CN116635078A - 用于制备含有脂质体的液体的方法和装置以及制备的液体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备含有脂质体的液体的方法和装置。该方法的特征在于，将第一液体和第二液体引导到微混合器中并引导到微混合器的出口，其通过来自至少一个气体源的气体压力，以及任选地还通过至少一个用于输送液体的装置进行，其中调整液体的总流速，使得微混合器的出口的总流速至少为10mL/min。该方法和装置允许以简单和可重复的方式在工业规模上制备含有具有窄尺寸分布的脂质体的液体。本发明还涉及含有具有窄尺寸分布的脂质体的液体及其用途。

Description

用于制备含有脂质体的液体的方法和装置以及制备的液体
提供了用于制备含有脂质体的液体的方法和装置。该方法的特征在于，将第一液体和第二液体引导到微混合器中并直至微混合器的出口，其通过来自至少一个气体源的气体压力，以及任选地通过至少一个用于输送液体的装置进行，其中调整液体的总流速使得其在微混合器的出口处至少为10mL/min。该方法和装置允许以简单和可重复的方式在工业规模上提供含有具有窄尺寸分布的脂质体的液体。此外，还提供了含有具有窄尺寸分布的脂质体的液体及其用途。
脂质体是世界上最成熟的用于制药的纳米传输体系统。已经在1995年被美国食品和药物管理局批准为第一个“纳米药物”。
目前，纳米脂质体是以多步骤批量方法进行工业化生产的。在第一步中，脂质，主要是大的多层脂质体(MLV)被水化。在第二步中，进行“缩小尺寸”以获得直径小于200nm的纳米脂质体。为此，通过具有相应纳米级孔隙的膜进行高压挤出(例如：的制备)。或者，进行高压均质处理(例如：/>的制备和用于化妆品的纳米脂质体)。
挤出需要在高温下进行，因为MLV脂质双层需要有足够的柔性以允许改变形状，这是实现缩小尺寸的必要条件。为实现所需的窄尺寸分布，多次通过挤出膜是必要的。该程序很耗时。此外，这种程序仅限于耐热的脂质原料和相应的结合或包封物质。此外，挤出法涉及到膜上材料的损失。此外，膜的堵塞(阻塞)需要经常更换膜和损失潜在的有价值的物质，如脂质和活性成分，这使提供带有脂质体的无菌液体的制备方法的实施成本增加。常用的聚碳酸酯膜也因孔径尺寸、孔的均匀性和表面润湿性等不同特性而有批次波动，这导致工艺的可重复性差。
另一方面，高压均质化往往导致分布的尺寸太宽，包括产生大比例的非常小的脂质体。此外，高压均质化还必须在高温下进行。
需要快速、简单、大规模制备含有纳米尺寸的脂质体的无菌液体的方法。此外，还需要不耐热的(热敏性)脂质和药物的配制方法。还需要用于下一代药物例如基于核酸的免疫治疗药物的平台技术。
WO2017/103268A1公开了制备纳米颗粒的连续方法。其中公开的方法不适合大规模生产含有脂质体的无菌液体。
EP1337322B1公开了制备脂质囊泡的方法。该方法不是严格意义上的微流控方法，并且在制备脂质体时使用如此复杂的API(如超疏水剂)方面受到限制。此外，关于所制备的脂质体的尺寸分布所达到的狭窄程度，仍有改进的余地。
WO2014/172045A1公开了大规模工业化制备无菌脂质体溶液的方法。然而，其重现性是有问题的，因为制备是通过平台进行的，其中必须确保平台的不同通道绝对均匀分布，这并不容易。
在此基础上，本发明的问题是提供用于制备含有脂质体的液体的方法和装置，其不具有现有技术的缺点。特别是，该方法和装置应能以简单和可重复的方式在工业规模上提供含有尺寸分布较窄的脂质体的液体，特别是无菌液体。
该问题通过具有权利要求1特征的方法、具有权利要求13特征的装置、具有权利要求16特征的液体和具有权利要求20和21特征的用途得到了解决。从属权利要求显示了有利的发展。
根据本发明，提供了用于制备含有脂质体的液体的连续方法，其包括以下步骤：
a)在第一容器中提供第一液体，其中第一液体包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成；
b)在第二容器中提供第二液体，其中第二液体包含水或由水组成；
c)将第一液体沿着第一流体管线引导到微混合器的第一入口中，并以流的形式引导到直至微混合器的出口；
d)将第二液体沿着第二流体管线引导到微混合器的第二入口中，并以与第一液体相邻的流的形式引导到直至微混合器的出口；
其中第一液体和第二液体在微混合器内混合，使得在微混合器的出口处排出含有脂质体的液体；
其特征在于，将第一液体和第二液体引导到微混合器中并直至微混合器的出口通过来自至少一个气体源的气体压力，以及任选地通过至少一个用于输送液体的装置(例如，磁力驱动的泵，优选地选自齿轮泵、齿轮环泵或离心泵)进行，其中调整液体的总流速，使其在微混合器的出口至少为10mL/min。
根据本发明，术语“脂质体”被定义为脂质体、脂质复合物和脂质纳米颗粒，它们可以装载物质(如活性成分)，其中“装载”被定义为脂质颗粒内的空腔和/或脂质颗粒的膜(优选两者)包含或含有物质(如活性成分)。脂质体(即脂质体、脂质复合物和/或脂质纳米颗粒)的直径特别为20nm至<200nm或>200nm至<500nm，优选40nm至150nm或250nm至400nm，特别优选60nm至120nm或300nm至350nm。直径可以通过动态光散射和/或低温透射电子显微镜确定，优选通过低温透射电子显微镜测量。
术语“微混合器”优选定义为所有混合原理是基于微混合器的混合原理的混合器，包括那些流体通道的尺寸(即横截面)大于微米范围(1μm到1000μm)的混合器。通过根据本发明的方法，可以在工业规模上以简单和可重复的方式提供含有具有窄尺寸分布的脂质体的液体。该方法也适用于确保可以提供含有脂质体的无菌液体，因为液体输送是通过来自至少一个气体源的气体压力进行的(任选地还通过至少一个用于液体输送的装置)。任选的用于液体输送的装置被布置在至少一个气体源的下游，这可以确保其与液体接触的表面是无菌的。通过向外密封该方法中使用的部件(例如流体管线和微混合器)，还可以确保液体不与微生物和/或病毒接触。
在微混合器中混合液体可以高度控制脂质体的结构，即可以获得良好的尺寸控制，并且可以实现非常窄的尺寸分布。另外的优点是，该方法可以扩大规模而不必重新进行调整，即在各个微混合器的“数增放大”过程中不必产生均匀的流量分布，这对微混合器来说通常是必要的(“外部数增放大”)和/或不必改变混合器类型。当扩大方法的规模时，例如可以使用同一类型的更大的混合器(“可扩展的微混合器”)(例如用Caterpillar 600代替Caterpillar 300，用StarLam 300代替StarLam 30)，即改变程序或系统配置所需的努力因此大大降低或完全消除了。对于StarLam微混合器来说，这种增加也被称为“内部数增放大”。这是一个关键的优势，特别是对于GMP方法。可扩展的微混合器，根据本发明可作为混合器或微混合器使用，其特点在于，在扩展的情况下，不需要任何额外的分配线和歧管。可扩展的微混合器例如是斜升/斜降分裂和重组混合器，这里特别是上述的履带型微混合器(例如在Hermann等人，Chemical Engineering Journal,vol.334,p.1996-2003中公开的)、StarLam型微混合器(例如在DE19927556C2中公开的)和/或气旋混合器(例如在EP1390131B1中公开的)。
该方法的特点是，第一液体和第二液体在到达微混合器的出口途中接触到的所有表面都是无菌的。此外，优选所有这些表面都是向外流体密封的，优选形成封闭的系统。这样做的好处是对于微混合器和液体输送装置(例如，来自至少一个气体源的气体压力，任选的用于液体输送的附加装置)，可以非常精确地设置条件，这对于达到所需的PDI值和其他质量标准是有利的。此外，还可以确保所用液体不与微生物和/或病毒接触。除此以外，优选所有这些表面都不具有任何可以收集残留物的区域。同样优选的是，所有这些表面都不包含玻璃也不由玻璃组成。这些特征中的每一个都有助于确保该方法可用于连续制备含有脂质体的无菌液体，即在其制备过程中不会发生液体污染。在优选的实施方案中，该方法中使用的所有流体都是无菌的(例如，第一无菌液体和第二无菌液体以及来自气体源的气体)。这一点也适用于该方法中使用的所有部件(例如微混合器、输送器和容器)，至少适用于它们与该方法中使用的液体接触的表面。
该方法的特征在于，至少一个气体源包括气体容器或由气体容器组成。
至少一个气体源可以与第一容器的第一流体连通和与第二容器的第二流体连通。
此外，至少一个气体源可以包含不包括氧气的气体，其中该气体优选包含选自氮气、惰性气体、及其混合物的气体或由选自氮气、惰性气体、及其混合物的气体组成。
气体源的气体压力，任选地连同液体输送装置一起，提供了输送压力。总流量可以通过气体源的恒定气体压力来调整，也可以选择通过用于液体输送的装置来调整。单独的气体压力优选在<12巴，更优选<8巴，特别优选<6巴，最优选大于1至6巴，特别是1.5至5巴。通过任选的用于液体输送的装置，可以实现高达50巴的输送压力。然后，总流量可以通过至少一个流量调节器，优选至少一个第一流量调节器和至少一个第二流量调节器保持恒定，其中特别优选地，至少一个第一流量调节器被布置在第一流体连通处，至少一个第二流量调节器被布置在第二流体连通处。简而言之，至少一个流量调节器用于将初始输送压力转换成恒定的流速。在流动方向上，首先是气体源(然后是任选的用于液体输送的装置)，然后是至少一个流量调节器。
混合器的混合室中的压力损失优选较低，优选<6巴，特别是1.5至5巴。
此外，总流速可以被调整为在微混合器的出口处80mL/min，优选≥320mL/min，特别优选≥1280mL/min，最优选≥2800mL/min，特别是≥5120mL/min。
除此以外，总流速可以被调整，使得在微混合器的出口处，总流速/微混合器的横截面积为≥20ml/(min·mm2)，优选≥100ml/(min·mm2)，特别优选≥200ml/(min·mm2)，最优选≥400ml/(min·mm2)，任选地≥1000ml/(min·mm2)，特别是100ml/(min·mm2)至400ml/(min·mm2)。
此外，总流速可以被调整，使得第二液体的流速与第一液体的流速之比<100:1，优选<20:1，特别优选<16:1，最优选<8:1，甚至更优选<7:1，强烈优选<6:1，非常强烈优选<5:1，特别是≤4:1。
总流速的流速变化可以小于总流速的1％，优选小于总流速的0.1％。这里的优点是可以实现非常低的PDI值。
此外，可以调整总流速，使流的雷诺数为>80至<1200，优选>120至<1000。
该方法的特征在于，具有一个或多于一个斜向或横向延伸至流动方向的混合结构，优选地，该结构适用于使第一液体和/或第二液体在斜向或横向流动方向上偏转。
此外，微混合器，特别是优选该方法中使用的所有部件，可以包含不锈钢或由不锈钢组成。这样做的好处是，微混合器或该方法中使用的所有部件可以很容易地通过温度的影响而被消毒，并且可以建立清洁验证。因此微混合器不必是一次性的产品，为此它的可重复混合性能必须不断地被控制和检查。这也适用于该方法中使用的其他部件，即用于执行该方法的整个装置，如果整个装置包含不锈钢或由不锈钢组成。
此外，微混合器可以进行高压灭菌。
除此之外，微混合器可以被拆成至少两部分，用于清洗微混合器的流体通道。
微混合器可以是“分裂和重组”微混合器，其中微混合器优选“斜升/斜降”微混合器，特别优选“履带”型微混合器(例如，见Hermann等人，Chemical Engineering Journal,vol.334,p.1996-2003)。已经发现，“履带”型微混合器有多种优点。首先，它们有连续的通道。这与其他许多“分裂和重组”微混合器形成对比，在这些微混合器中，主通道会分裂成流体分离的通道，然后再汇合到一起。此外，“履带”型微混合器的生产和清洁也更简单。此外，在这些微混合器中发生的剪切力也较低，因为沿着流动方向的斜面反复改变方向只是相当平缓的。优选地，斜面相对于主流动方向(即相对于平行于微混合器的液体通道壁的流动方向)的倾斜度小于70°，特别优选小于55°，最优选小于45°。因此，含有脂质体的液体的生产更温和，也就是说，离析物和产品的降解更少。此外，这种微混合器可以非常容易地进行扩展，例如通过增加垂直于主流向的混合通道的横截面积，同时保持履带型微混合器典型的重复基本结构。随着规模的扩大，如果有必要，可以通过增加重复的基本结构的数量来调整混合性能。
该微混合器也可以是“在微层中分裂并在多层物流中组合”的微混合器，特别优选“StarLam”微混合器(例如见DE19927556C2和Werner,B.等人，Chemical EngineeringTechnology,2005,vol.28,p.401ff)。这样做的好处是，微混合器也可以由不锈钢制成，易于组装和拆卸，也易于扩展。
优选地，微混合器，特别是“履带”微混合器，在混合室的下游，有基本不受限制的和/或基本直的出口。这里的优点是没有方向上的突然变化和/或流体流动的截面变窄，没有死角，只有很小的压力损失且有低剪切力。
该方法的特征在于，第一液体包含总浓度>30g/L、优选>50g/L、特别优选>80g/L、最优选>150g/L、特别是160g/L至400g/L(任选地210g/L至290g/L)的脂质。
此外，第一液体可以包含至少一种磷脂，优选至少一种两性离子型磷脂，其中优选地，磷脂选自磷脂酰胆碱、DSPC、DOPE、DOPC、DSPE、HSPC、及其混合物，其中该至少一种磷脂或其混合物的浓度优选>20g/L，优选>40g/L，特别优选>80g/L，最优选>160g/L，特别是210g/L至400g/L。此外，第一液体可以包含具有饱和脂肪酸残基和/或不饱和脂肪酸残基的磷脂，如DSPC(饱和)和DOPC(不饱和)，或其混合物。
此外，第一液体可以包含至少一种PEG化的脂质，优选DSPE-PEG2000和/或DMG-PEG2000，其中相对于第一液体中至少一种磷脂的摩尔量而言，PEG化的脂质的浓度优选为15摩尔％至40摩尔％，特别优选31摩尔％至35摩尔％。
此外，第一液体可以包含至少一种脂质，优选至少一种阳离子型脂质(例如，依赖pH值的带正电脂质)。特别是选自以下的物质：DOTMA(1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷)、DOTAP(1,2-二油酰氧基-3-(三甲胺)丙烷)、DDAB二甲基双十八烷基铵(溴化盐)、DODMA(1,2-二油酰氧-3-二甲胺丙烷)(在低pH下带正电)、及其混合物，其中至少一种脂质或其混合物的浓度优选>10g/L，优选>20g/L，特别优选>40g/L，最优选>80g/L，特别是90g/L至350g/L。
此外，第一液体可以包含至少一种类脂质，其中相对于第一液体中至少一种磷脂的摩尔量，类脂质的浓度优选为200摩尔％至1000摩尔％，特别优选300摩尔％至800摩尔％。根据本发明，术语“类脂质”被定义为由丙烯酰胺或丙烯酸酯与仲胺或伯胺反应产生的类脂质物质(即产生)。依赖pH值的正电优选通过伯氨基、仲氨基或叔氨基来实现。特别地，至少一种类脂质表示选自Acinc,A.等人在以下出版物中提到的类脂质：NatureBiotechnology(2008),vol.26,no.5,p.561-569。
此外，第一液体可以包含胆固醇。
第一液体的特征在于其不含有非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和/或两性表面活性剂，优选不含有表面活性剂(完全不含有)。
此外，第一液体可以包含至少一种有机溶剂或不包含有机溶剂，其中有机溶剂优选为有机的、水溶性的溶剂，特别优选选自醇类，特别优选乙醇、1-丙醇、2-丙醇和/或甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、二甲亚砜的溶剂，特别是乙醇。
在一个有利的实施方案中，第一液体是脱气的。这可以防止在组装脂质体时形成气泡。
该方法的特征在于，第二液体包含缓冲物质，优选选自乙酸盐、铵盐、柠檬酸盐、及其组合的缓冲物质，特别优选乙酸钙和/或硫酸铵。缓冲物质的浓度优选为5mM至300mM，特别优选8mM至250mM。这些浓度的优点是可以改善梯度的形成。
在一个有利的实施方案中，第二液体是脱气的。这可以防止在组装脂质体时形成气泡。
该方法的特征在于，液体中的脂质体被装载至少一种活性物质，其中装载优选在第一微混合器中进行，在第一微混合器的下游的另外的混合器中进行，在组装脂质体后进行和/或纯化脂质体后进行。
这里，活性物质可以包含至少一种有机活性物质或由至少一种有机活性物质组成，优选用于治疗疾病的活性成分，特别优选选自维生素、蛋白质、肽、脂质、DNA、RNA、质量≤500Da的有机分子、及其混合物的分子，特别是选自超疏水物质、siRNA、及其组合的物质。通过这种方式，可以封装具有挑战性的活性物质(如超疏水物质和/或siRNA)，这些物质在其他方法中不能被封装。此外，活性物质可以包括或由至少一种无机活性物质组成，优选选自磁性物质、顺磁性物质、及其混合物的物质，特别优选氧化铁、氧化锰、及其混合物。
至少一种活性物质优选包含在第一液体、第二液体和/或另外的液体中(在微混合器的下游)。相对于脂质的总重量，至少一种有机活性物质和/或至少一种无机活性物质的浓度可以为≥1重量％，优选5重量％至80重量％，特别优选10重量％至60重量％，特别是15重量％至30重量％。
在该方法的步骤a)、b)和/或c)中，优选在步骤a)至c)中，温度被调为>10℃至<70℃，优选15℃至40℃，特别优选22℃至30℃，特别是23℃至25℃。如有必要，温度被调为>0℃至<10℃。该方法的这种变体的优点是可以在该方法中使用对温度敏感的物质(例如活性成分)，即可以提供包括这些对温度敏感的物质的脂质体。
该方法的特征在于，在微混合器的出口处排出的液体中的脂质体是单层脂质体、多层脂质体、或其混合物。
该方法可以被配置为使在微混合器出口处排出的液体中的脂质体的直径为20nm至<200nm或>200nm至<500nm，优选40nm至150nm或250nm至400nm，特别优选60nm至120nm或300nm至350nm。直径可以通过动态光散射和/或低温透射电子显微镜确定，优选通过低温透射电子显微镜测量。
此外，该方法的特征在于，在微混合器的出口处排出的液体中的脂质体，相对于液体中所有脂质体的总数，单层脂质体占大于50％，大于70％或大于90％，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值为<0.200，优选≤0.150，特别优选≤0.100，最优选≤0.090，特别是≤0.075。
或者，该方法的特征在于，在微混合器的出口处排出的液体中的脂质体，相对于液体中所有脂质体的总数，多层脂质体占大于50％，大于70％或大于90％，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值为<0.500，优选<0.300。
PDI优选可以通过或通过根据标准DIN ISO 22412:2018-09的动态光散射确定。
该方法的特征在于，在步骤c)之后的另外的步骤中纯化液体，纯化包括，在步骤c)之后，进行优选连续的超滤、凝胶过滤和/或蒸发，特别优选进行超滤，以富集脂质体。此外，纯化可以包括去除脂质体以外的物质，优选去除缓冲物质和/或有机溶剂。此外，纯化可以包括用无菌渗透的糖溶液，优选无菌渗透的葡萄糖溶液或蔗糖溶液交换除脂质体以外的物质。无菌渗透的糖溶液特别优选包含4重量％至15重量％的糖，特别地，如果是葡萄糖溶液，无菌渗透的糖溶液包含4重量％至6重量％的葡萄糖，和/或如果是蔗糖溶液，无菌渗透的糖溶液包含9重量％至11重量％的蔗糖。纯化可以包括对含有脂质体的溶液进行灭菌，优选包括通过孔径(截止)为0.2μm的膜进行无菌过滤。
该方法还可以包括以下步骤：
i)将微混合器的出口处的含有脂质体的液体沿着第三条流体管线，任选的留置回路，引导到另外的混合器的第一入口中，并以流的形式引导到直至另外的混合器的出口；和
ii)将来自第三容器的另外的液体沿第四流体管线引导到另外的混合器的第二入口中，并以与含有脂质体的液体相邻的流的形式引导到直至另外的混合器的出口。
因此，另外的混合器内的含有脂质体的液体和另外的液体被混合，从而在另外的混合器的出口处排出经改变的含有脂质体的液体。优选地，在该另外的混合器中，溶剂的量被减少，并进行另外的稀释，优选地，稀释到小于液体中脂质体原始浓度的一半，优选小于其四分之一。这样一来，其中的脂质体在尺寸上更加稳定。另外，其他参数，例如pH值，也可以通过该外加剂进行调整，其中优选pH值被降低或中和。此外，在这一步骤中，脂质体也可以被装载至少一种活性物质。通过来自至少一个气体源的气体压力，和/或通过至少一个用于输送液体的装置，将含有脂质体的液体和另外的液体引导到另外的混合器中，其中调整液体的总流速，使其在另外的混合器的出口处大于10mL/min，优选至少20mL/min。优选地，另外的混合器是微混合器，优选静止微混合器，特别优选“分裂和重组”微混合器，最优选“履带”型微混合器。另外，也可以使用所谓的“StarLam”微混合器。这两种混合器都可以通过适当的选择或缩放来轻松适应所需的流速。
原则上，液体中的脂质体可以在第一台微混合器中，在另外的混合器中，在组装脂质体后和/或纯化脂质体后装载至少一种活性物质。
根据本发明，提供了用于制备含有脂质体的液体的装置，其包括：
a)含有第一液体的第一容器，其中第一液体包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成；
b)含有第二液体的第二容器，其中第二液体包含水或由水组成；
c)具有第一入口、第二入口和出口的微混合器，其中第一容器通过第一流体管线与微混合器的第一入口连接，第二容器通过第二流体管线与微混合器的第二入口连接，其中微混合器被配置为允许第一液体和第二液体分别在微混合器内流动，直至微混合器的出口，并在微混合器内混合，其中含有脂质体的液体在微混合器的出口处被排出；
d)至少一个气体源，以及任选的至少一个输送液体的装置；和
e)控制单元；
其特征在于，控制单元被配置为使第一液体和第二液体通过来自至少一个气体源的气体压力，任选地还通过至少一个输送液体的装置流入微混合器并直至微混合器的出口，其中调整液体的总流速使其在微混合器的出口处至少为10mL/min。
该装置的特征在于，在第一液体和第二液体到达微混合器的出口的途中与之接触的装置的所有表面是无菌的。此外，该装置的所有这些表面都可以是向外流体密封的，优选形成封闭的系统。这里的优点是，对于微混合器和液体输送装置(例如，来自至少一个气体源的气体压力，任选的用于液体输送的附加装置)，可以非常精确地设置条件，这对于实现理想的PDI值和其他质量标准是有利的。此外，可以确保使用的液体不与微生物和/或病毒接触。除此以外，所有这些表面都可以被认为没有可以收集残留物的区域。此外，优选所有这些表面都不包括玻璃也不由玻璃组成。这些特征中的每一个都有助于确保该装置可用于连续生产含有脂质体的无菌液体，即液体在生产过程中不会发生污染。在优选的实施方案中，装置中的所有液体(例如第一无菌液体和第二无菌液体以及来自气体源的气体)都是无菌的。这一点也适用于该装置的所有部件(例如微混合器、输送机和容器)，至少适用于它们与装置中的液体接触的表面。
该装置的特征在于，该装置和/或该装置的控制单元被配置为执行根据本发明的方法。在此，该装置可以具有上述与根据本发明的方法有关的特征，和/或该装置的控制单元可以被配置为执行上述与根据本发明的方法有关的步骤。
根据本发明，提供了含有脂质体的液体，其特征在于
i)液体中所有脂质体的大于50％、大于70％或大于90％是单层脂质体，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值<0.200，优选≤0.150，特别优选≤0.100，最优选≤0.090，特别是≤0.075；或
ii)液体中所有脂质体的大于50％、大于70％或大于90％是多层脂质体，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值<0.500，优选<0.300；
其中，PDI优选是根据标准DIN ISO 22412:2018-09通过动态光散射确定的。
液体中的脂质体的PDI越小，脂质体在其尺寸和其他特性方面的均匀性越高。例如，在脂质体的应用中(进入活体)，脂质体的尺寸更均匀，使其生物分布更可预测，能够更精确地控制。此外，含有具有小PDI的脂质体的液体可以更好地确保液体中不含有危险的过大的脂质体，过大的脂质体被认为是发生栓塞的风险因素。因此，较小的PDI也可以提供更高的安全度。此外，PDI越小，脂质体的稳定性就越均匀，从而可以对脂质体的耐贮性、运输稳定性和处理作出更准确的说明。此外，脂质体的PDI越小，意味着在给脂质体装载活性成分的情况下，每个脂质体的活性成分含量越均匀，这使得活性成分的剂量更加精确。
该液体可以通过根据本发明的方法制备。在优选的实施方案中，所提供的含有脂质体的液体是无菌的。
建议将该液体用于医药，优选用于对人体或动物身体进行治疗的方法，特别优选地
i)用于施用活性成分，特别优选用于局部施用活性成分；和/或
ii)用于靶向活性成分；和/或
iii)用于释放活性成分；
在对人体或动物身体进行手术或治疗的方法中，优选地，其中活性成分选自疫苗、细胞抑制剂、肾上腺皮质激素、及其组合，(多柔比星和/或地塞米松)，治疗特别是用于治疗癌症、炎症性疾病、免疫系统疾病和/或神经退行性疾病。活性成分可以选择上述有机活性物质中的至少一种(与根据本发明的方法有关)。
此外，建议将液体用于诊断方法，优选用于在人体或动物身体上进行的诊断方法，特别是其中脂质体含有生物标志物的诊断方法。
此外，建议将该液体用于化妆品和/或作为食品的添加剂。
此外，建议该液体的用途是
i)用于封装至少一种物质，任选地在第一微混合器中，在另外的混合器中，在组装脂质体后和/或在纯化脂质体后；和/或
ii)用于靶向至少一种物质；和/或
iii)用于释放至少一种物质；和/或
iv)制备复合材料；
其中至少一种物质优选包括或由至少一种有机活性物质和/或至少一种无机活性物质组成，并且用途任选地为体外用途。至少一种有机活性物质和/或至少一种无机活性物质可以是上面提到的活性物质之一(与根据本发明的方法有关)。
参照以下附图和实施例，将更详细地解释根据本发明的主题，而不限于此处所示的具体实施方案。
图1显示了根据本发明的装置，其包括单个微混合器3。位于第一容器1中的第一液体和位于第二容器2中的第二液体被来自两个气体源9、9’的气体压力引入，通过第一流体管线7进入微混合器3的第一入口4或通过第二流体管线8进入微混合器3的第二入口5，并输送到微混合器的出口6。在第一流体管线7和第二流体管线8中，流量调节器11、11’确保这些流体管线7、8中的液体流量保持在理想的水平。第一微混合器的出口6与贮液池10流体连通，使得从第一微混合器3排出的含有脂质体的液体被引导至贮液池10。
图2显示了根据本发明的装置，其包括第一微混合器3和第二微混合器12。位于第一容器1中的第一液体和位于第二容器2中的第二液体被来自两个气体源9、9’的气体压力引入，通过第一流体管线7进入微混合器3的第一入口4或通过第二流体管线8进入微混合器3的第二入口5，并输送到微混合器的出口6。在微混合器3的出口处，含有脂质体的液体被排出，并通过第三流体管线20进入另外的混合器12(此处为另外的微混合器)的第一入口14。位于第三容器13中的另外的液体被来自气体源9”的气体压力引导，通过第四流体管线21进入另外的混合器12的第二入口16。在另外的混合器12中，含有脂质体的液体与另外的液体混合，其中混合物在第二微混合器12的出口15处被排出，并被引导至贮液池10。在第一流体管线7、第二流体管线8和第四流体管线21中，各自的流量调节器11、11’、11”确保这些流体管线7、8、21中的液体流量保持在理想的水平。
图3显示了根据本发明的装置，其结构与图2所示的装置相似，不同的是液体的输送不仅由来自气体源的气体压力来完成，而且还由用于输送液体的装置17(此处为泵)来支持，以达到必要的输送压力。用于输送液体的装置17也具有流量调节器的特性，并确保第一流体管线7、第二流体管线8和第四流体管线21中各自的液体流量保持在理想的水平。
图4显示了根据本发明的装置，其结构基本与图3所示的装置类似，其中用于输送液体的装置17是磁力齿轮泵，三通阀19被布置在第二微混合器12的出口15的下游。通过三通阀19，从第二微混合器12排出的含有脂质体的液体可以被引导至贮液池10中，或者通过超滤模块18进入另外的贮液池10’、10”。
实施例1-根据本发明的装置的结构
装置包括微混合器和第二微混合器，第二微混合器连接在第一微混合器的出口处的短留置回路后面，例如为了实现不对称的流动条件，或者在通过渗滤纯化之前获得稀释，以进一步减少溶剂含量。
如果有必要，可以调节微混合器和留置回路的温度。也可以连接渗滤模块(膜堆)，其可以直接串联操作，或作为回路中的单独模块。
微混合器优选“分裂和重组”微混合器，特别优选“履带”微混合器(具有多个混合阶段的连续混合通道)。这些微混合器的混合通道的直径为微米范围至毫米范围。当然，在这里可以进行“规模升级”。例如，与R-300相比，使用流速为4倍的Caterpillar 600，以及流速为16倍Caterpillar 1200可以达到相同的产品质量。
扩展性的实例：
Caterpillar 300：2ml/min至80ml/min＝22.22ml/(min*mm2)至888.88ml/(min*mm2)
Caterpillar 600：8ml/min至320ml/min＝22.22ml/(min*mm2)至888.88ml/(min*mm2)
Caterpillar 1200：32ml/min至1280ml/min＝22.22ml/(min*mm2)至888.88ml/(min*mm2)
Caterpillar 2400：128ml/min至5120ml/min＝22.22ml/(min*mm2)至888.88ml/(min*mm2)
对通道结构宽度可能的缩放比例(四舍五入)是：
20ml/(min*mm2)至1000ml/(min*mm2)
可从300至2400 Caterpillar扩展：0.12L/h至345.6L/h
另外，微混合器和/或第二微混合器也可以是所谓的StarLam微混合器。StarLam微混合器也是可扩展的，例如可以作为StarLam 30、300和3000操作，流速为12L/h至8000L/h。
实施例2-制备含有脂质体的液体
第一液体：
100g/L(HSPC:PEG-脂质:胆固醇3:1:1)的乙醇溶液
第二液体：
250mM乙酸钙
两种液体在环境温度下用R300 caterpillar进行混合。优势：这种混合器在这些流动条件下的操作几乎是最理想的：充分的混合，低压降，直出口，固体处理，堵塞的风险低，相对容易清洗，分两半打开用于清洗和干燥。
然后进行灌装，无需纯化。液体在冰箱中储存一晚。
第二天，通过超滤对液体进行纯化，并在外部用5％的葡萄糖溶液替换乙酸钙(由于与相同渗透压的蔗糖溶液相比，葡萄糖溶液的黏度略低)。
液体中的脂质体的特性：
直径(根据DLS)：80nm
PDI：0.011
实施例3-制备含有封装siRNA的脂质体的液体
脂质混合物含有类脂质十二烷基-3-[3-[3-[3-[3-[双(3-十二烷氧基-3-氧基-丙基)氨基]丙基-甲基-氨基]丙基-(3-十二烷氧基-3-氧基-丙基)氨基]丙酸酯(M＝1106.8克/摩尔)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG 2000)。
为了制备脂质溶液，阳离子型脂质与胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000结合，并以以下摩尔比溶解于90％的乙醇(10％的10mM柠檬酸盐缓冲液，pH为3)中：阳离子型脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG 2000的摩尔比为50:10:38.5:1.5。
为了制备多核苷酸溶液，将si-RNA多核苷酸(30μM)溶解在pH为3.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中。
为了制备脂质纳米颗粒，将多核苷酸溶液和脂质溶液在第一微混合器中混合(总流速10ml/min)。
混合后的产物在第二微混合器中与PBS缓冲液混合(总流速20ml/min)。
多核苷酸溶液:脂质溶液:缓冲液的相对体积流速为1：1：2。
将新鲜制备的脂质纳米颗粒用PBS缓冲液透析，以除去乙醇、交换缓冲液和未结合的siRNA。
附图标记列表：
1：第一容器；
2：第二容器；
3：微混合器；
4：微混合器的第一入口；
5：微混合器的第二入口；
6：微混合器的出口；
7：第一流体管线；
8：第二流体管线；
9、9’、9”：气体源；
10、10’、10”：贮液池；
11、11’、11”：流量调节器；
12：另外的微混合器；
13：第三容器；
14：另外的微混合器的第一入口；
15：另外的微混合器的出口
16：另外的微混合器的第二入口；
17：用于输送液体的装置(如磁力齿轮泵)；
18：超滤模块；
19：三通阀；
20：第三流体管线；
21：第四流体管线。

Claims (21)

1.一种制备含有脂质体的液体的连续方法，其包括以下步骤：
a)在第一容器中提供第一液体，其中第一液体包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成；
b)在第二容器中提供第二液体，其中第二液体包含水或由水组成；
c)将第一液体沿着第一流体管线引导至微混合器的第一入口中，并以流的形式引导到直至微混合器的出口；
d)将第二液体沿着第二流体管线引导至微混合器的第二入口中，并以与第一液体相邻的流的形式引导到直至微混合器的出口；
其中，第一液体和第二液体在微混合器内混合，使得在微混合器的出口处排出含有脂质体的液体；
其特征在于，将第一液体和第二液体引导至微混合器中并直至微混合器的出口是通过来自至少一个气体源的气体压力来进行的，任选地，其还通过至少一种用于输送液体的装置进行，其中调整液体的总流速使其在微混合器的出口处至少为10mL/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在第一液体和第二液体到达微混合器的出口的途中与其接触的所有表面
i)是无菌的；和/或
ii)是向外流体密封的，优选形成封闭的系统；和/或
iii)不具有能够收集残留物的区域；和/或
iv)不包含玻璃或不由玻璃组成。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个气体源
i)包含气体容器或由气体容器组成；和/或
ii)与第一容器具有第一流体连通，并且与第二容器具有第二流体连通；和/或
iii)含有不含氧的气体，其中气体优选地包含选自氮气、惰性气体、及其混合物的气体，或由选自氮气、惰性气体、及其混合物的气体组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，
i)通过气体源的恒定气体压力调整总流速，任选地还通过增加压力的装置调整总流速，所述压力为<12巴，优选<8巴，特别优选<6巴，最优选大于1巴至6巴，特别是1.5巴至5巴；和/或
ii)通过至少一个流量调节器，优选至少一个第一流量调节器和至少一个第二流量调节器使总流速保持恒定，其中特别优选地，至少一个第一流量调节器布置在第一流体连通处，并且至少一个第二流量调节器布置在第二流体连通处；和/或
iii)调整微混合器的出口处的总流速，使得总流速≥80mL/min，优选≥320mL/min，特别优选≥1280mL/min，最优选≥2800mL/min，特别是≥5120mL/min；和/或
iv)调整微混合器的出口处的总流速，使得总流速/微混合器的出口的横截面积≥20ml/(min·mm2)，优选≥100ml/(min·mm2)，特别优选≥200ml/(min·mm2)，最优选≥400ml/(min·mm2)，任选地≥1000ml/(min·mm2)，特别是100ml/(min·mm2)至400ml/(min·mm2)；和/或
v)调整总流速，使得第二液体的流速与第一液体的流速之比为<8:1，优选<7:1，特别优选<6:1，最优选<5:1，特别是≤4:1；和/或
vi)总流速的流速变化小于总流速的1％，优选小于总流速的0.1％；和/或
vii)配置总流速，使得流的雷诺数为>80至<1200，优选>120至<1000。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，微混合器
i)具有一个或多于一个斜向或横向延伸至流动方向的混合结构，优选地，所述结构适用于使第一液体和/或第二液体斜向或横向偏转至流动方向；和/或
ii)包含不锈钢或由不锈钢组成；和/或
iii)能够被高压灭菌；和/或
iv)能够被分离为至少两部分，用于清洗微混合器的流体通道；和/或
v)是“分裂和重组”微混合器或“StarLam”微混合器，其中微混合器优选“斜升/斜降”微混合器，特别优选“履带”型微混合器。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，第一液体
i)包含总浓度>30g/L、优选>50g/L、特别优选>80g/L、最优选>150g/L、特别是160g/L至400g/L的脂质；和/或
ii)包含至少一种磷脂，优选至少一种两性离子型磷脂，其中磷脂优选地选自磷脂酰胆碱、DSPC、DOPE、DOPC、DSPE、HSPC、及其混合物，其中至少一种磷脂或其混合物的浓度优选>20g/L，优选>40g/L，特别优选>80g/L，最优选>160g/L，特别是210g/L至400g/L；和/或
iii)包含至少一种PEG化的脂质，优选DSPE-PEG2000和/或DMG-PEG2000，其中相对于第一液体中至少一种磷脂的摩尔量，PEG化的脂质的浓度优选为15摩尔％至40摩尔％，特别优选31摩尔％至35摩尔％；和/或
iv)包含至少一种脂质，优选包含至少一种阳离子型脂质，优选选自DOTMA、DOTAP、DDAB、DODMA、及其混合物的至少一种脂质，其中至少一种脂质或其混合物的浓度优选>10g/L，优选>20g/L，特别优选>40g/L，最优选>80g/L，特别是90g/L至350g/L；和/或
v)包含至少一种类脂质，其中相对于第一液体中至少一种磷脂的摩尔量，类脂质的浓度优选为200摩尔％至1000摩尔％，特别优选300摩尔％至800摩尔％；和/或
vi)包含胆固醇；和/或
vii)不含有非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和/或两性表面活性剂，优选不含有任何表面活性剂；和/或
viii)包含至少一种有机溶剂或不包含有机溶剂，其中有机溶剂优选为有机的水溶性溶剂，特别优选选自醇类，特别优选乙醇、1-丙醇、2-丙醇和/或甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、二甲亚砜的溶剂，特别是乙醇；和/或
ix)是脱气的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，第二液体
i)包含缓冲物质，优选选自乙酸盐、铵盐、柠檬酸盐、及其组合的缓冲物质，特别优选乙酸钙和/或硫酸铵，其中缓冲物质的浓度优选为5mM至300mM，特别优选8mM至250mM；和/或
ii)是脱气的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，液体中的脂质体被装载至少一种活性物质，其中装载优选在第一微混合器中进行，在第一微混合器下游的另外的混合器中进行，在组装脂质体后进行和/或在纯化脂质体后进行，特别地，其中至少一种活性物质
i)包含至少一种有机活性物质或由至少一种有机活性物质组成，优选用于治疗疾病的活性成分，特别优选选自维生素、蛋白质、肽、脂质、DNA、RNA、质量≤500Da的有机分子、及其混合物的分子，特别是选自超疏水物质、siRNA、及其组合的物质；和/或
ii)包含至少一种无机活性物质或由至少一种无机活性物质组成，优选选自磁性物质、顺磁性物质、及其混合物的物质，特别优选氧化铁、氧化锰、及其混合物；
其中至少一种活性物质优选包含在第一液体、第二液体和/或另外的液体中，优选地，相对于脂质的总重量，至少一种活性物质的浓度为≥1重量％，优选5重量％至80重量％，特别优选10重量％至60重量％，特别是15重量％至30重量％。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)、b)和/或c)中，优选在步骤a)至c)中，温度被调整为>10℃至<70℃，优选15℃至40℃，特别优选22℃至30℃，特别是23℃至25℃。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在微混合器的出口处流出的液体中
i)脂质体是单层脂质体、多层脂质体、或其混合物；和/或
ii)脂质体的直径为20nm至<200nm或>200nm至<500nm，优选40nm至150nm或250nm至400nm，特别优选60nm至120nm或300nm至350nm，其中直径可以通过动态光散射和/或低温透射电子显微镜确定，优选通过低温透射电子显微镜测量；和/或
iii)相对于液体中所有脂质体的总数，单层脂质体占大于50％，大于70％或大于90％，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值为<0.200，优选≤0.150，特别优选≤0.100，最优选≤0.090，特别是≤0.075，或相对于液体中所有脂质体的总数，多层脂质体占大于50％，大于70％或大于90％，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值为<0.500，优选<0.300，其中PDI优选可以通过或通过根据标准DIN ISO 22412:2018-09的动态光散射确定。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在c)之后的另外的步骤中纯化液体，其中纯化优选包括以下步骤中的至少一个，所述纯化在步骤c)之后，优选连续进行：
i)进行超滤、凝胶过滤和/或蒸发，特别优选进行超滤，以富集脂质体；
ii)除去脂质体以外的物质，优选除去缓冲物质和/或有机溶剂；和
iii)用无菌渗透的糖溶液，优选无菌渗透的葡萄糖溶液或蔗糖溶液交换除脂质体以外的物质，其中无菌渗透的糖溶液特别优选包含4重量％至15重量％的糖，特别地，如果是葡萄糖溶液，无菌渗透的糖溶液包含4重量％至6重量％的葡萄糖，和/或如果是蔗糖溶液，无菌渗透的糖溶液包含9重量％至11重量％的蔗糖。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
i)将微混合器的出口处的含有脂质体的液体沿着第三流体管线，任选的留置回路，引导至另外的混合器的第一入口中，并以流的形式引导到直至另外的混合器的出口；和
ii)将来自第三容器的另外的液体沿第四流体管线引导至另外的混合器的第二入口中，并以与含有脂质体的液体相邻的流的形式引导到直至另外的混合器的出口；
其中混合另外的混合器内的含有脂质体的液体和另外的液体，使得在另外的混合器的出口处排出经改变的含有脂质体的液体；
其中通过来自至少一个气体源的气体压力，和/或通过至少一个用于输送液体的装置将含有脂质体的液体和另外的液体引导至另外的混合器中，其中调整液体的总流速使其在另外的混合器的出口处大于10mL/min，优选至少20mL/min。
13.一种用于制备含有脂质体的液体的装置，其包括
a)含有第一液体的第一容器，其中第一液体包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成；
b)含有第二液体的第二容器，其中第二液体包含水或由水组成；
c)具有第一入口、第二入口和出口的微混合器，其中第一容器通过第一流体管线与微混合器的第一入口连接，第二容器通过第二流体管线与微混合器的第二入口连接，其中微混合器被配置为允许第一液体和第二液体分别在微混合器内流动直至微混合器的出口，并在微混合器内混合，其中含有脂质体的液体在微混合器的出口处被排出；
d)至少一个气体源，以及任选的至少一个用于输送液体的装置；和
e)控制单元；
其特征在于，控制单元被配置为使第一液体和第二液体通过来自至少一个气体源的气体压力，任选地还通过至少一个用于输送液体的装置流入微混合器并直至微混合器的出口，其中调整液体的总流速使其在微混合器的出口处为至少10mL/min。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，在第一液体和第二液体到达微混合器的出口的途中与其接触的装置的所有表面
i)是无菌的；和/或
ii)是向外流体密封的，优选形成封闭的系统；和/或
iii)不具有能够收集残留物的区域；和/或
iv)不包含玻璃或不由玻璃组成。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的装置，其特征在于，装置和/或装置的控制单元被配置为执行根据权利要求1至12中任一项所述的方法。
16.一种含有脂质体的液体，其特征在于
i)液体中所有脂质体的大于50％、大于70％或大于90％是单层脂质体，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值<0.200，优选≤0.150，特别优选≤0.100，最优选≤0.090，特别是≤0.075；或
ii)液体中所有脂质体的大于50％、大于70％或大于90％是多层脂质体，并且就其尺寸分布而言，脂质体的PDI值<0.500，优选<0.300；
其中PDI优选通过根据标准DIN ISO 22412:2018-09的动态光散射确定。
17.根据权利要求16所述的液体，其特征在于所述液体能够通过根据权利要求1至12中任一项所述的方法制备。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的液体，其用于医药，优选用于对人体或动物体进行治疗的方法，特别优选地
i)用于施用活性成分，特别优选用于局部施用活性成分；和/或
ii)用于靶向活性成分；和/或
iii)用于释放活性成分；
在对人体或动物体进行手术或治疗的方法中，其中活性成分优选地选自疫苗、细胞抑制剂、肾上腺皮质激素、及其组合，(多柔比星和/或地塞米松)，并且治疗特别用于治疗癌症、炎症性疾病、免疫系统疾病和/或神经退行性疾病。
19.根据权利要求16或17中任一项所述的液体，其用于诊断方法，优选用于在人体或动物体上进行的诊断方法，特别是其中脂质体含有生物标志物的诊断方法。
20.根据权利要求16或17中任一项所述的液体
i)用于化妆品的用途；和/或
ii)作为食品的添加剂的用途。
21.根据权利要求16或17中任一项所述的液体
i)用于封装至少一种物质的用途，任选地在第一微混合器中，在另外的混合器中，在组装脂质体后和/或在纯化脂质体后；和/或
ii)用于靶向至少一种物质的用途；和/或
iii)用于释放至少一种物质的用途；和/或
iv)用于制备复合材料的用途；
其中至少一种物质优选包含至少一种有机活性物质和/或至少一种无机活性物质或由至少一种有机活性物质和/或至少一种无机活性物质组成，并且所述用途任选地为体外用途。
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