DE102019204850B4

DE102019204850B4 - Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, Rotationsvorrichtung und System zur Vervielfältigung von DNA

Info

Publication number: DE102019204850B4
Application number: DE102019204850.1A
Authority: DE
Inventors: Frank Schwemmer; Gregor Czilwik
Original assignee: Spindiag GmbH
Current assignee: DERMAGNOSTIX GMBH, DE
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2021-02-25
Anticipated expiration: 2039-04-05
Also published as: DE102019204850A1

Abstract

Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, wobei verfahrensgemäß- ein Probenträger (4) mit mindestens einer Kavität (20), in der eine Probenflüssigkeit, die DNA enthält, aufgenommen ist, mittels einer Rotationsvorrichtung (2) um eine Rotationsachse (14) rotiert wird,- die Kavität (20) mittels einer Heizvorrichtung (30) nur an einer in einer Rotationsebene liegenden Wärmeeintragsseite (26) auf einen hohen Temperaturwert erwärmt wird,- aufgrund der Erwärmung eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb der Kavität (20) erzeugt wird, wobei die Konvektionsströmung wesentliche, senkrecht zur Rotationsebene gerichtete Strömungsanteile aufweist, und- eine Umlaufdauer eines Flüssigkeitsteilchens entlang eines Strömungspfads der Konvektionsströmung mittels der Drehzahl der Rotation vorgegeben wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vervielfältigung von DNA sowie eine Rotationsvorrichtung, die vorzugsweise zur Durchführung des Verfahrens eingerichtet und vorgesehen ist. Außerdem betrifft die Erfindung ein System zur Vervielfältigung von DNA.
DNA (Desoxyribonukleinsäure oder englisch: desoxyribonucleic acid) wird häufig - neben wissenschaftlichen Erbgutanalysen, Vaterschaftstests und dergleichen -zur Untersuchung auf vorliegende Krankheiten analysiert oder zum Nachweis von Krankheitserregern detektiert. Dazu müssen ausgehend von einer Probe - z. B. einem Abstrich, einer Blutprobe oder dergleichen - spezifische Bereiche einer darin enthaltenen DNA (optional auch RNA) vervielfältigt werden. Im Fall des Nachweises oder der Analyse von RNA in einer Probe (z. B. zum Nachweis eines Virus) wird diese zunächst durch die sogenannte „reverse transcription“ in DNA umgeschrieben und anschließend vervielfältigt.
Zur Vervielfältigung der DNA wird üblicherweise die sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR) in einem flüssigen Reaktionsansatz angewendet. Die DNA liegt typischerweise in Form einer Doppelhelix-Struktur, bestehend aus zwei komplementären DNA Einzelsträngen, vor. Bei der PCR wird die DNA zunächst durch eine erhöhte Temperatur des flüssigen Reaktionsansatzes zwischen typischerweise 90-96 Grad C in zwei Einzelstränge aufgetrennt („Denaturierungs-Phase“).
Anschließend wird die Temperatur wieder gesenkt („Annealing-Phase“, typischerweise in einen Bereich von 50-70 Grad C), um eine spezifische Anlagerung von sogenannten Primer Molekülen an die Einzelstränge zu ermöglichen. Die Primer Moleküle sind komplementäre, kurze DNA-Stränge, die an einer definierten Stelle an den Einzelsträngen der DNA anbinden. Die Primer dienen als Startpunkt für ein Enzym, der sogenannten Polymerase, das in der sogenannten Elongations-Phase die Grundbausteine (dNTPs) komplementär zur vorliegenden DNA-Sequenz des Einzelstranges auffüllt. Dabei entsteht ausgehend von dem Primer Molekül wieder eine doppelsträngige DNA. Die Elongation wird typischerweise bei der gleichen Temperatur wie bei der Annealing Phase oder bei einer leicht erhöhten Temperatur typischerweise zwischen 65 und 75 Grad C durchgeführt. Nach der Elongation wird die Temperatur wieder für die Denaturierungsphase erhöht.
Dieses Zyklieren der Temperatur im flüssigen Reaktionsansatz zwischen den zwei bis drei Temperaturbereichen wird PCR Thermocycling genannt und typischerweise in 30 und 50 Zyklen wiederholt. In jedem Zyklus wird der spezifische DNA Bereich vervielfältigt. Typischerweise wird das Thermocycling des flüssigen Reaktionsansatzes in einem Reaktionsgefäß durch die Kontrolle der äußeren Temperatur umgesetzt. Das Reaktionsgefäß befindet sich dabei z. B. in einem Thermoblock, in dem das PCR Thermocycling durch Heizen und Kühlen eines sich mit dem Reaktionsgefäß in thermischen Kontakt befindlichen Festkörper umgesetzt wird und dabei Wärme aus der Flüssigkeit zu- und abführen. Alternative Heiz- und Kühlkonzepte zur Umsetzung des PCR Thermocyclings sind unter Anderem die Temperaturkontrolle von Fluiden (ins. Luft und Wasser), welche das Reaktionsgefäß umströmen sowie strahlungsbasierte Konzepte, z. B. durch Einbringung von Wärme durch UV-Strahlung oder Laserstrahlung.
Bei einer üblichen Polymerase-Kettenreaktion liegen die Prozessdauern im Bereich von mehreren Minuten und sind mithin vergleichsweise zeitaufwändig.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Polymerase-Kettenreaktion zu beschleunigen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, welches Verfahren die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist. Ferner wird diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Rotationsvorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 9. Außerdem wird diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein System mit den Merkmalen des Anspruchs 13. Weitere vorteilhafte und teils für sich erfinderische Ausführungsformen und Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung dargelegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Vervielfältigung von DNA. Verfahrensgemäß wird dabei vorzugsweise zunächst ein Probenträger, der mindestens eine Kavität zur Aufnahme einer Probenflüssigkeit derart mit einer Probenflüssigkeit, die DNA enthält, befüllt, dass die Probenflüssigkeit in der Kavität aufgenommen ist. Anschließend wird der Probenträger mittels einer Rotationsvorrichtung um eine Rotationsachse rotiert. Die Kavität, vorzugsweise der Probenträger, wird dabei mittels einer Heizvorrichtung nur an einer in (d. h. insbesondere parallel zu) einer Rotationsebene liegenden Wärmeeintragsseite auf einen hohen Temperaturwert erwärmt. Vorzugsweise unterbleibt eine Erwärmung auf der der Wärmeeintragsseite gegenüberliegenden Seite. Aufgrund der Erwärmung wird eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb der Kavität erzeugt. Diese Konvektionsströmung weist dabei wesentliche, (zumindest vornehmlich) senkrecht zur Rotationsebene, d. h. von der Wärmeeintragsseite zu der gegenüberliegenden Seite - im Folgenden als „Wärmeaustragsseite“ bezeichnet - des Probenträgers und/oder umgekehrt gerichtete Strömungsanteile auf. Vorzugsweise wird die Konvektionsströmung dabei im Wesentlichen ringförmig erzeugt, wobei sich ein erster Strömungsabschnitt insbesondere etwa parallel zur Wärmeeintragsseite erstreckt, ein zweiter Strömungsabschnitt von der Wärmeeintragsseite zur Wärmeaustragsseite, ein dritter Strömungsabschnitt parallel zur Wärmeaustragsseite und ein vierter Strömungsabschnitt wieder (von der Wärmeaustragsseite) zur Wärmeeintragsseite zurück. Dadurch wird die Probenflüssigkeit vorzugsweise durch eine Denaturierungszone (die insbesondere einen hohen Temperaturwert aufweist), eine sogenannte Annealing-Zone (auch: Primerhybridisierungs-Zone) und eine Extensions-Zone und zurück zur Denaturierungszone geführt. Eine Umlaufdauer eines Flüssigkeitsteilchens der Probenflüssigkeit entlang eines Strömungspfads der Konvektionsströmung wird außerdem mittels der Drehzahl der Rotation vorgegeben (insbesondere „gesteuert“).
Insbesondere wird die Umlaufdauer des Flüssigkeitsteilchens zusätzlich auch von weiteren Parametern beeinflusst, wie z. B. der Geometrie des Kavität, der Viskosität der Probenflüssigkeit, der Dichte der Probenflüssigkeit, dem sich einstellenden Temperaturgradienten und dergleichen. Die Drehzahl stellt hierbei jedoch einen vergleichsweise einfach und schnell (sowie im Hinblick auf die Geometrie überhaupt) veränderbaren Parameter dar.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen einseitigen Erwärmung der Kavität wird - anders ausgedrückt - ein Temperaturgradient (der mithin in abnehmender Richtung von der Wärmeeintragsseite zur Wärmeaustragsseite ausgerichtet ist) vorzugsweise senkrecht zu einer dominierenden Kraft, insbesondere der aus der Rotation resultierenden Zentrifugalkraft auf die Probenflüssigkeit in der Kavität aufgeprägt.
Unter „wesentliche Strömungsanteile“ wird hier und im Folgenden insbesondere verstanden, dass diese Strömungsanteile einen nicht zu vernachlässigenden Anteil an dem Volumen der in der Konvektionsströmung strömenden Probenflüssigkeit aufweisen. D. h. es handelt sich bei diesen Strömungsanteilen nicht nur um zufällig auftretende lokal und gegebenenfalls zeitlich begrenzt auftretende Teilströmungen. Beispielsweise beträgt der Anteil eines solchen, senkrecht stehenden Strömungsanteils bis zu etwa einem Viertel des gesamten, strömenden Volumens. Insbesondere erfolgt ein für die Polymerase-Kettenreaktion erforderlicher Fluidaustausch zwischen der Denaturierungs-Zone und der Annealing-Zone über diese vornehmlich senkrecht zur Rotationsebene gerichteten Strömungsanteile bzw. Strömungsabschnitte. Unter „vornehmlich senkrecht“ wird dabei insbesondere verstanden, dass diese Strömungsabschnitte exakt oder zumindest näherungsweise (bspw. unter einer Neigung von bis zu 30 Grad) senkrecht zur Rotationsebene stehen.
Vorzugweise sind neben den vorstehend beschriebenen vier Strömungsabschnitten zusätzlich aber auch quer dazu strömende Anteile aufgrund der Zentrifugalkraft und/oder der Corioliskraft vorhanden. Dies führt dabei vorteilhafterweise zu einer zusätzlichen Vermischung der Probenflüssigkeit, so dass eine möglichst homogene Vermengung von Reaktionspartnern - d. h. zu vervielfältigender DNA, Primer-Molekülen und „Strangbausteinen“ - ermöglicht wird.
Unter dem Begriff „Umlaufdauer“ wird hier und im Folgenden insbesondere die Dauer (Zeit) verstanden, die das (insbesondere infinitesimale) Flüssigkeitsteilchen benötigt, um durch die Denaturierungszone, die Annealing-Zone (auch: Primerhybridisierungs-Zone) und die Extensions-Zone zurück zur Denaturierungszone zu fließen. Die Umlaufdauer kann mittels der Drehzahl (mithin mittels der Rotationsgeschwindigkeit) auf Zeiten im Bereich zwischen 0,1 s und 20 s eingestellt werden. Innerhalb der Kavität - die einer Reaktionskammer des Probenträgers entspricht - kann so eine durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit in der Größenordnung von bis zu 22 mm/s eingestellt werden.
Durch eine derart geringe Umlaufdauer und/oder eine derart hohe Strömungsgeschwindigkeit wird eine besonders schnelle Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht, so dass vorteilhafterweise Prozesszeit eingespart werden kann.
In einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die Kavität auf der der Wärmeeintragsseite gegenüber liegenden Wärmeaustragsseite auf einen gegenüber dem hohen Temperaturwert an der Wärmeeintragsseite niedrigen Temperaturwert gekühlt. Dadurch kann vorteilhafterweise die Temperatur der Annealing-Zone (und der Extensions-Zone eingestellt und insbesondere verhindert werden, dass sich die Probenflüssigkeit im Bereich der Annealing-Zone zunehmend erwärmt.
In einer bevorzugten Verfahrensvariante wird zur Erwärmung mittels der Heizvorrichtung ein konstanter Temperaturwert an der Wärmeeintragsseite angelegt. Gegebenenfalls wird analog zur Kühlung ebenfalls ein konstanter Temperaturwert an die Wärmeaustragsseite angelegt. Dadurch entfallen (üblicherweise zyklische) Heiz- und Kühlphasen, die bei herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktionen zu einer vergleichsweise großen (Gesamt-)Dauer der Vervielfältigung der DNA führen. Außerdem wird die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion, da nur eine Regelung auf einen Zielwert (hoher bzw. niedriger Temperaturwert) aber keine „Rampenfunktionen“ erforderlich sind, vereinfacht. Ebenfalls kann der Aufbau der Heizvorrichtung sowie gegebenenfalls auch der Rotationsvorrichtung einfach gehalten werden.
Vorzugsweise wird als Temperaturwert der Heizvorrichtung ein Wert zwischen 80 und 110 Grad Celsius vorgegeben, insbesondere zwischen 90 und 100 Grad Celsius, so dass sich in der Denaturierungszone ein Temperaturwert oberhalb der Schmelztemperatur der DNA, einstellt. Auf der Wärmeaustragsseite wird ein Temperaturwert von insbesondere etwa 10 bis 60, vorzugsweise um 40 Grad Celsius angelegt, so dass sich in der Annealing- oder Extensionszone (die vorzugsweise innerhalb des gleichen Bereichs an der Wärmeaustragsseite angeordnet sind) ein Temperaturwert von 50 bis 70, insbesondere um 60 Grad Celsius einstellt.
Bevorzugt wird zur Kühlung ein Kühlluftstrom genutzt. Dieser kann mittels vergleichsweise einfacher Maßnahmen, bspw. einer Art Prozessorlüfter, eines (bspw. Kühler-)Lüfters oder dergleichen erzeugt werden.
Weiter vorzugsweise wird die Erwärmung mittels der wenigstens die, an der Wärmeeintragsseite angeordnete, Grundfläche der Kavität überspannenden Heizvorrichtung vorgenommen. D. h. die eingesetzte Heizvorrichtung weist vorzugsweise durch ein Flächenheizelement auf. Die Flächenausdehnung der Heizvorrichtung erstreckt sich dabei vorzugsweise über eine größere Fläche als die Grundfläche der Kavität, bevorzugt über eine vielfach größere Fläche. Dadurch können vorteilhafterweise mehrere Kavitäten (desselben Probenträgers oder auch mehrerer Probenträger) gleichzeitig erwärmt werden und somit der Durchsatz erhöht werden. Vorzugsweise ist die Heizvorrichtung in einen Probenhalter der Rotationsvorrichtung, der den Probenträger trägt, integriert.
In einer zweckmäßigen Verfahrensvariante wird die Konvektionsströmung innerhalb der Kavität mittels eines der Kavität zugeordneten Fließwiderstands geführt. Dadurch kann die Fließgeschwindigkeit und/oder der Druck lokal verändert werden.
In einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die Konvektionsströmung mittels des vorstehend beschriebenen Fließwiderstands derart geführt, dass ein von der Wärmeeintragsseite zur Wärmeaustragsseite gerichteter Teil des Strömungspfads insbesondere nur auf einer der Rotationsachse zugewandten Seite der Kavität und der von der Wärmeaustragsseite zur Wärmeeintragsseite gerichtete Teil des Strömungspfads insbesondere nur auf der der Rotationsachse abgewandten Seite der Kavität verläuft. Vorzugsweise wird der Fließwiderstand derart gewählt und eingestellt, dass der Probenflüssigkeit in den Bereichen zwischen der Wärmeeintragsseite und der Wärmeaustragsseite gegenüber den der Wärmeeintragsseite und der Wärmeaustragsseite zugeordneten (wärmeren bzw. kälteren) Bereichen (d. h. insbesondere der Denaturierungs-, sowie der Annealing- und der Extensions-Zone) ein wenigstens verdoppelter Strömungswiderstand entgegen wirkt. Optional wird der Fließwiderstand auch derart gewählt und eingestellt, dass dem kälteren Bereich ein größeres Teilvolumen der Kavität zugewiesen ist, so dass die Probenflüssigkeit länger in diesem Bereich verweilen kann als im wärmeren Bereich. Durch diese Steuerung wird also vorteilhaft die Verweildauer der Flüssigkeitsteilchen im jeweiligen Bereich, vorzugsweise also die Extensionszeit, vorgegeben.
In einer bevorzugten Ausführung weist die Kavität eine etwa quaderförmige Geometrie auf. Der Fließwiderstand ist vorzugsweise durch eine Art Balken oder Quersteg gebildet und unterteilt die Kavität insbesondere in jeweils wenigstens einen Fließkanal von der Wärmeeintragsseite zur Wärmeaustragsseite auf einer radialen Innenseite sowie auf einer radialen Außenseite der Kavität. Durch diese beiden Fließkanäle sind die wärmeren und kälteren (der Wärmeeintragsseite bzw. der Wärmeaustragsseite zugeordneten) Teilvolumina der Kavität miteinander fluidisch gekoppelt. Optional ist jeder der beiden Fließkanäle nochmals mit Hilfe von Stegen in Teilkanäle unterteilt.
In einer weiteren zweckmäßigen Verfahrensvariante wird zur Beeinflussung (Steuerung) der Konvektionsströmung die Struktur des Probenträgers in der Umgebung zur Kavität entsprechend gewählt. Um den Wärmeeintrag seitens der Heizvorrichtung sowie den Wärmeaustrag auf der Wärmeaustragsseite (optional zur Kühlvorrichtung hin) zu beeinflussen, insbesondere die resultierende Wärmeleitfähigkeit vorzugeben, wird insbesondere die Geometrie, die Wandstärke und/oder das Material des Probenträgers entsprechend gewählt. Eine vergleichsweise dicke Wand aus Kunststoff, bspw. Polycarbonat oder Polymethylmethacrylat führt zu einer vergleichsweise niedrigen Wärmeleitfähigkeit. Die Zugabe von wärmeleitfähigen Füllstoffen (Ruß, Keramik oder dergleichen) erhöht bei gleicher Wandstärke die Wärmeleitfähigkeit.
In einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante wird ein Probenträger eingesetzt, der eine Mehrzahl von Kavitäten zur parallelen Vervielfältigung von DNA aufweist. Dadurch kann vorteilhafterweise der Durchsatz und somit die Menge der vervielfältigten DNA erhöht werden. Zusätzlich oder alternativ können dabei auch verschiedenen Kavitäten bereits „trocken“ (d. h. vor Befüllung mit Probenflüssigkeit) unterschiedliche Primer und/oder Sonden zugewiesen werden. Dies ermöglicht einen parallelen Nachweis von verschiedenen Ziel-DNA-Abschnitten in jeweils zugewiesenen Kavitäten.
Optional wird das vorstehend beschriebene Verfahren im Rahmen einer mehrstufigen Vervielfältigung für eine erste Vervielfältigungsstufe („Vorstufe“) und/oder eine zweite Vervielfältigungsstufe (Hauptvervielfältigung) eingesetzt. Optional weist der Probenträger auch unterschiedliche Kavitäten für die jeweilige Stufe auf, so dass die der jeweiligen Stufe zugewiesenen Proben gleichzeitig (mit anschließender „Umsetzung“ in die Kavität der nächsthöheren Stufe) vervielfältigt werden können.
Die erfindungsgemäße Rotationsvorrichtung ist zum Einsatz für die Vervielfältigung von DNA, insbesondere im Rahmen des vorstehend beschriebenen Verfahrens eingerichtet und vorgesehen. Dazu umfasst die Rotationsvorrichtung eine Prozesskammer sowie einen in der Prozesskammer angeordneten Probenhalter. Dieser Probenhalter ist zur Halterung wenigstens eines Probenträgers der vorstehend beschriebenen Art eingerichtet und vorgesehen. Dieser Probenträger weist mithin wenigstens eine Kavität (der vorstehend beschriebenen Art) auf, die zur Aufnahme der DNA enthaltenden Probenflüssigkeit dient. Ferner weist die Rotationsvorrichtung einen Rotationsantrieb auf, mittels dessen der Probenhalter im bestimmungsgemäßen Betrieb um die (vorstehend genannte) Rotationsachse rotiert wird. Außerdem weist die Rotationsvorrichtung die vorstehend genannte Heizvorrichtung auf, mittels derer im bestimmungsgemäßen Betrieb die in der Rotationsebene des Probenhalters liegende Wärmeeintragsseite des Probenträgers, zumindest der Kavität, auf einen hohen Temperaturwert erwärmt wird. Ferner weist die Rotationsvorrichtung einen Controller auf, der steuerungstechnisch mit dem Rotationsantrieb und der Heizvorrichtung verknüpft und dazu eingerichtet ist, das vorstehend beschriebene Verfahren zur Vervielfältigung von DNA insbesondere automatisch, optional in Zusammenwirkung mit Laborpersonal durchzuführen.
Die Rotationsvorrichtung sowie das vorstehend beschriebene Verfahren teilen die vorstehend beschriebenen Vorteile sowie insbesondere auch die gegebenenfalls im Rahmen des Verfahrens beschriebenen körperlichen Merkmale.
Der Controller (optional auch als „Steuereinheit“ bezeichnet) kann im Rahmen der Erfindung als nicht-programmierbare elektronische Schaltung ausgebildet sein. Vorzugsweise ist der Controller aber durch einen Mikrocontroller gebildet, in dem die Funktionalität zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Softwaremoduls implementiert ist. Optional ist dieser Mikrocontroller und/oder das Softwaremodul im Rahmen eines separaten Steuerungsrechners realisiert.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Probenhalter um eine Art Platte (auch: Scheibe oder Teller), auf der der Probenträger zur Durchführung des Verfahrens befestigt werden kann. Zur Befestigung weist der Probenhalter optional eine Spannvorrichtung - bspw. Klemmen, eine Art Spannpratze oder dergleichen - auf.
In einer zweckmäßigen Ausführung weist die Heizvorrichtung Peltier-Elemente auf. Alternativ weist die Heizvorrichtung ein Widerstandsheizelement, eine Keramikheizung oder dergleichen auf. Auch eine strahlungsbasierte Heizung - bspw. ein Infrarotstrahler ist optional eingesetzt. Bevorzugt ist die Heizvorrichtung flächig erstreckt, so dass sie insbesondere mehrere Kavitäten eines oder mehrerer Probenträger abdecken kann.
Besonders bevorzugt ist die Heizvorrichtung dabei in den Probenhalter integriert, zumindest in diesen eingelassen - bspw. in eine entsprechend dimensionierte Ausnehmung des Probenhalters eingesetzt. Dadurch wird eine kompakte Bauform ermöglicht.
In einer zweckmäßigen Ausführung umfasst die Rotationsvorrichtung die vorstehend beschriebene Kühlvorrichtung zur Kühlung der Kavität auf der der Wärmeeintragsseite gegenüberliegenden Wärmeaustragsseite auf einen niedrigen Temperaturwert.
In einer zweckmäßigen Variante ist die Kühlvorrichtung durch den (Kühler-)Lüfter gebildet. Mittels dieses Lüfters wird im bestimmungsgemäßen Betrieb vorzugsweise die Prozesskammer mit Kühlluft durchströmt. Der Lüfter dient in diesem Fall vorzugsweise auch zur Kühlung des Rotationsantriebs. Optional ist der Lüfter derart in der Prozesskammer angeordnet, dass die Wärmeaustragsseite des Probenträgers angeströmt wird. Dies kann vorteilhaft sein, falls eine aufgrund der Rotation des Probenträgers fliehkraftbedingte Abströmung von Luft von dem Probenträger zur Kühlung nicht ausreichend ist. Alternativ kann die Kühlvorrichtung aber auch durch eine Kühlplatte gebildet sein, die auf den Probenträger an dessen Wärmeaustragsseite aufgelegt wird. Diese Kühlplatte weist vorzugsweise Peltier-Elemente auf, die zur Kühlung eingesetzt sind.
Optional weist der vorstehend beschriebene Lüfter auch eine Kühlfunktion, bspw. nach Art eines Kühlschranks, einer Klimaanlage oder dergleichen auf. In diesem Fall kann die Rotationsvorrichtung vorteilhafterweise auch in einer vergleichsweise warmen Umgebung betrieben werden. Alternativ wird mittels des Lüfters „nur“ Umgebungsluft in die Prozesskammer geblasen. Eine konstante Temperierung der Prozesskammer erfolgt in diesem Fall optional durch eine Regelung der Lüftergeschwindigkeit mittels eines Temperatursensors.
Unter der Wärmeeintragsseite wird hier und im Folgenden insbesondere eine Seite, vorzugsweise die Unterseite des Probenträgers und somit auch der jeweiligen Kavität verstanden. Diese Unterseite liegt im bestimmungsgemäßen Betrieb auf dem Probenhalter und somit auf der Heizvorrichtung auf. Entsprechend bezeichnet die Wärmeaustragsseite insbesondere die Oberseite des Probenträgers. Zusätzlich können die Begriffe Wärmeeintragsseite und Wärmeaustragsseite auch den entsprechenden Seiten eines für den Probenträger vorgesehenen Teilvolumens innerhalb der Prozesskammer zugewiesen sein.
In einer weiteren zweckmäßigen Ausführung umfasst die Rotationsvorrichtung auch einen Fluoreszenz-Detektor zur Erkennung einer hinreichenden Vervielfältigung der DNA. Dazu wird vorzugsweise der Probenflüssigkeit ein (insbesondere zunächst inaktiver) Farbstoff beigefügt, dessen Fluoreszenz bspw. mit zunehmender Anzahl der vervielfältigten DNA-Stränge (und somit abnehmender Anzahl an freien Reaktionspartnern) zunimmt. Somit stellt die Fluoreszenz innerhalb der Kavität ein Maß für den erreichten Umsatz dar.
Die Erfindung betrifft außerdem auch ein System zur Vervielfältigung von DNA. Dieses System umfasst die vorstehend beschriebene Rotationsvorrichtung sowie den wenigstens einen vorstehend beschriebenen Probenträger.
Die Konjunktion „und/oder“ ist hier und im Folgenden insbesondere derart zu verstehen, dass die mittels dieser Konjunktion verknüpften Merkmale sowohl gemeinsam als auch als Alternativen zueinander ausgebildet sein können.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:

1 in einer schematischen Seitenansicht ein System zur Vervielfältigung von DNA, umfassend eine Rotationsvorrichtung sowie einen Probenträger,
2 in einer schematischen Schnittdarstellung einen Ausschnitt des Probenträgers und eines Probenhalters der Rotationsvorrichtung,
3 in Ansicht gemäß 2 ein alternatives Ausführungsbeispiel des Probenträgers,
4 in einer schematischen Draufsicht den Probenträger gemäß 3,
5 in Ansicht gemäß 4 ein weiteres Ausführungsbeispiel des Probenträgers, und
6 in einem schematischen Ablaufdiagramm ein Verfahren zur Vervielfältigung von DNA.

Einander entsprechende Teile sind in allen Figuren stets mit gleichen Bezugszeichen versehen.
In 1 ist ein System 1 zur Vervielfältigung von DNA dargestellt. Dieses System 1 umfasst eine Rotationsvorrichtung 2 sowie einen Probenträger 4. Mittels des Systems 1 wird ein im Folgenden anhand von 6 näher beschriebenes Verfahren zur Vervielfältigung von DNA durchgeführt.
Die Rotationsvorrichtung 2 weist ein Gehäuse 6 auf, das einen Gehäuseinnenraum, im Folgenden als „Prozesskammer 8“ bezeichnet, umgibt. Weiterhin weist die Rotationsvorrichtung 2 einen Probenhalter 10 auf. Auf diesem ist bei Durchführung des Verfahrens (d. h. im bestimmungsgemäßen Betrieb) der Probenträger 4 gehaltert. Der Probenhalter 10 ist mittels eines Rotationsantriebs 12 um eine Rotationsachse 14 rotierbar. Somit handelt es sich bei dem Probenhalter 10 um einen Drehteller. Ferner weist die Rotationsvorrichtung 2 als Kühlvorrichtung einen Lüfter 16 auf, mittels dessen die Prozesskammer 8 im bestimmungsgemäßen Betrieb mit einem Kühlluftstrom durchströmt wird. Außerdem weist die Rotationsvorrichtung 2 einen Fluoreszenz-Detektor 18 auf.
Der Probenträger 4 weist wenigstens eine Kavität 20 (s. 2) zur Aufnahme einer DNA enthaltenden Probenflüssigkeit auf. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist der Probenträger 4 mehrere dieser Kavitäten 20 auf. Die Kavität 20 weist eine quaderförmige Form mit beispielhaften Abmessungen von etwa 5 x 3 x 1,2 mm³ auf und ist durch eine Bodenwand 22 und eine Deckwand 24 zur Unterseite (im Folgenden: „Wärmeeintragsseite 26“) bzw. zur Oberseite (im Folgenden: „Wärmeaustragsseite 28“) sowie durch nicht näher dargestellte Seitenwände zu den übrigen Seiten begrenzt. Die Wände des Probenträgers 4 sind dabei aus Kunststoff, konkret einem Cycloolefin-Copolymer (COC) gebildet. Im bestimmungsgemäßen Betrieb ist der Probenträger 4 mit der Wärmeeintragsseite 26 auf den Probenhalter 10 aufgesetzt.
Die Rotationsvorrichtung 2 weist eine Heizvorrichtung 30 auf. Diese weist wiederum ein flächig über die der Wärmeeintragsseite 26 zugewandte Oberseite des Probenhalters 10 erstrecktes Peltier-Element, optional mehrere zur flächigen Wärmeabgabe nebeneinander positionierte Peltier-Elemente auf. Die Heizvorrichtung 30 ist in den Probenhalter 10 integriert. In einem nicht näher dargestellten Ausführungsbeispiel ist zwischen dem Peltier-Element und dem Probenhalter 10 eine Aluminiumplatte zur homogenen Temperaturverteilung angeordnet.
Ein Controller der Rotationsvorrichtung 2 zur Steuerung des Rotationsantriebs 12, der Heizvorrichtung 30 und des Lüfters 16 ist vorhanden aber nicht näher dargestellt.
Zur Vervielfältigung von DNA wird in einem ersten Verfahrensschritt S1 (s. 6) der Probenträger 4 und die DNA enthaltene Probenflüssigkeit bereitgestellt. Die Probenflüssigkeit enthält neben der zu vervielfältigenden DNA auch Primer-Moleküle, Strukturbausteine für die Bildung neuer DNA-Stränge sowie Polymerase. In einem zweiten Verfahrensschritt S2 werden die Kavitäten 20 mit der Probenflüssigkeit befüllt.
In einem dritten Verfahrensschritt S3 wird der Probenträger 4 mittels der Heizvorrichtung 30 auf der Wärmeeintragsseite 26 auf einem hohen Temperaturwert von etwa 95 Grad Celsius konstant gehalten. Parallel dazu treibt der Rotationsantrieb 12 den Probenhalter 10 zur Rotation um die Rotationsachse 14 an, so dass eine jede Kavität 20 um die Rotationsachse 14 rotiert wird. Mittels des Lüfters 16 wird ein Kühlluftstrom (von vorzugsweise 40 Grad Celsius) über den Probenträger 4 hinweg geblasen, so dass dessen Wärmeaustragsseite 28 konstant auf diesem niedrigen Temperaturwert gehalten wird.
Aufgrund der bodenseitigen Erwärmung und der deckelseitigen Kühlung bilden sich innerhalb der Kavität 20 ein warmer Bereich 32 und ein kalter Bereich 34 aus (angedeutet durch gestrichelte Linien), mithin ein Temperaturgradient, der parallel zur Rotationsachse 14 verläuft. Im kalten Bereich 34 weist die Probenflüssigkeit einen Temperaturwert von etwa 60 Grad Celsius auf. Im warmen Bereich 32 liegt der Temperaturwert der Probenflüssigkeit oberhalb der Schmelztemperatur der DNA, konkret oberhalb von 90 Grad Celsius.
Aufgrund der bodenseitigen Erwärmung und der deckelseitigen Kühlung stellt sich eine auftriebsgetriebene Konvektionsströmung ein, basierend auf den temperaturbedingten Dichteunterschieden der Probenflüssigkeit. Diese Konvektionsströmung ist grundsätzlich ringförmig (nämlich etwa in Form eines Ovals, vgl. halbkreisförmige Pfeile in 2) und mit Strömungsanteilen etwa senkrecht zur Rotationsebene des Probenhalters 10 ausgerichtet. Aufgrund der Zentrifugalkräfte der Rotation (in 2 nach rechts gerichtet) und der aufgrund der Rotation ebenfalls vorhandenen Corioliskraft erfolgt aber auch eine (homogene) Durchmischung der Probenflüssigkeit quer zum grundsätzlichen Strömungspfad der Konvektionsströmung. Die Geschwindigkeit der Konvektionsströmung nimmt dabei mit zunehmender Rotationsgeschwindigkeit zu.
Im Rahmen der Konvektionsströmung durchläuft die Probenflüssigkeit also den warmen Bereich 32 (etwa parallel zur Rotationsebene), in dem temperaturbedingt eine Denaturierung der DNA erfolgt. Deshalb wird der warme Bereich 32 auch als „Denaturierungszone“ bezeichnet. Nach etwa senkrecht zur Rotationsebene gerichteter Strömung zur Wärmeaustragsseite 28 hin, durchläuft die Probenflüssigkeit (wiederum etwa parallel zur Rotationsebene) den kalten Bereich 34, in dem eine Primerhybridisierung und anschließend eine Extension der DNA-Stränge erfolgen. Der kalte Bereich 34 wird deshalb auch als Annealing- oder Extensionszone bezeichnet. Nach Durchlauf des kalten Bereichs 34 strömt die Probenflüssigkeit wieder (etwa senkrecht zur Rotationsebene) zurück zum warmen Bereich 32.
Der Verfahrensschritt S3 wird aufrechterhalten bis mittels des Fluoreszenz-Detektors 18 ein hinreichend hoher Umsatz der für die Vervielfältigung vorgesehenen Strukturbausteine etc. ermittelt wird. Dazu wird konkret ein Schwellwertvergleich eines Werts der erfassten Fluoreszenz mit einem für einen hinreichend hohen Umsatz (z. B. empirisch ermittelten) vorgegebenen Schwellwert durchgeführt. Wird dieser Schwellwert überschritten, wird in einem vierten Verfahrensschritt S4 die Rotation des Probenhalters 10 sowie das Heizen mittels der Heizvorrichtung 30 eingestellt und die Probenflüssigkeit aus der jeweiligen Kavität 20 entnommen.
Alternativ wird der Verfahrensschritt S3 nach einer vorgegebenen Zeit abgebrochen. Anhand des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz wird dabei optional die Konzentration der DNA in der Originalprobe abgeschätzt.
Insbesondere die Verfahrensschritte S1 bis S3 können auch zumindest teilweise zeitgleich zueinander erfolgen. Insbesondere muss der Probenhalter 10 während der Befüllung der Kavitäten 20 nicht still stehen. Ebenso kann auch die Heizvorrichtung 30 bereits die Wärmeeintragsseite 26 erwärmen.
In 3 und 4 ist ein alternatives Ausführungsbeispiel des Probenträgers 4 mit einer abgewandelten Struktur der jeweiligen Kavität 20 dargestellt. Innerhalb der Kavität 20 ist dabei ein Fließwiderstand 36 in Form eines sich parallel zur Rotationsebene durch die Kavität 20 erstreckenden Balkens oder Quaders angeordnet. Der Fließwiderstand 36 ist dabei derart angeordnet, dass ein radial (zur Rotationsachse 14 gerichteter) innenliegender erster Fließkanal 38 und ein radial außenliegender Fließkanal 40 freigehalten sind, durch die der Strömungspfad der Konvektionsströmung verläuft. Mithin trennt der Fließwiderstand 36 - abgesehen von den Fließkanälen 38 bzw. 40 - den warmen Bereich 32 von dem kalten Bereich 34 ab.
Die Fließkanäle 38 und 40 weisen im dargestellten Ausführungsbeispiel den gleichen Kanalquerschnitt auf. Auch weisen die warmen und kalten Bereiche 32 bzw. 34 die gleichen Abmessungen auf.
In einem optionalen Ausführungsbeispiel (nicht näher dargestellt) ist der Fließwiderstand 36 derart angeordnet, dass dem kalten Bereich 34 ein größeres Teilvolumen der Kavität 20 zugeordnet ist als dem warmen Bereich 32. Dadurch wird eine höhere Extensionsdauer (Verweildauer im kalten Bereich 34, d. h. der Extensionszone) erreicht.
Weiter optional weisen die Fließkanäle 38 und 40 unterschiedliche Kanalquerschnitte auf.
In 5 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Kavität 20 dargestellt. Der Fließwiderstand 36 unterteilt dabei die jeweiligen Fließkanäle 38 bzw. 40 mittels weiterer Stege 42 in Teilkanäle 44. Die jeweils dem Fließkanal 38 bzw. 40 zugeordneten Teilkanäle 44 können dabei wiederum unterschiedlich Querschnitte aufweisen.
Der Gegenstand der Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr können weitere Ausführungsformen der Erfindung von dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung abgeleitet werden. Insbesondere können die anhand der verschiedenen Ausführungsbeispiele beschriebenen Einzelmerkmale der Erfindung und deren Ausgestaltungsvarianten auch in anderer Weise miteinander kombiniert werden.
Bezugszeichenliste

1: System
2: Rotationsvorrichtung
4: Probenträger
6: Gehäuse
8: Prozesskammer
10: Probenhalter
12: Rotationsantrieb
14: Rotationsachse
16: Lüfter
18: Fluoreszenz-Detektor
20: Kavität
22: Bodenwand
24: Deckwand
26: Wärmeeintragsseite
28: Wärmeaustragsseite
30: Heizvorrichtung
32: Bereich
34: Bereich
36: Fließwiderstand
38: Fließkanal
40: Fließkanal
42: Steg
44: Teilkanal
S1: Verfahrensschritt
S2: Verfahrensschritt
S3: Verfahrensschritt
S4: Verfahrensschritt
S5: Verfahrensschritt

Claims

Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, wobei verfahrensgemäß - ein Probenträger (4) mit mindestens einer Kavität (20), in der eine Probenflüssigkeit, die DNA enthält, aufgenommen ist, mittels einer Rotationsvorrichtung (2) um eine Rotationsachse (14) rotiert wird, - die Kavität (20) mittels einer Heizvorrichtung (30) nur an einer in einer Rotationsebene liegenden Wärmeeintragsseite (26) auf einen hohen Temperaturwert erwärmt wird, - aufgrund der Erwärmung eine Konvektionsströmung der Probenflüssigkeit innerhalb der Kavität (20) erzeugt wird, wobei die Konvektionsströmung wesentliche, senkrecht zur Rotationsebene gerichtete Strömungsanteile aufweist, und - eine Umlaufdauer eines Flüssigkeitsteilchens entlang eines Strömungspfads der Konvektionsströmung mittels der Drehzahl der Rotation vorgegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kavität (20) auf der der Wärmeeintragsseite (26) gegenüberliegenden Wärmeaustragsseite (28) auf einen im Vergleich zur Wärmeeintragsseite (26) niedrigen Temperaturwert gekühlt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zur Erwärmung ein konstanter Temperaturwert an die Wärmeeintragsseite (26) sowie gegebenenfalls zur Kühlung ein konstanter Temperaturwert an die Wärmeaustragsseite (28) angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Kühlung mittels eines Kühlluftstroms erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erwärmung mittels der wenigstens die an der Wärmeeintragsseite (26) angeordnete Grundfläche der Kavität (20) überspannenden Heizvorrichtung (30) erfolgt, insbesondere wobei die Heizvorrichtung (30) in einen Probenhalter (10) der Rotationsvorrichtung (2), der den Probenträger (4) trägt, integriert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konvektionsströmung innerhalb der Kavität (20) mittels eines der Kavität (20) zugeordneten Fließwiderstands (36) geführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Konvektionsströmung mittels des Fließwiderstands (36) derart geführt wird, dass ein von der Wärmeeintragsseite (26) zur Wärmeaustragsseite (28) gerichteter Teil des Strömungspfads auf einer der Rotationsachse (14) zugewandten Seite der Kavität (20) und der von der Wärmeaustragsseite (28) zur Wärmeeintragsseite (26) gerichtete Teil des Strömungspfads auf der der Rotationsachse (14) abgewandten Seite der Kavität (20) verläuft.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein Probenträger (4) mit einer Mehrzahl von Kavitäten (20) zur parallelen Vervielfältigung von DNA eingesetzt wird.
Rotationsvorrichtung (2) für die Vervielfältigung von DNA, - mit einer Prozesskammer (8), - mit einem in der Prozesskammer (8) angeordneten Probenhalter (10) zur Halterung wenigstens eines Probenträgers (4), der wenigstens eine Kavität (20) zur Aufnahme einer DNA enthaltenden Probenflüssigkeit aufweist, - mit einem Rotationsantrieb (12), mittels dessen der Probenhalter (4) im bestimmungsgemäßen Betrieb um eine Rotationsachse (14) rotiert wird, - mit einer Heizvorrichtung (30), mittels derer im bestimmungsgemäßen Betrieb eine in einer Rotationsebene des Probenhalters (10) liegende Wärmeeintragsseite (26) auf einen hohen Temperaturwert erwärmt wird, und - mit einem Controller, der steuerungstechnisch mit dem Rotationsantrieb (12) und der Heizvorrichtung (30) verknüpft und dazu eingerichtet ist, das Verfahren zur Vervielfältigung von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchzuführen.
Rotationsvorrichtung (2) nach Anspruch 9, wobei die Heizvorrichtung (30) ein Peltier-Element umfasst und/oder in den Probenhalter (10) integriert ist.
Rotationsvorrichtung (2) nach Anspruch 9 oder 10, mit einer Kühlvorrichtung (16) zur Kühlung einer der Wärmeeintragsseite (26) der Kavität (30) gegenüberliegenden Wärmeaustragsseite (28) auf einen niedrigen Temperaturwert.
Rotationsvorrichtung (2) nach Anspruch 11, wobei die Kühlvorrichtung einen Lüfter (16) umfasst, mittels dessen die Prozesskammer (8) mit Kühlluft durchströmt wird.
System (1) zur Vervielfältigung von DNA, umfassend die Rotationsvorrichtung (2) nach einem der Ansprüche 9 bis 12 sowie den Probenträger (4).