EP4048258A1 - Analogues de n-acyl-homoserine lactones et composition pharmaceutique les comprenant - Google Patents

Analogues de n-acyl-homoserine lactones et composition pharmaceutique les comprenant

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Publication number
EP4048258A1
EP4048258A1 EP20796580.7A EP20796580A EP4048258A1 EP 4048258 A1 EP4048258 A1 EP 4048258A1 EP 20796580 A EP20796580 A EP 20796580A EP 4048258 A1 EP4048258 A1 EP 4048258A1
Authority
EP
European Patent Office
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oxo
chem
formula
cells
hsl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20796580.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Seksik
Jean-Pierre GRILL
Jean-Maurice Mallet
Dominique RAINTEAU
Cécilia LANDMAN
Agathe PEYROTTES
Loïc BROT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Sorbonne Université
École Normale Supérieure - PSL
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
Assistance Publique - Hôpitaux de Paris
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Sorbonne Université
École Normale Supérieure - PSL
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/32—Oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/70—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/72—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C235/74—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of a saturated carbon skeleton

Definitions

  • TITLE ANALOGUES OF N-ACYL-HOMOSERINE LACTONS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THEM
  • the invention relates to analogs of N-acyl-homoserine lactones (AHLs) and pharmaceutical compositions comprising them. It also relates to their use in the treatment of inflammatory diseases of the epithelium. Inflammatory diseases of the epithelium affect both the digestive tract and the skin. Indeed, these organs are in direct contact with the external environment and their microbiome is specific. Inflammatory skin diseases include psoriasis.
  • IBD Chronic inflammatory bowel disease
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • CD can a priori affect all segments of the digestive tract, but more frequently affects the ileum, colon and anus.
  • the disease presents with transmural inflammation, i.e. affecting the different layers of the digestive wall, which can cause severe complications in patients, such as strictures and fistulas.
  • UC affects the rectum and the terminal part of the colon. The resulting inflammation is usually limited to the intestinal mucosa and submucosa.
  • the pathophysiology of IBD is complex and still poorly understood, but obviously involves multiple factors including environmental causes, genetic predisposition, immune disturbances, a defect in barrier function and an imbalance, called dysbiosis, of the intestinal flora: the microbiota.
  • the gut microbiota plays an important role in controlling inflammation and regulating barrier function.
  • barrier strengthening mechanisms have been described, such as the stimulation of the secretion of antimicrobial peptides or mucus, but little work has analyzed the influence of the commensal microbiota on the permeability of tight junctions, which are the key players in the control of paracellular permeability.
  • Quorum sensing is a mode of communication between the individuals of a bacterial colony, based on the secretion into the surrounding environment of small diffusible molecules playing the role of chemical messengers and called auto-inducers (AI). Quorum sensing is based on the density of bacteria present in the medium and on the concentration of signal molecules in their close environment. The quantity of molecules in the medium is a direct reflection of the state of the colony: when the number of individuals is low, the concentration of auto-inducers is also low; but when the cell density increases, the concentration of molecules in turn increases until it crosses a threshold beyond which one or more bacterial phenotypes are modified. This is called a quorum threshold.
  • sensing refers to the ability of bacteria to detect molecules in the medium via appropriate receptors, hence the name auto-inducers because the molecules are both secreted and detected.
  • Quorum sensing involving N-acyl-homoserine lactones (AHLs) is a mode of inter-bacterial communication described in Gram-negative bacteria in many ecosystems. These molecules are also capable of exerting effects on the host's cells, in a so-called “inter-kingdom” dialogue.
  • inter-kingdom the presence of molecules of the AHLs type in the intestinal ecosystem has hitherto remained very little described.
  • the intestinal microbiota includes all the microorganisms (bacteria, yeasts, archaea and viruses) present in our digestive tract, including 10 14 bacteria (about 10 times the number of human cells, although this ratio is subject to debate) distributed in a thousand species.
  • the relationship between the host and its gut microbiota is symbiotic, as it mutually benefits both parties.
  • the host provides nutrients via its food bolus, while the microbiota performs many physiological functions (metabolism of carbohydrates and lipids, transformation of bile acids, etc.), immune (“education” of the immune system), but also ecological, because the occupation of the intestinal space by a commensal flora prevents colonization by pathogenic species.
  • microbiota of an adult individual is unique to them, major common characteristics have been identified to describe a healthy microbiota in a state of normobiosis.
  • the dominant microbiota or core microbiome is made up of 4 phyla: Firmicutes and Bacteroidetes are strongly represented, and to a lesser extent Actinobacteria and Proteobacteria phyla.
  • an imbalance may appear in the representation of the bacterial populations normally present: this is dysbiosis. It has thus been shown that there is a state of dysbiosis in IBD, which certainly constitutes a key element in the establishment of these pathologies, although these mechanisms of establishment have not yet been elucidated.
  • This dysbiosis is characterized by a loss of diversity with changes in the microbial composition (decreased Bacteroidetes and Firmicutes with in particular a significant loss of the Clostridia genus, increase in Gammaproteobacteria and the appearance of new groups such as AIEC and Fusobacterium) and in the functions. of the microbiota (metabolism of amino acids and biosynthesis of SCFAs and reduced butyrate, increased oxidative stress, etc.). As described previously, QS is involved in bacterial inter-species communication, but can also intervene in host-microbiota relationships (interkingdom or inter-kingdom in French).
  • this molecule can modulate the immune response of the host by acting as a virulence factor in itself and lead to an inflammatory response by induction of immune cells and pro-inflammatory cytokines through the expression of NF- kappaB.
  • the entry of AHL into eukaryotic cells was demonstrated in 2007 by Ritchie et al.
  • ECollection 2018 are known and described as molecules having an anti-inflammatory effect and an action on tight junctions. These two molecules (3-oxo-C12-HSL produced by a pathogen and 3-oxo-C12: 2-HSL associated with a healthy microbiota) both act on eukaryotic cells in the intestinal ecosystem. However, "natural" AHLs are molecules with poor stability.
  • AHLs The degradation of AHLs can lead to two different by-products: on the one hand, hydrolysis of the lactone head produces an open form of AHL exhibiting a new alcohol function and a carboxylic acid (this molecule will be referred to here as 3 -oxo-C12-HS); on the other hand, a rearrangement of the molecule can give a new molecule called tetramic acid.
  • the transformation of AHLs into open form can take place by spontaneous hydrolysis in an aqueous medium, or else be catalyzed by enzymes secreted by the intestinal epithelium of mammals, and in particular paraoxonases (PON1, 2 and 3). Besides the question of the stability of AHLs, the recognition of these molecules by bacterial receptors is problematic.
  • the invention aims to provide molecules bio-inspired by natural AHLs (analogs of natural AHLs) whose structural modifications are intended: - to increase their stability, - to limit their toxicity, - to allow their direct use as therapeutic molecules, - to modulate their biological activity, - to study their impact on the host, - to exploit their properties for therapeutic purposes.
  • the invention provides a compound having the following general formula I: [Chem 3] in which: - X, Y, Z and W are independently of each other a carbon atom or a heteroatom chosen from S, N and O, provided that X is different from O, - X, Y, Z and W are independently of each other optionally substituted by a halogen chosen from Cl, F, Br, and I, or a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group, - x, y, z, and w, independently of each other others are 0 or 1, provided that 3 ⁇ x + y + z + w ⁇ 4, - R represents H or a linear or branched C1 to C4 alkyl group, or a hydroxyl group (OH) or an azido group (N3 ), - R 'represents H or a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group - - ----- represents a single or double bond (-cis or
  • the compound of formula I is chosen from the group formed by: - - (D / L) -3oxoC12 aminothiolactone ((D / L) -3oxoC12 -HTL) of following formula I-1: [Chem 4] (D / L) -3oxoC 12 -HTL Formula I-1 - la (S, S) 3-oxo C12-aminocyclohexanol (S, S) 3-oxo C12-ACH) of formula I-2 following: [Chem 5] - (S) -3 – oxo C12 aminothiolactone ((S) -3oxoC12 –HTL) of the following formula I-3: [Chem 6] - (R, S) -3-oxo C 12 -aminocyclohexanol of the following formula I-4: [Chem 7] -
  • the invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: - at least one compound having the following general formula I: [Chem 10]
  • Formula I in which: - X, Y, Z and W are independently of each other a carbon atom or a heteroatom selected from S, N and O, provided that X is other than O, - X, Y , Z and W are independently of each other optionally substituted by a halogen selected from Cl, F, Br, and I, or a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group, - x, y, z, and w, independently of each other is 0 or 1, provided that 3 ⁇ x + y + z + w ⁇ 4, - R represents H or a linear or branched C1 to C4 alkyl group, or a hydroxyl group (OH) or an azido group (N 3 ), - R 'represents H or a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group
  • the at least one compound of formula I is chosen from the group formed by: - - (D / L) -3oxoC 12 aminothiolactone ((D / L) -3-oxo-C 12 -HTL) of the following formula I-1: (D / L) -3oxoC 12 -HTL Formula I-1 - la (S, S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol (S, S) 3-oxo C12-ACH) of formula I-2 as follows: [Chem 12 ] , - (S) -3 – oxo C12 aminothiolactone ((S) -3oxoC12 –HTL) of the following formula I-3: [Chem 13] - (R, S) -3-oxo C 12 -aminocyclohexanol of the following formula I-4: [Chem 14] - 3-oxo C12-aminocyclohexanol
  • FIG. 1 shows in bar graph the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in the presence of (D, L) -3oxo C12 aminothiolactone of formula I-1 used in the invention
  • FIG. 2 shows the activation curves of the LasR receptor on a reporter bacterial strain compared to the natural molecules C4-HSL and 3-oxo-C12-HSL and to the molecule of formula I-1 used. in the invention
  • FIG. 3 FIG.
  • FIG. 3 represents in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in the presence of (S, S) 3- oxo C12 aminocyclohexanol (S, S) 3-oxo C12-ACH) of formula I-2 used in the invention
  • FIG. 4 represents the curve of inhibition of the secretion. IL-8 etion by human keratinocytes stimulated by IL-17 and TNF- ⁇ in the presence of increasing doses of (S, S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol (S, S) 3-oxo C12-ACH) of formula I-2 used in the invention
  • FIG. 5 FIG.
  • FIG. 5 represents the curve of inhibition of the secretion of IL-2 by human lymphocytes stimulated by CD2, CD3 and CD28, in the presence of increasing doses of (S, S) 3-oxo C 12 - aminocyclohexanol (S, S) 3-oxo C12-ACH) of formula I-2 used in the invention
  • FIG. 6 shows the activation curves of the LasR receptor on a reporter bacterial strain relative to the natural 3-oxo-C 12 HSL molecule and to the molecule of formula I-2 used in the invention
  • FIG. 7 FIG.
  • FIG. 7 represents in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1ß in the presence of (S) -3 – oxo C12 aminothiolactone ((S) -3oxoC12 - HTL) of formula I-3 used in the invention
  • FIG. 8 represents in the form of a bar graph the results of stimulation of murine cells Raw 264.7 by the combination IFN- ⁇ / LPS in the presence of (S, S) -3 – oxo C12 ami- nocyclohexanol ((S, S) -3 oxo C12-ACH) of formula I-2 used in the invention
  • FIG. 9 represents in bar graph form the results of stimulation of Caco- cells.
  • FIG. 10 represents in the form of a bar graph the results of stimulation of raw 264.7 murine cells by the IFN- ⁇ / LPS combination in the presence of (R, S) 3-oxo C12- ACH) of formula I-4 used in the invention, [Fig. 11] FIG.
  • FIG. 11 shows the curves of activation of the LasR receptor on a reporter bacterial strain compared to the natural molecule 3-oxo-C12-HSL and to the (R, S) 3- oxo C12-aminocy-clohexanol of formula I-4 used in the invention
  • FIG. 12 represents in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in presence of 3-oxo C12-aminochlorophenol of formula I-6 used in the invention
  • FIG. 13 FIG.
  • FIG. 13 represents in the form of a bar graph the results of stimulation of murine Raw 264.7 cells by the IFN- ⁇ / LPS combination in the presence of 3-oxo C 12 -amino-chlorophenol of formula I-6 used in the invention
  • FIG. 14 shows the curves of activation of the LasR receptor on a reporter bacterial strain compared to the natural molecule 3-oxo-C 12 -HSL and to the 3 -oxo C 12 -aminochlorophenol of formula I-6 used in the invention.
  • FIG.15 FIG.
  • FIG. 15 represents in the form of a “heat map” the secretion of 23 cytokines by murine cells Raw264.7 under stimulated conditions (LPS 10 ng / mL; IFN- ⁇ 20 U / mL) (normalized by compared to control),
  • Figure 16 represents in the form of histograms: Top, the amount of TNF ⁇ secreted by Raw264.7.7 murine cells stimulated by LPS and interferon ⁇ in the presence of 3-oxo-C12: 2-HSL Bottom, the amount of TNF ⁇ secreted by Raw264.7 murine cells stimulated by LPS and interferon ⁇ in the presence of PCR, [Fig. 17] FIG.
  • FIG. 18 represents in diagram form the results in gene expression obtained by measuring the messenger RNAs by quantitative PCR for 3 cytokines of interest: Rantes, TNF alpha, IL1-beta, [Fig. 18]
  • FIG. 18 represents in the form of histograms the cytotoxicity of the treatments with 3oxoC 12 -HSL (A) and 3oxoC 12 : 2-HSL (B) AHL on stimulated Caco-2 / TC7 cells. Mean values of different replicates (n ⁇ 3) ⁇ SEM, [Fig.
  • Figure 21 represents in the form of histograms the secretion of LDH under stimulated conditions in the Caco-2 / TC7 cell lines (A) and Raw264.7 (B). Mean values of several replicates (n ⁇ 6) ⁇ SEM, [Fig. 22] Figure 22 represents in the form of histograms the secretion of LDH under stimulated conditions in the cell lines Caco-2 / TC7 (A) and Raw264 .7 (B). Average values of several replicates (n ⁇ 8) ⁇ SEM, [Fig. 23] Figure 23 represents in the form of histograms the comparative survival of the E.
  • the invention is based on the discovery of bio-inspired synthetic analogues of N-acyl-homoserine lactones (AHLs) having anti-inflammatory activity and an action on tight junctions at least equal to those of natural AHLs produced in the invention.
  • AHLs N-acyl-homoserine lactones
  • intestine while having better stability, delayed bacterial recognition and lower toxicity.
  • Natural AHLs, produced in the intestine, including the compounds used in the invention are analogs, are 3-oxo-C12-HSL and -oxo-C12: 2-HSL.
  • the inventors have these natural AHLs segmented into three areas of interest: - homoserine lactone Head - Substitution oxo to form a ketone in the 3 rd carbon of the carbon chain - acyl chain from 10 to 16 carbons.
  • the L-enantiomer of AHL is the active form (no activity of the D-enantiomer).
  • the inventors then studied the influence of a modification with various chemical groups of each of these three areas of interest on the biological activity on human and murine cells, on the stability and bacterial recognition of the analogues thus obtained.
  • the length of the carbon chain can be from 10 and up to 16 carbon atoms, with an optimal length of 14 carbon atoms, and only tolerates the addition of chemical groups of small steric hindrance.
  • the presence of the lactone group in position C3 is necessary, since its removal or its transformation into acetal inhibits the anti-inflammatory activity of AHLs.
  • the head group can only tolerate minor modifications which do not excessively increase its size and which retain chemical groups capable of forming hydrogen bonds.
  • the compounds used in the invention for the treatment of inflammatory diseases of the epithelium, and in particular inflammatory diseases of the intestine and psoriasis have the following general formula I: [Chem 17] Formula I in which: - X, Y, Z and W are independently of each other a carbon atom or a heteroatom selected from S, N and O, provided that X is other than O, - X, Y, Z and W are independently of each other optionally substituted by a halogen selected from Cl, F, Br, and I, or a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group, - x, y, z, and w, independently each other is 0 or 1, provided that 3 ⁇ x + y + z + w ⁇ 4, - R represents H or a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group, or a hydroxyl group (OH) or an azido group (N3), - R 'represents H or a linear formula I
  • the pharmaceutical composition can be formulated for any form of administration, in a solid or liquid or semi-solid form, such as for example in the form of gel, cream, balm and can be administered orally, rectally, intravenously, or topical.
  • This pharmaceutical composition is in particular intended for the treatment of an inflammatory disease of the epithelium, and in particular of an inflammatory bowel disease and psoriasis.
  • Preferred compounds for use in the treatment of inflammatory disease of the epithelium are the following compounds.
  • the first of these compounds is (D / L) -3oxoC12 aminothiolactone ((D / L) -3oxoC 12 - HTL) of the following formula I-1: [Chem 18]
  • the compound of formula I-1 corresponds to natural 3-oxo-C12 HSL in which the lactone head has been replaced by a thiolactone group.
  • FIG. 1 shows in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in the presence of (D / L) -3oxo C12 aminothiolactone of formula I-1 used in the invention, in comparison with DMSO, this compound exhibits in the human enterocytes (cells of the intestinal epithelium) line Caco-2 / TC7 an activity equivalent to that of 3-oxo- C12 natural HSL, and is more active than this at the 100 ⁇ M dose.
  • FIG. 2 shows the activation curves of the LasR receptor on a reporter bacterial strain relative to the natural molecules C 4 -HSL and 3-oxo-C 12 -HSL and to the molecule of formula I-1 used in the invention.
  • the racemic of formula I-1 exhibits a delayed recognition capacity with an EC50 of 125 nM vs. 9 nM for the natural molecule 3-oxo-C 12 -HSL and vs. an absence of recognition (EC 50 > 1000 ⁇ M) for the natural molecule C4-HSL.
  • the second of these compounds is (S, S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol ((S, S) 3 oxo C12- ACH) of formula I-2 below: [Chem 19]
  • the compound of formula I-2 corresponds to 3-oxo-C12 HSL in which the lactone head has been replaced by an (S, S) -aminocyclohexanol group.
  • this compound has a relative EC 50 of 111nM and a maximum inhibition corresponding to 39% of the inhibition obtained in the presence of the reference compound betamethasone, which makes it possible to show the generalization of the anti-inflammatory effects of this molecule to several cell lines, derived from different organs of the human body.
  • Figure 8 shows in bar graph form the results of stimulation of Raw 264.7 murine cells by the IFN- ⁇ / LPS combination in the presence of (S, S) -3 – oxo C12 aminothiolactone ((S, S) -3 oxo C12-ACH) of formula I-2.
  • This figure shows that the compound of formula I-2 is more active than the reference molecule 3-oxo-C12-HSL, and this at all doses in the range of concentrations from 1 to 50 ⁇ M.
  • the third compound is (S) -3 – oxo C12aminothiolactone ((S) -3oxoC12 – HTL) of the following formula I-3: [Chem 20]
  • the compound of formula I-3 corresponds to 3-oxo-C 12 HSL in which the lactone head has been replaced by a thiolactone group.
  • FIG. 7 which represents in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in the presence of (S) -3 – oxo C 12 aminothiolactone ( (S) -3oxoC 12 –HTL) of formula I-3, we find during this stimulation effects observed with the molecule of formula I-3 used in the invention similar to those observed with the natural molecule 3-oxo-C12 -HSL, including a 27% decrease in inflammatory secretion at 5 ⁇ M.
  • the fourth compound is (R, S) -3-oxo C12-aminocyclohexanol of the following formula I-4: [Chem 21] FIG.
  • FIG. 9 represents in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in the presence of (R, S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol ((R, S) 3 - oxo C 12 -ACH) of formula I-4 used in the invention. From FIG. 9, an activity equivalent to that of natural 3-oxo-C12 HSL in the range 1-50 ⁇ M can be seen in the Caco-2 / TC7 human enterocyte line.
  • FIG. 10 represents in the form of a bar graph the results of stimulation of murine cells Raw 264.7 by the IFN- ⁇ / LPS combination in the presence of (R, S) 3-oxo C 12 -ACH of formula I-4 used in the invention. It can be seen from FIG.
  • FIG. 11 shows the activation curves of the LasR receptor on a reporter bacterial strain compared to the natural molecule 3-oxo-C 12 -HSL and to the (R, S) 3-oxo C 12 -aminocy- clohexanol of formula I -4 used in the invention.
  • the (R, S) -3-oxo C12-aminocyclohexanol of formula I-4 exhibits an EC50 of 200 ⁇ M. It therefore has a very markedly delayed recognition capacity compared to natural AHLs.
  • the fifth compound is 3-oxo C 12 -aminocyclohexanol of the following formula I-5: [Chem 22]
  • the compound of formula I-5 corresponds to 3-oxo-C12 HSL in which the lactone head has been replaced by an aminocyclohexanol group.
  • the sixth compound is 3-oxo C12-aminochlorophenol of the following formula I-6: [Chem 23]
  • the compound of formula I-6 corresponds to 3-oxo-C12 HSL in which the lactone head has has been replaced by an aminochlorophenol group.
  • FIG. 12 represents in bar graph form the results of stimulation of Caco-2 / TC7 cells by IL-1 ⁇ in the presence of 3-oxo C 12 -aminochlorophenol of formula I-6 used in the invention. . It can be seen from FIG. 12 that in the Caco-2 / TC7 human enterocyte line, the molecule exhibits significantly greater activity than that of natural 3-oxo-C 12 HSL in the 10-100 ⁇ M range.
  • FIG. 13 represents in bar graph form the results of stimulation of raw 264.7 murine cells by the IFN- ⁇ / LPS combination in the presence of 3-oxo C12-amino-chlorophenol of formula I-6 used in the combination. invention.
  • the molecule of formula I-6 exhibits in the murine macrophage line Raw 264.7 an activity significantly greater than that of natural 3-oxo-C12 HSL in the 10-50 ⁇ M range.
  • FIG. 14 shows the activation curves of the LasR receptor on a reporter bacterial strain compared to the natural molecule 3-oxo-C12-HSL and to the 3-oxo C12-aminochlorophenol of formula I-6 used in the invention.
  • the molecule of formula I-6 exhibits an EC 50 greater than 1000 ⁇ M. It has the most delayed recognition capacity compared to natural AHLs and to the molecules of formula I-1 to I-5 used in the invention. EXAMPLES 1.
  • the antibiotics penicillin-streptomycin, non-essential amino acids (NEAA) and L-glutamine were from Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).
  • Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X DPBS), High Glucose Cell Culture Medium (DMEM GlutaMAX 4.5g / L Glucose), DMEM, and DMEM without Red-Phenol were sourced from Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA).
  • the fetal calf serum was obtained from GE Healthcare (Life Sciences, South Logan, Utah, USA).
  • the 3oxoC 12 -HSL molecule was synthesized on request by the company Diverchim (Roissy-en-France, France • All the absorbance and luminescence tests were read on the SpectraMax M5 spectrometers of the Molecular Devices® brand.
  • the Caco-2 / TC7 cell line • The Caco-2 cell line originates from a human colon adenocarcinoma and represents a cell culture model of enterocytes lining the epithelium of the small intestine.
  • the Caco-2 / TC7 cell line is a clonal population of Caco-2 cells which to a large extent and homogeneously mimics most of the morphological and functional characteristics of normal human enterocytes.
  • Caco-2 / TC7 cells exhibit a contact inhibition property leading to growth arrest when cells reach confluence, which allows the establishment of a cell monolayer.
  • the cells During the exponential growth phase (from seeding to confluence), the cells remain undifferentiated. At the confluence, they can spontaneously (in the absence of differentiation inducers) differentiate and gradually polarize.
  • the differentiation process which is a mechanism related to growth, is maximal at the end of confluence (stationary phase of the growth curve).
  • the medium has been changed every day. Under these conditions, the cells showed confluence on day 6. On day 17, the cells were deprived of serum, and were used on day 18. 1.1.2.
  • the Raw 264.7 Cell Line consists of macrophage-type murine cells derived from the cell line transformed by the Abelson leukemia virus and originating from BALB / c mice. This cell line is very often used as a model of macrophages in vitro.
  • Raw 264.7 cells are capable of phagocytosis and pinocytosis, can kill target cells by antibody-dependent cytotoxicity, and secrete a wide range of inflammatory cytokines as well as nitric oxide (NO).
  • Raw 264.7 cells are a very practical cell line: cells grow quickly, appreciate small diameter wells and should be used before a match. These conditions make it an advantageous line for screening compounds.
  • the cells were used between passages 13 and 26.
  • the Raw 264.7 cells used come from the ATCC bank. They were grown in DMEM supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum and 1% 200 mM L-glutamine, and maintained at 37 ° C with an atmosphere of 5% CO 2 / air. The medium was changed every two days. 1.1.3.
  • the bacterial reporter strain E E.
  • coli pSB1075 • A reporter bacterial strain from Quorum Sensing was used to study the ability of molecules to be recognized by the Pseudomonas aeruginosa AHL receptor (LasR) and to induce activation. Thus, the strain pSB1075 of Escherichia coli was used. • The enterobacterium Escherichia coli does not naturally produce AHL, nor does it have an orphan receptor capable of recognizing AHL. This bioluminescent strain was modified by the addition of a plasmid pSB1075.
  • This plasmid contains genes encoding both tetracycline resistance and expression of the AHL LasR receptor of the bacterium Pseudomonas aeruginosa, as well as a fusion gene derived from the LasR promoter and the luxCDABE gene from Photorhabdus luminescens.
  • the bacterial strain was cultured in LB medium supplemented with 5 ⁇ g / ml of tetracycline to exert selection pressure and to ensure that only the desired strain is amplified.
  • the fusion gene included in the plasmid gives the bacteria the ability to emit bioluminescence when the LasR receptor is activated, and provides the user with a robust assay for molecular screening.
  • aeruginosa LasR receptor is well suited for the recognition of long chain AHLs, especially its natural partner, 3oxoC 12- HSL, which elicits the highest bioluminescent response.
  • short chain AHLs such as C 4 -HSL do not induce the emission of bioluminescence.
  • Caco-2 / TC7 cells were seeded in 6-well plates at 100,000 cells / well and grown for 18 days. On day 17, the cells were serum-deprived - meaning that the cell medium was replaced with medium without fetal calf serum - and used on day 18. • The stimulation medium consisted of a so-called “medium”. starvation ”ie without fetal calf serum (DMEM GlutaMAX, 1% NEAA, 1% penicillin-streptomycin) with 100 ⁇ M 2-HQ.
  • the cells were incubated for 18 h at 37 ° C with 2 ml of stimulation medium containing 0.1% DMSO (negative control) or stimulation medium containing the test compounds at the desired concentrations, with or without pro-inflam cytokines. - materials to induce inflammation. To induce inflammation, either IL-1 ⁇ at 25 ng / ml or the combination of TNF- ⁇ and IFN- ⁇ at 50 ng / ml each were used. After 18 h, the supernatants were collected and stored at -80 ° C before analysis by ELISA test. The cells were washed with 1 ml of 1X PBS / well, and lysed in 100 ⁇ l of 1X PBS containing 1% Triton X-100.
  • Raw 264.7 cells were harvested by scraping and stored at -80 ° C before protein quantification. The LDH assay was performed immediately before freezing. • All cell experiments were performed in triplicates. 1.2.2. Stimulation of Raw 264.7 with LPS and IFN- ⁇ • Raw 264.7 cells were seeded in 12-well plates at 75,000 cells / well, or 24-well plates at 40,000 cells / well, so as to reach 80 to 90% confluence after 3 days of culture. For stimulation, the cells were incubated for 6 h at 37 ° C with 750 ⁇ L (respectively 500 ⁇ L) of cell medium enriched in 2-HQ 100 ⁇ M, containing 0.1% DMSO (negative control) or test compounds.
  • cytokine levels were first normalized to the protein content determined in the corresponding cell lysates. Then, to compare the experiments, they could be further normalized using the activated control condition (DMSO + cytokines) as a 100% response. 1.2.5. Quantification of Murine Cytokines • Levels of murine IL-6 cytokines produced by cells were determined in cell supernatants or lysates using the "BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA Set" commercially available from BD Biosciences ( San Jose, California, USA, ref. 555240). All ELISA kits were used according to the manufacturer's instructions. • Cytokine levels were first normalized to the protein content determined in the corresponding cell lysates.
  • Cytotoxicity test • The cytotoxicity of test compounds and controls, with or without pro-inflammatory cytokines, was assessed using a lactate dehydrogenase (LDH) release test, which follows the release of this enzyme in the supernatants. of cells, a good indicator of membrane damage and cell death. A compound was considered cytotoxic when its level of secreted LDH was greater than 10%. • Two methods can be used to perform the test: measurement with a pyruvate / NADH solution (Sigma), or using the Cytotoxicity PLUS (LDH) detection kit from Roche (Sigma-Aldrich).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the percentage of cytotoxicity could be established with the formula: [Math 1] 1.3.
  • Biological activity of molecules on the bacterial reporter strain E. coli pSB1075 • Escherichia coli does not naturally produce AHL.
  • This bioluminescent strain was developed by the addition of a plasmid pSB1075 containing genes encoding tetracycline resistance and expression of the AHL LasR receptor, as well as a fusion gene of the LasR promoter and the gene luxCDABE from Photorhabdus luminescens.
  • Luminescence was then read at all wavelengths (integration time 200 ms) on a microplate reader.
  • the culture protocol was similar but the bacteria were previously subjected to a pre-incubation with 1, 10 or 100 nM of 3oxoC 12 -HSL for different durations (1, 2, 6 or 16 h) before dilution to obtain P2. After which the incubation was continued according to the standard protocol, with the test compound at the desired concentrations. 1.4.
  • Statistical Analysis • All data are represented as the mean plus or minus SEM of n independent experiments, and have been tested for the Gaussian distribution.
  • Anti-inflammatory effect of the compounds of the invention In order to evaluate the properties of compounds of interest, a line of murine macrophages, the RAW264.7 was used. In order to assess the effect on inflammation, the cells were treated or not by adding a pro-inflammatory cocktail (interferon- ⁇ (IFN- ⁇ , 20U / mL) and lipopolysaccharides (LPS, 10ng / mL)). The inflammatory state was evaluated by Multiplex analysis by assaying the secretion of 23 cytokines in the supernatant of the cells.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • LPS lipopolysaccharides
  • cytokines The results as a heatmap are shown in Figure 15, which shows the secretion of cytokines by RAW264.7 under stimulated conditions (LPS 10 ng / mL; IFN- ⁇ 20 U / mL) (normalized to control). These results make it possible to visualize overall a decrease in the production of cytokines in the presence of PCR at 50 ⁇ M.
  • the cytokines whose production has been modulated by the compounds of the invention are interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, TNF ⁇ , pro-inflammatory cytokines. The decrease in these proteins was dose dependent, and the greatest effects were observed in the presence of PCR at 50 ⁇ M.
  • FIG. 16 2 histograms (the first with 3oxoC12: 2; the 2 nd with PCR) showing the results observed for TNF alpha (results from the Multiplex analysis) are shown in figure 16 (top : TNF ⁇ secreted by RAW264.7 stimulated by LPS and interferon ⁇ in the presence of 3oC12: 2 and below: TNF ⁇ secreted by RAW264.7 stimulated by LPS and interferon ⁇ ⁇ in the presence of PCR).
  • the confirmation of certain results in gene expression was carried out by measuring the messenger RNAs by quantitative PCR, in particular for 3 cytokines of interest: Rantes, TNF aplha, IL1-beta. The results appear in the diagrams shown in FIG. 17.
  • FIG. 19 shows that in the murine cell line Raw264.7, an increase in secreted LDH was observed from 50 ⁇ M for the two AHLs, with a cytotoxicity greater than 10% at the 100 ⁇ M concentration. This phenomenon is observed in basal and stimulated condition, and is therefore attributable to the toxicity of the molecules. This justifies the use of the 1-50 ⁇ M doses in the remainder of the study on the macrophage line. b.
  • Natural AHL 3oxoC12-HSL and 3oxoC12 2-HSL
  • the AHL 3oxoC12-HSL and 3oxoC12: 2-HSL were tested for bactericidal effects in the range 1- 100 ⁇ M. No toxic effects were observed after 18h of incubation: Absorbances recorded were identical to those recorded for LYBHI medium alone and in the presence of 0.1% DMOS: see figure 23. 4.5 Results on bacterial strain a.

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Abstract

La présente invention a pour objet des analogues de N-acyl homosérine lactones (AHLs) et des compositions pharmaceutiques les comprenant. Elle concerne également leur utilisation dans le traitement des maladies inflammatoires de l'épithélium.

Description

TITRE : ANALOGUES DE N-ACYL-HOMOSERINE LACTONES ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LES COMPRENANT L’invention concerne des analogues de N-acyl-homosérine lactones (AHLs) et des com- positions pharmaceutiques les comprenant. Elle concerne également leur utilisation dans le traitement des maladies inflammatoires de l’épithélium. Les maladies inflammatoires de l’épithélium touchent aussi bien le tube digestif que la peau. En effet, ces organes sont en contact direct avec le milieu extérieur et leur microbiome est spécifique. Les maladies inflammatoires de la peau comprennent le psoriasis. Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI ou IBD en anglais) sont représentées par deux maladies principales : la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite Hémorragique (RCH) caractérisées par une inflammation chronique de la muqueuse intestinale menant à des dommages de l’intestin et à un risque de cancer intestinal accru (multiplié par 4 par rapport à la popultion globale pour le colon et multiplié par 40 pour l’intestin grêle). Les conséquences socio-économiques sont importantes car les MICI affectent les sujets jeunes et leur incidence est relativement élevée dans les pays industrialisés (8 à 15 pour 100000 habitants/an). Le risque à long terme est estimé à 1% en Europe et la MC tout comme la RCH demeurent des maladies incurables. Des progrès récents dans les traitements des MICI incluant l’expansion des agents biologiques ont permis d’obtenir une rémission clinique rapide et une qualité de vie améliorée chez de nombreux patients MICI. Cependant, ces thérapies immunosuppressives puissantes ne sont pas toujours efficaces, sont coûteuses et induisent potentiellement des effets secondaires graves. Il y a donc un besoin pour des approches plus physiologiques pour induire et maintenir les rémissions avec une toxicité limitée et une efficacité de coût élevée. La MC peut a priori atteindre tous les segments du tube digestif, mais touche plus fré- quemment l’iléon, le colon et l’anus. La maladie présente une inflammation transmurale, c’est à dire touchant les différentes couches de paroi digestive, pouvant provoquer des complications sévères chez les patients, telles que des sténoses et des fistules. La RCH affecte le rectum et la partie terminale du colon. L’inflammation résultante est généralement limitée aux muqueuses et sous-muqueuses intestinales. La physiopathologie des MICI est complexe et encore méconnue mais, à l’évidence, met en jeu des facteurs multiples parmi lesquels des causes environnementales, une prédisposition génétique, des perturbations immunitaires, un défaut de la fonction barrière et un déséquilibre, appelé dysbiose, de la flore intestinale : le microbiote. Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le contrôle de l’inflammation et la régulation de la fonction de barrière. Plusieurs mécanismes de renforcement de la barrière ont été décrits, comme la stimulation de la sécrétion de peptides anti-microbiens ou du mucus, mais peu de travaux ont analysé l'influence du microbiote commensal sur la perméabilité des jonc- tions serrées, qui sont les acteurs clés du contrôle de la perméabilité paracellulaire. Le quorum sensing (QS) est un mode de communication entre les individus d’une colonie bactérienne, basé sur la sécrétion dans le milieu environnant de petites molécules diffusibles jouant le rôle de messagers chimiques et appelées auto-inducteurs (AI). Le quorum sensing repose sur la densité de bactéries présentes dans le milieu et sur la concentration de molécules signal dans leur environnement proche. La quantité de molécules dans le milieu est un reflet direct de l’état de la colonie : lorsque le nombre d’individus est faible, la concentration en auto-inducteurs l’est également ; mais lorsque la densité cellulaire augmente, la concentration en molécules croît à son tour jusqu’à franchir un seuil au-delà du- quel un ou des phénotypes bactériens sont modifiés. C’est ce seuil qu’on appelle quorum. Le terme sensing réfère la capacité de détection des molécules dans le milieu par les bactéries via des récepteurs appropriés, d’où le nom d’auto-inducteurs car les molécules sont à la fois sécré- tées et détectées. Le quorum sensing impliquant les N-acyl-homosérine lactones (AHLs) est un mode de communication inter-bactérienne décrit chez les bactéries Gram-négatif dans de nombreux éco- systèmes. Ces molécules sont également capables d’exercer des effets sur les cellules de l’hôte, dans un dialogue dit « inter-règne ». Cependant, la présence de molécules de type AHLs dans l'éco- système intestinal restait jusqu'ici très peu décrite. Le microbiote intestinal regroupe l’ensemble des micro-organismes (bactéries, levures, archées et virus) présents dans notre tube digestif, parmi lesquels 1014 bactéries (environ 10 fois le nombre de cellules humaines, bien que ce ratio soit sujet à discussion) réparties en un millier d’espèces. La relation entre l’hôte et son microbiote intestinal est symbiotique, car elle bénéficie mutuellement aux deux parties. L’hôte fournit des nutriments via son bol alimentaire, tandis que le microbiote remplit de nombreuses fonctions d’ordre physiologique (métabolisme des glucides et des lipides, transformation des acides biliaires…), immunitaire (« éducation » du système immunitaire), mais aussi écologique, car l’occupation de l’espace intestinal par une flore commensale prévient la colonisation par des espèces pathogènes. Bien que le microbiote d’un individu adulte lui soit propre, de grandes caractéristiques communes ont pu être mises en évidence pour décrire un microbiote sain en état de normobiose. Le microbiote dominant ou core microbiome est constitué de 4 phyla : les Firmicutes et Bacte- roidetes sont fortement représentés, et dans une moindre mesure les phyla Actinobacteria et Proteobacteria. Dans certaines situations, il peut apparaître un déséquilibre dans la représentation des populations bactériennes normalement présentes : c’est la dysbiose. Il a ainsi été montré qu’il existait un état de dysbiose dans les MICI, qui constitue certainement un élément clé de la mise en place de ces pathologies, bien que ces mécanismes de mise en place soient à ce jour non élucidés. Cette dysbiose est caractérisée par une perte de diversité avec des changements dans la composition microbienne (Bacteroidetes et Firmicutes diminués avec notamment une perte importante du genre Clostridia, accroissement des Gammaproteobacteria et apparition de nou- veaux groupes comme les AIEC et Fusobacterium) et dans les fonctions du microbiote (méta- bolisme des acides aminés et biosynthèse des SCFAs et du butyrate diminués, accroissement du stress oxydant…). Comme décrit précédemment, le QS est mis en jeu dans la communication inter-espèces bactériennes, mais peut également intervenir dans les relations hôte-microbiote (interkingdom ou inter-règne en français). Il a été décrit dans des écosystèmes marins et diverses rhizosphères, mais aussi chez certains pathogènes gastro-intestinaux comme Yersinia. Ce dernier est capable de sécréter au moins huit AHLs différentes et possède deux systèmes homologues de LuxI/LuxR, qui le rendent sensibles aux AHLs produites par d’autres populations bactériennes. D’autres espèces ont été décrites comme possédant le récepteur SdiA (un récepteur homologue de LuxR non associé à une AHL synthase, et donc présent chez des espèces capables de détecter les AHLs sans pour autant en synthétiser elles-mêmes). De plus en plus d’études se penchent sur l’impact des AHLs, et tout particulièrement de la 3-oxo-C12 HSL produite par le pathogène Pseudomonas aeruginosa, sur les cellules de l’hôte humain. Il a été montré que cette molécule pouvait moduler la réponse immunitaire de l’hôte en agissant comme un facteur de virulence en soi et conduire à une réponse inflammatoire par induction de cellules immunitaires et cytokines pro-inflammatoires au travers de l’expression de NF-kappaB. L’entrée de l’AHL dans les cellules eucaryotes a été démontrée en 2007 par Ritchie et al. (Ritchie AJ, Jansson A, Stallberg J, Nilsson P, Lysaght P, Cooley MA, The Pseu- domonas aeruginosa Quorum-Sensing Molecule N-3-(Oxododecanoyl)-L-Homoserine Lactone Inhibits T-Cell Differentiation and Cytokine Production by a Mechanism Involving an Early Step in T-Cell Activation, Infect Immun. 2005;73: 1648–1655, doi:10.1128/IAI.73.3.1648- 1655,2005). L’attention s’est ainsi tournée vers la détection de molécules du QS dans le microbiote intestinal : la synthèse de la molécule du QS d’auto-induction de type 2 (AI-2) a été rapportée dans neuf espèces commensales et dans les selles de sujets sains, mais les études sur les AHLs (AI-1) restent plus rares. La présence d’AHLs dans les selles de nouveau-nés a été mise en évidence par bioluminescence. Les inventeurs ont pu mettre en évidence plusieurs AHLs dans l’écosystème intestinal, dont l’une est perdue chez les patients atteints de MICI en période de poussée inflammatoire, une 3-oxo-C12:2-HSL de formule B suivante : [Chem 1] Formule B. Ils ont montré que cette AHL était associée à un microbiote sain. A ce jour deux AHL "naturelles", la 3-oxo- C12-HSL de formule A suivante : [Chem 2] et la 3-oxo-C12:2- HSL de formule B (activités divulguées dans Inter-kingdom effect on epithelial cells of the N- Acyl homoserine lactone 3-oxo-C12:2, a major quorum-sensing molecule from gut microbiota, Landman C, Grill JP, Mallet JM, Marteau P, Humbert L, Le Balc'h E, Maubert MA, Perez K, Chaara W, Brot L, Beaugerie L, Sokol H, Thenet S, Rainteau D, Seksik P, Quévrain E; Saint Antoine IBD Network, PLoS One, 20129;13(8):e0202587 doi:10.1371/journal.pone.0202587. eCollection 2018) sont connues et décrites comme étant des molécules ayant un effet anti-in- flammatoire et une action sur les jonctions serrées. Ces deux molécules (la 3-oxo-C12-HSL produite par un pathogène et la 3-oxo-C12 :2- HSL associée à un microbiote sain) ont toutes deux une action sur les cellules eucaryotes de l’écosystème intestinal. Cependant, les AHLs "naturelles", sont des molécules à la stabilité médiocre. La dégra- dation des AHLs peut conduire à deux sous-produits différents : d'une part l’hydrolyse de la tête lactone produit une forme ouverte de l’AHL présentant une nouvelle fonction alcool et un acide carboxylique (cette molécule sera ici nommée 3-oxo-C12-HS) ; d'autre part un réarrangement de la molécule peut donner une nouvelle molécule appelée acide tétramique. La transformation des AHLs en forme ouverte peut avoir lieu par hydrolyse spontanée en milieu aqueux, ou bien être catalysée par des enzymes sécrétées par l’épithélium intestinal des mammifères, et notamment les Paraoxonases (PON1, 2 et 3). Outre la question de la stabilité des AHLs, la reconnaissance de ces molécules par des récepteurs bactériens est problématique. Il convient de garder à l’esprit qu’il s’agit en premier lieu de composés sécrétés par des bactéries pour des bactéries, et que celles-ci possèdent donc des récepteurs aux AHLs dont l’activation entraîne une cascade de réactions pour aboutir à la modification d’un phénotype. Entre autres, chez P. aeruginosa, l’activation du récepteur aux AHLs LasR dont le ligand naturel est la 3-oxo-C12-HSL provoque en aval la formation de biofilms et une sécrétion accrue de plusieurs facteurs de virulence, dont par exemple la pyocya- nine. Cette activation des récepteurs bactériens est problématique car elle empêche l’emploi direct d’AHL contre l’inflammation, en particulier dans les MICI. Les risques d’activation de la pathogénicité de certaines souches bactériennes sont des effets indésirables bien trop impor- tants. Dans ce contexte, l’invention vise à fournir des molécules bio-inspirées des AHLs natu- relles (analogues des AHLs naturelles) dont les modifications structurales ont pour but : - d’augmenter leur stabilité, - de limiter leur toxicité, - de permettre leur utilisation directe comme molécules thérapeutiques, - de moduler leur activité biologique, - de permettre d'étudier leur impact sur l'hôte, - d'exploiter leurs propriétés à des fins thérapeutiques. A cet effet, l’invention propose un composé ayant la formule générale I suivante : [Chem 3] dans laquelle : - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres un atome de carbone ou un hétéroatome choisi parmi S, N et O, à condition que X soit différent de O, - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres éventuellement substitués par un halo- gène choisi parmi Cl, F, Br, et I, ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, - x, y, z, et w, indépendamment les uns des autres valent 0 ou 1, à condition que 3 ≤ x + y+ z + w ≤ 4, - R représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, ou un groupe hydroxyle (OH) ou un groupe azido (N3), - R ‘représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4 - - ----- représente une liaison simple ou double (-cis ou trans) pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’épithélium. La maladie inflammatoire de l’épithélium est plus particulièrement une maladie inflammatoire de l’intestin ou le psoriasis. De préférence, le composé de formule I est choisi dans le groupe formé par : - - la (D/L)-3oxoC12 aminothiolactone ((D/L)-3oxoC12 -HTL) de formule I-1 suivante : [Chem 4] (D/L)-3oxoC12-HTL Formule I-1 - la (S,S) 3-oxo C12-aminocyclohexanol (S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 suivante : [Chem 5] - la (S)-3–oxo C12 aminothiolactone ((S)-3oxoC12 –HTL) de formule I-3 suivante : [Chem 6] - la (R,S)-3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-4 suivante : [Chem 7] - la 3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-5 suivante : [Chem 8] - 3-oxo C12-aminochlorophénol de formule I-6 suivante : [Chem 9]
L’invention propose également une composition pharmaceutique comprenant : - au moins un composé ayant la formule générale I suivante : [Chem 10] Formule I dans laquelle : dans laquelle : - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres un atome de carbone ou un hétéroatome choisi parmi S, N et O, à condition que X soit différent de O, - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres éventuellement substitués par un halo- gène choisi parmi Cl, F, Br, et I, ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, - x, y, z, et w, indépendamment les uns des autres valent 0 ou 1, à condition que 3 ≤ x + y+ z + w ≤ 4, - R représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, ou un groupe hydroxyle (OH) ou un groupe azido (N3), - R ‘représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4 - - ----- représente une liaison simple ou double (-cis ou trans), et - au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. De préférence, dans la composition pharmaceutique de l’invention, le au moins un composé de formule I est choisi dans le groupe formé par : - - la (D/L)-3oxoC12 aminothiolactone ((D/L)-3-oxo-C12-HTL) de formule I-1 sui- vante : (D/L)-3oxoC12-HTL Formule I-1 - la (S,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol (S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 sui- vante : [Chem 12] , - la (S)-3–oxo C12 aminothiolactone ((S)-3oxoC12 –HTL) de formule I-3 suivante : [Chem 13] - la (R,S)-3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-4 suivante : [Chem 14] - la 3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-5 suivante : [Chem 15] - 3-oxo C12-aminochlorophénol de formule I-6 suivante : [Chem 16] La composition pharmaceutique selon l’invention est de préférence pour une utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’épithélium, plus particulièrement une maladie inflammatoire de l’intestin ou le psoriasis. L’invention sera mieux comprise et d’autres avantages et caractéristiques de celle-ci ap- paraitront plus clairement à la lecture de la description explicative qui suit et qui est faite en relation avec les figures annexées dans lesquelles : FIGURES [Fig.1] La figure 1 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (D,L)-3oxo C12 aminothiolactone de formule I-1 utilisée dans l’invention, [Fig.2] La figure 2 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport aux molécules naturelles C4-HSL et 3-oxo-C12-HSL et à la molécule de formule I-1 utilisée dans l’invention, [Fig.3] La figure 3 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (S,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol (S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, [Fig.4] La figure 4 représente la courbe d’inhibition de la sécrétion d’IL-8 par des kératinocytes humains stimulés par IL-17 et TNF-α en présence de doses croissantes de la (S,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol (S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, [Fig.5] La figure 5 représente la courbe d’inhibition de la sécrétion d’IL-2 par des lymphocytes humains stimulés par CD2, CD3 et CD28, en présence de doses croissantes de la (S,S) 3-oxo C12- aminocyclohexanol (S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, [Fig.6] La figure 6 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport à la molécule naturelle 3-oxo-C12HSL et à la molécule de formule I-2 utilisée dans l’invention, [Fig.7] La figure 7 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (S)-3–oxo C12 aminothiolactone ((S)-3oxoC12 – HTL) de formule I-3 utilisée dans l’invention, [Fig.8] La figure 8 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules murines Raw 264.7 par la combinaison IFN-γ /LPS en présence de la (S,S)-3–oxo C12 ami- nocyclohexanol ((S,S)-3 oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, [Fig.9] La figure 9 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (R,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol (R,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-4 utilisée dans l’invention, [Fig.10] La figure 10 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules murines Raw 264.7 par la combinaison IFN-γ/LPS en présence de la (R,S) 3-oxo C12- ACH) de formule I-4 utilisée dans l’invention, [Fig.11] La figure 11 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport à la molécule naturelle 3-oxo-C12-HSL et à la (R,S) 3-oxo C12-aminocy- clohexanol de formule I-4 utilisée dans l’invention, [Fig.12] La figure 12 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la 3-oxo C12-aminochlorophénol de formule I-6 utilisée dans l’invention, [Fig.13] La figure 13 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules murines Raw 264.7 par la combinaison IFN-γ/LPS en présence de la 3-oxo C12-amino- chlorophénol de formule I-6 utilisée dans l’invention, et [Fig.14] La figure 14 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport à la molécule naturelle 3-oxo-C12-HSL et à la 3-oxo C12-aminochlorophé- nol de formule I-6 utilisée dans l’invention. [Fig.15] La figure 15 représente sous forme de « heat map » la sécrétion de 23 cytokines par des cellules murines Raw264.7 dans des conditions stimulées (LPS 10 ng/mL ; IFN-γ 20 U/mL) (normalisé par rapport au contrôle), [Fig.16] La figure 16 représente sous forme d’histogrammes : En haut, la quantité de TNF∝ sécrété par des cellules murines Raw264.7.7 stimulées par LPS et interféron^ en présence de 3-oxo-C12 :2-HSL En bas, la quantité de TNF∝ sécrété par des cellules murines Raw264.7 stimulées par LPS et interféron^ en présence de ACP, [Fig.17] La figure 17 représente sous forme de diagramme les résultats en expression génique obtenus en mesurant les ARN messagers par PCR quantitative pour 3 cytokines d’intérêt : Rantes, TNF alpha, IL1-béta, [Fig.18] La figure 18 représente sous forme d’histogrammes la cytotoxicité des traitements aux AHL 3oxoC12-HSL (A) et 3oxoC12 :2-HSL (B) sur cellules Caco-2/TC7 stimulées. Valeurs moyennes de différents réplicats (n ≥ 3) ± SEM, [Fig.19] La figure 19 représente sous forme d’histogrammes la cytotoxicité des traitements aux AHL 3-oxo-C12-HSL (A,C) et 3-oxo-C12 :2-HSL (B,D) sur cellules murines Raw264.7 à l’état basal (A,B) ou stimulé (C,D). Valeurs moyennes de différents réplicats (n=3) ± SEM. stimulé, [Fig.20] La figure 20 représente sous forme d’histogrammes la sécrétion de LDH en condi- tions stimulées dans les lignées cellulaires Caco-2/TC7 (gauche) et Raw264.7 (droite). Va- leurs moyennes de plusieurs réplicats (n ≥ 6) ± SEM, [Fig.21] La figure 21 représente sous forme d’histogrammes la sécrétion de LDH en condi- tions stimulées dans les lignées cellulaires Caco-2/TC7 (A) et Raw264.7 (B). Valeurs moyennes de plusieurs réplicats (n ≥ 6) ± SEM, [Fig.22] La figure 22 représente sous forme d’histogrammes la sécrétion de LDH en condi- tions stimulées dans les lignées cellulaires Caco-2/TC7 (A) et Raw264.7 (B). Valeurs moyennes de plusieurs réplicats (n ≥ 8) ± SEM, [Fig.23] La figure 23 représente sous forme d’histogrammes les survies comparées de la souche E. coli K12 après 18h d’incubation en présence de molécules contrôles ou de doses croissantes des AHL 3oxoC12-HSL et 3oxoC12 :2-HSL. Valeurs moyennes de différents répli- cats (n=6) ± SEM, et [Fig.24] La figure 24 représente sous forme d’histogrammes les survies comparées de la souche E. coli K12 après 18h d’incubation en présence de molécules contrôles ou de 100µM de molécule. Valeurs moyennes de différents réplicats (n=6) ± SEM. L’invention repose sur la découverte d’analogues synthétiques bio-inspirés de N-acyl- homosérine lactones (AHLs) ayant une activité anti-inflammatoire et une action sur les jonc- tions serrées au moins égales à celles des AHLs naturelles produites dans l’intestin tout en ayant une meilleure stabilité, une reconnaissance bactérienne retardée et une toxicité moindre. Les AHLs naturelles, produites dans l’intestin, dont les composés utilisés dans l’invention sont des analogues, sont la 3-oxo-C12-HSL et la -oxo-C12 :2-HSL. Les inventeurs ont segmenté ces AHLs naturelles en trois zones d’intérêt : - Tête homosérine lactone - Substitution oxo pour former une cétone au 3ème carbone de la chaîne carbonée - Chaîne acyle de 10 à 16 carbones. De plus, le L-énantiomère de l’AHL est la forme active (pas d’activité du D-énantiomère). Les inventeurs ont alors étudié l’influence d’une modification avec divers groupements chimiques de chacune de ces trois zones d’intérêt sur l’activité biologique sur cellules humaines et murines, sur la stabilité et la reconnaissance bactérienne des analogues ainsi obtenus. Ils ont alors découvert que la longueur de la chaine carbonée peut être de 10 et jusqu’à 16 atomes de carbone, avec une longueur optimale de 14 atomes de carbone, et ne tolère l'ajout de groupements chimiques que de faible encombrement stérique. La présence du groupement lac- tone en position C3 est nécessaire, car son retrait ou sa transformation en acétal inhibe l'activité anti-inflammatoire des AHLs. Le groupement de tête ne peut tolérer que des modifications mi- neures n'accroissant pas excessivement sa taille et conservant des groupements chimiques ca- pables de donner des liaisons hydrogènes. Ainsi, les composés utilisés dans l’invention pour le traitement des maladies inflamma- toires de l’épithélium, et en particulier des maladies inflammatoires de l’intestin et le psoriasis, ont la formule générale I suivante : [Chem 17] Formule I dans laquelle : - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres un atome de carbone ou un hétéroatome choisi parmi S, N et O, à condition que X soit différent de O, - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres éventuellement substitués par un halo- gène choisi parmi Cl, F, Br, et I, ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, - x, y, z, et w, indépendamment les uns des autres valent 0 ou 1, à condition que 3 ≤ x + y+ z + w ≤ 4, - R représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, ou un groupe hydroxyle (OH) ou un groupe azido (N3), - R ‘représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4 - ----- représente une liaison simple ou double (-cis ou trans). Ces composés de formule I peuvent être utilisés en combinaison avec un excipient phar- maceutiquement acceptable pour former une composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique peut être formulée pour toute forme d’administration, sous une forme solide ou liquide ou semi-solide, comme par exemple sous forme de gel, de crème, de baume et peut être administrée par voie orale, rectale, intraveineuse, ou topique. Cette composition pharmaceutique est en particulier destinée au traitement d’une maladie inflammatoire de l’épithélium, et en particulier d’une maladie inflammatoire de l’intestin et le psoriasis. Les composés préférés pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’épithélium sont les composés suivants. Le premier de ces composés est la (D/L)-3oxoC12 aminothiolactone ((D/L)-3oxoC12 - HTL) de formule I-1 suivante : [Chem 18] Le composé de formule I-1 correspond à la 3-oxo-C12 HSL naturelle dans laquelle la tête lactone a été remplacée par un groupement thiolactone. Comme on le voit en figure 1, qui représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (D/L)-3oxo C12 aminothio- lactone de formule I-1 utilisée dans l’invention, en comparaison au DMSO, ce composé pré- sente dans la lignée d’entérocytes (cellules de l’épithélium intestinal) humains Caco-2/TC7 une activité équivalente à celle de la 3-oxo-C12 HSL naturelle, et est plus active que celle-ci à la dose 100µM. La figure 2 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport aux molécules naturelles C4-HSL et 3-oxo-C12-HSL et à la molécule de formule I-1 utilisée dans l’invention. On voit à partir de cette figure 2 que le racémique de formule I-1 présente une capacité de reconnaissance retardée avec une EC50 de 125 nM vs .9 nM pour la molécule naturelle 3- oxo-C12-HSL et vs. une absence de reconnaissance (EC50 > 1000µM) pour la molécule naturelle C4-HSL. Le second de ces composés est la (S,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol ( (S,S) 3 oxo C12- ACH) de formule I-2 ci-dessous : [Chem 19] Le composé de formule I-2 correspond à la 3-oxo-C12 HSL dans laquelle la tête lactone a été remplacée par un groupement (S,S)-aminocyclohexanol. On voit à partir de la figure 3, qui représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules Caco-2/TC7 par l’IL-1B en présence de la (S,S) 3-oxo C12 aminocy- clohexanol ((S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, que ce composé présente dans la lignée d’entérocytes humains Caco-2/TC7 une activité équivalente à celle de la 3-oxo-C12 HSL naturelle dans la gamme 1-50µM. Comme on le voit en figure 4, qui repré- sente la courbe d’inhibition de la sécrétion d’IL-8 par des kératinocytes humains stimulés par IL-17 et TNF-α en présence de doses croissantes de la (S,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol ((S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, ce composé présente un EC50 relatif de 111nM et une inhibition maximale correspondant à 39% de l’inhibition obtenue en présence du composé de référence bétaméthasone, ce qui permet de montrer la généralisation des effets anti-inflammatoire de cette molécule à plusieurs lignées cellulaires, issues de différents organes du corps humain. On voit à partir de la figure 5, qui représente la courbe d’inhibition de la sécrétion d’IL- 2 par des lymphocytes humains stimulés par CD2, CD3 et CD28, en présence de doses crois- santes de la (S,S) 3-oxo C12-aminocyclohexanol ((S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 utilisée dans l’invention, que ce composé présente un EC50 relatif de 89,9 nM et une inhibition maxi- male correspondant à 46% de l’inhibition obtenue en présence du composé de référence béta- méthasone, ce qui confirme la généralisation des effets anti-inflammatoire de cette molécule à plusieurs lignées cellulaires, issues de différents organes du corps humain. On constate également, à partir des figures 4 et 5 que les AHL naturelles de Formules A et B sont inactives dans le cadre des tests dont les résultats figurent en fig. 4 et 5, ce qui dé- montre la supériorité des molécules de formule I utilisées dans l’invention. A partir de la figure 6, qui montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport à la molécule naturelle 3-oxo-C12HSL et à la molécule de formule I-2 utilisée dans l’invention, le composé de formule I-2 présente une EC50 de 165 nM. Il a donc une capacité de reconnaissance encore plus retardée que le composé de formule I-1. Enfin, cette molécule de formule I-2 est également résistante à l’hydrolyse donnant une forme ouverte (autant enzymatique que spontanée). La figure 8 montre sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules murines Raw 264.7 par la combinaison IFN-γ/LPS en présence de la (S,S)-3–oxo C12 amino- thiolactone ((S,S)-3 oxo C12-ACH) de formule I-2. Cette figure montre que le composé de formule I-2 est plus active que la molécule de référence 3-oxo-C12-HSL, et ce à toutes doses dans la gamme de concentrations de 1 à 50µM. Le troisième composé est la (S)-3–oxo C12aminothiolactone ((S)-3oxoC12–HTL) de for- mule I-3 suivante : [Chem 20] Le composé de formule I-3 correspond à la 3-oxo-C12 HSL dans laquelle la tête lactone a été remplacée par un groupement thiolactone. Comme on le voit en figure 7, qui représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cellules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (S)-3–oxo C12 aminothio- lactone ((S)-3oxoC12 –HTL) de formule I-3, on retrouve lors de cette stimulation des effets observés avec la molécule de formule I-3 utilisée dans l’invention similaires à ceux observés avec la molécule naturelle 3-oxo-C12-HSL, notamment une diminution de 27% de la sécrétion inflammatoire à 5 µM. Le quatrième composé est la (R,S)-3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-4 suivante : [Chem 21] La figure 9 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la (R,S) 3-oxo C12 aminocyclohexanol ((R,S) 3- oxo C12-ACH) de formule I-4 utilisée dans l’invention. On voit à partir de la figure 9 dans la lignée d’entérocytes humains Caco-2/TC7 une ac- tivité équivalente à celle de la 3-oxo-C12 HSL naturelle dans la gamme 1-50µM. La figure 10 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules murines Raw 264.7 par la combinaison IFN-γ/LPS en présence de la (R,S) 3-oxo C12-ACH de formule I-4 utilisée dans l’invention. On voit à partir de la figure 10 que dans la lignée de macrophages murins Raw 264.7 la molécule présente une activité supérieure à celle de la 3-oxo-C12 HSL naturelle dans la gamme 1-50µM. La figure 11 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport à la molécule naturelle 3-oxo-C12-HSL et à la (R,S) 3-oxo C12-aminocy- clohexanol de formule I-4 utilisée dans l’invention. Comme on le voit à partir de la figure 11, la (R,S)-3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-4 présente un EC50 de 200 µM. Elle a donc une capacité de reconnaissance très nettement retardée par rapport aux AHLs naturelles. - Le cinquième composé est la 3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-5 suivante : [Chem 22] Le composé de formule I-5 correspond à la 3-oxo-C12 HSL dans laquelle la tête lactone a été remplacée par un groupement aminocyclohexanol. - Le sixième composé est la 3-oxo C12-aminochlorophénol de formule I-6 suivante : [Chem 23] Le composé de formule I-6 correspond à la 3-oxo-C12 HSL dans laquelle la tête lactone a été remplacée par un groupement aminochlorophénol. La figure 12 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules Caco-2/TC7 par l’IL-1ß en présence de la 3-oxo C12-aminochlorophénol de formule I-6 utilisée dans l’invention. On voit à partir de la figure 12 que dans la lignée d’entérocytes humains Caco-2/TC7 la molécule présente une activité significativement supérieure à celle de la 3-oxo-C12 HSL natu- relle dans la gamme 10-100µM. La figure 13 représente sous forme de graphe à barres les résultats de stimulation de cel- lules murines Raw 264.7 par la combinaison IFN-γ/LPS en présence de la 3-oxo C12-amino- chlorophénol de formule I-6 utilisée dans l’invention. Comme on peut le voir, la molécule de formule I-6 présente dans la lignée de macro- phages murins Raw 264.7 une activité significativement supérieure à celle de la 3-oxo-C12 HSL naturelle dans la gamme 10-50µM. La figure 14 montre les courbes d’activation du récepteur LasR sur souche bactérienne rapportrice par rapport à la molécule naturelle 3-oxo-C12-HSL et à la 3-oxo C12-aminochloro- phénol de formule I-6 utilisée dans l’invention. Comme on peut le voir, la molécule de formule I-6 présente un EC50 supérieur à 1000 µM. Elle a la capacité de reconnaissance la plus retardée par rapport aux AHLs naturelles et aux molécules de formule I-1 à I-5 utilisées dans l’invention. EXEMPLES 1. Procédures expérimentales et protocoles utilisés en biologie • Les antibiotiques pénicilline-streptomycine, les acides aminés non essentiels (NEAA) et la L-glutamine provenaient d'Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États- Unis). La solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS 10X), le milieu de culture cellulaire à haute teneur en glucose (DMEM GlutaMAX 4 . 5 g / L de glucose), le DMEM et le DMEM sans rouge-phénol provenaient de Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). Le sérum de veau fœtal provenait de GE Healthcare (Sciences de la vie, South Logan, Utah, États-Unis). • La 2-hydroxyquinoline (CAS [59-31-4]), la molécule 3oxoC 12 -HSL, et le DMSO sté- rile ont été achetés auprès de Sigma. La molécule 3oxoC 12 : 2-HSL a été synthétisée à la de- mande par la société Diverchim (Roissy-en-France, France • Tous les tests d'absorbance et de luminescence ont été lus sur les spectromètres Spec- traMax M5 de la marque Molecular Devices®. 1.1. Culture cellulaire 1.1.1. La lignée cellulaire Caco-2 / TC7 • La lignée cellulaire Caco-2 provient d'un adénocarcinome de côlon humain et repré- sente un modèle de culture cellulaires d’entérocytes bordant l’épithélium de l'intestin grêle. La lignée de cellules Caco-2/TC7 est une population clonale de cellules Caco-2 qui reproduit dans une large mesure et de manière homogène la plupart des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des entérocytes normaux humains. • Les cellules Caco-2/TC7 présentent une propriété d'inhibition de contact conduisant à un arrêt de la croissance lorsque les cellules atteignent la confluence, laquelle permet l'éta- blissement d'une monocouche cellulaire. Durant la phase de croissance exponentielle (de l'en- semencement à la confluence), les cellules restent indifférenciées. À la confluence, elles peu- vent spontanément (en l'absence d'inducteurs de différenciation) se différencier et se polariser progressivement. Le processus de différenciation, qui est un mécanisme lié à la croissance, est maximal à la fin de la confluence (phase stationnaire de la courbe de croissance). • Les cellules développent une bordure en brosse au pôle apical contenant des microvil- losités et dotée d'enzymes entérocytiques caractéristiques, telles que les hydrolases. • Conformément à la littérature publiée, les cellules Caco-2/TC7 dans nos expériences ont été ensemencées à 105 cellules/puits (équivalent à 10-12 x 103 cellules/cm2 ) dans des plaques de culture en plastique à 6 puits. Les cellules ont été maintenues dans un milieu riche en glucose (taux élevé de glucose dans le milieu DMEM GlutaMAX 4,5 g/l de glucose) sup- plémenté avec 20% de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 1% d'acides aminés non essentiels NEAA et 1% de pénicilline streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère 10% de CO2 /air. Le milieu a été changé tous les jours. Dans ces condi- tions, les cellules présentaient une confluence au jour 6. Au jour 17, les cellules étaient privées de sérum, et étaient utilisées au jour 18. 1.1.2. La lignée cellulaire Raw 264.7 • La lignée cellulaire Raw 264.7 est constituée de cellules murines de type macrophages dérivées de la lignée cellulaire transformée par le virus de la leucémie Abelson et provenant de souris BALB/c. Cette lignée cellulaire est très souvent utilisée comme modèle de macro- phages in vitro. Les cellules Raw 264.7 sont capables de réaliser une phagocytose et une pi- nocytose, peuvent tuer les cellules cibles par cytotoxicité dépendant des anticorps et sécrètent un large éventail de cytokines inflammatoires ainsi que d'oxyde nitrique (NO). De plus, les cellules Raw 264.7 constituent une lignée cellulaire très pratique : les cellules se dévelop- pent rapidement, apprécient les puits de petit diamètre et doivent être utilisées avant la con- fluence. Ces conditions en font une lignée avantageuse pour le criblage de composés. Les cellules ont été utilisées entre les passages 13 et 26. • Les cellules Raw 264.7 utilisées proviennent de la banque ATCC. Elles ont été cultivés dans du DMEM additionné de 10% de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur et de 1% de L-glutamine à 200 mM, et maintenues à 37 ° C avec une atmosphère de 5% de CO2 /air. Le milieu a été changé tous les deux jours. 1.1.3. La souche de rapporteur bactérien E. coli pSB1075 • Une souche bactérienne rapportrice du Quorum Sensing a été utilisée pour étudier la capacité des molécules à être reconnues par le récepteur AHL de Pseudomonas aerugi- nosa (LasR) et à induire une activation. Ainsi, la souche pSB1075 d' Escherichia coli a été utilisée. • L'entérobactérie Escherichia coli ne produit pas naturellement d’AHL et ne possède pas non plus de récepteur orphelin capable de reconnaître des AHL. Cette souche biolumines- cente a été modifiée par addition d’un plasmide pSB1075. Ce plasmide contient des gènes codant à la fois pour la résistance à la tétracycline et l'expression du récepteur aux AHL LasR de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, ainsi qu'un gène de fusion dérivé du promoteur LasR et du gène luxCDABE de Photorhabdus luminescens. La souche bactérienne a été cultivée dans du milieu LB supplémenté avec 5 µg/ml de tetracycline pour exercer une pression de sélection et assurer que seule la souche souhaitée est amplifiée. Le gène de fusion inclus dans le plasmide donne à la bactérie la capacité d’émettre une bioluminescence lorsque le récepteur LasR est activé, et offre à l’utilisateur un test robuste pour le criblage moléculaire. Le récep- teur LasR de P. aeruginosa convient bien à la reconnaissance des AHL à longue chaîne, en particulier de son partenaire naturel, la 3oxoC 12- HSL, qui provoque la plus haute réponse bioluminescente. A l’opposé, des AHL à chaîne courte telles que la C 4 -HSL n’induisent pas l’émission de bioluminescence. • Brièvement, la culture bactérienne a été commencée le jour 0 dans 10ml de milieu LB additionné de 5 µg/ml de tétracycline et maintenue 24h à 37°C et sous agitation à 70 rpm. Au jour 1, la culture a été diluée à 1/100 (P1) dans 10 ml de milieu LB supplémenté avec 5 µg/ml de tétracycline et maintenue 24h à 37°C et sous agitation à 70 rpm. Le jour 2, l'expérience a eu lieu : une suspension bactérienne diluée extemporanément au 1/10 dans du milieu LB sup- plémenté avec 5 µg/ml de tétracycline (P2) a été distribuée dans une plaque opaque noire à 96 puits et incubée pendant 4 heures avec une gamme de concentrations d’AHL ou des témoins jusqu'à la lecture de la luminescence résultante au point final. Toutes les expériences ont été effectuées en triplicats. 1.1.4. Dosage bactéricide • La souche K12 de E. coli a été mise en culture sur gélose au jour 0 et une colonie a été transférée dans le milieu de culture bactérienne liquide LYBHI au jour 1. Au jour 2, la colonie a été diluée à 1/100 dans du milieu LYBHI et amplifiée pendant 18 heures avant transfert dans une plaque à 96 puits opaque. Dans chaque puits, on a distribué du LYBHI, des témoins ou des doses croissantes de molécules testées et des bactéries. L'absorbance à 600 nm a été lue au moment du démarrage (t = 0) et après une incubation de 18 heures. Les valeurs d'absor- bance brutes ont été corrigées à l'aide de l'absorbance de solutions sans bactéries. Toutes les expériences ont été effectuées deux fois, chacune avec 4 réplicats. 1.2. Évaluation de l'activité biologique des molécules dans les cellules de mammifères 1.2.1. Stimulation de Caco-2 / TC7 avec des cytokines • Les cellules Caco-2/TC7 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à 100000 cellules/puits et cultivées pendant 18 jours. Au jour 17 , les cellules étaient privées de sérum - ce qui signifie que le milieu cellulaire a été remplacé par un milieu sans sérum de veau fœtal - et utilisées au jour 18. • Le milieu de stimulation était composé d'un milieu dit de « starvation » c’est-à-dire sans sérum de veau fœtal (DMEM GlutaMAX, 1% de NEAA, 1% de pénicilline-streptomy- cine) avec 100 µM de 2-HQ. Les cellules ont été incubées pendant 18 h à 37 ° C avec 2 ml de milieu de stimulation contenant 0,1% de DMSO (contrôle négatif) ou de milieu de stimulation contenant les composés testés aux concentrations désirées, avec ou sans cytokines pro-inflam- matoires pour induire une inflammation. Pour induire l’inflammation, ont été utilisé soit l’IL- 1ß à 25 ng/ml, soit la combinaison de TNF-α et IFN-γ à 50 ng/ml chacun. Au bout de 18 h, les surnageants ont été recueillis et conservés à -80 ° C avant analyse par test ELISA. Les cellules ont été lavées avec 1 ml de PBS 1X/puits, et lysées dans 100 µl de PBS 1X contenant 1% de Triton X-100. Les cellules ont été récoltées par grattage et stockées à -80 ° C avant la quantification des protéines. Le dosage de la LDH a été effectué immédiatement avant la con- gélation. • Toutes les expériences sur les cellules ont été effectuées en triplicats. 1.2.2. Stimulation de Raw 264.7 avec LPS et IFN-γ • Des cellules Raw 264.7 ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à 75000 cel- lules/puits, ou des plaques à 24 puits à 40000 cellules/puits, de façon à atteindre 80 à 90% de confluence après 3 jours de culture. Pour la stimulation , les cellules ont été incubées pendant 6 h à 37°C avec 750 µL (respectivement 500 µL) de milieu cellulaire enrichi en 2-HQ 100 µM, contenant 0,1% de DMSO (contrôle négatif) ou de composés testés aux concentrations désirées, avec ou sans LPS (10 ng/ml) et IFN-γ (20 U/ml) pour établir une inflammation. Au bout de 6 h , les surnageants ont été recueillis et conservés à -80 ° C avant analyse par test ELISA. Les cellules ont été récoltées en les grattant dans 100 µL de PBS 1X / puits et stockées à -80 ° C avant la quantification des protéines totales. Le dosage de la LDH a été effectué immédiatement avant la congélation. • Toutes les expériences ont été effectuées en triplicats. 1.2.3. Mesure de la concentration en protéines dans le lysat cellulaire • Les concentrations en protéines totales ont été déterminées dans des lysats cellulaires à l'aide des réactifs de dosage des protéines qui sont l’acide bicinchoninique (BCA) et le sérum d’albumine bovine (BSA) conformément aux instructions du fabricant (Uptima-Interchim, Montluçon, France). 1.2.4. Quantification des cytokines humaines par ELISA • Les niveaux de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 produite par les cellules ont été déterminés dans les surnageants cellulaires et/ou des lysats cellulaires en utilisant le kit de dé- tection ELISA IL-8 disponible dans le commerce (Duoset Human C X CL8 / IL-8, réf. DY208) fournis par R & D Systems (Minneapolis, Minnesota, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. • Tous les niveaux de cytokines ont d'abord été normalisés à la teneur en protéines dé- terminée dans les lysats cellulaires correspondants. Ensuite, pour comparer les expériences, ils ont pu être davantage normalisés en utilisant la condition de contrôle activé (DMSO + cytokines) comme réponse à 100%. 1.2.5. Quantification des cytokines murines • Les niveaux de cytokines murines IL-6 produites par des cellules ont été déterminés dans des surnageants ou des lysats de cellules en utilisant le kit "BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA Set" disponible dans le commerce de BD Biosciences (San Jose, Californie, USA, réf. 555240). Tous les kits ELISA ont été utilisés conformément aux instructions du fabricant. • Les taux de cytokines ont d'abord été normalisés à la teneur en protéines déterminée dans les lysats cellulaires correspondants. Pour comparer les expériences, ils ont pu t être da- vantage normalisés en utilisant la condition de contrôle activé (DMSO + cytokines) comme réponse à 100%. 1.2.6. Test de cytotoxicité • La cytotoxicité des composés testés et des contrôles, avec ou sans cytokines pro-in- flammatoires, a été évaluée en utilisant un test de libération de la lactate déshydrogénase (LDH), qui suit la libération de cette enzyme dans les surnageants de cellules, un bon indica- teur des dommages de la membrane et de la mortalité cellulaire. Un composé a été considéré comme cytotoxique lorsque son taux de LDH sécrétée était supérieur à 10%. • Deux méthodes peuvent être utilisées pour effectuer le test : mesure avec une solution pyruvate/NADH (Sigma), ou en utilisant le kit de détection Cytotoxicité PLUS (LDH) de Roche (Sigma-Aldrich). • Pour la méthode Pyruvate / NADH , une solution de pyruvate / NADH a été préparée avec 4,1 mg d'acide pyruvique (0,62 mM) et 7,7 mg de NADH (0,18 mM) dans 60 ml de PBS 0,1 M (pH 7,4). • Pour mesurer la concentration de LDH dans le surnageant, 800 µL de NADH ont été ajoutés à 200 µL de surnageant dans une cuvette en plastique et la diminution de l'absorbance à 340 nm a été surveillée pendant 1 min. Pour mesurer la concentration de LDH dans le lysat cellulaire, 800 µL de NADH ont été ajoutés à 10 µL de surnageant et 190 µL de PBS 0,1 M dans une cuvette en plastique, et la diminution de l'absorbance à 340 nm a été surveillée pen- dant 1 min. Le pourcentage de LDH libéré dans le surnageant a été calculé comme le rapport des pentes corrigées dans le surnageant et le lysat cellulaire. • Avec le kit de détection de cytotoxicité PLUS (LDH - Roche - réf. 04744934001) , les niveaux de LDH ont été déterminés dans les surnageants et les lysats cellulaires au moyen du test basé sur l’absorption et la colorimétrie, et effectué conformément aux instructions du fabricant. Le pourcentage de cytotoxicité pourrait être établi avec la formule: [Math 1] 1.3. Activité biologique des molécules sur la souche reporter bactérienne E. coli pSB1075 • Escherichia coli ne produit pas naturellement d’AHL. Cette souche bioluminescente a été mise au point par l’addition d’un plasmide pSB1075 contenant des gènes codant pour la résistance à la tétracycline et l’expression du récepteur AHL LasR , ainsi que d’un gène de fusion du promoteur LasR et du gène luxCDABE de Photorhabdus luminescens . • Au jour 1, une dilution de 1/100 de la souche bactérienne (P1) a été cultivée pendant 24 heures à 37°C sous agitation (70 rpm) dans un milieu LB contenant 5 µg/ml de tétracycline (pression sélective). Au jour 2, P1 a été dilué au 1/10 dans le même milieu pour obtenir P2. Dans une plaque à 96 puits noire ont été placés 200 µL de P2 et 10 µL du composé à chaîne courte (milieu, eau et DMSO pour les contrôles négatifs, C4- HSL comme contrôle positif, et l'échantillon à tester à la concentration souhaitée). La plaque a été incubée pendant 4 heures à 37°C sous agitation à 70 tr / min. La luminescence a ensuite été lue à toutes les longueurs d'onde (temps d'intégration 200 ms) sur un lecteur de microplaques. • Pour les essais de compétition le protocole de culture était semblable mais les bactéries ont été préalablement soumises à une pré-incubation avec 1, 10 ou 100 nM de 3oxoC 12 -HSL pour différentes durées (1, 2, 6 ou 16 h) avant dilution pour obtenir P2. Après quoi l’incubation a été poursuivie selon le protocole classique, avec le composé à tester aux concentrations désirées. 1.4. Analyse statistique • Toutes les données sont représentées comme la moyenne plus ou moins SEM de n ex- périences indépendantes, et ont été testées pour la distribution gaussienne. La signification statistique a été examinée au moyen d'un test t de Student, d'une ANOVA unidirectionnelle, d'une ANOVA à deux voies ou d'un test de Kruskal-Wallis, en fonction de l'ensemble de données, associé à un post-test (test de comparaison multiple de Tukey ou de Dunn). Les dif- férences ont été considérées comme significatives lorsque p <0,05. Toutes les analyses statis- tiques ont été effectuées à l'aide du logiciel Prism 6.0, GraphPad. 2. Matériels et méthodes en chimie • Sauf indication contraire, toutes les réactions ont été effectuées sous atmosphère d'ar- gon dans de la verrerie sèche. Les réactifs ont été achetés auprès des fournisseurs commer- ciaux Sigma-Aldrich et TCI Chemicals et ont été utilisés sans purification supplémentaire. • La chromatographie flash a été réalisée sur des colonnes de gel de silice préemballées (gel de silice SiO2 irrégulier 40-63 µm) de CHROMABOND® Flash (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne), montées sur une plate-forme automatisée SPOT de ArMen . • La chromatographie en couche mince a été effectuée sur des feuilles d'aluminium re- couvertes de gel de silice 60 F 254 (Millipore, Merck) et révélée avec du permanganate de po- tassium (KMnO4), de l'iode sur de la silice, du vert de bromocrésol ou sous une lumière UV (254 nm ou 365 nm). 2.1. Convention pour la numérotation des atomes dans les N- acyl homosérine lactones et leurs analogues • la numérotation des atomes adoptée dans les molécules AHL et leurs analogues est la suivante : [Chem 24] 2.2. Procédures expérimentales de synthèse et de caractérisation physicochimique des AHL naturels, des intermédiaires et des analogues non naturels • Procédure générale pour la préparation des dérivés d'acide de Meldrum 3a- b (GP1) • L'acide carboxylique approprié (1,0 équiv.) a été dissous dans du dichlorométhane (noté DCM) (1,5 ml / mmol d'acide) à température ambiante. On a ajouté au mélange succes- sivement du DCC (1,1 équiv), de la DMAP (1,05 équiv) et de l'acide de Meldrum (1,0 équiv). Le mélange réactionnel a été agité pendant une nuit à température ambiante sous at- mosphère d'argon. Le suivi de la réaction a été réalisé par CCM dans un mélange EtOAc / cyclohexane à 1: 1 et révélé avec de l'iode. • Après complétion de la réaction, le mélange réactionnel a été filtré pour éliminer la DCU précipitée et le résidu de filtration soigneusement lavé avec du dichlorométhane. Le filtrat a été recueilli et le solvant éliminé sous vide. L'huile résultante a été diluée dans EtOAc et la phase organique a été extraite avec HCl 1 M (x2), tandis que la phase aqueuse a été lavée avec EtOAc (x2). Les phases organiques combinées sont séchées sur MgSO4 , avant de retirer le solvant sous vide. Le produit brut, obtenu sous forme d'huile, a été directement engagé dans l'étape suivante. • 2,2-diméthyl-5- (1-oxodécyl) -1,3-dioxanne-4,6-dione 3a [182359-65-5] [Chem 25] • Préparé par GP1 avec un rendement de 94%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl3): δ :12-3,03 (m, 2H, C (4)H2), 1,74 (s, 6H, OC(CH3)2O), 1,45-1:24 (m, 14H C (5) H2 à C (11) H 2 ), 0,91 à 0,86 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl3): δ 198,32 (C(3)), 170,57 (ester), 160,18 (ester), 104,74 (OC (CH3)2O), 91,23, 35,74, 31,83, 29,37, 26,76 , 26,15, 22,65, 14,08 (C (12)). R f (1: 3 EtOAc / Cychex): 0,22. • 2,2-diméthyl-5- (1-oxodécyl) -1,3-dioxanne-4,6-dione 3b azoture [Chem 26] Préparé par GP1 avec un rendement de 87%. 1 H RMN (300 MHz, chloroforme - d ) : 3,24 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, C (12)H ), 3:08-3:02 (m, 2H, C (4) H 2 ), 2,12 (s , 1 H, C (2) H ), 1,72 (s, 6H, C (CH 3 )2), 1,62 - 1,54 (m, 4H, C (5)H2 et C(6)H2 , 1,31-1,28 (m, 10H, C (7) H 2 à C (11) H 2 ).13 C RMN (75 MHz, CDCl3): δ198,33 (cétone), 170,68 (ester), 160,30 (ester), 104,88 (C2), 91,36 (OC (CH3)2 O), 51,56 (C12 , 43,87 (C 4 ), 35,82 (C 5 ), 29,37, 29,17, 28,92, 26,91 ((CH 3 ) 2 ), 26,77, 26,20, 23,91. R f (1: 3 EtOAc / Cychex): 0,25. • Procédure générale pour la méthanolyse du dérivé d'acide de Meldrum 4a- b (GP2) • Le dérivé d'acide 3a-c de Meldrum (1,0 équiv.) a été dissous dans du méthanol en ex- cès et le ballon réactionnel a été équipé d'un appareil à reflux sous une atmosphère d'argon. La réaction a été chauffée au reflux pendant 2 heures, puis le chauffage a été arrêté et le mélange est laissé refroidir spontanément à température ambiante et agité pendant une nuit. L'avance- ment de la réaction a été suivi par CCM dans un mélange EtOAc / cyclohexane à 1: 1 et révélé dans de l'iode. A complétion, le solvant a été éliminé sous vide et le produit huileux a été utilisé brut dans l'étape suivante. • 3-oxododécanoate de méthyle 4a [76835-64-8] [Chem 27] • Préparé par GP2 avec un rendement de 96%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ) δ 3,75 (s, 3H, OC H 3 ), 3,46 (s, 2H, C (2) H 2 ), 2,54 (t, J = 7,4 Hz, 2H, C (4 ) H 2 ), 1,59 (d, J = 7,4 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1,28 (s, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,92 à 0,87 (m , 3 H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ202,86 (C 3 ), 167,70 (C 1 ), 52,31 (OCH 3 ), 49,01, 43,09, 31,85, 29,39, 29,34, 29,24, 29,00, 23,47, 22,66, 14:09 ( C 12 ). R f (1: 3 EtOAc / Cychex): 0,55. • Ester méthylique de l'acide 12-azido-3-oxododécanoïque 4b [1421598-01-7] [Chem 28] • Préparé par GP2 avec un rendement de 81%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ3,71 (s, 3H, OC H 3 ), 3,42 (s, 2H, C (2) H 2 ), 3,22 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, C ( 12) H 2 ), 2,50 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (4) H 2 ), 01,55 (q, J = 6,8 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1,27 (t, J = 4,7 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ202,85, 167,77, 52,40, 51,56, 49,11, 43,12, 29,36, 29,30, 29,14, 29,02, 28,91, 26,77, 23,50. R f (1: 3 EtOAc / cyclohexane): 0,6. • Procédure générale pour l'installation d'un acétal en position C3 5a-b (GP3) • L'ester 3-cétométhylique 4a-b (1,0 équiv.) a été dilué dans du toluène (environ 1 ml / mmol d'ester) et ont été successivement ajoutés de l'acide camphorsulfonique (0,2 équiv), du triméthylorthoformate (5,0 équiv) et de l'éthylèneglycol (8,9 équiv). Le mélange réactionnel a été chauffé à 80°C pendant 3 heures, puis laissé refroidir spontanément et agité pendant une nuit à température ambiante. La réaction a été suivie par CCM dans un mélange EtOAc / cyclohexane 1: 6 et révélée avec de l'iode. A complétion, le toluène a été éliminé sous vide et l'huile résultante a été dissoute dans du DCM. La phase organique a été extraite avec une solution saturée de NaHCO3 (x3) tandis que la phase aqueuse a été lavée avec du DCM. Les phases organiques combinées ont été séchées sur MgSO4 et le solvant éliminé sous vide. • Si nécessaire, le produit huileux a été purifié par Chromatographie Flash sur une co- lonne de silice en utilisant un gradient d'élution de 1: 8 à 1: 2 EtOAc / cyclohexane. • Ester méthylique de l'acide 2-nonyl-1,3-dioxolane-2-acétique 5a [109873-29-2] [Chem 29] Préparé par GP3 avec un rendement de 95%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ04:01 - 3,95 (m, 4H, O CH 2 CH 2 O), 3,70 (s, 3H, OC H 3 ), 2,67 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 1,83 à 1,76 (m, 2H, C (4) H 2 ), 1,41-1:36 (m, 2H, C (5) H 2 ), 1,28 (d, J = 5,4 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,91-0,85 (m, 3H, C (12) H 3 ).13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ170,05 (C 1 ), 109,41 (C 3 ), 65,10 (cétal), 51,72 (OCH 3 ), 42,42, 37,75, 31,88, 29,68, 29,56, 29,51, 29,29, 23,51 , 22,67, 14,10 (C 12 ). R f (1: 8 EtOAc / Cychex): 0,31. • Ester méthylique de l'acide 2- (9-azido) nonyl-1,3-dioxolane-2-acétique 5b [Chem 30] • Préparé par GP3 avec un rendement de 93%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ04:00 - 3,93 (m, 4H, OC H 2 CH 2 O), 3,67 (d, J = 0,9 Hz, 3H, OC H 3 ), 3,23 (t, J = 6,9 Hz, 2H, C (12) H 2 ), 2,64 (s, 2H, C (2) H 2 ), 1,80 - 1,74 (m, 2H, C (4) H 2 ), 1,61 - 1,55 (m, 2H C (5) H 2 ), 1,28 (d, J = 5,3 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ170,15 (C 1 ), 109,49 (C 3 ), 65,22 (acétal), 51,87 (OCH 3 ), 51,59 (C 12 ), 42,52, 37,81, 29,71, 29,51, 29,45 , 29.20, 28.93, 26.79, 23.56. R f (1: 4 EtOAc / Cychex): 0,45. Procédure générale pour l'hydrolyse basique de l'ester méthylique 6a- b(GP4) • L'ester méthylique 5a-b protégé par un cétal (1,0 équiv) a été dissous dans du THF (1,25 ml / mmol d'ester) et une solution de NaOH 1 M (environ 2,5 équivalents) a été ajou- tée. Le mélange réactionnel a été porté à reflux pendant 3 heures. • L'avancement de la réaction a été suivi par CCM dans EtOAc / cyclohexane à 1: 8 et révélé avec de l'iode. • Une fois terminé et après que le mélange réactionnel a été refroidi à température am- biante, le pH a été fixé à 4-5 avec du HCl IM. La phase organique a été extraite avec du DCM (x3). Les phases organiques combinées ont été séchées sur MgSO4 et le solvant éliminé sous vide pour donner le produit souhaité sous forme d'huile. • Acide 2-nonyl-1,3-dioxolane-2-acétique 6a [596104-60-8] [Chem 31] • Préparé par GP4 avec un rendement de 95%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ10,93 (s, 1H, O H ), 4:06 - 3,99 (m, 4H, O CH 2 CH 2 O), 2,72 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 1,85 - 1,78 (m, 2H, C (4) H 2 ), 1,43-1,37 (m, 2H, C (5) H 2 ) 1,29 (d, J = 5,2 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,92-0,87 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ174,61 (C 1 ), 109,32 (C 3 ), 65,10 (OCH 2 CH 2 O), 42,36 (C 2 ), 37,61 (C 4 ), 31,88, 29,65, 29,51 , 29,30, 26,91, 23,51, 22,67, 14,10 (C 12 ). Ne migre pas dans les conditions habituelles de TLC. • Acide 2- (9-azido) nonyl-1,3-dioxolane-2-acétique 6b [1421598-02-8] [Chem 32] • Préparé par GP4 avec un rendement de 97%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ8,77 (s, 1H, O H ), 4,07 à 3,93 (m, 4H, O CH 2 CH 2 O), 3,24 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, C (12) H 2 ), 2,68 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 1,95 à 1,82 (m, 2H, C (4) H 2 ), 1,61 à 1,55 (m, 2H, C (5) H 2 ), 1,29 (d, J = 6,5 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ174,32 (C 1 ), 109,42 (C 3 ), 65,21 (acétal), 51,59 (C 12 ), 42,50, 37,66, 29,68, 29,51, 29,45, 29,20, 28,93, 26,19 , 23.56. Ne migre pas dans les conditions habituelles de TLC. • Préparation générale de cétoamides en utilisant EDC et DMAP avec installations de groupes de tête divers (GP5) • Pour les groupes de tête généraux, l’acide carboxylique protégé par un cétal 6a (1,0 équiv.) a été dissous dans du DCM (environ 7 ml/mmol d’acide) et ont été ajoutés successi- vement : EDC (1,2 équiv), DMAP (1,7 équiv) et le groupe de tête amino approprié (1,3 équiv). • Pour la (S)-(-)- (α)-amino-(γ) butyrolactone, l’acides 6a-b protégé par un cétal (1,0 équiv.) et l’EDC (1,1 équiv.) ont été dissous dans du DCM (environ 2 ml/mmol de substrat) sous atmosphère d'argon et laissés sous agitation à température ambiante pendant 20 min. Puis du chlorhydrate de (S)-(-)-(α) -amino- (γ) butyrolactone (1,3 équiv) et de la DMAP (1,7 équiv) dans du DCM (environ 2 ml/mmol de substrat) ont été ajoutés. La réaction a été agitée pendant 12-22 heures sous atmosphère d'argon à température ambiante. • La progression de la réaction a été suivie par CCM dans un mélange EtOAc/cyclo- hexane et la révélation a été obtenue avec de l'iode, une lumière UV, du permanganate de potassium ou du vert de bromocrésol, selon la nature du groupe de tête. A complétion de la réaction, une quantité supplémentaire de DCM a été ajoutée (13 ml/mmol de substrat) et la phase organique a été lavée avec du HCl 1 M (x3). Les phases ont été séparées, les phases organiques combinées ont été séchées sur MgSO4 et le solvant éliminé sous vide pour donner le composé désiré sous forme d’huile. Si nécessaire, le produit a été purifié par chromatogra- phie flash sur une colonne de silice. • Procédure alternative employant ECD et Et3N pour la préparation des cétoa- mides à partir de (S)-(-)-(α) -amino- (γ) butyrolactone (GP5) On a agité une solution de (S)-(-)-(α)-amino-(γ)chlorhydrate butyrolactone (0,91 équiv) dans du DCM (approx . 6 ml/mmol de substrat). Ont été ajoutés successivement Et3N (1,0 équiv), l’acide protégé 6a (1,0 équiv) et l’EDC (1,37 équiv). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 40 heures. • La réaction a été suivie par CCM dans EtOAc/Cychex 1:2 et révélée avec de l'iode, du permanganate de potassium et de la lumière UV. A complétion, le mélange a été évaporé à sec sous vide. Le résidu a été partitionné entre de l'eau (8 ml/mmol de substrat) et de l'EtOAc (17 ml/mmol de substrat), et la phase organique a été lavée successivement avec une solution saturée de NaHCO3 (x2) et saumure (x2). La couche organique a été séchée sur MgSO4 et évaporée à sec pour donner le composé désiré sous la forme d’une huile. Si nécessaire, le produit a pu être purifié par chromatographie flash sur une colonne de silice. • (S) -2- (2-nonyl-1,3-dioxolan-2-yl)-N-(2-oxotétrahydrofuranne-3-yl) acétamide 7a [182359-61-1] [Chem 33] Préparé par GP5 et GP5bis avec des rendements respectifs de 88% et 91% • 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ6,99 (d, J = 6,3 Hz, 1 H, NH) , 04,58 (ddd, J= 11,6, 8,6, 6,3 Hz, 1H, C αH ), 4,46 (td, J= 9,1, 1,3 Hz, 1H, HA), 4,27 (ddd, J = 11,2, 9,1, 5,9 Hz, 1H, HB), 4,11 à 3,96 (m, 4H, OCH2 CH2O), 2,80 ( dddd, J = 12,5, 8,7, 5,9, 1,3 Hz, 1H,HD), 2,64 (s, 2 H, C (2)H2), 2,13 (dtd, J= 12,5, 11,3, 8,8 Hz, 1H,HC), 1,71 - 1,65 (m, 2H, C (4)H2), 1,39 - 1,33 (m, 2H, C (5)H2), 1,27 (d, J= 7,0 Hz, 12H, C (6) H2 à C (11) H 2 ), 0,91-0,84 (m, 3H, C (12)H3 ).13C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ175,35 (C1), 169,95 (ester), 109,76 (C3), 66,06 ( CHA HB), 65,25 (CH2 acétal), 65,12 (CH2 acétal ), 49,11 (CH), 44,33, 37,66, 32,02, 30,53 (C H CHD ), 29,82, 29,67, 29,65, 29,45, 29,85, 22,82, 14,26 (C12). Rf (4:1 EtOAc/Cychex): 0,35. SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C18 H31 NO5Na ([M + Na]+): 362,2094. Trouvé 364.2095. • 12-azido-3- (1,3-dioxolane) -N - ((3S) -tétrahydro-2-oxo-3-furanyl) dodécana- mide 7b [Chem 34] • Préparé par GP5 avec un rendement de 69%.1H RMN (300 MHz, CDCl3 : δ,99 (d, J = 6,4 Hz, 1H, NH), 4,57 (ddd, J = 11,6, 8,7, 6,4 Hz, 1H, CαH), 4,45 (td , J = 9,1, 1,3 Hz, 1H, HA), 4,26 (ddd, J = 11,1, 9,1, 5,9 Hz, 1H, H B), 4,08 - 3,95 (m, 4H, OCH2CH2 O), 3,24 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, C (12)H2), 2,84 à 2,73 (m, 1H,HD), 2,63 (s, 2 H, C (2)H2), 2,13 (dtd, J = 12,5, 11,4, 8,9 Hz, 1H,HC), 1,71 à 1,65 (m, 2H, C (4)H2 ), 1,63 à 1,53 (m, 2H, C (5)H2), 1:38-1:28 (m , 12H, C (6)H2 à C (11)H2).13C RMN (75 MHz, CDCl 3):δ175,33 (C1), 169,90 (ester), 109,71 (C3), 66,03 (CHAHB), 65,23 (CH2 acétal), 65,11 (CH2 acétal ), 51,60 (C12), 49,07 (CH), 44,31, 37,60, 30,41 (CHCHD), 29,72, 29,48, 29,45, 29,21, 28,94, 26,80, 23,77. Rf (2:1 EtOAc/cyclohexane): 0,20. SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C18H30N4 O4Na ([M + Na]+): 405,2108.Trouvé: 405,2110. • 2-nonyl-N-(3-tétrahydro-2-oxo-3-thiényl)-1,3-dioxalanne-2-acétamide 7f [Chem • Préparé par GP5 modifié avec un rendement de 53%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ6,89 (d, J= 6,6 Hz, 1H, NH), 4,56 (dt, J= 13,1, 6,7 Hz, 1H, CαH), 4,10 à 3,93 (m , 4H, OCH2 CH2O), 03:34 (td, J= 11,7, 5,1 Hz, 1H,HB), 3,22 (ddd, J= 11,4, 7,1, 1,3 Hz, 1H, HA), 2,86 (dddd , J= 12,1, 6,7, 5,1, 1,4 Hz, 1H, HC), 2,61 (s, 2 H, C (2) H2), 1,92 (dq, J= 12,4, 7,0 Hz, 1H,HD), 1,70 - 1,62 (m, 2H, C (4) H2), 1:38-1:32 (m, 2H, C (5) H2), 1,23 (s, 12H, C (6) H2 à C (11) H2), de 0,90 à 0,81 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13C RMN (75 MHz, CDC 3):δ 205,32 (C = O), 169,79 (C1 , 109,75 (C3), 65,17 (OCH2CH2O), 65,03 (OCH2CH2O ), 59,27 (CH), 44,36 (C 2 ), 37,59, 31,96, 31,92, 29,77, 29,60, 29,59, 29,39, 27,59, 23,79, 22,76, 14:21 (C 12 ). R f (1: 1 EtOAc / Cychex): 0,31. SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 18 H 31 NO 4 SH ([M + H] + ): 358,2047. Trouvé: 358.2047. • 2-nonyl-N- (3 (S) -tétrahydro-2-oxo-3-thiényl) -1,3-dioxalanne-2-acéta- mide 7g [429675-24-1] [Chem 36] • Préparé par GP5bis avec un rendement de 64%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 6,89 (d, J= 6,6 Hz, 1H, NH), 4,56 (dt, J= 13,1, 6,7 Hz, 1H, H), 4,10 à 3,93 (m, 4H, OCH2 CH2O), 03:34 (td, J= 11,7, 5,1 Hz, 1H, HB), 3,22 (ddd, J= 11,4, 7,1, 1,3 Hz, 1H, HA), 2,86 (dddd, J= 12,1, 6,7, 5,1, 1,4 Hz, 1H, HC), 2,61 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 1,92 (dq, J = 12,4, 7,0 Hz, 1H, H D ), 1,70 à 1,62 (m, 2H, C (4) H 2 ), 1,38-1,32 (m, 2H, C (5) H 2 ), 1,23 (s, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,90 à 0,81 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ205,32 (C=O), 169,79 (C ), 109,75 (C 3 ), 65,17 (O C H 2 CH 2 O), 65,03 (OCH 2 C H 2 O ), 59,27 ( C H), 44,36 (C 2 ), 37,59, 31,96, 31,92, 29,77, 29,60, 29,59, 29,39, 27,59, 23,79, 22,76, 14:21 (C 12 ). R f (1:1 EtOAc / Cychex) : 0,31. SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 18 H 31 NO 4 SH ([M + HA] + ): 358,2047. Trouvé: 358.2047. • N - ((1 S , 2 S ) -2-hydroxycyclohexyl) -2- (2-nonyl-1,3-dioxalan-2-yl) acétamide 7h [Chem 37] • Préparé par GP5 avec un rendement de 54%.1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ6,47 (d, J = 7,5 Hz, 1H, N H ), 3,96 (p, J = 3,7, 3,1 Hz, 4H), 3,66 - 3,53 (m, 1H, NHCHC (OH) H ), 3,28 (td, J = 9,9, 4,3 Hz, 1H, NHC H ), 2,63 - 2,49 (m, 2 H, C (2) H2), 2,01 (ddd, J = 11,9, 4,9, 2,5 Hz, 1H, NHCHC (H) H éq ), 1,89 (dq, J = 14,3, 4,6, 3,3 Hz, 1H, NHCHC (H) H ax ), 1,73 - 1,59 (m, 4H, C (4) H 2 et NHCHCH (OH) C H2), 1,35 - 1,27 (m, 2H, C (5) H2), 1,21 (s, 16H, C (6) H 2 à C (11) H 2 et NHCHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C (OH) H), 0,83 (t, J = 6,7 Hz, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ170,95 (C 1 ), 109,89 (C 3 ), 75,31 (CHOH), 65,04 (cétal), 65,02 (cétal), 55.45 (NHCH), 44.56 (C 2 ), 37,51, 34,35, 31,92 (C 4 ), 31,44 (C 5 ), 29,73, 29,58, 29,55, 29,35, 24,62, 24,62, 24,06, 23,71, 22,72, 14,16 (C 12 ). R f (2: 1 EtOAc / Cychex) = 0,15. MS (ESI): masse exacte calculée pour C 20 H 37 NO 4 Na ([M + Na]+): 355,52. Trouvé: 378,1. • N - ((1 S , 2 R ) -2-hydroxycyclohexyl) -2- (2-nonyl-1,3-dioxolan-2-yl) acétamide 7i [Chem 38] • Préparé par GP5 avec un rendement de 51%.1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ6,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H, N H), 4:01 - 3,96 (m, 4H, cétal), 3,95 - 3,87 (m, 2H, NHCHC (OH) H et NHC H ), 2,56 (d, J = 2,7 Hz, 2 H, C (2) H 2 ), 2:37 (s, 1 H), 1,71 - 1,57 (m, 7H), 01:38 (ddd, J = 14,3, 6,9 , 4,0 Hz, 4H), 1,24 (d, J = 2,2 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), de 0,89 à 0,83 (m, 3H, C (12) H3). 13 C RMN (75 MHz, CDCl3): δ169,32 (C 1 ), 110,03 (C 3 ), 69,52 (CHOH), 65,09 (cétal), 50,78 (NHCH), 44.75 (C2), 37,52, 31,99, 31,53 , 29,83, 29,64, 29,43, 27,37, 23,80, 23,48, 22,79, 20,45, 14,23 (C 12 ). R f (3: 1 EtOAc / Cychex) = 0,26. HRMS (ESI): masse exacte calculée pour C20H37NO4Na ([M + Na]+): 378,2615. Trouvé: 378,2615. • N - (5-chloro-2-hydroxyphényl) -2- (2-nonyl-1,3-dioxolan-2-yl) acétamide 7m [Chem 39] • Préparé par GP5 avec un rendement de 37%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 8,78 (s, 1H, O H ), 8,67 (s, 1H, N H ), 7,07 (dd, J = 8,7, 12,5 Hz, 1H, aromatique), 6,98 ( d, J = 2,5 Hz, 1 H, aromatique), 6,94 (d, J = 8,7 Hz, 1H, aromatique), 4,07 (s, 4H, O CH 2 CH 2 O), 2,80 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 1,75 - 1,69 (m, 2H, C (4) H 2 ), 1,43 - 1,36 (m, 2H, C (5) H 2 ), 1,28 - 1,25 (m, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,90-0,85 (m, 3H, C (12) H 3 ).13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ169,75 (C 1 ), 147,68 ( C OH), 127,04 (NH C ), 126,73 ( C Cl), 124,94 (aroma- tique), 121,94 (aromatique), 121,17 (aromatique) 109,77 (C 3 ), 65,29 (acétal), 44,67 (C 2 ), 37,65, 32,01, 29,73, 29,62, 29,42, 23,80, 22,81, 14,25 (C 12 ). R f (1: 4 EtOAc / Cychex): 0,14. SMHR (ESI) : masse exacte calculée pour C 20 H 30 ClNO 4 H ([M + H + ]): 384,1936. Trouvé: 384,1936. • Procédure de synthèse de l'acide azido-carboxylique terminal • L'acide bromocarboxylique approprié (1,0 équivalent) et l'azoture de sodium (1,5 équi- valents) ont été dissous dans du DMF (5 ml / mmol d'acide carboxylique). Le mélange réac- tionnel a été chauffé à 60°C et agité pendant une nuit sous atmosphère d'argon. Après l'achè- vement, le solvant a été éliminé sous pression réduite. L'huile résultante a été dissoute dans 1: 1: 1 (v / v / v) mélange de EtOAc , H2O et de la saumure. Les phases organiques sont extraites avec EtOAc (x 3) et on les lave avec de la saumure semi-saturée (x2) avant séchage sur MgSO4. Les solvants ont été éliminés sous vide pour donner le produit sous forme d'une huile. [Chem 40] • Acide 10-azidodécanoïque 14 [186788-32-9] [Chem 41] • Préparé avec un rendement quantitatif. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 3,24 (t, J = 6,9 Hz, 2 H, C (10) H 2 ), 2:33 (t, J = 7,5 Hz, 2 H, C (2) H 2 ), 1,60 (dt, J = 10,1, 6,9 Hz, 4H, C (3) H 2 et C (9) H 2 ), 1,30 (m, 10H, C (4) H 2 à C (8) H 2 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ180,31 (acide), 51,59 (C 10 ), 34,18 (C 2 ), 29,36, 29,23, 29,19, 29,11, 28,94, 26,80, 24,76. • Procédure générale d'élimination du groupe protecteur de l'acétal (GP6) • Le précurseur AHL ou un analogue protégé (1,0 équiv.) a été dissous dans du TFA (4 ml / mmol de substrat) et de l'eau (1 ml / mmol de substrat). Du DCM pouvait être ajouté si nécessaire pour améliorer la solubilité (jusqu'à 10 ml / mmol de substrat). Le mélange réac- tionnel a été agité à température ambiante sous atmosphère d'argon jusqu'à ce qu'une analyse CCM dans EtOAc / CycHex indique une consommation totale du réactif de départ (pendant une nuit). La réaction a été arrêtée par addition d’une solution saturée de NaHCO3 et du NaHCO3(s) jusqu'à ce que le pH soit stabilisé à 4-5, et la phase organique est extraite avec du DCM (x3). Les phases organiques combinées ont été séchées sur MgSO4 et le solvant éli- miné sous vide. Si nécessaire, le produit a pu être purifié par chromatographie flash sur une colonne de silice. • N-(3(S)-oxododécanoyl) homosérine lactone 1 (= 15a) [168982-69-2] [Chem 42] • Préparé par GP6 avec un rendement de 98%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7,68 (d, J = 6,6 Hz, 1H, N H ), 4,59 (ddd, J = 11,5, 8,7, 6,6 Hz, 1H, C αH ), 4,48 (dt , J = 9,1, 1,4 Hz, 1H, H A ), 4,27 (ddd, J = 11,1, 9,1, 6,0 Hz, 1H, H B ), 3,47 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 2,76 (dddd , J = 12,6, 8,8, 6,0, 1,4 Hz, 1H, H C ), 2,52 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (4) H 2 ), 2:30-2:15 (m, 1H, H D ), 01,57 (d, J = 6,9 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1,26 (t, J = 3,1 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,90-0,85 (m, 3H, C (12) H 3 ).13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ206,77 (C 3 ), 174,85 (ester), 166,44 (C 1 ), 65,99 ( C H A H B ), 49,19 (C α), 48,12, 44,12, 31,99, 30.04, 29.52, 29.47, 29.38, 29.13, 23.51, 22.80, 14.24 (C 12 ). R f (2: 1 EtOAc / Cychex): 0,35. SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 16 H 27 NO 4 Na ([M + Na]+ ): 320,1832. Trouvé: 320,1834. • 12-azido-3-oxo N - ((3S) -tétrahydro-2-oxo-3-furanyl) dodécanamide 15b [1175052- 13-7] [Chem 43] • Préparé par GP6 avec un rendement de 87%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ 7,61 (d, J = 4,9 Hz, 1H, N H ), 4,58 (ddd, J = 11,5, 8,7, 6,5 Hz, 1H, C αH ), 4,47 (dt , J = 9,1, 1,5 Hz, 1H, H A ), 4,27 (ddd, J = 11,0, 9,3, 6,1 Hz, 1H, H B ), 3,46 (s, 2H, C (2) H 2 ), 3,25 (t , J = 6,9 Hz, 2 H, C (12) H 2 ), 2,76 (dddd, J = 12,6, 8,7, 6,0, 1,5 Hz, 1H, H D ), 2,52 (t, J = 7,3 Hz, 2 H, C ( 4) H 2 ), 2,22 (dtd, J = 12,5, 11,2, 8,9 Hz, 1H, H C ), 1,59 (t, J = 6,6 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1:37-1:27 (m, 12H, C (6) H 2 à C (11) H2). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ 210,56 (C 3 ), 168,45 (ester), 165,97 (C 1 ), 65,99 ( C H A H B ), 51,61 (C 12 ), 49,21, 48,19, 44,06, 30,06 ( C H C H D ), 29,35, 29,33, 29,18, 29,06, 28,96, 26,81, 23,45. SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 16 H 26 N 4 O 4 Na ([M + Na] + ): 361,1846. Trouvé: 361,1848. • 3- oxo- N- (tétrahydro-2-oxo-3-thiényl) -dodécanamide 15f [663883-93-0] [Chem 44] • Préparé par GP6 avec rendement quantitatif. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ7,47 (s, 1H, N H ), 4,58 (dt, J = 13,2, 6,8 Hz, 1H, C αH ), 3,45 (s, 2 H, C (2) H 2 ), 3,40 - 3,22 (m, 2H, C H A H B ), 2,86 (dddd, J = 12,2, 6,7, 5,1, 1,5 Hz, 1H, H D ), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H , C (4) H 2 ), 2,01 (dq, J = 12,4, 7,1 Hz, 1H, H C ) 1.62 - 1,55 (m, 2H, C (5) H 2 ), 1,26 (t, J = 2,8 Hz , 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,91-0,84 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ 206,76 (C 3 ), 204,67 (thioester), 166,39 (C 1), 59,40 (C α), 48,34, 44,09, 31,99, 31,66, 29,52, 29,47, 29,38, 29,13 , 27,62, 23,50, 22,80, 14,24 (C 12 ). SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 16 H 27 NO 3 Na ([M + Na] + ): 336,1604. Trouvé 336,1605. • 3-oxo N - [(3S) -tétrahydro-2-oxo-3-thiényl] -dodécanamide 15g [177158-29-1] [Chem 45] • Préparé par GP6 avec rendement quantitatif. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ7,48 (d, J = 6,6 Hz, 1H, N H ), 4 ,58 (dt, J = 13,3, 6,6 Hz, 1H, C αH ), 3,45 (s, 2H , C (2) H 2 ), 3,35 (td, J = 11,5, 5,1 Hz, 1H, C H A ), 3,25 (ddd, J = 11,5, 7,1, 1,5 Hz, 1H, C H B ), 2,84 (dddd , J = 12,4, 6,7, 5,1, 1,5 Hz, 1H, H D ), 2,52 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (4) H 2 ), 2,01 (dq, J = 12,4, 7,1 Hz, 1H, H C ) 1,57 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1,25 (t, J = 3,1 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,91 - 0,82 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ206,72 (C 3 ), 204,71 (thioester), 166,36 (C 1 ), 59,36 (C α), 48,41 (CS), 44,06 (C 2 ), 31,98, 31,64, 29,51, 29,47, 29,37, 29,12, 27,61, 23,48, 22,79, 14,24 (C 12 ). SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 16 H 27 NO 3 SH ([M + H]+): 314,1784. Trouvé: 314,1785. • N - [(1 S, 2 S ) -2-hydroxycyclohexyl] -3-oxo-dodécanamide 15h [886755-19-7] [Chem 46] • Préparé par GP6 avec un rendement de 54%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ): δ7,17 (d, J = 7,4 Hz, 1H, N H ), 3,65 (dddd, J = 11,2, 9,1, 7,4, 4,3 Hz, 1H, NHCHC (OH) H ax ), 3,41 (s, 2H, C (2) H 2 ), 3:38-3:27 (m, 1H, NHC H ), 2,51 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (4) H 2 ), 2,9 à 1,99 (m, 1H, NHCHC (H) H éq ), 1,95 (tdd, J = 7,4, 3,9, 2,3 Hz, 1H, NHCHC (H) H ax ), 1,71 (ddt, J = 8,8, 5,6, 2,7 Hz, 2H NHCHCH (OH) C H 2 ), 1,56 (p, J = 6,9 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1,36 - 1,16 (m, 16H, C (6) H 2 à C (11) H 2 et NHCHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C (OH) H, 0,90- 0,81 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ207,55 (C 3 ), 167,37 (C 1 ), 75,24 (CHOH), 55,88 (NHCH), 48.60, 44.08 (C 2 ), 34,39, 31,97, 31,38, 29,50, 29.46, 29.36, 29.11, 24.67, 24.10, 23.48, 22.78, 14.22 (C 12 ). SMHR (ESI): masse exacte calculée pour C 18 H 33 NO 3 Na ([M + Na]+): 334,2353. Trouvé 334,2353. • N - [(1 S, 2 R ) -2-hydroxycyclohexyl] -3-oxo-dodécanamide 15i [897031-37-7] [Chem 47] • Préparé par GP6 avec un rendement de 67%. 1 H RMN (300 MHz, CDCl3): δ7,25-7,14 (m, 1H, N H ), 3,98 (ddd, J = 8,2, 6,2, 2,7 Hz, 1H, NHC H ), 3,92 (dt, J = 5,8 , 2,6 Hz, 1H, NHCHC (OH) H eq ), 3,40 (d, J = 1,5 Hz, 2 H, C (2) H 2 ), 2,52 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (4) H 2 ), 2,20 - 2,08 (m, 2H), 1,68 - 1,53 (m, 6H), 1,42 (ttd, J = 11,5, 5,5, 5,0, 2,8 Hz, 2H), 1,26 (d, J = 3,5 Hz, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,91-0,83 (m, 3H, C (12) H 3 ).13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ): δ 207,31 (C 3 ), 165,84 (C 1 ), 69,38 (COH), 51,23 (NHCH), 49,17, 44,07, 31,99, 31,51, 29,52, 29,48, 29,38, 29,15, 27,32, 23,52, 23,44, 22,79, 20,43, 14,23 (C 12 ). R f (3: 1 EtOAc / CycHex) = 0,38. HRMS (ESI): masse exacte calculée pour C 18 H 33 NO 3 H ([M + H]+): 312,2533. Trouvé: 312,2534. • N - (5-chloro-2-hydroxyphényl) -3-oxododécanamide 15 m [663883-68-9] [Chem 48] • Préparé par GP6 avec un rendement de 98%. 1 H RMN (300 MHz, MeOD-d 4 ): δ8:01 (d, J = 2,5 Hz, 1H, aromatique H ), 6,94 (dd, J = 8,6, 2,6 Hz, 1H, aromatique H ), 6,84 à 6,76 ( m, 1H, H aromatique ), 3,64 (dd, J = 5,5, 3,3 Hz, 1H, C (2) H -forme-énol), 2,60 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C (4) H 2 ), 1,59 (p, J = 7,2 Hz, 2H, C (5) H 2 ), 1,34-1,26 (m, 12H, C (6) H 2 à C (11) H 2 ), 0,92 à 0,87 (m, 3H, C (12) H 3 ). 13 C RMN (75 MHz, MeOD-d 4 ): δ 207,41 (C 3 ), 167,64 (C 1 ), 147,59 ( C OH), 128,30 (aromatique C ), 125,51 (aromatique C H), 124,91 (aromatique C ) , 122,45 (aromatique C H), 116,95 (aromatique C H), 43,99 (C 2 ), 33,03 (C 4 ), 30,57, 30,53, 30,40, 30,13, 24,45, 23,72, 14,43 (C 12 ). SMHR (ESI): masse exacte cal- culée pour C 18 H 26 ClNO 3 H ([M + H] + ): 340,1654. Trouvé 340,1663. 3. Effet anti-inflammatoire des composés de l’invention Dans le but d’évaluer les propriétés de composés d’intérêt, une lignée de macrophages murins, les RAW264.7 a été utilisée. Afin d’évaluer l’effet sur l’inflammation, les cellules ont été traitée ou non par l’adjonction d’un cocktail pro-inflammatoire (interferon-γ (IFN-γ, 20U/mL) et lipopolysaccharides (LPS, 10ng/mL)). L’état inflammatoire a été évalué par analyse Multiplex en dosant la sécrétion de 23 cytokines dans le surnageant des cellules. Les résultats sous forme de heatmap sont montrés en figure 15, qui montre la sécrétion des cytokines par RAW264.7 dans des conditions stimulées (LPS 10 ng/mL ; IFN-^ 20 U/mL) (normalisé par rapport au contrôle). Ces résultats permettent de visualiser globalement une diminution de la production des cytokines en présence d’ACP à 50µM. Les cytokines dont la production a été modulée par les composés de l’invention sont l’interleukine-1β (IL-1β), l’IL-2, l’IL-6, l’IL-12, RANTES, TNFα, des cytokines pro-inflammatoires. La diminution de ces protéines était doses dépendante, et les effets les plus importants ont été observés en présence d’ACP à 50µM. Pour l’illustrer, 2 histogrammes (le premier avec la 3oxoC12 :2 ; le 2ème avec l’ACP) montrant les résultats observés pour le TNF alpha (résultats issus de l’analyse en Multiplex) sont montrés en figure 16 (en haut :TNF∝ sécrété par RAW264.7 stimulé par LPS et interféron^^ en présence de 3oC12 :2 et en bas : TNF∝ sécrété par RAW264.7 stimulé par LPS et interféron^ ^ en présence de ACP). La confirmation de certains résultats en expression génique a été effectuée en mesurant les ARN messagers par PCR quantitative notamment pour 3 cytokines d’intérêt : Rantes, TNF aplha, IL1- béta. Les résultats figurent dans les diagrammes montrés en figure 17. Ainsi, on observe un effet anti-inflammatoire des composés sur les cellules de type macrophages tant au niveau protéique qu’en expression en ARNm. 4 Mesure de la toxicité des composés de l’invention 4.1 Mesure de la toxicité des composés sur cellules eucaryotes La cytotoxicité des composés testés et contrôles a été évaluée en utilisant un test de mesure de la sécrétion de LDH (Lactate Déhydrogénase). Ce test se base sur la mesure de la quantité de LDH sécrétée par les cellules dans leur surnageant, par rapport à la quantité de LDH qui sera restée dans le compartiment intracellulaire. Ce ratio fournit une indication des dommages membranaires subis par les cellules, et donc de la cytotoxicité du composé. Un composé est considéré toxique lorsque le ratio est supérieur à 10%. Deux méthodes ont été utilisées pour réaliser ce test : la mesure à l’aide d’une solution de pyruvate/NADH préparée extemporanément, ou bien en utilisant le Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) du fabricant Roche (Sigma-Aldrich). Méthode pyruvate/NADH : solution pyruvate/NADH préparée avec 4,1 mg d’acide pyruvique (0,62 mM) et 7,7 mg de NADH (0,18 mM) dans 60 ml de 0.1M PBS (pH 7.4). Pour la mesure de la concentration de LDH dans les surnageants, 800µL de NADH étaient ajoutés à 200µL de surnageant dans des cuvettes plastiques de spectrométrie, et la diminution en absorbance de la solution finale était lue à 340 nm durant 1 min. Pour la mesure de la concentration de LDH dans les lysats cellulaires, 800µL de NADH étaient ajoutés à 10µL de lysats cellulaires et 190µL de 0.1M PBS dans des cuvettes plastiques de spectrométrie, et la diminution en absorbance de la solution finale était lue à 340 nm durant 1 min. Le pourcentage de LDH sécrété était ensuite calculé par le ratio des pentes de décroissance de l’absorbance des surnageants et des lysats cellulaires (respectivement). Méthode Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) : test d’absorbance réalisé selon les instructions fabricant. Le pourcentage de LDH sécrété était ensuite calculé par la formule : [Math 2] 4.2 Méthode de mesure de la toxicité des composés sur lignée bactérienne La souche E. coli K12 a été mise en culture à J0 sur gel d’agar, puis une colonie sélectionnée et transférée à J1 dans un milieu liquide de culture bactérienne LYBHI. À J2 cette colonie a été diluée au 1/100 en milieu LYBHI, et maintenue durant 18h pour expansion avant répartition dans une plaque 96-puits opaque. Dans chaque puit ont été distribués : du milieu LYBHI, de la culture bactérienne, et les composés testés ou contrôles. L’absorbance des puits a été lue à 600 nm à t0 et t18h. Les valeurs brutes d’absorbance ont été corrigées par rapport à l’absorbance des puits ne contenant que du milieu LYBHI sans bactérie ni composé. 4.3 Résultats sur cellules eucaryotes a. AHL naturelles 3oxoC12-HSL et 3oxoC12 :2-HSL La figure 18 montre que dans la lignée cellulaire Caco-2/TC7 les 2 molécules sont bien tolérées dans la gamme de concentration 1-100µM, en présence et absence de cytokines pro-inflammatoires : la cytotoxicité mesurée ne dépasse pas 2,5% pour la 3oxoC12-HSL et 1,5% pour la 3oxoC12 :2- HSL. En comparaison la toxicité du contrôle activé (DMSO 0,1% et cytokines) est d’environ 4%. La figure 19 montre que dans la lignée cellulaire murine Raw264.7, une augmentation de LDH sécrétée a été observée dès 50µM pour les deux AHL, avec une cytotoxicité supérieure à 10% à la concentration 100µM. Ce phénomène est observé en condition basale et stimulée, et est donc imputable à une toxicité des molécules. Ceci justifie l’utilisation des doses 1-50µM dans le reste de l’étude sur la lignée de macrophages. b. (D/L)-3oxoC12-HTL (formule I-1) et (S)-3oxoC12-HTL (formule I-3) Comme on le voit en figure 20 qu’aucun de ces deux composés à tête thiolactone ne présente de toxicité sur les deux lignées cellulaires, avec des sécrétions de LDH inférieures à 10% même aux plus hautes concentrations. c. (S,S)-3oxoC12-ACH (formule (I-2) et (R,S)-3oxoC12-ACH (formule (I-4) Ces deux composés ne sont pas cytotoxiques à faibles concentrations comme le montre la figure 21, mais la molécule (R,S)-3oxoC12-ACH montre une hausse de sécrétion de LDH aux plus fortes concentrations (≥ 50µM). Sur les cellules épithéliales Caco-2/TC7, sans toutefois excéder la barre des 10%, on observe une sécrétion de 9% à 100µM. Cet effet n’est pas aussi important pour le diastéréomère (S,S)-3oxoC12-ACH. Cette observation se retrouve sur la lignée de macrophages Raw264.7, où de façon consistante, la LDH sécrétée en présence de (R,S)-3oxoC12-ACH est supérieure à celle sécrétée en présence de (S,S)-3oxoC12-ACH, à toutes concentrations. La molécule (R,S)-3oxoC12-ACH est par ailleurs toxique à 50µM. d. 3oxoC12-aminochlorophenol (formule I-6) La molécule n’est pas toxique sur les deux lignées, à aucune des concentrations testées comme on le voit en figure 22. 4.4 Résultats sur souche bactérienne a. AHL naturelles 3oxoC12-HSL et 3oxoC12 :2-HSL Les AHL 3oxoC12-HSL et 3oxoC12 :2-HSL ont été testées pour effets bactéricides dans la gamme 1- 100µM.Aucun effet toxique n’a été observé après 18h d’incubation : les absorbances enregistrées étaient identiques à celles relevées pour le milieu LYBHI seul et en présence de DMOS 0,1% : voir la figure 23. 4.5 Résultats sur souche bactérienne a. Analogues (D/L)-3oxoC12-HTL (formule I-1), (S)-3oxoC12-HTL (formule I-3), (S,S)- 3oxoC12-ACH (formule (I-2), (R,S)-3oxoC12-ACH (formule (I-4) et 3oxoC12-aminochlorophe- nol (formule I-6) Aucune différence signifiante n’a été observée parmi toutes les concentrations et toutes les molécules testées, aussi seule la concentration maximale (100µM) est montrée en figure 24. De façon générale, aucun composé, naturel ou synthétique, n’est bactéricide sur la souche E. coli K12.

Claims

REVENDICATIONS 1. Composé ayant la formule générale I suivante : [Chem 49] dans laquelle : - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres un atome de carbone ou un hétéroatome choisi parmi S, N et O, à condition que X soit différent de O, - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres éventuellement substitués par un halo- gène choisi parmi Cl, F, Br, et I, ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, - x, y, z, et w, indépendamment les uns des autres valent 0 ou 1, à condition que 3 ≤ x + y+ z + w ≤ 4, - R représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, ou un groupe hydroxyle (OH) ou un groupe azido (N3), - ----- représente une liaison simple ou double (cis ou trans), - R ‘représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4 pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’épithélium. 2. Composé selon la revendication 1 choisi dans le groupe formé par : - - la (D/L)-3-oxo-C12 aminothiolactone ((D/L)-3-oxo-C12 -HTL) de formule I-1 suivante : [Chem 50] (D/L)-3oxoC12-HTL Formule I-1 - la (S,S) 3-oxo-C12 aminocyclohexanol ((S,S) 3-oxo C12-ACH) de formule I-2 suivante : [Chem 51] - la (S) 3–oxo- C12aminothiolactone (S)-3oxoC12 –HTL) de formule I-3 suivante : [Chem 52] - la (R,S)-3-oxo-C12-aminocyclohexanol de formule I-4 suivante : [Chem 53] - la 3-oxo-C12-aminocyclohexanol de formule I-5 suivante : [Chem 54] - la 3-oxo-C12-aminochlorophénol de formule I-6 suivante : [Chem 55]
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’intestin. 4. Composé selon la revendication 1 ou 2 pour utilisation dans le traitement du psoriasis. 5. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé ayant la formule générale I suivante : [Chem 56] dans laquelle : - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres un atome de carbone ou un hétéroatome choisi parmi S, N et O, à condition que X soit différent de O, - X, Y, Z et W sont indépendamment les uns des autres éventuellement substitués par un halo- gène choisi parmi Cl, F, Br, et I, ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, - x, y, z, et w, indépendamment les uns des autres valent 0 ou 1, à condition que 3 ≤ x + y+ z + w ≤ 4, - R représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, ou un groupe hydroxyle (OH) ou un groupe azido (N3), - R’ représente H ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C4, - ----- représente une liaison simple ou double (cis ou trans),et - au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 dans laquelle le au moins un composé de formule I est choisi dans le groupe formé par : - - la (D/L)-3-oxo-C12-aminothiolactone ((D/L)-3oxoC12 -HTL) de formule I-1 suivante : [Chem 57] (D/L)-3oxoC12-HTL Formule I-1 - la (S,S) 3-oxo-C12 -aminocyclohexanol (S,S ) 3-oxo- C12-ACH) de formule I-2 suivante : [Chem 58] - la (S)-3–oxo- C12-aminothiolactone ((S)-3-oxo-C12 –HTL) de formule I-3 suivante : [Chem 59] - la (R,S)-3-oxo-C12-aminocyclohexanol de formule I-4 suivante : [Chem 60] - la 3-oxo C12-aminocyclohexanol de formule I-5 suivante : [Chem 61] - 3-oxo C12-aminochlorophénol de formule I-6 suivante : [Chem 62] 7. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 ou 6 pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’épithélium. 8. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 ou 6 pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire de l’intestin. 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 ou 6 pour utilisation dans le traitement du psoriasis.
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