang einer ersten Fluidleitung in einen ersten Eingang eines Mikromischers und in einem Strom bis zu einem Ausgang des Mikromischers; d) Leiten der zweiten Flüssigkeit entlang einer zweiten Fluidleitung in einen zweiten Eingang des Mikromischers und in einem Strom neben der ersten Flüssigkeit bis zu dem Ausgang des Mikromischers; wobei sich die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit innerhalb des Mikromischers mischen, sodass am Ausgang des Mikromischers eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen austritt; dadurch gekennzeichnet, dass das Leiten der ersten Flüssigkeit und der zweiten Flüssigkeit in den Mikromischer und bis zum Ausgang des Mikromischers durch Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, optional zusätzlich durch mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, erfolgt, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des Mikromischers mindestens 10 mL/min beträgt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass alle Oberflächen, mit denen die erste und zweite Flüssigkeit auf dem Weg zum Ausgang des Mikromischers in Berührung kommen, i) steril sind; und/oder ii) nach außen fluiddicht abgeschlossen sind, bevorzugt ein geschlossenes System bilden; und/oder iii) keine Bereiche aufweisen, an denen sich Rückstände sammeln können; und/oder iv) kein Glas enthalten oder daraus bestehen.
3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens ein Quelle von Gas i) einen Gasbehälter enthält oder daraus besteht; und/oder ii) eine erste fluidische Verbindung zum ersten Behälter und eine zweite fluidische Verbindung zum zweiten Behälter aufweist; und/oder iii) ein Gas enthält, das keinen Sauerstoff enthält, wobei das Gas bevorzugt ein Gas ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Edelgas und Mischungen hiervon enthält oder daraus besteht.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtflussrate i) über einen konstanten Gasdruck der Quelle von Gas, optional zudem über eine Vorrichtung zur Druckerhöhung, eingestellt wird, der im Bereich von < 12 bar, bevorzugt < 8 bar, besonders bevorzugt < 6 bar, ganz besonders bevorzugt bei größer 1 bis 6 bar, insbesondere 1,5 bis 5 bar, liegt; und/oder ii) über mindestens einen, bevorzugt mindestens einen ersten und mindestens einen zweiten, Flussregler konstant gehalten wird, wobei besonders bevorzugt der mindestens eine erste Flussregler an der ersten fluidischen Verbindung angeordnet ist und der mindestens eine zweite Flussregler an der zweiten fluidischen Verbindung angeordnet ist; und/oder iii) so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des Mikromischers ≥ 80 mL/min, bevorzugt ≥ 320 mL/min, besonders bevorzugt ≥ 1280 mL/min, ganz besonders bevorzugt ≥ 2800 mL/min, insbesondere ≥ 5120 mL/min, beträgt; und/oder iv) so eingestellt wird, dass sie die am Ausgang des Mikromischers pro Querschnittsfläche des Ausgangs des Mikromischers ≥ 20 ml/(min-mm2), bevorzugt ≥ 100 ml/(min-mm2), besonders bevorzugt ≥ 200 ml/(min-mm2), ganz besonders bevorzugt ≥ 400 ml/(min-mm2), optional ≥ 1000 ml/(min-mm2), insbesondere von 100 bis 400 ml/(min-mm2), beträgt; und/oder v) so eingestellt wird, dass das Verhältnis der Flussrate der zweiten Flüssigkeit zur Flussrate der ersten Flüssigkeit < 8:1, bevorzugt < 7:1, besonders bevorzugt < 6:1, ganz besonders bevorzugt < 5:1, insbesondere < 4:1, beträgt; und/oder vi) eine Flussratenschwankung von weniger als 1% der Gesamtflussrate, bevorzugt weniger als 0,1% der Gesamtflussrate, aufweist; und/oder vii) derart eingestellt wird, dass die Strömung eine Reynolds-Zahl im Bereich von > 80 bis < 1200, vorzugsweise >120 bis < 1000, aufweist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikromischer i) eine oder mehrere sich schräg oder quer zur Strömungsrichtung erstreckende Mischstrukturen aufweist, die bevorzugt dazu geeignet sind, die erste Flüssigkeit und/oder zweite Flüssigkeit in eine Richtung schräg oder quer zur Strömungsrichtung abzulenken; und/oder ii) Edelstahl enthält oder daraus besteht; und/oder iii) autoklavierbar ist; und/oder iv) in mindestens zwei Teile zur Reinigung von Fluidkanälen des Mikromischers zerlegbar ist; und/oder v) ein „split-recombine" Mikromischer oder ein „StarLam" Mikromischer ist, wobei der Mikromischer bevorzugt ein „ramp- up/ramp-down" Mikromischer, besonders bevorzugt ein „caterpillar"-artiger Mikromischer, ist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Flüssigkeit i) Lipide in einer Gesamtkonzentration von > 30 g/L, bevorzugt > 50 g/L, besonders bevorzugt > 80 g/L, ganz besonders bevorzugt > 150 g/L, insbesondere 160 g/L bis 400 g/L, enthält; und/oder ii) mindestens ein Phospholipid, bevorzugt mindestens ein zwitterionisches Phospholipid, enthält, wobei das Phospholipid bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylcholin, DSPC, DOPE, DOPC, DSPE, HSPC und Mischungen hiervon, wobei die Konzentration des mindestens einen Phospholipids, oder Mischungen hiervon, bevorzugt > 20 g/L, bevorzugt > 40 g/L, besonders bevorzugt > 80 g/L, ganz besonders bevorzugt > 160 g/L, insbesondere 210 g/L bis 400 g/L, beträgt; und/oder iii) mindestens ein PEG-yliertes Lipid, bevorzugt DSPE-PEG2000 und/oder DMG-PEG2000, enthält, wobei die Konzentration des PEG-ylierten Lipids bevorzugt im Bereich von 15 bis 40 Mol.-%, besonders bevorzugt im Bereich von 31 bis 35 Mol.-%, in Bezug auf den molaren Anteil von mindestens einem Phospholipid in der ersten Flüssigkeit liegt; und/oder iv) mindestens ein Lipid, bevorzugt mindestens ein kationisches Lipid enthalten, bevorzugt mindestens ein Lipid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DOTMA, DOTAP, DDAB, DODMA und Mischungen hiervon, wobei die Konzentration des mindestens einen Lipids, oder Mischungen hiervon, bevorzugt > 10 g/L, bevorzugt > 20 g/L, besonders bevorzugt > 40 g/L, ganz besonders bevorzugt > 80 g/L, insbesondere 90 g/L bis 350 g/L, beträgt; und/oder v) mindestens ein Lipidoid enthält, wobei die Konzentration des Lipidoids bevorzugt im Bereich von 200 bis 1000 Mol.-%, besonders bevorzugt im Bereich von 300 bis 800 Mol.-%, in Bezug auf den molaren Anteil von mindestens einem Phospholipid in der ersten Flüssigkeit liegt; und/oder vi) Cholesterin enthält; und/oder vii) kein nicht-ionisches, kationisches, anionisches und/oder amphoteres Tensid enthält, bevorzugt kein Tensid enthält; und/oder viii) mindestens ein organisches Lösungsmittel oder kein organisches Lösungsmittel enthält, wobei das organische Lösungsmittel bevorzugt ein organisches, mit Wasser-mischbares Lösungsmittel ist, besonders bevorzugt ein Lösungsmittel ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, besonders bevorzugt Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, und/oder Methanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, insbesondere Ethanol ist; und/oder ix) entgast ist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Flüssigkeit i) eine Puffersubstanz, bevorzugt eine Puffersubstanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetat, Ammonium, Citrat und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt Calciumacetat und/oder Ammoniumsulfat, enthält, wobei die Konzentration der Puffersubstanz bevorzugt im Bereich von 5 mM bis 300 mM, besonders bevorzugt im Bereich von 8 mM bis 250 mM, liegt; und/oder ii) entgast ist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Beladung der Liposomen der Flüssigkeit mit mindestens einer Wirksubstanz durchgeführt wird, wobei die Beladung bevorzugt im ersten Mikromischer erfolgt, in einem weiteren Mischer stromabwärts des ersten Mikromischers erfolgt, nach einer Assemblierung der Liposomen und/oder nach einer Aufreinigung der Liposomen erfolgt, wobei die mindestens eine Wirksubstanz insbesondere i) mindestens eine organische Wirksubstanz, bevorzugt ein Wirkstoff zur Behandlung einer Krankheit, besonders bevorzugt ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vitamin, Protein, Peptid, Lipid, DNA, RNA, organisches Molekül mit einer Masse < 500 Da und Mischungen hiervon, insbesondere einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ultrahydrophobe Substanz, siRNA und Kombinationen hiervon, enthält oder daraus besteht; und/oder ii) mindestens eine anorganische Wirksubstanz, bevorzugt eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus magnetischer Substanz, paramagnetischer Substanz und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt Eisenoxid, Manganoxid und Mischungen hiervon, enthält oder daraus besteht; wobei die mindestens eine Wirksubstanz bevorzugt in der ersten Flüssigkeit, in der zweiten Flüssigkeit und/oder in einer weiteren Flüssigkeit enthalten ist, bevorzugt in einer Konzentration von > 1 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 80 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 30 Gew.-%, in Bezug auf das Gesamtgewicht der Lipide, beträgt. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt a), b) und/oder c), bevorzugt in den Schritten a) bis c), auf eine Temperatur von > 10 °C bis < 70°C, bevorzugt 15 bis 40 °C, besonders bevorzugt 22 bis 30 °C, insbesondere 23 °C bis 25 °C, temperiert wird. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen der Flüssigkeit, die am Ausgang des Mikromischers austritt, i) unilamellare Liposomen, multilammellare Liposomen oder Mischungen hiervon sind; und/oder ii) einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis < 200 nm oder im Bereich von > 200 nm bis < 500 nm, bevorzugt im Bereich von 40 nm bis 150 nm oder im Bereich 250 nm bis 400 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 60 nm bis 120 nm oder im Bereich von 300 nm bis 350 nm, aufweisen, wobei der Durchmesser durch dynamische Lichtstreuung und/oder cryogener Transmissionselektronenmikroskopie, bevorzugt über eine Messung mit cryogener Transmissionselektronenmikroskopie, bestimmbar ist; und/oder iii) zu mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, in Bezug auf die Gesamtzahl aller Lipsomen der Flüssigkeit, unilamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von < 0,200, bevorzugt von < 0,150, besonders bevorzugt im Bereich von < 0,100, ganz besonders bevorzugt im Bereich von < 0,090, insbesondere im Bereich von < 0,075, aufweisen, oder zu mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, in Bezug auf die Gesamtzahl aller Liposomen der Flüssigkeit, multilamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von <0,500, bevorzugt im Bereich von < 0,300 aufweisen, wobei der PDI bevorzugt mittels dynamischer Lichtstreuung nach der Norm DIN ISO 22412:2018-09 bestimmbar ist oder bestimmt wird. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit in einem weiteren Schritt nach Schritt c) aufgereinigt wird, wobei die Aufreinigung bevorzugt mindestens einen der folgenden Schritte umfasst, der sich, bevorzugt kontinuierlich, an den Schritt c) anschließt: i) Durchführen einer Ultrafiltration, Gelfiltration und/oder Evaporation, besonders bevorzugt Durchführen einer Ultrafiltration, um die Liposomen anzureichern; ii) Entfernen von Substanzen, die neben den Liposomen vorhanden sind, bevorzugt Entfernen von Puffersubstanzen und/oder organischen Lösungsmitteln; und iii) Austausch von Substanzen, die neben den Liposomen vorhanden sind, gegen eine sterile, osmolare Zuckerlösung, bevorzugt gegen eine sterile, osmolare Glukoselösung oder Sucroselösung, wobei die sterile, osmolare Zuckerlösung besonders bevorzugt 4 bis 15 Gew.-% Zucker aufweist, insbesondere 4 bis 6 Gew.-% Glukose bei einer Glukoselösung und/oder 9 bis 11 Gew.-% Sucrose bei einer Sucroselösung. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ferner die folgenden Schritte umfasst i) Leiten der Flüssigkeit enthaltend Liposomen am Ausgang des Mikromischers entlang einer dritten Fluidleitung, optional einer Verweilschleife, in einen ersten Eingang eines weiteren Mischers und in einem Strom bis zu einem Ausgang des weiteren Mischers; und ii) Leiten einer weiteren Flüssigkeit aus einem dritten Behälter, entlang einer vierten Fluidleitung in einen zweiten Eingang des weiteren Mischers und in einem Strom neben der Flüssigkeit enthaltend Liposomen bis zu dem Ausgang des weiteren Mischers; wobei sich die Flüssigkeit enthaltend Liposomen und die weitere Flüssigkeit innerhalb des weiteren Mischers mischen, sodass am Ausgang des weiteren Mischers eine veränderte Flüssigkeit enthaltend Liposomen austritt; wobei das Leiten der Flüssigkeit enthaltend Liposomen und der weiteren Flüssigkeit in den weiteren Mischer über Gasdruck aus mindestens einer Quelle von Gas, und/oder über mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, erfolgt, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des weiteren, Mischers mehr als 10 mL/min, bevorzugt mindestens 20 mL/min, beträgt.
13. Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen, enthaltend a) einen ersten Behälter, der eine erste Flüssigkeit enthält, wobei die erste Flüssigkeit mindestens ein Lipid enthält oder daraus besteht; b) einen zweiten Behälter, der eine zweite Flüssigkeit enthält, wobei die zweite Flüssigkeit Wasser enthält oder daraus besteht; c) einen Mikromischer, der einen ersten Eingang, einen zweiten Eingang und einen Ausgang aufweist, wobei der erste, Behälter über eine erste Fluidleitung mit dem ersten Eingang des Mikromischers verbunden ist und der zweite, Behälter über eine zweite Fluidleitung mit dem zweiten Eingang des Mikromischers verbunden ist, wobei der Mikromischer konfiguriert ist, die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit jeweils in einem Strom innerhalb des Mikromischers bis zum Ausgang des Mikromischers fließen zu lassen und innerhalb des Mikromischers zu mischen, wobei am Ausgang des Mikromischers eine Flüssigkeit enthaltend Liposomen austritt; d) mindestens eine Quelle von Gas, optional zudem mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung; und e) eine Steuereinheit; dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit konfiguriert ist, zu veranlassen, dass die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit in den Mikromischer und bis zum Ausgang des Mikromischers durch Gasdruck aus der mindestens einen Quelle von Gas, optional zudem durch die mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung, zu leiten, wobei die Gesamtflussrate der Flüssigkeiten so eingestellt wird, dass sie am Ausgang des Mikromischers mindestens 10 mL/min beträgt.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass alle Oberflächen der Vorrichtung, mit denen die erste und zweite Flüssigkeit auf dem Weg zum Ausgang des Mikromischers in Berührung kommen können, i) steril sind; und/oder ii) nach außen fluiddicht abgeschlossen sind, bevorzugt ein geschlossenes System bilden; und/oder iii) keine Bereiche aufweisen, an denen sich Rückstände sammeln können; und/oder iv) kein Glas enthalten oder daraus bestehen.
15. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder die Steuereinheit der Vorrichtung konfiguriert ist/sind, das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 durchzuführen.
16. Flüssigkeit enthaltend Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass i) mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, aller Liposomen der Flüssigkeit unilamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von
< 0,200, bevorzugt im Bereich von < 0,150, besonders bevorzugt im Bereich von < 0,100, ganz besonders bevorzugt im Bereich von
< 0,090, insbesondere im Bereich von < 0,075, aufweisen; oder ii) mehr als 50%, mehr als 70% oder mehr als 90%, aller Liposomen der Flüssigkeit mulitlamellare Liposomen sind und die Liposomen im Hinblick auf ihre Größenverteilung einen PDI-Wert im Bereich von <0,500, bevorzugt im Bereich von < 0,300 aufweisen; wobei der PDI bevorzugt mittels dynamischer Lichtstreuung nach der Norm DIN ISO 22412:2018-09 bestimmt ist.
17. Flüssigkeit gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 herstellbar ist. Flüssigkeit gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 zur Verwendung in der Medizin, bevorzugt zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, besonders bevorzugt i) zur Applikation von einem Wirkstoff, besonders bevorzugt zur topischen Applikation von einem Wirkstoff; und/oder ii) zum Targeting von einem Wirkstoff; und/oder iii) zur Freisetzung von einem Wirkstoff; in einem Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei der Wirkstoff bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Impfstoff, Zytostatikum, Corticoid und Kombinationen hiervon, (Doxorubin und/oder Dexamethason) und es sich bei der Behandlung insbesondere um die Behandlung von Krebs, einer inflammatorischen Erkrankung, einer Erkrankung des Immunsystems und/oder eine neurodegenerative Erkrankung handelt. Flüssigkeit gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, bevorzugt in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird, insbesondere an einem Diagnostizierverfahren, in dem die Liposomen einen Biomarker enthalten. Verwendung der Flüssigkeit gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 i) in der Kosmetik; und/oder ii) als Zusatz in einem Nahrungsmittel. Verwendung der Flüssigkeit gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 i) zur Verkapselung mindestens einer Substanz, optional in einem ersten Mikromischer, in einem weiteren Mischer, nach einer Assemblierung der Liposomen und/oder nach einer Aufreinigung der Liposomen; und/oder ii) zum Targeting mindestens einer Substanz; und/oder iii) zur Freisetzung mindestens einer Substanz; und/oder iv) Herstellung eines Kompositmaterials; wobei die mindestens eine Substanz bevorzugt mindestens eine organische Wirksubstanz und/oder mindestens eine anorganische Wirksubstanz enthält oder daraus besteht, und es sich bei der
Verwendung optional um eine in-vitro-Verwendung handelt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19927556C2 (de) 1999-06-16 2003-05-08 Inst Mikrotechnik Mainz Gmbh Statischer Mikromischer und Verfahren zum statischen Mischen zweier oder mehrerer Edukte
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JP5823405B2 (ja) * 2009-11-04 2015-11-25 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 核酸含有脂質粒子および関連方法
US9693958B2 (en) * 2013-03-15 2017-07-04 Cureport, Inc. Methods and devices for preparation of lipid nanoparticles
CA2906732C (en) 2013-03-15 2023-08-08 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
DE102015226018A1 (de) 2015-12-18 2017-06-22 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von vesikulären oder scheibenförmigen, supramolekularen Nanopartikeln, und Verwendungen hiervon
EP3915544A1 (de) * 2020-05-25 2021-12-01 Leon-Nanodrugs GmbH Verfahren zur herstellung einer liposomendispersion

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