EP4118220A1 - Verfahren zur biotechnologischen herstellung von aldehydgemischen - Google Patents

Verfahren zur biotechnologischen herstellung von aldehydgemischen

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EP4118220A1
EP4118220A1 EP20711570.0A EP20711570A EP4118220A1 EP 4118220 A1 EP4118220 A1 EP 4118220A1 EP 20711570 A EP20711570 A EP 20711570A EP 4118220 A1 EP4118220 A1 EP 4118220A1
Authority
EP
European Patent Office
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alpha
oil
aldehyde
carboxylic acid
seq
Prior art date
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Pending
Application number
EP20711570.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Torsten Geißler
Jakob Peter Ley
Michael Backes
Christoph Harms
Uwe Bornscheuer
Kathleen BALKE
Holger Zorn
Marco Alexander Fraatz
Andreas Hammer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Symrise AG
Original Assignee
Symrise AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Symrise AG filed Critical Symrise AG
Publication of EP4118220A1 publication Critical patent/EP4118220A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
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    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01004—Aldehyde dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
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    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)

Definitions

  • the present invention relates to biotechnological processes for the production of saturated and unsaturated aldehydes, as well as mixtures thereof, with the aid of at least one alpha-dioxygenase and at least one aldehyde dehydrogenase.
  • the process can be carried out either fermentatively or enzymatically.
  • the present invention further relates to a vector system, as well as sequences and recombinant microorganisms which code for the enzymes which can be used for the production of the aldehydes and mixtures according to the invention.
  • the present invention further relates to compositions which are obtained by the methods according to the present invention.
  • 8Z, 11Z-heptadecadienal can be obtained by chemical oxidation of the unsaturated alcohol (JP 63233914).
  • Various aldehydes can also be produced from fatty acids in a known manner by alpha-oxidation using vegetable enzymes, as described in WO2012025629 A1.
  • algal biomass for the production of unsaturated aldehydes is also known ("Concise synthesis of (8Z, 11Z, 14Z) -8,11,14-heptadecatrienal, (7Z, 10Z, 3Z) -7, 10,13- hexadecatrienal, and ( 8Z, 11Z) -8, 11-heptadecadienal, components of the essential oil of marine green alga Ulva pertusa ", Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Jul; 69 (7): 1348-52).
  • 8Z-pentadecenal is known as a naturally occurring component of cucumbers (Kemp, A C15 aldehyde from Cucumis sativus, Phytochemistry, Volume 16, Issue 11, 1977, Pages 1831-1832).
  • the taste of 8Z-pentadecenal is primarily described as oily and the taste-improving properties on chicken and grilled beef are also described.
  • a process for the production from 1-nonine and 6-bromo-1-hexanol is known, but this cannot be classified as a natural production process according to EC 1334/2008 (JP 2014043409).
  • aldehydes can be produced from fatty acids by alpha oxidation using vegetable enzymes, as described in WO2012025629 A1.
  • the use of algae biomass for the production of unsaturated aldehydes is also known.
  • the prior art also discloses further processes for the production of fatty acids from the corresponding oils or fats by enzymatic cleavage.
  • bacterial lipases such as enzymes from Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, PenicilHum camembertii, Mucor juvanicus, PenicilHum roquefortii, pig pancreas, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Candida antarctica or Rhizops, microbial and enzymes, and enzymes Technology Volume 39, Issue 2, June 26, 2006, Pages 235-251).
  • the object of the present invention was therefore to provide a process for the production of aldehydes or aldehyde mixtures which can be classified as a natural production process according to EC 1334/2008. Furthermore, it was an object to provide an integrated biotechnological process through the targeted coordination of enzymatic metabolic steps, which can provide the products of interest in high yield and purity without chemical intermediate steps.
  • the present invention accordingly relates, according to a primary aspect, to the provision of a method for the preparation of saturated and unsaturated aldehydes with the aid of at least one alpha-dioxygenase and at least one
  • the present invention relates to a fermentative process for the production of saturated and unsaturated aldehydes and mixtures thereof.
  • the present invention relates to a fermentative process for the production of saturated and unsaturated aldehydes and mixtures thereof.
  • the present method according to the invention relates to the use of starting materials which are either of biotechnological, natural or chemical origin.
  • the process according to the invention relates to preferred starting materials selected from the group of carboxylic acids and carboxylic acids esterified with alcohols.
  • the method according to the invention relates to preferred product mixtures, microorganisms which are used in the method and amino acid sequences of the enzymes to be used preferably and nucleotide sequences or nucleic acid segments coding for the enzymes to be used.
  • Another aspect of the present invention relates to the provision of a vector system which codes for the enzymes used according to the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a composition which is obtained by a method according to the invention. Brief description of the images
  • Figure 1 Plasmid pET28a_OSaDOX with genes that code for an alpha-dioxygenase.
  • Figure 2 Plasmid pET-Duet_VhFALDH with genes for a
  • Figure 3 Plasmid pET-Duet_LsNOX_VhFALDH with genes which code for an aldehyde dehydrogenase and a NADH oxidase.
  • Figure 4 Biocatalytic conversion of a mixture of oleic acid and linoleic acid to an aldehyde mixture containing 8,11-heptadecadienal and 7,10-hexadecadienal.
  • Figure 5 Time course of a biocatalytic conversion of a mixture of oleic acid and linoleic acid by means of alpha-dioxygenase, aldehyde dehydrogenase and NADH oxidase to a corresponding aldehyde mixture within one hour.
  • Figure 6 Time course of a biocatalytic conversion of a mixture of oleic acid and linoleic acid by means of alpha-dioxygenase and aldehyde dehydrogenase without NADH oxidase to a corresponding aldehyde mixture within 24 hours.
  • Figure 7 Increased, temporal course of a biocatalytic conversion of a mixture of oleic acid and linoleic acid by means of alpha-dioxygenase and aldehyde dehydrogenase with NADH oxidase to a corresponding aldehyde mixture within 24 hours.
  • SEQ ID NO 1 nucleic acid sequence which codes for the enzyme Os-alpha-DOX from Oryza sativa.
  • SEQ ID NO 2 nucleic acid sequence which codes for the enzyme VhFALDH from Vibrio harveyi.
  • SEQ ID NO 3 nucleic acid sequence which codes for the 175Q mutant of the enzyme VhFALDH from Vibrio harveyi.
  • SEQ ID NO 4 Nucleic acid sequence which is derived from the enzyme LsNOX
  • Lactobacillus sanfranciscenis Lactobacillus sanfranciscenis.
  • SEQ ID NO 5 Nucleic acid sequence which is derived from the enzyme ReALDH
  • SEQ ID NO 6 Nucleic acid sequence which is derived from the enzyme GtALDH
  • SEQ ID NO 7 nucleic acid sequence which codes for the enzyme Maqu3410, an aldehyde dehydrogenase from Marinobacter aquaeolei VT8.
  • SEQ ID NO 8 amino acid sequence which codes for the enzyme Os-alpha-DOX from Oryza sativa.
  • SEQ ID NO 9 Amino acid sequence which codes for the enzyme VhFALDH from Vibrio harveyi.
  • SEQ ID NO 10 Amino acid sequence which codes for the 175Q mutant of the enzyme VhFALDH from Vibrio harveyi.
  • SEQ ID NO 11 Amino acid sequence for the enzyme LsNOX
  • Lactobacillus sanfranciscenis Lactobacillus sanfranciscenis.
  • SEQ ID NO 12 Amino acid sequence necessary for the enzyme ReALDH
  • SEQ ID NO 13 Amino acid sequence for the enzyme GtALDH from
  • SEQ ID NO 14 Amino acid sequence for the enzyme Maqu3410, a
  • SEQ ID NO 15 nucleic acid sequence which codes for a forward primer.
  • SEQ ID NO 16 nucleic acid sequence which codes for a reverse primer.
  • SEQ ID NO 17 nucleic acid sequence which codes for the enzyme At-alpha-DOX2 from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID NO 18 nucleic acid sequence which codes for the enzyme At-alpha-DOX from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID NO 19 Nucleic acid sequence for the enzyme CaaDOX
  • SEQ ID NO 20 Nucleic acid sequence for the enzyme CbaDOX
  • SEQ ID NO 21 Nucleic acid sequence for the enzyme CsaDOX2
  • SEQ ID NO 22 Nucleic acid sequence for the enzyme CsaDOX
  • SEQ ID NO 23 Nucleic acid sequence which codes for the enzyme CsaDOxlikel from Cucumis sativus.
  • SEQ ID NO 24 nucleic acid sequence which codes for the enzyme Le-alpha-DOX1 from Solanum lycopersicum.
  • SEQ ID NO 25 nucleic acid sequence which codes for the enzyme Le-alpha-DOX2 from Solanum lycopersicum.
  • SEQ ID NO 26 Nucleic acid sequence for the NaaDOX2 enzyme
  • SEQ ID NO 27 Nucleic acid sequence for the enzyme Na-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 28 Nucleic acid sequence for the enzyme Nt-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 29 Nucleic acid sequence for the enzyme PpaDOX from
  • SEQ ID NO 30 nucleic acid sequence for the enzyme Ps-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 31 Nucleic acid sequence which is derived from the enzyme SlaDOX2
  • SEQ ID NO 32 Nucleic acid sequence for the enzyme StaDOX1.1
  • SEQ ID NO 33 Nucleic acid sequence for the enzyme StaDOX1.2
  • SEQ ID NO 34 Nucleic acid sequence for the enzyme StaDOX1.3
  • SEQ ID NO 35 Nucleic acid sequence for the enzyme StaDOXI from
  • SEQ ID NO 36 Nucleic acid sequence for the enzyme StaDOX2
  • SEQ ID NO 37 Amino acid sequence which codes for the enzyme At-alpha-DOX2 from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID NO 38 Amino acid sequence for the enzyme At-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 39 Amino acid sequence for the enzyme CaaDOX from
  • SEQ ID NO 40 Amino acid sequence for the enzyme CbaDOX from
  • SEQ ID NO 41 Amino acid sequence for the enzyme CsaDOX2
  • SEQ ID NO 42 Amino acid sequence which codes for the enzyme CsaDOX from Cucumis sativus.
  • SEQ ID NO 43 Amino acid sequence for the enzyme CsaDOxlikel
  • SEQ ID NO 44 Amino acid sequence for the enzyme Le-alpha-DOX1 from
  • SEQ ID NO 45 Amino acid sequence for the enzyme Le-alpha-DOX2 from
  • SEQ ID NO 46 Amino acid sequence for the enzyme NaaDOX2 from
  • SEQ ID NO 47 Amino acid sequence for the enzyme Na-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 48 Amino acid sequence for the enzyme Nt-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 49 Amino acid sequence for the enzyme PpaDOX from
  • SEQ ID NO 50 Amino acid sequence for the enzyme Ps-alpha-DOX
  • SEQ ID NO 51 Amino acid sequence for the enzyme SlaDOX2
  • SEQ ID NO 52 Amino acid sequence for the enzyme StaDOX1.1 from
  • SEQ ID NO 53 Amino acid sequence for the enzyme StaDOX1.2 from
  • SEQ ID NO 54 Amino acid sequence for the enzyme StaDOX1.3 from
  • SEQ ID NO 55 Amino acid sequence for the enzyme StaDOXI from
  • SEQ ID NO 56 Amino acid sequence for the enzyme StaDOX2
  • SEQ ID NO 57 nucleic acid sequence which is used for the enzyme Ald1 from Acinetobacter sp. Encoded strain M1.
  • SEQ ID NO 58 nucleic acid sequence for the enzyme HFD4, a
  • SEQ ID NO 59 Amino acid sequence which is used for the enzyme Ald1 from Acinetobacter sp. Encoded strain M1.
  • SEQ ID NO 60 Amino acid sequence for the enzyme HFD4, a
  • SEQ ID NO 61 nucleic acid sequence which codes for a NAD (P) H oxidase from Lactobacillus sanfranciscensis.
  • SEQ ID NO 62 Amino acid sequence which codes for a NAD (P) H oxidase from Lactobacillus sanfranciscensis.
  • SEQ ID NO 63 nucleic acid sequence which codes for a NADH oxidase from Lactobacillus brevis.
  • SEQ ID NO 64 Amino acid sequence which codes for a NADH oxidase from Lactobacillus brevis.
  • vector system denotes a system which consists of or contains at least one or more vectors or plasmid vectors.
  • a vector system can contain a (plasmid) vector which codes for several different target genes.
  • a vector system can also contain several (plasmid) vectors, which in turn contain at least one target gene according to the present disclosure.
  • a vector system can thus comprise only one (plasmid) vector construct or several (plasmid) vector constructs, the latter being able to be transformed stably or transiently into the corresponding recombinant host organism simultaneously or one after the other, so that the target genes encoded by the individual constructs are transcribed and translated by the word organism can.
  • amino acid protein and polypeptide are used interchangeably herein.
  • amino acids disclosed herein, or functional sections thereof, have an enzymatic function when correctly folded. Accordingly, the term enzyme is used interchangeably for the term amino acid.
  • sequence identities of nucleic or protein sequences is referred to in the form of percentages, this information relates to values as determined using EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nucleotides) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ emboss_water / nucleotide.html) for
  • Nucleic acid sequences or EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (protein) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) for amino acid sequences can be calculated.
  • tools provided by the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioninformatics Institute (EBI) for local EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (protein) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) for amino acid sequences can be calculated.
  • EMBL European Molecular Biology Laboratory
  • EBI European Bioninformatics Institute
  • nucleic acids, nucleotide sequences or nucleic acid segments (these terms are used interchangeably for DNA sequences which encode a functional enzyme, or a functional region thereof), which according to the present invention are used to express a desired target protein, can optionally be codon-optimized , ie the codon usage of a gene is adapted to that of the recombinant microorganism or fungus selected as the expression strain. It is known to those skilled in the art that a desired target gene encoding a protein of interest can be modified without altering the translated protein sequence to accommodate the specific species-dependent codon usage.
  • the nucleic acids of the present invention to be transformed can specifically target the codon usage of E. coli or of another bacterium, of Saccharomyces spp. or another yeast.
  • the disclosed carboxylic acids can either be present in their free form or esterified with alcohols, which occur, for example, as components of lipids.
  • the object of the present invention is primarily achieved by providing a biotechnological process for the preparation of at least one unsaturated aldehyde and its corresponding carboxylic acid and / or at least one saturated aldehyde and its corresponding carboxylic acid, the method providing at least one alpha-dioxygenase and at least one
  • aldehyde dehydrogenase Includes aldehyde dehydrogenase.
  • the aldehyde obtained is always shortened by one carbon atom compared to the starting material used.
  • a saturated aldehyde refers to an aldehyde without double bonds
  • an unsaturated aldehyde refers to aldehydes with double bonds present.
  • the corresponding carboxylic acid is a compound with the same chain length and the same degree of saturation as the aldehyde obtained, but which carries at least one carboxyl group.
  • the at least one alpha-dioxygenase used according to the invention catalyzes the oxidation of carboxylic acids of chain length C6 - C22 on the alpha carbon atom, so that the aldehyde corresponding to the carboxylic acid and shortened by one carbon atom is formed.
  • the at least one aldehyde dehydrogenase used catalyzes the oxidation of an aldehyde to the corresponding carboxylic acid due to its substrate specificity, which in turn can be further converted to an aldehyde shortened by one carbon atom with the alpha-dioxygenase.
  • aldehyde mixtures can be produced in a targeted manner with aldehydes which have different chain lengths.
  • the alpha-oxidation and the aldehyde oxidation can take place simultaneously, wherein in a further embodiment the alpha-oxidation and then the aldehyde oxidation can be carried out, the reaction cycle in both embodiments until the desired product is obtained can be continued.
  • the biotechnological production method can be a fermentative method which comprises the following steps: i. Providing at least one recombinant microorganism or fungus containing a nucleic acid segment comprising at least one gene coding for an alpha-dioxygenase and / or at least one gene coding for an aldehyde dehydrogenase; ii. Culturing the at least one recombinant microorganism under conditions which allow expression of the corresponding expression product; iii. Adding at least one carboxylic acid or at least one carboxylic acid esterified with an alcohol to the at least one cultivated, recombinant microorganism; iv.
  • a fermentative process in the context of the present invention relates to a process in which, in at least one step, a recombinant microorganism is cultivated which expresses the at least one alpha-dioxygenase and the at least one aldehyde dehydrogenase which are required for the production of the product according to the invention.
  • the expression product here is the at least one alpha-dioxygenase and / or the at least one aldehyde dehydrogenase.
  • the reaction of the educt can take place through the secretion of the enzyme into the reaction mixture in which the educts are present, whereas according to a further embodiment, the conversion can take place in the cytosol of the at least one microorganism and the product can then be secreted.
  • the provision can always be a technical step, such as, for example, the cloning of a reaction organism or the production of a starting material.
  • the biotechnological production method can be an enzymatic method which comprises the following steps:
  • At least one alpha-dioxygenase and at least one aldehyde dehydrogenase wherein the at least one alpha-dioxygenase and / or the at least one aldehyde dehydrogenase can be produced naturally, chemically or biotechnologically; ii. Adding at least one carboxylic acid or at least one carboxylic acid esterified with an alcohol to the enzymes provided from step i; iii. Obtaining at least one unsaturated aldehyde and its corresponding carboxylic acid and / or at least one saturated
  • Aldehyde and its corresponding carboxylic acid by reaction of the at least one alpha-dioxygenase and the at least one aldehyde dehydrogenase with the at least one carboxylic acid or the carboxylic acid esterified to an alcohol from step ii.
  • An enzymatic process in the context of the present invention denotes a process in which the at least one alpha-dioxygenase and the at least one aldehyde dehydrogenase can be present in purified or partially purified form outside of a microorganism.
  • the two enzymes can be present as cell lysate, which denotes the state of microorganisms that can no longer be cultured and that have been disrupted by physical, chemical or enzymatic processes.
  • the enzymes can be present with a purity of> 80%, with these being purified by a purification process familiar to the person skilled in the art.
  • the enzymes can be present with a purity of ⁇ 80%, these being partially purified by a cleaning process familiar to the person skilled in the art.
  • the enzymes can be obtained by protein synthesis and optionally purified.
  • An educt of biotechnological origin is an educt produced by fermentation of microorganisms, an educt of natural origin from a natural source, for example a plant, a fungus, an animal, a microorganism or from the Soil can be gained.
  • An educt of chemical origin can be produced by a chemical synthesis process from precursors of the educt.
  • At least one of the starting materials of the process according to the invention can be of biotechnological, natural or chemical origin. What has been said above applies to the educts of biotechnological, natural or chemical origin.
  • the starting materials can be selected from the group of carboxylic acids and carboxylic acids esterified with alcohols. Preference is given here to starting materials which are selected from the group consisting of palmitoleic acid, arachidonic acid, alpha-linolenic acid, linoleic acid, gamma-linolenic acid, oleic acid, punicic acid, alpha-eleostearic acid, docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic acid.
  • Petroselinic acid chaulmoograic acid, alpha-licaric acid, olive oil, rapeseed oil, macadamia nut oil, sea buckthorn pulp oil, tung oil, fish oil, borage oil, chaulmoogra oil, parsley oil, oiticica oil, pomegranate seed oil, coconut oil, sunflower oil, field stone oil, selected from cone seed oil, as well as mushroom stone oil, independently and grape seed oil , Flamm ulina, Fomes, Ganoderma, Mortierella, Panellus, Pleurotus, Psathyrella, Stereum, Umbelopsis.
  • the product of the process according to the invention can be at least one saturated aldehyde and its corresponding carboxylic acid and / or one unsaturated aldehyde and its corresponding carboxylic acid.
  • the products of the process according to the invention can preferably be selected from the group comprising 7Z, 10Z-hexadecadienal, 8Z, 11Z-heptadecadienal, 6E, 9E-pentadecadienal, 7Z-hexadecenal, 8Z-pentadecenal, 7Z-tetradecenal, 8Z, 11Z, 14Z- Heptadecatrienal, 7Z, 10Z, 13Z-Hexadecatrienal,
  • Heptadecadienal 9-methylundecanal, 10-methylundecanal, 10-methyldodecanal, 11- Methyldodecanal, 11-methyltridecanal, 12-methyltridecanal, 12-methyltetradecanal, 13-methyltetradecanal and 13-methylpentadecanal.
  • the at least one recombinant microorganism can be selected from the group consisting of Escherichia coli, preferably E. coli BL21, E. coli MG1655, E. coli W3110 and their derivatives, Bacillus spp., Preferably B. licheniformis , B. subitilis or ß. amyloliquefaciens, and their derivatives, Saccharomyces spp., preferably S. cerevesiae, and their derivatives, Hansenula or Komagatella spp., preferably K. phaffii and H. polymorpha, and their derivatives, Kluyveromyces spp, preferably K. lactis.
  • Escherichia coli preferably E. coli BL21, E. coli MG1655, E. coli W3110 and their derivatives
  • Bacillus spp. Preferably B. licheniformis , B. subitilis or ß.
  • At least one NADH oxidase and / or at least one lipase can additionally be provided.
  • NADH oxidases are those which, due to their substrate specificity and regioselectivity, can catalyze the oxidation of an aldehyde. In a preferred embodiment of the process according to the invention, these can be used as additional enzymes in order to make the closely coordinated processes even more efficient by recycling the corresponding cofactor.
  • the at least one NADH oxidase can comprise an amino acid sequence, the amino acid sequence being independently selected from the group consisting of SEQ IDs NO: 62 and 64, or a sequence with at least 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to it.
  • the amino acid sequence coding for NADH oxidase is encoded by a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ IDs NO: 61 and 62, or a sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to it.
  • an enzyme which catalyzes the reaction according to the invention according to the various aspects and embodiments of the present invention can be a catalytically active domain or a fragment of the particular enzyme from which it originates.
  • the at least one lipase can be a commercial lipase selected from the group consisting of Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Penicillium camembertii, Mucorjuvanicus, PenicilHum roqueforti, pig pancreas, Candida rugosa, Rhizomucor miehei del or Rhizoparctus delem, Candarida antarida .
  • the alpha-dioxygenase can comprise an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 11, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55 or 56 or a sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% or 100% sequence identity to it.
  • the at least one is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 11, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55 or 56 or a sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% or 100% sequence identity to it.
  • the at least one is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 11, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47,
  • Aldehyde dehydrogenase comprise or consist of an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence can be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 12, 13, 14, 59, or 60 or a sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to it.
  • Another embodiment of the present invention can be based on
  • Nucleic acid sequences or sections thereof which code for polypeptides with an enzymatic function, which for the purpose of purification, secretion, detection or localization of the at least one alpha-dioxygenase and / or the at least one aldehyde dehydrogenase and / or the at least one lipase and / or the at least one NADH oxidase is used.
  • These nucleic acid sections are also referred to as tag sequences and can precede (N-terminal) and / or follow (C-terminal) the nucleic acid sections that code for the at least one alpha-dioxygenase and / or the at least one aldehyde dehydrogenase.
  • Tag sequences are preferably selected from the following list: polyhistidine (His) tag, glutathione-S-transferase (GST) tag, thioredoxin tag, FLAG tag, green fluorescent protein (GFP) tag, streptavidin tag, Maltose binding protein (MBP) tag, chloroplast transit peptide, mitochondrial transit peptide and / or secretion tag.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP Maltose binding protein
  • chloroplast transit peptide chloroplast transit peptide
  • mitochondrial transit peptide and / or secretion tag preferably selected from the following list: polyhistidine (His) tag, glutathione-S-transferase (GST) tag, thioredoxin tag, FLAG tag, green fluorescent protein (GFP) tag, streptavidin tag, Maltose binding protein (MBP) tag, chloroplast transit peptide, mitochondrial transit peptide and / or secreti
  • the invention relates to a vector system, preferably a plasmid vector system, which comprises at least one vector or plasmid vector comprising a nucleic acid segment (a) comprising at least one gene coding for an alpha-dioxygenase, and a nucleic acid segment (b) comprising at least one gene coding for an aldehyde dehydrogenase; and optionally as part of the nucleic acid segment (a) and / or (b) comprises a nucleic acid segment which comprises at least one gene coding for an NADH oxidase and / or a nucleic acid segment comprising at least one gene coding for a lipase, the nucleic acid segment (a) and / or the nucleic acid segment (b) is provided on the same vector, or on two or more separate vectors.
  • a vector system preferably plasmid vector system, which comprises at least one vector or plasmid vector comprising a nucleic acid segment (a) comprising at least
  • the vector system can code for the expression of at least one polypeptide, this polypeptide being selected from the group consisting of the SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59 or 60 or a sequence with at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to it.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising an aldehyde mixture obtained by a method according to the invention, characterized in that the composition comprises at least one or preferably at least two or three aldehydes selected from the group consisting of 7 Z-tetradecenal, 8Z-pentadecenal, pentadecanal , 7Z-hexadecenal and 8Z-heptadecenal, the one or more aldehydes each in a proportion of approximately 0.0001-20% by weight, preferably 0.001-10% by weight, particularly preferably 0.01 - 5 wt.
  • composition 7Z-tetradecenal in a proportion of approximately 0.0001-20 wt. % comprises, or wherein the composition comprises 8Z-pentadecenal in a proportion of approximately 0.0001-20% by weight, with respect to the total composition, or wherein the composition comprises pentadecanal in a proportion of approximately 0.0001-20% by weight % includes, in terms of the
  • composition or wherein the composition comprises 7Z-hexadecenal in a proportion of about 0.0001-20% by weight, based on the total composition, or wherein the composition comprises 8Z-heptadecenal in one Proportion of about 0.0001-20% by weight, based on the total composition, or wherein the composition comprises at least 8Z-pentadecenal and pentadecanal, the proportion of 8Z-pentadecenal and pentadecanal in the total composition being about 0.0001-20 % By weight, or wherein the composition comprises at least 8Z-pentadecenal and 8Z-heptadecenal, wherein the proportion of 8Z-pentadecenal and 8Z-heptadecenal in the total composition comprises approximately 0.0001-20% by weight.
  • a composition in the context of the present invention is a semi-finished or finished product composition and is preferably selected from the group consisting of nutrition or pleasure preparation or a cosmetic or cleaning preparation.
  • Preparations for nutrition or pleasure in the sense of the present invention are, for example, baked goods (e.g. bread, dry biscuits, cakes, other pastries), confectionery (e.g. chocolates, chocolate bar products, other bar products, fruit gums, hard and soft caramels, chewing gum), alcoholic or non-alcoholic Beverages (e.g. coffee, tea, wine, beverages containing wine, beer, beverages containing beer, liqueurs, schnapps, brandies, fruit-containing lemonades, isotonic drinks, soft drinks, nectars, fruit and vegetable juices, fruit or
  • baked goods e.g. bread, dry biscuits, cakes, other pastries
  • confectionery e.g. chocolates, chocolate bar products, other bar products, fruit gums, hard and soft caramels, chewing gum
  • alcoholic or non-alcoholic Beverages e.g. coffee, tea, wine, beverages containing wine, beer, beverages containing beer, liqueurs, schnapps, brandies, fruit-containing lemonades, isotonic
  • Vegetable juice preparations e.g. instant cocoa drinks, instant tea drinks, instant coffee drinks, instant fruit drinks
  • meat products e.g.
  • Ham fresh sausage or raw sausage preparations, seasoned or marinated fresh or salted meat products
  • eggs or egg products dried egg, egg white, egg yolk
  • grain products e.g. breakfast cereals, muesli bars, pre-cooked ready-to-eat rice products
  • dairy products e.g. milk beverages, buttermilk beverages, etc. , Cream cheese, soft cheese, hard cheese, dry milk powder, whey, butter, buttermilk, partially or fully hydrolyzed milk protein-containing products
  • products made from soy protein or other soy bean fractions e.g. soy milk and products made from it, fruit drinks with soy protein, preparations containing soy lecithin, fermented products such as tofu or Tempe or products made from them
  • fruit preparations e.g. jams, fruit ice cream, fruit sauces, fruit fillings
  • vegetable preparations e.g.
  • Ketchup sauces, dried vegetables, frozen vegetables, pre-cooked vegetables, cooked vegetables
  • snacks e.g. baked or deep-fried potato chips or
  • Potato dough products, extrudates based on corn or peanuts), products based on fat and oil or emulsions of the same e.g. mayonnaise, tartar sauce, dressings
  • other ready meals and soups e.g. dry soups, instant soups, pre-cooked soups
  • Spices e.g. dry soups, instant soups, pre-cooked soups
  • Spices e.g. seasonings and especially seasonings, which are used, for example, in the snack sector.
  • the preparations within the meaning of the invention can also serve as semi-finished goods for the production of further preparations used for nutrition or pleasure.
  • the preparations within the meaning of the invention can also be in the form of capsules, tablets (non-coated as well as coated tablets, e.g.
  • a cosmetic or cleaning preparation within the meaning of the present invention is a preparation which can be used for cleaning, caring for or perfuming the body or for cleaning.
  • Preferred cosmetic preparations are selected from the group consisting of floor cleaners, window glass cleaners, dishwashing detergents, bathroom and sanitary cleaners, scouring milk, solid and liquid toilet cleaners, powder and foam carpet cleaners, textile fresheners, ironing aids, liquid detergents, powder detergents, laundry pretreatment agents such as bleach, Soaking agents and stain removers, fabric softeners, laundry soaps, washing tablets, disinfectants, surface disinfectants and air fresheners in liquid, gel-like or solid carrier form, aerosol sprays, waxes and polishes such as furniture polishes, floor waxes, shoe polishes and body care products such as solid and liquid soaps, Shampoos, shaving soaps, shaving foams, bath oils, cosmetic emulsions of the oil-in-water, of the water-in-oil and of the water-in-oil-in-water type, such as, for example, skin creams and lotions, face creams and oils lotions, sun protection creams and lotions, after-sun creams and lotions
  • the composition obtained contains, depending on the embodiment of the process according to the invention, further aldehydes, carboxylic acids or alcohols selected from the group consisting of dodecanol, tridecanal, tridecanol, tetradecanal, 8Z-tetradecenol, tetradecanol, pentadecanal, pentadecanol, octanoic acid, decanoic acid, tridecanal , Tridecenoic acid, pentadecenal and 8Z-tetradecenoic acid.
  • further aldehydes, carboxylic acids or alcohols selected from the group consisting of dodecanol, tridecanal, tridecanol, tetradecanal, 8Z-tetradecenol, tetradecanol, pentadecanal, pentadecanol, octanoic acid, decanoic acid, tridecanal , Tridecenoic acid, pent
  • the individual components of the mixtures obtained can be partially or completely purified using a method known to the person skilled in the art.
  • a great advantage of these mixtures is therefore their universal applicability in a large number of branches of industry, since they can be used both as a mixture and as individual components.
  • a suitable vector with a coding sequence was created to generate the individual constructs used for protein expression.
  • the respective coding sequence of different target genes was synthesized and cloned between two restriction cleavage sites in the vector pET28a (Merck Chemicals GmbH, Schwalbach) or pETDuet-1 (Merck Chemicals GmbH, Schwalbach).
  • Table 1 Overview of the genes, vectors and restriction sites used
  • Example 2 Generation of different VhAldh variants by means of mutagenesis
  • VhFaldh introduced.
  • the primers VhFALDH-T175Q_fw (SEQ ID NO: 15) and VhFALDH-T 175Q_rv (SEQ ID NO: 16) were used.
  • the sequences of the nucleic acid and the corresponding translated protein are shown in SEQ ID NO: 3 and 10, respectively.
  • Example 3 Protein expression and purification of Osa-DOX
  • a preculture of 5 mL LB medium (Carl Roth GmbH, Düsseldorf) with the appropriate antibiotic was first set up and E. coli BL21 (DE3) cells containing pET28a_OsaDOX were removed from the agar plate using an inoculation loop removed and transferred to the preculture. This was then incubated for 16 h at 37 ° C. and 150 rpm. From the preculture, the main culture was inoculated with 50 mL LB medium (Carl Roth GmbH, Düsseldorf) and the corresponding antibiotic, so that an optical density of 0.05 was present at 600 nm. The main culture was then incubated at 37 ° C.
  • the cell disruption was first carried out using the B-PER protein extraction reagent (Thermo Fisher Scientific, Bonn) in accordance with the manufacturer's instructions.
  • a preculture of 5 ml LB medium (Carl Roth GmbH, Düsseldorf) with the appropriate antibiotic was prepared and E. coli BL21 (DE3) cells containing pET-Duet_LsNOX_VhFALDH from were prepared using an inoculation loop removed from the agar plate and transferred to the preculture. This was then incubated for 16 h at 37 ° C. and 150 rpm. From the preculture, the main culture was inoculated with 50 ml LB medium (Carl Roth GmbH, Düsseldorf) and the corresponding antibiotic, so that an optical density of 0.1 was present at 600 nm. The main culture was then incubated at 37 ° C.
  • E. coli BL21 (DE3) cells containing pET28a_OsaDOX according to Example 3 and lysate from E. coli BL21 (DE3) cells containing pET-Duet_LsNOX_VhFALDH according to Example 4 were used to convert various fatty acids or hydrolysates according to Example 5.
  • 25 mM linoleic acid (Sigma-Aldrich) 40 g / L E. coli alpha-Dox according to Example 3, lysate from 10 g / L E.
  • the mixture was then adjusted to pH 2 using hydrochloric acid and extracted twice by adding the same volume of ethyl acetate (Sigma-Aldrich) with vortexing (1 min).
  • the organic phase was separated from the aqueous phase by Centrifugation for 10 min at 17,105 x g.
  • the samples were analyzed by gas chromatography (20 m ZB-1 df: 0.18pm iD: 0.18mm / 60-12-300 ° KAS). Retention indices for the selected GC method were determined by comparison with standards and GC-MS data.
  • Table 3 Aldehyde mixtures which were produced using the process according to the invention.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft biotechnologische Verfahren zur Herstellung von gesättigten als auch ungesättigten Aldehyden, sowie Mischungen daraus mit mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer Aldehyddehydrogenase. Das Verfahren kann entweder fermentativ oder enzymatisch durchgeführt werden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Vektorsystem, sowie Sequenzen und rekombinante Mikroorganismen, die für die Enzyme kodieren, welche zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aldehyde und Mischungen benutzt werden können. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, welche durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden.

Description

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Aldehydgemischen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft biotechnologische Verfahren zur Herstellung von gesättigten und ungesättigten Aldehyden, sowie Mischungen daraus, mit Hilfe mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer Aldehyddehydrogenase. Das Verfahren kann entweder fermentativ oder enzymatisch durchgeführt werden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Vektorsystem, sowie Sequenzen und rekombinante Mikroorganismen, die für die Enzyme kodieren, welche zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aldehyde und Mischungen benutzt werden können. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, welche durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Hintergrund der Erfindung
Auf dem Gebiet der industriellen Gewinnung von Geschmacksstoffen besteht ein ständiger Bedarf an effizienten und kostengünstigen Wegen der Synthese von Geschmacksstoffen. Ein Beispiel für derartige Geschmacksstoffe sind (un)gesättigte Aldehyde. Ein beispielhafter Aldehyd ist 8Z-Tetradecenal oder 1-Decenal. Diese Stoffklasse kommt vor allem in Fleischzubereitungen und Zitrusölen vor. Derzeit ist jedoch noch kein allgemein anwendbares biotechnologisches Verfahren zur Herstellung dieser Aldehyde und der korrespondierenden Säuren beschrieben worden.
Aus dem Stand der Technik sind Prozesse zur Herstellung von ungesättigten Aldehyden bekannt. So lässt sich zum Beispiel 8Z,11Z-Heptadecadienal durch die chemische Oxidation des ungesättigten Alkohols erhalten ( JP 63233914). Verschiedene Aldehyde lassen sich zudem in bekannter Weise durch alpha-Oxidation mittels pflanzlicher Enzyme aus Fettsäuren hersteilen, wie in WO2012025629 A1 beschrieben. Die Nutzung von Algenbiomasse zur Herstellung ungesättigter Aldehyde ist ebenfalls bekannt („Concise synthesis of (8Z, 11Z, 14Z)-8,11,14-heptadecatrienal, (7Z, 10Z,3Z)-7, 10,13- hexadecatrienal, and (8Z, 11Z)-8, 11-heptadecadienal, components of the essential oil of marine green alga Ulva pertusa“, Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Jul;69(7):1348-52). Weiterhin sind Prozesse zur Herstellung von 4,7,10,13,16-Nonadecapentaenal oder 3,6,9, 12,15, 18-Heneicosahexaenal bekannt ( Preparation of halopolyenes and their intermediates, JP05000974A).
Weiterhin sind zahlreiche Verfahren mit Aldehyddehydrogenasen bekannt, um Aldehyde zu Säuren zu oxidieren ( Takeru Ishigeetal., Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 3481-3486; Tomohisa Kato et al., Extremophiles 2010, 14, 33.).
Die voran genannten chemischen Verfahren sowie Verfahren ausschließlich basierend auf der Verwendung eines sehr speziellen Enzyms alleine besitzen jedoch den Nachteil, dass hierdurch kein umfassendes Spektrum an Aldehyden bzw. von Gemischen davon zugänglich ist. Weiterhin beruhen manche der Verfahren auf der Umsetzung mit chemischen Reagenzien sowie Katalysatoren, weshalb solche Verfahren nicht als natürliche Prozesse im Sinne der EG 1334/2008 gelten. Ein kombiniertes Verfahren, welches eine alpha-Dioxygenase mit einer Aldehyddehydrogenase spezifisch kombiniert und das Produktionsspektrum gezielt erweitert, ist nicht bekannt. Bei einem rekombinanten Reaktionssystem mit zwei oder mehr Enzymen, wobei die gewünschten katalytischen Reaktionen sequenziell und hinsichtlich der Substratspezifität und -Selektivität spezifisch ablaufen sollen, ist es nötig die verwendeten Enzyme genau aufeinander abzustimmen, sodass diese nicht durch, z.B. im Fall einer Ganzzell-Katalyse, endogene Enzyme des Produktionsorganismus beeinträchtigt werden. Die Reaktionsführung ist daher entscheidend, damit die Zwischenprodukte auch vom zweiten oder jeweils nächsten Enzym in der Kaskade erkannt werden und für dieses zur Verfügung stehen. Eine solche Abstimmung bzw. Kombination ist technisch stets anspruchsvoll und nicht geradlinig prognostizierbar, sondern bedarf vielmehr intensiver Analysen zu den Enzymen von Interesse im jeweiligen biotechnologischen Kontext.
Das natürliche Vorkommen einiger ungesättigter Aldehyde mit ein oder mehreren Doppelbindungen wie z.B. 8Z-Heptadecenal, 8Z,11Z-Heptadecadienal oder 8Z,11Z,14Z- Heptadecatrienal wurde in Presssäften von Gurke ( Cucumber Aroma formation of cucumber (Cucumis sativus L) and biter gourd (Momordica charantia L) by salt- squeezing, Journal of Home Economics of Japan Vol. 60 (2009) No. 10 p. 877-885) oder der Alge Ulva pertusa beschrieben ( Production of bioflavor by regeneration from protoplasts of Ulvapertusa (Ulvales, Chlorophyta) Hydrobiologia, 1990, Vol. 204, pp 143- 149). Der Gehalt der Aldehyde 8Z-Heptadecenal, 8Z,11Z-Heptadecadienal, 8Z,11Z,14Z- Heptadecatrienal wird in der Literatur mit 2%, 19,9% und 26,1% angegeben.
Der Geruch von 8Z,11Z-Heptadecadienal wird als typisch für Algen beschrieben ( Production of bioflavor by regeneration from protoplasts of Ulva pertusa (Ulvales,
Chlorophyta), Hydrobiologia, 1990, Vol. 204, pp 143-149).
Der Geschmack von 4Z,7Z,10Z,13Z-Nonadecatetraenal, 4Z,7Z,10Z,13Z,16Z- Nonadecapentaenal oder 3,6,9,12,15,18-Heneicosahexaensäure ist dagegen nicht beschrieben.
8Z-Pentadecenal ist als natürlich vorkommender Bestandteil von Gurken bekannt (Kemp, A C15 aldehyde from Cucumis sativus, Phytochemistry, Volume 16, Issue 11, 1977, Pages 1831-1832). Der Geschmack von 8Z-Pentadecenal wird vor allem als ölig beschrieben und auch die geschmacksverbessernden Eigenschaften auf Hühnchen und gegrilltes Rindfleisch sind beschrieben. Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung aus 1-Nonin und 6-Brom-1-hexanol bekannt, was jedoch nicht als natürliches Herstellverfahren nach EC 1334/2008 klassifiziert werden kann (JP 2014043409).
Der Geschmack von 4Z,7Z,10Z,13Z-Nonadecatetraenal ist nicht bekannt und es existierten bislang auch keine Herstellverfahren.
Verschiedene Aldehyde lassen sich durch alpha-Oxidation mittels pflanzlicher Enzyme aus Fettsäuren hersteilen, wie in WO2012025629 A1 beschrieben. Die Nutzung von Algenbiomasse zur Herstellung ungesättigter Aldehyde ist ebenfalls bekannt. Aus dem Stand der Technik sind zudem weitere Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren aus den entsprechenden Ölen oder Fetten durch enzymatische Spaltung bekannt. Hierzu werden vor allem bakterielle Lipasen wie zum Beispiel Enzyme aus Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, PenicilHum camembertii, Mucor juvanicus, PenicilHum roquefortii, Schweinepankreas, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Candida antarctica oder Rhizops delemar verwendet ( Industrial applications of microbial lipases, Enzyme and Microbial Technology Volume 39, Issue 2, 26 June 2006, Pages 235-251).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden oder Aldehydgemischen bereitzustellen, welches als natürliches Herstellverfahren nach EC 1334/2008 klassifiziert werden kann. Ferner war es eine Aufgabe, durch die gezielte Abstimmung von enzymatischen Stoffwechselschritten ein integriertes biotechnologisches Verfahren bereitzustellen, das ohne chemische Zwischenschritte die Produkte von Interesse in hoher Ausbeute und Reinheit bereitstellen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach gemäß einem primären Aspekt das Bereitstellen eines Verfahrens zur Herstellung von gesättigten und ungesättigten Aldehyden mit Hilfe mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer
Aldehyddehydrogenase.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von gesättigten und ungesättigten Aldehyden und Mischungen daraus. In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird ein enzymatisches Verfahren bereitgestellt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren die Nutzung von Edukten, welche entweder biotechnologischen, natürlichen oder chemischen Ursprungs sind.
In wiederum einer weiteren Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt eingesetzte Edukte ausgewählt aus der Gruppe der Carbonsäuren und mit Alkoholen veresterten Carbonsäuren.
Weiterhin betrifft das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugte Produktmischungen, Mikroorganismen, die im Verfahren eingesetzt werden sowie Aminosäuresequenzen der bevorzugt einzusetzenden Enzyme und Nukleotidsequenzen bzw. Nukleinsäure- Abschnitte kodierend für die einzusetzenden Enzyme.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Vektorsystems, welches die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme kodiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten wird. Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 : Plasmid pET28a_OSaDOX mit Genen, die für eine alpha-Dioxygenase kodieren. Abbildung 2: Plasmid pET-Duet_VhFALDH mit Genen, die für eine
Aldehyddehydrogenase kodieren.
Abbildung 3: Plasmid pET-Duet_LsNOX_VhFALDH mit Genen, die für eine Aldehyddehydrogenase und eine NADHOxidase kodieren.
Abbildung 4: Biokatalytische Umwandlung einer Mischung aus Ölsäure und Linolsäure einem Aldehydgemisch enthaltend 8,11-Heptadecadienal und 7,10-Hexadecadienal.
Abbildung 5: Zeitlicher Verlauf einer biokatalytischen Umwandlung einer Mischung aus Ölsäure und Linolsäure mittels alpha-Dioxygenase, Aldehyddehydrogenase und NADH-Oxidase zu einem entsprechenden Aldehydgemisch innerhalb einer Stunde.
Abbildung 6: Zeitlicher Verlauf einer biokatalytischen Umwandlung einer Mischung aus Ölsäure und Linolsäure mittels alpha-Dioxygenase und Aldehyddehydrogenase ohne NADH Oxidase zu einem entsprechenden Aldehydgemisch innerhalb von 24 Stunden. Abbildung 7: Gesteigerter, zeitlicher Verlauf einer biokatalytischen Umwandlung einer Mischung aus Ölsäure und Linolsäure mittels alpha-Dioxygenase und Aldehyddehydrogenase mit NADH-Oxidase zu einem entsprechenden Aldehydgemisch innerhalb von 24 Stunden. Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO 1 : Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Os-alpha-DOX aus Oryza sativa kodiert.
SEQ ID NO 2: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym VhFALDH aus Vibrio harveyi kodiert.
SEQ ID NO 3: Nukleinsäuresequenz, die für die 175Q Mutante des Enzyms VhFALDH aus Vibrio harveyi kodiert.
SEQ ID NO 4: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym LsNOX aus
Lactobacillus sanfranciscenis kodiert.
SEQ ID NO 5: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym ReALDH aus
Rhodococcus erythropolis UPV-1 kodiert.
SEQ ID NO 6: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym GtALDH aus
Geobacillus thermodenitrificans kodiert.
SEQ ID NO 7: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Maqu3410, eine Aldehyddehydrogenase aus Marinobacter aquaeolei VT8 kodiert.
SEQ ID NO 8: Amnosäuresequenz, die für das Enzym Os-alpha-DOX aus Oryza sativa kodiert.
SEQ ID NO 9: Aminosäuresequenz, die für das Enzym VhFALDH aus Vibrio harveyi kodiert.
SEQ ID NO 10: Aminosäuresequenz, die für die 175Q Mutante des Enzyms VhFALDH aus Vibrio harveyi kodiert.
SEQ ID NO 11 : Aminosäuresequenz, die für das Enzym LsNOX aus
Lactobacillus sanfranciscenis kodiert.
SEQ ID NO 12: Aminosäuresequenz, die für das Enzym ReALDH aus
Rhodococcus erythropolis UPV-1 kodiert.
SEQ ID NO 13: Aminosäuresequenz, die für das Enzym GtALDH aus
Geobacillus thermodenitrificans kodiert.
SEQ ID NO 14: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Maqu3410, eine
Aldehyddehydrogenase aus Marinobacter aquaeolei VT8 kodiert.
SEQ ID NO 15: Nukleinsäuresequenz, die für einen Forward-Primer kodiert. SEQ ID NO 16: Nukleinsäuresequenz, die für einen Reverse-Primer kodiert. SEQ ID NO 17: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym At-alpha-DOX2 aus Arabidopsis thaliana kodiert.
SEQ ID NO 18: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym At-alpha-DOX aus Arabidopsis thaliana kodiert. SEQ ID NO 19: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym CaaDOX aus
Capsicum annuum kodiert.
SEQ ID NO 20: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym CbaDOX aus
Cercospora beticola kodiert.
SEQ ID NO 21 : Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym CsaDOX2 aus
Cucumis sativus kodiert.
SEQ ID NO 22: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym CsaDOX aus
Cucumis sativus kodiert.
SEQ ID NO 23: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym CsaDOxlikel aus Cucumis sativus kodiert.
SEQ ID NO 24: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Le-alpha-DOX1 aus Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 25: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Le-alpha-DOX2 aus Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 26: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym NaaDOX2 aus
Nicotiana attenuata kodiert.
SEQ ID NO 27: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Na-alpha-DOX aus
Nicotiana attenuata kodiert.
SEQ ID NO 28: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Nt-alpha-DOX aus
Nicotiana tabacum kodiert.
SEQ ID NO 29: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym PpaDOX aus
Physcomitrella patens kodiert.
SEQ ID NO 30: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Ps-alpha-DOX aus
Pisum sativum kodiert.
SEQ ID NO 31 : Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym SlaDOX2 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 32: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym StaDOX1.1 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 33: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym StaDOX1.2 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 34: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym StaDOX1.3 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 35: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym StaDOXI aus
Solanum tuberosum kodiert.
SEQ ID NO 36: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym StaDOX2 aus
Solanum tuberosum kodiert. SEQ ID NO 37: Aminosäuresequenz, die für das Enzym At-alpha-DOX2 aus Arabidopsis thaliana kodiert.
SEQ ID NO 38: Aminosäuresequenz, die für das Enzym At-alpha-DOX aus
Arabidopsis thaliana kodiert.
SEQ ID NO 39: Aminosäuresequenz, die für das Enzym CaaDOX aus
Capsicum annuum kodiert.
SEQ ID NO 40: Aminosäuresequenz, die für das Enzym CbaDOX aus
Cercospora beticola kodiert.
SEQ ID NO 41 : Aminosäuresequenz, die für das Enzym CsaDOX2 aus
Cucumis sativus kodiert.
SEQ ID NO 42: Aminosäuresequenz, die für das Enzym CsaDOX aus Cucumis sativus kodiert.
SEQ ID NO 43: Aminosäuresequenz, die für das Enzym CsaDOxlikel aus
Cucumis sativus kodiert.
SEQ ID NO 44: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Le-alpha-DOX1 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 45: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Le-alpha-DOX2 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 46: Aminosäuresequenz, die für das Enzym NaaDOX2 aus
Nicotiana attenuata kodiert.
SEQ ID NO 47: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Na-alpha-DOX aus
Nicotiana attenuata kodiert.
SEQ ID NO 48: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Nt-alpha-DOX aus
Nicotiana tabacum kodiert.
SEQ ID NO 49: Aminosäuresequenz, die für das Enzym PpaDOX aus
Physcomitrella patens kodiert.
SEQ ID NO 50: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Ps-alpha-DOX aus
Pisum sativum kodiert.
SEQ ID NO 51 : Aminosäuresequenz, die für das Enzym SlaDOX2 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 52: Aminosäuresequenz, die für das Enzym StaDOX1.1 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 53: Aminosäuresequenz, die für das Enzym StaDOX1.2 aus
Solanum lycopersicum kodiert.
SEQ ID NO 54: Aminosäuresequenz, die für das Enzym StaDOX1.3 aus
Solanum lycopersicum kodiert. SEQ ID NO 55: Aminosäuresequenz, die für das Enzym StaDOXI aus
Solanum tuberosum kodiert.
SEQ ID NO 56: Aminosäuresequenz, die für das Enzym StaDOX2 aus
Solanum tuberosum kodiert.
SEQ ID NO 57: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym Ald1 aus Acinetobacter sp. Stamm M1 kodiert.
SEQ ID NO 58: Nukleinsäuresequenz, die für das Enzym HFD4, eine
Aldehyddehydrogenase aus Yarrowia lipolytica kodiert.
SEQ ID NO 59: Aminosäuresequenz, die für das Enzym Ald1 aus Acinetobacter sp. Stamm M1 kodiert.
SEQ ID NO 60: Aminosäuresequenz, die für das Enzym HFD4, eine
Aldehyddehydrogenase aus Yarrowia lipolytica kodiert.
SEQ ID NO 61 : Nukleinsäuresequenz, die für eine NAD(P)H-Oxidase aus Lactobacillus sanfranciscensis kodiert.
SEQ ID NO 62: Aminosäuresequenz, die für eine NAD(P)H-Oxidase aus Lactobacillus sanfranciscensis kodiert.
SEQ ID NO 63: Nukleinsäuresequenz, die für eine NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis kodiert.
SEQ ID NO 64: Aminosäuresequenz, die für eine NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis kodiert.
Definitionen
Der Begriff Vektorsystem wie hierein verwendet, bezeichnet ein System, das aus mindestens einem oder mehreren Vektoren oder Plasmidvektoren besteht oder diese enthält. So kann ein Vektorsystem einen (Plasmid)vektor enthalten, welcher mehrere unterschiedliche Zielgene kodiert. Ein Vektorsystem kann darüber hinaus auch mehrere (Plasmid)vektoren enthalten, die ihrerseits mindestens ein Zielgen gemäß der vorliegenden Offenbarung enthalten. Ein Vektorsystem kann somit nur ein (Plasmid)vektorkonstrukt oder mehrere (Plasmid)vektorkonstrukte umfassen, wobei letztere gleichzeitig oder hintereinander in den entsprechenden rekombinanten Wirtsorganismus stabil oder transient transformiert werden können, sodass die von den einzelnen Konstrukten kodierten Zielgene von dem Wrtsorganismus transkribiert und translatiert werden können.
Die Begriffe Aminosäure, Protein und Polypeptid werden hierin austauschbar verwendet. Die hierein offenbarten Aminosäuren, oder funktionale Abschnitte davon, haben nach korrekter Faltung enzymatische Funktion. Demnach wird auch der Begriff Enzym hierin austauschbar für den Begriff Aminosäure verwendet.
Wann immer die vorliegende Offenbarung auf Sequenzhomologien oder
Sequenzidentitäten von Nuklein- oder Proteinsequenzen in Form von Prozentangaben Bezug nimmt, beziehen sich diese Angaben auf Werte, wie sie unter Verwendung von EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nucleotide) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) für
Nukleinsäuresequenzen bzw. EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Protein) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) für Aminosäuresequenzen berechnet werden können. Bei vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioninformatics Institute (EBI) zur Verfügung gestellten Tools für lokale
Sequenzalignments verwenden einen modifizierten Smith-Waterman Algorithmus (siehe http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ und Smith, T.F. & Waterman, M.S. “Identification of common molecular subsequences” Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1 ): 195-197). Ferner wird hierbei bei der Durchführung des jeweiligen paarweisen Alignments zweier Sequenzen unter Verwendung des modifizierten Smith-Waterman Algorithmus auf die vom EMBL-EBI derzeit angegebenen Default Parameter Bezug genommen. Diese lauten (i) für Aminosäuresequenzen: Matrix = BLOSUM62, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5 sowie (ii) für Nukleinsäuresequenzen: Matrix = DNAfull, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5. Die Anzucht und Kultivierung, Isolierung sowie Aufreinigung eines rekombinanten Mikroorganismus oder Pilzes bzw. eines Proteins bzw. Enzyms, welches von einer Nukleinsäure gemäß der Offenbarung der vorliegenden Erfindung kodiert wird, ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Die Begriffe Protein, Polypeptid und Enzym werden auf Grund der stets enzymatischen Funktion der hierin offenbarten Genprodukte austauschbar verwendet. Ebenso werden die Begriffe Gen und Nukleinsäure(abschnitt) für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung austauschbar verwendet.
Die Nukleinsäuren, Nukleotidsequenzen oder Nukleinsäure-Abschnitte (diese Begriffe werden austauschbar verwendet für DNS Sequenzen, welchen ein funktionales Enzym, oder einen funktionalen Bereich davon, kodieren), welche gemäß der vorliegenden Erfindung zur Expression eines gewünschten Zielproteins verwendet werden, können gegebenenfalls Codon-optimiert sein, d.h. die Codon-Verwendung eines Genes wird auf die des als Expressionsstamm gewählten rekombinanten Mikroorganismus oder Pilzes angepasst. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass ein gewünschtes Zielgen, welches ein Protein von Interesse kodiert, ohne Änderung der translatierten Proteinsequenz modifiziert werden kann, um der spezifischen Spezies-abhängigen Codon- Verwendung Rechnung zu tragen. So können die zu transformierenden Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung spezifisch auf die Codon-Verwendung von E. coli oder eines anderen Bakteriums, von Saccharomyces spp. oder einer anderen Hefe angepasst werden.
Die offenbarten Carbonsäuren können entweder in ihrer freien Form oder verestert an Alkohole, welche etwa als Bestandteile von Lipiden Vorkommen, vorliegen.
Sofern die Konfiguration(en) von (Z)/(E) Isomeren hierein für eine genannte Verbindung nicht speziell angegeben ist, so umfasst die Angabe alle möglichen Konfigurationsisomere der entsprechenden Verbindung, oder eine Mischung davon. Es gilt anzumerken, dass gewisse hierin genannte Enzyme dazu in der Lage sind, beide Isomere einer Verbindung von Interesse zu erkennen und umzusetzen. Ausführliche Beschreibung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird primär durch Bereitstellen eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung mindestens eines ungesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure und/oder mindestens eines gesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure gelöst, wobei das Verfahren das Bereitstellen mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer
Aldehyddehydrogenase umfasst. Der erhaltene Aldehyd ist dabei immer um ein Kohlenstoffatom verkürzt im Vergleich zu dem eingesetzten Edukt. Ein gesättigter Aldehyd bezieht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung auf einen Aldehyd ohne Doppelbindungen, wobei ein ungesättigter Aldehyd sich auf Aldehyde mit vorhandenen Doppelbindungen bezieht. Die korrespondierende Carbonsäure ist hierbei eine Verbindung mit gleicher Kettenlänge und gleichem Sättigungsgrad wie der erhaltene Aldehyd, welche aber mindestens eine Carboxylgruppe trägt. Die erfindungsgemäß verwendete mindestens eine alpha-Dioxygenase katalysiert die Oxidation von Carbonsäuren der Kettenlänge C6 - C22 am alpha-Kohlenstoffatom, sodass der zur Carbonsäure korrespondierende und um ein Kohlenstoffatom verkürzte Aldehyd entsteht.
Die mindestens eine verwendete Aldehyddehydrogenase katalysiert aufgrund ihrer Substratspezifität die Oxidation eines Aldehyds zur korrespondierenden Carbonsäure, die wiederum weiter umgesetzt werden kann zu einem um ein Kohlenstoffatom verkürzten Aldehyd mit der alpha-Dioxygenase. Somit kann man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gezielt Aldehydmischungen mit Aldehyden hersteilen, die unterschiedliche Kettenlängen besitzen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die alpha-Oxidation und die Aldehyd-Oxidation gleichzeitig erfolgen, wobei in einerweiteren Ausführungsform erst die alpha-Oxidation und dann die Aldehyd-Oxidation durchgeführt werden kann, wobei der Reaktionszyklus in beiden Ausführungsformen bis zum Erhalt des gewünschten Produktes fortgesetzt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das biotechnologische Herstellungsverfahren ein fermentatives Verfahren sein, welches die folgenden Schritte umfasst: i. Bereitstellen mindestens eines rekombinanten Mikroorganismus oder Pilzes enthaltend einen Nukleinsäure-Abschnitt, umfassend mindestens ein für eine alpha-Dioxygenase kodierendes Gen und/oder mindestens ein für eine Aldehyddehydrogenase kodierendes Gen; ii. Kultivieren des mindestens einen rekombinanten Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des entsprechenden Expressionsproduktes erlauben; iii. Hinzufügen mindestens einer Carbonsäure oder mindestens einer mit einem Alkohol veresterten Carbonsäure zu dem mindestens einen kultivierten, rekombinanten Mikroorganismus; iv. Erhalten mindestens eines ungesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure und/oder mindestens eines gesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure durch Reaktion der mindestens einen alpha-Dioxygenase und der mindestens einen Aldehyddehydrogenase mit der mindestens einen Carbonsäure oder der an einen Alkohol veresterten Carbonsäure aus Schritt iii.
Ein fermentatives Verfahren im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem in mindestens einem Schritt ein rekombinanter Mikroorganismus kultiviert wird, welcher die mindestens eine alpha-Dioxygenase und die mindestens eine Aldehyddehydrogenase exprimiert, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Produktes erforderlich sind. Das Expressionsprodukt ist hierbei die mindestens eine alpha- Dioxygenase und/oder die mindestens eine Aldehyddehydrogenase. Dabei kann die Umsetzung des Edukts gemäß einer Ausführungsform durch die Sekretion des Enzyms in den Reaktionsansatz, in welchem die Edukte vorliegen, stattfinden, wohingegen gemäß einer weiteren Ausführungsform die Umsetzung im Zytosol des mindestens einen Mikroorganismus stattfinden kann und das Produkt anschließend sekretiert werden kann.
Bereitstellen im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet immer das Involvieren eines aktiven Schrittes zur Verfügbarmachung eines Edukts, eines Enzyms oder ähnlichem. Gemäß einer Ausführungsform kann das Bereitstellen immer einen technischen Schritt, wie zum Beispiel die Klonierung eines Reaktionsorganismus oder die Herstellung eines Edukts sein. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das biotechnologische Herstellungsverfahren ein enzymatisches Verfahren sein, welches die folgenden Schritte umfasst:
Bereitstellen mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer Aldehyddehydrogenase, wobei die mindestens eine alpha-Dioxygenase und/oder die mindestens eine Aldehyddehydrogenase natürlich, chemisch oder biotechnologisch hergestellt sein kann/können; ii. Hinzufügen mindestens einer Carbonsäure oder mindestens einer mit einem Alkohol veresterten Carbonsäure zu den bereitgestellten Enzymen aus Schritt i; iii. Erhalten mindestens eines ungesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure und/oder mindestens eines gesättigten
Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure durch Reaktion der mindestens einen alpha-Dioxygenase und der mindestens einen Aldehyddehydrogenase mit der mindestens einen Carbonsäure oder der an einen Alkohol veresterten Carbonsäure aus Schritt ii.
Ein enzymatisches Verfahren im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein Verfahren, bei dem die mindestens eine alpha-Dioxygenase und die mindestens eine Aldehyddehydrogenase gereinigt oder partiell gereinigt außerhalb eines Mikroorganismus vorliegen können. In einer Ausführungsform können die beiden Enzyme als Zelllysat vorliegen, welches den Zustand von nicht mehr kultivierbaren Mikroorganismen bezeichnet, die durch physikalische, chemische oder enzymatische Prozesse aufgeschlossen wurden. In einerweiteren Ausführungsform können die Enzyme mit einer Reinheit von > 80% vorliegen, wobei diese durch ein dem Fachmann geläufigen Reinigungsverfahren gereinigt wurden. In wiederum einer weiteren Ausführungsform können die Enzyme mit einer Reinheit < 80% vorliegen, wobei diese durch ein dem Fachmann geläufigen Reinigungsverfahren partiell gereinigt wurden. In noch einer weiteren Ausführungsform können die Enzyme durch Proteinsynthese gewonnen und optional aufgereinigt werden. Ein Edukt biotechnologischen Ursprungs ist ein durch Fermentation von Mikroorganismen hergestelltes Edukt, wobei ein Edukt natürlichen Ursprungs aus einer natürlichen Quelle, zum Beispiel einer Pflanze, einem Pilz, einem Tier, einem Mikroorganismus oder aus dem Boden gewonnen werden kann. Ein Edukt chemischen Ursprungs kann durch ein chemisches Syntheseverfahren aus Vorstufen des Edukts hergestellt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann mindestens eines der Edukte des erfindungsgemäßen Verfahrens biotechnologischen, natürlichen oder chemischen Ursprungs sein. Für die Edukte biotechnologischen, natürlichen oder chemischen Ursprung gilt das voran Gesagte.
Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Edukte ausgewählt sein aus der Gruppe der Carbonsäuren und der mit Alkoholen veresterten Carbonsäuren. Bevorzugt sind hierbei Edukte, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Palmitoleinsäure, Arachidonsäure, alpha- Linolensäure, Linolsäure, gamma-Linolensäure, Ölsäure, Punicinsäure, alpha- Elaeostearinsäure, Docosahexaensäure, Eicosapentaensäure. Petroselinsäure, Chaulmoograsäure, alpha-Licarsäure, Olivenöl, Rapsöl, Macadamianussöl, Sanddornfruchtfleischöl, Tungöl, Fischöl, Borretschöl, Chaulmoograöl, Petersilienöl, Oiticicaöl, Granatapfelkernöl, Kokosnussöl, Sonnenblumenöl, Acker-Steinsamenöl und Traubenkernöl, sowie Pilzöle, gewonnen von Gattungen unabhängig ausgewählt aus Conidiobolus, Flamm ulina, Fomes, Ganoderma, Mortierella, Panellus, Pleurotus, Psathyrella, Stereum, Umbelopsis.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens ein gesättigter Aldehyd und dessen korrespondierende Carbonsäure und/oder ein ungesättigter Aldehyd und dessen korrespondierende Carbonsäure sein. Hierbei können die Produkte des erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 7Z,10Z-Hexadecadienal, 8Z,11Z- Heptadecadienal, 6E,9E-Pentadecadienal, 7Z-Hexadecenal, 8Z-Pentadecenal, 7 Z- Tetradecenal, 8Z,11Z,14Z-Heptadecatrienal, 7Z,10Z,13Z-Hexadecatrienal,
4Z,7Z, 10Z, 13Z-Nonadecatetraenal, 8 Z, 10E, 12E-Heptadecatrienal, 8 Z, 10E, 12Z- Heptadecatrienal, 7Z,9E,11Z-Hexadecatrienal, 7Z,9E,11E-Hexadecatrienal, 9-Decenal, 10-Undecenal, 3Z-Decenal, 4Z-Undecenal, 7Z-Dodecenal, 8Z-Tridecenal, 7 Z-
Tetradecenal, 8Z-Pentadecenal, 9Z-Tetradecenal, 10Z-Pentadecenal, 7Z-Pentadecenal, 8Z-Hexadecenal, 9Z-Hexadecenal, 10Z-Heptadecenal, 5Z,8Z-Tetradecadienal, 6Z,9Z- Pentadecadienal, 7Z,10Z-Tetradecadienal, 8Z,11Z-Pentadecadienal, 7Z,9E- Hexadecadienal, 8Z,10E-Heptadecadienal, 8E,10Z-Hexadecadienal, 9E,11Z-
Heptadecadienal, 9-Methylundecanal, 10-Methylundecanal, 10-Methyldodecanal, 11- Methyldodecanal, 11-Methyltridecanal, 12-Methyltridecanal, 12-Methyltetradecanal, 13-Methyltetradecanal sowie 13-Methylpentadecanal sein.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfassen alle Verbindungen, in denen die Positionen der Doppelbindung hinsichtlich der (Z)/(E)-Konfiguration nicht spezifisch angegeben ist, alle möglichen Positionen der Doppelbindung und Mischungen der relevanten Verbindungen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der mindestens eine rekombinante Mikroorganismus ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, bevorzugt E. coli BL21 , E. coli MG1655, E. coli W3110 und deren Abkömmlinge, Bacillus spp., bevorzugt B. licheniformis, B. subitilis oder ß. amyloliquefaciens, und deren Abkömmlinge, Saccharomyces spp., bevorzugt S. cerevesiae, und deren Abkömmlinge, Hansenula bzw. Komagatella spp., bevorzugt K. phaffii und H. polymorpha, und deren Abkömmlingen, Kluyveromyces spp, bevorzugt K. lactis.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann zusätzlich mindestens eine NADH- Oxidase und/oder mindestens eine Lipase bereitgestellt werden.
NADH-Oxidasen sind solche, die aufgrund ihrer Substratspezifität und Regioselektivität die Oxidation eines Aldehyds katalysieren können. Diese können in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als zusätzliche Enzyme eingesetzt werden, um die eng aufeinander abgestimmten Verfahren durch das Recycling des entsprechenden Co-Faktors noch effizienter zu gestalten.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die mindestens eine NADH-Oxidase eine Aminosäuresequenz umfassen, wobei die Aminosäuresequenz unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ IDs NO: 62 und 64, oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu. In einer Ausführungsform wird die die NADH Oxidase kodierende Aminosäuresequenz kodiert von einer Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ IDs NO: 61 und 62, oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu. Darüber hinaus kann ein Enzym, das nach den verschiedenen Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäße Reaktion katalysiert, eine katalytisch aktive Domäne oder ein Fragment des jeweiligen Enzyms sein, von dem es stammt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die mindestens eine Lipase eine kommerzielle Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Penicillium camembertii, Mucorjuvanicus, PenicilHum roqueforti, Schweinepankreas, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Candida antarctica oder Rhizopus delemar sein. In wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die alpha-Dioxygenase eine Aminosäuresequenz umfassen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 8, 11 , 37, 38, 39, 40, 41 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51 , 52, 53, 54, 55 oder 56 oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die mindestens eine
Aldehyddehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfassen bzw. aus dieser bestehen, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 9, 10, 12, 13, 14, 59, oder 60 oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann auf
Nukleinsäuresequenzen oder Abschnitte davon gerichtet sein, die für Polypeptide mit enzymatischer Funktion kodieren, welche zum Zwecke der Reinigung, Sekretion, Detektion oder Lokalisation der mindestens einen alpha-Dioxygenase und/oder der mindestens einen Aldehyddehydrogenase und/oder der mindestens einen Lipase und/oder der mindestens einen NADH-Oxidase dienen. Diese Nukleinsäureabschnitte werden auch als tag- Sequenzen bezeichnet und können den Nukleinsäureabschnitten, die für die mindestens eine alpha-Dioxygenase und/oder die mindestens eine Aldehyddehydrogenase kodieren vorangestellt (N-terminal) und/oder nachgestellt (C-terminal) sein. Bevorzugt sind tag- Sequenzen ausgewählt aus der folgenden Liste: Polyhistidin(His)-Tag, Glutathion-S- transferase (GST)-tag, Thioredoxin-Tag, FLAG-tag, green fluorescent protein (GFP)-tag, Streptavidin-Tag, Maltose-Bindeprotein(MBP)-Tag, Chloroplastentransitpeptid, Mitochondrientransitpeptid und/oder Sekretionstag. Der Fachmann kennt überdies eine Reihe weiterer geeigneter tag-Sequenzen für Mikroorganismen oder Pilze von Interesse als Produktionsstamm, wobei diese tag-Sequenzen die Sekretion eines Polypeptids von Interesse unmittelbar in den Kulturüberstand erlauben. Dies mag in einigen Ausführungen vorteilhaft sein, um ein Polypeptid von Interesse leichter erhalten und optional reinigen zu können.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung ein Vektorsystem, bevorzugt ein Plasmidvektorsystem, welches mindestens einen Vektor oder Plasmidvektor umfassend einen Nukleinsäureabschnitt (a) umfassend mindestens ein für eine alpha-Dioxygenase kodierendes Gen umfasst, sowie einen Nukleinsäureabschnitt (b) umfassend mindestens ein für eine Aldehyddehydrogenase kodierendes Gen; und optional als Teil des Nukleinsäureabschnitts (a) und/oder (b) einen Nukleinsäureabschnitt umfasst, welcher mindestens ein für eine NADH-Oxidase kodierendes Gen und/oder einen Nukleinsäureabschnitt umfassend mindestens ein für eine Lipase kodierendes Gen umfasst, wobei der Nukleinsäureabschnitt (a) und/oder der Nukleinsäureabschnitt (b) auf dem gleichen Vektor, oder auf zwei oder mehreren separaten Vektoren bereitgestellt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das Vektorsystem für die Expression mindestens eines Polypeptids kodieren, wobei dieses Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 37, 38, 39, 40, 41 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 59 oder 60 oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung umfassendeine Aldehydmischung erhalten durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens ein oder bevorzugt mindestens zwei oder drei Aldehyde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 7 Z- Tetradecenal, 8Z-Pentadecenal, Pentadecanal, 7Z-Hexadecenal und 8Z-Heptadecenal umfasst, wobei der eine oder die mehreren Aldehyd(e) jeweils in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-%, bevorzugt 0,001 - 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 - 5 Gew.-
%, jeweils in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, vorliegt und wobei die Zusammensetzung optional weitere Aldehyde erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält, oder wobei die Zusammensetzung 7Z-Tetradecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, oder wobei die Zusammensetzung 8Z-Pentadecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung Pentadecanal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die
Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung 7Z-Hexadecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung 8Z-Heptadecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung mindestens 8Z- Pentadecenal und Pentadecanal umfasst, wobei der Anteil an 8Z-Pentadecenal und Pentadecanal in der Gesamtzusammensetzung ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, oder wobei die Zusammensetzung mindestens 8Z-Pentadecenal und 8Z-Heptadecenal umfasst, wobei der Anteil an 8Z-Pentadecenal und 8Z-Heptadecenal in der Gesamtzusammensetzung ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst.
Eine Zusammensetzung im Kontext der vorliegenden Erfindung ist eine Halbfertig- oder Fertigwarenzusammensetzung und ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Ernährung oder dem Genuss dienende Zubereitung oder einer kosmetischen oder reinigenden Zubereitung.
Der Ernährung oder dem Genuss dienende Zubereitungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind z.B. Backwaren (z.B. Brot, Trockenkekse, Kuchen, sonstiges Gebäck), Süßwaren (z.B. Schokoladen, Schokoladenriegelprodukte, sonstige Riegelprodukte, Fruchtgummi, Hart- und Weichkaramellen, Kaugummi), alkoholische oder nichtalkoholische Getränke (z.B. Kaffee, Tee, Wein, weinhaltige Getränke, Bier, bierhaltige Getränke, Liköre, Schnäpse, Weinbrände, fruchthaltige Limonaden, isotonische Getränke, Erfrischungsgetränke, Nektare, Obst- und Gemüsesäfte, Frucht- oder
Gemüsesaftzubereitungen), Instantgetränke (z.B. Instant-Kakao-Getränke, Instant-Tee- Getränke, Instant-Kaffeegetränke, Instant-Fruchtgetränke), Fleischprodukte (z.B.
Schinken, Frischwurst- oder Rohwurstzubereitungen, gewürzte oder marinierte Frischoder Pökelfleischprodukte), Eier oder Eiprodukte (Trockenei, Eiweiß, Eigelb), Getreideprodukte (z.B. Frühstückscerealien, Müsliriegel, vorgegarte Fertigreis-Produkte), Milchprodukte (z.B. Milchgetränke, Buttermilchgetränke, Milcheis, Joghurt, Kefir, Frischkäse, Weichkäse, Hartkäse, Trockenmilchpulver, Molke, Butter, Buttermilch, teilweise oder ganz hydrolisierte Milchprotein-haltige Produkte), Produkte aus Sojaprotein oder anderen Sojabohnen-Fraktionen (z.B. Sojamilch und daraus gefertigte Produkte, Fruchtgetränke mit Sojaprotein, Sojalecithin-haltige Zubereitungen, fermentierte Produkte wie Tofu oder Tempe oder daraus gefertigte Produkte), Fruchtzubereitungen (z.B. Konfitüren, Fruchteis, Fruchtsoßen, Fruchtfüllungen), Gemüsezubereitungen (z.B.
Ketchup, Soßen, Trockengemüse, Tiefkühlgemüse, vorgegarte Gemüse, eingekochte Gemüse), Knabberartikel (z.B. gebackene oder frittierte Kartoffelchips oder
Kartoffelteigprodukte, Extrudate auf Mais- oder Erdnussbasis), Produkte auf Fett-und Ölbasis oder Emulsionen derselben (z.B. Mayonnaise, Remoulade, Dressings), sonstige Fertiggerichte und Suppen (z.B. Trockensuppen, Instant-Suppen, vorgegarte Suppen), Gewürze, Würzmischungen sowie insbesondere Aufstreuwürzungen (englisch: Seasonings), die beispielsweise im Snackbereich Anwendung finden. Die Zubereitungen im Sinne der Erfindung können auch als Halbfertigware zur Herstellung weiterer der Ernährung oder dem Genuss dienenden Zubereitungen dienen. Die Zubereitungen im Sinne der Erfindung können auch in Form von Kapseln, Tabletten (nichtüberzogene sowie überzogene Tabletten, z.B. magensaftresistente Überzüge), Dragees, Granulaten, Pellets, Feststoffmischungen, Dispersionen in flüssigen Phasen, als Emulsionen, als Pulver, als Lösungen, als Pasten oder als andere schluck- oder kaubare Zubereitungen als Nahrungsergänzungsmittel vorliegen. Eine kosmetische oder reinigende Zubereitung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Zubereitung, welche zur Reinigung, Pflege oder Parfümierung des Körpers oder zur Reinigung verwendet werden kann. Bevorzugte kosmetische Zubereitungen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fußbodenreinigern, Fensterglasreinigern, Geschirrspülmittel, Bad- und Sanitärreinigern, Scheuermilch, festen und flüssigen WC- Reinigern, pulver- und schaumförmigen Teppichreinigern, Textilerfrischern, Bügelhilfen, flüssigen Waschmitteln, pulverförmigen Waschmitteln, Wäschevorbehandlungsmitteln wie Bleichmittel, Einweichmittel und Fleckenentfernern, Wäscheweichspülern, Waschseifen, Waschtabletten, Desinfektionsmitteln, Oberflächendesinfektionsmitteln sowie von Luftverbesserern in flüssiger, gelartiger oder auf einem festen Träger aufgebrachter Form, Aerosolsprays, Wachsen und Polituren wie Möbelpolituren, Fußbodenwachsen, Schuhcremes sowie Körperpflegemitteln wie z.B. festen und flüssigen Seifen, Duschgelen, Shampoos, Rasierseifen, Rasierschäumen, Badeölen, kosmetischen Emulsionen vom Öl- in-Wasser-, vom Wasser-in-ÖI- und vom Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Typ wie z.B. Hautcremes- und -lotionen, Gesichtscremes und -lotionen, Sonnenschutzcremes-und - lotionen, After-sun-cremes und -lotionen, Handcremes und -lotionen, Fußcremes und - lotionen, Enthaarungscremes und -lotionen, After-shave-Cremes und -lotionen, Bräunungscremes und -lotionen, Haarpflegeprodukten wie z.B. Haarsprays, Haargelen, festigenden Haarlotionen, Haarspülungen, permanenten und semipermanenten Haarfärbemitteln, Haarverformungsmitteln wie Kaltwellen und Haarglättungsmitteln, Haarwässern, Haarcremes und -lotionen, Deodorantien und Antiperspirantien wie z.B. Achselsprays, Roll-ons, Deosticks, Deocremes, Produkten der dekorativen Kosmetik wie z.B. Lidschatten, Nagellacke, Make-ups, Lippenstifte, Mascara sowie von Kerzen, Lampenölen, Räucherstäbchen, Insektiziden, Repellentien und Treibstoffen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erhaltene Zusammensetzung je nach Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weitere Aldehyde, Carbonsäuren oder Alkohole, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dodecanol, Tridecanal, Tridecanol, Tetradecanal, 8Z-Tetradecenol, Tetradecanol, Pentadecanal, Pentadecanol, Octansäure, Decansäure, Tridecanal, Tridecensäure, Pentadecenal und 8Z- Tetradecensäure.
In einer weiteren Ausführungsform können die Einzelkomponenten der erhaltenen Mischungen mit einem dem Fachmann bekannten Verfahren partiell oder vollständig gereinigt werden. Ein großer Vorteil dieser Mischungen ist demnach die universelle Einsetzbarkeit in einer Vielzahl von Industriezweigen, da diese sowohl als Mischung als auch als Einzelkomponenten verwendet werden können.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von nicht-limitierenden Beispielen und basierend auf der im Sequenzprotokoll und den Abbildungen bereitgestellten Offenbarung weiter erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 : Erzeugung von Einzelkonstrukten
Für die Erzeugung der genutzten Einzelkonstrukte zur Proteinexpression wurde ein geeigneter Vektor mit einer kodierenden Sequenz erzeugt. Hierfür wurde die jeweilige kodierende Sequenz unterschiedlicher Zielgene synthetisiert und jeweils zwischen zwei Restriktionsschnittstellen in den Vektor pET28a (Merck Chemicals GmbH, Schwalbach) oder pETDuet-1 (Merck Chemicals GmbH, Schwalbach) kloniert. Eine Übersicht der Monierten Gene mit den jeweils für die Klonierung genutzten Restriktionsschnittstellen ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Für alle SEQ ID NOs. wurde die Codon-Nutzung des Gens auf E. coli als einem der geplanten Expressionswirte angepasst. Darüber hinaus trägt die SEQ ID NO: 3 eine Punktmutation gegenüber der aus dem jeweiligen Organismus erhaltenen Ursprungssequenz. Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Gene, Vektoren und Restriktionsschnittstellen
Mittels Standard-Transformationsmethoden (Maniatis et al. 1983) wurden erhaltene Plasmide in kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen eingebracht und die Zellen für 18 h bei 37°C auf selektivem Festmedium (LB + Ampicillin (100 mg/L) + 6 g/L Agar) angezogen.
Beispiel 2: Erzeugung verschiedener VhAldh-Varianten mittels Mutagenese
Ausgehend von dem Plasmid pET-Duet_LsNOX_VhFALDH wurden mit Hilfe des QuikChange II Site-Directed Mutagenese Kit (Agilent, Waldbronn) verschiedene Enzymvarianten erzeugt. Dabei wurden entsprechend der Herstellerangaben unter Verwendung spezifischer Primer gezielte Mutationen in der kodierenden Sequenz von
VhFaldh eingeführt. Für die Variante pET-Duet _ LsNOX_VhFALDHT175Q von VhFALDH wurden die Primer VhFALDH-T175Q_fw (SEQ ID NO: 15) und VhFALDH-T 175Q_rv (SEQ ID NO:16) verwendet. Die Sequenzen der Nukleinsäure bzw. des entsprechenden translatierten Proteins sind in SEQ ID NO: 3 bzw. 10 wiedergegeben. Beispiel 3: Proteinexpression und Reinigung Osa-DOX
Zur Vorbereitung der Proteinexpression in einem Volumen von 50 mL wurde zunächst eine Vorkultur von 5 mL LB-Medium (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) mit dem entsprechenden Antibiotikum angesetzt und mittels einer Impföse wurden E. coli BL21 (DE3) Zellen enthaltend pET28a_OsaDOX von der Agarplatte abgenommen und in die Vorkultur überführt. Diese wurde dann für 16 h bei 37 °C und 150 Upm inkubiert. Aus der Vorkultur wurde die Hauptkultur mit 50 mL LB-Medium (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) und dem entsprechenden Antibiotikum angeimpft, so dass eine optische Dichte bei 600 nmvon 0,05 vorlag. Die Hauptkultur wurde anschließend bei 37 °C und 200 Upm inkubiert, bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,6 - 1 ,0 erreicht war. Zur Induktion der Proteinexpression wurde zu diesem Zeitpunkt 0,5 mM Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid zugegeben und die Kultur für weitere 16 h bei 21 °C inkubiert. Abschließend wurde die Hauptkultur für 10 min bei 17.105 x g zentrifugiert, um das Zellpellet zu erhalten und anschließend die Proteinextraktion und -reinigung durchführen zu können. Dafür wurde zunächst mit Hilfe des B-PER Protein Extraktionsreagenz (Thermo Fisher Scientific, Bonn) entsprechend der Herstellerangaben der Zellaufschluss durchgeführt. Daraufhin wurde das erhaltene Zelllysat entweder direkt verwendet oder unter Zuhilfenahme einer 1 mL HisPur Ni-NTA Chromatographiesäule (Thermo Fisher Scientific, Bonn) entsprechend der Herstellerangaben aufgearbeitet. Beispiel 4: Proteinexpression von VhFaldh und LsNOX
Zur Vorbereitung der Proteinexpression in einem Volumen von 50 ml_ wurde zunächst eine Vorkultur von 5 ml_ LB-Medium (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) mit dem entsprechenden Antibiotikum angesetzt und mittels einer Impföse wurden E. coli BL21 (DE3) Zellen enthaltend pET-Duet_LsNOX_VhFALDH von der Agarplatte abgenommen und in die Vorkultur überführt. Diese wurde dann für 16 h bei 37 °C und 150 Upm inkubiert. Aus der Vorkultur wurde die Hauptkultur mit 50 ml_ LB-Medium (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) und dem entsprechenden Antibiotikum angeimpft, so dass eine optische Dichte bei 600 nmvon 0,1 vorlag. Die Hauptkultur wurde anschließend bei 37 °C und 200 Upm inkubiert, bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,6-0, 8 erreicht war. Zur Induktion der Proteinexpression wurde zu diesem Zeitpunkt 0,5 mM lsopropyl-/3-D-thiogalactopyranosid zugegeben und die Kultur für weitere 16 h bei 16°C inkubiert. Abschließend wurde die Hauptkultur für 10 min bei 17.105 x g zentrifugiert, um das Zellpellet zu erhalten und anschließend die Proteinextraktion und -reinigung durchführen zu können. Dafür wurde zunächst mit Hilfe der B-PER Protein Extraktionsreagenz (Thermo Fisher Scientific, Bonn) entsprechend der Herstellerangaben der Zellaufschluss durchgeführt. Daraufhin wurde das erhaltene nicht geklärte Zelllysat direkt verwendet.
Beispiel 5: Hydrolyse der Fettsäuretriqlvceride
In einem 1 L-Rundkolben wurden 5 - 10 g CALB-imm (Novozym 435; 10,000 U/g) für 0,5 - 3 h in 380 mL fe/f-Butanol (Carl Roth) gerührt. Daraufhin wurden 50 g Triglyceride, sowie
15 mL 200 mM Tris-HCI pH 8 Puffer hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter starkem Rühren für 15 - 21 h bei 60 °C durchgeführt. Im Anschluss wurde das Enzym mittels Filtration entfernt und der Reaktionsansatz mit einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Das Produkt wurde über Nacht bei 4 °C gelagert und anschließend in 200 mL 200 mM Tris-HCI pH 2 aufgenommen. Die Fettsäuren wurden durch Zugabe von 500 mL fe/f-Buthylmethylether (Honeywell) unter Rühren für 1 h extrahiert. Das Gemisch wurde in einen Scheidetrichter überführt bis die Phasentrennung erfolgte. Die organische Phase wurde nachfolgend in einen Rundkolben überführt und mittels Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Das Produkt wurde bei -20 °C gelagert und die Zusammensetzung mittels GC-MS analysiert (20m ZB-1 , 60-9-300, Split 60:1). Retentionsindices der Produkte wurden durch Abgleich mit Standards bestimmt.
Beispiel 6: Herstellung von Aldehvdqemischen mittels Os-alpha-Dox und VhFaldh
Zur Umsetzung verschiedener Fettsäuren bzw. Hydrolysate nach Beispiel 5 wurden E. coli BL21 (DE3) Zellen enthaltend pET28a_ OsaDOX nach Beispiel 3 sowie Lysat aus E. coli BL21 (DE3) Zellen enthaltend pET-Duet_LsNOX_VhFALDH nach Beispiel 4 verwendet. Dazu wurden in einem 50 mL-Reaktionsgefäß 25 mM Linolsäure (Sigma- Aldrich), 40 g/L E. coli alpha-Dox nach Beispiel 3, Lysat aus 10 g/L E. coli VhFALDH_NOX, 3,25 mM NAD+ (Sigma Aldrich), 0,5% Glucose, 0,1% (w/v) Gummi arabicum sowie 4,7 mL Kaliumphosphat-Puffer pH 8 suspendiert. Dabei wurden Puffer, Linolsäure, NAD+, Glukose und Gummi Arabicum in einem 100 mL- Schüttelkolben mit einer Schikane zusammengegeben und für 5 min bei 200 Upm und 37 °C vermischt. Anschließend wurden angegebene Zellen bzw. Lysate hinzugefügt und die Reaktion bei 200 Upm und 37 °C für 24 h inkubiert.
Nachfolgend wurde die Mischung mittels Salzsäure auf pH 2 eingestellt und zweimalig durch Zugabe des gleichen Volumens Ethylacetat (Sigma-Aldrich) unter Vortexen (1 min) extrahiert. Die Trennung der organischen von der wässrigen Phase erfolgte durch Zentrifugation für 10 min bei 17.105 x g. Die Proben wurden mittels Gaschromatographie (20 m ZB-1 df:0.18pm i.D.:0.18mm / 60-12-300° KAS) analysiert. Retentionsindizes für die gewählte GC-Methode wurden durch Abgleich mit Standards und GC-MS-Daten bestimmt.
Beispiel 7: Erfindunqsqemäße Aldehvdmischunqen Tabellen 2 und 3 zeigen exemplarisch erhaltene Mischungen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden können. Zusätzlich zu den erhaltenen Mischungen können die einzelnen Komponenten in einem nachfolgenden Schritt gereinigt werden.
Tabelle 2: Aldehydmischungen, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden
Tabelle 3: Aldehydmischungen, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden.

Claims

Ansprüche
1. Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung mindestens eines ungesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure und/oder mindestens eines gesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure, wobei das Verfahren das Bereitstellen mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer Aldehyddehydrogenase umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das biotechnologische Verfahren ein fermentatives Verfahren ist, umfassend die Schritte: i. Bereitstellen mindestens eines rekombinanten Mikroorganismus oder Pilzes enthaltend einen Nukleinsäure-Abschnitt, umfassend mindestens ein für eine alpha-Dioxygenase kodierendes Gen und/oder mindestens ein für eine Aldehyddehydrogenase kodierendes Gen; ii. Kultivieren des mindestens einen rekombinanten Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des entsprechenden Expressionsproduktes erlauben; iii. Hinzufügen mindestens einer Carbonsäure oder mindestens einer mit einem Alkohol veresterten Carbonsäure zudem mindestens einen kultivierten, rekombinanten Mikroorganismus; iv. Erhalten mindestens eines ungesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure und/oder mindestens eines gesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure durch Reaktion der mindestens einen alpha-Dioxygenase und der mindestens einen
Aldehyddehydrogenase mit der mindestens einen Carbonsäure oder der mit einem Alkohol veresterten Carbonsäure aus Schritt iii.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das biotechnologische Herstellungsverfahren ein enzymatisches Verfahren ist, umfassend die Schritte: i. Bereitstellen mindestens einer alpha-Dioxygenase und mindestens einer Aldehyddehydrogenase, wobei die mindestens eine alpha-Dioxygenase und/oder die mindestens eine Aldehyddehydrogenase natürlich, chemisch oder biotechnologisch hergestellt sein kann/können; ii. Hinzufügen mindestens einer Carbonsäure oder mindestens einer mit einem Alkohol veresterten Carbonsäure zu den bereitgestellten Enzymen aus Schritt i; iii. Erhalten mindestens eines ungesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure und/oder mindestens eines gesättigten Aldehyds und dessen korrespondierender Carbonsäure durch Reaktion der mindestens einen alpha-Dioxygenase und der mindestens einen
Aldehyddehydrogenase mit der mindestens einen Carbonsäure oder der mit einem Alkohol veresterten Carbonsäure aus Schritt ii.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Edukte biotechnologischen, natürlichen oder chemischen Ursprungs ist, oder eine Kombination davon ist.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Edukte ausgewählt sind aus der Gruppe der Carbonsäuren und der mit Alkoholen veresterten Carbonsäuren, bevorzugt, wobei die Edukte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Palmitoleinsäure, Arachidonsäure, alpha-Linolensäure,
Ölsäure, Punicinsäure, alpha-Elaeosterarinsäure, Docosahexaensäure, Eicosapentaensäure, Petroselinsäure, Chaulmoograsäure, alpha-Licarsäure, Olivenöl, Rapsöl, Macadamianussöl, Sanddornfruchtfleischöl, Tungöl, Fischöl, Borretschöl, Chaulmoogröl, Petersilienöl, Oiticicaöl, Granatapfelkernöl, Kokosnussöl, Sonnenblumenöl, Traubenkernöl sowie Pilzöle, gewonnen aus einer beliebigen der Gattungen, ausgewählt aus Conidiobolus, Flammulina, Fomes, Ganoderma, Mortierella, Panellus, Pleurotus, Psathyrella, Stereum, Umbelopsis und deren Derivate sind.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Produkt des Verfahrens mindestens ein gesättigter Aldehyd und dessen korrespondierende
Carbonsäure und/oder mindestens ein ungesättigter Aldehyd und dessen korrespondierende Carbonsäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 7Z,10Z-Hexadecadienal, 8Z,11Z-Heptadecadienal, 6E,9E)-Pentadecadienal, 7 Z- Hexadecenal, 8Z-Pentadecenal, 8Z,11Z,14Z-Heptadecatrienal, 7Z,10Z,13Z- Hexadecatrienal, 4Z,7Z,10Z,13Z-Nonadecatetraenal, 8Z,10E,12E-
Heptadecatrienal, 8Z,10E,12Z-Heptadecatrienal, 7Z,9E,11Z-Hexadecatrienal, 7Z,9E,11E-Hexadecatrienal, 9-Decenal, 10-Undecenal, 3Z-Decenal, 4Z- Undecenal, 7Z-Dodecenal, 8Z-Tridecenal, 7Z-Tetradecenal, 8Z-Pentadecenal, 9Z-Tetradecenal, 10Z-Pentadecenal, 7Z-Pentadecenal, 8Z-Hexadecenal, 9Z- Hexadecenal, 10Z-Heptadecenal, 5Z,8Z-Tetradecadienal, 6Z,9Z)- Pentadecadienal, 7Z,10Z-Tetradecadienal, 8Z,11Z-Pentadecadienal, 7Z,9E- Hexadecadienal, 8Z,10E-Heptadecadienal, 8E,10Z-Hexadecadienal, 9E,11Z- Heptadecadienal, 9-Methylundecanal, 10-Methylundecanal, 10-Methyldodecanal, 11-Methyldodecanal, 11-Methyltridecanal, 12-Methyltridecanal, 12-
Methyltetradecanal, 13-Methyltetradecanal sowie 13-Methylpentadecanal.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine rekombinante Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, bevorzugt E. coli BL21 , E. coli MG1655, E. coli W3110 und deren Abkömmlinge, Bacillus spp., bevorzugt B. licheniformis, B. subitilis oder B. amyloliquefaciens, und deren Abkömmlinge, Saccharomyces spp., bevorzugt S. cerevesiae, und deren Abkömmlinge, Hansenula bzw. Komagatella spp., bevorzugt K. phaffii und H. polymorpha, und deren Abkömmlingen, Kluyveromyces spp, bevorzugt K. lactis.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zusätzlich mindestens eine NADH-Oxidase und/oder mindestens eine Lipase bereitgestellt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die mindestens eine NADH-Oxidase eine Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ IDs NOs: 62 und 64, oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu.
10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die mindestens eine Lipase eine kommerzielle Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Penicillium camembertii, Mucor juvanicus, Penicillium roqueforti, Schweinepankreas, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Candida antarctica oder Rhizopus delemar ist.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine alpha-Dioxygenase eine Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs:
8, 11 , 37, 38, 39, 40, 41 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51 , 52, 53, 54, 55 oder 56 oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu. 12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Aldehyddehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 9, 10,
12, 13, 14, 59 oder 60 oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu.
13. Vektorsystem, bevorzugt ein Plasmidvektorsystem, bestehend aus mindestens einem Vektor oder Plasmidvektor, umfassend einen Nukleinsäureabschnitt (a) umfassend mindestens ein für eine alpha-Dioxygenase kodierendes Gen, sowie einen Nukleinsäureabschnitt (b) umfassend mindestens ein für eine Aldehyddehydrogenase kodierendes Gen; und optional umfassend als Teil des
Nukleinsäureabschnitts (a) und/oder (b) einen Nukleinsäureabschnitt, umfassend mindestens ein für eine NADH-Oxidase kodierendes Gen und/oder einen Nukleinsäureabschnitt umfassend mindestens ein für eine Lipase kodierendes Gen, wobei der Nukleinsäureabschnitt (a) und/oder der Nukleinsäureabschnitt (b) auf dem gleichen Vektor, oder auf zwei oder mehreren separaten Vektoren bereitgestellt wird.
14. Vektorsystem nach Anspruch 13, kodierend für die Expression von mindestens einem Polypeptid, wobei dieses Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 37, 38, 39, 40, 41 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 59 oder 60, oder einer Sequenz mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität dazu.
15. Zusammensetzung umfassend eine Aldehydmischung erhalten durch ein Verfahren wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens ein oder bevorzugt mindestens zwei oder drei Aldehyde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 7Z-Tetradecenal, 8Z- Pentadecenal, Pentadecanal, 7Z-Hexadecenal und 8Z-Heptadecenal umfasst, wobei der eine oder die mehreren Aldehyd(e) jeweils in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-%, bevorzugt 0,001 - 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 - 5 Gew.-%, jeweils in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, vorliegt und wobei die Zusammensetzung optional weitere Aldehyde erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält, oderwobei die Zusammensetzung 7Z- Tetradecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, oder wobei die Zusammensetzung 8Z-Pentadecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung Pentadecanal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung 7Z-Hexadecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die
Zusammensetzung 8Z-Heptadecenal in einem Anteil von ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung, oder wobei die Zusammensetzung mindestens 8Z-Pentadecenal und Pentadecanal umfasst, wobei der Anteil an 8Z-Pentadecenal und Pentadecanal in der Gesamtzusammensetzung ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst, oder wobei die
Zusammensetzung mindestens 8Z-Pentadecenal und 8Z-Heptadecenal umfasst, wobei der Anteil an 8Z-Pentadecenal und 8Z-Heptadecenal in der Gesamtzusammensetzung ungefähr 0,0001 - 20 Gew.-% umfasst.
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