WO2015177464A1 - Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes - Google Patents

Production commerciale de l'allergène amb a1 par expression transitoire chez les plantes Download PDF

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WO2015177464A1
WO2015177464A1 PCT/FR2015/051319 FR2015051319W WO2015177464A1 WO 2015177464 A1 WO2015177464 A1 WO 2015177464A1 FR 2015051319 W FR2015051319 W FR 2015051319W WO 2015177464 A1 WO2015177464 A1 WO 2015177464A1
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amb
pectate lyase
plant cell
plant
identity
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PCT/FR2015/051319
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Véronique GOMORD
Anne-Catherine FITCHETTE
Virginie CATALA
Loïc FAYE
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Angany Genetics
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Publication date
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    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/55—Vectors comprising a special origin of replication system from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a plant cell comprising a DNA molecule comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of a pectate lyase chosen from Amb a 1, the alpha subunit of Amb a 1, the subunit beta unit of Amb a 1, and homologs of Amb a 1, operably linked to a strong promoter.
  • the invention also relates to a process for producing pectate lyase using the plant cell.
  • Ragweed in particular Ambrosia artemisiifolia, is an annual plant, which belongs to the family Tubuliflores (or Asteraceae). This wild plant, native to North America, blooms from late summer until autumn. Its pollen has a very high allergenic power. Thus, ragweed is the leading cause of pollen allergy in the United States, with about 30 million people out of 40 million suffering from pollinosis. Introduced involuntarily in France in the nineteenth century, ambrosia is a highly invasive plant that has rapidly progressed from the Rhône- Switzerland region to the north of France. Thus, in 2011, ambrosia plants were found in the Ile de France. The pollen of this plant causes in susceptible persons an allergic reaction characterized by its severity.
  • allergic rhinitis to ragweed is much more severe than that caused by other pollen. Symptoms such as pruritus, anosmia (loss or diminished sensitivity to smell), rhinorrhea, sneezing, and nasal obstruction are more important. In addition, in 50% of cases, this allergy evolves into asthma, often more severe than that caused by other pollen. These symptoms are all the more pronounced as the rate of pollen in the air is high.
  • ragweed allergy now affects 6 to 12% of the population between late August and early September.
  • the total number of consumers of ragweed antiallergic drugs increased significantly (+ 60%) between 2008 and 2011, from 161,200 to 258,700 people, and the health care costs generated by this allergy. between 5.6 and 8.6 million euros.
  • Allergy to ragweed therefore represents a real public health problem today.
  • the simplest way to protect yourself from the risks of allergy is to avoid pollen exposures ambrosia, but a total eviction seems impossible already despite prefectural decrees making obligatory the destruction of ambrosia. These measures have not stopped the spread of this invasive plant in many areas.
  • Treatments called “symptomatic” either locally (drops, eye drops, sprays) or by the general route (tablets, capsules), help relieve symptoms during the period when pollen is present in the air. But the symptoms come back soon after stopping treatment.
  • allergen immunotherapy or desensitization
  • This therapeutic way makes it possible to treat the cause of the allergy contrary to the so-called “symptomatic” drugs.
  • the extracts used today for the desensitization of patients allergic to ambrosia are of insufficient quality for this treatment to be effective.
  • ragweed allergens have been characterized, in particular Amb a 1, which is responsible for more than 80% of cases of ragweed allergy.
  • Amb a 1 is a complex plant protein with typically vegetable post-translational maturations, and only a plant expression system will be able to produce this allergen in a usable and effective form in allergen immunotherapy.
  • allergen Amb a 1 although toxic in vivo, in recombinant form is possible, by transient expression in plants.
  • This production which is done in a plant cell, makes it possible to obtain allergen Amb a 1 in mature and active form, with a good yield, in a very simple and reproducible way.
  • Amb 1 allergen obtained is not contaminated with proteases and / or other plant-based contaminants. The inventors have thus been able to obtain a production, at commercially acceptable levels, of allergen Amb a 1.
  • the subject of the invention is therefore a plant cell comprising a DNA molecule comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of a pectate lyase chosen from Amb a 1, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1, and homologs of Amb a 1, operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter.
  • a strong promoter preferably a 35S promoter.
  • said plant cell is a Nicotiana benthamiana cell.
  • the plant cell according to the invention comprises a DNA molecule comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of pectate lyase operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter, said molecule of DNA not being integrated into the genome of the plant cell.
  • a strong promoter preferably a 35S promoter
  • pectate lyase chosen from Amb al, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1, and the homologues of Amb a 1 are called "pectate lyase according to the invention" in the this request.
  • the subject of the invention is also a plant comprising at least one plant cell according to the invention.
  • Another object of the invention is to provide a process for producing a pectate lyase according to the invention, comprising the expression of said pectate lyase in a plant cell according to the invention, or in a plant comprising such a cell.
  • the pectate lyase obtainable by the method according to the invention, with a plant cell according to the invention, or with a plant according to the invention.
  • the pectate lyase thus obtained can be used as a medicament. It can also be used in allergic immunotherapy alone or in combination with at least one other Asteraceae allergen. It can also be used in the diagnosis of allergies, and be integrated in an allergy diagnostic kit.
  • the plant cell according to the invention comprises a DNA molecule operably linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter.
  • a strong promoter preferably a 35S promoter.
  • transient expression allows the expression of said DNA molecule in transient form, ie without integration of the DNA, in particular the cDNA, into the genome of the plant cell.
  • the use of the transient expression in a plant cell or a plant according to the invention makes it possible to increase the yields of production of the pectate lyase according to the invention in active form up to high levels compatible with a commercial exploitation, but incompatible with the survival of a plant that would express these stably poisonous pectates lyases.
  • transient expression harvesting of the plant biomass takes place during peak expression of the recombinant protein, ie typically 4 to 6 days after transfection.
  • the plant cell according to the invention comprises an expression vector comprising at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of a pectate lyase according to the invention operatively linked to a strong promoter, preferably a 35S promoter.
  • Amb a 1 is a pectate lyase from Ambrosia artemisiifolia. Recognized by more than 80% of patients sensitized to ragweed, this allergen is responsible for more than 90% of the allergenic activity of ragweed pollen. It is a 38 kDa protein described as unglycosylated belonging to the pectate lyase family. Twelve isoforms of Amb a 1 are listed, from Amb a 1.0101 to Amb a 1.0502 (from www.allergome.org).
  • Table 1 The twelve isoforms of Amb a 1, their nucleic and protein sequences
  • Amb a 1 the twelve isoforms mentioned above in Table 1 above.
  • the protein sequences described in Table 1 correspond to the preproproteins of the different isoforms.
  • Amb a 1 undergoes proteolysis in the pollen grain and / or during the extraction or purification process resulting in two chains, alpha (26 kDa) and beta (12 kDa), non-covalently associated (King et al. , 1974, 1981). It has been shown that chemical modifications of Amb a 1, including the reduction and alkylation of disulfide bridges as well as the process of denaturation / renaturation by urea or succinylation of lysine residues, reduce its reactivity to IgE (King, 1976, Smith et al, 1988). The alpha and beta subclones of Amb a 1 have a different reactivity on IgE and T cells. In fact, Amb a 1 beta contains a large number of IgE-binding epitopes, whereas Amb has 1 alpha. Behaves like a hypoallergen and stimulates the activity of T cells.
  • Amb has the protein sequence SEQ ID NO: 7 (preproprotein).
  • the beta subunit has the protein sequence SEQ ID NO: 8.
  • the alpha subunit has the protein sequence SEQ ID NO: 9.
  • homologs of Amb a 1 proteins of the Asteraceae family which have at least 57% identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the isoforms of Amb has 1.
  • the homolog of Amb a 1 is a plant protein of the genus Ambrosia or Artemisia, more preferably Artemisia vulgaris, Ambrosia psilostachya or Ambrosia trifida, which has at least 57% identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the isoforms of Amb has 1.
  • the homologue of Amb a 1 is selected from Amb p 1 (from Ambrosia psilostachya, accession code 9064 on www.allergome.org) and Art v 6 (from Artemisia vulgaris, accession number A0PJ16 in Uniprot).
  • percent identity between two amino acid sequences in the sense of the present invention, it is meant to designate a percentage of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistics and the differences between the two sequences being randomly distributed and their entire length.
  • best alignment or “optimal alignment” is meant the alignment for which the percentage of identity determined as hereinafter is the highest.
  • Sequence comparisons between two amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being performed by segment or by "comparison window” to identify and compare the local regions of sequence similarity. .
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981, J.
  • the pectate lyase according to the invention is chosen from Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401. , Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, the alpha subunit of Amb a 1, the beta subunit of Amb a 1, and proteins of the Asteraceae family with at least 57% of identity, preferably at least 60% identity, preferably at least 64% identity, with one of the Amb a 1 isoforms.
  • the pectate lyase according to the invention is chosen from Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb.
  • the DNA molecule comprises at least one heterologous nucleotide sequence coding for a preproprotein of the pectate lyase according to the invention.
  • the preproprotein of the pectate lyase according to the invention comprises a signal peptide, a propeptide and the mature pectate lyase.
  • the heterologous nucleotide sequence coding for the preproprotein according to the invention therefore comprises a sequence encoding the signal peptide, a sequence encoding the propeptide and a sequence encoding the mature pectate lyase.
  • the heterologous nucleotide sequence coding for the preproprotein according to the invention comprises a sequence encoding the signal peptide, a sequence encoding the propeptide of the beta subunit, a sequence encoding the beta subunit, a sequence encoding the propeptide of the subunit alpha and a sequence encoding the alpha subunit.
  • the signal peptide is especially any signal peptide recognized by the plant cell, whether or not a pectate lyase. It targets in particular the pectate lyase according to the invention in the intercellular medium.
  • the signal peptide is that of tobacco chitinase, or the natural signal peptide of pectate lyase.
  • the propeptide is, for its part, the natural propeptide of a pectate lyase, or the propeptide of a CIA peptidase.
  • the propeptide is a propeptide of CIA peptidases, especially mites or of plant origin.
  • the CIA peptidase propeptide is the natural propeptide or the mutated or non-mutated propeptide of Der pl.
  • the CIA peptidase propeptide is chosen from the natural peptidase propeptide CIA and the sequence SEQ ID NO: 6 (i.e., amino acids 19 to 98 of the Uniprot sequence p08176).
  • the pectate lyase according to the invention is melted with its own propeptide or in fusion with the mica peptidase propeptide of mites or in fusion with a plant CIA peptidase propeptide, so to increase the production yields of the protein.
  • the pectate lyase preproprotein sequence is chosen from the protein sequences listed in Table 1 above and the sequences exhibiting at least 57%, preferably at least 60%, preferably at least 64% identity. with one of these.
  • the heterologous nucleotide sequence coding for the preproprotein is chosen from SEQ ID NO: 1 to 5.
  • its sequence is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the heterologous nucleotide sequence encoding the preproprotein can be obtained from a known gene already cloned encoding a pectate lyase according to the invention, or by screening a cDNA library with anti-human antibodies. pectate lyase.
  • the methods used are well known to those skilled in the art, and include in particular the identification of the gene by hybridization with probes, PCR, sequencing and molecular cloning. It is also possible to synthesize the gene to reflect the use of preferred codons in plants; in this case, it is referred to as codon optimization, often useful for strong expression of the selected proteases (Murray et al, Nucleic Acid Res 17: 477 498 (1980)).
  • the heterologous nucleotide sequence encoding the preproprotein further comprises a sequence, referred to as an intracellular targeting sequence.
  • This sequence makes it possible to target a storage compartment of the pectate lyase according to the invention, in order to control its maturation. This maturation is necessary to obtain pectate lyases in the most suitable form for the diagnosis of allergy and immunotherapy.
  • this peptide targeting sequence targets the pectate lyase according to the invention in soluble or membrane form towards the endoplasmic reticulum or the various constituent compartments of the endomembrane secretion system of the plant cell.
  • the gene of interest has been isolated and modified to contain all or part of the modifications described above and obtain the heterologous nucleotide sequence, the latter is placed in an expression vector by conventional methods.
  • the selection of an appropriate expression vector will depend on the method of introducing the expression vector into host cells.
  • a typical expression vector contains prokaryotic DNA elements encoding an origin of bacterial replication and an antibiotic resistance gene to be provided for growth and selection of the expression vector in the bacterial host, a cloning for insertion of an exogenous DNA sequence encoding pectate lyase; eukaryotic DNA elements such as an exogenous gene transcription initiation sequence, such as a promoter, and DNA elements that control the transcript processing, such as termination / polyadenylation sequences and an expression cassette allowing the expression of a silencing inhibitor. It also contains sequences such as t-DNAs that are necessary for the integration of a piece of DNA into the plant or into the plant cell.
  • the expression vector comprises:
  • DNA elements that control the processing of transcripts such as termination / polyadenylation sequences, preferably the Tnos sequence (nopaline synthase termination sequence).
  • the expression vector is pAGO1.
  • Promoters used to control the expression of pectate lysis are strong promoters, and may be promoters of plant genes, such as for example the ubiquitin promoter, the small subunit promoter of ribulose. 1,5-bis-Phosphate carboxylase, promoters of Agrobacterium tumefaciens, promoters of nopaline synthase and octopine synthase, or viral promoters such as 19S and 35S of cauliflower mosaic virus (CaMV).
  • the strong promoter is 35S.
  • the high expression and quality of the recombinant pectate lyases produced in the invention makes it possible to design their commercial production. Indeed, the pectate lyase according to the invention is typically expressed in an amount equal to at least 0.1% of the total soluble proteins of the plant, but often in a much higher amount, up to 5 to 10%.
  • the plant comprising the plant cells according to the invention may be a whole plant, but may also be a plant part, such as leaves.
  • the plant or plant cells according to the invention can be used as such as a medicament.
  • the plant or the plant cells according to the invention can be used as such, for applications as biofuel, in animal nutrition, or in the production of paper or textile (including cotton fibers).
  • the recombinant pectate lyase is purified after extraction from the plant or plant cells that express it.
  • the enzyme may be expressed in fusion with tags (His6, GST, MBP, FLAG etc.) which will preferably be located in the N- or C-terminal position of the mature protein.
  • tags His6, GST, MBP, FLAG etc.
  • the pectate lyase according to the invention obtainable by the method according to the invention, with a plant cell according to the invention, or with a plant according to the invention, can be used as a medicament. It can also be used in allergic immunotherapy alone or in combination with at least one other Asteraceae allergen. This other allergen of Asteraceae can be selected from Amb ail, Amb a 5 and mixtures thereof.
  • the subject of the invention is therefore also an allergy diagnostic kit, comprising the pectate lyase according to the invention, and means for measuring the antibodies directed against this protein.
  • the subject of the invention is also an allergy diagnostic kit, comprising the pectate lyase according to the invention, means for measuring the antibodies directed against this protein, and means for measuring the antibodies directed against another Asteraceae allergen. for example allergen Amb a 11 or Amb a 5.
  • the general methods of growing plants, as well as methods for introducing expression vectors into plant tissue, are available to those skilled in the art. They are varied and depend on the selected plant. Preferably, the plants will be grown according to the techniques specific to the platform Allergopur.
  • This method of producing recombinant proteins is described in the application FR1255510, and comprises a first step of cultivating the plant, aeroponic or hydroponic, preferably free float culture, and under LED lighting. After this first step, in particular five weeks of hydroponic culture on free floats, agroinfiltration plants is carried out under vacuum, by agrobacteria comprising a DNA fragment coding for the pectate lyase according to the invention.
  • This step of agroinfiltration can be implemented by any means to evacuate. Preferably, in the method used according to the invention, it is carried out under vacuum by the Venturi effect.
  • agrobacteria that can be used according to the invention, mention may be made preferably of strains LBA4404, GV3101, EHA 101/105 or C58.
  • the plants are typically drained upside down for 15 minutes, then put back into culture, typically 3 to 6 days, ideally by ensuring frequent misting of the latter for 6 minutes. first hours of culture following agroinfiltation.
  • the protein is extracted and purified. Preferably, the protein is extracted and purified as described in application FR1255510.
  • the plants are directly put back into culture, typically 3 to 6 days, and then the protein is extracted and purified. Extraction of the protein can be carried out by grinding the leaves, or by a process involving enzymatic infiltration.
  • the pectinase is P162L marketed by Biocatalyst, formulated at 4% in a medium comprising 50mM sodium citrate pH5.2, 0.5M NaCl and 0.04% metabisulfite.
  • the macérozyme is formulated at 0.5% in a medium comprising 50 mM of sodium citrate pH5.2, 0.5 M NaCl and 0.04% metabisulphite, removal of the leaves of the infiltrated plants, and incubation in an enzymatic solution of pectinase or macérozyme, for a period of between 2 h 30 and 5 h, preferably 3 h or 4 h 30, at a temperature of between 24 ° C. and 30 ° C., preferably 26 ° C., and then
  • the digestate is then filtered, preferably on a web of 250 ⁇ m, and then optionally centrifuged (for example at 250 ⁇ g for 10 minutes),
  • the supernatant is recovered in order to carry out a depth filtration, preferably on a Kl 00 filter (marketed by Pall).
  • a depth filtration preferably on a Kl 00 filter (marketed by Pall).
  • the filtrate is concentrated 20 times on a 5kDa cassette and its pH is adjusted to 7 with Na3PO4.
  • the allergens Amb a 1 and Amb ai 1 can be purified by chromato graphy from the extracts as described in application FR 1255510.
  • the subject of the invention is also a process for producing a pectate lyase according to the invention in a plant cell or a plant, comprising the following steps:
  • step a) transfection of the plant cell or plant with the agrobacteria obtained in step a).
  • the agrobacteria that can be used in step a) are chosen from strains LBA4404, GV3101, EHA 101/105 and C58.
  • the expression vector used in step a) comprises:
  • prokaryotic DNA elements encoding an origin of bacterial replication and an antibiotic resistance gene
  • an expression cassette for the expression of a silencing inhibitor preferably p19;
  • DNA elements that control the processing of transcripts such as termination / polyadenylation sequences, preferably the Tnos sequence.
  • step a) is typically by methods known from the prior art, for example by thermal shocks with successive passages at 4 ° C, -80 ° C and 37 ° C.
  • step b) preferably comprises the following steps:
  • step bl cultivation of the plant cell or plant, aeroponic or hydroponic, and under LED lighting, preferably for five weeks in hydroponics on free floats, b2) agro-infiltration of the plant cell or plant obtained in b) under vacuum by the agrobacteria obtained in step a).
  • This step of agro-infiltration is preferably carried out under vacuum by the Venturi effect.
  • the pectate lyase according to the invention thus produced is extracted and purified.
  • the process for producing a pectate lyase according to the invention in a plant cell or a plant further comprises a step c) of extracting the pectate lyase produced, said step c) comprising the following steps:
  • pectinase or macérozyme are as described above,
  • Figure 1 Schematic representation of the different cassettes for producing a mature and active pectate lyase A (B, C, F and G) or the alpha (E and I) subunit or the beta subunit (D and H), using either the signal peptide and the natural propeptide of the protein (AF), or the signal peptide of the tobacco chitinase and a propeptide of the CIA (GI) peptidase family in order to increase the yields.
  • B, C, F and G or the alpha (E and I) subunit or the beta subunit (D and H)
  • AF signal peptide and the natural propeptide of the protein
  • GI propeptide of the CIA
  • Pectate lyase is also produced in mutated form on lysine 180 (Kl 80) in order to limit proteolysis allowing the production of alpha and beta subunits (F).
  • A (SEQ ID NO: 1): cDNA coding for the natural preproprotein (SEQ sequence
  • This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265,
  • SEQ ID NO: 2 cDNA optimized for use in N. benthamiana, encoding the natural preproprotein (sequence SEQ ID NO: 7). This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265,
  • C (SEQ ID NO: 3): harmonized cDNA coding for the form of the natural preproprotein (of sequence SEQ ID NO: 7).
  • This cDNA contains codons optimized for use in N.benthamiana, but also includes rare codons, in order to preserve the synthesis rate of the protein for better conservation of the 3D structure.
  • This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265,
  • D native / optimized / harmonized cDNA coding for the beta subunit (of sequence SEQ ID NO: 8). This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265.
  • E native / optimized / harmonized cDNA coding for the alpha subunit (of sequence SEQ ID NO: 9). This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265.
  • F native / optimized / harmonized cDNA encoding the mutated form (K180) of the protein. This cDNA may be fused to the addressing signals described in the application
  • G native / optimized / harmonized cDNA coding for the mature form of the protein fused to the tobacco chitinase signal sequence (Neuhaus, J.-M., 1996) and the propeptide Der pl (p08176 - aa 19 to 98 or SEQ ID NO: 6).
  • This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265.
  • H native / optimized / harmonized cDNA encoding the beta subunit of the protein fused to the tobacco chitinase signal sequence (Neuhaus, J.-M., 1996) and the propeptide Der pl (p08176 - aa 19 to 98 or SEQ ID NO: 6).
  • This cDNA may be fused to addressing signals described in application WO2008 / 056265.
  • FIG 3 Expression of the Amb a protein 1.
  • the proteins extracted from plants transfected with the native cDNA (F1-F3), with the optimized cDNA (F4-F6) or with the harmonized cDNA (F7-F9) coding Amb-1 protein was separated by SDS-PAGE and analyzed for immuno-detection with an antibody against a Flag tag.
  • the immuno-detection assay shows the specific production of the Amb a 1 protein and the alpha subunit. The cleaved beta subunit is not immunodetected on this blot.
  • Figure 4 Purification of the allergen Amb 1.
  • FIG. 5 Expression of the allergen Amb a 11.
  • the proteins extracted from 3 plants (PI-P3) transfected with the cDNA encoding the allergen Amb a 1 I were separated by SDS-PAGE electrophoresis. Protein extracts are analyzed as soon as they are extracted (OH) or after incubation for 12 hours (12 hours) at room temperature. Incubation at room temperature shows the accumulation of two polypeptides corresponding to Amb a 11, as well as the almost complete degradation of N. benthamiana proteins.
  • the allergen Amb a 11 is therefore produced in active form according to the same process as that currently described for Amb a 1.
  • the cDNAs are synthesized in native form, optimizing the use of codons for their recognition by the plant system or by harmonizing the use of codons (reintroduction of rare codons to rhythm the synthesis of the protein).
  • the preferred optimization is the optimization for expression in Nicotiana benthamiana, as shown in FIG. 1.
  • Xba I / kpn I and Sal I / Sac I restriction sites are respectively integrated at the 5 'and 3' ends of the cDNA during the synthesis. These sites are then used to clone the cDNAs into the pAG01 binary expression vector ( Figure 1).
  • the cDNAs are cloned upstream of a 35S promoter (35S) and downstream of a nopaline synthase termination sequence (Tnos); the pAGO1 vector additionally contains an expression cassette making it possible to express the simultaneous p19 silencing inhibitor of the recombinant protein in order to increase the production yields.
  • the vectors are then used to transform Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Transient expression of pectates lyases according to the invention in leaves of Nicotiana benthamiana - Use of the AllergoPur platform
  • Agobacterium tumefaciens LBA4404 is used for the transfer of a cDNA encoding pectate lyase without the gene of interest being integrated into the genome of the plant cell: this is called transfection and not transgenesis.
  • the plants are grown under hydroponic conditions in the presence of a nutrient medium (GHE, floragrow, floramicro, florabloom, 10mL / 15mL / 5mL per 10 L of osmosis water) and under LED lighting.
  • GHE nutrient medium
  • Agrobacteria are transferred to leaf tissue by agroinfiltration by two methods.
  • the Agrobacteria are injected manually using a syringe applied against the epidermis of the underside of the leaf.
  • Leaf discs taken from the leaves 4 to 6 days after the agroinfiltration are used for the analysis of the different prototypes of pectate lyases. This screening step makes it possible to define the expression vector that will be used to obtain a pectate lyase of optimal quality.
  • agro-infiltration is carried out under vacuum, in enclosures containing several liters of a culture of agrobacteria and where several tens of plants are infiltrated simultaneously. These plants are then re-cultured for 4 to 6 days before purification of the pectates lyases from the leaf extracts ( Figure 2).
  • the expressed proteins are active. Indeed, the expression of Amb a 1 causes significant necrosis from the 4th day of expression compared to control plants. These necroses are due to a strong pectate lyase activity (Liu et al, 2010).
  • pectate lyases are extracted from fresh or frozen biomass and then purified on IMAC column (HisTrap Excell). This purification allows the production of the precursor form (preproprotein) and the alpha subunit.
  • allergens Amb a 1 and Amb a i 1 obtained by the process according to the invention to obtain a composition that can be used in allergic immunotherapy.
  • allergens can be produced and purified after mechanical extraction as described in application FR1255510, or according to the enzymatic infiltration extraction alternative as described in the present application.

Abstract

La présente invention est relative à une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort.

Description

Production commerciale de l'allergène Amb Al par expression transitoire chez les plantes
La présente invention se rapporte à une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort. L'invention se rapporte également un procédé de production de la pectate lyase utilisant la cellule végétale.
L'ambroisie, en particulier Ambrosia artemisiifolia, est une plante annuelle, qui appartient à la famille des Composées tubuliflores (ou Astéracées). Cette plante sauvage, originaire d'Amérique du nord, fleurit de la fin de Tété jusqu'à l'automne. Son pollen a un pouvoir allergénique très élevé. Ainsi, l'ambroisie est la première cause d'allergie pollinique aux Etats-Unis, avec environ 30 millions de personnes sur 40 millions souffrant de pollinoses. Introduite involontairement en France au XIXème siècle, l'ambroisie est une plante fortement invasive qui a rapidement progressé à partir de la région Rhône-Alpes vers le nord de la France. Ainsi, en 2011, des pieds d'ambroisie ont été retrouvés dans l'Ile de France. Le pollen de cette plante provoque chez les personnes sensibles une réaction allergique caractérisée par sa sévérité. Globalement, la rhinite allergique à l'ambroisie est beaucoup plus sévère que celle causée par d'autres pollens. Les symptômes tels que prurit, anosmie (perte ou diminution de la sensibilité aux odeurs), rhinorrhée, éternuements et obstruction nasale sont plus importants. De plus, dans 50% des cas, cette allergie évolue en un asthme, souvent plus sévère que celui provoqué par d'autres pollens. Ces symptômes sont d'autant plus prononcés que le taux de pollen dans l'air est élevé.
Dans la région Rhône-Alpes, l'allergie à l'ambroisie touche aujourd'hui 6 à 12% de la population entre fin août et début septembre. Ainsi, pour cette seule région, le nombre total de consommateurs de médicaments antiallergiques à l'ambroisie a fortement augmenté (+60%) entre 2008 et 2011, passant de 161 200 à 258 700 personnes, et les dépenses de santé engendrées par cette allergie représentent entre 5,6 et 8,6 millions d'euros. L'allergie à l'ambroisie représente donc aujourd'hui un véritable problème de santé publique. Le plus simple pour se protéger des risques d'allergie serait d'éviter les expositions au pollen d'ambroisie, mais une éviction totale semble d'ores et déjà impossible malgré des arrêtés préfectoraux rendant obligatoire la destruction de l'ambroisie. Ces mesures n'ont pas permis d'enrayer la propagation de cette plante invasive dans un grand nombre de régions. Les traitements dits « symptomatiques » soit par voie locale (gouttes, collyres, sprays), soit par voie générale (comprimés, gélules), permettent de soulager les symptômes pendant la période où les pollens sont présents dans l'air. Mais les symptômes reviennent rapidement dès l'arrêt du traitement. A l'inverse des traitements "symptomatiques", l'immunothérapie allergénique (ou désensibilisation) est le seul traitement susceptible de modifier l'évolution de la maladie allergique. Cette voie thérapeutique permet de traiter la cause de l'allergie contrairement aux médicaments dits « symptomatiques ». Toutefois, comme pour les autres allergies, les extraits utilisés aujourd'hui pour la désensibilisation des patients allergiques à l'ambroisie sont d'une qualité insuffisante pour que ce traitement soit efficace. Plusieurs allergènes d'ambroisie ont été caractérisés, en particulier Amb a 1 qui est responsable de plus de 80% des cas d'allergie à l'ambroisie. Différentes tentatives de production d'un Amb a 1 recombinant destiné à une désensibilisation spécifique ont échoué. En effet, Amb a 1 est une protéine végétale complexe présentant des maturations post-traductionelles typiquement végétales, et seul un système d'expression végétale sera capable de produire cet allergène sous une forme utilisable et efficace en immunothérapie allergénique.
Il existe donc un besoin pour produire cet allergène Amb a 1 sous forme recombinante, avec une bonne qualité, et de façon reproductible et efficace (avec un bon rendement). Par « bonne qualité », on entend que allergène est très fortement similaire, dans sa séquence et sa structure, à allergène présent naturellement dans l'ambroisie. Il existe également un besoin pour produire cet allergène à des niveaux commercialement et économiquement acceptables.
De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant découvert que la production de allergène Amb a 1, bien que toxique in vivo, sous forme recombinante est possible, par expression transitoire chez les plantes. Cette production, qui se fait dans une cellule végétale, permet l'obtention de allergène Amb a 1 sous forme mature et active, avec un bon rendement, de façon très simple et reproductible. En outre, allergène Amb a 1 obtenu n'est pas contaminé par des protéases et/ou d'autres contaminants d'origine végétale. Les inventeurs ont ainsi pu obtenir une production, à des niveaux commercialement acceptables, de allergène Amb a 1. L'invention a donc pour objet une cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. La molécule d'ADN liée au promoteur fort permet d'exprimer de façon transitoire la pectate lyase mature et active dans la cellule. De préférence, ladite cellule végétale est une cellule de Nicotiana benthamiana. De préférence, la cellule végétale selon l'invention comprend une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine de la pectate lyase liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S, ladite molécule d'ADN n'étant pas intégrée dans le génome de la cellule végétale.
La pectate lyase choisie parmi Amb a l, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1 est appelée « pectate lyase selon l'invention » dans la présente demande.
L'invention a également pour objet une plante comprenant au moins une cellule végétale selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de production d'une pectate lyase selon l'invention, comprenant l'expression de ladite pectate lyase dans une cellule végétale selon l'invention, ou dans une plante comprenant une telle cellule.
Un autre objet de l'invention se rapporte à une pectate lyase susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention. La pectate lyase ainsi obtenue peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée en immunothérapie allergique, seule ou en combinaison avec au moins un autre allergène d'Asteracée. Elle peut également être utilisée dans le diagnostic d'allergies, et être intégrée dans un kit de diagnostic d'allergies. La cellule végétale selon l'invention comprend une molécule d'ADN liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. Par « lié de manière fonctionnelle », on entend que la molécule d'ADN est fusionnée avec le promoteur fort, de telle sorte que le promoteur fort induise la transcription de la molécule d'ADN. Cela permet l'expression de ladite molécule d'ADN sous forme transitoire, i.e. sans intégration de l'ADN, notamment l'ADNc, dans le génome de la cellule végétale. En effet, l'utilisation de l'expression transitoire dans une cellule végétale ou une plante selon l'invention permet d'augmenter les rendements de production de la pectate lyase selon l'invention sous forme active jusqu'à des niveaux élevés, compatibles avec une exploitation commerciale, mais incompatibles avec la survie d'une plante qui exprimerait ces pectates lyases toxiques de façon stable. Dans le cas d'une expression transitoire, la récolte de la biomasse végétale a lieu lors du pic d'expression de la protéine recombinante, i.e. typiquement 4 à 6 jours après la transfection.
De préférence, la cellule végétale selon l'invention comprend un vecteur d'expression comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S. Amb a 1 est une pectate lyase provenant & Ambrosia artemisiifolia. Reconnu par plus de 80 % des patients sensibilisés à l'ambroisie, cet allergène est responsable de plus de 90 % de l'activité allergénique du pollen d'ambroisie. C'est une protéine de 38 kDa décrite comme non glycosylée appartenant à la famille des pectates lyases. Douze isoformes de Amb a 1 sont recensées, de Amb a 1.0101 à Amb a 1.0502 (d'après le site www.allergome.org).
Les séquences nucléique et d'acides aminés des douze isoformes sont détaillées dans le tableau 1 ci-dessous :
Figure imgf000005_0001
Tableau 1 : les douze isoformes d'Amb a 1, leurs séquences nucléiques et protéiques Par « Amb a 1 » selon l'invention, on entend les douze isoformes précitées dans le tableau 1 ci-dessus. Les séquences protéiques décrites dans ce tableau 1 correspondent aux préproprotéines des différentes isoformes.
Amb a 1 subit une protéolyse dans le grain de pollen et/ou au cours du processus d'extraction ou de purification résultant en deux chaînes, alpha (26 kDa) et bêta (12 kDa), associées de façon non covalente (King et al, 1974, 1981). Il a été démontré que des modifications chimiques d'Amb a 1, y compris la réduction et l'alkylation des ponts disulfures ainsi que le processus de dénaturation/renaturation par l'urée ou la succinylation des résidus lysine, réduit sa réactivité vis-à-vis des IgE (King, 1976; Smith et al, 1988). Les sous-chai nés alpha et be ta d'Amb a 1 ont une réactivité différente sur les IgE et les lymphocytes T. En effet, Amb a 1 bêta contient un nombre important d'épitopes fixant les IgE, tandis que Amb a 1 alpha se comporte comme un hypoallergène et stimule l'activité des cellules T.
De préférence, Amb a 1 a pour séquence protéique SEQ ID NO :7 (préproprotéine). De préférence, la sous-unité bêta a pour séquence protéique SEQ ID NO :8. De préférence, la sous-unité alpha a pour séquence protéique SEQ ID NO :9.
Par « homologues d'Amb a 1 », on entend des protéines de la famille des Astéracées qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1. De préférence, l'homologue d'Amb a 1 est une protéine de plante du genre Ambrosia ou Artemisia, plus préférentiellement d'Artemisia vulgaris, d' Ambrosia psilostachya ou d' Ambrosia trifida, qui présente au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1. De préférence, l'homologue d'Amb a 1 est choisi parmi Amb p 1 (provenant d' Ambrosia psilostachya, de code d'accession 9064 sur www.allergome.org) et Art v 6 (provenant d' Artemisia vulgaris, de numéro d'accession A0PJ16 dans Uniprot).
Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
Ainsi, de préférence, la pectate lyase selon l'invention est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines de la famille des Astéracées qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
Plus préférentiellement, la pectate lyase selon l'invention est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines d'Artemisia vulgaris, d' 'Ambrosia psilostachya ou d'Ambrosia trifida, qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
La molécule d'ADN comprend au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine de la pectate lyase selon l'invention.
La préproprotéine de la pectate lyase selon l'invention comprend un peptide signal, un propeptide et la pectate lyase mature. La séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention comprend donc une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide et une séquence codant la pectate lyase mature. De préférence, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine selon l'invention comprend une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide de la sous-unité bêta, une séquence codant la sous-unité bêta, une séquence codant le propeptide de la sous- unité alpha et une séquence codant la sous-unité alpha.
Le peptide signal est notamment tout peptide signal reconnu par la cellule végétale, provenant ou non d'une pectate lyase. Il cible notamment la pectate lyase selon l'invention dans le milieu intercellulaire. De préférence, le peptide signal est celui de la chitinase de tabac, ou le peptide signal naturel de la pectate lyase.
Le propeptide est, quant à lui, le propeptide naturel d'une pectate lyase, ou bien le propeptide d'une peptidase CIA. Dans un mode de réalisation préféré, le propeptide est un propeptide de peptidases CIA, notamment d'acariens ou d'origine végétale. De préférence, le propeptide de peptidase CIA est le propeptide naturel ou le propeptide muté ou non de Der pl. De préférence, le propeptide de peptidase CIA est choisi parmi le propeptide naturel de peptidase CIA et la séquence SEQ ID NO :6 (i.e. les acides aminés 19 à 98 de la séquence Uniprot p08176). Dans un mode de réalisation préférée de la présente invention, la pectate lyase selon l'invention est produite en fusion avec son propre propeptide ou en fusion avec le propeptide de peptidase CIA d'acariens ou en fusion avec un propeptide de peptidase CIA végétale, afin d'augmenter les rendements de production de la protéine. De préférence, la séquence de la préproprotéine de pectate lyase est choisie parmi les séquences protéiques listées dans le tableau 1 ci-avant et les séquences présentant au moins 57%, de préférence au moins 60%, de préférence au moins 64% d'identité avec l'une de ces dernières. De préférence, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine est choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 5. De préférence, elle a pour séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 ou SEQ ID NO :5.
Selon l'invention, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine peut être obtenue à partir d'un gène connu déjà cloné codant pour une pectate lyase selon l'invention, ou bien par criblage d'une banque d'ADNc avec des anticorps anti-pectate lyase. Les méthodes utilisées sont bien connues de l'homme de l'art, et incluent notamment l'identification du gène par hybridation avec des sondes, PCR, séquençage et clonage moléculaire. Il est également possible de synthétiser le gène pour refléter l'utilisation des codons préférés chez les plantes ; dans ce cas, on parle d'optimisation de codons, souvent utile pour une forte expression des protéases sélectionnées (Murray et al, Nucleic Acid Res. 17:477 498 (1980)). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique hétérologue codant la préproprotéine comprend en outre une séquence, appelée séquence d'adressage intracellulaire. Cette séquence permet de cibler un compartiment de stockage de la pectate lyase selon l'invention, afin de contrôler sa maturation. Cette maturation est nécessaire pour l'obtention des pectates lyases sous la forme la plus adaptée pour le diagnostic d'allergie et l'immunothérapie. De préférence, cette séquence peptidique d'adressage cible la pectate lyase selon l'invention sous forme soluble ou membranaire vers le réticulum endoplasmique ou les différents compartiments constitutifs du système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale. Une fois que le gène d'intérêt a été isolé et modifié pour contenir tout ou partie des modifications décrites ci-dessus et obtenir la séquence nucléotidique hétérologue, cette dernière est placée dans un vecteur d'expression par des méthodes classiques. La sélection d'un vecteur d'expression approprié dépendra de la méthode d'introduction du vecteur d'expression dans des cellules hôtes. Un vecteur d'expression typique contient des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique à fournir pour la croissance et la sélection du vecteur d'expression dans l'hôte bactérien, un site de clonage pour l'insertion d'une séquence d'ADN exogène codant pour la pectate lyase; des éléments d'ADN eucaryotes comme une séquence d'initiation de la transcription du gène exogène, comme un promoteur, et des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation et une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing. Il contient également des séquences telles que des t-DNA qui sont nécessaires pour l'intégration d'un morceau d'ADN dans la plante ou dans la cellule végétale.
De préférence, le vecteur d'expression comprend :
- des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique ;
au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S ; une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence pl9 ; et
des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos (séquence de terminaison de la nopaline synthase).
De préférence, le vecteur d'expression est pAGOl.
Les promoteurs utilisés pour contrôler l'expression de la pectate lyse sont des promoteurs forts, et peuvent être des promoteurs de gènes de plantes, tels que par exemple, le promoteur de l'ubiquitine, le promoteur de la petite sous-unité de la ribulose-1, 5-bis-phosphate carboxylase, des promoteurs d'Agrobacterium tumefaciens, les promoteurs de la nopaline- synthase et de l'octopine synthase, ou encore des promoteurs viraux comme les 19S et 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV). De préférence, le promoteur fort est le 35S. L'expression élevée et la qualité des pectates lyases recombinantes produites dans l'invention permettent de concevoir leur production commerciale. En effet, la pectate lyase selon l'invention est typiquement exprimée en une quantité égale à au moins 0,1 % des protéines solubles totales de la plante, mais souvent en une quantité beaucoup plus élevée, pouvant atteindre 5 à 10%.
La plante comprenant les cellules végétales selon l'invention peut être une plante entière, mais peut également être une partie de plante, telle que des feuilles.
La plante ou les cellules végétales selon l'invention peuvent être utilisées en tant que telles, comme médicament.
La plante ou les cellules végétales selon l'invention peuvent être utilisées en tant que telles, pour des applications comme biocarburant, dans la nutrition animale, ou encore dans la production de papier ou de textile (fibres de coton notamment).
Dans d'autres applications, la pectate lyase recombinante est purifiée après extraction à partir de la plante ou des cellules végétales qui l'expriment. Afin de faciliter sa purification, l'enzyme pourra être exprimée en fusion avec des tags (His6, GST, MBP, FLAG etc..) qui seront localisés de préférence en position N- ou C-terminale de la protéine mature. La pectate lyase selon l'invention susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, avec une cellule végétale selon l'invention, ou avec une plante selon l'invention, peut être utilisée comme médicament. Elle peut également être utilisée en immunothérapie allergique, seule ou en combinaison avec au moins un autre allergène d'Asteracée. Cet autre allergène d'Asteracée peut être choisi parmi Amb a i l, Amb a 5 et leurs mélanges.
Elle peut également être utilisée dans le diagnostic d'allergies, notamment d'allergies aux pollens. L'invention a donc également pour objet un kit de diagnostic d'allergies, comprenant la pectate lyase selon l'invention, et des moyens de mesure des anticorps dirigés contre cette protéine. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic d'allergies, comprenant la pectate lyase selon l'invention, des moyens de mesure des anticorps dirigés contre cette protéine, et des moyens de mesure des anticorps dirigés contre un autre allergène d'Asteracée, par exemple allergène Amb a 11 ou Amb a 5.
Les méthodes générales de culture de plantes, ainsi que les procédés pour introduire des vecteurs d'expression dans un tissu végétal, sont à la disposition de l'homme de l'art. Ils sont variés et dépendent de la plante sélectionnée. De préférence, les plantes seront cultivées selon les techniques propres à la plateforme Allergopur. Ce procédé de production de protéines recombinantes est décrit dans la demande FR1255510, et comprend une première étape de culture de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, de préférence culture sur flotteur libre, et sous éclairage LEDs. Après cette première étape, notamment cinq semaines de culture en hydroponie sur des flotteurs libres, agroinfiltration des plantes est réalisée sous vide, par des agrobactéries comprenant un fragment d'ADN codant pour la pectate lyase selon l'invention. Cette étape d' agroinfiltration peut être mise en œuvre par tout moyen permettant de faire le vide. De préférence, dans le procédé utilisé selon l'invention, elle est réalisée sous vide par effet Venturi. Parmi les agrobactéries utilisables selon l'invention, on peut citer de préférence, les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 ou C58. Selon une première alternative, une fois l'étape d' agroinfiltration réalisée, les plantes sont typiquement égouttées tête en bas pendant 15 minutes, puis remises en culture, typiquement 3 à 6 jours, idéalement en assurant une brumisation fréquente de ces dernières pendant les 6 premières heures de culture qui suivent l'agroinfiltation. Enfin, la protéine est extraite et purifiée. De préférence, la protéine est extraite et purifiée comme décrit dans la demande FR1255510. Selon une seconde alternative, une fois l'étape d' agroinfiltration réalisée, les plantes sont directement remises en culture, typiquement 3 à 6 jours, puis la protéine est extraite et purifiée. L'extraction de la protéine peut être effectuée par broyage des feuilles, ou encore selon un procédé faisant appel à une infiltration enzymatique.
Dans un tel procédé faisant appel à une infiltration enzymatique, l'extraction de la protéine est effectuée par les étapes suivantes :
- infiltration sous vide (notamment comme il a été décrit ci-dessus pour agroinfiltration) de la partie aérienne des plantes, dans une solution enzymatique contenant une pectinase ou de la macérozyme, qui ne présente pas d'activité protéolytique. De préférence, la pectinase est la P162L commercialisée par Biocatalyst, formulée à 4% dans un milieu comprenant 50mM de citrate de sodium pH5.2, 0.5M NaCl et 0.04% métabisulfite. De préférence, la macérozyme est formulée à 0.5% dans un milieu comprenant 50mM de citrate de sodium pH5.2, 0.5M NaCl et 0.04% métabisulfite,prélèvement des feuilles des plantes infiltrées, et incubation dans une solution enzymatique de pectinase ou de macérozyme, pendant une durée comprise entre 2h30 et 5h, de préférence de 3h ou 4h30, à une température comprise entre 24°C et 30°C, de préférence 26°C, puis
mise sous agitation du mélange obtenu entre 20 et 30 rpm à température ambiante (i.e. environ 20-23°C) pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2h,
le digestat est ensuite filtré, de préférence sur une toile de 250μιη, puis éventuellement centrifugé (par exemple à 250xg pendant 10 minutes),
- le surnageant est récupéré afin d'effectuer une filtration en profondeur de préférence sur filtre Kl 00 (commercialisé par Pall). De préférence, le filtrat est concentré 20 fois sur une cassette 5kDa et son pH est ajusté à 7 avec du Na3P04.
Les allergènes Amb a 1 et Amb ai l peuvent être purifiés par chromato graphie à partir des extraits comme il a été décrit dans la demande FR 1255510.
Ainsi, de préférence, l'invention a également pour objet un procédé de production d'une pectate lyase selon l'invention dans une cellule végétale ou une plante, comprenant les étapes suivantes :
a) transformation d' agrobactéries avec un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort ; et
b) transfection de la cellule végétale ou de la plante avec les agrobactéries obtenues à l'étape a). De préférence, les agrobactéries utilisables dans l'étape a) sont choisies parmi les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 et C58. De préférence, le vecteur d'expression utilisé dans l'étape a) comprend :
des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique ;
au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase selon l'invention liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort, de préférence un promoteur 35S ;
une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence pl9 ; et
des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos.
La transformation de l'étape a) se fait typiquement par des méthodes connues de l'art antérieur, par exemple par chocs thermiques avec passages successifs à 4°C, -80°C et 37°C.
La transfection de l'étape b) comprend de préférence les étapes suivantes :
bl) culture de la cellule végétale ou de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, et sous éclairage LEDs, de préférence pendant cinq semaines en hydroponie sur des flotteurs libres, b2) agroinfiltration de la cellule végétale ou plante obtenue en bl) sous vide, par les agrobactéries obtenues à l'étape a). Cette étape d' agroinfiltration est, de préférence, réalisée sous vide par effet Venturi.
b3) remise en culture de la cellule végétale ou de la plante obtenue en b2), typiquement pendant 3 à 6 jours.
Enfin, de préférence, la pectate lyase selon l'invention ainsi produite est extraite et purifiée.
De préférence, le procédé de production d'une pectate lyase selon l'invention dans une cellule végétale ou une plante, comprend en outre une étape c) d'extraction de la pectate lyase produite, ladite étape c) comprenant les étapes suivantes :
infiltration sous vide de la cellule végétale ou des feuilles (i.e. partie aérienne) de la plante, dans une solution enzymatique contenant une pectinase ou de la macérozyme, qui ne présente pas d'activité protéolytique. De préférence, la pectinase ou la macérozyme sont telles que décrites ci-avant,
prélèvement de la cellule végétale infiltrée ou des feuilles de la plante infiltrées et incubation, dans une solution enzymatique de pectinase ou de macérozyme, pendant une durée comprise entre 2h30 et 5h, à une température comprise entre 24°C et 30°C, puis
mise sous agitation du mélange obtenu entre 20 et 30 rpm à température ambiante pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2h,
- filtration puis éventuellement centrifugation du digestat obtenu, et
récupération du surnageant.
Les exemples qui suivent, illustrent, mais ne visent pas à limiter la portée de l'invention. Il sera évident pour l'homme de l'art que des variantes et modifications sont possibles et entrent dans le cadre et l'esprit de l'invention.
Les légendes des figures sont les suivantes :
Figure 1 : Représentation schématique des différentes cassettes permettant de produire une pectate lyase Amb a 1 mature et active (A, B, C, F et G) ou la sous-unité alpha (E et I) ou la sous-unité bêta (D et H), en utilisant soit le peptide signal et le propeptide naturel de la protéine (A-F), soit le peptide signal de la chitinase de tabac et un propeptide de la famille des peptidases CIA (G-I) afin d'augmenter les rendements.
La pectate lyase est également produite sous forme mutée sur la lysine 180 (Kl 80) afin de limiter la protéolyse permettant la production des sous-unités alpha et bêta (F).
A (SEQ ID NO : 1): ADNc codant pour la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ
ID NO :7). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265,
B (SEQ ID NO : 2): ADNc optimisé pour une utilisation chez N.benthamiana, codant pour la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265,
C (SEQ ID NO : 3): ADNc harmonisé codant pour la forme la préproprotéine naturelle (de séquence SEQ ID NO :7). Cet ADNc contient des codons optimisés pour une utilisation chez N.benthamiana, mais comprend également des codons rares, afin de préserver le rythme de synthèse de la protéine pour une meilleure conservation de la structure 3D. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265,
D (SEQ ID NO : 4) : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité bêta (de séquence SEQ ID NO :8). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265. E (SEQ ID NO : 5) : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité alpha (de séquence SEQ ID NO :9). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265.
F : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la forme mutée (Kl 80) de la protéine. Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande
WO2008/056265.
G : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la forme mature de la protéine fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M., 1996) et au propeptide Der pl (p08176 - aa 19 à 98 ou SEQ ID NO :6). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265.
H : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité bêta de la protéine fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M., 1996) et au propeptide Der pl (p08176 - aa 19 à 98 ou SEQ ID NO :6). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265.
I : ADNc natif/optimisé/harmonisé codant pour la sous-unité alpha de la protéine fusionnée à la séquence signal de la chitinase de tabac (Neuhaus, J.-M., 1996) et au propeptide Der pl (p08176 - aa 19 à 98 ou SEQ ID NO :6). Cet ADNc pourra être fusionné à des signaux d'adressage décrits dans la demande WO2008/056265. Figure 2 : La plateforme AllergoPur utilisée pour l'expression et la production des différentes formes de pectate lyase selon l'invention.
Figure 3: Expression de la protéine Amb a 1. Les protéines extraites de plantes transfectées par l'ADNc natif (F1-F3), par l'ADNc optimisé (F4-F6) ou par l'ADNc harmonisé (F7-F9) codant la protéine Amb a 1 ont été séparées par SDS-PAGE et analysées immmuno-détection avec un anticorps dirigé contre une étiquette Flag. L'analyse par immuno-détection met en évidence la production spécifique de la protéine Amb a 1 et de la sous-unité alpha. La sous- unité bêta clivée n'est pas immunodétectée sur ce blot. Figure 4: Purification de l'allergène Amb a 1. Les protéines extraites de plantes ont été transfectées sous vide avec l'ADNc harmonisé codant la protéine Amb a 1 par chromatographie IMAC. Puis les fractions retenues sur la colonne ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE. Compte tenu de la position C-terminale du Flag, deux polypeptides correspondant à la forme précurseur (préproprotéine) (Amb a lp) et à la sous- unité alpha sont purifiés à partir de l'extrait transfecté par l'ADNc complet (piste 3). Ces deux polypeptides (Amb a 1 alpha et Amb a lp) sont ensuite séparés (pistes 4 et 5 respectivement) par chromato graphie de tamisage moléculaire. Les deux polypeptides produits présentent une mobilité électrophorétique légèrement plus faible que les protéines natives. Cette différence s'explique par la présence du flag en position C-terminale.
Figure 5 : Expression de l'allergène Amb a 11. Les protéines extraites de 3 plantes (PI - P3) transfectées par l'ADNc codant l'allergène Amb a i l ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE. Les extraits protéiques sont analysés dès leur extraction (OH) ou après une incubation de 12h (12H) à température ambiante. L'incubation à température ambiante met en évidence l'accumulation de deux polypeptides correspondant à Amb a 11, ainsi que la dégradation quasi-totale des protéines de N.benthamiana. L'allergène Amb a 11 est donc produit sous forme active selon le même procédé que celui décrit présentement pour Amb a 1.
EXEMPLE :
Design moléculaire et synthèse de gène
Les ADNc sont synthétisés sous forme native, en optimisant l'usage des codons pour leur reconnaissance par le système végétal ou en harmonisant l'usage de codons (réintroduction de codons rares pour rythmer la synthèse de la protéine). Dans le cadre de cette invention, l'optimisation préférée est l'optimisation pour une expression chez Nicotiana benthamiana, comme indiqué en Figure 1. Préparation des plasmides
Des sites de restriction Xba I/kpn I et Sal I/Sac I sont respectivement intégrés aux extrémités 5' et 3' de l'ADNc lors de la synthèse. Ces sites sont ensuite utilisés afin de cloner les ADNc dans le vecteur binaire d'expression pAGOl (Figure 1). Les ADNc sont clonés en amont d'un promoteur 35S (35S) et en aval d'une séquence de terminaison de la nopaline synthase (Tnos) ; le vecteur pAGOl contient en outre une cassette d'expression permettant d'exprimer l'inhibiteur de silencing pl9 simultanément de la protéine recombinante afin d'augmenter les rendements de production. Les vecteurs sont ensuite utilisés pour transformer la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens . Expression transitoire de pectates lyases selon l'invention dans des feuilles de Nicotiana benthamiana - Utilisation de la plateforme AllergoPur
Pour la production par expression transitoire Agobacterium tumefaciens LBA4404 est utilisé pour le transfert d'un ADNc codant la pectate lyase sans que le gène d'intérêt soit intégré dans le génome de la cellule végétale : on parle ici de transfection et non de transgenèse. Les plantes sont cultivées en condition hydroponique en présence d'un milieu nutritif (GHE, floragrow, floramicro, florabloom, lOmL/ 15mL/ 5mL pour 10 L d'eau osmosée) et sous éclairage LED.
L' agrobactérie est transférée dans le tissu foliaire par agro-infiltration selon deux procédés. Pour la production de petits lots de pectates lyases destinés au criblage de prototypes, les agrobactéries sont injectées manuellement grâce à une seringue appliquée contre l'épiderme de la face inférieure de la feuille. Des disques foliaires prélevés dans les feuilles 4 à 6 jours après l'agro -infiltration sont utilisés pour l'analyse des différents prototypes de pectates lyases. Cette étape de criblage permet de définir le vecteur d'expression qui sera utilisé pour l'obtention d'une pectate lyase de qualité optimale. Le même procédé est utilisé pour la production commerciale à grande échelle mais, dans ce cas, agro-infiltration s'effectue sous vide, dans des enceintes contenant plusieurs litres d'une culture d' agrobactéries et où plusieurs dizaines de plantes sont infiltrées simultanément. Ces plantes sont ensuite remises en culture pendant 4 à 6 jours avant la purification des pectates lyases à partir des extraits foliaires (Figure 2).
Expression de la pectate lyase Amb a 1 et de ses sous-unités
L'expression des protéines ainsi que les rendements sont respectivement analysés par Western blotting et ELISA. Les résultats sont illustrés pour les 3 formes d'ADNc codant la protéine naturelle (Figure 3).
Les protéines exprimées sont actives. En effet, l'expression d'Amb a 1 provoque des nécroses importantes dès le 4eme jour d'expression comparé à des plantes contrôles. Ces nécroses sont dues à une forte activité pectate lyase (Liu et al, 2010).
Purification et caractérisation
Comme l'illustre la figure 4, les pectates lyases sont extraites à partir de la biomasse fraîche ou congelée puis purifiées sur colonne IMAC (HisTrap Excell). Cette purification permet la production de la forme précurseur (préproprotéine) et de la sous- unité alpha.
Enfin, comme le montre la figure 5, il est possible de combiner les allergènes Amb a 1 et Amb a i l obtenus par le procédé selon l'invention, pour obtenir une composition utilisable en immunothérapie allergique. Ces allergènes peuvent être produits et purifiés après une extraction mécanique comme décrit dans la demande FR1255510, ou selon l'alternative d'extraction par infiltration enzymatique comme décrit dans la présente demande.

Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule végétale comprenant une molécule d'ADN comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1, et les homologues d'Amb a 1, liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort.
2. Cellule végétale selon la revendication 1, dans laquelle ladite molécule d'ADN n'est pas intégrée dans le génome de la cellule végétale.
3. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle la pectate lyase est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines de la famille des Astéracées qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
4. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle la pectate lyase est choisie parmi Amb a 1.0101, Amb a 1.0201, Amb a 1.0202, Amb a 1.0301, Amb a 1.0302, Amb a 1.0303, Amb a 1.0304, Amb a 1.0305, Amb a 1.0401, Amb a 1.0402, Amb a 1.0501, Amb a 1.0502, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les protéines ά' Artemisia vulgaris, d' 'Ambrosia psilostachya ou ά' Ambrosia trifida, qui présentent au moins 57% d'identité, de préférence au moins 60% d'identité, de préférence au moins 64% d'identité, avec l'une des isoformes d'Amb a 1.
5. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue comprend une séquence codant le peptide signal, une séquence codant le propeptide et une séquence codant la pectate lyase mature.
6. Cellule végétale selon la revendication 5, dans laquelle :
- le peptide signal est choisi parmi le peptide signal naturel de la pectate lyase et le peptide signal de la chitinase de tabac ; et
- le propeptide est choisi parmi les propeptides naturels de pectates lyases et les propeptides de peptidases CIA.
7. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue comprend en outre une séquence peptidique d'adressage intracellulaire qui cible la pectate lyase sous forme soluble ou membranaire vers le réticulum endoplasmique ou les différents compartiments constitutifs du système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale.
8. Cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 7, qui comprend un vecteur d'expression comprenant :
des éléments d'ADN procaryote codant pour une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique ;
la séquence nucléotidique hétérologue telle que définie dans l'une des revendications précédentes ;
une cassette d'expression permettant l'expression d'un inhibiteur du silencing, de préférence pl9 ; et
des éléments d'ADN qui contrôlent le traitement des transcrits, comme des séquences de terminaison / polyadénylation, de préférence la séquence Tnos.
9. Plante comprenant au moins une cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Procédé de production d'une pectate lyase choisie parmi Amb a 1, la sous-unité alpha d'Amb a 1, la sous-unité bêta d'Amb a 1 et les homologues d'Amb a 1, comprenant l'expression de ladite pectate lyase dans une cellule végétale selon l'une des revendications 1 à 8, ou dans une plante selon la revendication 9.
11. Procédé de production d'une pectate lyase selon la revendication 10, comprenant les étapes suivantes :
a) transformation d' agrobactéries avec un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique hétérologue codant pour une préproprotéine d'une pectate lyase liée de manière fonctionnelle à un promoteur fort ; et
b) transfection de la cellule végétale ou de la plante avec les agrobactéries obtenues à l'étape a).
12. Procédé de production d'une pectate lyase selon la revendication 11, dans lequel les agrobactéries utilisées dans l'étape a) sont choisies parmi les souches LBA4404, GV3101, EHA 101/105 et C58, et dans lequel la transfection de l'étape b) comprend de préférence les étapes suivantes :
bl) culture de la cellule végétale ou de la plante, en aéroponie ou en hydroponie, et sous éclairage LEDs, de préférence pendant cinq semaines en hydroponie sur des flotteurs libres, b2) agroinfiltration de la cellule végétale ou plante obtenue en bl) sous vide, par les agrobactéries obtenues à l'étape a) ; et
b3) remise en culture de la cellule végétale ou de la plante obtenue en b2), typiquement pendant 3 à 6 jours.
13. Procédé de production d'une pectate lyase selon la revendication 11 ou 12, comprenant en outre une étape c) d'extraction de la pectate lyase produite, ladite étape c) comprenant les étapes suivantes :
infiltration sous vide de la cellule végétale ou des feuilles (i.e. partie aérienne) de la plante, dans une solution enzymatique contenant une pectinase ou de la macérozyme, qui ne présente pas d'activité protéolytique,
prélèvement de la cellule végétale infiltrée ou des feuilles infiltrées de la plante et incubation, dans une solution enzymatique de pectinase ou de macérozyme, pendant une durée comprise entre 2h30 et 5h, à une température comprise entre 24°C et 30°C, puis
mise sous agitation du mélange obtenu entre 20 et 30 rpm à température ambiante pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2h,
filtration puis éventuellement centrifugation du digestat obtenu, et
récupération du surnageant.
14. Pectate lyase susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 10 à 13.
15. Pectate lyase selon la revendication 14, pour son utilisation comme médicament.
16. Pectate lyase selon la revendication 14 pour son utilisation en immunothérapie allergique, seule ou en combinaison avec au moins un autre allergène d'Astéracée.
17. Pectate lyase selon la revendication 14 ou 15 pour son utilisation en immunothérapie allergique, en combinaison avec au moins Γ allergene d'Astéracée Amb a i l et/ou Amb a 5.
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ES15732775T ES2781861T3 (es) 2014-05-23 2015-05-20 Producción comercial del alergeno Amb a1 por expresión transitoria en plantas
US15/313,802 US20170159037A1 (en) 2014-05-23 2015-05-20 Commercial production of allergen amb a 1 by means of transient expression in plants
CA2949875A CA2949875C (fr) 2014-05-23 2015-05-20 Production commerciale de l'allergene amb a1 par expression transitoire chez les plantes
DK15732775.0T DK3145948T3 (da) 2014-05-23 2015-05-20 Kommerciel produktion af allergen amb a 1 ved hjælp af transient ekspression i planter

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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6817341B2 (ja) * 2016-06-14 2021-01-20 ブロムクイスト、リチャード 宇宙船及び制御方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1255510A (fr) 1960-01-28 1961-03-10 S E B A M Charnière invisible pour porte de meuble
WO2000020612A2 (fr) * 1998-10-07 2000-04-13 Syngenta Participations Ag Proteines vegetales a action therapeutique
FR2809413A1 (fr) * 2000-05-29 2001-11-30 Tabacs & Allumettes Ind Production d'allergenes recombinants dans des cellules vegetales
WO2008056265A2 (fr) 2006-11-08 2008-05-15 Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs Ensemble de séquences pour ciblage d'expression et contrôle des modifications post-traduction d'un polypeptide de recombinaison
EP2692732A1 (fr) * 2012-08-03 2014-02-05 Stallergenes S.A. Nouvel allergène du pollen d'ambroisie et ses utilisations

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1255510A (fr) 1960-01-28 1961-03-10 S E B A M Charnière invisible pour porte de meuble
WO2000020612A2 (fr) * 1998-10-07 2000-04-13 Syngenta Participations Ag Proteines vegetales a action therapeutique
FR2809413A1 (fr) * 2000-05-29 2001-11-30 Tabacs & Allumettes Ind Production d'allergenes recombinants dans des cellules vegetales
WO2008056265A2 (fr) 2006-11-08 2008-05-15 Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs Ensemble de séquences pour ciblage d'expression et contrôle des modifications post-traduction d'un polypeptide de recombinaison
EP2692732A1 (fr) * 2012-08-03 2014-02-05 Stallergenes S.A. Nouvel allergène du pollen d'ambroisie et ses utilisations

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"An Integrated View of the Molecular Recognition and Toxinology - From Analytical Procedures to Biomedical Applications", 1 July 2013, INTECH, ISBN: 978-9-53-511151-1, article JOS CANTILLO ET AL: "From Molecular Cloning to Vaccine Development for Allergic Diseases", XP055161355, DOI: 10.5772/52821 *
GREGORY P. POGUE ET AL: "Production of pharmaceutical-grade recombinant aprotinin and a monoclonal antibody product using plant-based transient expression systems", PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 8, no. 5, 1 June 2010 (2010-06-01), pages 638 - 654, XP055038517, ISSN: 1467-7644, DOI: 10.1111/j.1467-7652.2009.00495.x *
GRIFFITH I J ET AL: "SEQUENCE POLYMORPHISM OF AMB A I AND AMB A II, THE MAJOR ALLERGENS IN AMBROSIA ARTEMISIIFOLIA (SHORT RAGWEED)", INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND APPLIED IMMUNOLOGY, BASEL, CH, vol. 96, no. 4, 1 January 1991 (1991-01-01), pages 296 - 304, XP000647685, ISSN: 0020-5915 *
LOÏC FAYE ET AL: "Success stories in molecular farming-a brief overview", PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 8, no. 5, 9 May 2010 (2010-05-09), pages 525 - 528, XP055038398, ISSN: 1467-7644, DOI: 10.1111/j.1467-7652.2010.00521.x *
MURRAY ET AL., NUCLEIC ACID RES, vol. 17, 1980, pages 477 498
PEARSON; LIPMAN, PNAS, vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448
SMITH; WATERMAN; 1981, J. MOL EVOL., vol. 18, pages 38 - 46
VOINNET O ET AL: "An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus", THE PLANT JOURNAL, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, OXFORD, GB, vol. 33, no. 5, 1 March 2003 (2003-03-01), pages 949 - 956, XP002367694, ISSN: 0960-7412, DOI: 10.1046/J.1365-313X.2003.01676.X *

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