EP4118101A1 - Enzyme pour la conversion d'acide chlorogénique en acide isochlorogénique - Google Patents

Enzyme pour la conversion d'acide chlorogénique en acide isochlorogénique

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EP4118101A1
EP4118101A1 EP21710177.3A EP21710177A EP4118101A1 EP 4118101 A1 EP4118101 A1 EP 4118101A1 EP 21710177 A EP21710177 A EP 21710177A EP 4118101 A1 EP4118101 A1 EP 4118101A1
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EP
European Patent Office
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seq
protein
acid
sequence
identity
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP21710177.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédéric Jean BOURGAUD
Sissi Miguel
Aleksander SALWINSKI
Cindy SIGNE
Alain Hehn
Jean-Louis HILBERT
David GAGNEUL
Guillaume Legrand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellengo
Institut National Polytechnique de Lorraine
Universite de Lille
Original Assignee
Cellengo
Institut National Polytechnique de Lorraine
Universite de Lille
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Filing date
Publication date
Application filed by Cellengo, Institut National Polytechnique de Lorraine, Universite de Lille filed Critical Cellengo
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a protein whose enzymatic activity makes it possible to convert chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • a subject of the present invention is also a process for converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, comprising the production of a protein according to the invention and its use for the production of isochlorogenic acid from chlorogenic acid.
  • the invention therefore lies in the field of the production and use of a recombinant enzyme for the synthesis of a substance.
  • Isochlorogenic acid or 3,5-DiCaféoylQuinique or 3,5-DCQ acid
  • 3,5-DCQ can be purified from plants, in particular from sweet potato (Ipomoea batatas) (Harrison et al, “Contents of caffeoylquinic acid compounds in the storage roots of sixteen sweet potato genotypes and their potential biological activity J. Amer. Soc. Hort. Sci., 133 (4): 492-500, 2008).
  • 3,5-DCQ is however synthesized in relatively small quantities, its purification from plants is therefore laborious and expensive, and is therefore not compatible with a widely distributed use.
  • different isomers of caffeoylquinic acid can be produced by the same plant cell, which also involves an additional step of isolating 3,5-DCQ from the other isomers.
  • the international application published under the number WO 2013/178 705 describes enzymes for converting chlorogenic acid (in English Chlorogenic Acid, or CGA) in di-, tri- or tetracaffeoylquinic acids.
  • the function of said enzymes is close to that of proteins of the HCT (Hydroxycynnamoyl-CoA shikimate / quinate hydroxycinnamoyl transferases) or HQT (Hydroxycynnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferases) type proteins, belonging more generally to the BAHD acyltransferase family.
  • Kojima and Kondo (“An enzyme in sweet potato root which catalyzes the conversion of chlorogenic acid, 3-caféoylquinic acid, to isochlorogenic acid, 3,5- dicaffeoylquinic acid”, Agric. Biol. Chem., 49 (8), 2467- 9, 1985) describe an enzyme, the function of which is not precisely identified and the structure of which is not disclosed, present in a sweet potato extract and capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • Teutschbein et al (“Identification and localization of a lipase-like acyltransferase in phenylpropanoid metabolism of tomato (Solanum lycopersicum", J. Biol. Chem., 285 (49), p. 38374-81, 2010) describe the identification of a chlorogenate glucarate caffeoyltransferase (CGT) in a tomato extract.
  • CCT chlorogenate glucarate caffeoyltransferase
  • the inventors have now isolated and cloned, from extracts of Ipomoea batatas, an enzyme belonging to the GDSL lipase / esterase family, which are characterized by the presence within their amino acid sequence of the sequence of the four following amino acids: glycine (G) - aspartic acid (D) - serine (S) -leucine (L).
  • This enzyme is designated by: IbGDSL, for “Ipomoea batatas GDSL enzyme.
  • IbGDSL for “Ipomoea batatas GDSL enzyme.
  • the inventors have also shown that this enzyme is capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, with high substrate specificity and exclusive or almost exclusive production of 3,5-DCQ.
  • the present invention meets the aforementioned needs, in fact after transformation of host cells transformed with a recombinant vector comprising a sequence nucleotide encoding a GDSL esterase / lipase enzyme according to the invention, and placed in suitable culture condition, the enzyme is detected in an extract of total proteins from said host cells.
  • said enzyme according to the invention is functional when it is present in an isolated form or in the culture medium of said host cell.
  • the GDSL esterase / lipase according to the invention exclusively catalyzes the formation of 3,5-DCQ, to the exclusion of any other isomer.
  • the inventors have shown that the GDSL esterase / lipase according to the invention effectively catalyzes the conversion into 3,5-DCQ of the chlorogenic acid present in a plant extract.
  • the first subject of the present invention is therefore a protein capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid and comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence having at least 80% of identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1.
  • the second subject of the invention is a process for the production of isochlorogenic acid (3,5-DCQ) from chlorogenic acid, this process using a protein according to the invention.
  • a third subject of the invention is the use of a protein according to the invention for the production of isochlorogenic acid (3,5-DCQ) from chlorogenic acid.
  • the invention relates to a protein comprising, or constituted by, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • the invention relates to a recombinant protein, that is to say a protein produced by a cell whose genetic material has been modified.
  • the sequence in question may in particular also comprise additional amino acids, on the N-terminal or C-terminal side of said sequence, these additional amino acids making it possible in particular to facilitate the characterization and / or purification of the protein of interest .
  • the object sequence can in particular also comprise additional nucleotides, on the 3 'or 5' side of said sequence.
  • exhibiting at least 80% identity is meant that said sequences exhibit at least 80% identity after optimal global alignment, that is to say by global alignment between two sequences giving the highest percentage identity. between them.
  • the optimal overall alignment of two sequences can in particular be carried out according to the Needleman-Wunsch algorithm, well known to those skilled in the art (Needleman & Wunsch, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins ”, J. Mol. Biol., 48 (3): 443-53).
  • the proteins according to the invention comprise, or consist of an amino acid sequence having at least 80%, advantageously at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the amino acid sequence SEQ ID N ° 1 after global alignment optimal.
  • the proteins according to the invention comprise, or consist of an amino acid sequence exhibiting at least 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99, 6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 1 after optimal overall alignment.
  • proteins according to the invention comprising, or consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 1 and capable of converting chlorogenic acid in isochlorogenic acid
  • the proteins comprising at least one sequence chosen from: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 are preferred.
  • proteins according to the invention comprising, or consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 1 and capable of converting the acid chlorogenic to isochlorogenic acid, proteins comprising:
  • proteins according to the invention comprising, or consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 1 and capable of converting the chlorogenic acid to isochlorogenic acid
  • proteins comprising an amino acid serine at position 11, an amino acid aspartic acid at position 317, an amino acid aspartic acid at position 153 and a histidine amino acid at position 320 are preferred.
  • proteins according to the invention comprising, or consisting of a fragment of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 1 and capable of converting l 'chlorogenic acid to isochlorogenic acid
  • proteins comprising an amino acid serine in position 11 and / or an amino acid aspartic acid in position 317 and / or an amino acid aspartic acid in position 153 and / or an amino acid histidine in position 320 are favorite.
  • the proteins according to the invention comprising, or consisting of, a fragment of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence SEQ ID N ° 1 and capable of capable of converting l Chlorogenic acid to isochlorogenic acid contain at least 50 amino acids, preferably at least 100 amino acids and more preferably at least 150 amino acids.
  • chlorogenic acid is meant the simple ester of caffeic acid and quinic acid, also designated by caffeoylquinic acid or trans-5-O-caffeoyl-D-quinate, of the following formula (I):
  • a dicaffeoylquinic acid is a diester composed of a quinic acid molecule of which two of the four alcohol functions have been esterified by a caffeic acid molecule.
  • the general formula of DCQs is as follows (II), wherein R2, R3, R4 and Rs each independently represent a caffeoyl group or a hydrogen atom provided that at least two of R2, R3 , R4 and Rs is different from a hydrogen atom:
  • isochlorogenic acid also designated by 3,5-0-dicaféoylquinic acid or by “3,5-DCQ”
  • 3,5-DCQ is naturally present in particular in an extract of sweet potato, Ipomoea batatas.
  • capable of capable of converting chlorogenic acid to isochlorogenic acid is meant a protein which, when placed in suitable reaction conditions, is capable of catalyzing the formation of chlorogenic acid into isochlorogenic acid by the condensation of two molecules of chlorogenic acid, according to the reaction scheme described in Figure 1.
  • a protein according to the invention is capable of converting predominantly, and preferably exclusively or almost exclusively, chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • the catalytic activity as defined above of a protein according to the invention meets one, two, three or four of the following characteristics: a) Vmax (maximum initial speed) of between 60 and 240 nanomoles. s 1 ), b) Km (Micha ⁇ lis constant) between 2 and 5 mM (with respect to CGA), c) optimum operating pH between 6 and 6.6; d) optimum operating temperature between 39 and 41 ° C.
  • the catalytic activity as defined above of a protein according to the invention meets one, two, three or four of the following characteristics: a) Vmax (maximum initial speed) of 7.18 micromol . Min 1 (or 120 nanomoles. S 1 ); b) Km (Micha ⁇ lis constant) of 3.5 mM (with respect to CGA); c) optimum operating pH of 6.3; d) optimum operating temperature of 39.9 ° C.
  • the invention relates to a protein comprising, or constituted by, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence having at least 95% identity with SEQ ID No. 1 and comprising the sequence SEQ ID No. 7, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • the invention relates to a protein comprising, or constituted by, an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 1 and capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • said protein being chosen from the so-called “GDSL esterase / l ipase” enzymes, and in particular from the “GDSL esterase / l ipase” enzymes from Ipomoea, more particularly from the “GDSL esterase / l ipase” enzymes.
  • the invention relates to a protein comprising, or constituted by, the amino acid sequence chosen SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid and being chosen from the “GDSL esterase” enzymes. / lipase 'from Ipomoea batatas.
  • the subject of the invention is an isolated nucleic acid molecule encoding a protein according to the invention.
  • the invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding a protein according to the invention, said molecule comprising, or consisting of, a nucleic acid sequence chosen from: SEQ ID No. 2 and a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID N ° 2. Due to the degeneration of the genetic code, different nucleic acid sequences can code for the proteins according to the invention. Depending on the host chosen to produce a protein according to the invention, the degeneration of the nucleic code can be used so that the codons of the nucleotide sequence are adapted to the use of the codons preferably observed in the chosen host, so as to optimize expression of the protein of interest in the host protein.
  • the invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding a protein according to the invention, said molecule comprising or being constituted by a nucleic acid sequence chosen from: SEQ ID No. 2 and a sequence exhibiting at minus 95% identity with SEQ ID N ° 2.
  • the invention relates to a recombinant vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention, each of said at least one molecule being placed under the control of the means necessary for the expression of said. protein in a given host cell.
  • a vector can in particular be chosen from plasmids, Yeast artificial chromosomes (Yeast Artificial Chromosomes or YACs), binary type vectors (pBIN, pGW) and any type of vector that is appropriate depending on the host cell chosen.
  • Said means necessary for the expression of said protein in a host cell are well known to those skilled in the art.
  • a vector according to the invention may further comprise a nucleotide sequence encoding a means ensuring the export of the protein produced in the culture medium of the host cell and / or a nucleotide sequence encoding a means intended to allow the purification of the protein produced.
  • Such means are well known to those skilled in the art who can therefore easily select them and insert, functionally, said nucleotide sequences.
  • one of the known means consists of a histidine tag, or series of histidine amino acids.
  • the invention relates to a recombinant vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention, each of said at least one molecule being placed under the control of means necessary for the expression of said protein in a cell.
  • the means necessary for the expression of said protein in a yeast host cell are well known to those skilled in the art, they are in particular present in the vectors pPICZa, pPIC9K, pAOX815 sold by the company ThermoFischer.
  • the invention relates to a host cell comprising at least one isolated nucleic acid molecule according to the invention or at least one recombinant vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention, each said at least one molecule being placed under the control of means necessary for the expression of said protein in a host cell.
  • the invention relates to a host cell chosen from yeast cells, in particular yeast cells of the strain Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Komagataella sp. and Kluyveromyces lactis, and preferably Pichia pastoris.
  • the invention relates to a host cell chosen from plant cells, in particular Nicotiana benthamiana Ipomoea batatas, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaiiana, Zea mays, rice, Coffea arabica, tomato, asteraceae (thistles, artichokes) etc. .
  • the invention relates to a transgenic plant comprising at least one isolated nucleic acid molecule according to the invention, at least one recombinant vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention, or at least a plant host cell according to the invention.
  • the invention relates to a transgenic plant comprising at least one isolated nucleic acid molecule according to the invention, at least one recombinant vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention, or at least one host cell.
  • the invention relates to a process for the production of isochlorogenic acid comprising bringing into contact, under appropriate reaction conditions, chlorogenic acid and a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting acid chlorogenic to isochlorogenic acid, to obtain a composition enriched in isochlorogenic acid.
  • the invention relates to a process for the production of isochlorogenic acid comprising bringing into contact, under appropriate reaction conditions, chlorogenic acid and a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, to obtain a composition enriched in isochlorogenic acid, said process further comprising:
  • a host cell capable of expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein produced being optionally purified, and / or said chlorogenic acid is present in isolated form or in a composition, said composition being in particular a plant extract, and / or
  • the invention relates to a method in which said protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, is purified, prior to its bringing into contact, with chlorogenic acid.
  • the purification is carried out by any means known to those skilled in the art.
  • the invention relates to a process in which, when bringing said protein into contact with chlorogenic acid, said protein is present in a composition or a mixture, in particular the medium. culture, or supernatant, of a recombinant host cell which has produced said protein.
  • the invention relates to a process for the production of isochlorogenic acid further comprising a prior step of culturing, in a culture medium and under suitable conditions, a host cell capable of expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1.
  • reaction time is preferably greater than 4 hours, preferably between 4 and 60 hours, preferably 50 hours.
  • the pH of the reaction is between 5 and 7, and preferably is 6 ⁇ 0.5.
  • the reaction temperature is between 30 and 40 ° C, and is preferably 35 ° C ⁇ 5 ° C.
  • concentration of GDSL per volume of plant extract is between 0.5 mg / L to 10 mg / L, preferably 4.2 mg of GDSL / L ⁇ 3.4.
  • the invention relates to a process for the production of isochlorogenic acid further comprising a subsequent step of isolating the isochlorogenic acid produced during the reaction.
  • the invention relates to a process for the production of isochlorogenic acid comprising the steps of: i) culturing, in a culture medium and under suitable conditions, a host cell capable of expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No.
  • step ii) 1, to express a protein capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, ii) contacting, under appropriate reaction conditions, the protein expressed during step i) with chlorogenic acid, and iii) isolation of the isochlorogenic acid produced during the reaction of step ii).
  • said chlorogenic acid is present either in isolated form or in a composition, said composition being in particular a plant extract.
  • plant extract is meant the result of the extraction of the active principles of a plant, or of at least a part of a plant, by fermentation, maceration, decoction or infusion.
  • Said plant extract can in particular be added in the form of a liquid or a powder.
  • a plant extract comprises at least 5% of CGA.
  • Such a plant extract can be chosen from plant extracts of coffee, blueberry, sunflower, large burdock, endive, artichoke, Japanese loquat, prune, mint, carrot, potato, apple and pear.
  • the invention further relates to a process for producing isochlorogenic acid comprising the steps of: i) culturing, in a culture medium and suitable conditions, a host cell capable of expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80 % identity with SEQ ID No. 1, to express a protein capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, ii) bringing into contact, under appropriate reaction conditions, the protein expressed during step i) with chlorogenic acid, and iii) isolation of the isochlorogenic acid produced during the reaction of step ii).
  • a process for producing isochlorogenic acid comprises the steps of: i) Culture, in a culture medium and under appropriate conditions, of a Pichia pastoris host cell capable of expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, to express a protein capable of to convert chlorogenic acid into isochlorogenic acid, said protein being produced and then exported into the culture supernatant of P. Pastoris cells, ii) bringing into contact, under appropriate reaction conditions, the protein expressed during step i ) with chlorogenic acid present in a green coffee extract, and iii) isolation of the isochlorogenic acid produced during the reaction of step ii).
  • a process for the production of isochlorogenic acid according to the invention comprises the steps of:
  • a protein capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting in at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, with chlorogenic acid present in a green coffee extract, and
  • green coffee is meant the beans of plants of the genus Coffea before cooking or roasting, in particular the beans of the species Coffea canephora or Coffea arabica.
  • green coffee is meant Coffea canephora.
  • green coffee extract an extract obtained by solid / liquid extraction in ethanol to recover the metabolites contained in the dried green coffee beans.
  • the ethanol used is pure or in the form of a solution aqueous alcohol, the latter comprising from 10% to 99.9% alcohol, more particularly between 40% and 90%, and even more particularly between 50% and 85%.
  • the caffeine is removed from the extract by treatment with ethyl acetate or an ethyl acetate / hexane mixture.
  • the extract is reduced to powder form by implementing any suitable process known to those skilled in the art, and in particular atomization or lyophilization.
  • the chlorogenic acid is present at a minimum concentration of at least 2 mM, preferably at least 5 mM, at least 7.5 mM, preferably 10 mM.
  • a process for the production of isochlorogenic acid according to the invention comprises the steps of:
  • Pichia pastoris host cell capable of expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, to express a protein capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, said protein being produced and then exported into the culture supernatant of P. Pastoris cells
  • the subject of the invention is the product capable of being obtained by a process according to the invention, said process comprising bringing into contact, under appropriate reaction conditions, a green coffee extract whose concentration of chlorogenic acid is greater than equal to 2 mM, and of a protein capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid and comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from:
  • a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1 A fragment comprising at least 50 amino acids of said SEQ ID N ° 1 and
  • a fragment comprising at least 50 amino acids of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1.
  • the subject of the invention is the product capable of being obtained by a process according to the invention, said process comprising:
  • the invention relates to the use of at least one protein, said protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence having at least 80% of 'identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, or a host cell expressing such a protein, to convert chlorogenic acid to isochlorogenic acid.
  • the invention relates to the use of at least one protein comprising, or constituted by, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence having at least 80% identity with SEQ ID N ° 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, in order to convert from acid chlorogenic to isochlorogenic acid, said protein being brought into contact with chlorogenic acid, under appropriate reaction conditions, without having been previously isolated from the host cell or from the culture medium in which the host cell has been cultured to produce said protein.
  • the invention relates to the use of at least one protein comprising, or constituted by, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, for converting chlorogenic acid to isochlorogenic acid, said protein being contacted with chlorogenic acid, under appropriate reaction conditions, after having been previously isolated or purified from the host cell or from the culture medium in which the host cell has been cultured to produce said protein.
  • said protein, isolated from the host cell or purified from culture medium is added to a solution comprising mainly, or only, chlorogenic acid.
  • said protein, isolated from the host cell or purified from culture medium is added to an extract comprising in particular chlorogenic acid.
  • the invention relates to the use of at least one host cell expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid to isochlorogenic acid, to convert chlorogenic acid to isochlorogenic acid.
  • the subject of the invention is the use of at least one yeast cell expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of converting chlorogenic acid into isochlorogenic acid, in order to convert chlorogenic acid into isochlorogenic acid.
  • said yeast cell is a cell of the Pichia pastoris strain transformed with a recombinant vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention, each of said at least one molecule being placed under the control of the means necessary for it.
  • Such a vector is in particular chosen from plasmids, Yeast Artificial Chromosomes (YACs), vectors of binary type (pBIN, pGW) and any type of vector which is appropriate depending on the host cell.
  • YACs Yeast Artificial Chromosomes
  • pBIN vectors of binary type
  • pGW vectors of binary type
  • the invention relates to the use of at least one plant host cell expressing a protein comprising, or consisting of, an amino acid sequence chosen from: SEQ ID No. 1, a sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, a fragment of said SEQ ID No. 1 and a fragment of said sequence exhibiting at least 80% identity with SEQ ID No. 1, said protein being capable of to convert chlorogenic acid to isochlorogenic acid, to convert chlorogenic acid to isochlorogenic acid.
  • Figure 1 represents the diagram of the enzymatic reaction carried out by IbGDSL, which catalyzes the formation of 3,5-DCQ and quinic acid (QA) by the condensation of two molecules of CGA.
  • Figures 2A and 2B respectively represent the detection of the enzyme by a western blot test carried out using antibodies directed specifically against the label of six histidines in the C-terminal position of the protein, which demonstrates production of IbGDSL (predicted size 40.1 kDa) by N. benthamiana plants ( Figure 1A) and P. pastoris cells (Figure IB).
  • column 1 represents the analysis carried out on the production host transformed with the empty vector (negative control)
  • column 2 represents the analysis carried out on the production host transformed with the vector comprising the gene. of interest.
  • Figures 3A, 3B and 3C respectively represent the concentration of 3,5-DCQ (in mM) (Fig. 3A and 3B), or the rate of bioconversion in 3,5-DCQ (in micromoles / minutes). (Fig. 3C), depending on the pH (Fig. 3A), the temperature (Fig. 3B) or the CGA substrate concentration (in mM) (Fig. 3C).
  • Figures 4A, 4B and 4C respectively represent the chromatograms of the standard of 3,5-DCQ (Fig. 4A) and of the enzymatic reactions of conversion of CGA to 3,5-DCQ carried out with the culture supernatants of P pastoris transformed with the empty vector (FIG. 4B) or transformed with the vector carrying the gene encoding IbGDSL (FIG. 4C) after 3 days of induction with methanol.
  • the peaks with a retention time of 3.2 minutes and 8.3 minutes correspond respectively to CGA (m / z neg 353) and to 3,5-DCQ (m / z neg 515).
  • Figures 5A and 5B represent the chromatograms of the reactions of bioconversion of chlorogenic acid to 3,5-DCQ via the addition of the substrate directly in the cultures of P. pastoris transformed or with the empty vector (Fig. 5A) or with the vector carrying the gene encoding IbGDSL (FIG. 5B).
  • FIG. 5B the chromatograms corresponding respectively to T0 before the addition of CGA, 6 hours after the addition of CGA and 120 hours after the addition of CGA.
  • the peaks with a retention time of 3.2 minutes and 8.3 minutes correspond respectively to CGA (m / z neg 353) and to 3,5-DCQ (m / z neg 515).
  • Figures 6A and 6B represent respectively, as a function of the reaction time (in hours), the degree of conversion of pure CGA to 3,5-DCQ (in mol%) (Fig. 6A) or the concentration in 3,5-DCQ (in mg / L) (Fig. 6B).
  • the theoretical limit at 50% corresponds to the maximum yield obtained when all the CGA molecules are transformed into 3,5-DCQ (stoichiometric yield 2 to 1 respectively).
  • Figure 6A curves with triangles (CGA 5 mM or 1.9 g / L), light crosses (CGA 7.5 mM or 2.6 g / L), dark crosses (CGA 9 mM or 3.2 g / L) , dark squares (CGA 10 mM or 3.6 g / L), light squares (CGA 15 mM or 5.5 g / L).
  • Figure 6B curves with triangles (CGA 5 mM or 1.9 g / L), light crosses (CGA 7.5 mM or 2.6 g / L), lines (CGA 9 mM or 3.2 g / L), dark squares (CGA 10 mM or 3.6 g / L), light squares (CGA 15 mM or 5.5 g / L).
  • Figure 7A represents a chromatogram showing the composition of caffeic acid derivatives of a hydro-alcoholic extract of green coffee, with: peak 1: MCQ1 (another isomer of mono-caffeoylquinic acid), peak 2: MCQ2 (other isomer of mono-caffeoylquinic acid), peak 3: CGA (chlorogenic acid, 5-O-caffeoyl quinic acid); peak 4: CA (caffeic acid); peak 5: MFQ (monoferuloyl quinic acid); peak 7: 4,5-DCQ (3,4 dicaffeoyl quinic acid); peak 8: 3,5-DCQ (3,5 dicaffeoyl quinic acid); peak 9: 3,4-DCQ (4,5 dicaffeoyl quinic acid).
  • FIG. 7B represents a chromatogram of a hydroalcoholic extract of green coffee obtained before (black trace) and after 50 h (clear trace) of bioconversion by IbGDSL, in the green coffee extract; the initial substrate concentration is equivalent to 10 mM CGA.
  • Pic 1 MCQ
  • peak 2 CGA
  • peak 3 MFQ
  • peak 4 4.5-DCQ
  • peak 5 3.5-DCQ
  • peak 6 3,4-DCQ.
  • the difference in the light and black traces is notably visible at peak 5: 3.5-DCQ.
  • FIG. 8 represents the DCQ content (mg / L) obtained for different concentrations of green coffee extract, expressed in CGA equivalent, as a function of the reaction time (in hours).
  • the P. pastoris culture medium supernatant containing the GDSL enzyme was concentrated 37 times. Curve with solid line (CGA 1 mM), light circles (CGA 3.5 mM), diamonds (CGA 5 mM), dark squares (CGA 10 mM).
  • Figure 9 represents the content of 3,5-DCQ (mg / L) measured in a green coffee extract bioconverted by a cell suspension of P. pastoris expressing IbGDSL (GDSL +) or not expressing it. (GDSL-), as a function of time (in days).
  • Figure 10 represents the content of 3,5-DCQ (mg / L) obtained by enzymatic bioconversion by IbGDSL of a green coffee solution containing 5 mM of CGA, as a function of time (in hours) when the P. pastoris culture medium supernatant containing the GDSL enzyme was concentrated 10 times (round), 20 times (triangles) or 37 times (squares).
  • Example 1 Identification, production and characterization of a recombinant GDSL enzyme from Ipomoea batatas.
  • a DNA bank complementary to batatas was prepared according to the protocol described in WO2013 / 178705 from roots obtained from plants grown under aeroponic conditions rich in 3,5-DCQ.
  • the fragmentation of a complex protein extract from a tuber d ⁇ . batatas rich in 3,5-DCQ was carried out in order to select step by step the proteins exhibiting isochlorogenic acid synthase activity.
  • SDS-PAGE profiles were obtained and the proteins observed were sequenced. 400 peptides were obtained and their amino acid sequence was aligned with the batatas cDNA library using the tBIastn program which compares a peptide sequence to the translation products of a nucleotide sequence.
  • the sequences exhibiting strong homologies with the sequenced peptides were detected among all the sequences composing the transcriptome of the tissue.
  • RNA roots of batatas grown in aeroponic conditions were extracted using a specific commercial extraction kit plant tissue according to the manufacturer's instructions (RNeasy Plant Mini Kit ® -QIAGEN).
  • the cDNA encoding the candidate protein was amplified using, on the one hand, primers specific to the sequence, designed in such a way as to add a label of six histidines in the C-terminal position of the protein, necessary for its detection after production and for its purification, and, on the other hand, of a commercial kit allowing in a single step: the conversion of the mRNAs into cDNA and the amplification of the sequence by PCR (Polymerase Chain Reaction) (SuperScript TM III One-Step RT-PC R System with Platinum TM Taq High Fidelity DNA Polymerase - INVITROGEN). The amplicon obtained was then cloned into a basic commercial vector (pCR TM 8 / GW / TOPO TM - INVITROGEN) allowing its sequencing and its integration into several vectors dedicated to various expression systems.
  • primers specific to the sequence designed in such a way as to add a label of six histidines in the C-terminal position of the protein,
  • the peptide and nucleotide sequences encoding IbGDSL are respectively SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
  • the gene encoding IbGDSL is subsequently integrated into an expression vector dedicated to plant cells by homologous recombination.
  • a label in English: “tag”
  • 6 histidines is added at the end of the gene in order to have, after transcription and translation, a labeled protein at the C-terminal. This label allows easy purification of the protein by affinity chromatography.
  • This vector is then introduced into Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 capable of transfecting a DNA of interest into plant cells according to the freezing and thawing method described in the work of Chen et al (“Enhanced recovery of transformants of Agrobacterium tumefaciens after freeze- thaw transformation and drug selection. ”BioTechniques 16 (4): 664-68, 1994).
  • the bacteria having integrated the vector will have acquired at the same time a resistance to an antibiotic thus allowing their selection from the bacteria not transformed in the presence of this antibiotic agent.
  • the agrobacteria carrying the recombinant vector are cultured in 15 mL of nutrient medium supplemented with the selection antibiotic and are incubated at 28 ° C with shaking at 200rpm for 24 hours. The next day, 3 hours before the transformation, 100 mM of acetosyringone are added to the cultures of ag ro bacteria to activate their virulence. After this time, the bacteria are centrifuged and taken up in nutrient medium once or twice to remove the antibiotics and at the end, taken up in the infiltration buffer at pH 5.6 (MES 10 mM, acetosyringone 100 mM) . The OD 600 m (optical density) of the bacterial suspension is adjusted to 0.5.
  • the aerial parts of the several plants of N. benthamiana aged 3-4 weeks grown in a culture chamber with a photoperiod of 16h / 8h day / night under artificial light (70 pmol m -2 s -1) at 26 ° C with 70% humidity are fully immersed in the agrobacteria solution and subjected to vacuum infiltration in a bell connected to a pump.
  • a vacuum step is carried out down to 20 mbar to cause the entry of agrobacteria into the tissues before reestablishing the conditions of atmospheric pressure.
  • the N. benthamiana plants are then placed in culture under the same environmental conditions described above for 6 days. It is during this time that the agrobacteria will transfect the DNA of interest corresponding to the IbGDSL gene in plant cells and that the protein will be produced by the transcription and translation machinery of the host cells.
  • the gene encoding the protein is integrated into an expression vector dedicated to P. pastoris by homologous recombination.
  • This vector allows the expression and the secretion of the protein in the culture medium in the presence of methanol.
  • the classic P. pastoris transformation protocol used in this work is described in Cregg and Russell ("Transformation". In Pichia Protocols, edited by David R. Higgins and James M. Cregg, 27-39. Methods in Molecular Biology TM. Totowa, NJ: Humana Press. Https://doi.Org/10.1385/0-89603-421-6:27, 1998). Confirmation of the production of the enzyme was carried out as described above by western blot (FIG. 2B).
  • Example 2 Characterization of the catalytic activity of purified recombinant IbGDSL.
  • Enzymatic in vitro tests are carried out on the purified recombinant enzyme produced in a plant system. After 6 days of co-culture, the leaves of N. benthamiana agro-infiltrated with the vector carrying the gene of interest, are harvested and ground in an extraction buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7.4). The extract is then centrifuged and the supernatant in which is found all the soluble proteins from which the IbGDSL is recovered and sterilized by 0.2 ⁇ m filtration. Purification of the protein is then carried out according to the supplier's instructions on Nickel columns (HisTrap HP-GE HEALTHCARE).
  • the elution fraction recovered after purification containing the protein was concentrated and desalted on centrifuge units with a cutoff lOkDa (Amicon ® Ultra Centrifugal Filters 0.5 mL -PMNL lOkDa - MILLIPORE).
  • the enzymatic tests are carried out in a volume of 50 ⁇ l with 200 to 400 ng of the purified protein (ie a few ⁇ l).
  • the optimum reaction pH will be determined using a polybuffer (0.1 M Tris / 20 mM MES / 0.1 M acetic acid) from which a range of 4 to 9 in pH will be constructed.
  • a 100 mM stock solution of chlorogenic acid (CGA) is prepared shortly before the experiments from a CGA powder with a purity level greater than 99% diluted in the polybuffer at pH 6.5.
  • 150 ml of absolute ethanol are added to the 50 ml reaction to stop the reaction and extract the molecules produced present in the reaction. The test is then centrifuged and the supernatant is recovered for analyzes in UPLC-MS.
  • the apparatus used for the analysis step is a Shimadzu Nexera X2 UPLC (LC-30AD pumps, SIL-30AC sample changer, CTO-20A oven, SPD-M20A diode array detectors; Kyoto, Japan) operating in reverse phase with a Kinetex Biphenyl column (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) of dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 ⁇ m.
  • Shimadzu Nexera X2 UPLC LC-30AD pumps, SIL-30AC sample changer, CTO-20A oven, SPD-M20A diode array detectors; Kyoto, Japan
  • a Kinetex Biphenyl column (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) of dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 ⁇ m.
  • the mobile phase consists of a solvent A (ultrapure water Mili-Q, Merck Millipore + 0.1% formic acid, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) and a solvent B (Acetonitrile, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany), the gradient of which has been programmed as follows: phase B (%) 5-25% (0-10 min); 25-90% (10-10.5 min); 90% (10.5-12min), 90-5% (12-12.1min), 5% (12.1-14.1min).
  • the analysis flow rate is 0.5 mb / min with an oven temperature of 40 ° C.
  • a diode array detector records the UV spectra between 220 and 370 nm.
  • the device is coupled to a mass spectrometer (Shimadzu LCMS-2020) operating with electrospray ionization (4.5 kV) in negative mode in a range of m / z between 100 and 1000.
  • the LabSolutions software version 5.60 SP2 ) is used to operate the system.
  • 3,5-DCQ is used as a quantification standard for the different 3,4-DCQ and 4,5-DCQ compounds because the latter belong to the same family of molecules.
  • the experiments aimed at determining the physicochemical parameters essential for IbGDSL to convert CGA to 3,5-DCQ were carried out on the purified enzyme produced in the plant expression system.
  • IbGDSL is an esterase / lipase capable of condensing two CGA molecules into 3,5-DCQ by transferring the caffeoyl group from one CGA molecule to another CGA molecule (Fig. 1). Therefore, CGA is used herein as an acyl donor. The addition of caffeic acid to the reaction medium does not promote the formation of 3,5-DCQ.
  • a pH range between 4 and 9 was established in order to determine the optimum pH for the conversion of CGA to 3,5-DCQ using IbGDSL.
  • a fixed amount of purified IbGDSL is contacted with a fixed 10 mM concentration of CGA at different pH conditions established by the polybuffer.
  • the reaction is incubated for 30 minutes at 25 ° C and quenched with ethanol.
  • the curve obtained made it possible to determine that the optimum reaction pH is situated between 6 and 7 (FIG. 3A).
  • a range of CGA concentration was established in order to determine the substrate concentration threshold from which inhibition of the activity of IbGDSL by the product is observed. With a fixed quantity of enzyme and a pH established at 6.5, a slowing down of the enzymatic activity is observed starting from the 10 mM concentration of CGA after 30 minutes of incubation at 36 ° C (FIG. 3C).
  • Example 3 Characterization of the activity of recombinant IbGDSL present in the culture supernatant of P. pastoris
  • Bioconversion of CGA to 3,5-DCQ in vivo requires the establishment of a metabolically highly active P. pastoris culture.
  • the yeasts are put in culture in the nutrient medium containing a buffer composed of 100 mM potassium phosphate with a pH adjusted to pH 6.0. This makes it possible to maintain at a pH 6 the medium in which the enzyme obtained from the microbial cells and the substrate will be in contact.
  • the first step of this experiment is to show if the IbGDSL produced by P. pastoris is able to convert CGA into 3,5-DCQ knowing that the original enzyme could potentially be glycosylated three times and that the glycosyl trees generated by P. pastoris are not composed and organized in the same way as plant glycan trees. These differences could directly influence the stability and prevent the good activity of the enzyme.
  • the supernatants of two cultures of P. pastoris, one transformed with the empty vector (negative control) and the other with the vector carrying the gene encoding IbGDSL were recovered after 3 days of induction with methanol. These supernatants were incubated at pH 6.5 conditions with 10 mM chlorogenic acid for 30 minutes at 36 ° C. The enzymatic reaction is then stopped with the addition of ethanol and analyzed in UPLC-MS.
  • the second step of this experiment is to show whether the CGA directly added to the culture medium of P. pastoris expressing the enzyme could be directly converted to 3,5-DCQ.
  • the objective is to dispense with the need for the stage of purification of the enzyme.
  • the CGA is added directly to the culture whose pH is buffered at 6 to a final concentration of 10 mM and left in contact with the microbial cells for 3 days. This experiment was carried out at 30 ° C, the ideal temperature for the culture and growth of the organism P. pastoris.
  • the supernatant is then analyzed in UPLC-MS.
  • the results obtained presented in FIG. 5B show that the culture of P. pastoris expressing IbGDSL is capable of converting CGA into 3,5-DCQ in 3 days with very high efficiency. Indeed, we estimated a bioconversion yield at around 44%, the maximum stoichiometric limit being 50% since two molecules of CGA are needed to form a molecule of 3,5-DCQ.
  • CGA can be added indifferently every day, or at the start of the induction phase, or at the end of the induction phase, without affecting the final conversion rate obtained.
  • Example 4 Bioconversion of the chlorogenic acid of a green coffee extract into 3,5-DCQ by the culture supernatant of cells of P. pastoris expressing IbGDSL, secreted in said culture medium
  • the bioconversion reaction of CGA to 3,5-DCQ was also carried out using a green coffee extract (Coffea canephora), the composition of which is indicated in Fig. 7A.
  • This green coffee extract comprising a CGA concentration equivalent to 10 mM and bioconverted over a period of 50 hours, at 30 ° C and at a pH of 6, led to a new extract, the composition of which is shown in Fig. 7B.
  • IbGDSL exclusively catalyzes the formation of 3,5-DCQ, to the exclusion of any other isomer.
  • no other substrate containing a caffeic acid than chlorogenic acid is biotransformed because no decrease in peaks is observed except for that corresponding to CGA.
  • the bioconversion of the green coffee extract with IbGDSL makes it possible to multiply by 4.5 the content of 3,5-DCQ initially present in the extract (200 mg / L at To and 900 mg at Tsoh) for a concentration of start in CGA equivalent to 10 mM.
  • the concentration of the enzyme IbGDSL obtained by fermentation of P. pastoris makes it possible to accelerate the reaction rate of the conversion of CGA to 3,5-DCQ (Fig. 10). It is noted that the same level of 3,5-DCQ concentration can be obtained for enzyme concentration factors of 10, 20 and 37 times after 60 h of bioconversion.
  • the recombinant IbGDSL enzyme obtained by cultures of P. pastoris constitutes an effective catalyst making it possible to obtain the conversion of chlorogenic acid to 3,5-DCQ in large quantities, either by converting chlorogenic acid. pure, or by transforming a plant extract naturally containing chlorogenic acid such as a green coffee extract.

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Abstract

La présente demande a pour objet une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isocholorogénique, ladite protéine comprenant ou étant constituée par une séquence en acides aminés SEQ ID N°1, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec cette séquence ou un fragment de cette séquence. La présente demande a également pour objet un procédé de production d'acide isochlorogénique à partir d'acide chlorogénique, comprenant production de ladite protéine et sa mise en contact avec l'acide chlorogénique.

Description

ENZYME POUR LA CONVERSION D'ACIDE CHLOROGENIQUE EN ACIDE ISOCHLOROGENIQUE
Domaine de l'invention
La présente invention a pour objet une protéine dont l'activité enzymatique permet de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique. La présente invention a également pour objet un procédé pour convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, comprenant la production d'une protéine selon l'invention et son utilisation pour la production d'acide isochlorogénique à partir d'acide chlorogénique. L'invention se situe donc dans le domaine de la production et de l'utilisation d'une enzyme recombinante pour la synthèse d'une substance.
Etat de la technique
L'acide isochlorogénique, ou acide 3,5-DiCaféoylQuinique ou 3,5-DCQ, fait actuellement l'objet de nombreuses études et plusieurs propriétés pharmacologiques laissent présager des développements importants notamment dans le domaine de la prévention et/ou du traitement de maladies, telle que la maladie d'Alzheimer et du cancer, des maladies virales et dans des applications cosmétiques. Le 3,5-DCQ peut être purifié à partir de végétaux, notamment à partir de la patate douce ( Ipomoea batatas ) (Harrison et al, « Contents of caffeoylquinic acid compounds in the storage roots of sixteen sweet potato génotypes and their potential biological activity » ; J. Amer. Soc. Hort. Sci. , 133(4) :492-500, 2008). Le 3,5-DCQ est cependant synthétisé en quantités relativement faibles, sa purification à partir de végétaux est donc laborieuse et coûteuse, et n'est donc pas compatible avec une utilisation largement diffusée. Par ailleurs, différents isomères d'acide caféoylquinique peuvent être produits par une même cellule végétale, ce qui implique en outre une étape supplémentaire d'isolement du 3,5-DCQ par rapport aux autres isomères.
Il existe donc un besoin de disposer d'un moyen permettant d'obtenir, de façon fiable, aisée, et peu coûteuse, de l'acide isochlorogénique en quantité importante.
La demande internationale publiée sous le numéro WO 2013/178 705 décrit des enzymes de conversion de l'acide chlorogénique (en anglais Chlorogenic Acid, ou CGA) en acides di-, tri- ou tétracaféoylquinique. La fonction desdites enzymes est proche de celle des protéines de type HCT (Hydroxycynnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transférases) ou HQT (Hydroxycynnamoyl- CoA quinate hydroxycinnamoyl transférases), appartenant plus généralement à la famille des BAHD acyltransferases.
Kojima et Kondo (« An enzyme in sweet potato root which catalyzes the conversion of chlorogenic acid, 3-caféoylquinic acid, to isochlorogenic acid, 3,5- dicaffeoylquinic acid », Agric. Biol. Chem., 49(8), 2467-9, 1985) décrivent une enzyme, dont la fonction n'est pas précisément identifiée et dont la structure n'est pas divulguée, présente dans un extrait de patate douce et capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Villegas et al (« Purification and characterization of chlorogenic potato roots », Phytochemistry, vol. 26(6), 1577-81, 1987) décrivent une chlorogenate caféoyltransférase capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique).
Teutschbein et al (« Identification and localization of a lipase-like acyltransferase in phenylpropanoid metabolism of tomato ( Solanum lycopersicum », J. Biol. Chem., 285(49), p. 38374-81, 2010) décrivent l'identification d'une chlorogénate glucarate caféoyltransférase (CGT) dans un extrait de tomate.
Les inventeurs ont maintenant isolé et cloné, à partir d'extraits d'Ipomoea batatas, une enzyme appartenant à la famille des GDSL lipases/estérases, qui sont caractérisées par la présence au sein de leur séquence en acides aminés de l'enchaînement des quatre acides aminés suivants : glycine (G) - acide aspartique (D) - sérine (S) -leucine (L). Cette enzyme est désignée par : IbGDSL, pour « enzyme GDSL d'Ipomoea batatas. Les inventeurs ont également montré que cette enzyme est capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, avec une grande spécificité de substrat et une production exclusive ou quasi-exclusive de 3,5-DCQ.
La présente invention répond aux besoins cités, en effet après transformation de cellules hôte transformées par un vecteur recombinant comprenant une séquence nucléotidique codant pour une enzyme GDSL estérase/lipase selon l'invention, et mise en condition de culture appropriée, l'enzyme est détectée dans un extrait de protéines totales desdites cellules hôtes. De plus, les inventeurs ont démontré que ladite enzyme selon l'invention est fonctionnelle lorsqu'elle est présente sous une forme isolée ou dans le milieu de culture de ladite cellule hôte. La GDSL estérase/lipase selon l'invention catalyse exclusivement la formation de 3,5-DCQ, à l'exclusion de tout autre isomère. Enfin, les inventeurs ont montré que la GDSL estérase/lipase selon l'invention catalyse efficacement la conversion en 3,5-DCQ de l'acide chlorogénique présent dans un extrait végétal.
La présente invention a donc pour premier objet une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l. L'invention a pour second objet un procédé de production de l'acide isochlorogénique (3,5-DCQ) à partir de l'acide chlorogénique, ce procédé mettant en œuvre une protéine selon l'invention. L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une protéine selon l'invention pour la production d'acide isochlorogénique (3,5-DCQ) à partir de l'acide chlorogénique.
Exposé de l'invention
Selon un premier objet, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Selon un aspect particulier de ce premier objet, l'invention concerne une protéine recombinante, c'est-à-dire une protéine produite par une cellule dont le matériel génétique a été modifié.
Par « comprenant » on entend que l'élément est présent mais que d'autres éléments peuvent également être présents. Dans le cas d'une séquence en acides aminés, la séquence en objet peut notamment comprendre en outre des acides aminés additionnels, du côté N-terminal ou C-terminal de ladite séquence, ces acides aminés additionnels permettant notamment de faciliter la caractérisation et/ou la purification de la protéine d'intérêt. Dans le cas d'une séquence nucléotidique, la séquence en objet peut notamment comprendre en outre des nucléotides additionnels, du côté 3' ou 5' de ladite séquence.
Par « constitué par » on entend qu'aucun autre élément que ceux qui sont mentionnés n'est présent. Cette limite inclut cependant d'éventuelles modifications post-traductionnelles de la protéine d'intérêt.
Par « présentant au moins 80% d'identité » on entend que lesdites séquences présentent au moins 80% d'identité après alignement global optimal, c'est-à-dire par alignement global entre deux séquences donnant le plus fort pourcentage d'identité entre elles. L'alignement global optimal de deux séquences peut notamment être réalisé selon l'algorithme de Needleman-Wunsch, bien connu de l'homme du métier (Needleman & Wunsch, « A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins », J. Mol. Biol., 48(3) :443-53). Les protéines selon l'invention comprennent, ou sont constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80%, avantageusement au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 après alignement global optimal. Avantageusement, les protéines selon l'invention comprennent, ou sont constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 après alignement global optimal.
Selon un aspect particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant au moins une séquence choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 sont préférées. Selon un autre aspect particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant :
- un acide aminé sérine en position 11
- et/ou un acide aminé acide aspartique en position 317
- et/ou un acide aminé acide aspartique en position 153
- et/ou un acide aminé histidine en position 320 sont préférées.
Selon un aspect encore plus particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant un acide aminé sérine en position 11, un acide aminé acide aspartique en position 317, un acide aminé acide aspartique en position 153 et un acide aminé histidine en position 320 sont préférées.
Selon un autre aspect particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'un fragment de séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant un acide aminé sérine en position 11 et/ou un acide aminé acide aspartique en position 317 et/ou un acide aminé acide aspartique en position 153 et/ou un acide aminé histidine en position 320 sont préférées.
Selon cet aspect, les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées, d'un fragment de séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique comportent au moins 50 acides aminés, de préférence au moins 100 acides aminés et plus préférentiellement au moins 150 acides aminés.
Par « acide chlorogénique » on entend l'ester simple de l'acide caféique et de l'acide quinique, aussi désigné par acide caféoylquinique ou trans-5-O-caféoyl-D- quinate, de formule (I) suivante :
(I)
Un acide dicaféoylquinique, abrégé en DCQ, est un diester composé d'une molécule d'acide quinique dont deux des quatre fonctions alcool ont été estérifiées par une molécule d'acide caféique. La formule générale des DCQ est la suivante (II), dans laquelle R2, R3, R4 et Rs représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe caféoyle ou un atome d'hydrogène à condition que au moins deux de R2, R3, R4 et Rs soit différent d'un atome d'hydrogène :
Par « acide isochlorogénique », également désigné par acide 3,5-0- dicaféoylquinique ou par « 3,5-DCQ », on entend un di-ester composé d'une molécule d'acide quinique dont les fonctions alcool 3 et 5 sont estérifiées par une molécule d'acide caféique, selon la formule (III) suivante. Le 3,5-DCQ est naturellement présent notamment dans un extrait de patate douce, Ipomoea batatas.
Par « capable de capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique », on entend une protéine qui, lorsqu'elle est placée dans des conditions réactionnelles adaptée, est capable de catalyser la formation de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique par la condensation de deux molécules d'acide chlorogénique, selon le schéma réactionnel décrit dans la Figure 1.
Plus particulièrement, une protéine selon l'invention est capable de convertir de façon majoritaire, et de préférence de façon exclusive ou quasi-exclusive, l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Encore plus particulièrement, l'activité catalytique telle que définie ci-dessus d'une protéine selon l'invention répond à une, deux, trois ou quatre des caractéristiques suivantes : a) Vmax (vitesse initiale maximale) comprise entre 60 et 240 nanomoles. s 1), b) Km (constante de Michaëlis) comprise entre 2 et 5 mM (vis-à- vis du CGA), c) pH optimal de fonctionnement compris entre 6 et 6,6 ; d) température optimale de fonctionnement comprise entre 39 et 41°C.
De façon encore plus particulière, l'activité catalytique telle que définie ci-dessus d'une protéine selon l'invention répond à une, deux, trois ou quatre des caractéristiques suivantes : a) Vmax (vitesse initiale maximale) de 7,18 micromol. Min 1 (soit 120 nanomoles. s 1) ; b) Km (constante de Michaëlis) de 3,5 mM (vis-à-vis du CGA) ; c) pH optimal de fonctionnement de 6,3 ; d) température optimale de fonctionnement de 39,9°C.
Selon un aspect plus particulier, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 95% d'identité avec SEQ ID N°1 et comprenant la séquence SEQ ID N°7, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Plus particulièrement, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant choisie parmi les enzymes dites « GDSL estérase/l ipase », et en particulier parmi les enzymes « GDSL estérase/l ipase » d 'Ipomoea, plus particulièrement parmi les enzymes « GDSL estérase/lipase » d 'Ipomoea batatas, et parmi les enzymes « GDSL estérase/lipase » de Solanacées, d'Astéracées et de Rubiacées.
Encore plus particulièrement, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, la séquence en acides aminés choisie SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et étant choisie parmi les enzymes « GDSL estérase/lipase » d 'Ipomoea batatas.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet une molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention, ladite molécule comprenant, ou étant constituée par, une séquence en acides nucléiques choisie parmi : SEQ ID N°2 et une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°2. Du fait de la dégénérescence du code génétique, différentes séquences d'acides nucléiques peuvent coder pour les protéines selon l'invention. Selon l'hôte choisi pour produire une protéine selon l'invention, la dégénérescence du code nucléique peut être utilisée pour que les codons de la séquence nucléotidique soient adaptés à l'usage des codons préférablement constaté chez l'hôte choisi, de façon à optimiser l'expression de la protéine d'intérêt dans la protéine hôte. Un homme du métier souhaitant produire une protéine recombinante dans une cellule hôte particulière, telle que par exemple une cellule de levure ou une cellule de plante, aura facilement accès aux codons optimaux, grâce à des logiciels facilement disponibles d'optimisation des codons. Plus particulièrement, l'invention a pour objet une molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention, ladite molécule comprenant ou étant constituée par une séquence en acides nucléiques choisie parmi : SEQ ID N°2 et une séquence présentant au moins 95% d'identité avec SEQ ID N°2.
Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle des moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte donnée. Un tel vecteur peut notamment être choisi parmi les plasmides, les chromosomes artificiels de levure (Yeast Artificial Chromosomes ou YACs), les vecteurs de type binaires (pBIN, pGW) et tout type de vecteur approprié en fonction de la cellule hôte choisie. Lesdits moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte sont bien connus de l'homme du métier. Par « moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte » on entend tout moyen permettant d'obtenir ladite protéine, notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication, et éventuellement un marqueur de sélection, lesdits moyens étant liés de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour la protéine d'intérêt. Un vecteur selon l'invention pourra comprendre en outre une séquence nucléotidique codant pour un moyen assurant l'exportation de la protéine produite dans le milieu de culture de la cellule hôte et/ou une séquence nucléotidique codant pour un moyen destiné à permettre la purification de la protéine produite. De tels moyens sont bien connus de l'homme du métier qui peut donc aisément les sélectionner et insérer, de manière fonctionnelles, lesdites séquences nucléotidiques. Pour assurer la purification de ladite protéine, l'un des moyens connus consiste en une étiquette histidine, ou série d'acides aminés histidine.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de levure ou sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de plante.
Les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de levure sont bien connus de l'homme du métier, ils sont notamment présents dans les vecteurs pPICZa, pPIC9K, pAOX815 commercialisés par la société ThermoFischer.
Les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de plante, et notamment dans une cellule de plante couramment utilisée pour la production de protéines exogènes, telles que les cellules de tabac, de riz, de tomate, ou de plante carnivore, sont également bien connus de l'homme du métier. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une cellule hôte comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'invention ou au moins un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte.
Plus particulièrement, l'invention concerne une cellule hôte choisie parmi les cellules de levure, en particulier les cellules de levure de la souche Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Komagataella sp. et Kluyveromyces lactis, et de préférence Pichia pastoris.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne une cellule hôte choisie parmi les cellules de plante, en particulier Nicotiana benthamiana Ipomoea batatas, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaiiana, Zea mays, riz, Coffea arabica, tomate, asteracées (chardons, artichauts) etc.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne une plante transgénique comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'invention, au moins un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, ou au moins une cellule hôte de plante selon l'invention. De préférence, l'invention concerne une plante transgénique comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'invention, au moins un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, ou au moins une cellule hôte de Nicotiana benthamiana Ipomoea batatas, Nicotiana tabacum , Arabidopsis thaiiana , Zea mays, riz, Coffea arabica, tomate ou asteracée selon l'invention.
Selon un deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'acide chlorogénique et d'une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour obtenir une composition enrichie en acide isochlorogénique.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'acide chlorogénique et d'une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour obtenir une composition enrichie en acide isochlorogénique, ledit procédé comprenant en outre :
- une étape préalable de culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine produite étant optionnellement purifiée, et/ou ledit acide chlorogénique est présent sous forme isolée ou dans une composition, ladite composition étant notamment un extrait végétal, et/ou
- une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne un procédé dans lequel ladite protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, est purifiée, préalablement à sa mise en contact, avec de l'acide chlorogénique. La purification est réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un procédé dans lequel, lors de la mise en contact de ladite protéine avec de l'acide chlorogénique, ladite protéine est présente dans une composition ou un mélange, notamment le milieu de culture, ou surnageant, d'une cellule hôte recombinante qui a produit ladite protéine.
Plus particulièrement, selon ce deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant en outre une étape préalable de culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l.
Par « conditions réactionnelles appropriées » on entend les différents paramètres permettant la réalisation de la réaction enzymatique menée par l'IbGDSL, qui catalyse la formation du 3,5-DCQ et de l'acide quinique (QA) par la condensation de deux molécules de CGA. La durée de la réaction est de préférence supérieure à 4 heures, de préférence comprise entre 4 et 60 heures, de préférence d'une durée de 50 heures. Le pH de la réaction est compris entre 5 et 7, et de préférence est de 6 ±0.5. La température de la réaction est comprise entre 30 et 40°C, et est de préférence de 35°C± 5°C. La concentration de GDSL par volume d'extrait végétal est comprise entre 0,5 mg/L à 10 mg/L, de préférence de 4,2mg de GDSL/L ± 3,4.
Selon un autre aspect particulier de ce deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant en outre une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.
Selon un aspect plus particulier de ce deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant les étapes de : i) culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ii) mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique, et iii) isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape ii).
Dans un procédé selon le deuxième objet de l'invention, ledit acide chlorogénique est présent soit sous forme isolée, soit dans une composition, ladite composition étant notamment un extrait végétal. Par « extrait végétal » on entend le résultat de l'extraction des principes actifs d'une plante, ou d'au moins une partie de plante, par fermentation, macération, décoction ou infusion. Ledit extrait végétal peut notamment être additionné sous la forme d'un liquide ou d'une poudre. De préférence, dans un tel procédé selon l'invention, un extrait végétal comprend au moins 5% de CGA. Un tel extrait végétal peut être choisi parmi les extraits végétaux de café, myrtille, tournesol, grande bardane, endives, artichaut, nèfle du Japon, pruneau, menthe, carotte, pomme de terre, pomme et poire.
L'invention concerne en outre un procédé de production d'acide isochlorogénique comprenant les étapes de : i) culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ii) mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique, et iii) isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape ii).
Selon un aspect particulier, un procédé production d'acide isochlorogénique selon l'invention comprend les étapes de : i) Culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte de Pichia pastoris capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture de cellules de P. Pastoris, ii) Mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique présent dans un extrait de café vert, et iii) Isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape ii).
Selon un autre aspect particulier, un procédé de production d'acide isochlorogénique selon l'invention comprend les étapes de :
• Mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, avec de l'acide chlorogénique présent dans un extrait de café vert, et
• Isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de la réaction précédente.
Par « café vert » on entend on entend les grains de plantes du genre Coffea avant cuisson ou torréfaction, notamment les grains des espèces Coffea canephora ou Coffea arabica. De préférence, par « café vert » on entend Coffea canephora.
Par « extrait de café vert » on entend un extrait obtenu par extraction solide / liquide dans de l'éthanol pour récupérer les métabolites contenus dans les grains de café vert séchés. L'éthanol utilisé est pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% d'alcool, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Optionnellement, la caféine est enlevée de l'extrait par un traitement avec de l'acétate d'éthyle ou un mélange acétate d'éthyle / hexane. L'extrait est réduit sous forme de poudre par la mise en œuvre de tout procédé adapté et connu de l'homme du métier, et notamment l'atomisation ou la lyophilisation.
Dans un extrait de café vert selon l'invention, l'acide chlorogénique est présent à une concentration minimale d'au moins 2 mM, de préférence au moins 5 mM, au moins 7,5 mM, de préférence 10 mM.
Selon un aspect encore plus particulier, un procédé de production d'acide isochlorogénique selon l'invention comprend les étapes de :
• Culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte de Pichia pastoris capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture de cellules de P. Pastoris
• Mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique présent dans un extrait de café vert, et
• Isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape précédente
Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet le produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, ledit procédé comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'un extrait de café vert dont la concentration en acide chlorogénique est supérieure à égale à 2mM, et d'une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi :
SEQ ID N°l,
Une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, Un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID N°1 et
Un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l.
Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet le produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, ledit procédé comprenant :
• Une étape de culture de P. pastoris transformée par un vecteur d'expression ayant intégré le gène codant pour la protéine IbGSDL de SEQ ID N°l, dans un milieu nutritif et des conditions appropriées, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture,
• La purification optionnelle de la protéine de SEQ ID N°l,
• La mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'un extrait de café vert dont la concentration en acide chlorogénique est supérieure à égale à 2mM, avec ledit surnageant de culture, ou optionnellement avec ladite protéine purifiée.
• Optionnellement une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.
Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une protéine, ladite protéine comprenant, ou étant constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ou d'une cellule hôte exprimant une telle protéine, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant mise en contact avec l'acide chlorogénique, dans des conditions réactionnelles appropriées, sans avoir été préalablement isolée de la cellule hôte ou du milieu de culture dans lequel la cellule hôte a été cultivée pour produire ladite protéine.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant mise en contact avec l'acide chlorogénique, dans des conditions réactionnelles appropriées, après avoir été préalablement isolée ou purifiée à partir de la cellule hôte ou du milieu de culture dans lequel la cellule hôte a été cultivée pour produire ladite protéine. Encore plus particulièrement, dans une utilisation selon l'invention ladite protéine, isolée de la cellule hôte ou purifiée à du milieu de culture, est ajoutée à une solution comprenant majoritairement, ou uniquement, de l'acide chlorogénique. Alternativement, dans une utilisation selon l'invention ladite protéine, isolée de la cellule hôte ou purifiée à du milieu de culture, est ajoutée à un extrait comprenant notamment de l'acide chlorogénique.
Selon un autre aspect particulier de ce troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une cellule hôte exprimant une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins une cellule de levure exprimant une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique. De préférence, ladite cellule de levure est une cellule de la souche Pichia pastoris transformée par un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte. Un tel vecteur est notamment choisi parmi les plasmides, les Yeast Artificial Chromosomes (YACs), les vecteurs de type binaires (pBIN, pGW) et tout type de vecteur approprié en fonction de la cellule hôte.
Selon un autre aspect particulier de ce troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une cellule hôte de plante exprimant une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
Description des figures et modes de réalisation
D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de réalisation nullement limitatif, et des figures annexées, dans lesquels :
La Figure 1 (Exemple 1) représente le schéma de la réaction enzymatique menée par l'IbGDSL, qui catalyse la formation du 3,5-DCQ et de l'acide quinique (QA) par la condensation de deux molécules de CGA.
Les Figures 2A et 2B (Exemple 1) représentent respectivement la détection de l'enzyme par un test western-blot réalisé en utilisant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'étiquette de six histidines en position C-terminale de la protéine, qui met en évidence la production l'IbGDSL (taille prédite de 40,1 kDa) par des plants de N. benthamiana (Figure IA) et des cellules de P. pastoris (Figure IB). Dans chacune des figures, la colonne 1 représente l'analyse menée sur l'hôte de production transformé avec le vecteur vide (témoin négatif) et la colonne 2 représente l'analyse menée sur l'hôte de production transformé avec le vecteur comprenant le gène d'intérêt.
Les Figures 3A, 3B et 3C (Exemple 2) représentent respectivement la concentration en 3,5-DCQ (en mM) (Fig. 3A et 3B), ou la vitesse de bioconversion en 3,5-DCQ (en micromoles/minutes) (Fig. 3C), en fonction du pH (Fig. 3A), de la température (Fig. 3B) ou de la concentration en substrat CGA (en mM) (Fig. 3C).
Les Figures 4A, 4B et 4C (Exemple 3) représentent respectivement les chromatogrammes du standard de 3,5-DCQ (Fig. 4A) et des réactions enzymatiques de conversion du CGA en 3,5-DCQ menées avec les surnageants de culture de P. pastoris transformée avec le vecteur vide (Fig. 4B) ou transformée avec le vecteur portant le gène codant l'IbGDSL (Fig. 4C) après 3 jours d'induction au méthanol. Les pics avec un temps de rétention à 3,2 minutes et à 8,3 minutes correspondent respectivement au CGA (m/z neg 353) et au 3,5-DCQ (m/z neg 515).
Les Figures 5A et 5B (Exemple 3) représentent les chromatogrammes des réactions de bioconversion de l'acide chlorogénique en 3,5-DCQ via l'ajout du substrat directement dans les cultures de P. pastoris transformées soit avec le vecteur vide (Fig. 5A) soit avec le vecteur portant le gène codant l'IbGDSL (Fig. 5B). Dans chacune des figures, de haut en bas et avec un décalage vers la droite, se trouvent respectivement, les chromatogrammes correspondant respectivement à T0 avant l'ajout de CGA, 6 heures après l'ajout de CGA et 120 heures après l'ajout de CGA. Les pics avec un temps de rétention à 3,2 minutes et à 8,3 minutes correspondent respectivement au CGA (m/z neg 353) et au 3,5-DCQ (m/z neg 515).
Les Figures 6A et 6B (Exemple 3) représentent respectivement, en fonction du temps de réaction (en heures), le taux de conversion de CGA pur en 3,5-DCQ (en % molaire) (Fig. 6A) ou la concentration en 3,5-DCQ (en mg/L) (Fig. 6B). La limite théorique à 50% correspond au rendement maximal obtenu lorsque toutes les molécules de CGA sont transformées en 3,5-DCQ (rendement stoechiométrique de 2 pour 1 respectivement). Figure 6A : courbes avec triangles (CGA 5 mM ou 1,9 g/L), croix claires (CGA 7,5 mM ou 2,6 g/L), croix foncées (CGA 9 mM ou 3,2 g/L), carrés foncés (CGA 10 mM ou 3,6 g/L), carrés clairs (CGA 15 mM ou 5,5 g/L). Figure 6B : courbes avec triangles (CGA 5 mM ou 1,9 g/L), croix claires (CGA 7,5 mM ou 2,6 g/L), traits (CGA 9 mM ou 3,2 g/L), carrés foncés (CGA 10 mM ou 3,6 g/L), carrés clairs (CGA 15 mM ou 5,5 g/L).
La Figure 7A (Exemple 4) représente un chromatogramme montrant la composition en dérivés d'acide caféique d'un extrait hydro-alcoolique de café vert, avec : pic 1 : MCQ1 (autre isomère d'acide mono-caféoylquinique) , pic 2 : MCQ2 (autre isomère d'acide mono-caféoylquinique) , pic 3 : CGA (acide chlorogénique, acide 5-O-caféoyl quinique) ; pic 4 : CA (acide caféique) ; pic 5 : MFQ (acide monoferuloyl quinique) ; pic 7 : 4,5-DCQ (acide 3,4 dicaféoyl quinique) ; pic 8 : 3,5-DCQ (acide 3,5 dicaféoyl quinique) ; pic 9 : 3,4-DCQ (acide 4,5 dicaféoyl quinique).
La Figure 7B (Exemple 4) représente un chromatogramme d'un extrait hydro alcoolique de café vert obtenu avant (trace noire) et après 50h (trace claire) de bioconversion par l'IbGDSL, dans l'extrait de café vert ; la concentration de substrat initiale est équivalente à 10 mM de CGA. Pic 1 : MCQ ; pic 2 : CGA ; pic 3 : MFQ ; pic 4 : 4,5-DCQ ; pic 5 : 3,5-DCQ ; pic 6 : 3,4-DCQ. La différence des traces claire et noire est notamment visible au niveau du pic 5 : 3,5-DCQ.
La Figure 8 (Exemple 4) représente la teneur en DCQ (mg/L) obtenue pour différentes concentrations d'extrait de café vert, exprimées en équivalent CGA, en fonction du temps de réaction (en heures). Le surnageant de milieu de culture de P. pastoris contenant l'enzyme GDSL a été concentré 37 fois. Courbe avec trait continu (CGA 1 mM), ronds clairs (CGA 3,5 mM), losanges (CGA 5 mM), carrés foncés (CGA 10 mM).
La Figure 9 (Exemple 4) représente la teneur en 3,5-DCQ (mg/L) mesurée dans un extrait de café vert bioconverti par une suspension cellulaire de P. pastoris exprimant l'IbGDSL (GDSL+) ou ne l'exprimant pas (GDSL-), en fonction du temps (en jours). La Figure 10 (Exemple 4) représente la teneur en 3,5-DCQ (mg/L) obtenue par bioconversion enzymatique par IbGDSL d'une solution de café vert contenant 5 mM de CGA, en fonction du temps (en heures) lorsque le surnageant de milieu de culture de P. pastoris contenant l'enzyme GDSL a été concentré 10 fois (ronds), 20 fois (triangles) ou 37 fois (carrés).
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples 1 à 4 suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Identification, production et caractérisation d'une enzyme recombinante GDSL d'Ipomoea batatas.
1.1. Matériel et méthodes
Une banque d'ADN complémentaire d' batatas a été préparée selon le protocole décrit dans WO2013/178 705 à partir de racines issues de plants cultivés en conditions aéroponiques riches en 3,5-DCQ. En parallèle, la fragmentation d'un extrait protéique complexe issu d'un tubercule d Ί. batatas riche en 3,5-DCQ a été effectuée afin de sélectionner étape par étape les protéines présentant une activité d'acide isochlorogénique synthase. A la fin de cette expérimentation, des profils SDS-PAGE ont été obtenus et les protéines observées ont été séquencées. 400 peptides ont été obtenus et leur séquence en acides aminés a été alignée avec la banque d'ADNc d' batatas à l'aide du programme tBIastn qui compare une séquence peptidique aux produits de traduction d'une séquence nucléotidique. Ainsi, les séquences présentant de fortes homologies avec les peptides séquençés ont été détectées parmi toutes les séquences composant le transcriptome du tissu.
Après avoir identifié une séquence candidate à partir de la banque d'ADNc, sa séquence codante a été isolée à partir d'une extraction d'ARN messagers totaux convertis en ADNc. Pour cela, les ARNm de racines d' batatas cultivées en conditions aéroponiques ont été extraits à l'aide d'un kit d'extraction commercial spécifique aux tissus végétaux selon les instructions du fournisseur (RNeasy® Plant Mini Kit -QIAGEN). Après avoir dosé et vérifié la qualité des ARNm extraits, l'ADNc codant la protéine candidate a été amplifié à l'aide, d'une part, d'amorces spécifiques à la séquence, dessinées de telle manière à rajouter une étiquette de six histidines en position C-terminale de la protéine, nécessaire à sa détection après production et à sa purification, et, d'autre part, d'un kit commercial permettant en une seule étape la conversion des ARNm en ADNc et l'amplification de la séquence par PCR (Polymerase Chain Reaction) (SuperScript™ III One-Step RT- PC R System with Platinum™ Taq High Fidelity DNA Polymerase - INVITROGEN). L'amplicon obtenu a ensuite été cloné dans un vecteur commercial basique (pCR™8/GW/TOPO™- INVITROGEN) permettant son séquençage et son intégration dans plusieurs vecteurs dédiés à divers systèmes d'expression.
L'alignement de peptides sur la banque d'ADNc d 'Ipomea batatas a permis d'identifier un gène codant une GDSL estérase/l ipase parmi tous les transcrits séquencés. Les séquences peptidique et nucléotidique codant pour IbGDSL sont respectivement SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Le gène codant pour IbGDSL est intégré par la suite dans un vecteur d'expression dédié aux cellules végétales par recombinaison homologue. Au moment de l'amplification du gène, une étiquette (en anglais : « tag ») composée de 6 histidines est rajoutée à la fin du gène pour avoir après transcription et traduction une protéine marquée en C-terminal. Cette étiquette permet une purification aisée de la protéine par chromatographie d'affinité.
Ce vecteur est ensuite introduit dans Agrobacterium tumefaciens de souche EHA105 capable de transfecter un ADN d'intérêt dans les cellules végétales selon la méthode de congélation et décongélation décrite dans le travail de Chen et al (« Enhanced recovery of transformants of Agrobacterium tumefaciens after freeze-thaw transformation and drug sélection. » BioTechniques 16 (4) : 664-68, 1994). Les bactéries ayant intégré le vecteur auront acquis en même temps une résistance à un antibiotique permettant ainsi leur sélection parmi les bactéries non transformées en présence de cet agent antibiotique.
Pour la transformation transitoire de N. benthamiana, les agrobactéries portant le vecteur recombinant sont mises en culture dans 15 mL de milieu nutritif additionné de l'antibiotique de sélection et sont incubées à 28°C sous agitation à 200rpm pendant 24 heures. Le lendemain, 3 heures avant la transformation, 100 mM d'acétosyringone sont ajoutés aux cultures d 'a g ro bactéries pour activer leur virulence. Après ce laps de temps, les bactéries sont centrifugées et reprises dans du milieu nutritif une à deux fois pour éliminer les antibiotiques et à la fin, reprises dans le tampon d'infiltration à pH 5,6 (MES 10 mM, acétosyringone 100 mM). La D06oonm (densité optique) de la suspension bactérienne est ajustée à 0.5.
Les parties aériennes des plusieurs pieds de N. benthamiana âgés de 3-4 semaines cultivés en chambre de culture avec une photopériode de 16 h/8 h jour/nuit sous lumière artificielle (70 pmol m -2 s -1) à 26 °C avec 70 % d'humidité sont intégralement immergées dans la solution d'agrobactéries et soumises à une infiltration sous vide dans une cloche reliée à une pompe. Une étape de dépression est réalisée jusqu'à 20 mbar pour provoquer l'entrée des agrobactéries dans les tissus avant le rétablissement aux conditions de pression atmosphérique. Les plants de N. benthamiana sont ensuite replacés en culture dans les mêmes conditions environnementales décrites précédemment pendant 6 jours. C'est durant ce lapse de temps que les agrobactéries transfecteront l'ADN d'intérêt correspondant au gène de l'IbGDSL dans les cellules végétales et que la protéine sera produite par les machineries de transcription et de traduction des cellules de l'hôte.
La confirmation de la production de la protéine par ce système a été déterminée par western-blot utilisant un anticoprs dirigé spécifiquement contre l'étiquette composée de 6 histidines ajoutée en position C-terminale de la protéine (Fig. 2A).
En parallèle, le gène codant la protéine est intégré dans un vecteur d'expression dédié à P. pastoris par recombinaison homologue. Ce vecteur permet l'expression et la sécrétion de la protéine dans le milieu de culture en présence de méthanol. Le protocole classique de transformation de P. pastoris utilisé dans ce travail est décrit dans Cregg et Russell (« Transformation ». In Pichia Protocols, édité par David R. Higgins et James M. Cregg, 27-39. Methods in Molecular Biology™. Totowa, NJ: Humana Press. https://doi.Org/10.1385/0-89603-421-6:27, 1998). La confirmation de la production de l'enzyme a été menée comme décrit précédemment par western blot (Fig. 2B). 1.2. Résultats
Les résultats montrent que, après avoir transformé les hôtes de production, l'enzyme a été détectée par western-blot dans un extrait de protéines totales issu des feuilles de N. benthamiana agroinfiltrées et dans le surnageant de levures génétiquement transformées. Ainsi, contrairement au témoin négatif (Fig. 2A puits 1) une bande aux alentours de 40 kDa est observée pour les tissus de N. benthamiana agroinfiltrés depuis 6 jours avec le gène codant l'IbGDSL (Fig. 2A puits 2). De même, la culture de P. pastoris transformée par le gène de l'IbGDSL a produit et sécrété l'enzyme dans le milieu de culture en 3 jours (Fig. 2B puits 2) contrairement au témoin négatif transformé avec le vecteur vide (Fig. 2A puits 1).
Exemple 2 : Caractérisation de l'activité catalytique d'IbGDSL recombinante purifiée.
Les tests enzymatiques in vitro sont menés sur l'enzyme recombinante purifiée produite dans un système végétal. Après 6 jours de co-culture, les feuilles de N. benthamiana agro-infiltrées avec le vecteur portant le gène d'intérêt, sont récoltées et broyées dans un tampon d'extraction (20 mM sodium phosphate, 0,5 M NaCI, pH 7,4). L'extrait est ensuite centrifugé et le surnageant dans lequel se trouve la totalité des protéines solubles dont l'IbGDSL est récupéré et stérilisé par filtration 0,2 pm. La purification de la protéine est ensuite menée selon les instructions du fournisseur sur des colonnes de Nickel (HisTrap HP-GE HEALTHCARE). La fraction d'élution récupérée après purification contenant la protéine est concentrée et dessalée sur des unités de centrifugation avec un seuil de coupure à lOkDa (Amicon® Ultra 0,5 mL Centrifugal Filters -PMNL lOkDa - MILLIPORE).
Les tests enzymatiques sont effectués dans un volume de 50 pl avec 200 à 400 ng de la protéine purifiée (soit quelques pl). Le pH réactionnel optimal sera déterminé à l'aide d'un polytampon (0,1 M Tris/20 mM MES/ 0,1 M acide acétique) à partir duquel une gamme de 4 à 9 en pH sera construite. Une solution mère d'acide chlorogénique (CGA) à 100 mM est préparée peu avant les expérimentations à partir d'une poudre de CGA avec un niveau de pureté supérieur à 99% diluée dans le polytampon à pH 6,5. Après chaque réaction, 150 mI d'éthanol absolu sont rajoutés aux 50 mI réactionnels pour stopper la réaction et extraire les molécules produites présentes dans la réaction. L'essai est ensuite centrifugé et le surnageant est récupéré pour analyses en UPLC-MS.
L'appareil utilisé pour l'étape d'analyse est une UPLC Shimadzu Nexera X2 (les pompes LC-30AD, passeur d'échantillon SIL-30AC, four CTO-20A, détecteurs à barrette de diodes SPD-M20A ; Kyoto, Japon) fonctionnant en phase inverse avec une colonne Kinetex Biphenyl (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) de dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm. La phase mobile est constituée d'un solvant A (Eau ultrapure Mili-Q, Merck Millipore +0.1% d'acide formique, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et d'un solvant B (Acetonitrile, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) dont le gradient a été programmé de la façon suivante : phase B (%) 5-25% (0-10 min) ; 25-90% (10-10,5 min) ; 90% (10,5- 12 min), 90-5% (12-12,1 min), 5% (12,1-14,1 min). Le débit d'analyse est de 0,5 mb/min avec une température de four de 40°C. En sortie de colonne, un détecteur à barrettes de diodes enregistre les spectres UV entre 220 et 370 nm. L'appareil est couplé à un spectromètre de masse (Shimadzu LCMS-2020) fonctionnant avec une ionisation par électrospray (4,5 kV) en mode négatif dans une gamme de m/z entre 100 et 1000. Le logiciel LabSolutions (version 5.60 SP2) est utilisé pour exploiter le système.
La quantification en 3,5-DCQ se fait grâce à la mesure de l'aire du pic d'un standard de 3,5-DCQ à 330 nm. Le standard 3,5-DCQ est préparé à la concentration de 100 mg/L dans un mélange DMSO/eau selon le ratio 70/30 et acidifié au pH 3 avec de l'acide chlorhydrique. Les teneurs des autres composés (acide chlorogénique et les autres isomères de DCQ) sont exprimées en équivalents de 3,5-DCQ. La teneur est calculée selon la formule suivante pour un composé :
Teneur en 3,5
(aire du pic correspondant au 3,5 - DCQ à 330 nm de l' échantillon) 100 (aire du pic correspondant au 3,5 - DCQ à 330 nm de la solution standard )
Le 3,5-DCQ est utilisé comme standard de quantification pour les différents composés 3,4-DCQ et 4,5-DCQ car ces derniers appartiennent à la même famille de molécules. Les expérimentations visant à déterminer les paramètres physicochimiques indispensables à l'IbGDSL pour convertir du CGA en 3,5-DCQ ont été menées sur l'enzyme purifiée produite dans le système d'expression végétal.
L'IbGDSL est une estérase/lipase capable de condenser deux molécules de CGA en 3,5-DCQ en transférant le groupement caféoyl d'une molécule de CGA sur une autre molécule de CGA (Fig. 1). Par conséquent, le CGA est utilisé ici comme donneur d'acyl. L'ajout d'acide caféique dans le milieu réactionnel ne favorise pas la formation de 3,5-DCQ.
Une gamme de pH entre 4 et 9 a été établie afin de déterminer le pH optimal pour la conversion du CGA en 3,5-DCQ grâce à l'IbGDSL. Sur une réaction de 50pl, une quantité fixe d'IbGDSL purifiée est mise en contact avec une concentration fixe de lOmM du CGA à des conditions de pH différentes établies par le polytampon. La réaction est incubée pendant 30 minutes à 25°C et stoppée avec de l'éthanol. La courbe obtenue a permis de déterminer que le pH réactionnel optimal est situé entre 6 et 7 (Fig. 3A).
Pour déterminer la température réactionnelle optimale pour la conversion du CGA en 3,5-DCQ grâce à l'IbGDSL, une gamme de température a été établie entre 15 et 45°C. Avec une quantité fixe d'IbGDSL purifiée, une concentration fixe de lOmM de CGA et le polytampon à un pH 6,5, la température optimale à la conversion est estimée entre 34 et 41°C, avec un maximum à 37°C (Fig. 3B).
Une gamme de concentration de CGA a été établie afin de déterminer le seuil de concentration du substrat à partir duquel une inhibition de l'activité de l'IbGDSL par le produit est observée. Avec une quantité d'enzyme fixe et un pH établi à 6.5, un ralentissement de l'activité enzymatique est observé à partir de la concentration 10 mM de CGA après 30 minutes d'incubation à 36°C (Fig. 3C).
Exemple 3 : Caractérisation de l'activité d'IbGDSL recombinante présente dans le surnageant de culture de P. pastoris
La bioconversion de CGA en 3,5-DCQ in vivo passe par l'établissement d'une culture de P. pastoris métaboliquement très active. Les levures sont mises en culture dans le milieu nutritif contenant un tampon composé de lOOmM potassium phosphate avec un pH ajusté à pH 6.0. Celui-ci permet de maintenir à un pH 6 le milieu dans lequel seront en contact l'enzyme obtenue à partir des cellules microbiennes et le substrat. Après avoir établi un inoculum de 25 ml de culture de levure pendant une nuit à 30°C sous agitation de 250-300 rpm, celui-ci est utilisé pour inoculer un volume de 100-200 ml de milieu nutritif de telle manière à obtenir une D06oonm aux alentours de 1. Dans cette culture est ajouté 0,5% de méthanol afin d'initier la production d'IbGDSL. L'ajout de méthanol est à renouveler toutes les 24 heures pour maintenir le niveau d'induction de la production de la protéine. Trois jours après l'établissement de cette culture, le CGA est rajouté directement dans le milieu de telle manière à établir une concentration finale de lOmM.
La première étape de cette expérimentation est de montrer si l'IbGDSL produite par P. pastoris est capable de convertir le CGA en 3,5-DCQ sachant que l'enzyme d'origine pourrait être potentiellement glycosylée trois fois et que les arbres glycaniques générés par P. pastoris ne sont pas composés et organisés de la même façon que les arbres glycaniques de plante. Ces différences pourraient influencer directement la stabilité et empêcher la bonne activité de l'enzyme. Pour ce faire, les surnageants de deux cultures de P. pastoris, l'une transformée avec le vecteur vide (témoin négatif) et l'autre avec le vecteur portant le gène codant l'IbGDSL ont été récupérés après 3 jours d'induction au méthanol. Ces surnageants ont été incubés à des conditions de pH de 6,5 avec lOmM d'acide chlorogénique pendant 30 minutes à 36°C. La réaction enzymatique est ensuite stoppée avec l'ajout d'éthanol et analysée en UPLC-MS.
Les résultats obtenus démontrent que contrairement au témoin négatif (Fig. 4B) le surnageant dans lequel a été sécrétée l'IbGDSL présente un pic avec le même temps de rétention (8,3 min) et la même masse (m/z neg 515) (Fig. 4C) que le standard de 3,5-DCQ (Fig. 4A). L'enzyme synthétisée par ce système d'expression hétérologue microbien est donc bien fonctionnelle malgré certaines différences au niveau post-traductionnel. Il faut prendre en compte que l'incubation n'a duré que 30 minutes ce qui pourrait expliquer la faible intensité du pic.
La seconde étape de cette expérimentation est de montrer si le CGA directement rajouté dans le milieu de culture de P. pastoris exprimant l'enzyme pourrait être directement converti en 3,5-DCQ. L'objectif est de s'affranchir au besoin de l'étape de purification de l'enzyme.
Après avoir induit l'expression de la protéine avec du méthanol pendant 3 jours, le CGA est ajouté directement dans la culture dont le pH est tamponné à 6 à une concentration finale de lOmM et laisser en contact avec les cellules microbiennes pendant 3 jours. Cette expérimentation a été menée à 30°C, température idéale pour la culture et la croissance de l'organisme P. pastoris.
Le surnageant est ensuite analysé en UPLC-MS. Les résultats obtenus présentés dans la Figure 5B montrent que la culture de P. pastoris exprimant l'IbGDSL est capable de convertir le CGA en 3,5-DCQ en 3 jours avec une très grande efficacité. En effet, nous avons estimé un rendement de bioconversion aux alentours de 44%, la limité stoechiométrique maximale étant 50% puisqu'il faut deux molécules de CGA pour former une molécule de 3,5-DCQ.
Nous avons démontré que le CGA peut être ajouté indifféremment tous les jours, ou en début de phase d'induction, ou en fin de phase d'induction, sans affecter le taux de conversion final obtenu.
Les cinétiques de conversion du CGA pur en 3,5 CDQ ont été établies (Fig. 6A) en fonction des concentrations de départ en CGA. Après 50 heures de bioconversion, on constate qu'un rendement maximum de 32% est obtenu pour les deux concentrations 5 et 7,5 mM. Les concentrations supérieures à 7,5 mM testées ici dégradent les rendements finaux en 3,5-DCQ.
Les teneurs en 3,5 CDQ mesurées à l'issue des 50 heures de bioconversion montrent des quantités maximales de l'ordre de 1,2 g/L pour des concentrations en CGA pur de départ de 7,5 et 9 mM (Fig. 6B).
Exemple 4 : Bioconversion de l'acide chlorogénique d'un extrait de café vert en 3,5-DCQ par le surnageant de culture de cellules de P. pastoris exprimant l'IbGDSL, sécrétée dans ledit milieu de culture
La réaction de bioconversion du CGA en 3,5-DCQ a également été réalisée à partir d'un extrait de café vert ( Coffea canephora ) dont la composition est indiquée en Fig. 7A. Cet extrait de café vert, comprenant une concentration en CGA équivalente à 10 mM et bioconverti sur une période de 50 heures, à 30°C et à un pH de 6, a conduit à un nouvel extrait dont la composition est présentée sur la Fig. 7B. On constate que l'IbGDSL catalyse exclusivement la formation du 3,5- DCQ, à l'exclusion de tout autre isomère. Par ailleurs, aucun autre substrat contenant un acide caféique que l'acide chlorogénique n'est biotransformé car on n'observe pas de diminution des pics à l'exception de celui correspondant au CGA. La bioconversion de l'extrait de café vert avec la IbGDSL permet de multiplier par 4,5 la teneur en 3,5-DCQ initialement présente dans l'extrait (200 mg/L à To et 900 mg à Tsoh) pour une concentration de départ en CGA équivalente à 10 mM.
Une bioconversion du CGA en 3,5-DCQ, à partir de l'extrait de café vert, a été réalisée après 4 et 7 jours, dans l'objectif d'analyser l'effet d'une réaction à la GDSL se déroulant sur un temps long (Fig. 9). On constate que la teneur mesurée en 3,5-DCQ n'augmente pas entre le 4ème et le 7ème jour et il n'y a donc pas d'intérêt particulier à réaliser des fermentations longues. La concentration de l'enzyme IbGDSL obtenue par fermentation de P. pastoris permet d'accélérer la vitesse de réaction de la conversion de CGA en 3,5-DCQ (Fig. 10). On constate que le même niveau de concentration en 3,5-DCQ peut-être obtenu pour des facteurs de concentration en enzyme de 10, 20 et 37 fois après 60 h de bioconversion. En conclusion, l'enzyme IbGDSL recombinante obtenu par des cultures de P. pastoris constitue un catalyseur efficace permettant d'obtenir du la conversion de l'acide chlorogénique en 3,5-DCQ en grande quantité, soit en convertissant de l'acide chlorogénique pur, soit en transformant un extrait végétal contenant naturellement de l'acide chlorogénique tel qu'un extrait de café vert.

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi :
SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID
N°1 et un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
2. Protéine selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les enzymes GDSL estérase/l ipase, en particulier une enzyme GDSL esté ra se/ 1 ipase d'Ipomoea.
3. Protéine selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les enzymes GDSL estérase/l ipase d'ipomoea batatas.
4. Molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'une des revendications précédentes.
5. Molécule isolée d'acide nucléique selon la revendication 4, ladite molécule comprenant ou étant constituée par une séquence en acides nucléiques choisie parmi : SEQ ID N°2 et une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°2.
6. Vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 4 ou 5, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte.
7. Cellule hôte comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'une des revendications 4 ou 5 ou au moins un vecteur selon la revendication 5.
8. Cellule hôte selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules de levure, en particulier de souche Pichia pastoris, ou parmi les cellules de plante, en particulier Nicotiana benthamiana.
9. Procédé de production d'acide isochlorogénique comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'acide chlorogénique et d'une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi :
SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID
N°1 et un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour obtenir une composition enrichie en acide isochlorogénique.
10. Procédé selon la revendication 9, comprenant en outre : une étape préalable de culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID N°1 et un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine produite étant optionnellement purifiée, et/ou ledit acide chlorogénique est présent sous forme isolée ou dans une composition, ladite composition étant notamment un extrait végétal, et/ou une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel :
• Ladite protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID N°1 et un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, est produite puis exportée dans le surnageant de culture par des cellules de P. Pastoris, et
• Ledit acide chlorogénique est présent dans une composition qui est un extrait de café vert.
12. Produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 9 à 11, ledit procédé comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'un extrait de café vert dont la concentration en acide chlorogénique est supérieure à égale à 2 mM, et d'une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi :
SEQ ID N°l,
Une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, Un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID N°1 et
Un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l.
13. Produit selon la revendication 12, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
• Une étape de culture de P. pastoris transformée par un vecteur d'expression ayant intégré le gène codant pour la protéine IbGSDL de SEQ ID N°l, dans un milieu nutritif et des conditions appropriées, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture,
• La purification optionnelle de la protéine de SEQ ID N°l,
• La mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'un extrait de café vert dont la concentration en acide chlorogénique est supérieure à égale à 2 mM, avec ledit surnageant de culture, ou optionnellement avec ladite protéine purifiée.
• Optionnellement une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.
14. Utilisation d'au moins une protéine, ladite protéine comprenant, ou étant constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi :
SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, - un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID
N°1 et un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ou d'une cellule hôte exprimant une telle protéine, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.
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