EP4243626A1 - Composition symbiotique comme additif d'alimentation pour les porcelets ou les truies et son utilisation - Google Patents

Composition symbiotique comme additif d'alimentation pour les porcelets ou les truies et son utilisation

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EP4243626A1
EP4243626A1 EP21815428.4A EP21815428A EP4243626A1 EP 4243626 A1 EP4243626 A1 EP 4243626A1 EP 21815428 A EP21815428 A EP 21815428A EP 4243626 A1 EP4243626 A1 EP 4243626A1
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EP
European Patent Office
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day
animal
probiotic
post
bifidobacterium
Prior art date
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Pending
Application number
EP21815428.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Ester AREVALO SUREDA
Véronique DELCENSERIE
Nadia EVERAERT
Jehan LIÉNART VAN LIDTH DE JEUDE
Elisa Martinez
Ahmed Sabri
Philippe Thonart
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ARTECHNO
Superbiotics
Original Assignee
Artechno
Aveve Biochem
Vesale Pharmaceutica
University of Liège
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Artechno, Aveve Biochem, Vesale Pharmaceutica, University of Liège filed Critical Artechno
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system

Definitions

  • the present invention relates to a symbiotic composition for the treatment or prevention of dysbiosis in suckling and/or post-weaning piglets.
  • Intestinal dysbiosis is an imbalance of the intestinal microbiota that can generate an overgrowth of pathogens (eg E. coli) causing diarrhea.
  • the microbiota is defined as all the microorganisms present in a given environment (definition from the Quebec office of the French language, 2008). This particular environment is called the microbiome.
  • the imbalance of the intestinal microbiota results in a reduction in the diversity of bacterial populations and an excess of pathogenic bacteria in the microbiota.
  • a microbiota that is balanced in the distribution of the species of microorganisms that compose it is said to be in eubiosis.
  • the meat production sector is growing rapidly in the world, pork production is increasing steadily and represents one of the largest consumers of antibiotics in animal production.
  • weaning stopping breastfeeding and switching to dry feed
  • weaning is a period associated with a risk for young animals.
  • a recurring problem when weaning animals is the increased risk of diarrhea resulting from the abrupt transition in diet. This abrupt transition can lead to intestinal dysbiosis.
  • Diarrhea can lead to weight loss, even death of the newborn in severe cases. Routine treatment as well as prophylactic procedures applied for diarrhea detected just after the birth of the piglet are often not very effective.
  • This transition period also generates in the animal, in particular in the piglet, a significant stress at the behavioral, nutritional and environmental level, responsible for a strong reduction in food consumption. It is therefore crucial to control this risk of diarrhea because it causes a considerable loss for breeders since it is often associated with a high mortality rate, weight loss, stunted growth, and treatment-related costs.
  • a combination of at least one probiotic with at least one prebiotic is called a synbiotic, when the prebiotic acts as a substrate in synergy with the probiotic to provide a positive effect on health, in particular on digestion.
  • the digestion of proteins, sugars and fats in monogastric individuals, and in particular in pigs and poultry, is based first on digestion taking place in the stomach, which constitutes an acid environment leading to denaturation of the macromolecules to form a digesta.
  • the digesta then arrives in the intestine and again undergoes hydrolysis there by the action of the pancreatic juice which contains several proteases and by the action of aminopeptidases and intestinal dipeptidases.
  • probiotics include various microorganisms such as bacteria Bacillus coagulons, Bacillus subfilis, Bifidobacterium animalis lacfis, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium thermophilum, Clostridium butyricum, Enterococcus faecium, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium mongoliense, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus akajohnsonii, Bifidobacterium longei, Collins , Pediococcus acidilacticiici, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseb
  • probiotic bacteria are those of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium. Probiotics also include yeasts such as Saccharomyces boulardii (Sanders ME, “Probiotics, strains matter”, Functional foods & nutraceuticals magazine, 2007, 36-41).
  • Prebiotics are substrates selectively utilized by host microorganisms that selectively stimulate the growth or activity of desirable microorganisms (Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017, 14, 491-502, https://doi.org/!0.1038/nrgastro.2017.75).
  • prebiotics include, among others, inulin, beta-glucan, 2'-Fucosyllactose (2FL), oligosaccharides such as galactooligosaccharides (GOS), fructooligosaccharides (FOS), mannanoligosaccharide (MOS), xylooligosaccharide (XOS) , polyunsaturated fatty acids (polyunsaturated fatty acid: PUFA), conjugated linoleic acid (CLA).
  • inulin beta-glucan
  • oligosaccharides such as galactooligosaccharides (GOS), fructooligosaccharides (FOS), mannanoligosaccharide (MOS), xylooligosaccharide (XOS)
  • polyunsaturated fatty acids polyunsaturated fatty acid: PUFA
  • CLA conjugated linoleic acid
  • a formulation combining at least one probiotic in combination with at least one prebiotic to prevent and treat bacterial infections that can lead to diarrhea, increase the weight of the animal and promote growth is known from document WO2014049023.
  • the document WO2014049023 describes products and compositions which can be beneficial in breeding. Said products and compositions described therein comprise microorganisms, such as bacteria, in particular probiotic bacteria.
  • the strains, as well as the compositions comprising them, can be administered to animals, preferably to farm animals, such as pigs. The administration can take place in the first days of life. According to this document, the administration of the products or compositions promote animal growth and animal weight gain. Bacterial infections can also be prevented or treated by said compounds or compositions.
  • compositions comprising at least 2 probiotics is suitable for treating diarrhea in newborn (unweaned) piglets.
  • a composition comprising Lactobacillus reuteri and Enterococcus faecium makes it possible to reduce diarrhoea, to increase the average daily gain in weight gain and to reduce the mortality of the newborn piglet.
  • WO2018002671 discloses a composition for the treatment and/or nutrition of poultry such as broilers comprising (i) a commensal probiotic chosen from Bifidobacterium animalis, Collinsella tanakaei, Lactobacillus reuteri, Anaerostipes, Lactobacillus crispatus, Pediococcus acidilacticiici, Lactobacillus pontis , Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes butyraticus, Butyricicoccus, Lactobacillus johnsonii and Ruminococcus sp.; and (ii) a prebiotic.
  • This document also discloses the use of such a composition for the treatment of enteric diseases in poultry, such as necrotic enteritis.
  • the document WO2006133472A1 relates to a food additive and/or additive for animal or human drinking water promoting the health or the growth of probiotics. This document also relates to a use of the human and animal food additive and/or drinking water, in particular for the prevention of the harmful effect of a certain number of undesirable germs in the digestive system of animals and/or domestic birds.
  • the document WO2017156548A1 relates to certain foods comprising a fermentable nutritional component and a probiotic component, where the probiotic component is selected, on the basis of genetic and/or metabolic criteria, to specifically metabolize any free sugar monomer (Free Sugar Monomers (FSM )) or any free amino acid (Free Amino Acids (FAA)) or peptide that accumulate in the small and large intestines due to the fermentable nutritional component, which without this metabolization would be fermented and metabolized by bacteria less adaptive/opportunistic, creating blooms of deleterious gut bacteria and shifting the microbiome to a potential state of dysbiosis.
  • FSM Free Sugar Monomers
  • FAA Free Amino Acids
  • compositions comprising several probiotics will have an advantageous effect in combating dysbiosis compared to compositions comprising a single probiotic.
  • compositions comprising several probiotics have the disadvantage of being less simple and more expensive to produce industrially.
  • Interventions at the end of the sow's gestation and/or from the birth of the piglet should allow, by the principle of early programming, to influence in an optimal and lasting way the good development of the microbiota of the newborn. Consequently, the positive effects for the animal's health would not only be observed at the start of life and during the 3-4 weeks after weaning, but they would also remain observable throughout adult life.
  • the first intestinal colonization of the piglet by the maternal microbiota at the time of farrowing is crucial for the establishment of a favorable intestinal microbiota of the newborn, but the composition of the microbiota can be influenced by many factors such as antibiotics, food, environment, infectious agents, etc.
  • Bifidobacterium crudilactis as a probiotic, and one or more prebiotics, this composition being to be administered to a pregnant or lactating sow, and/or to a nursing and/or post-weaning piglet, to promote an anti -inflammatory in the intestine of said suckling and/or post-weaning piglet, with the aim of improving the health conditions of the newborn.
  • the present invention therefore aims to provide a symbiotic formulation which has an effect which is maintained over time by acting specifically on the modulation of the microbiota in an early manner, thus promoting intestinal eubiosis in a reliable manner.
  • the present invention aims to provide a simple symbiotic formulation (symbiotic composition) with a determined main probiotic, which facilitates the production and verification of production batches. Indeed, the industrial production of a simple, minimal symbiotic composition will be easier, faster, and will be economically more profitable than the production of a symbiotic composition comprising, for example, several probiotics.
  • the symbiotic formulation according to the present invention making it possible to modulate the microbiota of the fetus in a pregnant or newborn animal will make it possible to have a maximum prophylactic effect and will ensure optimal growth and development of the animal.
  • the formulation according to the present invention promotes a healthy intestinal flora which thus protects the animal which ingests it, in particular when the latter is ingested by the pregnant female by the generation demonstrated and reproducible of an onti-inflammatory environment donations the stomach and/or the intestine, and this in a systematic way.
  • the symbiotic formulation according to the present invention provides an effective solution against dysbiosis and the problem of diarrhea occurring during weaning, of which the probiotic and the prebiotic(s) are chosen specifically not only on cell viability, but for their associated effects on the cell viability and on the anti-inflammatory response of the host microbiota.
  • the symbiotic formulation containing a probiotic and at least one prebiotic produces a reduction in the production of IL-8 in an in vitro test, and an increase in short chain fatty acids "Short Chain Fatty Acids, SCFAs” as well as an improvement in the diversity and quantity of endogenous bacterial populations such as Lactobacillus and bitidobacteria as well as bacteria involved in the metabolic pathways for the production of butyrate or other short-chain fatty acids.
  • the probiotic and the prebiotic(s) together form a balanced gut microbiota, thereby leading to the generation together of an anti-inflammatory environment in the digestive system of the animal, in particular of the mammal, in particular pigs, preferably pregnant animals and newborns, in particular pregnant or non-pregnant sows and piglets.
  • SCFA Short Chain Fatty Acids
  • SCFAs can also reduce the pro-inflammatory response of gut epithelial cells (Iraporda C. et al., Immunology, 2015 10:1161-1169. https://doi.org/10.1016/j.imbio.2015.06. 004).
  • the symbiotic formulation according to the present invention promotes the establishment of a balanced intestinal microbiota very early, protecting the pregnant pig or animal or even the newborn, more particularly the pregnant sow or the piglet in a sustained manner against dysbiosis by the probiotic and the prebiotic it contains, which together generate an anti-inflammatory environment.
  • composition according to the invention is characterized in that the therapeutically or preventively effective amount of probiotic for the treatment or prevention of dysbiosis is an amount of probiotic for
  • the therapeutically or preventively effective quantity for reducing diarrhea in suckling and/or post-weaning piglets is a quantity of probiotic according to which the quantity of soft and/or liquid stools produced by said suckling and/or post-weaning piglet is smaller than the quantity of soft and/or liquid stools produced by a control piglet during the same period of time and at the same stage of development.
  • the quantity therapeutically or preventively effective for increasing the growth of the suckling and/or post-weaning piglet is a quantity of probiotic according to which a) a weight of said suckling and/or post-weaning piglet is higher relative to the weight of a control piglet at the same stage of development and for the same period of time and/or b) a non-pathological growth curve said nursing and/or post-weaning piglet is above, for at least two days, a growth curve of a control piglet for the same period of time at the same stage of development.
  • said one or more prebiotics is chosen from the group consisting of inulin, beta-glucan, 2' Fucosyllactose, GOS/FOS (galacto-oligosaccharide, fructo-oligosaccharide) , resistant starch and mixtures thereof.
  • Bifidobacterium thermophilum comes from the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) listed under number 18892, Enterococcus faecium (LMG S-28935), Bifidobacterium animalis lactis is a strain deposited at the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) having the deposit number LMG P-28149, Clostridium butyricum (LMG1217), Bifidobacterium crudilactis is a strain deposited at the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM, Institut Pasteur) having the deposit number ( CNCM 1-3342) as part of document WC2006122850.
  • the therapeutically or preventively effective amount of probiotic is between 1.00E+05 and 1.00E+015 CFU/day/animal, preferentially between 1.00E+06 and 1.
  • 00E+013 CFU/day/animal advantageously between 1.00E+07 and 1.00E+011 CFU/day/animal.
  • an amount of said one or more prebiotics is between 0.1 and 1000 g/day/animal, preferentially between 0.5 and 100 g/day/animal, advantageously between 1 and 25 g/day/animal.
  • said probiotic consists for at least 80% by weight of a single probiotic chosen from the group consisting of (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, and (iv) Bifidobacterium crudilactis.
  • said probiotic consists for at least 85%, even more preferentially for at least 90%, advantageously for at least 95%, advantageously for at least 99%, 100% by weight of a single probiotic selected from the group consisting of (i) Enterococcus taecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, and (iv) Bifidobacterium crudilactis.
  • composition according to the invention is characterized in that it comprises a single probiotic chosen from the group consisting of (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, and (iv) Bifidobacterium crudilactis.
  • the composition according to the invention is in the form of a combination comprising said probiotic in a therapeutically or preventively effective amount and said one or more prebiotics, the combination being chosen from the group consisting of Bifidobacterium crudilactis and beta-glucans, Bifidobacterium crudilactis and inulin , Bifidobacterium crudilactis and 2'fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis and GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis and resistant starch, Bifidobacterium animalis lactis and 2'fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis and inulin, Bifidobacterium animalis lactis and beta-glucans, Bifidobacterium animalis lactis and GOS /FOS, Bifidobacterium animalis lactis and resistant starch, Clostridium butyricum and
  • the combination is preferentially chosen from the group consisting of Clostridium butyricum and inulin, Clostridium butyricum and GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis and inulin, Bifidobacterium animalis lactis and 2′fucosyllactose, Enterococcus taecium and beta -glucans, and Bifidobacterium crudilactis and beta-glucans, so as to allow a daily probiotic dosage of between 1.00E+05 and 1.00E+015 CFU/day/animal, preferably between 1.00E+06 and L00E+013 CFU/day/animal, advantageously between 1.00E+07 and 1.00E+01 1 CFU/day/animal, and a daily prebiotic dosage of between 0.1 and 1000 g/day/animal, preferably between 0 5 and 100 g/day/animal, advantageously between 1 and 25 g
  • a symbiotic composition comprising for example Bifidobacterium crudilactis and beta-g lucanes, or comprising Bifidobacterium animalis lac fis and 2'fucosyllactose or comprising Clostridium butyricum and GOS/FOS or also comprising Enterococcus faecium and beta-g lucanes has shown a synergistic capacity to create an anti-inflammatory environment, by reducing the presence of IL-8, by increasing the production of short-chain fatty acids and promoting the growth of bacterial populations favorable to the microbiota.
  • composition according to the invention contains at least one conventional excipient, in liquid or solid form.
  • the composition according to the invention is characterized in that said probiotic and/or said one or more prebiotics and/or said at least one conventional excipient are in encapsulated form(s) and/or in powder form and/or in the form of granules and/or in liquid form. Said probiotic and said one or more prebiotics of the composition are administered simultaneously, separately or staggered over time.
  • the therapeutically or preventively effective amount provides treatment or prevention of dysbiosis for a period of time, counted from the day of birth of said piglet, greater than 3 days, preferably greater than 5 days, even more preferably greater than 15 days, favorably over 50 days, even more favorably over 100 days.
  • the composition according to the present invention can generate a persistence effect to treat or prevent dysbiosis in piglets.
  • the treatment or prevention of piglet dysbiosis may be favored even when the piglet is at the post-weaning stage.
  • the composition according to the invention is administered to a pregnant sow for the treatment or prevention of dysbiosis in suckling and/or post-weaning piglets.
  • the composition according to the invention is administered to a suckling sow for the treatment or prevention of dysbiosis in suckling piglets and/or post-weaning.
  • the composition according to the invention is administered to a suckling piglet for the treatment or prevention of piglet dysbiosis in breastfeeding and/or post-weaning.
  • composition according to the invention is administered to a pregnant and/or lactating sow and/or to a lactating piglet for the treatment or prevention of dysbiosis in the piglet during lactation and/or post-weaning. .
  • the therapeutically effective amount for the treatment or prevention of dysbiosis is a therapeutically or preventively effective amount of probiotic to increase the production of mucus in the intestine of said suckling and/or post-weaning piglet according to which an amount of goblet cells (goblet cells) in the intestine of said suckling and/or post-weaning piglet is greater than the quantity of goblet cells in the intestine of said control piglet at the same stage of development.
  • the therapeutically effective amount for the treatment or prevention of dysbiosis is a therapeutically or preventively effective amount of probiotic for increasing the absorption capacity of the intestinal villi of suckling and/or post-weaning piglets according to which
  • a ratio between the depth of the intestinal villi and the height of the intestinal crypts in the intestine of said suckling and/or post-weaning piglet is greater than the ratio between the depth of the intestinal villi and the height of the intestinal crypts in the intestine of a control piglet at the same stage of development, and/or
  • a thickness of the intestinal lamina basement membrane in the intestine of said suckling and/or post-weaning piglet is greater than the thickness of the intestinal lamina basement in the intestine of a control piglet at the same stage of development, and/or
  • the therapeutically effective quantity for the treatment or prevention of dysbiosis is a quantity of probiotic according to which the concentrations of endogenous bacterial populations favorable to the intestinal microbiota such as lactobacillus and bifidobacteria are increased in the suckling piglet and/or in post-weaning compared to the concentrations of endogenous bacterial populations favorable to the intestinal microbiota of the control piglet at the same stage of development.
  • this increase in population concentrations bacteria generates a better balance of the host's intestinal microbiota, reducing the risk of intestinal dysbiosis.
  • the therapeutically effective amount for the treatment or prevention of dysbiosis is a therapeutically effective amount of probiotic according to which the concentration of IL-8 is reduced by at least 10% in the intestine of the piglet in suckling and/or post-weaning relative to the concentration of IL-8 in the intestine of the control piglet at the same stage of development, said reduced concentration of IL-8 forming said anti-inflammatory environment.
  • the concentration of IL-8 was measured by means of in vitro tests on IPEC_J2 cells in the presence of the fermentation juice (containing or not containing the symbiotic composition to be tested).
  • the symbiotic composition is preferably characterized in that the therapeutically effective amount for the treatment or prevention of dysbiosis is a therapeutically effective amount according to which the secretion of short-chain fatty acids (SCFA's ) by the intestinal microbiota of a suckling and/or post-weaning piglet and/or of intestinal cells in vitro, is stabilized or increased compared to the secretion of short-chain fatty acids of a control piglet and/or or control intestinal cells in vitro.
  • SCFAs produced during the fermentation process of the microbiota are an indicator of the balance and growth of the microbiota.
  • SCFAs have a multiple beneficial role in the intestine: butyrate, in particular, has a regulatory role in the transport of transepithelial fluid. It also improves the oxidative state and inhibition of inflammation of the intestinal mucosa, it strengthens the epithelial defense barrier, it modulates visceral sensitivity and intestinal motility (Canani, R. B. et al. World J. Gastroenterol., 2011, 17:1519-1528, doi:10.3748/wjg.v17.i12.1519).
  • said SCFAs are chosen from butyrate, propionate, acetate, lactate or combinations thereof.
  • the production of said SCFAs is measured using the in vitro static fermentation model detailed in more detail below.
  • the synbiotic composition can contain more than 1 probiotic, for example 2 probiotics, or for example 3 probiotics, or for example 4 probiotics or for example 5 probiotics.
  • the symbiotic composition may also contain more than 1 prebiotic, for example 2 prebiotics, or for example 3 prebiotics, or for example 4 prebiotics.
  • Other embodiments of the symbiotic composition according to the invention are indicated in the appended claims.
  • the present invention also relates to a food supplement which can be administered to pregnant or non-pregnant sows and to piglets for the preventive and/or curative treatment of intestinal dysbiosis.
  • Said food supplement comprising said composition
  • the present invention also relates to a complete or complementary feed for farm animals comprising said composition, said feed being in the form of flour and/or granules and/or milk feeds and/or any other forms of food packaging. .
  • the present invention further relates to a food for newborn animals comprising said composition according to the present invention and a milk base compatible with the diet of the newborn.
  • the present invention also relates to a use of the composition to be administered to a pregnant or lactating sow, and/or to a suckling and/or post-weaning piglet for the treatment or prevention of dysbiosis in suckling and/or post-weaning piglets in which the therapeutically or preventively effective amount of probiotic is between 1.00E+05 and L00E+015 CFU/day/animal, preferably between 1.00E+06 and 1.
  • the amount of prebiotic is between 0.1 and 1000 g/day/animal, preferably between 0.5 and 100 g/day/animal, advantageously between 1 and 25 g/day/animal, the probiotic and the prebiotic of the composition being administered simultaneously, separately or staggered over time.
  • the present invention also relates to a use of the aforedescribed symbiotic composition, for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of dysbiosis in suckling and/or post-weaning piglets to be administered to a pregnant or lactating sow , and/or to a suckling and/or post-weaning piglet.
  • the present invention finally relates to a method for treating or preventing dysbiosis in suckling and/or post-weaning piglets, comprising administration of the composition according to the invention to a pregnant or non-pregnant sow, for example a sow lactating piglet, and/or suckling piglet and/or post-weaning piglet.
  • a pregnant or non-pregnant sow for example a sow lactating piglet, and/or suckling piglet and/or post-weaning piglet.
  • Figure 1 shows the schematic of the experimental device of the BabySPIME system (Dufourny S. et al. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735. https://doi.Org/10.1016/j.mimet.2019). Compartment 1:
  • FIG. 2 illustrates the level of IL-8 production (pg/ml) by IPEC-J2 cells.
  • the IPEC-J2 cells were brought into contact with a fermentation juice coming from a fermentation with only a prebiotic: GOS/FOS (GF) or Inulin (Inu) or 2'FL (2FL) or beto-glucone (BG) or resistant starch (RS), or else originating from a fermentation during which a composition combining a prebiotic and a probiotic according to the invention was tested.
  • the results show the mean of the level of IL-8 production +/- the standard deviation.
  • the horizontal line corresponds to the level of IL-8 in the control condition (blank-mucin).
  • BCO Bacillus coagulons
  • BT Bifidobacterium thermophilum
  • CB Clostridium butyricum
  • EF Enterococcus faecium
  • BAL Bifidobacterium animalis lactis, BCU; Bifidobacterium crudilactis
  • BMC Bifidobacterium mongoliense, LP; Lactobacillus plantarum.
  • Figure 3 shows a time series indicating the accumulation of gas production in a batch in vitro fermentation (in vitro static fermentation) of a prebiotic alone or in combination with a probiotic (symbiotic).
  • the in vitro batch fermentation of the symbiotic combination is carried out with 1.00E+07 CFU/ml of probiotic and 0.1 g of prebiotic (same quantity in the condition where the prebiotic is present alone), in the presence of an inoculum of 3 % in faeces.
  • the results indicate the mean (ml/g of substrate) +/- the standard deviation of 3 experimental replicates.
  • GF GOS/FOS
  • Inu inulin
  • 2FL 2'FL
  • BG beta-glucan
  • resistant starch RS.
  • BCO Bacillus coagulons
  • BT Bacillus coagulons
  • CB Clostridium butyricum, EF
  • Enterococcus faecium BAL
  • Bifidobacferium animalis lactis BCU
  • Bifidobacferium crudilactis BMC
  • Bifidobacferium mongoliense LP
  • Figure 4 shows the relative abundance of groups of bacteria beneficial for intestinal eubiosis at 24 hours after the start of the batch in vitro fermentation (in vitro static fermentation) in the presence of the prebiotic alone or in the presence of symbiotic combinations (prebiotic + probiotic).
  • Beneficial bacteria groups selected include bifidobacteria, lactobacilli, Clostridium cluster IV, Clostridium cluster XlVa and the butyryl-CoA:acetyl-CoA transferase gene.
  • the qPCR 2 ⁇ (- ⁇ Ct) measurement method was used to establish the relative abundance, the measurements were normalized to the total bacteria and a mixture of DNA samples from all extracts was used as a calibrator.
  • the in vitro fermentation, in an individual fermenter, of the symbiotic combinations was carried out at L00E+07 CFU/ml of probiotic and 0.1 g of prebiotic (same quantity for the condition with the prebiotic alone), in the presence of 3% of a faeces inoculate.
  • the results indicate the mean (ml/g of substrate) +/- the standard deviation of 3 experimental replicates.
  • the statistical significance was analyzed by a one-way ANOVA test with a Dunnett type multiple comparison and where * corresponds to p ⁇ 0.05, ** to p ⁇ 0.01, *** to p ⁇ 0.01, and **** to p ⁇ 0.0001.
  • GF GOS/FOS
  • Inu inulin
  • 2FL 2' FL
  • BG beta-glucan
  • resistant starch RS.
  • BCO Bacillus coagulons
  • BT Bifidobacterium thermophilum
  • CB Clostridium butyricum
  • EF Enterococcus faecium
  • BAL Bifidobacterium animalis lactis
  • BCU Bifidobacterium crudilactis
  • BMO Bifidobacterium mongoliense
  • LP Lactobacillus plantarum.
  • Figure 5 shows the ability of the probiotic to survive and establish in a complex microbial community.
  • Figure 5 shows the relative abundance of each probiotic compared to the total bacteria at 12 h, 24 h and 48 h after the start of fermentation for different symbiotic compositions. The relative abundance of each probiotic is normalized to the relative amount of probiotic obtained in the sample where only the probiotic was added.
  • GoF GOS/FOS
  • Inu inulin
  • 2FL 2' FL
  • BG beta-glucan
  • resistant starch RS.
  • BCO Bacillus coagulons
  • BT Bacillus coagulons
  • CB Clostridium butyricum, EF
  • Enterococcus faecium BAL
  • Bifidobacferium animalis lactis LP
  • Lactobacillus plantarum Bacillus coagulons
  • FIG. 6 shows the evolution of the bacterial population between the end of the stabilization period and the end of the week of treatment: The results are shown with the following symbiotic compositions Enterococcus faecium (EF)+beta-glucan (BG); Bifidobacferium thermophilum (BT) + inulin (Inu); Clostridium butyricum (CB) + GOS/FOS (G/F); Bifidobacferium animalis lactis (BAL) + 2' FL (2FL); Bifidobacferium crudilactis (BG) + beta-glucan (BG); and the control condition.
  • EF Enterococcus faecium
  • BT Bifidobacferium thermophilum
  • Inu inulin
  • CB Clostridium butyricum
  • BAL Bifidobacferium animalis lactis
  • BAL Bifidobacferium crudilactis
  • BG beta-glu
  • FIG. 7 shows the impact of a symbiotic composition comprising Bifidobacterium thermophilum and inulin on the production of volatile fatty acids (VFA), SCFA, between the end of the stabilization period and the end of the week of treatment.
  • VFA volatile fatty acids
  • FIG. 8 shows the impact of a symbiotic composition comprising Bacillus animalis lactis and 2′ FL on the production of volatile fatty acids (VFA), SCFA, between the end of the stabilization period and the end of the week of treatment.
  • VFA volatile fatty acids
  • FIG. 9 shows the impact of a symbiotic composition comprising Bacillus crudilactis and beta-glucan on the production of volatile fatty acids (VFA), SCFA, between the end of the stabilization period and the end of the week of treatment.
  • VFA volatile fatty acids
  • FIG. 10 shows the impact of a symbiotic composition comprising Enterococcus faecium and beta-glucan on the production of volatile fatty acids (VFA), SCFA between the end of the stabilization period and the end of the week of treatment.
  • VFA volatile fatty acids
  • the present invention relates to a symbiotic composition
  • a symbiotic composition comprising a therapeutically or preventively effective amount of (i) Enterococcus faecium, or (ii) Bifidobacterium animalis lactis, or (iii) Clostridium butyricum, or (iv) Bifidobacterium crudilactis, as a probiotic, and one or more prebiotics.
  • the symbiotic formulation containing a probiotic and a prebiotic produces a reduction in the production of IL-8 in an in vitro test, and a stabilization or an increase in “Short Chain Fatty Acids, SCFAs » as well as an improvement in the diversity and quantity of endogenous bacterial populations such as Lactobacillus, bifidobacteria, Clostridium clusters IV and XlVa as well as bacteria involved in the metabolic pathways of butyrate production, forming a balanced intestinal microbiota, leading in this way to generation of an anti-inflammatory environment in the digestive system of suckling and/or post-weaning piglets.
  • the symbiotic formulation according to the present invention promotes the establishment of a balanced intestinal microbiota very early, protecting the pregnant animal or even the newborn, more particularly the pregnant sow or piglet sustainably against dysbiosis with the help of the probiotic and prebiotic it contains, which together generate an anti-inflammatory environment.
  • the combination is chosen from the group consisting of Clostridium butyricum and inulin, Clostridium butyricum and GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis and inulin, Bifidobacterium animalis lactis and 2'fucosyllactose, Enterococcus faecium and beta-glucans, and Bifidobacterium crudilactis and beta- glucans, so as to allow a daily dosage of probiotic of between 1.00E+05 and 1.00E+015 CFU/day/animal, preferably between 1.00E+06 and 1.00E+013 CFU/day/animal, of advantageously between 1.00E+07 and 1.00E+011 CFU/day/animal, and a daily prebiotic dosage of between 0.1 and 1000 g/day/animal, preferably between 0.5 and 100 g/day/ animal, advantageously between 1 and 25 g/day/animal.
  • the probiotic consists for at least 80% by weight of a single probiotic chosen from the group consisting of (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, and ( (iv) Bifidobacterium crudilactis.
  • the composition comprises a single probiotic chosen from the group consisting of (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, and (iv) Bifidobacterium crudilactis.
  • the therapeutically or preventively effective amount of probiotic is between 1.00E+05 and L00E+015 CFU/day/animal, preferably between 1.00E+06 and L00E+013 CFU/day/animal, advantageously between 1.00E+07 and 1.00E+01 1 CFU/day/animal.
  • the amount of said one or more prebiotics is between 0.1 and 1000 g/day/animal, preferably between 0.5 and 100 g/day/animal, advantageously between 1 and 25 g/day/animal.
  • in vitro fermentation was carried out in flasks containing 15 ml of a solution containing 3% pre-weaning piglet faeces; three mucin-coated media previously immersed in mucin agar; 100 mg of prebiotic and 1.00E+07 CFU / ml of probiotic. Sealed vials were incubated at 39°C with shaking for 48 h in a water bath. Three replicates were performed per test condition.
  • the gas pressure was measured 2, 5, 8, 12, 16, 20, 24 and 48 h after the start of fermentation to determine the kinetics of fermentation using the monophasic mathematical model of Groot et al. Animal Feed Science and Technology 1996, 64, 77-89. https://doi.org/10.1016/S0377-8401(96)01012-7.
  • A maximum gas volume, ml/g substrate
  • B time to reach A/2, h
  • C constant determining the slope of the inflection point of the profile
  • Rmax rate fermentation, ml/g of substrate/hour
  • Tmax time to reach Rmax (h)).
  • Lactate and short chain fatty acids were measured in the fermentation juice obtained after 24 hours by isocratic HPLC.
  • the standard curve used contained acetate, propionate, butyrate as well as branched chain fatty acids (BCFA): isobutyrate, valerate and isovalerate.
  • the SCFA measurement was then calculated taking into account the basal production in the control-mucin flasks containing the microcosm carriers with mucin.
  • the values are given in mmol per g of substrate and compared to measurements in the fermentation juice containing only the corresponding prebiotic.
  • Bacteria belonging to the lactobacillus group are targeted using the primers described in Wang R. F. et al. Appl Environ Microbiol 1996, 62, 1242-1247, doi: 10.1 128/AEM.62.4.1242-1247.1996.
  • the bacteria belonging to the bifidobacterium group are targeted using the primers described in Langendijk P. S. et al. Appl Environ Microbiol 1995, 61, 3069-3075, doi:10.1128/AEM.61.8.3069-3075.1995.
  • the bacteria forming part of the clostridium cluster IV group are targeted using the primers described in Matsuki T. et al. Appl Environ Microbiol 2004, 70, 7220-7228, doi: 10.1 128/AEM.70.12.7220-7228.2004.
  • the bacteria forming part of the clostridium cluster XlVa group are targeted using the primers described in Matsuki T. et al. Appl Environ Microbiol 2002, 68, 5445-5451, doi:10.1128/aem.68.11.5445-5451.2002.
  • Butyril-CoA:acetate-CoA transferase is targeted using the primers described in Uerlings J. et al. J Sci Food Agric 2019, 99, 5720-5733, doi: 10.1002/isfa.9837.
  • the IPEC-J2 line intestinal enterocytes isolated from the jejunum of a newly born and non-breastfed piglet (or fed with a milk formulation) and belonging to a cell line neither transformed nor tumorigenic
  • the IPEC-J2 line was incubated in the fermentation juice produced by the symbiotic combination to be tested or containing only the prebiotic in question for 24 hours. Following this incubation period, the immune response is evaluated by the production of induced cytokines (IL-8, IL-6, IL-1 b) and TNF-alpha.
  • the cytotoxicity of the fermentation juices on the IPEC-J2 cells was evaluated because, in order to be able to observe an immune response, it is important that the cell line remains viable.
  • the effect of the different concentrations of fermentation juice, previously filtered at 0.8 ⁇ m, on the viability of the IPEC-J2 cells was measured by the MTT test (MTT tetrazolium salt: 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium), which is a colorimetric test for counting viable cells.
  • MTT test MTT tetrazolium salt: 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
  • the concentration of IL-8 was measured using in vitro tests on IPEC-J2 cells in the presence of the fermentation juice (containing or not containing the symbiotic composition to be tested) (see Figure 2 ) .
  • a test was carried out comparing the concentrations of IL-8 (the other markers IL-6, IL-1 b and TNF-alpha were not detected) produced in the presence of the fermentation juice in different conditions: control-mucin (horizontal line in Figure 2), prebiotics alone (GOS/FOS (GF), 2FL, Inulin (Inu), resistant starch (RS) and (3-glucan (BG)) conditions, and symbiotic ( other conditions in Figure 2.
  • This assay indicates that if the level of IL-8 is lower in the presence of the fermentation juice containing the prebiotic or symbiotic composition compared to the control fermentation juice-mucin, it shows an anti-inflammatory effect. the presence of the pre- or symbiotic.
  • the level of IL-8 is lower in the presence of the fermentation juice containing the symbiotic composition compared to the fermentation juice containing only the prebiotic, this shows that the specific combination of said au at least one probiotic with said at least one prebiotic has an additional anti-inflammatory effect compared to the prebiotic alone.
  • the cell viability of the synbiotics was taken into account to adjust the concentrations of IL-8.
  • the level of expression of IL-8 is determined by ELISA (Porcine IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA kit DY535: R&D Systems).
  • the BabySPIME model is a scientifically validated model (Dufourny S. et al. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735. https://doi.Org/10.1016/j.mimet.2019) that simulates physiological dynamics and conditions of a complete gastrointestinal tract in piglets in an in vitro environment (equipment derived from the SHIME model of ProDigest Bvba, Gent, Belgium).
  • the model includes 2 times 3 reactors that sequentially simulate the stomach (acid condition and digestion by pepsin), the ileum (process of enzymatic digestion) and the proximal colon (process of fermentation by microbiota) (see Figure 1 ).
  • This system makes it possible to obtain complex and stable microbial communities whose function and structure are strongly similar to the microbial communities found in the different regions of the intestine.
  • Peristaltic pumps allow the transfer of culture medium, pancreatic juice, bile, acid (0.5M HCl), base (0.5M NaOH) and fermentation liquids from one reactor to another during a complete cycle.
  • reactor 1 simulates the functions of the stomach, duodenum and jejunum
  • reactor 2 simulates the functions of the ileum
  • reactor 3 simulates the functions of the proximal colon.
  • a full trial in the babySPIME system lasts 3 weeks: 2 weeks of microbiota stabilization followed by a week of treatment with the symbiotic composition.
  • a solution of 1.00E+08 CFU/ml was prepared to inoculate a final dose of 1.00E+07 CFU/ml of intestinal contents.
  • the dose of prebiotic is 2 g of prebiotic/day to reach a concentration of 1% of the diet.
  • the faeces of 6 suckling 27-day-old piglets that had not undergone antibiotic treatment were used to prepare the inoculum for the study. Faeces were collected directly from the piglets and kept on ice under anaerobic conditions. For each test, the inoculum was then homogenized for 10 minutes by adding the faeces of each piglet to a phosphate buffer solution under anaerobic conditions. After macroscopic filtration to eliminate the particles still in suspension, the filtrate was injected simultaneously into reactors 2 and 3. Before inoculation, these two reactors were filled with a non-acidified culture medium and the pH was automatically adjusted in each reactor so as to best simulate the physiological conditions.
  • the culture medium was prepared and validated beforehand. Bottles of medium were stored at 4°C and the pH was adjusted to 3.0 before use in the first reactor. A solution mimicking pancreatic juice containing sodium bicarbonate (2.5 g/L, VWR Chemicals, Radnol, Pennsylvania, USA), pancreatin (0.9g/L, ProDigest) and bile salts (Oxgall 4.0 g/L) a was added in the middle.
  • the feeding cycle is scheduled 3 times per day based on a total retention time of 14h.
  • the culture medium maintained at 4° C.
  • the mixture of pancreatic juice/bile salts (60ml) also maintained at 4° C., is added to the same reactor for 1 hour.
  • the contents of reactors 1, 2 and 3 are transferred, respectively, into reactors 2, 3 as well as a biological waste container.
  • the anaerobic conditions of all the reactors are maintained thanks to a flow of nitrogen (N2) once a day for 10 minutes at the level of the reactors.
  • the contents of the reactors are stirred continuously (300 rpm) and maintained at 39.5°C.
  • the pH of reactors 2 and 3 is continuously monitored in order to stabilize the pH of the ileum and the proximal colon.
  • Samples were collected in the babySPIME system during the stabilization phase, before the treatment with the symbiotic formulations and at the end of the treatment with the symbiotic.
  • Example 1 The fermentation capacity of the symbiotic composition by modeling the production of gas and the production of lactate and SCFA in an in vitro static fermentation model
  • the fermentation curves of the pre- or symbiotics are shown in Figure 3. Under all conditions in Figure 3, there is an increase in fermentation capacity measured by the increase in gas production. Under all the conditions of FIG. 3, this gas production is greater in the presence of a symbiotic composition compared to the presence of the prebiotic alone. The parameters resulting from the modeling of the gas production during the static fermentation of the symbiotics are compared with the parameters of the prebiotics alone (Table 3).
  • the gas production kinetics and model parameters include: A: maximum gas production; B: the time to have 50% of the maximum gas production; C: the slope; D: the maximum rate of gas production (Rmax); the time at Rmax (Tmax).
  • the static fermentation of the symbiotic combinations was carried out at 1.00E+7 CFU/ml of probiotic and 0.1 g of prebiotic (same quantity of prebiotic used in the condition where the prebiotic is alone) in the presence of 3% of an inoculum of faeces. Results show the mean +/- standard deviation of 3 experimental replicates. The p-values were obtained by a one-way ANOVA statistical analysis with a Dunnett type multiple comparison test. Results are considered significant when p ⁇ 0.05.
  • the SCFAs present in the fermentation juice after 24 h of fermentation are presented in Table 4. There was no production of lactate after 24 h of fermentation.
  • Example 2 Determination of changes in the microbiota by qPCR during an in vitro static fermentation model test in the presence of different symbiotic compositions
  • the relative abundance of beneficial bacteria after 24 h of fermentation are presented in Figure 4.
  • the delta-delta CT method was used to express the target bacteria compared to the total bacteria.
  • the results of the synbiotics are compared with the prebiotics alone.
  • several symbiotic compositions such as BT-GF, CB-GF, BCO-GF, BCU-2FL, BMO-2FL, BAL-2FL, BAL-Inu, BT-Inu, CB-RS, BCU -RS, BAL-BG, LP-BG, or BCU-BG, make it possible to significantly increase the relative abundance of beneficial bacteria at 24 hours of fermentation.
  • Example 3 Determination of the ability of probiotics to survive and establish during fermentation
  • Figure 5 shows the presence of probiotics in the fermentation juice after 12, 24 and 48 hours of fermentation.
  • Symbiotic compositions such as BT-Inu, allow good establishment and survivability of the probiotic.
  • Example 4 Determination of the immunomodulatory effect of the symbiotic composition by quantification of the production of IL-8 and NO by IPEC-J2 cells.
  • IPEC-J2 cells were incubated with 0.8% (V/V) of fermentation juice previously sterilized by filtration. Moreover, the survival rate of IPEC-J2 cells is greater than or equal to 70% in all the tested conditions of fermentation juice.
  • the production rate of IL-8 was measured in a control condition where the fermentation juice contains a faeces inoculum. , mucin (control-mucin), but in the absence of probiotics, prebiotics or symbiotics.
  • a basal level of IL-8 expression is 932 pg/ml (represented by the horizontal line in Figure 2).
  • Pre- and synbiotics were compared against control-mucin.
  • the synbiotics were compared with the prebiotic to estimate the additional effect of the probiotic. Table 5 shows the p-values of these comparisons, and Figure 2 shows the concentrations of IL8.
  • Table 5 Production of IL-8 by the IPEC-J2 cells in the supernatant after 24 hours of incubation with 0.8% of fermentation juice previously sterilized by filtration produced by the symbiotic composition or the prebiotic alone. Values are corrected for cell viability. The results are means with their standard deviations. The comparisons are made between the symbiotic compositions and the prebiotic alone. The statistical significances are analyzed by a one-way ANOVA with a Dunnett type multiple comparison test. When p ⁇ 0.05: *; p ⁇ 0.01: **; p ⁇ 0.001: ***; p ⁇ 0.0001: ****.
  • Example 5 Determination of the modifications of the microbiota by qPCR during a test in the baby SPIME model in the presence of different symbiotic compositions. The overall results obtained on the baby SPIME system are presented in Figure 6 and Table 6.
  • Table 6 Summary of the upward or downward regulation of bacterial groups of interest following symbiotic treatment in the BABY-SPIME system after one week of treatment with the various symbiotics.
  • Composition C1 was prepared by adding 1 E07 CFU/ml Clostridium bufyricum and 0.1 g GOS/FOS.
  • the prebiotic consists of a homogeneous liquid solution of 80% (w/w) GOS and 20% (w/w) FOS.
  • the level of probiotic a freeze-dried powder of bacteria was pre-mixed in a buffer solution at a concentration of 1.5E08 CFU/ml (stock solution).
  • the pre-mixed probiotic solution underwent a revivification process consisting of a 30 min incubation at 37°C with shaking. Then, 1 ml of the pre-mixed solution (stock solution) was added to the vial leading to a final probiotic concentration of 1 E07 CFU/ml in the vial.
  • the symbiotic composition comprising at least Clostridium butyricum and at least GOS/FOS against intestinal dysbiosis showed a favorable effect on fermentation, by increasing the A value (maximum gas production) compared to the prebiotic alone (see CB-GoF condition of the Table 3, and by increasing the concentrations of total SCFAs and butyrate after 24 hours of static fermentation in vitro (see CB-GoF condition of Table 4)
  • the relative abundance of Bifidobacteria and lactobacilli increased in comparison with the prebiotic alone (see CB-GF condition in Figure 4).
  • the probiotic Clostridium butyricum was still present in the fermentation juice after 48 hours of fermentation.An anti-inflammatory effect is shown in vitro on IPEC-J2 cells generating a decrease in the IL-8 production compared to GOS/FOS alone, while IL-8 concentration was not different compared to control-mucin (see CB-GF condition in Figure 2).
  • the Cl symbiotic composition shows an improvement of the microbiota in the BABY-SPIME model by increasing the bacterial populations involved in the metabolic pathways of butyrate production.
  • the increase in these bacterial populations was analyzed by qPCR (see condition CB+G/F of FIG. 6 and Table 6 presented above).
  • the sequences of the forward primers and the antisense primers used to measure by qPCR the relative abundance of the beneficial bacterial populations for the microbial community of the intestine are indicated in Table 1.
  • Example 7 C2 symbiotic composition comprising at least Bifidobacterium thermophilum and at least inulin against intestinal dysbiosis.
  • Composition C2 was prepared by adding 1 E07 CFU/ml of Bifidobacterium thermophilum and 0.1 g of inulin.
  • inulin was added to each fermentation bottle containing 15 ml of fermentation juice.
  • a freeze-dried powder of bacteria was pre-mixed in a buffer solution at a concentration of 1.5E08 CFU/ml (stock solution).
  • the pre-mixed probiotic solution underwent a revivification process consisting of a 30 min incubation at 37°C with shaking. Then, 1 ml of the pre-mixed solution (stock solution) was added to the vial leading to a final probiotic concentration of 1 E07 CFU/ml in the vial.
  • the C2 symbiotic composition comprising Bifidobacterium thermophilum (BT) and inulin (Inu) against intestinal dysbiosis showed a beneficial effect on fermentation, demonstrated by an increase in A value (maximal gas production), a decrease in B value (the time to reach 50% of maximum gas production), an increase in fermentation rate (Rmax), and a decrease in time to reach the maximum amount of gas produced (Tmax) compared to inulin alone (see BT-Inu condition in Table 3).
  • an increase in the concentration of butyrate and the relative abundance of bifidobacteria in the fermentation juice after 24 hours is demonstrated (see BT-Inu condition in Figure 4), Bifidobacterium thermophilum was indeed present until the end of the fermentation.
  • the C2 symbiotic composition shows an improvement of the microbiota in the BABY-SPIME model by increasing the bacterial populations involved in the metabolic pathways of butyrate production and showing a tendency towards an increase in bifidobacteria.
  • the increase in these bacterial populations was measured by qPCR (see BT + INU condition of Figure 6 and Table 6).
  • the sequences of the forward primers and the antisense primers used to measure by qPCR the relative abundance of the beneficial bacterial populations for the microbial community of the intestine are indicated in Table 1.
  • Example 8 C3 symbiotic composition comprising at least Bifidobacterium animalis lactis and at least 2' FL against intestinal dysbiosis.
  • Composition C3 was prepared by adding 1 E07 CFU/ml of Bifidobacterium animalis lactis and 0.1 g of 2' FL.
  • 0.1 g of 2' FL was added to each fermentation flask containing 15 ml of fermentation juice.
  • a freeze-dried powder of bacteria was pre-mixed in a buffer solution at a concentration of 1.5E08 CFU/ml (stock solution).
  • the pre-mixed probiotic solution underwent a revivification process consisting of a 30 min incubation at 37°C with shaking. Then, 1 ml of the pre-mixed solution (stock solution) was added to the vial leading to a final probiotic concentration of 1 E07 CFU/ml in the vial.
  • the C3 symbiotic composition against intestinal dysbiosis showed a beneficial effect on fermentation, demonstrated by an increase in the A value (maximum gas production), a decrease in the B value (the time to reach 50% of the maximum production of gas), an increase in the fermentation rate (Rmax), and a decrease in the time to reach the maximum quantity of gas produced (Tmax) compared to 2' FL alone (see Bal-2FL condition of Table 3).
  • an increase in the butyrate concentration see BAL-2FL condition in Table 4
  • Bifidobacterium animalis lactis was present until the end of fermentation.
  • An in vitro anti-inflammatory effect on IPEC-J2 cells generating a decrease in the production of IL-8 (see BAL-2FL condition in Figure 2) compared to 2' FL alone and compared to the control-mucin according to the protocol of Example 1.
  • the C3 symbiotic composition shows an improvement of the microbiota in the BABY-SPIME model by increasing the bacterial populations of bifidobacteria.
  • the increase in these bacterial populations was measured by qPCR (see BAL + 2FL condition of Figure 6 and Table 6).
  • the sequences of sense primers and antisense primers used to measure by qPCR the relative abundance of bacterial populations beneficial to the microbial community of the intestine are shown in Table 1.
  • VFA volatile fatty acids
  • Example 9 C4 symbiotic composition comprising Bifidobacterium crudilactis and beta-glucan against intestinal dysbiosis.
  • Composition C4 was prepared by adding 1 E07 CFU/ml of Bifidobacterium crudilactis and 0.1 g of beta-glucan.
  • beta-glucan was added to each fermentation bottle containing 15ml of fermentation juice.
  • a freeze-dried powder of bacteria was pre-mixed in a buffer solution at a concentration of 1.5E08 CFU/ml (stock solution).
  • the pre-mixed probiotic solution underwent a revivification process consisting of a 30 min incubation at 37°C with shaking. Then, 1 ml of the pre-mixed solution (stock solution) was added to the vial leading to a final probiotic concentration of 1 E07 CFU/ml in the vial.
  • the C4 symbiotic composition comprising Bifidobacferium crudilactis and beta-glucan against intestinal dysbiosis showed a beneficial effect on fermentation, demonstrated by an increase in the A value (maximum gas production) and an increase in the rate of fermentation (Rmax) compared to beta-glucan alone (see BCU-BG condition in Table 3).
  • BCU-BG condition in Table 3
  • Rmax rate of fermentation
  • Example 10 C5 symbiotic composition comprising Enterococcus faecium and beta-glucan against intestinal dysbiosis.
  • the C5 symbiotic composition against intestinal dysbiosis showed a beneficial effect on fermentation, demonstrated by an increase in the A value (maximal gas production) and an increase in the rate of fermentation (Rmax) compared to beta-glucan alone (see condition EF-BG in Table 3).
  • Rmax rate of fermentation
  • the C5 symbiotic composition shows an improvement of the microbiota in the BABY-SPIME model by increasing the bacterial populations involved in the metabolic pathways of butyrate production.
  • the increase in these bacterial populations was measured by qPCR (see EF + BG condition of Figure 6 and Table 6).
  • the sequences of the forward primers and the antisense primers used to measure by qPCR the relative abundance of the beneficial bacterial populations for the microbial community of the intestine are indicated in Table 1.
  • Example 11 Symbiotic compositions administered in vivo to the pregnant and/or lactating sow and/or to the suckling piglet
  • Table 7 below describes the various symbiotic compositions (SYN) given in vivo to the pregnant and/or lactating sow and/or nursing piglets.
  • Symbiotic supplementation of the sows started from the 80th day of gestation and it was distributed manually in the form of a portion directly added to the plate of each sow (top feeding) once per day with a meal. Supplementation of the synbiotic continued throughout the three-week lactation (nursing) period.
  • the synbiotics were prepared, ie mixed with a growth standard food, just before the start of the experiments and kept in a cool, dry place. A group of non-supplemented sows was used as a reference/control group for the comparison.
  • the sows were distributed into different groups according to their parity, in order to obtain a homogeneous distribution and an equal average parity between the groups (4).
  • the sows were placed in individual pens with individual feed automatically distributed twice a day. After 115 days of gestation, the sows were transferred to individual farrowing pens. The sows were fed twice a day with an automatic feeder and had unlimited access to water by pressing a button above their pan.
  • the supplementation of the symbiotic compositions (examples 13, 15, 17, 19, 21 of table 7) was carried out once a day in the morning.
  • Table 8 below indicates the dose of probiotic and prebiotic administered to sows according to the stage of development (gestation or lactating).
  • the symbiotic combinations selected consisted of a single probiotic strain with a single prebiotic (see examples 13 (SYN 1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) and 21 (SYN 5) in Table 7 ) .
  • Symbiotic combinations that included a milk oligosaccharide as a prebiotic were replaced by inulin for sow supplementation.
  • Examples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) and 22 (SYN 5) of Table 7 indicate the symbiotic compositions administered to suckling piglets.
  • the piglets During the suckling phase, the piglets remained with their mother in maternity pens whose floor was covered with a plastic mesh. The piglets had unrestricted access to suckling, and from the first day after birth a floor-mounted pan was placed in each pen. During the first week after birth, the piglets received a milk replacer once a day. During the second and third weeks of lactation, the piglets received a wet transition food.
  • the prebiotic solutions (dissolved in drinking water) were prepared once a week and stored in the refrigerator (+4°C).
  • the probiotic powder and prebiotic solution were freshly mixed each day just before distribution.
  • the symbiotic compositions were administered at a dose established for an average litter of 15 piglets receiving 2 ml of symbiotic per piglet per day during the first week, and 4 ml per piglet per day from the second week until weaning.
  • the symbiotic composition was distributed to the piglets by administering it in the milk replacer given to them during the first week and with the liquid wet transition food until weaning.
  • Table 9 below indicates the dose of probiotic and prebiotic administered to piglets according to the stage of development.
  • Examples 13 to 22 Different symbiotic compositions administered in vivo to sows and piglets.
  • Examples 13 (SYN 1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) and 21 (SYN 5) of Table 7 indicate the symbiotic compositions administered to pregnant or lactating sows.
  • Examples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) and 22 (SYN 5) of Table 7 indicate the symbiotic compositions administered to suckling piglets.
  • Examples 23 to 43 Impact of different administration protocols of a symbiotic composition to the sow and/or to the suckling piglet on different zootechnical criteria of the suckling piglet and/or post-weaning.
  • piglets were counted (live, dead and mummified) and the total litter weight of live piglets was recorded. One day before weaning, the piglets were counted and the total litter weight of live piglets was recorded. The piglets were weaned three weeks after farrowing, at around 21 days of age. At weaning, piglets were transferred to post-weaning pens in groups per treatment, rearranged by sex (male or female) and size (small, medium, large) into groups of approximately 25 piglets per pen. Two weeks after weaning, the piglets were counted and weighed.
  • Table 10 below indicates the different administration protocols of the symbiotic composition to the sow and/or to the suckling piglet.
  • Table 10 Different protocols/profiles for administration of the symbiotic composition to the sow and/or to the piglet.
  • Table 7 indicates the prebiotic and probiotic composition of each SYN indicated in Table 10.
  • Tables 8 and 9 show the doses administered. Different zootechnical criteria were measured on the suckling piglet and on the post-weaning piglet according to different administration profiles of the different symbiotic compositions. These different zootechnical criteria are: the weight of the piglet (kg) (see table 1 1 ) the average daily gain, GQM (g/day) (see table 12) the quantity (score) of diarrhea (%) (see table 13)
  • Diarrhea scores were measured by assigning each pen/litter the highest score according to the diarrhea score scale based on feces consistency.
  • the rating scale used included five categories: score 0 - hard granule; 1 - soft and dry granule; 2 - wet granule/soft form; 3 - soft, unformed granule; 4 - watery. Only score 4 was considered diarrhea. Observations of diarrhea occurred twice during the experiment, 3 days before weaning and 10 days after weaning. The days of observation of the diarrhea scores were chosen not to coincide with the weighing of the piglets nor with the collection of faeces in order to avoid interfering with the results due to the stress caused by the handling on the piglets.
  • Table 11 shows the impact of different SYN administration profiles on piglet weight during suckling and post-weaning.
  • Certain administration profiles of symbiotic compositions allow a significant increase in piglet weight compared to the control condition in the post-weaning phase or in the post-weaning phase. breastfeeding (see for example SYN 3 in Example 32).
  • the symbiotic compositions involving SYN 5 are counter-examples showing that certain symbiotic compositions will not necessarily be positive for the weight gain of the suckling piglet and/or post-weaning.
  • Table 12 below shows the impact of different SYN administration profiles on the average daily gain (ADG) of suckling and post-weaning piglets.
  • ADG average daily gain
  • Table 13 shows the impact of different SYN administration profiles on the diarrhea score of suckling and post-weaning piglets.
  • Table 13 Diarrhea in suckling and post-weaning piglets according to different SYN administration profiles.
  • the administration profiles involving SYN 3 and SYN 4 allow a reduction in severe diarrhea (score 4) in the piglet compared to a control piglet, in particular for the post-weaning piglet.
  • compositions will have a direct positive impact (compared to the control condition) on the zootechnical criteria for suckling piglets while others will have a persistence effect by having a more marked positive impact on zootechnical criteria for post-weaning piglets.
  • Example 44 Synbiotic composition SYN 6 comprising E. faecium, C. butyricum, beta-glucan and inulin against intestinal dysbiosis and doses administered in vivo to the sow before farrowing and after farrowing.
  • the amount administered is indicated in CFU/sow/day, while for prebiotics the amount administered is indicated in g/sow/day (see Table 14).
  • the in vivo administration of the symbiotic composition was carried out at 4 different stages of development: before whelping, one week after whelping, 2 weeks after whelping, 3 weeks after whelping and 4 weeks after whelping.
  • the sows were weighed. The sows were then divided into three different groups according to their parity, in order to obtain a homogeneous distribution and an equal average parity in all the groups.
  • day 80 after insemination the sows were placed in individual pens.
  • the sows were weighed.
  • the sows were transferred to individual pens in the farrowing house. Parturition was planned for day 1 of gestation with an injection of Planate® and uterine involution was facilitated by an injection of dinolytic® after parturition.
  • piglets During the post-weaning period, they received a diet devoid of any dietary supplement (devoid of any symbiotic composition). The piglets were checked daily in the morning to check their general state of health and monitor the appearance of diarrhoea. Feeders were filled as needed. The enclosures were cleaned with water every day. Once a week, the piglets were weighed and feed consumption was recorded.
  • Table 14 SYN 6 symbiotic composition
  • E. faecium, C. butyricum, beta-glucan and inulin quantity of each probiotic and prebiotic administered per day at 5 stages of development.
  • the 5 stages of development are G80-G107 (between 80 days and 107 days of gestation, before parturition), 1 week after parturition, 2 weeks after parturition,
  • Example 45 SYN 7 symbiotic composition comprising E. faecium,
  • the amount administered is indicated in CFU/sow/day, while for prebiotics the amount administered is indicated in g/sow/day (see Table 15).
  • G80-G107 (between 80 and 107 days of gestation, before parturition, MB), one week after parturition, 2 weeks after parturition and 3 weeks after parturition.
  • Table 15.- SYN 7 symbiotic composition comprising E. faecium,
  • Example 46 Symbiotic composition against intestinal dysbiosis and doses administered in vivo to the piglet
  • the symbiotic 1 (SYN 1) is composed of Clostridium butyricum and GOS/FOS (80/20) and the symbiotic 2 (SYN 2) is composed of B. animalis lactis and 2' FL (see Table 16).
  • the control condition was just potable water.
  • the piglets ingested a determined amount of symbiotic, which increased with age.
  • the symbiotic composition was prepared daily by mixing a prebiotic mixture of 0.4 g of prebiotic per ml in drinking water with the corresponding probiotic (6E08 CFU/ml).
  • the GOS/FOS prebiotic mixture contained 0.32 g/ml GOS and 0.08 g/ml FOS according to the proportions of sow milk oligosaccharides.
  • the prebiotic solution was prepared weekly and stored at +4°C until use. Prior to administration, the symbiotic mixtures were brought to room temperature. The symbiotic compositions were administered from birth, at increasingly shorter intervals and at increasing doses with age, until weaning on the 28th postnatal day (see Table 16). No symbiotic composition was administered during the post-withdrawal period.
  • the volumes of the symbiotic compositions administered were as follows:
  • synbiotic compositions SYN 6 and SYN 7 increase the amount of diarrhea (score 4) in suckling piglets by 10% and 17% respectively compared to the control condition. It is understood that the present invention is in no way limited to the embodiments described above and that many modifications can be made thereto without departing from the scope of the appended claims.

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Abstract

Composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clostridium butyricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post- sevrage.

Description

COMPOSITION SYMBIOTIQUE COMME ADDITIF D’ALIMENTATION POUR LES PORCELETS OU LES TRUIES ET SON UTILISATION
La présente invention se rapporte à une composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
La dysbiose intestinale est un déséquilibre du microbiote intestinal pouvant générer une prolifération de pathogènes (par ex E. coli) provoquant la diarrhée. Le microbiote est, quant à lui, défini comme l'ensemble des microorganismes présents dans un milieu déterminé (définition de l'office québécois de la langue française, 2008). Ce milieu déterminé est appelé microbiome. Le déséquilibre du microbiote intestinal se traduit par une réduction de la diversité des populations bactériennes et par un excès des bactéries pathogènes du microbiote. A l'inverse un microbiote équilibré dans la répartition des espèces de microorganismes qui le composent est dit en eubiose.
Le secteur de la production de viande grandit rapidement dans le monde, la production de porc augmente de manière régulière et représente l' un des plus gros consommateurs d'antibiotiques dans la production animale.
Dans les fermes porcines, le sevrage (interruption de l'allaitement et changement vers une alimentation sèche) est une période associée à un risque pour les jeunes animaux. Une problématique récurrente lors du sevrage des animaux est le risque accru de diarrhées résultant de la transition abrupte de régime alimentaire. Cette transition abrupte peut engendrer une dysbiose intestinale.
Les diarrhées peuvent entraîner une perte de poids, voire la mort du nouveau-né dans des cas graves. Le traitement de routine ainsi que les procédures de prophylaxie appliquées pour la diarrhée détectée juste après la naissance du porcelet sont souvent peu efficaces.
Cette période de transition génère par ailleurs chez l'animal, en particulier chez le porcelet, un stress significatif au niveau comportemental, nutritionnel et environnemental, responsable d'une forte réduction dans la consommation de nourriture. Il est donc crucial de maîtriser ce risque de diarrhées car elles occasionnent une perte considérable pour les éleveurs puisqu'elles sont souvent associées à un taux de mortalité élevé, une perte de poids, un retard de croissance, et des coûts liés aux traitements.
Actuellement ce risque de diarrhées est maîtrisé par l'ajout d'additifs minéraux bactériostatiques (ZnO, CuSO4) dans le régime des porcelets sevrés mais, au-delà de la résistance déjà observée à ces composés, la pratique d'ajout d'additifs minéraux bactériostatiques mène à des problèmes environnementaux (contamination des eaux par les minéraux lessivés et contenus dans les effluents d'élevage).
L'ajout d'antibiotiques thérapeutiques dans la nourriture des animaux autour du sevrage est également une pratique courante. Ce traitement reste problématique car il induit la résistance des bactéries aux antibiotiques. Chez les animaux d'élevage, une utilisation aveugle d'antibiotiques peut également favoriser la dysbiose intestinale. De plus, sachant que la résistance aux antibiotiques augmente de plus en plus et en particulier chez les animaux d'élevage, la commission européenne a interdit depuis le 1 er janvier 2006 l'utilisation des antibiotiques comme facteurs de croissance dans les aliments pour animaux.
Compte tenu de la croissance de la démographie mondiale et de la demande croissante de viande dans le monde, il est donc crucial de trouver des solutions alternatives à l' usage des antibiotiques et des additifs minéraux pour réduire l'incidence et la sévérité des problèmes digestifs chez les animaux sevrés et, de manière plus générale, pour soutenir une croissance durable de l'industrie de la viande.
Au vu de ce qui précède, des solutions alternatives aux antibiotiques et minéraux bactériostatiques ont été développées impliquant une utilisation optimale de probiotiques en combinaison ou non avec des prébiotiques.
D' une manière générale, une combinaison d'au moins un probiotique avec au moins un prébiotique est appelée un symbiotique, lorsque le prébiotique agit comme substrat en synergie avec le probiotique pour procurer un effet positif sur la santé, en particulier sur la digestion. La digestion des protéines, des sucres et des graisses chez les individus monogastriques, et en particulier chez les porcs et la volaille, repose d'abord sur une digestion s'effectuant au niveau de l'estomac qui constitue un environnement acide entraînant une dénaturation des macromolécules pour former un digesta. Le digesta arrive ensuite dans l'intestin et y subit encore une hydrolyse par action du suc pancréatique qui contient plusieurs protéases et par action des aminopeptidases et des dipeptidases intestinales.
L'absorption des produits de ces hydrolyses a lieu dans la partie supérieure de l'intestin grêle et tous les produits non digérés dans l'intestin grêle gagnent le gros intestin où ils sont soumis à l'action des microorganismes (microbiote intestinal) en entraînant une fermentation.
Il existe de nombreuses publications qui confirment le rôle indispensable du microbiote intestinal sur la santé des animaux (et des humains). Le microbiote intestinal interagit aussi de manière permanente avec le système immunitaire présent dans la paroi intestinale. Certaines études ont aussi démontré la capacité des probiotiques et/ou des prébiotiques à rééquilibrer le microbiote intestinal et leur utilité sur la santé intestinale par effets généralement directs et à court-terme.
L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l'Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) ont défini les probiotiques comme étant des « micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels ». Il existe des définitions plus larges qui ne font pas référence à l'alimentation, et où le mot « ingérés » peut être remplacé par « administrés ».
Bien que les gens pensent souvent aux bactéries et autres microorganismes comme des « germes » nocifs, beaucoup sont en fait utiles. Certaines bactéries aident à digérer les aliments, à détruire les cellules pathogènes ou à produire des vitamines. Beaucoup de micro-organismes dans les produits probiotiques sont les mêmes que ou similaires aux micro-organismes qui vivent naturellement, de manière endogène, dans notre corps.
Sans être exhaustif, les probiotiques comprennent différents microorganismes comme les bactéries Bacillus coagulons, Bacillus subfilis, Bifidobacterium animalis lacfis, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium thermophilum, Clostridium butyricum, Enterococcus faecium, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium mongoliense, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Collinsella tanakaei, Pediococcus acidilacticiici, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes butyraticus. Les bactéries probiotiques les plus courantes étant celles du genre Lactobacillus et Bifidobacterium. Les probiotiques comprennent également des levures comme Saccharomyces boulardii (Sanders M.E., « Probiotics, strains matter », Functional foods & nutraceuticals magazine, 2007, 36-41 ).
Les prébiotiques, quant à eux, sont des substrats utilisés de manière sélective par les micro-organismes de l' hôte qui stimulent sélectivement la croissance ou l'activité de micro-organismes souhaitables (Expert consensus document : The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017, 14, 491-502, https://doi.org/! 0.1038/nrgastro.2017.75) .
Sans être exhaustif, les prébiotiques comprennent entre autres l'inuline, le beta-glucane, le 2'-Fucosyllactose (2FL), des oligosaccharides comme les galactooligosaccharides (GOS), fructooligosaccharides (FOS), mannanoligosaccharide (MOS), xylooligosaccharide (XOS), acides gras polyinsaturés (polyunsaturated fatty acid: PUFA), acide linoléique conjugué (ALC).
Une formulation combinant au moins un probiotique en association avec au moins un prébiotique pour prévenir et traiter les infections bactériennes pouvant mener à la diarrhée, augmenter le poids de l'animal et promouvoir la croissance est connue du document WO2014049023. Le document WO2014049023 décrit des produits et compositions pouvant être bénéfiques en élevage. Lesdits produits et compositions qui y sont décrits comprennent des microorganismes, tels que des bactéries, en particulier des bactéries probiotiques. Les souches, ainsi que les compositions les comprenant, peuvent être administrées à des animaux, de préférence à des animaux d'élevage, tels que les porcs. L'administration peut avoir lieu dans les premiers jours de vie. Selon ce document, l'administration des produits ou des compositions favorise la croissance animale et la prise de poids de l'animal. Les infections bactériennes peuvent également être prévenues ou traitées par lesdits composés ou compositions. Ce document WO2014049023 mentionne qu' une composition comprenant au moins 2 probiotiques est appropriée pour traiter la diarrhée chez le porcelet nouveau-né (non sevré). En particulier, une composition comprenant Lactobacillus reuteri et Enterococcus faecium permet de réduire la diarrhée, d'augmenter le gain quotidien moyen de prise de poids et de réduire la mortalité du porcelet nouveau-né.
Le document WO2018002671 divulgue une composition pour le traitement et/ou la nutrition de volailles telles que des poulets de chair comprenant (i) un probiotique commensal choisi parmi Bifidobacterium animalis, Collinsella tanakaei, Lactobacillus reuteri, Anaerostipes, Lactobacillus crispatus, Pediococcus acidilacticiici, Lactobacillus pontis, Faecalibacterium prausnitzii, Coprococcus catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes butyraticus, Butyricicoccus, Lactobacillus johnsonii et Ruminococcus sp.; et (ii) un prébiotique. Ce document divulgue également l'utilisation d'une telle composition pour le traitement des maladies entériques chez les volailles, telles que l'entérite nécrotique.
Le document W02006133472A1 concerne un additif alimentaire et/ou additif pour l'eau potable animale ou humaine favorisant la santé ou la croissance de probiotiques. Ce document concerne en outre une utilisation de l'additif alimentaire humain et animal et/ou de l'eau potable, notamment pour la prévention de l'effet néfaste d'un certain nombre de germes indésirables dans le système digestif des animaux et/ou des oiseaux domestiques.
Finalement, le document WO2017156548A1 concerne certains aliments comprenant un composant nutritionnel fermentescible et un composant probiotique, où le composant probiotique est sélectionné, sur la base de critères génétiques et/ou métaboliques, pour métaboliser spécifiquement tout monomère de sucre libre (Free Sugar Monomers (FSM)) ou tout acide aminé libre (Free Amino Acids (FAA)) ou peptide qui s'accumulent dans l'intestin grêle et le gros intestin en raison de la composante nutritionnelle fermentescible, qui, sans cette métabolisation seraient fermentés et métabolisés par des bactéries moins adaptées / opportunistes, créant des efflorescences de bactéries intestinales délétères et déplaçant le microbiome vers un potentiel état de dysbiose. Malheureusement, les formulations connues sont essentiellement utilisées comme agent thérapeutique de dysbiose ou de déséquilibre du microbiome chez l'animal d'élevage. Les effets démontrés in vivo par ces formulations restent très généraux comme la prise de poids ou le pourcentage de mortalité de l'animal. De nombreux probiotiques sont décrits en association avec n'importe quel prébiotique dans des buts bien divers. De plus, selon Wang et col. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104 : 335-349, DOI: 10.1007/s00253-019-10259-6, il est admis que des compositions symbiotiques comprenant plusieurs probiotiques auront un effet avantageux pour lutter contre la dysbiose par rapport à des compositions comprenant un seul probiotique. Par contre, de telles compositions comprenant plusieurs probiotiques présentent l'inconvénient d'être moins simple et plus coûteuse à produire de manière industrielle.
En outre, selon Barba-Vidal et col. Animal, 2018, 12, 2489-2498, DOI: 10.1017/S1751731 1 18000873, il existe un manque criant de reproductibilité au niveau des expérimentations montrant l'effet bénéfique des probiotiques.
Les interventions à la fin de la gestation de la truie et/ou dès la naissance du porcelet devraient permettre par le principe de la programmation précoce d'influencer de manière optimale et durable le bon développement du microbiote du nouveau-né. Par conséquent, les effets positifs pour la santé de l'animal ne seraient pas observés seulement en début de vie et durant les 3-4 semaines après le sevrage mais ils resteraient aussi observables au long de la vie adulte.
La première colonisation intestinale du porcelet par le microbiote maternel au moment de la mise bas est cruciale pour l'établissement d' un microbiote intestinal favorable du nouveau-né, mais la composition du microbiote peut être influencée par de nombreux facteurs tels que des antibiotiques, la nourriture, l'environnement, les agents infectieux, etc.
La présente invention entend donc pallier les inconvénients précités en procurant une composition comprenant une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de
(i) Enterococcus faecium, ou de
(ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clostridium butyricum, ou de
(iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, dans le but d'améliorer les conditions de santé du nouveau-né.
La présente invention vise donc à procurer une formulation symbiotique qui a un effet qui se maintient dans le temps en agissant spécifiquement sur la modulation du microbiote de manière précoce, favorisant ainsi une eubiose intestinale de manière fiable. De plus, la présente invention vise à procurer une formulation symbiotique (composition symbiotique) simple avec un probiotique principal déterminé, ce qui facilite la production et la vérification des lots de production. En effet, la production industrielle d'une composition symbiotique simple, minimale, sera plus facile, plus rapide, et sera économiquement plus rentable que la production d' une composition symbiotique comprenant, par exemple, plusieurs probiotiques.
Selon la présente invention, il a ainsi été mis en évidence qu'il était possible de mettre à disposition une formulation symbiotique simple comprenant comme probiotique principal Enterococcus faecium, ou Bifidobacterium animalis lacfis, ou Clostridium butyricum, ou Bifidobacterium crudilactis qui génère de manière démontrée et reproductible un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif, tant de l'animal en gestation que plus tard du nouveau-né, lequel se maintient dans le temps pour protéger l'animal contre des dysbioses ultérieures.
La formulation symbiotique selon la présente invention permettant de moduler le microbiote du foetus dans un animal en gestation ou du nouveau-né permettra d'avoir un effet prophylactique maximal et assurera une croissance et un développement optimal de l'animal.
En effet, la formulation selon la présente invention favorise une flore intestinale saine qui protège ainsi l'animal qui l'ingère, en particulier lorsque celle-ci est ingérée par la femelle en gestation par la génération démontrée et reproductible d' un environnement onti-inflommotoire dons l'estomac et/ou l'intestin, et ce de manière systématique.
En effet, il est crucial d'analyser l'impact des probiotiques à travers 3 critères importants : la concentration en cellules viables, l'effet bénéfique sur la croissance de l' hôte et l'effet bénéfique sur le fonctionnement du tube digestif grâce notamment à un impact anti-inflammatoire (Markowiak P. et Slizewska K., Gut Pathog. 2018, 10, 21 , doi: 10.1 186/s 13099).
La formulation symbiotique selon la présente invention procure une solution efficace contre la dysbiose et le problème de diarrhée survenant lors du sevrage, dont le probiotique et le ou les prébiotiques sont choisis spécifiquement non pas uniquement sur la viabilité cellulaire, mais pour leurs effets associés sur la viabilité cellulaire et sur la réponse anti-inflammatoire du microbiote de l'hôte.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la formulation symbiotique contenant un probiotique et au moins un prébiotique produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une augmentation des acides gras à courtes chaînes « Short Chain Fatty Acids, SCFAs » ainsi qu'une amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les Lactobacillus et les bitidobacteries ainsi que les bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate ou d'autres acides gras à chaînes courtes. Le probiotique et le ou les prébiotique(s), ensemble, forment un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la génération ensemble d' un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif de l'animal, en particulier du mammifère, en particulier du porc, de préférence de l'animal en gestation et du nouveau-né, en particulier de la truie en gestation ou non et du porcelet.
En effet, ces indicateurs sont importants car il a été montré qu'un environnement inflammatoire du tractus gastrointestinal peut générer une dysbiose intestinale (Zeng et col., Mucosal Immunol., 2017, 10,18-26, doi: 10.1038/mi.2016.75). Il a également été montré que les « Short Chain Fatty Acids, SCFA » peuvent avoir additionnellement un effet bénéfique de régulateurs immunologiques sur l'environnement gastro-intestinal (Parada Venegas et col., Frontiers in Immunology, 2019, 10, doi:l 0.3389/fimmu.2019.00277). Les SCFAs sont des acides gras à courtes chaînes, produits par le processus de fermentation dans le colon. L'acétate, le propionate et le butyrate sont les trois principaux SCFAs. Le butyrate est particulièrement important pour le bon fonctionnement du colon car il est la source d'énergie principale des colonocytes (cellules épithéliales du colon). Les SCFAs peuvent également réduire la réponse pro-inflammatoire des cellules épithéliales de l'intestin (Iraporda C. et col., Immunology, 2015 10:1161-1169. https://doi.org/10.1016/j.imbio.2015.06.004).
Administrée à la truie en gestation ou non et au porcelet, la formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d' un microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant le porc ou l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le porcelet de manière soutenue dans le temps contre la dysbiose par le probiotique et le prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Avantageusement, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique pour
(i) diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, et/ou
(ii) augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Préférentiellement, dans la composition selon l'invention, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace pour diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle la quantité de selles molles et/ou liquides produite par ledit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus petite que la quantité de selles molles et/ou liquides produite par un porcelet contrôle au cours d'une même période de temps et au même stade de développement.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace pour augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle a) un poids dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus élevé par rapport au poids d' un porcelet contrôle au même stade de développement et pendant une même période de temps et/ou b) une courbe de croissance non-pathologique dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est au-dessus, pendant au moins deux jours, d' une courbe de croissance d'un porcelet contrôle pendant une même période de temps au même stade de développement.
Dans une forme de réalisation préférentielle de la présente invention, ledit un ou plusieurs prébiotiques est choisi dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS (galacto-oligosaccharide, fructo- oligosaccharide), de l'amidon résistant et de leur mélange.
Selon la présente invention, Bifidobacterium thermophilum provient de la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) répertoriée sous le numéro 18892, Enterococcus faecium (LMG S-28935), Bifidobacterium animalis lactis est une souche déposée à la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) ayant le numéro de dépôt LMG P-28149, Clostridium butyricum (LMG1217), Bifidobacterium crudilactis est une souche déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM, Institut Pasteur) ayant le numéro de dépôt (CNCM 1-3342) dans le cadre du document WC2006122850.
De préférence, dans la composition symbiotique selon l'invention, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre l ,00E+05 et l,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre l ,00E+06 et 1 ,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre l,00E+07 et l ,00E+01 1 CFU/jour/animal.
Avantageusement, dans la composition symbiotique selon l'invention, une quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Préférentiellement, dans la composition symbiotique selon l'invention, ledit probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d' un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis. Plus préférentiellement, dans la composition symbiotique, ledit probiotique est constitué pour au moins 85%, encore plus préférentiellement pour au moins 90%, de manière avantageuse pour au moins 95%, de manière favorable pour au moins 99%, 100% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus taecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière avantageuse, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
Préférentiellement, la composition selon l'invention se présente sous forme de combinaison comprenant ledit probiotique en quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs prébiotiques, la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium crudilactis et 2'fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et beta- glucanes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et beta-glucanes, Clostridium butyricum et 2'fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus taecium et beta-glucanes, Enterococcus taecium et inuline, Enterococcus taecium et 2'fucosyllactose, Enterococcus taecium et GOS/FOS, Enterococcus taecium et l'amidon résistant.
Avantageusement, dans la composition selon l'invention, la combinaison est préférentiellement choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Enterococcus taecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1 ,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et L00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1 ,00E+01 1 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal. En effet, selon la présente invention, une composition symbiotique comprenant par exemple Bifidobacterium crudilactis et beta-g lucanes, ou comprenant Bifidobacterium animalis lac fis et 2'fucosyllactose ou comprenant Clostridium butyricum et GOS/FOS ou encore comprenant Enterococcus faecium et beta-g lucanes a montré une capacité synergique à créer un environnement anti-inflammatoire, en réduisant la présence d'IL-8, en augmentant la production d'acide gras à courtes chaînes et en favorisant la croissance des populations bactérienne favorables au microbiote.
De préférence, la composition selon l'invention contient au moins un excipient conventionnel, sous forme liquide ou solide.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit probiotique et/ou ledit un ou plusieurs prébiotiques et/ou ledit au moins un excipient conventionnel se présentent sous forme encapsulé(s) et/ou sous forme de poudre et/ou sous forme de granulé(s) et/ou sous forme liquide. Ledit probiotique et ledit un ou plusieurs prébiotiques de la composition sont administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
De préférence, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace procure le traitement ou la prévention de la dysbiose pendant une période de temps, comptée à partir du jour de naissance dudit porcelet, supérieure à 3 jours, préférentiellement supérieure à 5 jours, encore plus préférentiellement supérieure à 15 jours, de manière favorable supérieure à 50 jours, de manière encore plus favorable supérieure à 100 jours. En effet, il a été montré que la composition suivant la présente invention peut générer un effet de rémanence pour traiter ou prévenir la dysbiose du porcelet. En fonction de la composition symbiotique et du profil d'administration de cette composition, par exemple en fonction d'une administration de la composition à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement, le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet pourra être favorisé même lorsque celui-ci est au stade de post-sevrage.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est administrée à une truie en gestation pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition selon l'invention est administrée à une truie allaitante pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition selon l'invention est administrée à un porcelet en allaitement pour le traitement ou la prévention la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière préférée alternative, la composition selon l'invention est administrée à une truie en gestation et/ou allaitante et/ou à un porcelet en allaitement pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Avantageusement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour augmenter la production de mucus dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon laquelle une quantité de cellules en gobelet (cellules caliciformes) dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que la quantité de cellules en gobelet dans l'intestin dudit porcelet contrôle au même stade de développement.
Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour augmenter la capacité d'absorption des villosités intestinales du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon laquelle
(i) un rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post- sevrage est plus grande que le rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin d' un porcelet contrôle au même stade de développement, et/ou
(ii) une épaisseur de la lamina propria intestinale dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que l'épaisseur de la lamina propria intestinale dans l'intestin d'un porcelet contrôle au même stade de développement, et/ou
Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique selon laquelle des concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote intestinal telles que les lactobacillus, et les bifidobacteries sont augmentées chez le porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport aux concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote intestinal du porcelet contrôle au même stade de développement. Avantageusement, cette augmentation des concentrations en populations bactériennes génère un meilleur équilibre du microbiote intestinal de l'hôte diminuant le risque de dysbiose intestinal.
Avantageusement, selon l'invention, la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement efficace de probiotique selon laquelle la concentration d'IL-8 est réduite d'au moins 10 % dans l'intestin du porcelet en allaitement et/ou en postsevrage par rapport à la concentration d' IL-8 dans l'intestin du porcelet contrôle au même stade de développement, ladite concentration réduite d' IL-8 formant ledit environnement anti-inflammatoire. Dans le cadre de la présente invention, la concentration d' IL-8 a été mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC_J2 en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester).
Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique est caractérisée, de préférence, en ce que la quantité thérapeutiquement efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement efficace selon laquelle la sécrétion d'acides gras à courte chaîne (SCFA's) par le microbiote intestinal d'un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage et/ou de cellules intestinales in vitro, est stabilisée ou augmentée par rapport à la sécrétion d'acides gras à courte chaîne d' un porcelet contrôle et/ou de cellules intestinales contrôles in vitro. Lesdits SCFAs, produits lors du processus de fermentation du microbiote sont un indicateur de l'équilibre et de la croissance du microbiote. Les SCFAs ont en effet un rôle bénéfique multiple au niveau de l'intestin : le butyrate, notamment, a un rôle régulateur dans le transport de fluide transépithélial. Il améliore également l'état oxydatif et l'inhibition de l'inflammation de la muqueuse de l'intestin, il renforce la barrière de défense épithéliale, il module la sensibilité viscérale et la mobilité intestinale (Canani, R. B. et col. World J. Gastroenterol., 201 1 , 17 : 1519-1528, doi: 10.3748/wjg.v17.i12.1519).
De préférence, selon l'invention, lesdits SCFAs sont choisis parmi le butyrate, le propionate, l'acétate, le lactate ou leurs combinaisons.
Dans le cadre de la présente invention, la production desdits SCFAs est mesurée grâce au modèle in vitro fermentation statique détaillé plus en détails ci-après. Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique peut contenir plus de 1 probiotique, par exemple 2 probiotiques, ou par exemple 3 probiotiques, ou par exemple 4 probiotiques ou par exemple 5 probiotiques. Selon l'invention, la composition symbiotique pourra également contenir plus de 1 prébiotique, par exemple 2 prébiotiques, ou par exemple 3 prébiotiques, ou par exemple 4 prébiotiques. D'autres formes de réalisation de la composition symbiotique suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte également à un complément alimentaire administrable à la truie en gestation ou non et au porcelet pour le traitement préventif et/ou curatif de la dysbiose intestinale.
Ledit complément alimentaire, comprenant ladite composition, peut être sous forme liquide par exemple dans une base lactée ou huileuse ou sous forme solide comme une poudre, une poudre dans une gélule, un granulé ou un comprimé ou une autre forme quelconque.
D'autres formes de réalisation du complément alimentaire suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte en outre à un aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage comprenant ladite composition, ledit aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations lactées et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
D'autres formes de réalisation de l'aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte de plus à un aliment pour nouveau- né animal comprenant ladite composition selon la présente invention et une base lactée compatible avec l'alimentation du nouveau-né.
D'autres formes de réalisation de l'aliment pour nouveau-né animal suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la composition à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage dans laquelle la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre l ,00E+05 et L00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre l ,00E+06 et l ,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre l ,00E+07 et l ,00E+01 1 CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0, 1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, le probiotique et le prébiotique de la composition étant administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la composition symbiotique prédécrite, pour la fabrication d' un médicament pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en postsevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres formes d' utilisation de ladite composition suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte enfin à une méthode de traitement ou de prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant une administration de la composition selon l'invention à une truie en gestation ou non, par exemple une truie allaitante, et/ou au porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
La figure 1 montre le schéma du dispositif expérimental du système BabySPIME (Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735. https://doi.Org/10.1016/j.mimet.2019). Compartiment 1 :
Estomac/duodenum/jejunum, compartiment 2 : iléon, compartiment 3 : colon ascendant. A: Alimentation, B: probiotique, C: prébiotique.
La figure 2 illustre le niveau de production d' IL-8 (pg/ml) par des cellules IPEC-J2. Les cellules IPEC-J2 ont été mise en contact d' un jus de fermentation venant d' une fermentation avec uniquement un prébiotique : GOS/FOS (GF) ou Inuline (Inu) ou 2'FL (2FL) ou beto-glucone (BG) ou amidon résistant (RS), ou bien provenant d' une fermentation pendant laquelle une composition combinant un prébiotique et un probiotique selon l'invention a été testée. Les résultats montrent la moyenne du niveau de production d' IL-8 +/- l'écart-type. La ligne horizontale correspond au niveau d' IL-8 dans la condition contrôle (blanc-mucine). La signification statistique a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel avec une comparaison multiple de type Dunnett de chaque prébiotique et symbiotique par rapport à la condition contrôle (indiqué par *), et entre les combinaisons symbiotiques et le prébiotique seul (indiqué par #). Lorsque p < 0.05 : ; lorsque p
< 0.01 : **, ## ; lorsque p < 0.001 : ***, ### ; et lorsque p < 0.0001 : ****, ####. BCO : Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophilum, CB : Clostridium butyricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU; Bifidobacterium crudilactis, BMC: Bifidobacterium mongoliense, LP; Lactobacillus plantarum.
La figure 3 montre une série temporelle indiquant l'accumulation de la production de gaz dans une fermentation in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) d'un prébiotique seul ou en combinaison avec un probiotique (symbiotique). La fermentation in vitro en lot de la combinaison symbiotique se réalise avec l,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0.1 g de prébiotique (même quantité dans la condition où le prébiotique est présent seul), en présence d' un inoculât de 3% en fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, Inu : inuline, 2FL : 2' FL, BG : beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT : Bifidobacferium thermophilum, CB ; Clostridium butyricum, EF ; Enterococcus faecium, BAL; Bifidobacferium animalis lactis, BCU; Bifidobacferium crudilactis, BMC; Bifidobacferium mongoliense, LP; Lactobacillus plantarum.
La figure 4 montre l'abondance relative de groupes de bactéries bénéfiques pour l'eubiose intestinale à 24h après le démarrage de la fermentation in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) en présence du prébiotique seul ou en présence de combinaisons symbiotiques (prébiotique + probiotique). Les groupes de bactéries bénéfiques sélectionnés comprennent les bifidobacteria, les lactobacilli, les clostridium cluster IV, les clostridium cluster XlVa et le gène butyryl-CoA:acetyl- CoA transférase. La méthode de mesure par qPCR 2^(-ΔΔCt) a été utilisée pour établir l'abondance relative, les mesures ont été normalisées par rapport aux bactéries totales et un mélange d'échantillons d'ADN de tous les extraits a été utilisé comme calibrateur. La fermentation in vitro, en fermenteur individuel, des combinaisons symbiotiques a été effectuée à L00E+07 CFU/ml de probiotique et de 0.1 g de prébiotique (même quantité pour la condition avec le prébiotique seul), en présence de 3% d'un inoculât de fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. La signifiance statistique a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel avec une comparaison multiple de type Dunnett et où * correspond à p < 0.05, ** à p < 0.01, *** à p < 0.01 , et **** à p < 0.0001. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, Inu : inuline, 2FL : 2' FL, BG : beta- glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophilum, CB : Clostridium butyricum, EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU: Bifidobacterium crudilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP; Lactobacillus plantarum.
La figure 5 montre la capacité du probiotique à survivre et à s'établir dans une communauté microbienne complexe. La figure 5 montre l'abondance relative de chaque probiotique par rapport aux bactéries totales à 12h, 24h et 48h après le démarrage de la fermentation pour différentes compositions symbiotiques. L'abondance relative de chaque probiotique est normalisée par rapport à la quantité relative de probiotique obtenu dans l'échantillon où seul le probiotique a été ajouté. Pour les prébiotiques, GoF : GOS/FOS, Inu : inuline, 2FL : 2' FL, BG : beta- glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus coagulons, BT : Bifidobacferium thermophilum, CB ; Clostridium butyricum, EF ; Enterococcus faecium, BAL; Bifidobacferium animalis lactis, LP; Lactobacillus plantarum.
La figure 6 montre l'évolution de la population bactérienne entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement: Les résultats sont montrés avec les compositions symbiotiques suivantes Enterococcus faecium (EF) + beta-glucane (BG); Bifidobacferium thermophilum (BT) + inuline (Inu); Clostridium butyricum (CB) + GOS/FOS (G/F); Bifidobacferium animalis lactis (BAL) + 2' FL (2FL); Bifidobacferium crudilactis (BG) + beta-glucane (BG); et la condition contrôle.
Les résultats correspondent aux abondances relatives de la quantité d'ADN de la bactérie cible par rapport à la quantité d'ADN des bactéries totales (méthode de mesure par qPCR 2^(-ΔΔCt)). La figure 7 montre l'impact d' une composition symbiotique comprenant Bifidobacterium thermophilum et inuline sur la production des acides gras volatiles (AGV), SCFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 8 montre l'impact d' une composition symbiotique comprenant Bacillus animalis lactis et 2' FL sur la production des acides gras volatiles (AGV), SCFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 9 montre l'impact d' une composition symbiotique comprenant Bacillus crudilactis et beta-glucane sur la production des acides gras volatiles (AGV), SCFA, entre la fin de la période destabilisation et la fin de la semaine de traitement.
La figure 10 montre l'impact d'une composition symbiotique comprenant Enterococcus faecium et beta-glucane sur la production des acides gras volatiles (AGV), SCFA entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement.
Comme indiqué précédemment, la présente invention se rapporte à une composition symbiotique comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de (iii) Clostridium butyricum, ou de (iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques.
Préférentiellement choisis dans le groupe constitué de l'inuline, du beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS, de l'amidon résistant et de leur mélange.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la formulation symbiotique contenant un probiotique et un prébiotique produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une stabilisation ou une augmentation des «Short Chain Fatty Acids, SCFAs» ainsi qu' une amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les Lactobacillus, les bifidobactéries, les Clostridium clusters IV et XlVa ainsi que les bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate, formant un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la génération d' un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Administrée à la truie en gestation et/ou au porcelet, la formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d' un microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le porcelet de manière durable contre la dysbiose à l'aide du probiotique et du prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Préférentiellement, la combinaison est choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05 et 1 ,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Avantageusement, selon l'invention, le probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d' un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière préférentielle, selon l'invention, la composition comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1 ,00E+05 et L00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et L00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+01 1 CFU/jour/animal. Préférentiellement, la quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Fermentation statique in vitro:
La capacité de fermentation des différentes combinaisons symbiotiques a été testée dans un modèle statique de fermentation in vitro, suivant le protocole décrit par Bindelle et col. Journal of Animal Science 2010, 87, 583-93. https://doi.orq/10.2527/ias.2007-0717 et par Tran et col. FEMS Microbiology Ecology 2016, 92, 1-13. https://doi.org/10.1093/femsec/fiyl 65. En résumé, la fermentation in vitro a été réalisée dans des flacons contenant 15 ml d' une solution contenant 3% de matières fécales de porcelet en pré-sevrage; trois supports recouverts de mucine préalablement immergés dans de la gélose à la mucine; 100 mg de prébiotique et 1 ,00E+07 CFU / ml de probiotique. Les flacons scellés ont été incubés à 39 ° C sous agitation pendant 48 h dans un bain-marie. Trois répétitions ont été réalisées par condition de test.
Production de gaz:
La pression du gaz a été mesurée 2, 5, 8, 12, 16, 20, 24 et 48h après le début de la fermentation pour la détermination de la cinétique de fermentation en utilisant le modèle mathématique monophasique de Groot et col. Animal Feed Science and Technology 1996, 64, 77-89. https://doi.org/10.1016/S0377- 8401 (96)01012-7. Plusieurs paramètres ont été calculés avec ce modèle: A (volume de gaz maximal, ml/g substrat), B (temps pouratteindre A/2, h), C comme constante déterminant la pente du point d'inflexion du profil, Rmax (taux de fermentation maximum, ml/g de substrat/heure) et Tmax (temps pour atteindre Rmax (h)).
Acides gras à chaîne courte:
Le lactate et les acides gras à chaîne courte (SCFA) ont été dosés dans le jus de fermentation obtenu après 24h par HPLC isocratique. La courbe standard utilisée contenait de l'acétate, du propionate, du butyrate ainsi que des acides gras à chaîne ramifiée (BCFA): isobutyrate, valérate et isovalérate.
La mesure de SCFA a ensuite été calculée en tenant compte de la production basale dans les flacons témoins-mucine contenant les supports de microcosme avec de la mucine. Les valeurs sont données en mmol par g de substrat et comparées aux mesures dans le jus de fermentation ne contenant que le prébiotique correspondant.
Détermination des modifications du microbiote par qPCR lors d’un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le système de fermentation statique in vitro, l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés après 24 heures de fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer l'expression par qPCR des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1.- Séquences des amorces sens (F) et anti-sens (R) pour mesurer par qPCR des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin. Les bactéries totales sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Amit-Romach E. et col. Poult Sci 2004, 83, 1093-1098, doi: 10.3382/ps/pey394.
Les bactéries faisant partie du groupe lactobacillus sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Wang R. F. et col. Appl Environ Microbiol 1996, 62, 1242-1247, doi: 10.1 128/AEM.62.4.1242-1247.1996. Les bactéries faisant partie du groupe bifidobacterium sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Langendijk P. S. et col. Appl Environ Microbiol 1995, 61 , 3069-3075, doi: 10.1 128/AEM.61 .8.3069-3075.1995.
Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster IV sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ Microbiol 2004, 70, 7220-7228, doi: 10.1 128/AEM.70.12.7220-7228.2004. Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster XlVa sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ Microbiol 2002, 68, 5445-5451 , doi: 10.1 128/aem.68.1 1 .5445-5451 .2002.
La Butyril-CoA:acetate-CoA transférase est ciblée à l'aide des amorces décrites dans Uerlings J. et col. J Sci Food Agric 2019, 99, 5720-5733, doi: 10.1002/isfa.9837.
Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de s’établir dans un écosystème microbien complexe par qPCR lors d’un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le modèle de fermentation statique in vitro, l'analyse et suivi de la présence de chaque probiotique dans le jus de fermentation a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés à 12, 24 et 48 heures après le début de la fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par RT-qPCR l'abondance relative des probiotiques sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2.- Séquences des amorces sens (F) et anti-sens (R) pour mesurer par qPCR l'abondance relative des probiotiques.
Références biblioaraohiaues du Tableau 2: Veiga, P., et col. 2010. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107: 18132-37, https://doi.org/10.1073/pnas.101 1737107.
Hidaka T., et col. Wafer Research 2010, 44, 2554-62, https://doi.org/10.1016/j.watres.2010.01 .007. Mathys S. et col. BMC Microbiology 2008, 8, 179, https://doi.org/10.1 186/1471 -2180- 8-179.
Cremonesi P. et col. Journal of Dairy Research 2012, 79,318-23, https://doi.org/! 0.1017/S002202991200026X.
Loquasto J.R. et col. Applied and Environmental Microbiology 2013, 79, 6903-10, https://doi.org/! 0.1 128/AEM.01777-13.
Hoormon M. et col. Applied and Environmental Microbiology 2005, 71 , 2318-24, https://doi.org/! 0.1 128/AEM.71 .5.2318.
Determination de la réponse immunitaire causée par incubation du jus de fermentation obtenu lors d’un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques.
Dans la cadre de la présente invention, la lignée IPEC-J2 (entérocytes intestinaux isolés du jéjunum d'un porcelet nouvellement né et non allaité (ou alimenté avec une formulation lactée) et appartenant à une lignée cellulaire ni transformée ni tumorigène) a été incubée dans le jus de fermentation produit par la combinaison symbiotique à tester ou contenant uniquement le prébiotique en question pendant 24h. A la suite de cette période d'incubation, la réponse immunitaire est évaluée par la production de cytokines induites (IL-8, IL-6, IL-1 b) et TNF-alpha.
Préalablement, la cytotoxicité des jus de fermentation sur les cellules IPEC-J2 a été évaluée car, pour pouvoir observer une réponse immunitaire, il est important que la lignée cellulaire reste viable. Pour chaque combinaison sélectionnée, l'effet des différentes concentrations en jus de fermentation, préalablement filtré à 0.8 pm, sur la viabilité des cellules IPEC-J2 a été mesurée par le test MTT (sel de tétrazolium MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tétrazolium), qui est un test colorimétrique de numérotation des cellules viables. Le contact avec les cellules IPEC-J2 a été ensuite réalisé avec un taux d'inoculation du jus de fermentation de 0.8% (V/V).
Mesure de la concentration d’IL-8:
Dans le cadre de la présente invention, la concentration d' IL-8 a été mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC-J2 en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester) (voir Figure 2) . Pour réaliser le test, un essai a été réalisé en comparant les concentrations de IL-8 (les autres marqueurs IL-6, IL-l b et TNF-alpha n'ont pas été détectés) produites en présence du jus de fermentation dans différentes conditions : témoin-mucine (ligne horizontale de la Figure 2), prébiotiques seules (conditions GOS/FOS (GF), 2FL, Inuline (Inu), amidon résistant (RS) et (3-glucane (BG)), et symbiotiques (les autres conditions de la Figure 2). Cet essai indique que, si le niveau de IL-8 est plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition prébiotique ou symbiotique comparé au jus de fermentation témoin-mucine, cela montre un effet antiinflammatoire de la présence du pré- ou symbiotique. En plus, si le niveau de IL-8 est plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition symbiotique comparé au jus de fermentation contenant uniquement le prébiotique, cela montre que la combinaison spécifique dudit au moins un probiotique avec ledit au moins un prébiotique possède un effet anti-inflammatoire supplémentaire par rapport au prébiotique seul. La viabilité cellulaire des symbiotiques (résultats du test MTT) a été prise en compte pour ajuster les concentrations d'IL-8. Le niveau d'expression d' IL-8 est déterminé par ELISA (Porcine IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA kit DY535: R&D Systems) .
Modèle BabySPIME :
Le modèle BabySPIME est un modèle scientifiquement validé (Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735. https://doi.Org/10.1016/j.mimet.2019) qui simule la dynamique et les conditions physiologiques d' un tractus gastrointestinal complet chez le porcelet dans un environnement in vitro (équipement dérivé du modèle SHIME de ProDigest Bvba, Gent, Belgium). Le modèle comprend 2 fois 3 réacteurs qui simulent de manière séquentielle l'estomac (condition acide et digestion par la pepsine), l'iléon (processus de digestion enzymatique) et le côlon proximal (processus de fermentation par le microbiote) (voir Figure 1 ). Ce système permet d'obtenir des communautés microbiennes complexes et stables dont la fonction et la structure sont fortement similaires aux communautés microbiennes retrouvées dans les différentes régions de l'intestin.
Des pompes péristaltiques permettent le transfert du milieu de culture, du jus pancréatique, de la bile, de l'acide (HCl 0.5M), de la base (NaOH 0.5M) et des liquides de fermentation d'un réacteur à l'autre au cours d' un cycle complet. En pratique, le réacteur 1 simule les fonctions de l'estomac, du duodenum et du jejunum, le réacteur 2 simule les fonctions de I' ileum, le réacteur 3 simule les fonctions du colon proximal.
Un essai complet dans le système babySPIME dure 3 semaines : 2 semaines de stabilisation du microbiote suivie par une semaine de traitement avec la composition symbiotique. Une solution de 1,00E+08 CFU/ml a été préparée pour inoculer une dose finale de 1,00E+07 CFU/ml de contenu intestinal. La dose de prébiotique est de 2 g de prébiotique/jour pour atteindre une concentration de 1 % de l'alimentation.
Les matières fécales de 6 porcelets âgé de 27 jours en allaitement et n'ayant pas subi de traitement antibiotique ont été utilisées pour préparer l'inoculat de l'étude. Les matières fécales ont été prélevées directement des porcelets et maintenues sur glace dans des conditions anaérobies. Pour chaque essai, l'inoculat a ensuite été homogénéisé pendant 10 minutes en ajoutant les matières fécales de chaque porcelet à une solution de tampon phosphate en condition anaérobie. Après une filtration macroscopique pour éliminer les particules encore en suspension, le filtrat a été injecté de manière simultanée dans les réacteurs 2 et 3. Avant l'inoculation, ces deux réacteurs ont été remplis avec un milieu de culture non- acidifié et le pH a été ajusté de manière automatique dans chaque réacteur de manière à simuler au mieux les conditions physiologiques.
Le milieu de culture a été préparé et validé préalablement. Les bouteilles de milieu ont été stockées à 4°C et le pH a été ajusté à 3.0 avant l' utilisation dans le premier réacteur. Une solution mimant le jus pancréatique contenant du bicarbonate de sodium (2.5 g/L, VWR Chemicals, Radnol, Pennsylvania, USA), de la pancréatine (0.9g/L, ProDigest) et des sels biliaires (Oxgall 4.0 g/L) a été ajoutée au milieu.
Le cycle d'alimentation est planifié 3 fois par jour basé sur un temps total de rétention de 14h. Au cours de chaque cycle, le milieu de culture, maintenu à 4°C, passe dans le réacteur 1 pendant 1 h30. Ensuite, le mélange de jus pancréatique/sels biliaires (60ml), aussi maintenu à 4°C, est ajouté dans le même réacteur pendant I h. Après ce temps, et de manière simultanée, le contenu des réacteurs 1 , 2 et 3 est transvasé, respectivement, dans les réacteurs 2, 3 ainsi que un conteneur biologique de déchet.
Les conditions anaérobies de tous les réacteurs sont maintenues grâce à un flux d'azote (N2) une fois par jour pendant 10 minutes au niveau des réacteurs. Le contenu des réacteurs est agité de manière continue (300 rpm) et maintenu à 39.5°C. Le pH des réacteurs 2 et 3 est contrôlé en continu afin de stabiliser le pH de l'iléum et du colon proximal.
Des prélèvements ont été collectés dans le système babySPIME durant la phase de stabilisation, avant le traitement avec les formulations symbiotiques et en fin de traitement avec le symbiotique.
Pour chaque essai dans le système babySPIME, l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés en fin de phase de stabilisation et à la fin de la semaine de traitement par une composition symbiotique. Les séquences des amorces sens et des amorces anti- sens utilisées pour mesurer par qPCR la quantité relative des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 mentionné plus haut.
Trois répétitions sur le modèle BABY-SPIME ont été réalisées pour chacune des combinaisons symbiotiques.
Exemples.-
Exemple 1 : La capacité de fermentation de la composition symbiotique par modélisation de la production de gaz et la production de lactate et SCFA dans un modèle de fermentation statique in vitro
Les courbes de la fermentation des pré- ou symbiotiques sont montrées dans la figure 3. Dans toutes les conditions de la Figure 3, il y a une augmentation de la capacité de fermentation mesurée par l'augmentation de la production de gaz. Dans toutes les conditions de la figure 3, cette production de gaz est plus importante en présence d'une composition symbiotique par rapport à la présence du prébiotique seul. Les paramètres issus de la modélisation de la production de gaz pendant la fermentation statique des symbiotiques sont comparés par rapport aux paramètres des prébiotiques seules (tableau 3) .
La cinétique de production de gaz et les paramètres du modèle incluent : A : la production maximale de gaz ; B : le temps pour avoir 50% de la production maximale de gaz ; C : la pente ; D : le taux maximal de production de gaz (Rmax) ; le temps à Rmax (Tmax). La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été réalisée à 1 ,00E+7 CFU/ml de probiotique et 0.1 g de prébiotique (même quantité de prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence de 3% d' un inoculât de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de 3 réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse statistique ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett. Les résultats sont considérés comme étant significatifs lorsque p < 0.05.
Les SCFAs présents dans le jus de fermentation après 24h de fermentation sont présentés dans le tableau 4. Il n'y avait pas de production de lactate après 24h de fermentation.
La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été réalisée à l ,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0,1 g de prébiotique (même quantité de prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence de 3% d' un inoculât de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de 3 réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse statistique ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett. Lorsque p < 0,05 : * ; p < 0,01 : ** ; p < 0,001 : *** ; p < 0,0001 : ****.
Example 2 : Détermination des modifications du microbiote par qPCR lors d' un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes compositions symbiotiques
L'abondance relative des bactéries bénéfiques après 24h de fermentation sont présentés dans la figure 4. La méthode de delta-delta CT a été utilisée pour exprimer les bactéries cibles par rapport aux bactéries totales. Les résultats des symbiotiques sont comparés par rapport aux prébiotiques seuls. Comme l'indique la figure 4, plusieurs compositions symbiotiques, comme BT-GF, CB- GF, BCO-GF, BCU-2FL, BMO-2FL, BAL-2FL, BAL-Inu, BT-Inu, CB-RS, BCU-RS, BAL-BG, LP- BG, ou BCU-BG, permettent d'augmenter de manière significative l'abondance relative des bactéries bénéfiques à 24h de fermentation.
Exemple 3 : Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de s'établir pendant la fermentation
La figure 5 montre la présence des probiotiques dans le jus de fermentation après 12, 24 et 48h de fermentation. Des compositions symbiotiques, comme BT-Inu, permettent un bon établissement et une bonne capacité de survie du probiotique.
Exemple 4 : Détermination de l'effet immunomodulateur de la composition symbiotique par quantification de la production d' IL-8 et NO par des cellules IPEC-J2.
La production d' IL-8 dans les cellules IPEC-J2 a été mesurée par un test
ELISA.
Après 24h d'incubation, la réponse immunitaire a été évaluée en mesurant la production d' IL-8 dans le milieu de culture cellulaire. Les cellules IPEC-J2 ont été incubées avec 0,8 % (V/V) de jus de fermentation préalablement stérilisé par filtration. De plus, le taux de survie des cellules IPEC-J2 est supérieur ou égal à 70% dans toutes les conditions testées de jus de fermentation.
Pour déterminer l'impact de la composition symbiotique contenue dans le jus de fermentation sur la production d' IL-8, le taux de production d' IL-8 a été mesuré dans une condition contrôle où le jus de fermentation contient un inoculât de fèces, de la mucine (témoin-mucine), mais en absence de probiotiques, de prébiotiques ou de symbiotiques. Dans cette condition contrôle, un niveau de base d'expression d' IL-8 est de 932 pg/ml (représenté par la ligne horizontale à la figure 2) . Les pré- et symbiotiques ont été comparés par rapport au témoin-mucine. En plus les symbiotiques ont été comparés par rapport au prébiotique pour estimer l'effet additionnel de probiotique. Le tableau 5 montre les p-valeurs de ces comparaisons, et la figure 2 montre les concentrations d'IL8.
Tableau 5.- Production d' IL-8 par les cellules IPEC-J2 dans le surnageant après 24h d'incubation avec 0,8% de jus de fermentation préalablement stérilisé par filtration produit par la composition symbiotique ou le prébiotique seul. Les valeurs sont corrigées en fonction de la viabilité cellulaire. Les résultats sont des moyennes avec leurs écart-types. Les comparaisons sont réalisées entre les compositions symbiotiques et le prébiotique seul. Les significativités statistiques sont analysées par une ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett. Lorsque p<0,05 : * ; p<0,01 : ** ; p<0,001 : *** ; p<0,0001 : ****.
Exemple 5 : Détermination des modifications du microbiote par qPCR lors d' un essai en modèle baby SPIME en présence de différentes compositions symbiotiques. Les résultats globaux obtenus sur le système baby SPIME sont présentés dans la figure 6 et le tableau 6.
Tableau 6.- Synthèse de la régulation à la hausse ou à la baisse de groupes bactériens d'intérêt suite au traitement symbiotique dans le système BABY- SPIME après une semaine de traitement avec les différents symbiotiques.
Nous retrouvons soit une diminution de la population bactérienne, soit une augmentation de la population bactérienne ou soit une stabilisation de la population bactérienne. Le test statistique réalisé est un test de Wilcoxon. Exemple 6 : Composition symbiotique Cl comprenant au moins
Clostridium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition Cl en ajoutant 1 E07 CFU/ml Clostridium bufyricum et 0, 1 g de GOS/FOS.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1 g de GOS/FOS a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15ml de jus de fermentation. Pour le mélange GOS/FOS, le prébiotique consiste en une solution liquide homogène de 80% (p/p) de GOS et 20% (p/p) de FOS. Au niveau du probiotique, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1 ,5E08 CFU/ml (solution stock) . Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37°C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1 E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique comprenant au moins Clostridium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale a montré un effet favorable sur la fermentation, en augmentant la valeur A (production maximale de gaz) par rapport au prébiotique seul (voir condition CB-GoF du Tableau 3, et en augmentant les concentrations de SCFAs totales et butyrate après 24 heures de fermentation statique in vitro (voir condition CB-GoF du Tableau 4). En plus, l'abondance relative des Bifidobacteries et lactobacilles a augmenté en comparaison avec le prébiotique seul (voir condition CB-GF de la Figure 4). Le probiotique Clostridium butyricum était encore présent dans le jus de fermentation après 48h de fermentation. Un effet anti-inflammatoire est montré in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d' IL-8 par rapport au GOS/FOS seul, tandis que la concentration d' IL-8 n'était pas différent par rapport au témoin-mucine (voir condition CB-GF de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique Cl montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate. L'augmentation de ces populations bactériennes a été analysée par qPCR (voir condition CB + G/F de la Figure 6 et Tableau 6 présentés plus haut). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 .
Exemple 7 : Composition symbiotique C2 comprenant au moins Bifidobacterium thermophilum et au moins l'inuline contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C2 en ajoutant 1 E07 CFU/ml de Bifidobacterium thermophilum et 0,1 g d'inuline.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1 g d'inuline a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15ml de jus de fermentation. Au niveau du probiotique Bifidobacterium thermophilum, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1 ,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37°C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1 E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C2 comprenant Bifidobacterium thermophilum (BT) et de l'inuline (Inu) contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à l'inuline seule (voir condition BT-Inu du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate et l'abondance relative des bifidobactéries dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BT-Inu de la Figure 4), Bifidobacterium thermophilum était bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par rapport à l'inuline seule (pas de différence entre le symbiotique et le témoin-mucine) selon le protocole décrit à l'exemple 1 (voir condition BT-Inu de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique C2 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant une tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BT + INU de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 . En parallèle, une analyse des AGV (Figure 7) a pu montrer une tendance à l'augmentation du valérate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.066) et une tendance à l'augmentation des AGV totaux dans l'iléon (p = 0.090). Exemple 8 : Composition symbiotique C3 comprenant au moins Bifidobacterium animalis lactis et au moins 2' FL contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C3 en ajoutant 1 E07 CFU/ml de Bifidobacterium animalis lactis et 0,1 g de 2' FL.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de 2' FL a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15ml de jus de fermentation. Au niveau du probiotique Bifidobacterium animalis lactis, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixée dans une solution tampon à une concentration de 1 ,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37°C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1 E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C3 contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à 2' FL seule (voir condition Bal-2FL du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate (voir condition BAL-2FL du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium clusters IV dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BAL-2FL de la Figure 4), Bifidobacterium animalis lactis était bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 (voir condition BAL-2FL de la Figure 2) par rapport à 2' FL seul et par rapport au témoin-mucine selon le protocole de l'exemple 1.
De plus, la composition symbiotique C3 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes de bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BAL + 2FL de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer parqPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dons le Tableau 1 . En parallèle, une analyse des acides gras volatiles (AGV) (Figure 8) a pu montrer une augmentation significative de l'acétate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.034) et dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.023). Une tendance à l'augmentation de l'acétate dans le fermenteur mimant le colon ascendant (p = 0.075) et une tendance à la diminution de l'isobutyrate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.076) et colon ascendant (p = 0.095) ont également été observées.
Exemple 9 : Composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C4 en ajoutant 1 E07 CFU/ml de Bifidobacterium crudilactis et 0,1 g de beta-glucane.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1 g de beta-glucane a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15ml de jus de fermentation. Au niveau du probiotique Bifidobacterium animalis lactis, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1 ,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37°C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en probiotique de 1 E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacferium crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition BCU-BG du Tableau 3). En plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des SCFAs totales et de butyrate (voir condition BCU-BG du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium clusters XlVa dans le jus de fermentation est démontré (voir condition BCU-BG de la Figure 4). Un effet anti-inflammatoire est démontré in vitro sur des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d' IL-8 par rapport au beta- glucaneseule et parrapport au témoin-mucineselon le protocole décrit à l'exemple 1 (voir condition BCU-BG de la Figure 2) . De plus, la composition symbiotique C4 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant une tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BG + BG de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 .
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 9) a montré une diminution significative de l'isobutyrate (p = 0.018) dans les fermenteurs iléons et colons ascendants tandis qu'une tendance à la baisse des AGV totaux a été observée dans le colon ascendant (p = 0.058).
Exemple 10 : Composition symbiotique C5 comprenant Enterococcus faecium et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
La composition symbiotique C5 contre la dysbiose intestinale a montré un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A (production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation (Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition EF-BG du Tableau 3). En plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des SCFAs totales et de butyrate dans le jus de fermentation est démontré (voir condition EF- BG du Tableau 4).
De plus, la composition symbiotique C5 montre une amélioration du microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations bactériennes impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate. L'augmentation de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition EF + BG de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 .
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 10) a montré une diminution significative du valérate dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.0096). Une tendance à la diminution de l'isovalérate a également été observée dans l'iléon (p = 0.099) et dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.052).
Exemple 11 : Compositions symbiotiques administrées in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement Le tableau 7 ci-dessous décrit les différentes compositions symbiotiques (SYN) donnée in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante et/ou aux porcelets en allaitement.
Tableau 7.- Différentes compositions symbiotiques (SYN) testées in vivo. Exemple 12 : Protocole de supplémentation in vivo aux truies et aux porcelets.
La supplémentation en symbiotique des truies a commencé à partir du 80ème jour de gestation et elle a été distribuée manuellement sous forme de portion directement ajoutée dans l'assiette de chaque truie (top feeding) une fois par jour avec un repas. La supplémentation du symbiotique a continué pendant toute la période de lactation (d'allaitement) de trois semaines. Les symbiotiques ont été préparés, c'est-à-dire mélangés à un aliment standard de croissance, juste avant le début des expériences et conservés dans un endroit frais et sec. Un groupe de truies non supplémentées a été utilisé comme groupe de référence/contrôle pour la comparaison. Les truies ont été distribuées en différents groupes selon leur parité, afin d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale entre les groupes (4). Après 80 jours de gestation, les truies ont été placées dans des enclos individuels avec une alimentation individuelle distribuée automatiquement deux fois par jour. Après 1 15 jours de gestation, les truies ont été transférées dans des loges de mise- bas individuelles. Les truies étaient nourries deux fois par jour avec une distribution automatique et avaient un accès illimité à l'eau en appuyant sur un bouton au- dessus de leur assiette. La supplémentation des compositions symbiotiques (exemples 13, 15, 17, 19, 21 du tableau 7) était effectuée une fois par jour le matin.
Le tableau 8 ci-dessous indique la dose de probiotique et de prébiotique administrée aux truies en fonction du stade de développement (gestation ou allaitante).
Tableau 8.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux truies.
Les combinaisons symbiotiques sélectionnées consistaient en une seule souche de probiotique avec un seul prébiotique (voir exemples 13 (SYN 1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7) . Les combinaisons symbiotiques qui comprenaient un oligosaccharide du lait comme prébiotique ont été remplacées par de l'inuline pour la supplémentation des truies. Les exemples 14 (SYN 1 ), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5) du tableau 7 indiquent les compositions symbiotiques administrées aux porcelets en allaitement.
Pendant la phase d'allaitement, les porcelets restaient avec leur mère dans des enclos de maternité dont le sol était recouvert d' un grillage en plastique. Les porcelets avaient un accès illimité à la tétée et, à partir du premier jour après la naissance, une assiette fixée au sol était placée dans chaque enclos. Pendant la première semaine suivant la naissance, les porcelets ont reçu une fois par jour un substitut de lacto-remplaceur. Pendant les deuxième et troisième semaines de lactation, les porcelets ont reçu un aliment humide de transition.
La supplémentation symbiotique des porcelets a commencé le lendemain de la naissance, chaque loge de maternité a reçu un complément de lacto-remplaceur dans une assiette fixée au sol. La supplémentation du symbiotique s'est poursuivie pendant toute la période d'allaitement de trois semaines. La supplémentation symbiotique a été interrompue au moment du sevrage. Ainsi, aucune supplémentation symbiotique n'a été donnée aux porcelets pendant la période post-sevrage. Les portées/porcelets qui ont reçu les symbiotiques ont été comparées aux portées/porcelets non supplémentés.
Les solutions prébiotiques (dissoutes dans l'eau potable) ont été préparées une fois par semaine et conservées au réfrigérateur (+4°C). La poudre de probiotiques et la solution de prébiotiques étaient fraîchement mélangées chaque jour juste avant la distribution. Les compositions symbiotiques ont été administrées à une dose établie pour une portée moyenne de 15 porcelets recevant 2 ml de symbiotique par porcelet et par jour pendant la première semaine, et 4 ml par porcelet et par jour de la deuxième semaine jusqu'au sevrage. La composition symbiotique a été distribuée aux porcelets en l'administrant dans l'aliment d'allaitement qui leur a été donné pendant la première semaine et avec l'aliment liquide de transition humide jusqu'au sevrage.
Le tableau 9 ci-dessous indique la dose de probiotique et de prébiotique administrée aux porcelets en fonction du stade de développement.
Tableau 9.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux porcelets.
Exemples 13 à 22 : Différentes compositions symbiotiques administrées in vivo aux truies et aux porcelets.
Les exemples 13 (SYN 1 ), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées à la truie en gestation ou allaitante. Les exemples 14 (SYN 1 ), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées aux porcelets en allaitement.
Exemples 23 à 43 : Impact de différents protocoles d'administration d' une composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement sur différents critères zootechniques du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
À la naissance, les porcelets ont été comptés (vivants, morts et momifiés) et le poids total de la portée des porcelets vivants a été enregistré. Un jour avant le sevrage, les porcelets ont été comptés et le poids total de la portée des porcelets vivants a été enregistré. Les porcelets ont été sevrés trois semaines après la mise bas, à l'âge de 21 jours environ. Au moment du sevrage, les porcelets ont été transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement, réorganisés selon le sexe (mâle ou femelle) et la taille (petit, moyen, grand) en groupes d'environ 25 porcelets par enclos. Deux semaines après le sevrage, les porcelets ont été comptés et pesés.
Le tableau 10 ci-dessous indique les différents protocoles d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement.
Tableau 10.- Différents protocoles/profils d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet.
Le tableau 7 indique la composition en prébiotique et en probiotique de chaque SYN indiquée au tableau 10. Les tableaux 8 et 9 reprennent les doses administrées. Différents critères zootechniques ont été mesurés sur le porcelet en allaitement et sur le porcelet en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration des différentes compositions symbiotiques. Ces différents critères zootechniques sont : le poids du porcelet (kg) (voir tableau 1 1 ) la gain quotidien moyen, GQM (g/jour) (voir tableau 12) la quantité (score) de diarrhée (%) (voir tableau 13)
Les scores de diarrhées ont été mesurés en attribuant à chaque loge/portée le score le plus élevé selon l'échelle de score de diarrhée basée sur la consistance des matières fécales. L'échelle de cotation utilisée comprenait cinq catégories : score 0 - granule dur ; 1 - granule mou et sec ; 2 - granule humide/forme molle ; 3 - granule mou et non formé ; 4 - aqueux. Seul le score 4 était considéré comme une diarrhée. Les observations de la diarrhée ont eu lieu deux fois pendant l'expérience, 3 jours avant le sevrage et 10 jours après le sevrage. Les jours d'observation des scores de diarrhée ont été choisis pour ne pas coïncider avec la pesée des porcelets ni avec la collecte des matières fécales afin d'éviter d'interférer avec les résultats en raison du stress causé par les manipulations sur les porcelets.
Le tableau 1 1 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 11.- Poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
Certains profils d'administration de compositions symbiotiques, comme SYN 1 et SYN 2 (exemple 26 ou 29) (voir tableau 10), permettent une augmentation significative du poids du porcelet par rapport à la condition contrôle en phase de post-sevrage ou en phase d'allaitement (voir par exemple SYN 3 à l'exemple 32) . Les compositions symbiotiques impliquant SYN 5 (Exemples 40 à 43) sont des contre-exemples montrant que certaines compositions symbiotiques ne seront pas forcément positives pour la prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. Le tableau 12 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le gain quotidien moyen (GQM) du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 12.- GQM du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
Les résultats du tableau 12 montrent que les profils d'administration impliquant SYN 1 (exemple 26), SYN 3 (exemples 32, 33) et SYN 4 (exemples 34-36) permettent un meilleur gain quotidien moyen du porcelet par rapport à la condition contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Le tableau 13 ci-dessous reprend l'impact de différents profils d'administration du SYN sur le score de diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage.
Tableau 13.- Diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage en fonction de différents profils d'administration du SYN.
Les profils d'administration impliquant SYN 3 et SYN 4 permettent une réduction des diarrhées sévère (score 4) du porcelet par rapport à un porcelet contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Ces résultats montrent qu'en fonction de la composition symbiotique et en fonction du profil d'administration, certaines compositions auront un impact positif direct (par rapport à la condition contrôle) sur les critères zootechniques pour porcelet en allaitement tandis que d'autres auront un effet de rémanence en ayant un impact positif plus marqué sur les critères zootechniques pour le porcelet en postsevrage.
Exemple 44 : Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium, C. butyricum, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est indiquée en g/truie/jour (voirTableau 14).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à 4 stades de développement différents : avant mise bas, une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas, 3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas.
Au 76e jour de gestation, les truies ont été pesées. Les truies ont ensuite été réparties dans trois groupes différents en fonction de leur parité, afin d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale dans tous les groupes. Le jour 80 après l'insémination, les truies ont été placées dans des enclos individuels. Au 107e jour de gestation, les truies ont été pesées. Au 108e jour de gestation, les truies ont été transférées dans des cases individuelles dans la maternité. La mise-bas a été planifiée pour le jour 1 15 de la gestation avec une injection de Planate® et l'involution utérine a été facilitée par une injection de dinolytic® après la mise bas.
À la naissance, les porcelets ont été comptés et leur poids individuel a été enregistré. Les porcelets étaient logés avec les truies dans des loges de maternité avec un accès continu à la tétée. Dès le premier jour, après que toutes les truies aient fini de mettre bas, la taille des portées a été équilibrée au moyen d'adoptions entre les portées d'un même traitement. Les porcelets ont été pesés individuellement chaque semaine. Dans cette expérience, les porcelets ont été sevrés quatre semaines après la mise bas, à environ 28 jours d'âge. Au moment du sevrage, une sélection de 2 mâles et de 2 femelles de la même portée a été effectuée en fonction du poids corporel moyen dans le traitement. Lorsque cela n'était pas possible, on a choisi des porcelets de poids et de sexe appropriés provenant d'une autre portée du même groupe de traitement. Les porcelets sélectionnés ont été transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement.
Pendant la période de post-sevrage, ils ont reçu une alimentation dépourvue de tout complément alimentaire (dépourvu de toute composition symbiotique). Les porcelets ont été contrôlés quotidiennement le matin pour vérifier leur état de santé général et surveiller l'apparition de diarrhées. Les mangeoires étaient remplies selon les besoin. Les enclos étaient nettoyés à l'eau tous les jours. Une fois parsemaine, les porcelets étaient pesés et la consommation d'aliments était notée.
Tableau 14.- Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium, C. butyricum, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
MB : mise-bas ; G : jour de gestation
Les 5 stades de développement sont G80-G107 (entre 80 jours et 107 jours de gestation, avant mise bas), 1 semaine après mise bas, 2 semaines après mise base,
3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas. Exemple 45 : Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium,
B. animalis lactis, B. crudilactis, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est indiquée en g/truie/jour (voir Tableau 15).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : G80-G107 (entre 80 et 107 jours de gestation, avant mise bas, MB), une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas et 3 semaines après mise bas. Tableau 15.- Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium,
B. animalis lactis, B. crudilactis, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
MB : mise-bas ; G : jour de gestation
Exemple 46 : Composition symbiotique contre la dysbiose intestinale et doses administrées in vivo au porcelet
Dans un essai in vivo (première expérience), le symbiotique 1 (SYN 1 ) est composé de Clostridium butyricum et GOS/FOS (80/20) et le symbiotique 2 (SYN 2) est composé de B. animalis lactis et 2' FL (voir Tableau 16). La condition contrôle était juste de l'eau potable. De manière contrôlée, les porcelets ont ingéré une quantité déterminée de symbiotique, qui a augmenté avec l'âge. La composition symbiotique a été préparé quotidiennement en mélangeant un mélange prébiotique de 0,4 g de prébiotique par ml dans l'eau potable avec le probiotique correspondant (6E08 CFU/ml). Le mélange prébiotique de GOS/FOS contenait 0,32 g/ml de GOS et 0,08 g/ml de FOS selon les proportions des oligosaccharides du lait de truie. La solution prébiotique a été préparée chaque semaine et stockée à +4°C jusqu'à son utilisation. Avant l'administration, les mélanges symbiotiques ont été amenés à température ambiante. Les compositions symbiotiques ont été administrées dès la naissance, à des intervalles de plus en plus rapprochés et à des doses croissantes avec l'âge, jusqu'au sevrage au 28e jour postnatal (voir tableau 16). Aucune composition symbiotique n'a été administrée pendant la période de post-sevrage. Les volumes des compositions symbiotiques administrés étaient les suivants :
1 ,25 ml/porcelet jusqu'au samedi compris qui suit,
1.75 ml/porcelet les deux jours suivants,
2,5 ml/porcelet jusqu'au vendredi inclus de la semaine suivante,
3.75 ml/porcelet la deuxième semaine dès le lundi,
5 ml/porcelet ensuite dès le lundi de la troisième semaine. Tableau 16.- Volumes et doses de compositions symbiotiques administrées aux porcelets durant la phase de lactation de la naissance au sevrage (J28) . On a observé que l'administration d' une composition symbiotique comprenant plusieurs probiotiques, comme SYN 6 ou SYN 7 (exemples 44 et 45), ne permet pas une plus grande prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en postsevrage, ni un plus grand gain quotidien moyen du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport à une composition comprenant un seul probiotique, comme SYN1 ou SYN 2 (exemple 46), ou par rapport à une condition contrôle (porcelet contrôle) n'ayant pas reçu de composition symbiotique. De plus, les compositions symbiotiques SYN 6 et SYN 7 augmentent la quantité de diarrhée (score 4) du porcelet en allaitement de respectivement 10% et 17% par rapport à la condition contrôle. Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.

Claims

« Revendications »
1. Composition symbiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant, une quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de
(i) Enterococcus faecium, ou de
(ii) Bifidobacterium animalis lactis, ou de
(iii) Clostridium butyricum, ou de
(iv) Bifidobacterium crudilactis, comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
2. Composition selon la revendication 1 , dans laquelle ledit un ou plusieurs prébiotiques est choisi dans le groupe constitué de l'inuline, du beta- glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS (galacto-oligosaccharide, fructo- oligosaccharide), de l'amidon résistant et de leur mélange.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre l,00E+05 et L00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre l,00E+06 et l,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre l,00E+07 et 1 ,00E+01 1 CFU/jour/animal.
4. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle une quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
5. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus taecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
6. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
7. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, sous forme de combinaison comprenant ledit probiotique en quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs prébiotiques, la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium crudilactis et 2'fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et beta- glucanes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et beta-glucanes, Clostridium butyricum et 2'fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus taecium et beta-glucanes, Enterococcus taecium et inuline, Enterococcus taecium et 2'fucosyllactose, Enterococcus taecium et GOS/FOS, Enterococcus taecium et l'amidon résistant.
8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle la combinaison étant préférentiellement choisie dans le groupe constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose, Enterococcus taecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta- glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre l,00E+05 et 1 ,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre l,00E+06 et l,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre l,00E+07 et l ,00E+01 1 CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, contenant au moins un excipient conventionnel, sous forme liquide ou solide.
10. Composition selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit probiotique et/ou ledit un ou plusieurs prébiotiques et/ou ledit au moins un excipient conventionnel se présentent sous forme encapsulé(s) et/ou sous forme de poudre et/ou sous forme de granulé(s) et/ou sous forme liquide, dans laquelle ledit probiotique et ledit un ou plusieurs prébiotiques de la composition sont administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
1 1. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique pour
(i) diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage, et/ou
(ii) augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post- sevrage.
12. Aliment complet ou complémentaire pour animaux d'élevage comprenant ladite composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , ledit aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations lactées et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
13. Aliment pour nouveau-né animal comprenant ladite composition selon l' une quelconque des revendications 1 à 1 1 et une base lactée compatible avec l'alimentation du nouveau-né.
14. Utilisation d' une composition selon l' une des revendications 1 à 1 1 , à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage dans laquelle la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et 100E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1 ,00E+01 1 CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, ledit probiotique et ledit prébiotique de la composition étant administrée de manière simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
15. Utilisation d'une composition selon l' une des revendications 1 à 1 1 , pour la fabrication d' un médicament pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
16. Méthode de traitement ou de prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage comprenant une administration d' une composition selon l' une des revendications 1 à 1 1 à une truie en gestation ou non, par exemple une truie allaitante, et/ou au porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
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