EP4182084A1 - Probenträger und rotationsvorrichtung - Google Patents

Probenträger und rotationsvorrichtung

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EP4182084A1
EP4182084A1 EP21783225.2A EP21783225A EP4182084A1 EP 4182084 A1 EP4182084 A1 EP 4182084A1 EP 21783225 A EP21783225 A EP 21783225A EP 4182084 A1 EP4182084 A1 EP 4182084A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
channel
sample
cooling
chamber
sample carrier
Prior art date
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Pending
Application number
EP21783225.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Schwemmer
Gregor GROSS-CZILWIK
Niklas Virks
Nils Paust
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dermagnostix GmbH
Original Assignee
Spindiag GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Spindiag GmbH filed Critical Spindiag GmbH
Publication of EP4182084A1 publication Critical patent/EP4182084A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • B01L2400/0442—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces thermal energy, e.g. vaporisation, bubble jet
    • B01L2400/0445—Natural or forced convection

Definitions

  • the invention relates to a sample carrier for use in a method for amplifying DNA and a rotation device which is also set up and provided for use in such a method.
  • the invention relates to the use of such a sample carrier and such a rotation device in a method for amplifying DNA.
  • DNA deoxyribonucleic acid or English: deoxyribonucleic acid
  • DNA is often - in addition to scientific genetic analyses, paternity tests and the like - analyzed to examine existing diseases or detected to detect pathogens.
  • SARS-CoV-2 due to the spread of SARS-CoV-2 and the tests required for detection, this has also become comparatively well known.
  • a sample e.g. B. a smear
  • RNA specific areas of a DNA contained therein (optionally RNA) are duplicated. If RNA is detected or analyzed in a sample (e.g. to detect a virus), this is first transcribed into DNA by so-called “reverse transcription” and then multiplied.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA is typically in the form of a double helix structure, consisting of two complementary single strands of DNA.
  • the DNA is first through an increased temperature of the liquid reaction mixture between typically 90 and 96 degrees Celsius separated into two individual strands ("denaturation phase").
  • the temperature is then lowered again ("annealing phase", typically in the range of 50-70 degrees Celsius) in order to enable specific attachment of so-called primer molecules to the individual strands.
  • the primer molecules are complementary, short DNA strands that bind to the individual strands of the DNA at a defined point.
  • the primers serve as the starting point for an enzyme, the so-called polymerase, which in the so-called elongation phase fills in the basic building blocks (“dNTPs”) of the DNA to complement the existing DNA sequence of the single strand.
  • dNTPs basic building blocks
  • a double-stranded DNA is formed again.
  • the elongation is typically performed at the same temperature as the annealing phase or at a slightly elevated temperature typically between 65 and 75 degrees Celsius. After the elongation, the temperature is increased again for the next denaturation phase.
  • the primer molecules and the above Basic building blocks are also present in the reaction mixture. These are usually contained in a starting mixture to which the sample is fed.
  • thermocycling This cycling of the temperature in the liquid reaction mixture between the two to three temperature ranges described above is called PCR thermocycling and is typically repeated in 30 and 50 cycles. In each cycle, the specific DNA region is amplified.
  • the thermocycling of the liquid reaction mixture is implemented in a reaction vessel by controlling the external temperature.
  • the reaction vessel is z. B. in a thermal block, in which the PCR thermocycling takes place by heating and cooling a located with the reaction vessel in thermal contact solid. In this way, heat from the liquid in the reaction mixture is supplied or removed.
  • Alternative heating and cooling concepts for implementing PCR thermocycling include controlling the temperature of fluids (esp. air and water), which flow around the reaction vessel as well as radiation-based concepts, e.g. B. by introducing heat by IR radiation or laser radiation.
  • the invention is based on the object of accelerating a polymerase chain reaction, in particular the entire course of the analysis.
  • sample carrier according to the invention and the rotation device according to the invention are preferably used together, but alternatively also independently of one another (ie the sample carrier independently of the rotation device and vice versa) in a method for amplifying or detecting (“detecting”) DNA.
  • a (or the inventive) sample carrier specifically at least one cavity of the sample carrier, is preferably first filled with a sample liquid that preferably or (e.g. in the case of an examination for pathogens) at least potentially contains DNA.
  • the sample carrier is then rotated about a rotation axis by means of a rotation device (or the rotation device according to the invention).
  • the cavity preferably the sample carrier, is heated to a high temperature by means of a heating device on a heat input side lying in (ie in particular parallel to) a plane of rotation. There is preferably no heating on the side opposite the heat input side. Due to the heating, a convection flow of the sample liquid is generated inside the cavity.
  • the convection flow is generated essentially annularly, with a first flow section extending approximately parallel to the heat input side, a second flow section from the heat input side to the opposite heat discharge side (also: “cooling side”), a third flow section parallel to the heat discharge side and a fourth flow section again (from the heat discharge side) back to the heat input side.
  • the sample liquid is preferably conducted through a denaturation zone (which in particular has a high temperature value), a so-called annealing zone (also: primer hybridization zone) and an extensions zone and back to the denaturation zone.
  • a denaturation zone which in particular has a high temperature value
  • annealing zone also: primer hybridization zone
  • extensions zone and back to the denaturation zone.
  • a period of circulation of a liquid particle of the sample liquid along a flow path of the convection flow is specified (in particular “controlled”) by means of the rotational speed of the rotation.
  • the period of circulation of the liquid particle is also influenced by other parameters, such as e.g. B. the geometry of the cavity, the viscosity of the sample liquid, the density of the sample liquid, the resulting temperature gradient and the like.
  • a temperature gradient (which is therefore aligned in a decreasing direction from the heat input side to the heat output side) is preferably perpendicular to a dominant force, in particular the centrifugal force resulting from the rotation, on the sample liquid in the cavity imprinted.
  • a fluid exchange required for the polymerase chain reaction takes place between the denaturing zone and the annealing zone via the flow portions or flow sections (ie the second and fourth flow sections) directed perpendicularly to the plane of rotation described above.
  • the flow portions or flow sections ie the second and fourth flow sections
  • orbital period is understood here and in the following in particular to mean the period (time) that the (particularly infinitesimal) liquid particle requires to pass through the denaturation zone, the annealing zone (also: primer hybridization zone) and the extension Zone to flow back to the denaturation zone.
  • the rotation time can be set to times in the range between 0.1 s and 20 s by means of the number of revolutions (thus by means of the rotation speed).
  • An average flow velocity of the order of up to 22 mm/s can thus be set within the corresponding cavity, which corresponds to a reaction chamber of the sample carrier.
  • a particularly fast polymerase chain reaction is made possible by such a short cycle time and/or such a high flow rate, so that advantageously process time can be saved.
  • the corresponding cavity on the heat discharge side (or also: “cooling side”) opposite the heat input side is cooled to a low temperature value compared to the high temperature value on the heat input side.
  • the temperature of the annealing zone (and the extensions zone optionally contained therein) can be set and in particular the sample liquid in the area of the annealing zone can be prevented from heating up increasingly or at least to a negligible extent.
  • the sample carrier according to the invention is for use in the rotation-based method for duplication described above and also below established and provided for by DNA.
  • the sample carrier has a disc-like base body.
  • the sample carrier has a number of preferably microfluidic cavities formed in the base body, in which, in an intended method step, a sample liquid which, at least potentially (especially in the case of an analysis for the presence of pathogens), DNA (or optionally alternatively RNA ) contains is included.
  • a flat side (or disk side) of the base body preferably forms a heat input side and the flat side (or disk side) facing away from this (ie the heat input side) forms in particular a heat discharge side (also referred to as “cooling side”).
  • the cavity or one of possibly several cavities is formed by an annular channel--ie preferably a loop-like or ring-like channel--with a first and a second channel section.
  • These two channel sections are at least indirectly fluidically connected at both longitudinal ends by means of a respective connecting section (or connecting channel).
  • the first channel section is also arranged offset in the thickness direction (ie in particular in the direction of the intended axis of rotation) of the base body with respect to the second channel section. In other words, one of the two channel sections is offset towards the heat input side and the other towards the cooling side.
  • disk-like is understood in particular in the sense of “plate-like”, i.e. in particular to mean that the corresponding body has a flat extension that is many times greater than its thickness - preferably fundamentally independent of the geometry of its flat Extension-limiting outer contour.
  • microfluidic means in particular that the at least one cavity has dimensions of less than 0.5 or even 0.1 millimeters up to 10 to 15 millimeters. In particular, at least one dimension, for example a width or depth, is in the range of less than 0.5 millimeters. A longitudinal extent, in particular of cavities forming a channel, can also exceed the 15 millimeters described above.
  • the ring channel preferably forms a process or reaction chamber in which a polymerase chain reaction (PCR for short) takes place when the sample carrier is used as intended.
  • PCR polymerase chain reaction
  • This is supported by the shape of the cavity as a ring channel, since a flow driven by convection and gravity can form particularly easily in this way, in particular by the respective “liquid particles” flowing through the individual channel sections one after the other in accordance with the above description.
  • the liquid particles in the more heated channel section can "rise” against the centrifugal force during rotation, whereas the cooler and therefore denser or heavier liquid particles in the other channel section "sink” in the direction of the centrifugal force.
  • the second and fourth flow sections described above here run through the connecting channels between the first and second channel sections.
  • the offset of the first duct section and the second duct section towards the heat input side or towards the cooling side also advantageously allows the heat input and the heat output (i.e. in particular the cooling) to be primarily concentrated on the corresponding (i.e. closer) duct section affect, are preferably limited to this. In other words, the effect of cooling on the passage portion shifted toward the heat input side is reduced.
  • the first channel section is on the heat input side (i.e. towards it) and the second channel section is on the cooling side of the sample carrier (i.e. H. offset towards this) arranged.
  • the first channel section is preferably used for introducing heat into the sample liquid, and the second correspondingly for discharging heat. More preferably, the first and second channel sections are also aligned parallel to the direction of the centrifugal force (applied during the intended processing) (ie in particular radial to the axis of rotation about which the sample carrier is rotated when used as intended).
  • the first duct section (in the above-mentioned case) has a reduced cross-sectional area (at least in regions) compared to the second duct section (which is arranged offset to the cooling side).
  • the reduced cross-sectional area leads on the one hand to an increase in the flow speed and consequently also to a reduced dwell time of the individual “liquid particles” in the first channel section.
  • the surface available for the heat input is usually smaller, so that the possible heat input is limited.
  • the first duct section which is preferably arranged on the heat input side (i.e. offset towards it), has (in addition to or as an alternative to the reduced cross-sectional area) compared to the second duct section, which is arranged in particular on the cooling side, (at least in regions) an in Disk surface direction of the body directed, reduced channel width.
  • the "attack surface" for the heat input is smaller than that for the heat output.
  • the heat output can be matched to the heat input.
  • this makes it possible to design the cooling in a particularly simple manner, in particular using the ambient atmosphere. Active and thus energy-intensive generation of cold can thus advantageously be omitted. Active heating, on the other hand, is regularly required anyway.
  • the second channel section comprises a cooling channel and a cooling channel in an expedient embodiment, preferably in the intended flow direction of the sample liquid during processing, subsequent annealing channel designed with a channel width that is reduced compared to the cooling channel.
  • the cooling channel serves to enable the process liquid to be cooled as quickly as possible.
  • the cooling within the annealing channel is reduced, so that the temperature conditions here are as constant as possible.
  • the cross-sectional area of the cooling channel and the annealing channel is the same and/or selected in such a way that the annealing channel has a greater “depth”, ie a greater extension in the thickness direction of the base body.
  • the flow rate also remains at least approximately the same.
  • the cross-sectional area of the annealing channel is also reduced compared to the cooling channel, so that the flow rate is increased here and the residence time is therefore also reduced.
  • DNA basic building blocks can already be deposited inside the cooling channel on denatured DNA strands fed in from the first channel section due to the heating there.
  • the annealing channel alternatively has the same channel width as the cooling channel, but in contrast to it the greater depth.
  • the volume in the annealing channel is increased compared to the cooling channel, so that the cooling is opposed by a larger amount (specifically a larger volume) of sample liquid and the cooling is thus slowed down.
  • the first channel section also includes two sub-chambers (or “sub-sections”), which are referred to as “denaturation channel” and “resistance channel”.
  • the resistance channel is "upstream”, i.e. in the intended direction of flow ahead of the denaturation channel (and thus in particular downstream of the annealing channel).
  • the resistance channel is designed with a reduced width compared to the denaturation channel, preferably with a reduced cross-sectional area. As a result, the sample liquid is accelerated in the resistance channel. in particular In particular, this resistance channel influences the flow rate in the annealing channel on the one hand and also (e.g.
  • the resistance channel advantageously also represents a “control element” in terms of design for the respective temperature values within the sample liquid.
  • the denaturing channel is omitted.
  • the denaturing can also take place in the first channel section, which in this case is in particular designed only as a resistance channel, particularly with a suitable process control—for example, heating from the outside and/or a comparatively low rotational speed.
  • the shaping (or: “structuring”) of the ring channel described above advantageously enables the cycle time and the individual temperature values to be specified (or: “control”) by means of the channel cross sections or channel profiles and/or by means of the rotational speed.
  • the channel geometry can be adapted to the process parameters (e.g. heating and cooling temperature values) specified by means of an analysis device (in particular the rotation device described in more detail below) in such a way that a time limit is not (or no longer) primarily specified by heating or cooling periods, but at least 20% or more through biochemical processes.
  • first and the second channel section are offset to one another in the direction of the pane surface in addition to the offset in the direction of thickness.
  • the sample carrier has a thermal insulation layer.
  • This underlies the second channel section at least over part of its length in the direction of the heat input side (or, depending according to viewing direction, superimposed; in general terms, the thermal insulation layer is thus arranged between the second channel section and the heat input side).
  • the thermal insulation layer is only assigned to the cooling channel described above (e.g. underlaid), so that the heat input into the cooling channel is prevented or at least reduced to a negligible extent and the heat dissipation significantly predominates.
  • a heat input into the subsequent annealing channel is "allowed" in this optional case, so that the sample liquid in this channel is only cooled to a lesser extent or the temperature is even approximately (ie with a difference of a few degrees Celsius, For example, equal to or less than 10 or 5 degrees Celsius) can be kept constant.
  • the ring channel is connected to a bubble trap chamber in an inlet area through which the ring channel is filled (in particular with the sample liquid) when used as intended.
  • an incision that connects the bubble trap chamber to the ring channel is preferably designed with such a large thickness that it is possible for gas bubbles that normally occur to pass through from the ring channel into the bubble trap chamber.
  • a thickness of the gate of at least 100 microns - especially at a rotation speed of 20 Hz - is sufficient for the passage of the gas bubbles into the bubble trap chamber. Gas bubbles appear in particular due to the heating of the sample liquid.
  • the annular channel is preferably filled with enough sample liquid for the sample liquid to at least partially fill the bubble trap chamber. This further simplifies the flow of the bubbles out of the ring channel into the bubble trap chamber, since there are no Liquid-gas interface needs to be overcome.
  • the bubble trap chamber is expediently arranged radially on the inside of the annular channel, given the intended rotation of the sample carrier. As a result, the gas bubbles, which are lighter than the sample liquid, can “rise” against the rotation-driven gravitational field, i.e. move radially inwards.
  • a bubble trap chamber is preferably provided for each of the first and second channel sections, which also preferably extend in the radial direction.
  • the annular duct has a third duct section which is connected between the first and the second duct section in terms of fluid guidance, in particular downstream of the second duct section.
  • This third channel section is preferably aligned (at least approximately) parallel to the first and the second channel section. Viewed in the thickness direction of the base body of the sample carrier, however, the third channel section is arranged between the first and the second channel section.
  • the target temperature values in the first channel section are around 85 to 100, in particular 95 degrees Celsius, in the second channel section around 50 to 75, preferably around 60 degrees Celsius and (if available) in the third channel section around 65 to 80, preferably by about 72 degrees Celsius, e.g. to support an elongation of the DNA.
  • the sample body has several of the annular channels described above, each of which has different structures (ie preferably dimensions, in particular with regard to their cross sections and widths). This results in different dwell times of the sample liquid in the individual areas, so that in a sample carrier - especially with constant heating and cooling conditions - with different borrowed process parameters (in particular different temperature values and / or cycle times), optionally with different biochemistry, can be tested.
  • the rotation device according to the invention described in more detail below optionally represents an independent invention and is therefore independent of the sample carrier described above. Nevertheless, the use of the sample carrier described above in the rotation device described here and below is particularly advantageous.
  • the rotation device according to the invention is set up and provided for use in the rotation-based method described above.
  • the rotation device has an analysis chamber and a sample holder arranged in the analysis chamber.
  • the latter is for holding at least one sample carrier, in particular the sample carrier described above, which has a number of cavities formed in the (or a) base body, in which a sample liquid that at least potentially contains DNA is received in a specified method step.
  • the rotation device has a rotation drive, by means of which the sample holder is rotated about a rotation axis during normal operation.
  • the rotation device has a heating device, by means of which an atmosphere in a partial area of the analysis chamber forming a heating chamber is tempered to a target heating temperature during normal operation, and a cooling device, by means of which an atmosphere in a partial area of the analytical chamber forming a cooling chamber is heated to a temperature during normal operation Target cooling temperature is tempered.
  • the heating chamber and the cooling chamber are fluidically separated from one another by the sample holder, at least in cooperation with the sample carrier held thereon.
  • the rotation device has a controller (also referred to as a "control device"), which is linked in terms of control technology to the rotation drive and the heating device as well as to the cooling device and is set up to specify a rotation speed of the sample holder and the target heating temperature and the target cooling temperature.
  • the heating and cooling therefore preferably takes place via the respective temperature-controlled atmosphere of the heating or cooling chamber.
  • the respective atmosphere is particularly preferably air. This results in a particularly simple construction of the rotation device.
  • the controller is formed at least in its core by a microcontroller with a processor and a data memory, in which the functionality for carrying out the method is implemented in the form of operating software (firmware), so that the method - possibly in interaction with operating personnel - is carried out automatically when the operating software is executed in the microcontroller.
  • the controller can also be formed by a non-programmable electronic component, e.g. an ASIC, in which the functionality for carrying out the method is implemented using circuitry means.
  • the rotation device has a housing that surrounds the analysis chamber and thus the heating chamber and the cooling chamber together.
  • the housing does not partition the analysis chamber. Rather, the subdivision into the heating chamber and the cooling chamber is effected by the sample holder or sample carrier.
  • the sample holder or the sample carrier held thereon during normal operation forms a sealing gap with a housing wall, in particular a side wall of the housing. This is dimensioned in such a way that a reduction or even suppression of a gas exchange between the heating chamber and the cooling chamber is made possible.
  • the width of the sealing gap ie a distance between the sample holder or sample carrier and the side wall
  • the housing wall forms a type of labyrinth seal between the heating chamber and the cooling chamber with the sample holder or the sample carrier.
  • Labyrinth seals regularly have a comparatively high Sealing effect in contactless sealing concepts.
  • a circumferential groove is preferably formed into the housing wall, in particular the side wall, into which the sample holder or sample carrier engages.
  • the sealing gap here also has dimensions of preferably equal to or less than 1 mm.
  • the analysis chamber is preferably designed as a circular cylinder.
  • the sample holder forms a circular disc on its own or at least with one or more sample carriers attached to it.
  • the sealing gap is preferably the same all around.
  • the housing can preferably be opened or dismantled for loading the sample holder and optionally also for maintenance purposes.
  • a parting plane of the housing is expediently arranged in the groove described above.
  • the sample holder of the rotation device is set up to accommodate the sample carrier on a heat input side (here of the sample holder) facing the heating chamber.
  • a heat input side here of the sample holder
  • the rotary drive is arranged in the area of the cooling chamber.
  • the sample holder has at least one window connecting the heat input side and the cooling side (of the sample holder).
  • a region of the number of cavities to be cooled or heated (in particular the first or second channel section) of the sample carrier is connected through this window to the cooling chamber or the heating chamber for heat transfer.
  • the area to be cooled (in particular the second channel section) of the sample carrier is in connection with the cooling chamber if the sample carrier is positioned on the heat input side of the sample holder (and thus in the heating chamber).
  • its (in particular second) channel section offset towards the cooling side optionally protrudes into the window or through it towards the cooling side.
  • the sample carrier is on the cooling side of the sample holder is to be arranged, this applies analogously to the area to be heated.
  • the sample holder has a thermal insulation layer. This is arranged in such a way that at least part of the region of the number of cavities of the sample carrier to be cooled and/or heated is shielded from the temperature effects of the heating chamber or cooling chamber during normal operation. This is the case in particular when the sample carrier itself does not have a thermal insulation layer.
  • the thermal insulation layer of the sample holder is optionally formed by an element arranged separately on the sample holder, for example a material with low thermal conductivity.
  • the heat insulation layer of the sample holder serves the same purpose as the heat insulation layer of the sample carrier according to the invention described above.
  • the cooling device of the rotating device has a controllable valve for connecting the cooling chamber to the surroundings of the rotating device and/or a fan for (in particular actively) flooding the cooling chamber with ambient atmosphere, preferably ambient air.
  • Active cooling by means of a type of air conditioning system or the like (that is to say with active refrigeration) can therefore be omitted.
  • This is particularly advantageous in that this configuration—the controllable valve or the fan—is technically easy to implement.
  • the target cooling temperature in the cooling chamber is specified in particular by the controller at approximately 50 degrees Celsius (ie with a deviation of, for example, +/-5 degrees Celsius).
  • This temperature value which is comparatively high compared to the usual ambient temperature, results from (optionally targeted) leakage through the sealing gap described above and/or from thermal conduction effects through the sample holder.
  • a temperature sensor is preferably arranged in the cooling chamber and connected to the controller for temperature control to this temperature value. When the temperature rises, the controller opens the valve or valves so that an exchange with the environment can take place. If applicable and if available, the controller also activates the fan in order to be able to transport more ambient atmosphere, in particular air, through the cooling chamber and thus increase the cooling effect.
  • the controller is preferably set up to control the heating device in such a way that a temperature of approximately 80 to 120 degrees Celsius is present in the heating chamber.
  • a temperature sensor is preferably also arranged in the heating chamber.
  • the heating device optionally has heating wires, surface heating or the like. Since, during normal operation, the sample holder rotates with the sample carrier(s) held thereon, the atmosphere in the heating chamber is advantageously swirled and the temperature is thus homogenized. In addition, due to the movement of the sample carrier relative to the atmosphere, the convective heat transfer is improved, in particular since standing boundary layers between the sample carrier and the heating chamber that have an insulating effect are repeatedly dissolved or do not form.
  • the sample carrier according to the invention described above is used in the method described at the outset.
  • the sample carrier is consequently first filled with the sample liquid, which at least potentially contains DNA, and rotated about a rotation axis by means of a rotation device, optionally the rotation device according to the invention described above.
  • At least the first channel section is heated to a high temperature at least in sections by means of the atmosphere tempered by the heating device, whereby a convection flow of the sample liquid is generated within the annular channel of the corresponding cavity.
  • the rotation device according to the invention one can optionally be used which, instead of the heating device described above, has contact or surface heating, preferably integrated in the sample holder, for tempering the atmosphere in the heating chamber.
  • the first channel section (or the one to be heated) is heated on one side by thermal conduction, for example by means of a Peltier element or a resistance heater.
  • the rotation device according to the invention described above is used in the method described at the outset.
  • a sample carrier other than the sample carrier according to the invention described above can also be used here.
  • the sample carrier according to the invention is preferably used.
  • at least one section of the cavity or one of optionally several cavities of the sample carrier is heated to a high temperature value at least in sections by means of the atmosphere that is temperature-controlled by means of the heating device, and another section (preferably the same cavity) is heated by means of the prefers cooler atmosphere chilled. Due to the heating, in particular due to the temperature difference brought about by the additional cooling, a convection flow of the sample liquid is generated within the corresponding cavity.
  • FIG. 1 shows a sample carrier with a number of cavities in a schematic view of an underside
  • FIG. 1 shows a sample carrier 1 in a roughly schematic manner, which is set up and provided for use in a rotation-based method for amplifying or detecting DNA, described in more detail below with reference to FIG. 4 .
  • the sample carrier 1 has a disc-shaped—ie flat—base body 2 that is semicircular in the present exemplary embodiment.
  • a filling chamber 4 shown here only as an example, into which a sample taken can be introduced, a process chamber 6 arranged “downstream” thereto, and a connecting channel 8 between these two.
  • the size of the process chamber 6 compared to the base body 2 is shown here in a greatly exaggerated manner to clarify the properties described in more detail below.
  • FIGS. 2 and 3 show two exemplary embodiments of a rotation device 10 which is also set up and provided for use in a rotation-based method for amplifying DNA, preferably together with the sample carrier 1 .
  • the rotation device 10 has a housing 12 which, with its side wall 14, encloses a circular-cylindrical housing interior, referred to below as “analysis chamber 16”. Furthermore, the rotation device 10 has a sample holder 18 .
  • the sample carrier 1 is held on this when the method is carried out (i.e. during normal operation).
  • the sample holder 18 can be rotated about an axis of rotation 22 by means of a rotary drive 20 .
  • the sample holder 18 is a turntable.
  • the sample holder 18 is arranged in the analysis chamber 16 in such a way that it divides it into two parts.
  • the upper part in FIGS. 2 and 3 forms a heating chamber 24.
  • the rotary device 10 has a heating device 26 which is set up to heat the atmosphere, specifically the air in the heating chamber 24.
  • the lower part of the analysis chamber 16 in FIGS. 2 and 3 forms a cooling chamber 28.
  • the rotation device 10 has a cooling device 30 for its temperature control. In the illustrated embodiment, this includes a fan 32, by means of which the cooling chamber 28 in the intended Be- drove with a flow of cooling air, which is formed by sucked in outside air, is flowed through.
  • the cooling device 30 includes a controllable valve 34 through which air can be discharged from the cooling chamber 28 into the environment or admitted without the fan 32 being activated.
  • a controller of the rotation device 10 for controlling the rotation drive 20, the heating device 26 and the cooling device 30, ie the fan 32 and the valve 34 is present but not shown in detail.
  • a sealing gap 36 between the side wall 14 and the sample holder 18 is kept at less than 1 mm.
  • the housing 12 can be opened up by means of a joint 38 between the heating chamber 24 and the cooling chamber 28 .
  • the sample holder 18 can be loaded easily and/or the rotation device 10 can be serviced.
  • the outer edge of the sample holder 18 lies in a groove 40 which is worked into the side wall 14 . This creates a labyrinth seal (see FIG. 3).
  • the housing 12 of the exemplary embodiment according to FIG. 2 can also be folded open in order to be able to load the sample holder 18, but not necessarily in the plane of the sample holder 18.
  • the sample carrier 1 is automatically drawn into the rotating device 10—comparable to a CD or DVD drive.
  • the rotation device 10 has a code reader for reading in, for example, barcodes and/or QR codes, by means of which an analysis result for the current sample can be forwarded in a specified manner to a database via a network.
  • the sample carrier 1 and the sample containing DNA are provided in a first method step S1 (see FIG. 4).
  • the sample liquid forms after the sample has been introduced into the filling chamber 4 and, in addition to the DNA to be amplified, also contains primer molecules, deoxynucleoside triphosphates (“dNTPs”), structural building blocks for the formation of new DNA strands as well as polymerase and co-factors of the polymerase .
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • the liquid is buffered.
  • a liquid is preferably stored in the filling chamber 4 or in another chamber, not shown, which is used to “wash out” the sample material from a sample carrier (e.g. a swab) and as a carrier liquid for the above-mentioned reagents.
  • a sample carrier e.g. a swab
  • some of these reagents are also only added in the form of upstream (dry) substances in the process chamber 6 .
  • the filled sample carrier 1 is placed on the sample holder 18 and fastened to it. The sample carrier 1 rests on a heat input side 40 of the sample holder 18 located in the heating chamber 24 .
  • a third method step S3 the air in the heating chamber 24 is heated to about 100 degrees Celsius by means of the heating device 26. In the method described, this represents a high temperature value.
  • the rotary drive 20 drives the sample holder 18 to rotate about the axis of rotation 22 , so that each cavity of the sample carrier 1 is also rotated about the axis of rotation 22 .
  • the air in the cooling chamber 28 is tempered to a low temperature value of approximately 50 degrees Celsius by means of the cooling device 30 . Due to the rotation of the sample holder 18, there is also a movement and thus mixing of the air in the heating chamber 24 and in the cooling chamber 28.
  • the process chamber 6 of the sample carrier 1 has a channel structure which runs in the shape of a ring and is in turn formed by a first channel section 50 and a second channel section 52 .
  • These channel sections 50 and 52 are elongated and run (at least approximately, ie optionally with an angular offset of a few, single angular degrees) parallel to one another and (at least approximately parallel) to a - in the mood-related operating state on the axis of rotation 22 perpendicular - radials.
  • the two channel sections 50 and 52 are aligned in the direction of the centrifugal force during the intended rotation during the process.
  • the channel sections 50 and 52 are each fluidically connected at the ends by connecting channels 54 .
  • the channel sections 50 and 52 are offset from one another in the direction of the thickness of the base body 2 , ie in the direction of the axis of rotation 22 .
  • the first channel section 50 is offset towards a heat source when the sample carrier 1 is in the intended operating state, ie towards the heating chamber 24 in the present exemplary embodiment of the rotation device 10 .
  • the second channel section 52 is offset toward the cooling chamber 28 .
  • the sample holder 18 has a window 56 through which air can flow from the cooling chamber 28 to the second channel section 52.
  • the second channel section 52 protrudes beyond the level of the heat input side 40 of the sample holder 18 and thus lies in the window 56 or even protrudes to the underside, i.e. into the cooling chamber 28 beyond the sample holder 18 (not shown).
  • step S3 comparatively more heat is introduced into the first channel section 50 due to its greater "closeness" to the heating chamber 24 (seen in relation to the second channel section 52) than into the second channel section 52. Due to the rotation of the sample holder 18 and the resulting heat Relative movement to the air, the convective heat exchange of the two channel sections 50 and 52 with the heating chamber 24 and the cooling chamber 28 is supported.
  • a temperature gradient that runs parallel to the axis of rotation 22 forms within the channel structure of the process chamber 6 . Due to the rotation, an artificial gravitational field occurs radially to the axis of rotation 22 . Furthermore, the temperature gradient leads to differences in density in the sample liquid. These temperature-related density differences, in conjunction with the artificial gravitational field, lead to a buoyancy-driven convection flow, the main flow direction of which is fundamentally radial due to the artificial gravitational field. In other words, the main lift component is radially inward.
  • liquid elements flow radially inwards due to their heating in the first channel section 50 and the associated decrease in density.
  • liquid elements flow radially outwards due to the force of gravity. Since the two channel sections 50 and 52 are connected to form a ring, the liquid elements flow radially inwards from the first channel section 50 through the connecting channel 54 into the second channel section 52 and at its end back into the first channel section 50. Due to the centrifugal forces of the rotation (directed to the right in FIG.
  • the second channel section 52 has two partial or “sub-chambers”, of which the radially inner one is referred to as the “cooling channel 58” and the one connected to it radially on the outside as the “annealing channel 60”.
  • the cooling channel 58 has a greater width than the annealing channel 60 in the direction of the plane of the base body 2, so that the fastest possible cooling to an “annealing temperature” of about 65 degrees Celsius is made possible.
  • the cross section of the annealing channel 60 is selected to be smaller than that of the cooling channel 58 so that a comparatively higher outflow speed and thus a reduced heat dissipation, as well as a lower heat loss at the transition to the first channel section 50, is made possible.
  • the first channel section 50 also has two partial chambers, of which the radially outer side is referred to as the resistance channel 62 and the radially inner side as the denaturing channel 64 .
  • the resistance channel 62 has a cross section that is further reduced in comparison to the annealing channel 60 and also the connecting channel 54 .
  • the sample liquid is accelerated and the flow through the annealing channel 60 is also controlled (or also: predetermined).
  • the temperature from, for example, 90 to 100, in particular about 95 degrees Celsius
  • the present exemplary embodiment the temperature (from, for example, 90 to 100, in particular about 95 degrees Celsius) can be kept at least approximately constant due to its enlarged cross section—in the present exemplary embodiment.
  • the differences from the previous exemplary embodiment lie in the dimensions of the annealing channel 60 in relation to the cooling channel 58 and in the design of the first channel section 50.
  • the annealing channel 60 has the same "depth" or "height" (i.e. in the direction of the axis of rotation 22 running extent) as the cooling channel 58.
  • the first channel section 50 is designed to be almost conformal over its entire length.
  • resistance channel 62 and denaturation channel 64 is not made here.
  • the first channel section 50 is designed in the manner of a nozzle with a comparatively elongated, tapered central part.
  • Denaturation also takes place here in the tapered middle section as soon as the appropriate temperature is reached.
  • This is possible in an exemplary embodiment - at least in the case of a rotary device with contact heating - in which the cross-sectional area of the first channel section 50 (in its tapered area) is 0.162 mm 2 and the second channel section 52 is designed in such a way that at a rotational speed of 10 Hz the Sample carrier 1, the sample liquid remains in the first channel section 50 for such a long time that the denaturing temperature value is reached.
  • the cross-sectional area of the first channel cross-section 50 can be correspondingly reduced due to the higher flow rate then.
  • the thermal insulation layer is a gas-filled “cushion”, e.g. a hollow or foamed plate.
  • FIGS. A further exemplary embodiment of the process chamber 6 is shown in FIGS.
  • the annealing channel 60 is narrower but deeper than the cooling channel 58 .
  • the volume in the annealing channel 60 is increased, so that the heat loss can be kept low, although the thermal insulation layer 66 is only placed underneath the cooling channel 58 here.
  • the denaturing channel 64--again pronounced here-- is designed in a manner comparable to the exemplary embodiment according to FIGS.
  • the first and second channel sections 50 and 52 are offset from one another in a tangential direction. On the one hand, this simplifies the intermediate storage of the thermal insulation layer 66, but on the other hand it also makes it possible - particularly in the event that the base body 2 is designed to be transparent at least in the area of the process chamber 6 - to monitor the processes within the two channel sections 50 and 52, e.g by means of a fluorescence detector or the like.
  • the two channel sections 50 and 52 are assigned an inlet 68 (or also: “inlet area”), via which the filling with the sample liquid takes place.
  • This inlet 68 has two inlet chambers, also referred to as “bubble traps 70”, each of which is in fluid communication with one of the two channel sections 50 and 52 via a gate 72.
  • the amount of sample liquid supplied is selected in such a way that after channel sections 50 and 52 have been filled as intended, i.e. when there is sample liquid in both channel sections 50 and 52 and in connecting channels 54, there is also sample liquid in bubble traps 70 parts of the sample liquid are still standing.
  • the incisions 72 are dimensioned in such a way that gas bubbles, which form during normal operation due to the heating of the sample liquid, can “rise” through the liquid against the artificial gravitational field into the bubble traps 70 and collect there without “clogging” the incisions. . This is favored by the partially filled bubble traps 70.
  • the dimensions of the channel sections 50 and 52 and the connecting channels 54 are selected in such a way that at rotational speeds in the range of 5 to 40 Hz, the sample liquid in the annealing chamber 60 has a temperature of about 65 degrees Celsius and in the first channel section 50 above the melting temperature of the DNA, specifically above 90 degrees Celsius, in particular at around 90 degrees Celsius.
  • method steps S1 to S3 can also take place at least partially at the same time.
  • the sample holder 10 does not have to stand still while the process chamber 6 is being filled.
  • the heating device 26 can already heat the air in the heating chamber 24 .
  • method step S3 is maintained for a specified duration. Then, in a fourth method step S4, the rotation of the sample holder 10 and the heating by means of the heating device 26 are stopped.
  • the fourth method step S4 can also be initiated if a sufficiently high conversion of reagents is detected by means of the above-mentioned fluorescence detector.

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Abstract

Ein erfindungsgemäßer Probenträger (1), der zur Verwendung in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung oder Detektion von DNA eingerichtet und vorgesehen ist, weist einen scheibenartigen Grundkörper (2) und eine Anzahl von in dem Grundkörper (2) ausgebildeten Kavitäten (4, 6, 8) auf, worin in einem bestimmungsgemäßen Verfahrens-schritt (S1,...,S4) eine Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, aufgenommen ist. Eine Scheibenseite des Grundkörpers (2) bildet eine Wärmeeintragsseite (39) und die dieser abgewandte Flachseite eine Wärmeaustragsseite. Die Kavität (6) oder eine von gegebenenfalls mehreren Kavitäten (4, 6, 8) ist durch einen Ringkanal mit einem ersten und einem zweiten Kanalabschnitt (50, 52) gebildet, die an beiden Längsenden mittels jeweils eines Verbindungsabschnitts (54) fluidisch verbunden sind. Der erste Kanalabschnitt (50) ist in Dickenrichtung des Grundkörpers (2) zu dem zweiten Kanalabschnitt (52) versetzt angeordnet.

Description

Beschreibung
Probenträger und Rotationsvorrichtung
Die Erfindung betrifft einen Probenträger zur Verwendung in einem Verfahren zur Vervielfältigung von DNA sowie eine Rotationsvorrichtung, die ebenfalls zur Verwendung in einem solchen Verfahren eingerichtet und vorgesehen ist. Außerdem betrifft die Erfindung jeweils die Verwendung eines solchen Probenträgers sowie einer solchen Rotationsvorrichtung in einem Verfahren zur Vervielfältigung von DNA.
DNA (Desoxyribonukleinsäure oder englisch: desoxyribonucleic acid) wird häufig - neben wissenschaftlichen Erbgutanalysen, Vaterschaftstests und dergleichen - zur Untersuchung auf vorliegende Krankheiten analysiert oder zum Nachweis von Krankheitserregern detektiert. Aktuell ist dies aufgrund der Ausbreitung von SARS-CoV-2 und den zur Detektion erforderlichen Tests auch vergleichsweise bekannt geworden. Für die Analyse (oder: Detektion) müssen dabei ausgehend von einer Probe - z. B. einem Abstrich, einer Blutprobe oder dergleichen - spezifische Bereiche einer darin enthaltenen DNA (optional auch RNA) vervielfältigt werden. Im Fall des Nachweises oder der Analyse von RNA in einer Probe (z. B. zum Nachweis eines Virus) wird diese zunächst durch sogenannte „reverse transcription“ in DNA umgeschrieben und anschließend vervielfältigt.
Zur Vervielfältigung der DNA wird üblicherweise die sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR) in einem flüssigen Reaktionsansatz angewendet. Die DNA liegt typischerweise in Form einer Doppelhelix-Struktur, bestehend aus zwei komplementären DNA Einzelsträngen, vor. Bei der PCR wird die DNA zunächst durch eine erhöhte Temperatur des flüssigen Reaktionsansatzes zwischen typischerweise 90 und 96 Grad Celsius in zwei Einzelstränge aufgetrennt („Denaturierungs- Phase“).
Anschließend wird die Temperatur wieder gesenkt („Annealing-Phase“, typischerweise in einen Bereich von 50-70 Grad Celsius), um eine spezifische Anlagerung von sogenannten Primer-Molekülen an die Einzelstränge zu ermöglichen. Die Primer-Moleküle sind komplementäre, kurze DNA-Stränge, die an einer definierten Stelle an den Einzelsträngen der DNA anbinden. Die Primer dienen als Startpunkt für ein Enzym, der sogenannten Polymerase, das in der sogenannten Elongations- Phase die Grundbausteine („dNTPs“) der DNA komplementär zur vorliegenden DNA-Sequenz des Einzelstranges auffüllt. Dabei entsteht ausgehend von dem Primer Molekül wieder eine doppelsträngige DNA. Die Elongation wird typischerweise bei der gleichen Temperatur wie bei der Annealing Phase oder bei einer leicht erhöhten Temperatur typischerweise zwischen 65 und 75 Grad Celsius durchgeführt. Nach der Elongation wird die Temperatur wieder für die nächste Denaturierungsphase erhöht. Die Primer-Moleküle sowie die o. g. Grundbausteine sind ebenfalls in dem Reaktionsansatz vorhanden. Üblicherweise sind diese in einer Ausgangsmischung, der die Probe zugeführt wird, enthalten.
Dieses vorstehend beschriebene Zyklieren der Temperatur im flüssigen Reaktionsansatz zwischen den zwei bis drei Temperaturbereichen wird PCR Thermocyc- ling genannt und typischerweise in 30 und 50 Zyklen wiederholt. In jedem Zyklus wird der spezifische DNA Bereich vervielfältigt. Typischerweise wird das Ther- mocycling des flüssigen Reaktionsansatzes in einem Reaktionsgefäß durch die Kontrolle der äußeren Temperatur umgesetzt. Das Reaktionsgefäß befindet sich dabei z. B. in einem Thermoblock, in dem das PCR Thermocycling durch Heizen und Kühlen eines sich mit dem Reaktionsgefäß in thermischen Kontakt befindlichen Festkörpers erfolgt. Wärme aus der Flüssigkeit des Reaktionsansatzes wird so zu- bzw. abgeführt. Alternative Heiz- und Kühlkonzepte zur Umsetzung des PCR Thermocyclings sind unter anderem die Temperaturkontrolle von Fluiden (ins. Luft und Wasser), welche das Reaktionsgefäß umströmen sowie strahlungsbasierte Konzepte, z. B. durch Einbringung von Wärme durch IR-Strahlung oder Laserstrahlung.
Bei einer üblichen Polymerase-Kettenreaktion liegen die Prozessdauern im Bereich im Bereich von typischerweise 45 min bis 3 h und sind mithin vergleichsweise zeitaufwändig.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Polymerase-Kettenreaktion, insbesondere den gesamten Ablauf der Analyse zu beschleunigen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch einen Probenträger mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Des Weiteren wird diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Rotationsvorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 9. Außerdem wird diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Verwendung mit den Merkmalen des Anspruch 15 sowie durch eine Verwendung mit den Merkmalen des Anspruchs 16. Vorteilhafte und teils für sich erfinderische Ausführungsformen und Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung dargelegt.
Der erfindungsgemäße Probenträger und die erfindungsgemäße Rotationsvorrichtung kommen vorzugsweise gemeinsam, alternativ aber auch unabhängig voneinander (d. h. der Probenträger unabhängig von der Rotationsvorrichtung und umgekehrt), in einem Verfahren zur Vervielfältigung oder zum Nachweis („Detektion“) von DNA zum Einsatz. Verfahrensgemäß wird dabei vorzugsweise zunächst ein (oder der erfindungsgemäße) Probenträger, konkret wenigstens eine Kavität des Probenträgers mit einer Probenflüssigkeit, die vorzugsweise oder (bspw. im Fall einer Untersuchung auf Krankheitserreger) zumindest potentiell DNA enthält, befällt. Anschließend wird der Probenträger mittels einer (oder der erfindungsgemäßen) Rotationsvorrichtung um eine Rotationsachse rotiert. Die Kavität, vorzugsweise der Probenträger, wird dabei mittels einer Heizvorrichtung an einer in (d. h. insbesondere parallel zu) einer Rotationsebene liegenden Wärmeeintragsseite auf einen hohen Temperaturwert erwärmt. Vorzugsweise unterbleibt eine Erwärmung auf der der Wärmeeintragsseite gegenüberliegenden Seite. Aufgrund der Erwärmung wird eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb der Kavität erzeugt. Vorzugsweise wird die Konvektionsströmung dabei im Wesentlichen ringförmig erzeugt, wobei sich ein erster Strömungsabschnitt insbesondere etwa parallel zur Wärmeeintragsseite erstreckt, ein zweiter Strömungsabschnitt von der Wärmeeintragsseite zur gegenüberliegenden Wärmeaustragsseite (auch: „Kühlseite“), ein dritter Strömungsabschnitt parallel zur Wärmeaustragsseite und ein vierter Strömungsabschnitt wieder (von der Wärmeaustragsseite) zur Wärmeeintragsseite zurück. Dadurch wird die Probenflüssigkeit vorzugsweise durch eine Denaturierungszone (die insbesondere einen hohen Temperaturwert aufweist), eine sogenannte Annealing-Zone (auch: Primerhybridisierungs-Zone) und eine Ex- tensions-Zone und zurück zur Denaturierungszone geführt. Eine Umlaufdauer eines Flüssigkeitsteilchens der Probenflüssigkeit entlang eines Strömungspfads der Konvektionsströmung wird hierbei insbesondere mittels der Drehzahl der Rotation vorgegeben (insbesondere „gesteuert“).
Insbesondere wird die Umlaufdauer des Flüssigkeitsteilchens zusätzlich auch von weiteren Parametern beeinflusst, wie z. B. der Geometrie der Kavität, der Viskosität der Probenflüssigkeit, der Dichte der Probenflüssigkeit, dem sich einstellenden Temperaturgradienten und dergleichen.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen einseitigen Erwärmung der Kavität wird - anders ausgedrückt - ein Temperaturgradient (der mithin in abnehmender Richtung von der Wärmeeintragsseite zur Wärmeaustragsseite ausgerichtet ist) vorzugsweise senkrecht zu einer dominierenden Kraft, insbesondere der aus der Rotation resultierenden Zentrifugalkraft, auf die Probenflüssigkeit in der Kavität aufgeprägt.
Insbesondere erfolgt ein für die Polymerase-Kettenreaktion erforderlicher Fluidaustausch zwischen der Denaturierungs-Zone und der Annealing-Zone über die vorstehend beschriebene senkrecht zur Rotationsebene gerichteten Strömungsanteile bzw. Strömungsabschnitte (d. h. den zweiten und vierten Strömungsabschnitten). Vorzugweise sind neben den vorstehend beschriebenen vier Strömungsabschnitten zusätzlich aber auch quer dazu strömende Anteile aufgrund der Zentrifugalkraft und/oder der Corioliskraft vorhanden. Dies führt dabei vorteilhafterweise zu einer zusätzlichen Vermischung der Probenflüssigkeit, so dass eine möglichst homogene Vermengung von Reaktionspartnern - d. h. zu vervielfältigender DNA, Primer-Molekülen und „Strangbausteinen“ - ermöglicht wird.
Unter dem Begriff „Umlaufdauer“ wird hier und im Folgenden insbesondere die Dauer (Zeit) verstanden, die das (insbesondere infinitesimale) Flüssigkeitsteilchen benötigt, um durch die Denaturierungszone, die Annealing-Zone (auch: Primer- hybridisierungs-Zone) und die Extensions-Zone zurück zur Denaturierungszone zu fließen. Die Umlaufdauer kann mittels der Drehzahl (mithin mittels der Rotationsgeschwindigkeit) auf Zeiten im Bereich zwischen 0,1 s und 20 s eingestellt werden. Innerhalb der entsprechenden Kavität - die einer Reaktionskammer des Probenträgers entspricht - kann so eine durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit in der Größenordnung von bis zu 22 mm/s eingestellt werden.
Durch eine derart geringe Umlaufdauer und/oder eine derart hohe Strömungsgeschwindigkeit wird eine besonders schnelle Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht, so dass vorteilhafterweise Prozesszeit eingespart werden kann.
In einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die entsprechende Kavität auf der der Wärmeeintragsseite gegenüberliegenden Wärmeaustragsseite (oder auch: „Kühlseite“) auf einen gegenüber dem hohen Temperaturwert an der Wärmeeintragsseite niedrigen Temperaturwert gekühlt. Dadurch kann vorteilhafterweise die Temperatur der Annealing-Zone (und der optional in dieser enthaltenen Extensi- ons-Zone) eingestellt und insbesondere verhindert werden, dass sich die Probenflüssigkeit im Bereich der Annealing-Zone zunehmend oder zumindest in vernach- lässigbarem Maß erwärmt.
Der erfindungsgemäße Probenträger ist zur Verwendung in dem vorstehend sowie auch nachfolgend beschriebenen rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA eingerichtet und vorgesehen. Der Probenträger weist dabei einen scheibenartigen Grundkörper auf. Außerdem weist der Probenträger eine Anzahl von in dem Grundkörper ausgebildeten, vorzugsweise mikrofluidischen, Kavitäten auf, worin in einem bestimmungsgemäßen Verfahrensschritt eine Probenflüssigkeit, die, zumindest potentiell (dies insbesondere im Fall einer Analyse hinsichtlich dem Vorliegen von Krankheitserregern), DNA (oder gegebenenfalls alternativ RNA) enthält, aufgenommen ist. Eine Flachseite (oder: Scheibenseite) des Grundkörpers bildet dabei vorzugsweise eine Wärmeeintragsseite und die dieser (d. h. der Wärmeeintragsseite) abgewandte Flachseite (oder: Scheibenseite) bildet insbesondere eine Wärmeaustragsseite (auch als „Kühlseite“ bezeichnet). Die Kavität oder eine von gegebenenfalls mehreren Kavitäten ist dabei durch einen Ringkanal - d. h. vorzugsweise einen schleifenartig oder ringartig gebildeten Kanal - mit einem ersten und einem zweiten Kanalabschnitt gebildet. Diese beiden Kanalabschnitte (d. h. der erste und zweite) sind dabei an beiden Längsenden mittels jeweils eines Verbindungsabschnitts (oder Verbindungskanals) zumindest mittelbar fluidtechnisch verbunden sind. Der erste Kanalabschnitt ist außerdem in Dickenrichtung (insbesondere also in Richtung der bestimmungsgemäßen Rotationsachse) des Grundkörpers zu dem zweiten Kanalabschnitt versetzt angeordnet. Anders ausgedrückt ist einer der beiden Kanalabschnitte in Richtung Wärmeeintragsseite und der andere in Richtung Kühlseite versetzt.
Unter „scheibenartig“ wird hier und im Folgenden insbesondere im Sinn von „plattenartig“, also insbesondere dahingehend verstanden, dass der entsprechende Körper eine flächige Erstreckung aufweist, die um ein Vielfaches größer ist als seine Dicke - vorzugweise grundsätzlich unabhängig von der Geometrie seiner die flächige Erstreckung begrenzende Außenkontur.
Der Begriff „Anzahl von“ wird hier und im Folgenden insbesondere im Sinne des Begriffs „Menge“ verstanden, so dass eine Anzahl von Elementen sowohl nur ein einziges Element beschreibt als auch eine mindestens zwei Elementen. Unter „mikrofluidisch“ wird hier und im Folgenden insbesondere verstanden, dass die wenigstens eine Kavität Abmessungen von weniger als 0,5 oder sogar 0,1 Millimeter bis zu 10 bis 15 Millimeter aufweisen. Insbesondere liegt wenigstens ein Maß, bspw. eine Breite oder Tiefe im Bereich von weniger als 0,5 Millimeter. Eine Längserstreckung insbesondere von einen Kanal bildenden Kavitäten kann auch die vorstehend beschriebenen 15 Millimeter überschreiten.
Vorzugsweise bildet der Ringkanal eine Prozess- oder Reaktionskammer, in der bei bestimmungsgemäßer Verwendung des Probenträgers eine Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR) stattfindet. Diese wird durch die Form der Kavität als Ringkanal unterstützt, da sich so besonders einfach eine konvektions- und schwerkraftgetriebene Strömung, ausbilden kann, insbesondere, indem die jeweiligen „Flüssigkeitsteilchen“ entsprechend der vorstehenden Beschreibung die einzelnen Kanalabschnitte nacheinander durchströmen. Insbesondere können im stärker erwärmten Kanalabschnitt bei Rotation die Flüssigkeitsteilchen entgegen der Zentrifugalkraft „aufsteigen“, wohingegen die kühleren und damit dichteren oder schwereren Flüssigkeitsteilchen im anderen Kanalabschnitt in Richtung der Zentrifugalkraft „absinken“. Die vorstehend beschriebenen zweiten und vierten Strömungsabschnitte durchlaufen hier die Verbindungskanäle zwischen den ersten und zweiten Kanalabschnitten. Insbesondere wird dabei eine Durchmischung und Bewegung und somit Prozessierung der gesamten im Ringkanal aufgenommenen Probenflüssigkeit verbessert. Durch den Versatz des ersten Kanalabschnitts und des zweiten Kanalabschnitts zur Wärmeeintragsseite bzw. zur Kühlseite hin (also in Dickenrichtung) wird außerdem vorteilhafterweise ermöglicht, dass sich der Wärmeeintrag und der Wärmeaustrag (insbesondere also die Kühlung) vornehmlich auf den entsprechenden (d. h. näher angeordneten) Kanalabschnitt auswirken, bevorzugt auf diesen begrenzt sind. Anders ausgedrückt wird der Effekt der Kühlung auf den in Richtung zur Wärmeeintragsseite hin versetzten Kanalabschnitt verringert. Für den in Richtung zur Kühlseite versetzten Kanalabschnitt gilt entsprechendes umgekehrt.
Vorzugsweise sind der erste Kanalabschnitt auf der Wärmeeintragsseite (d. h. zu dieser hin) und der zweite Kanalabschnitt auf der Kühlseite des Probenträgers (d. h. zu dieser hin versetzt) angeordnet. Vorzugsweise dient der erste Kanalabschnitt in der bestimmungsgemäßen Verwendung zum Wärmeeintrag in die Probenflüssigkeit, der zweite entsprechend zum Wärmeaustrag. Weiter bevorzugt sind die ersten und zweiten Kanalabschnitte auch parallel zur Richtung der (während der bestimmungsgemäßen Prozessierung aufgeprägten) Fliehkraft (insbesondere also radial zur Rotationsachse, um die der Probenträger bei bestimmungsgemäßer Verwendung rotiert wird) ausgerichtet.
In einer zweckmäßigen Ausführung weist der erste Kanalabschnitt (im vorstehend genannten Fall) gegenüber dem zweiten (zur Kühlseite versetzt angeordneten) Kanalabschnitt (zumindest bereichsweise) eine verringerte Querschnittsfläche auf. Die verringerte Querschnittsfläche führt dabei einerseits zu einer Steigerung der Strömungsgeschwindigkeit sowie folglich auch zu einer verringerten Verweildauer der einzelnen „Flüssigkeitsteilchen“ in dem ersten Kanalabschnitt. Außerdem ist auch die für den Wärmeeintrag zur Verfügung stehenden Oberfläche meist kleiner, so dass der mögliche Wärmeeintrag begrenzt ist.
In einer weiteren zweckmäßigen Ausführung weist der erste Kanalabschnitt, der vorzugsweise auf der Wärmeeintragsseite (also zu dieser hin versetzt) angeordnet ist, (zusätzlich oder alternativ zur verringerten Querschnittsfläche) gegenüber dem zweiten, insbesondere auf der Kühlseite angeordneten, Kanalabschnitt (zumindest bereichsweise) eine in Scheibenflächenrichtung des Grundkörpers gerichtete, verringerte Kanalbreite auf. Dadurch ist die „Angriffsfläche“ für den Wärmeeintrag gegenüber der für den Wärmeaustrag kleiner. Dadurch kann der Wärmeaustrag auf den Wärmeeintrag abgestimmt werden. Insbesondere ist es dadurch möglich, die Kühlung besonders einfach, insbesondere durch Umgebungsatmosphäre zu gestalten. Eine aktive und damit energieaufwendige Kälteerzeugung kann so vorteilhaft unterbleiben. Eine aktive Heizung ist dagegen regelmäßig ohnehin erforderlich.
Insbesondere in der Ausführung, in der der zweite Kanalabschnitt zur Kühlseite versetzt ist, umfasst der zweite Kanalabschnitt in einer zweckmäßigen Ausführung einen Kühlkanal und einen, vorzugsweise in bestimmungsgemäßer Fließrichtung der Probenflüssigkeit während der Prozessierung, daran anschließenden, mit gegenüber dem Kühlkanal verringerter Kanalbreite ausgebildeten Annealing-Kanal. Der Kühlkanal dient in diesem Fall dazu, eine möglichst schnelle Abkühlung der Prozessflüssigkeit zu ermöglichen. Die Abkühlung innerhalb des Annealing-Kanals ist demgegenüber verringert, so dass hier möglichst konstante Temperaturbedingungen vorliegen. Optional ist die Querschnittsfläche des Kühlkanals und des Annealing-Kanals gleich und/oder derart gewählt, dass bei dem Annealing-Kanal eine größere „Tiefe“, d. h. eine größere Erstreckung in Dickenrichtung des Grundkörpers, vorliegt. Insbesondere in ersterem Fall bleibt auch die Strömungsgeschwindigkeit zumindest annähernd gleich. Alternativ ist die Querschnittsfläche des Annealing-Kanals aber ebenfalls gegenüber dem Kühlkanal verringert, so dass hier die Strömungsgeschwindigkeit erhöht und damit auch die Verweildauer gesenkt wird. Unabhängig von der Nomenklatur „Kühlkanal“ und Annealing-Kanal kann bereits innerhalb des Kühlkanals eine Anlagerung von DNA-Grundbau- steinen an aus dem ersten Kanalabschnitt aufgrund der dortigen Erwärmung zugeführten, denaturierten DNA-Strängen erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführung weist der Annealing-Kanal alternativ die gleiche Kanalbreite auf wie der Kühlkanal, aber im Gegensatz zu diesem die größere Tiefe. Dadurch ist das Volumen in dem Annealing-Kanal gegenüber dem Kühlkanal vergrößert, so dass der Kühlung eine größere Menge (konkret ein größeres Volumen) an Probenflüssigkeit entgegensteht und die Kühlung somit verlangsamt wird.
In einer optionalen Ausgestaltung umfasst auch der erste Kanalabschnitt zwei Teilkammern (oder „Teilabschnitte“), die als „Denaturierungskanal“ und „Widerstands-Kanal“ bezeichnet sind. Der Widerstands-Kanal liegt dabei „stromaufwärts“, also in bestimmungsgemäßer Fließrichtung dem Denaturierungskanal voraus (und damit insbesondere nachfolgend zum Annealing-Kanal). Außerdem ist der Widerstands-Kanal mit gegenüber dem Denaturierungskanal verringerter Breite, vorzugsweise verringerter Querschnittsfläche ausgebildet. In dem Widerstands-Kanal erfolgt dadurch eine Beschleunigung der Probenflüssigkeit. Insbe- sondere beeinflusst dieser Widerstands-Kanal aber einerseits die Fließgeschwindigkeit im Annealing-Kanal sowie andererseits auch (bspw. zu mehr als 40, vorzugsweise mehr als 50 %) den Fluidwiderstand innerhalb des Ringkanals und somit die Umlaufdauer eines (zumindest theoretischen) Flüssigkeitsteilchens durch die jeweiligen Kanalabschnitte. Die Umlaufdauer wirkt sich wiederum auf die aufgenommene und abgegebene Wärmemenge und somit die sich innerhalb der Probenflüssigkeit einstellenden Temperaturwerte aus. Somit stellt er Widerstands-Kanal vorteilhafterweise auch ein designtechnisches „Steuerglied“ für die jeweiligen Temperaturwerte innerhalb der Probenflüssigkeit dar.
Alternativ entfällt der Denaturierungskanal. Die Denaturierung kann insbesondere bei geeigneter Prozessführung - bspw. Heizen von außen und/oder einer vergleichsweise geringen Rotationsgeschwindigkeit - auch in dem in diesem Fall insbesondere nur als Widerstandkanal ausgebildeten ersten Kanalabschnitt erfolgen.
Die vorstehend beschriebene Ausformung (oder: „Strukturierung“) des Ringkanals ermöglicht vorteilhafterweise eine Vorgabe (oder: „Steuerung“) der Umlaufdauer und der einzelnen Temperaturwerte mittels der Kanalquerschnitte oder Kanalprofile und/oder mittels der Rotationsgeschwindigkeit. Insbesondere kann die Kanalgeometrie derart an die mittels eines Analysegeräts (insbesondere die nachfolgend näher beschriebene Rotationsvorrichtung) vorgegebenen Prozessparameter (bspw. Heiz- und Kühltemperaturwerte) angepasst werden, dass eine zeitliche Begrenzung nicht (mehr) vornehmlich durch Heiz- oder Kühldauern vorgegeben ist, sondern zumindest zu 20 % oder mehr durch biochemische Abläufe.
In einer zweckmäßigen Ausführung sind der erste und der zweite Kanalabschnitt zusätzlich zum Versatz in Dickenrichtung auch in Scheibenflächenrichtung zueinander versetzt.
In einer weiteren zweckmäßigen Ausführung weist der Probenträger eine Wärmeisolationsschicht auf. Diese ist dem zweiten Kanalabschnitt zumindest zu einem Teil seiner Länge in Richtung auf die Wärmeeintragsseite untergelegt (oder, je nach Betrachtungsrichtung, darübergelegt; allgemein ausgedrückt ist die Wärmeisolationsschicht also dem zweiten Kanalabschnitt und der Wärmeeintragsseite zwischengeordnet). Dadurch wird vorteilhafterweise im bestimmungsgemäßen Betrieb der Wärmeeintrag aus der Heizkammer in den zweiten Kanalabschnitt (insbesondere im Fall des Versatzes in Dickenrichtung noch mehr) unterbunden. Optional ist die Wärmeisolationsschicht dabei nur dem vorstehend beschriebenen Kühlkanal zugeordnet (bspw. untergelegt), so dass der Wärmeeintrag in den Kühlkanal verhindert oder zumindest auf ein vernachlässigbares Maß verringert ist und der Wärmeaustrag signifikant überwiegt. Ein Wärmeeintrag in den nachfolgenden An- nealing-Kanal ist in diesem optionalen Fall also „erlaubt“, so dass die Probenflüssigkeit in diesem Kanal nur noch zu einem geringeren Maß abgekühlt wird oder die Temperatur sogar näherungsweise (d. h. mit einer Differenz von wenigen Grad Celsius, bspw. von gleich oder kleiner 10 oder 5 Grad Celsius) konstant gehalten werden kann.
In einer bevorzugten Ausführung ist der Ringkanal in einem Einlaufbereich, durch den im bestimmungsgemäßen Einsatz die Füllung des Ringkanals (insbesondere mit der Probenflüssigkeit) erfolgt, mit einer Blasenfangkammer verbunden. Vorzugsweise ist in diesen Fall ein Anschnitt, der die Blasenfangkammer mit dem Ringkanal verbindet, mit einer derart großen Dicke ausgeführt, dass ein Durchtritt von herkömmlicherweise auftretenden Gasblasen vom Ringkanal in die Blasenfangkammer ermöglicht ist. Beispielsweise ist eine Dicke des Anschnitts von mindestens 100 Mikrometer - insbesondere bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 20 Hz - für den Durchtritt der Gasblasen in die Blasenfangkammer ausreichend. Gasblasen treten insbesondere aufgrund der Erwärmung der Probenflüssigkeit auf. Verbleiben die Gasblasen im Ringkanal können diese an Übergängen mit besonders kleinem Querschnitt, insbesondere also an schmalen Schlitzen, zu einer Verstopfung führen, ähnlich einer Gasembolie. Bei der bestimmungsgemäßen Verwendung des Probenträger in dem o. g. Verfahren ist vorzugsweise derart viel Probenflüssigkeit in den Ringkanal eingefüllt, dass die Probenflüssigkeit die Blasenfangkammer zumindest teilweise füllt. Dadurch ist ein Abfließen der Blasen aus dem Ringkanal in die Blasenfangkammer hinein weiter vereinfacht, da keine Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche überwunden werden braucht. Die Blasenfangkammer ist außerdem zweckmäßigerweise - bei bestimmungsgemäßer Rotation des Probenträgers - radial innenliegend zu dem Ringkanal angeordnet. Dadurch können die im Vergleich zur Probenflüssigkeit leichteren Gasblasen entgegen dem rotationsgetriebenen Schwerefeld „aufsteigen“, sich also nach radial innen bewegen.
Vorzugsweise ist jeweils eine Blasenfangkammer für den ersten und den zweiten Kanalabschnitt, die sich außerdem vorzugsweise in Radialrichtung erstrecken, vorhanden.
In einer optionalen Ausführung weist der Ringkanal einen dritten Kanalabschnitt auf, der fluidführungstechnisch zwischen den ersten und den zweiten Kanalabschnitt, insbesondere stromab des zweiten Kanalabschnitts geschaltet ist. Vorzugsweise ist dieser dritte Kanalabschnitt (zumindest näherungsweise) parallel zu dem ersten und dem zweiten Kanalabschnitt ausgerichtet. In Dickenrichtung des Grundkörpers des Probenträgers gesehen ist der dritte Kanalabschnitt aber zwischen dem ersten und dem zweiten Kanalabschnitt angeordnet. Dadurch bildet sich im bestimmungsgemäße Betrieb vorzugsweise ein zwischen den jeweiligen (mittleren) Temperaturwerten des ersten und zweiten Kanalabschnitts liegender Temperaturwert innerhalb des dritten Kanalabschnitts aus. Bspw. liegen die Zieltemperaturwerte in dem ersten Kanalabschnitt bei etwa 85 bis 100, insbesondere bei 95 Grad Celsius, im zweiten Kanalabschnitt bei 50 bis 75, vorzugsweise bei etwa 60 Grad Celsius und (sofern vorhanden) im dritten Kanalabschnitt bei etwa 65 bis 80, vorzugsweise um etwa 72 Grad Celsius, bspw. um eine Elongation der DNA zu unterstützen.
In einer weiteren optionalen Ausführung weist der Probenkörper mehrere der vorstehend beschriebenen Ringkanäle auf, die jeweils unterschiedliche Strukturierungen (d. h. vorzugsweise Abmessungen insbesondere hinsichtlich ihrer Querschnitte und Breiten) aufweisen. Dadurch ergeben sich unterschiedliche Verweilzeiten der Probenflüssigkeit in den einzelnen Bereichen, so dass in einem Probenträger - insbesondere bei gleichbleibenden Heiz- und Kühlbedingungen - bei un- terschied liehen Prozessparametern (insbesondere unterschiedlichen Temperaturwerten und/oder Umlaufdauern), optional mit unterschiedlicher Biochemie, getestet werden kann.
Die nachfolgend näher beschriebene, erfindungsgemäße Rotationsvorrichtung stellt optional eine eigenständige und somit von dem vorstehend beschriebenen Probenträger unabhängige Erfindung dar. Gleichwohl ist aber der Einsatz des vorstehend beschriebenen Probenträgers in der hier und im Folgenden beschriebenen Rotationsvorrichtung besonders vorteilhaft. Die erfindungsgemäße Rotationsvorrichtung ist dabei für die Verwendung in dem vorstehend beschriebenen rotationsbasierten Verfahren eingerichtet und vorgesehen. Die Rotationsvorrichtung weist dazu eine Analysekammer auf sowie einen in der Analysekammer angeordneten Probenhalter. Letzterer ist zur Halterung wenigstens eines Probenträgers, insbesondere des vorstehend beschriebenen Probenträgers, der eine Anzahl von in dem (oder einem) Grundkörper ausgebildeten Kavitäten aufweist, worin in einem bestimmungsgemäßen Verfahrensschritt eine Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, aufgenommen ist. Des Weiteren weist die Rotationsvorrichtung einen Rotationsantrieb auf, mittels dessen der Probenhalter im bestimmungsgemäßen Betrieb um eine Rotationsachse rotiert wird. Ferner weist die Rotationsvorrichtung eine Heizvorrichtung, mittels derer im bestimmungsgemäßen Betrieb eine Atmosphäre in einem eine Heizkammer bildenden Teilbereich der Analysekammer auf eine Zielheiztemperatur temperiert wird, sowie eine Kühlvorrichtung auf, mittels derer im bestimmungsgemäßen Betrieb eine Atmosphäre in einem eine Kühlkammer bildenden Teilbereich der Analysekammer auf eine Zielkühltemperatur temperiert wird. Heizkammer und Kühlkammer sind dabei durch den Probenhalter, zumindest in Zusammenwirkung mit dem darauf gehalterten Probenträger voneinander fluidisch getrennt. Außerdem weist die Rotationsvorrichtung einen Controller (auch als „Steuergerät“ bezeichnet) auf, der steuerungstechnisch mit dem Rotationsantrieb und der Heizvorrichtung sowie auch mit der Kühlvorrichtung verknüpft und dazu eingerichtet ist, eine Rotationsgeschwindigkeit des Probenhalters sowie die Zielheiztemperatur und die Zielkühltemperatur vorzugeben. Vorzugsweise erfolgt die Heizung und Kühlung also über die jeweilige temperierte Atmosphäre der Heiz- bzw. Kühlkammer. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der jeweiligen Atmosphäre um Luft. Dadurch ist ein besonders einfacher Aufbau der Rotationsvorrichtung gegeben.
In bevorzugter Ausgestaltung ist der Controller zumindest im Kern durch einen Mikrocontroller mit einem Prozessor und einem Datenspeicher gebildet, in dem die Funktionalität zur Durchführung des Verfahrens in Form einer Betriebssoftware (Firmware) programmtechnisch implementiert ist, so dass das Verfahren - gegebenenfalls in Interaktion mit Bedienpersonal - bei Ausführung der Betriebssoftware in dem Mikrocontroller automatisch durchgeführt wird. Der Controller kann im Rahmen der Erfindung alternativ aber auch durch ein nicht-programmierbares elektronisches Bauteil, z.B. einen ASIC, gebildet sein, in dem die Funktionalität zur Durchführung des Verfahrens mit schaltungstechnischen Mitteln implementiert ist.
In einer bevorzugten Ausführung weist die Rotationsvorrichtung ein Gehäuse auf, das die Analysekammer und somit die Heizkammer und die Kühlkammer gemeinsam umgibt. Anders ausgedrückt unterteilt das Gehäuse die Analysekammer nicht. Die Unterteilung in die Heizkammer und die Kühlkammer erfolgt vielmehr durch den Probenhalter bzw. Probenträger. Der Probenhalter oder der im bestimmungsgemäßen Betrieb daran gehalterte Probenträger bildet dabei mit einer Gehäusewand, insbesondere einer Seitenwand des Gehäuses, einen Dichtspalt. Dieser ist so bemessen, dass eine Verringerung oder sogar Unterdrückung eines Gasaustauschs zwischen der Heizkammer und der Kühlkammer ermöglicht ist. Beispielsweise weist der Dichtspalt eine Breite (also einen Abstand zwischen Probenhalter bzw. Probenträger zur Seitenwand) von gleich oder vorzugsweise kleiner als 1 mm, insbesondere von gleich oder kleiner 0,5 mm auf.
In einer hinsichtlich der Dichtwirkung zwischen der Heiz- und der Kühlkammer vorteilhaften Weiterbildung bildet die Gehäusewand mit dem Probenhalter bzw. dem Probenträger eine Art Labyrinthdichtung zwischen der Heizkammer und der Kühlkammer. Labyrinthdichtungen weisen regelmäßig eine vergleichsweise hohe Dichtwirkung bei kontaktlosen Dichtungskonzepten auf. In diesem Fall ist vorzugsweise in die Gehäusewand, insbesondere die Seitenwand, eine umlaufende Nut eingeformt, in die der Probenhalter bzw. Probenträger eingreift. Der Dichtspalt weist hierbei ebenfalls Maße von bevorzugt gleich oder weniger als 1 mm auf.
Vorzugsweise ist die Analysekammer kreiszylindrisch ausgebildet. Der Probenhalter bildet dabei für sich alleine oder zumindest mit einem oder mehreren daran gehalterten Probenträgern eine Kreisscheibe nach. Dadurch ist der Dichtspalt vorzugsweise umlaufend gleich. Vorzugsweise ist im Fall der Labyrinthdichtung das Gehäuse zum Bestücken des Probenhalters und optional auch zu Wartungszwecken aufklappbar oder demontierbar. Eine Trennebene des Gehäuses ist in diesem Fall zweckmäßigerweise in der vorstehend beschriebenen Nut angeordnet.
In einer weiteren zweckmäßigen Ausführung ist der Probenhalter der Rotationsvorrichtung dazu eingerichtet, den Probenträger auf einer der Heizkammer zugewandten Wärmeeintragsseite (hier des Probenhalters) aufzunehmen. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn der Rotationsantrieb im Bereich der Kühlkammer angeordnet ist. Alternativ ist es aber gleichermaßen möglich, den Rotationsantrieb auf der Seite der Heizkammer zu positionieren, so dass der Probenhalter den Probenträger insbesondere auf der der Kühlkammer zugewandten Kühlseite (des Probenhalters) aufnimmt. In jedem Fall weist der Probenhalter wenigstens ein die Wärmeeintragsseite und die Kühlseite (des Probenhalters) miteinander verbindendes Fenster auf. Durch dieses Fenster hindurch steht im bestimmungsgemäßen Betrieb ein zu kühlender bzw. zu erwärmender Bereich der Anzahl von Kavitäten (insbesondere also der erste bzw. zweite Kanalabschnitt) des Probenträgers entsprechend mit der Kühlkammer bzw. der Heizkammer in wärmeübertragungstechnischer Verbindung. D. h. der zu kühlende Bereich (insbesondere der zweite Kanalabschnitt) des Probenträgers steht, für den Fall, dass der Probenträger auf der Wärmeeintragsseite des Probenhalters (und somit in der Heizkammer) positioniert ist, mit der Kühlkammer in Verbindung. Im Fall des vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Probenträgers steht dessen zur Kühlseite hin versetzter (insbesondere zweiter) Kanalabschnitt optional in das Fenster oder durch dieses in Richtung auf die Kühlseite vor. Für den Fall, dass der Probenträger auf der Kühlseite des Probenhalters anzuordnen ist, gilt dies analog für den zu erwärmenden Bereich.
In einer optionalen Ausgestaltung, bevorzugt für den Fall, dass der erfindungsgemäße Probenträger mit der Rotationsvorrichtung verwendet wird, weist der Probenhalter eine Wärmeisolationsschicht auf. Diese ist derart angeordnet, dass zumindest ein Teil des zu kühlenden und/oder zu erwärmenden Bereichs der Anzahl von Kavitäten des Probenträgers im bestimmungsgemäßen Betrieb von der Temperatureinwirkung der Heizkammer bzw. Kühlkammer abgeschirmt ist. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn der Probenträger selbst keine Wärmeisolationsschicht aufweist. Die Wärmeisolationsschicht des Probenhalters ist optional durch ein separat am Probenhalter angeordnetes Element, bspw. ein Material mit geringer Wärmeleitung, gebildet. Die Wärmeisolationsschicht des Probenhalters dient dem gleichen Zweck wie die vorstehend beschriebene Wärmeisolationsschicht des erfindungsgemäßen Probenträgers.
In einer zweckmäßigen Ausführung weist die Kühlvorrichtung der Rotationsvorrichtung ein steuerbares Ventil zur Verbindung der Kühlkammer mit der Umgebung der Rotationsvorrichtung und/oder einen Lüfter zur (insbesondere aktiven) Flutung der Kühlkammer mit Umgebungsatmosphäre, vorzugsweise Umgebungsluft auf. Eine aktive Kühlung mittels einer Art Klimaanlage oder dergleichen (also mit einer aktiven Kälteerzeugung) kann somit unterbleiben. Dies ist insbesondere dahingehend vorteilhaft, dass diese Ausgestaltung - das steuerbare Ventil bzw. der Lüfter - technisch einfach umsetzbar ist. Die Zielkühltemperatur in der Kühlkammer wird insbesondere seitens des Controllers auf etwa (d. h. mit einer Abweichung von bspw. +/- 5 Grad Celsius) 50 Grad Celsius vorgegeben. Dieser im Vergleich zur üblichen Umgebungstemperatur vergleichsweise hohe Temperaturwert ergibt sich aufgrund von (optional gezielter) Leckage durch den vorstehend beschriebenen Dichtspalt und/oder durch Wärmeleitungseffekte durch den Probenhalter hindurch. Vorzugsweise ist zur Temperierung auf diesen Temperaturwert ein Temperatursensor in der Kühlkammer angeordnet und mit dem Controller verschaltet. Der Controller öffnet bei steigender Temperatur das Ventil oder die Ventile, so dass ein Austausch mit der Umgebung erfolgen kann. Gegebenenfalls und sofern vorhanden aktiviert der Controller auch den Lüfter, um mehr Umgebungsatmosphäre, insbesondere Luft, durch die Kühlkammer transportieren zu können und somit die Kühlwirkung zu steigern.
Bevorzugt ist der Controller dazu eingerichtet, die Heizvorrichtung derart anzusteuern, dass in der Heizkammer ein Temperaturwert von etwa 80 bis 120 Grad Celsius vorliegt. Vorzugsweise ist hierzu auch in der Heizkammer ein Temperatursensor angeordnet. Die Heizvorrichtung weist optional Heizdrähte, eine Flächenheizung oder dergleichen auf. Da im bestimmungsgemäßen Betrieb der Probenhalter mit dem oder dem jeweiligen daran gehalterten Probenträger rotiert, erfolgt vorteilhafterweise eine Verwirbelung der Atmosphäre in der Heizkammer und damit eine Homogenisierung der Temperatur. Außerdem ist aufgrund der Relativbewegung des Probenträgers zur Atmosphäre die konvektive Wärmeübertragung verbessert, insbesondere da isolierend wirkende, stehende Grenzschichten zwischen Probenträger und Heizkammer immer wieder aufgelöst werden oder sich nicht ausbilden.
Erfindungsgemäß wird der vorstehend beschriebene, erfindungsgemäße Probenträger in dem eingangs beschriebenen Verfahren verwendet. Dabei wird der Probenträger folglich zunächst mit der Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, befüllt und mittels einer Rotationsvorrichtung, optional der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Rotationsvorrichtung, um eine Rotationsachse rotiert. Wenigstens der erste Kanalabschnitt wird dabei zumindest abschnittsweise mittels der mittels der Heizvorrichtung temperierten Atmosphäre auf einen hohen Temperaturwert erwärmt, wodurch eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb des Ringkanals der entsprechenden Kavität erzeugt wird. Alternativ zu der erfindungsgemäßen Rotationsvorrichtung kommt optional eine solche zum Einsatz, die anstelle der vorstehend beschriebenen Heizvorrichtung zum Temperieren der Atmosphäre in der Heizkammer eine Kontakt- oder Flächenheizung, vorzugsweise in den Probenhalter integriert, aufweist. In diesem Fall wird der erste (oder zu erwärmende) Kanalabschnitt durch Wärmeleitung, bspw. mittels eines Peltier-Elements oder eines Widerstandsheizkörpers, einseitig erwärmt. Weiter erfindungsgemäß wird die vorstehend beschriebene, erfindungsgemäße Rotationsvorrichtung in dem eingangs beschriebenen Verfahren verwendet. Optional kann hierbei auch ein anderer Probenträger als der vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Probenträger zum Einsatz kommen. Bevorzugt kommt aber der erfindungsgemäße Probenträger zum Einsatz. Im Rahmen des Verfahrens wird dabei wenigstens ein Abschnitt der Kavität oder einer von gegebenenfalls mehreren Kavitäten des Probenträgers zumindest abschnittsweise mittels der mittels der Heizvorrichtung temperierten Atmosphäre auf einen hohen Temperaturwert erwärmt sowie vorzugsweise ein anderer Abschnitt (vorzugsweise derselben Kavität) mittels der in der Kühlkammer vorliegenden, bevorzugt kühleren Atmosphäre gekühlt. Aufgrund der Erwärmung, insbesondere aufgrund der durch die zusätzliche Kühlung hervorgerufenen Temperaturdifferenz, wird dabei eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb der entsprechenden Kavität erzeugt.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:
Fig. 1 in einer schematischen Ansicht auf eine Unterseite einen Probenträger mit einer Anzahl von Kavitäten,
Fig. 2, 3 in schematischer, quasi-durchsichtiger Seitenansicht jeweils ein alternatives Ausführungsbeispiel einer Rotationsvorrichtung, die in dem Verfahren verwendet wird,
Fig. 4 in einem schematischen Ablaufdiagramm ein Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, und
Fig. 5-10 in schematischer Detailansicht von einer Unterseite und von einer Seite jeweils verschiedene Ausführungsbeispiele einer Kavität des Probenträgers.
Einander entsprechende Teile sind in allen Figuren stets mit gleichen Bezugszeichen versehen. In Fig. 1 ist ein Probenträger 1 grob schematisch dargestellt, der zur Verwendung in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung oder Detektion von DNA, nachfolgend anhand von Fig. 4 näher beschrieben, eingerichtet und vorgesehen ist. Der Probenträger 1 weist einen scheibenförmigen - d. h. flachen - und im vorliegenden Ausführungsbeispiel halbkreisförmigen Grundkörper 2 auf. In diesem sind mehrere mikrofluidische Kavitäten ausgebildet, hier nur beispielhaft dargestellt eine Füllkammer 4, in die eine entnommene Probe eingeführt werden kann, eine hierzu „stromabwärts“ angeordnete Prozesskammer 6 sowie ein Verbindungskanal 8 zwischen diesen beiden. Die Größe der Prozesskammer 6 gegenüber dem Grundkörper 2 ist hier zu Verdeutlichung der nachfolgend näher beschriebenen Eigenschaften stark übertrieben dargestellt.
In Fig. 2 und 3 sind zwei Ausführungsbeispiele einer Rotationsvorrichtung 10 dargestellt, die ebenfalls zur Verwendung in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, vorzugsweise gemeinsam mit dem Probenträger 1 , eingerichtet und vorgesehen ist. Die Rotationsvorrichtung 10 weist dabei ein Gehäuse 12 auf, das mit seiner Seitenwand 14 einen kreiszylindrischen Gehäuseinnenraum, im Folgenden als „Analysekammer 16“ bezeichnet, umgibt. Weiterhin weist die Rotationsvorrichtung 10 einen Probenhalter 18 auf. Auf diesem ist bei Durchführung des Verfahrens (d. h. im bestimmungsgemäßen Betrieb) der Probenträger 1 gehaltert. Der Probenhalter 18 ist mittels eines Rotationsantriebs 20 um eine Rotationsachse 22 rotierbar. Somit handelt es sich bei dem Probenhalter 18 um einen Drehteller.
Der Probenhalter 18 ist derart in der Analysekammer 16 angeordnet, dass er diese in zwei Teile unterteilt ist. Der in Fig. 2 und 3 obere Teil bildet dabei eine Heizkammer 24. Die Rotationsvorrichtung 10 weist eine Heizvorrichtung 26 auf, die dazu eingerichtet ist, die Atmosphäre, konkret die Luft in der Heizkammer 24 zu erwärmen. Der in Fig. 2 und 3 untere Teil der Analysekammer 16 bildet eine Kühlkammer 28. Zu deren Temperierung weist die Rotationsvorrichtung 10 eine Kühlvorrichtung 30 auf. Im dargestellten Ausführungsbeispiel umfasst diese einen Lüfter 32 auf, mittels dessen die Kühlkammer 28 im bestimmungsgemäßen Be- trieb mit einem Kühlluftstrom, der durch eingesaugte Außenluft gebildet ist, durchströmt wird. Außerdem umfasst die Kühlvorrichtung 30 ein steuerbares Ventil 34, durch das Luft aus der Kühlkammer 28 in die Umgebung ab- oder auch ohne aktivierten Lüfter 32 eingelassen werden kann.
Ein Controller der Rotationsvorrichtung 10 zur Steuerung des Rotationsantriebs 20, der Heizvorrichtung 26 und der Kühlvorrichtung 30, also des Lüfters 32 und des Ventils 34 ist vorhanden aber nicht näher dargestellt.
Um den Übertritt warmer Luft aus der Heizkammer 24 in die Kühlkammer 28 möglichst gering zu halten, ist ein Dichtspalt 36 zwischen der Seitenwand 14 und dem Probenhalter 18 auf weniger als 1 mmm gehalten.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Gehäuse 12 mittels eines Gelenks 38 zwischen der Heizkammer 24 und der Kühlkammer 28 aufklappbar gestaltet. Dadurch kann der Probenhalter 18 einfach bestückt und/oder die Rotationsvorrichtung 10 gewartet werden. Der Außenrand der Probenhalters 18 liegt dabei in einer Nut 40 ein, die in die Seitenwand 14 eingearbeitet ist. Dadurch ist eine Labyrinthdichtung geschaffen (vgl. Fig. 3). Prinzipiell ist das Gehäuse 12 des Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 2 ebenfalls aufklappbar, um den Probenhalter 18 bestücken zu können, aber nicht notwendigerweise in der Ebene des Probenhalters 18.
In einem weiteren, nicht dargestellten Ausführungsbeispiel ist ein automatischer Einzug des Probenträgers 1 in die Rotationsvorrichtung 10 - vergleichbar zu einem CD- oder DVD-Laufwerk - vorgesehen.
Des Weiteren weist die Rotationsvorrichtung 10 in einem zweckmäßigen Ausführungsbeispiel einen Codeleser zum Einlesen von bspw. Bar- und/oder QR-Codes auf, mittels derer ein Analyseergebnis für die aktuelle Probe spezifiziert über ein Netzwerk an eine Datenbank weitergegeben werden kann. Zur Vervielfältigung von DNA wird in einem ersten Verfahrensschritt S1 (s. Fig. 4) der Probenträger 1 und die DNA enthaltene Probe bereitgestellt. Die Probenflüssigkeit bildet sich nach dem Einführen der Probe in die Füllkammer 4 und enthält neben der zu vervielfältigenden DNA auch Primer-Moleküle, Desoxynucleosid- triphosphate („dNTPs“), Strukturbausteine für die Bildung neuer DNA-Stränge sowie Polymerase und Co-Faktoren der Polymerase. Außerdem ist die Flüssigkeit gepuffert. Vorzugsweise ist in der Füllkammer 4 oder einer weiteren nicht dargestellten Kammer eine Flüssigkeit vorgelagert, die zum „Auswaschen“ des Probenmaterials aus einem Probenträger (bspw. einem Tupfer) sowie als Trägerflüssigkeit für die o. g. Reagenzien dient. Optional kommen manche dieser Reagenzien auch erst in Form von vorgelagerten (trockenen) Stoffen in der Prozesskammer 6 hinzu. In einem zweiten Verfahrensschritt S2 wird der befüllte Probenträger 1 auf den Probenhalter 18 aufgelegt und auf diesem befestigt. Der Probenträger 1 liegt dabei auf einer in der Heizkammer 24 liegenden Wärmeeintragsseite 40 des Probenhalters 18 auf.
In einem dritten Verfahrensschritt S3 wird mittels der Heizvorrichtung 26 die Luft in der Heizkammer 24 auf etwa 100 Grad Celsius temperiert. Dies stellt im beschriebenen Verfahren einen hohen Temperaturwert dar. Parallel dazu treibt der Rotationsantrieb 20 den Probenhalter 18 zur Rotation um die Rotationsachse 22 an, so dass auch eine jede Kavität des Probenträgers 1 um die Rotationsachse 22 rotiert wird. Mittels der Kühlvorrichtung 30 wird die Luft in der Kühlkammer 28 auf einen niedrigen Temperaturwert von etwa 50 Grad Celsius temperiert. Aufgrund der Rotation des Probenhalters 18 erfolgt auch eine Bewegung und somit Durchmischung der Luft in der Heizkammer 24 sowie in der Kühlkammer 28.
Wie aus Fig. 1 und 5 hervorgeht, weist die Prozesskammer 6 des Probenträgers 1 eine ringförmig verlaufende Kanalstruktur auf, die wiederum durch einen ersten Kanalabschnitt 50 und einen zweiten Kanalabschnitt 52 gebildet ist. Diese Kanalabschnitte 50 und 52 sind langgestreckt ausgebildet und verlaufen (zumindest annähernd, d. h. optional mit einem Winkelversatz von wenigen, einzahligen Winkelgrad) parallel zueinander sowie (zumindest annähernd parallel) zu einer - im be- stimmungsgemäßen Betriebszustand auf der Rotationsachse 22 senkrecht stehenden - Radialen. Anders ausgedrückt sind die beiden Kanalabschnitte 50 und 52 bei bestimmungsgemäßer Rotation während des Verfahrens also in Richtung der Fliehkraft ausgerichtet. Die Kanalabschnitte 50 und 52 sind jeweils endseitig durch Verbindungskanäle 54 fluidisch verbunden. Außerdem sind die Kanalabschnitte 50 und 52 in Dickenrichtung des Grundkörpers 2, also in Richtung der Rotationsachse 22 zueinander versetzt. Konkret ist dabei der erste Kanalabschnitt 50 im bestimmungsgemäßen Einsatzzustand des Probenträgers 1 zu einer Wärmequelle hin versetzt, im vorliegenden Ausführungsbeispiel der Rotationsvorrichtung 10 also zur Heizkammer 24 hin. Umgekehrt ist der zweite Kanalabschnitt 52 zur Kühlkammer 28 hin versetzt. Um einen Wärmeaustausch der Luft in der Kühlkammer 28 mit der Prozesskammer 6, zumindest mit dem zweiten Kanalabschnitt 52 zu ermöglichen, weist der Probenhalter 18 ein Fenster 56 auf, durch das hindurch Luft aus der Kühlkammer 28 an den zweiten Kanalabschnitt 52 strömen kann. Optional steht der zweite Kanalabschnitt 52 über die Ebene der Wärmeeintragsseite 40 des Probenhalters 18 über und liegt somit in dem Fenster 56 ein oder steht sogar zur Unterseite hin, also in die Kühlkammer 28 über den Probenhalter 18 hinaus (nicht dargestellt).
Somit wird im Verfahrensschritt S3 in den ersten Kanalabschnitt 50 aufgrund seiner (in Bezug auf den zweiten Kanalabschnitt 52 gesehen) größeren „Nähe“ zur Heizkammer 24 vergleichsweise mehr Wärme eingetragen als in den zweiten Kanalabschnitt 52. Aufgrund der Rotation des Probenhalters 18 und der dadurch bedingten Relativbewegung zur Luft, wird auch der konvektive Wärmeaustausch der beiden Kanalabschnitte 50 und 52 mit der Heizkammer 24 bzw. der Kühlkammer 28 unterstützt.
Aufgrund der Erwärmung des ersten Kanalabschnitts 50 von der Heizkammer 24 her und der Kühlung des zweiten Kanalabschnitts 52 von der Kühlkammer 28 her bildet sich innerhalb der Kanalstruktur der Prozesskammer 6 ein Temperaturgradient aus, der parallel zur Rotationsachse 22 verläuft. Aufgrund der Rotation stellt sich ein künstliches Schwerefeld radial zur Rotationsachse 22 ein. Des Weiteren führt der Temperaturgradient zu Dichteunterschieden in der Probenflüssigkeit. Diese temperaturbedingten Dichteunterschiede führen in Verbindung mit dem künstlichen Schwerefeld zu einer auftriebsgetriebenen Konvektionsströmung, dessen Hauptströmungsrichtung aufgrund des künstlichen Schwerefelds grundsätzlich radial gerichtet ist. Anders ausgedrückt ist die Haupt-Auftriebskomponente radial einwärtsgerichtet. Aufgrund der Ringstruktur der Prozesskammer 6 fließen Flüssigkeitselemente aufgrund ihrer Erwärmung in dem ersten Kanalabschnitt 50 und der damit einhergehenden Dichteabnahme radial einwärts. Entsprechend fließen Flüssigkeitselemente aufgrund der Abkühlung in dem zweiten Kanalabschnitt 52 und der damit einhergehenden Dichtezunahme schwerkraftbedingt radial nach außen. Da die beiden Kanalabschnitte 50 und 52 zu einem Ring verbunden sind, fließen die Flüssigkeitselemente radial innenseitig von dem ersten Kanalabschnitt 50 durch den Verbindungskanal 54 in den zweiten Kanalabschnitt 52 ab und an dessen Ende entsprechend wieder in den ersten Kanalabschnitt 50. Aufgrund der Zentrifugalkräfte der Rotation (in Fig. 4 nach rechts gerichtet) und der aufgrund der Rotation ebenfalls vorhandenen Corioliskraft erfolgt aber auch eine (homogene) Durchmischung der Probenflüssigkeit quer zum grundsätzlichen Strömungspfad der Konvektionsströmung. Die Geschwindigkeit der Konvektionsströmung nimmt dabei mit zunehmender Rotationsgeschwindigkeit zu.
Wie aus Fig. 5 und 6 ersichtlich ist, weist der zweite Kanalabschnitt 52 zwei Teiloder „Subkammern“ auf, von denen die radial innenliegende als „Kühlkanal 58“ und die radial außenseitig daran angeschlossene als „Annealing-Kanal 60“ bezeichnet wird. Der Kühlkanal 58 weist dabei eine in Ebenenrichtung des Grundkörpers 2 größere Breite als der Annealing-Kanal 60 auf, damit eine möglichst schnelle Abkühlung auf eine „Annealing-Temperatur“ von etwa 65 Grad Celsius ermöglicht wird. Der Querschnitt des Annealing-Kanals 60 ist in diesem Ausführungsbeispiel kleiner als der des Kühlkanals 58 gewählt, damit eine im Vergleich höhere Abflussgeschwindigkeit und damit ein verringerter Wärmeaustrag, sowie auch ein geringer Wärmeverlust beim Übergang zum ersten Kanalabschnitt 50, ermöglicht wird. Der erste Kanalabschnitt 50 weist ebenfalls zwei Teilkammern auf, von denen die radial außenseitige als Widerstands-Kanal 62 und die radial innenseitige als Denaturierungskanal 64 bezeichnet wird. Der Widerstands-Kanal 62 weist dabei einen gegenüber dem Annealing-Kanal 60 und auch dem Verbindungskanal 54 weiter verringerten Querschnitt auf. Dadurch wird die Probenflüssigkeit beschleunigt und auch der Fluss durch den Annealing-Kanal 60 kontrolliert (oder auch: vorgegeben). Im Denaturierungskanal 64 kann die Temperatur (von bspw. 90 bis 100, insbesondere etwa 95 Grad Celsius) aufgrund dessen wiederum - im vorliegenden Ausführungsbeispiel - vergrößerten Querschnitts zumindest näherungsweise konstant gehalten werden.
In Fig. 7 und 8 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Prozesskammer 6 dargestellt. Die Unterschiede zum vorausgehenden Ausführungsbeispiel liegen hierbei in den Abmessungen des Annealing-Kanals 60 im Verhältnis zum Kühlkanal 58 sowie in der Gestaltung des ersten Kanalabschnitts 50. Der Annealing-Kanal 60 weist dabei die gleiche „Tiefe“ oder „Höhe“ (also das in Richtung der Rotationsachse 22 verlaufende Maß) auf wie der Kühlkanal 58. Dadurch wird die Strömung im Verhältnis zum Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 5 und 6 geringer beschleunigt. Der erste Kanalabschnitt 50 ist dabei über seine gesamte Länge nahezu konform ausgebildet. Eine Unterscheidung in Widerstands-Kanal 62 und Denaturierungskanal 64 wird hierbei nicht gemacht. Der erste Kanalabschnitt 50 ist dabei etwa düsenartig mit einem vergleichsweise langgestreckten, verjüngten Mittelteil ausgebildet. Die Denaturierung erfolgt hier ebenfalls im verjüngten Mittelteil, sobald die entsprechende Temperatur erreicht ist. Dies ist in einer beispielhaften Ausführung - zumindest bei einer Rotationsvorrichtung mit einer Kontaktheizung - möglich, bei der die Querschnittsfläche des ersten Kanalabschnitts 50 (in seinem verjüngten Bereich) 0,162 mm2 beträgt sowie der zweite Kanalabschnitts 52 so gestaltet ist, dass bei 10 Hz Rotationsgeschwindigkeit des Probenträgers 1 die Probenflüssigkeit derart lange im ersten Kanalabschnitt 50 verbleibt, dass der Denaturierungstemperaturwert erreicht wird. Für höhere Drehzahlen kann die Querschnittsfläche des ersten Kanalquerschnitts 50 aufgrund der dann höheren Fließgeschwindigkeit entsprechend verringert werden. Um die Einwirkung der aufgeheizten Luft der Heizkammer 24 - oder eines anderen Heizmittels - auf den zweiten Kanalabschnitt 52 zu verringern, ist diesem eine Wärmeisolationsschicht 66 untergelegt. Bspw. handelt es sich bei der Wärmeisolationsschicht um ein Gas-gefülltes „Kissen“, bspw. eine hohle oder geschäumte Platte.
In Fig. 9 und 10 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Prozesskammer 6 dargestellt. Hierbei ist der Annealing-Kanal 60 schmäler, aber dafür tiefer als der Kühlkanal 58 ausgebildet. Dadurch ist das Volumen im Annealing-Kanal 60 erhöht, so dass der Wärmeverlust geringgehalten werden kann, obwohl hier die Wärmeisolationsschicht 66 nur dem Kühlkanal 58 untergelegt ist. Der - hier wieder ausgeprägt vorhandene - Denaturierungskanal 64 ist vergleichbar zum Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 5 und 6 mit gegenüber dem Widerstands-Kanal 62 vergrößertem Querschnitt ausgebildet.
In jedem der vorstehend beschrieben Ausführungsbeispiele sind die ersten und zweiten Kanalabschnitte 50 und 52 in tangentialer Richtung zueinander versetzt. Dadurch wird einerseits die Zwischenlagerung der Wärmeisolationsschicht 66 vereinfacht, andererseits wird so aber auch ermöglicht - insbesondere für den Fall, dass der Grundkörper 2 zumindest im Bereich der Prozesskammer 6 transparent gestaltet ist -, die Vorgänge innerhalb der beiden Kanalabschnitte 50 und 52 zu überwachen, bspw. mittels eines Fluoreszenz-Detektors oder dergleichen.
Außerdem ist in jedem der vorstehend beschrieben Ausführungsbeispiele den beiden Kanalabschnitten 50 und 52 ein Zulauf 68 (oder auch: „Einlaufbereich“) zugeordnet, über den die Befüllung mit der Probenflüssigkeit erfolgt. Dieser Zulauf 68 weist zwei Einlaufkammern, auch als „Blasenfallen 70“ bezeichnet auf, von denen jede mit einem der beiden Kanalabschnitte 50 und 52 über einen Anschnitt 72 in fluidischer Verbindung steht. Die zugeführte Menge an Probenflüssigkeit wird dabei derart gewählt, dass nach bestimmungsgemäßer Befüllung der Kanalabschnitte 50 und 52, d. h., wenn in beiden Kanalabschnitten 50 und 52 sowie in den Verbindungskanälen 54 die Probenflüssigkeit steht, auch in den Blasenfallen 70 noch Teile der Probenflüssigkeit stehen. Die Anschnitte 72 sind dabei derart bemessen, dass Gasblasen, die sich im bestimmungsgemäßen Betrieb aufgrund der Erwärmung der Probenflüssigkeit bilden, durch diese hindurch entgegen dem künstlichen Schwerefeld in die Blasenfallen 70 „aufsteigen“ und sich dort sammeln können, ohne die Anschnitte zu „verstopfen“. Dies wird durch die teilgefüllten Blasenfallen 70 begünstigt.
Die Abmessungen der Kanalabschnitte 50 und 52 sowie der Verbindungskanäle 54 sind dabei derart gewählt, dass bei Rotations-Drehzahlen im Bereich von 5 bis 40 Hz die Probenflüssigkeit in der Annealing-Kammer 60 einen Temperaturwert von etwa 65 Grad Celsius aufweist und im ersten Kanalabschnitt 50 oberhalb der Schmelztemperatur der DNA, konkret oberhalb von 90 Grad Celsius, insbesondere bei etwa 90 Grad Celsius.
Insbesondere die Verfahrensschritte S1 bis S3 können auch zumindest teilweise zeitgleich zueinander erfolgen. Insbesondere muss der Probenhalter 10 während der Befüllung der Prozesskammer 6 nicht stillstehen. Ebenso kann auch die Heizvorrichtung 26 bereits die Luft in der Heizkammer 24 erwärmen.
In einer optionalen Ausführung des Verfahrens wird der Verfahrensschritt S3 für eine vorgegebene Dauer aufrechterhalten. Danach wird in einem vierten Verfahrensschritt S4 die Rotation des Probenhalters 10 sowie das Heizen mittels der Heizvorrichtung 26 eingestellt. Optional kann der vierte Verfahrensschritt S4 auch eingeleitet werden, wenn mittels des vorstehend genannten Fluoreszenz-Detektors ein hinreichend hoher Umsatz an Reagenzien festgestellt wird.
Der Gegenstand der Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr können weitere Ausführungsformen der Erfindung von dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung abgeleitet werden. Insbesondere können die anhand der verschiedenen Ausführungsbeispiele beschriebenen Einzelmerkmale der Erfindung und deren Ausgestaltungsvarianten auch in anderer Weise miteinander kombiniert werden. Bezugszeichenliste
1 Probenträger
2 Grundkörper
4 Füllkammer
6 Prozesskammer
8 Verbindungskanal
10 Rotationsvorrichtung
12 Gehäuse
14 Seitenwand
16 Analysekammer
18 Probenhalter
20 Rotationsantrieb
22 Rotationsachse
24 Heizkammer
26 Heizvorrichtung
28 Kühlkammer
30 Kühlvorrichtung
32 Lüfter
34 Ventil
36 Dichtspalt
38 Gelenk
39 Nut
40 Wärmeeintragsseite
50 Kanalabschnitt
52 Kanalabschnitt
54 Verbindungskanal
56 Fenster
58 Kühlkanal
60 Annealing-Kanal
62 Widerstands-Kanal
64 Denaturierungskanal
66 Wäremisolationsschicht 68 Zulauf
70 Blasenfalle
72 Anschnitt S1-S4 Verfahrensschritt

Claims

29
Ansprüche Probenträger (1 ), zur Verwendung in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung oder Detektion von DNA, aufweisend einen scheibenartigen Grundkörper (2) und eine Anzahl von in dem Grundkörper (2) ausgebildeten Kavitäten (4,6,8), worin in einem bestimmungsgemäßen Verfahrensschritt (S1 , ... ,S4) eine Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, aufgenommen ist, wobei
- eine Scheibenseite des Grundkörpers (2) eine Wärmeeintragsseite (39) und die dieser abgewandte Flachseite eine Wärmeaustragsseite bilden,
- die Kavität (6) oder eine von gegebenenfalls mehreren Kavitäten (4,6,8) durch einen Ringkanal mit einem ersten und einem zweiten Kanalabschnitt (50,52) gebildet ist, die an beiden Längsenden mittels jeweils eines Verbindungsabschnitts (54) fluidisch verbunden sind, und
- der erste Kanalabschnitt (50) in Dickenrichtung des Grundkörpers (2) zu dem zweiten Kanalabschnitt (52) versetzt angeordnet ist. Probenträger (1 ) nach Anspruch 1 , wobei der erste Kanalabschnitt (50) auf der Wärmeeintragsseite (40) angeordnet und gegenüber dem zweiten, auf der Wärmeaustragsseite angeordneten zweiten Kanalabschnitt (52) eine verringerte Querschnittsfläche aufweist. Probenträger (1 ) nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Kanalabschnitt (50) auf der Wärmeeintragsseite (40) angeordnet ist und gegenüber dem zweiten, auf der Wärmeaustragsseite angeordneten zweiten Kanalabschnitt (52) eine in Scheibenflächenrichtung des Grundkörpers (2) gerichtete, verringerte Kanalbreite aufweist. Probenträger (1 ) nach Anspruch 3, wobei der zweite Kanalabschnitt (52) einen Kühlkanal (58) und einen daran anschließenden, mit gegenüber dem Kühlkanal (58) vergrößerter Tiefe ausgebildeten Annealing-Kanal (60) umfasst. 30 Probenträger (1 ) nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der erste Kanalabschnitt (50) einen Denaturierungskanal (64) und einen diesem vorausliegenden, mit gegenüber dem Denaturierungskanal (64) verringerter Breite ausgebildeten Widerstands-Kanal (62) umfasst. Probenträger (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der erste und der zweite Kanalabschnitt (50,52) in Scheibenflächenrichtung zueinander versetzt sind. Probenträger (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, mit einer Wärmeisolationsschicht (66), die dem zweiten Kanalabschnitt (52) zumindest zu einem Teil seiner Länge in Richtung auf die Wärmeeintragsseite untergelegt ist. Probenträger (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Ringkanal in einem Einlaufbereich (68), durch den im bestimmungsgemäßen Einsatz die Füllung des Ringkanals erfolgt, mit einer Blasenfangkammer (70) verbunden ist, insbesondere wobei ein Anschnitt (72), der die Blasenfangkammer (70) mit dem Ringkanal verbindet, eine derart große Dicke aufweist, dass ein Durchtritt von herkömmlicherweise auftretenden Gasblasen vom Ringkanal in die Blasenfangkammer (70) ermöglich ist. Rotationsvorrichtung (10) für die Verwendung in einem rotationsbasierten Verfahren zur Vervielfältigung oder Detektion von DNA,
- mit einer Analysekammer (16),
- mit einem in der Analysekammer (16) angeordneten Probenhalter (18) zur Halterung wenigstens eines Probenträgers (1 ), insbesondere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, der eine Anzahl von in dem Grundkörper (2) ausgebildeten Kavitäten (4,6,8) aufweist, worin in einem bestimmungsgemäßen Verfahrensschritt eine Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, aufgenommen ist,
- mit einem Rotationsantrieb (20), mittels dessen der Probenhalter (18) im bestimmungsgemäßen Betrieb um eine Rotationsachse (22) rotiert wird, - mit einer Heizvorrichtung (26), mittels derer im bestimmungsgemäßen Betrieb eine Atmosphäre in einem eine Heizkammer (24) bildenden Teilbereich der Analysekammer (16) auf eine Zielheiztemperatur temperiert wird,
- mit einer Kühlvorrichtung (30), mittels derer im bestimmungsgemäßen Betrieb eine Atmosphäre in einer eine Kühlkammer (28) bildenden Teilbereich der Analysekammer (16) auf eine Zielkühltemperatur temperiert wird, wobei Heizkammer (24) und Kühlkammer (28) durch den Probenhalter (18), zumindest in Zusammenwirkung mit dem darauf gehalterten Probenträger (1 ) voneinander fluidisch getrennt sind, und
- mit einem Controller, der steuerungstechnisch mit dem Rotationsantrieb (20), der Heizvorrichtung (26) und der Kühlvorrichtung (30) verknüpft und dazu eingerichtet ist, eine Rotationsgeschwindigkeit des Probenhalters (18) sowie die Zielheiztemperatur und die Zielkühltemperatur vorzugeben. Rotationsvorrichtung (10) nach Anspruch 9, mit einem, die Heizkammer (24) und die Kühlkammer (28) gemeinsam umgebenden Gehäuse (12), wobei der Probenhalter (18) oder der im bestimmungsgemäßen Betrieb daran gehalterte Probenträger (1 ) mit einer Gehäusewand (14) des Gehäuses (12) einen Dichtspalt (36) bilden, der zur Verringerung eines Gasaustauschs zwischen der Heizkammer (24) und der Kühlkammer (28) ausgebildet ist. Rotationsvorrichtung (10) nach Anspruch 10, wobei die Gehäusewand (14) mit dem Probenhalter (18) bzw. Probenträger (1 ) eine Art Labyrinthdichtung zwischen der Heizkammer (24) und der Kühlkammer (28) bildet, insbesondere indem der Probenhalter (18) bzw. Probenträger in einer umlaufend in die Gehäusewand (14) eingeformte Nut (39) eingreift. Rotationsvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , wobei der Probenhalter (18) dazu eingerichtet ist, den Probenträger (1 ) auf einer der Heizkammer (24) zugewandten Wärmeeintragsseite (40) oder einer der Kühlkammer (28) zugewandten Kühlseite aufzunehmen, und wobei der Probenhalter (18) wenigstens ein die Wärmeeintragsseite (40) und die Kühlseite miteinander verbindendes Fenster (56) aufweist, durch das hindurch ein zu kühlender bzw. zu erwärmender Bereich der Anzahl von Kavitäten (4,6,8) des Probenträgers (1 ) im bestimmungsgemäßen Betrieb entsprechend mit der Kühlkammer (28) bzw. der Heizkammer (24) in wärmeübertragungstechnischer Verbindung steht. Rotationsvorrichtung (10) nach Anspruch 12, mit einer Wärmeisolationsschicht, die derart angeordnet ist, dass zumindest ein Teil des zu kühlenden und/oder zu erwärmenden Bereichs der Anzahl von Kavitäten (4,6,8) des Probenträgers (1 ) im bestimmungsgemäßen Betrieb von der Temperatureinwirkung der Heizkammer (24) bzw. Kühlkammer (28) abgeschirmt ist. Rotationsvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Kühlvorrichtung (30) ein steuerbares Ventil (34) zur Verbindung der Kühlkammer (28) mit der Umgebung der Rotationsvorrichtung (10) und/oder einen Lüfter (32) zur Flutung der Kühlkammer (28) mit Umgebungsatmosphäre aufweist. Verwendung eines Probenträgers (1 ) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Verfahren zur Vervielfältigung oder Detektion von DNA, bei dem verfahrensgemäß
- der Probenträger (1 ), in dem eine Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, aufgenommen ist, mittels einer Rotationsvorrichtung (10), insbesondere gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, um eine Rotationsachse (22) rotiert wird,
- wenigstens der erste Kanalabschnitt (50) zumindest abschnittsweise mittels einer mittels einer Heizvorrichtung (26) temperierten Atmosphäre auf einen hohen Temperaturwert erwärmt wird, und
- aufgrund der Erwärmung eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb des Ringkanals der entsprechenden Kavität (6) erzeugt wird. 33 Verwendung einer Rotationsvorrichtung (10) gemäße einem der Ansprüche 9 bis 13 in einem Verfahren zur Vervielfältigung oder Detektion von DNA, bei dem verfahrensgemäß
- ein Probenträger (1 ), insbesondere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, aufweisend eine Anzahl von Kavitäten (4,6,8), wobei in wenigstens einer eine Probenflüssigkeit, die zumindest potentiell DNA enthält, aufgenommen ist, mittels der Rotationsvorrichtung (10) um eine Rotationsachse (22) rotiert wird,
- wenigstens ein Abschnitt der Kavität (6) oder einer von gegebenenfalls mehreren Kavitäten (4,6,8) zumindest abschnittsweise mittels der mittels der Heizvorrichtung (26) temperierten Atmosphäre auf einen hohen Temperaturwert erwärmt wird, und
- aufgrund der Erwärmung eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb der entsprechenden Kavität (6) erzeugt wird.
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